JP7430301B2 - 遺伝子サンプルを識別且つ区別するためのシステムと方法 - Google Patents

遺伝子サンプルを識別且つ区別するためのシステムと方法 Download PDF

Info

Publication number
JP7430301B2
JP7430301B2 JP2019561279A JP2019561279A JP7430301B2 JP 7430301 B2 JP7430301 B2 JP 7430301B2 JP 2019561279 A JP2019561279 A JP 2019561279A JP 2019561279 A JP2019561279 A JP 2019561279A JP 7430301 B2 JP7430301 B2 JP 7430301B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
probes
nucleic acid
minutes
cases
subject
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2019561279A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2020519254A (ja
JP2020519254A5 (ja
Inventor
チャールズ ケイン，ロバート
コツェログロウ，セオフィロス
アイ． バシキーロフ，ウラジーミル
シェン，リチャード
Original Assignee
リヴィア バイオセンサーズ，エルエルシー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by リヴィア バイオセンサーズ，エルエルシー filed Critical リヴィア バイオセンサーズ，エルエルシー
Publication of JP2020519254A publication Critical patent/JP2020519254A/ja
Publication of JP2020519254A5 publication Critical patent/JP2020519254A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7430301B2 publication Critical patent/JP7430301B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
    • G01N27/44791—Microapparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Description

相互参照
本出願は、２０１７年５月９日出願の米国仮特許出願第６２／５０３，５０２号、２０１７年８月１７日出願の米国仮特許出願第６２／５４６，９２９号、及び２０１７年１１月１５日出願の米国仮特許出願第６２／５８６，７６０号の利益を主張するものであり、これらの各々は全ての目的のためにその全体において参照により本明細書に組み込まれる。
ＤＮＡマイクロアレイ（又はバイオチップ）は、標的核酸の存在に対しサンプルをプローブで探すために頻繁に使用される。マイクロアレイは、固形支持体に固定されたプローブのアレイを含んでいる。プローブのアレイは、プローブのクラスタとして構築することができ、各々が個々に対処可能である。各クラスタは複数のプローブを含むことができ、各プローブは各クラスタ中の他のプローブと同一であり、各々が同じ標的核酸配列に結合することができる。サンプルがマイクロアレイにハイブリダイズされた後、プローブに結合される標的核酸の存在が判定され得る。マイクロアレイは、コスト効率が良く、サンプル中の何千～何百万もの配列の存在を判定することができるという点で非常にスケーラブルであり、且つ他の同様に調整した（ｓｃａｌｅｄ）手法よりも早い時間での返答を提供するという利点を提供することができる。
標準マイクロアレイは、検出電位を最大化するためにアレイ上の特定位置のプローブの編成を必要とすることから、慎重に設計されなければならない。それ故に、環境サンプルなどの複合サンプル、即ち遺伝物質の１より多くのソースを含むものを調べる時に、検出が問題となり得る。プローブの統合（Ｐｏｏｌｏｎｇ）は、特異的なプローブ編成の要件により制限されることなく、使用可能な検出プラットフォームの型に適応性を提供する。本明細書中の方法とシステムは、統合プローブ（ｐｏｏｌｅｄ ｐｒｏｂｅｓ）を使用した複合サンプル中の被験体の識別と区別のための新たな検出システムを記載する。
本明細書には、特定の実施形態において、（ａ）分析物を含むサンプルを提供する工程；及び（ｂ）チャネル中の等速電気泳動（ＩＴＰ）によって前記分析物を濃縮する又は輸送する工程を含む方法が開示され、前記チャネルの表面はシリコン基板を含む。場合によっては、前記シリコン基板は絶縁層を含む。場合によっては、前記絶縁層は酸化ケイ素を含む。場合によっては、前記絶縁層は少なくとも約２５０ナノメートルの厚さである。場合によっては、前記絶縁層は少なくとも約５００ナノメートルの厚さである。
幾つかの実施形態において、前記表面は少なくとも１つのウェルを含む。場合によっては、前記少なくとも１つのウェルはマイクロウェルである。場合によっては、前記少なくとも１つのウェルはウェルのアレイを含む。場合によっては、プローブは前記表面に結合される。場合によっては、前記プローブはアレイに配置される。場合によっては、前記アレイの単一特徴におけるプローブは、プローブの少なくとも２つの種を含む。
幾つかの実施形態において、前記プローブの少なくとも２つの種は各々、同じ被験体に特異的である。場合によっては、前記被験体は有機体の種を含む。場合によっては、前記被験体は有機体の株を含む。場合によっては、前記被験体は有機体の分岐群を含む。場合によっては、前記被験体は遺伝学的変異体を含む。場合によっては、前記被験体は病原性の形質を含む。場合によっては、前記被験体は抵抗性の形質を含む。場合によっては、前記被験体は有機体の種の個々のメンバーを含む。
幾つかの実施形態において、前記ＩＴＰは、約８００ボルト以下の電圧で実施される。幾つかの実施形態において、前記ＩＴＰは、約４００ボルト以下の電圧で実施される。幾つかの実施形態において、前記ＩＴＰは、約２００ボルト以下の電圧で実施される。幾つかの実施形態において、前記チャネルは１００マイクロメートル以下の高さを持つ。幾つかの実施形態において、前記チャネルは７５マイクロメートル以下の高さを持つ。幾つかの実施形態において、前記チャネルは５０マイクロメートル以下の高さを持つ。幾つかの実施形態において、前記チャネルは２５マイクロメートル以下の高さを持つ。幾つかの実施形態において、前記チャネルは狭窄部分又はテーパー状部分を含まない。幾つかの実施形態において、前記チャネルは２０００マイクロメートル以下の幅を持つ。幾つかの実施形態において、前記チャネルは１０００マイクロメートル以下の幅を持つ。幾つかの実施形態において、前記チャネルは５００マイクロメートル以下の幅を持つ。
幾つかの実施形態において、前記分析物は核酸を含む。場合によっては、前記分析物はＤＮＡを含む。場合によっては、前記分析物はＲＮＡを含む。場合によっては、前記方法は、前記分析物を前記表面上のプローブに結合する工程を更に含む。場合によっては、前記方法は、前記分析物を検出する工程を更に含む。場合によっては、前記方法は、前記分析物を前記表面上のプローブに結合する工程、及び前記分析物を検出する工程を更に含み、ここで、前記方法は約６０分以下で実施される。場合によっては、前記方法は、前記分析物を前記表面上のプローブに結合する工程、及び前記分析物を検出する工程を更に含み、ここで、前記方法は約４５分以下で実施される。場合によっては、前記方法は、前記分析物を前記表面上のプローブに結合する工程、及び前記分析物を検出する工程を更に含み、ここで、前記方法は約３０分以下で実施される。場合によっては、前記方法は、前記分析物を前記表面上のプローブに結合する工程、及び前記分析物を検出する工程を更に含み、ここで、前記方法は約１５分以下で実施される。場合によっては、前記方法は、前記分析物を前記表面上のプローブに結合する工程、及び前記分析物を検出する工程を更に含み、ここで、前記方法は約５分以下で実施される。
本明細書には、特定の実施形態において、検出装置が開示され、該検出装置はプローブの１つ以上のセットを含み、前記プローブの１つ以上のセットの各セットは複数のプローブを含み、前記複数のプローブの各々は１つ以上の被験体に特異的な特徴を含み、前記プローブの１つ以上のセットの各セットは、複数の異なる被験体のうち１人の異なる被験体の標的核酸に結合し、プローブの１つ以上のセットは統合される（ｐｏｏｌｅｄ）。
幾つかの実施形態において、１セットのプローブ内の前記複数のプローブの少なくとも２つが同一である。幾つかの実施形態において、１セットのプローブ内の前記複数のプローブの少なくとも２つが異なっている。幾つかの実施形態において、前記複数のプローブの各セットは複数の固有のプローブを含む。幾つかの実施形態において、前記複数のプローブの各セットは、前記複数の固有のプローブの平均表示を含む。幾つかの実施形態において、前記複数の固有のプローブの平均表示は、前記プローブの１つ以上のセットの少なくとも１つのセット内のプローブの総数を制限することにより、予め定めた比率で前記複数の固有のプローブを混合することにより、或いはその両方の組み合わせにより、制御される。幾つかの実施形態において、前記プローブの１つ以上のセットの少なくとも１つは、約２－１０００の固有のプローブを含む。幾つかの実施形態において、前記平均表示は、前記プローブのセット内に前記複数の固有のプローブの少なくとも１つの約２－１０００の表示を含む。
幾つかの実施形態において、プローブの少なくとも１つのセット内の被験体に特異的な特徴は同一である。幾つかの実施形態において、前記プローブの１つ以上のセットの少なくとも１つのセットは、異なる被験体に特異的な特徴を含む。幾つかの実施形態において、前記プローブの１つ以上のセットの少なくとも１つのセットは、個々に対処可能である。幾つかの実施形態において、１セットのプローブ内の前記複数のプローブの少なくとも１つは、前記標的核酸上に存在する同一の核酸配列に相補的である。幾つかの実施形態において、１セットのプローブ内の前記複数のプローブの少なくとも２つは、前記標的核酸上に存在する異なる核酸配列に相補的である。幾つかの実施形態において、前記プローブの１つ以上のセットの少なくとも１つのセットは、被験体のゲノムの固有領域に相補的である。幾つかの実施形態において、前記被験体のゲノムの固有領域は、異なる被験体のゲノムには表わされない。幾つかの実施形態において、前記複数の異なる被験体は、複数の異なる細胞型を含む。幾つかの実施形態において、前記プローブの１つ以上のセットの少なくとも１つのセットは、前記複数の異なる細胞型の１つの異なる細胞型からの標的核酸に結合する。幾つかの実施形態において、前記複数の異なる被験体は、複数の異なる遺伝子、ゲノム領域、有機体、個体、或いは株を含む。幾つかの実施形態において、前記プローブの１つ以上のセットの少なくとも１つのセットは、前記複数の異なる有機体のうち１つの異なる有機体の標的核酸に結合する。幾つかの実施形態において、前記複数のプローブは核酸分子を含む。幾つかの実施形態において、前記プローブの１つ以上のセットの少なくとも１つのセットは、検出装置の表面上に固定される。幾つかの実施形態において、前記表面はビーズである。幾つかの実施形態において、前記プローブの１つ以上のセットの少なくとも１つのセットは、検出装置の表面上に固定されない。幾つかの実施形態において、前記被験体に特異的な特徴は１つ以上の遺伝子特徴を含む。幾つかの実施形態において、前記１つ以上の遺伝子特徴は、以下から成る群から選択される：ゲノム、染色質、染色体、染色体座、染色体材料、対立遺伝子、遺伝子、遺伝子群、遺伝子座、遺伝的多型、遺伝子突然変異、ヌクレオチド、一塩基多型（ＳＮＰ）、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、可変タンデムリピート（ＶＴＲ）、コピー数多型（ＣＮＶ）、マイクロサテライト配列、遺伝子マーカー、配列マーカー、配列でタグ付けされた部位（ＳＴＳ）、プラスミド、転写単位、転写生成物、遺伝子発現状態、保存領域、病原性遺伝子島（ＰＩＡ）、及びそれらの任意の組み合わせ。幾つかの実施形態において、前記プローブの１つ以上のセットの少なくとも１つのセットは、１００を超えるセットのプローブを含む。幾つかの実施形態において、前記プローブの１つ以上のセットの少なくとも１つのセットは、約５０－１０００のプローブを含む。幾つかの実施形態において、複数のプローブの少なくとも１つは、標的特異的ガイド核酸（ｇＮＡ）：核酸に誘導されたヌクレアーゼシステム複合体を含む。
幾つかの実施形態において、プローブの１つ以上のセットは反応チャンバに統合される。幾つかの実施形態において、反応チャンバは、ＰＣＲウェル、アレイスポット、ドロップレット、電極、又はマイクロ流体チャネルである。幾つかの実施形態において、検出装置は更に複数の反応チャンバを含む。幾つかの実施形態において、電極は、金、イリジウム、白金、銅、又はこれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態において、反応チャンバは少なくとも１つの孔を含む。幾つかの実施形態において、複数のプローブの少なくとも１つは検出可能なラベルで標識される。幾つかの実施形態において、検出可能なラベルは、酵素、酵素基質、抗体、抗原結合フラグメント、ペプチド、発色団、ルミフォア、フルオロフォア、クロモゲン、ハプテン、抗原、放射性同位体、磁性粒子、ナノ粒子、量子ドット、バーコード、活性部位、結合部位、酸化還元反応活性マーカー群、アプタマー、疎水性種（ｓｐｅｃｉｅ）、親水性種、結合対の１つのメンバー、ドナー染料（レポーター）、アクセプター染料（クエンチャー）、有機金属化合物、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。
幾つかの実施形態において、検出装置は第２のプローブの１つ以上のセットを更に含み、前記第２のプローブの１つ以上のセットの各セットは複数の第２のプローブを含み、前記第２のプローブの１つ以上のセットの各セットは、標的核酸付近の核酸の領域に結合する。幾つかの実施形態において、標的核酸付近の核酸の領域は、標的核酸の上流又は下流にある。幾つかの実施形態において、標的核酸付近の核酸の領域は、標的核酸から１０ｂｐ未満分離される。幾つかの実施形態において、標的核酸付近の核酸の領域は、標的核酸から１０ｂｐ未満、２０ｂｐ未満、３０ｂｐ未満、４０ｂｐ未満、５０ｂｐ未満、又は１００ｂｐ未満分離される。幾つかの実施形態において、前記第２のプローブの１つ以上のセットの少なくとも１つのセットは、検出装置の表面上に固定されない。幾つかの実施形態において、前記第２のプローブの１つ以上のセットの少なくとも１つは、検出装置の表面上に固定される。幾つかの実施形態において、前記第２のプローブの１つ以上のセットの少なくとも１つは、検出可能なラベルにより標識される。幾つかの実施形態において、ラベルは、酵素、酵素基質、抗体、抗原結合フラグメント、ペプチド、発色団、ルミフォア、フルオロフォア、クロモゲン、ハプテン、抗原、放射性同位体、磁性粒子、ナノ粒子、量子ドット、バーコード、活性部位、結合部位、酸化還元反応活性マーカー群、アプタマー、疎水性種（ｓｐｅｃｉｅ）、親水性種、結合対の１つのメンバー、ドナー染料（レポーター）、アクセプター染料（クエンチャー）、有機金属化合物、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。幾つかの実施形態において、複数の第２のプローブの少なくとも１つは、標的特異的ガイド核酸（ｇＮＡ）：核酸に誘導されたヌクレアーゼシステムタンパク質複合体である。幾つかの実施形態において、第２のプローブの１つ以上のセットは、捕捉プローブの１つ以上のセットである。幾つかの実施形態において、検出装置は単回用装置である。
本明細書には、特定の実施形態において、（ａ）複数の異なる被験体に由来する複数の核酸を含むサンプルを提供する工程；（ｂ）前記複数の核酸を検出装置にハイブリダイズする工程であって、前記検出装置はプローブの１つ以上のセットを含み、前記プローブの１つ以上のセットは統合され、前記プローブの１つ以上のセットの各セットは複数のプローブを含み、前記複数のプローブの各々は１つ以上の被験体に特異的な特徴を含み、前記プローブの１つ以上のセットの各セットは、前記複数の異なる被験体のうち少なくとも２つからの前記少なくとも１つの標的核酸に結合する、工程；（ｃ）前記複数のプローブの１つのプローブへの前記少なくとも１つの標的核酸の結合に関連したシグナルを検出する工程；及び（ｄ）前記サンプル中の前記少なくとも１つの標的核酸の存在に基づいて前記複数の異なる被験体を識別する工程を含む方法が開示される。幾つかの実施形態において、前記方法は、工程ａ）の前に、前記複数の異なる被験体から前記複数の核酸を抽出する工程を更に含む。幾つかの実施形態において、前記方法は、工程ｂ）の前に、前記複数の核酸を断片化する工程を更に含む。幾つかの実施形態において、前記方法は、工程ｂ）の前に、前記複数の核酸を増幅する工程を更に含む。幾つかの実施形態において、前記複数の核酸は増幅されない。幾つかの実施形態において、前記方法は、前記複数の異なる被験体を識別する１つ以上のレポートを提供する工程を更に含む。
幾つかの実施形態において、前記複数の異なる被験体は、複数の異なる細胞型を含む。幾つかの実施形態において、前記複数の異なる被験体は、複数の異なる有機体を含む。幾つかの実施形態において、１セットのプローブ内の前記複数のプローブの少なくとも２つが同一である。幾つかの実施形態において、１セットのプローブ内の前記複数のプローブの少なくとも２つが異なっている。幾つかの実施形態において、前記複数のプローブの各セットは複数の固有のプローブを含む。幾つかの実施形態において、前記複数のプローブの各セットは、前記複数の固有のプローブの平均表示を含む。幾つかの実施形態において、前記複数の固有のプローブの平均表示は、前記プローブの１つ以上のセットの少なくとも１つのセット内のプローブの総数を制限することにより、予め定めた比率で前記複数の固有のプローブを混合することにより、或いはその両方の組み合わせにより、制御される。幾つかの実施形態において、前記プローブの１つ以上のセットの少なくとも１つは、約２－１０００の固有のプローブを含む。幾つかの実施形態において、前記平均表示は、前記プローブのセット内に前記複数の固有のプローブの少なくとも１つの約２－１０００の表示を含む。
幾つかの実施形態において、プローブの少なくとも１つのセット内の被験体に特異的な特徴は同一である。幾つかの実施形態において、前記プローブの１つ以上のセットの少なくとも１つのセットは、異なる被験体に特異的な特徴を含む。幾つかの実施形態において、前記プローブの１つ以上のセットの少なくとも１つのセットは、個々に対処可能である。幾つかの実施形態において、１セットのプローブ内の前記複数のプローブの少なくとも１つは、前記標的核酸上に存在する同一の核酸配列に相補的である。幾つかの実施形態において、１セットのプローブ内の前記複数のプローブの少なくとも１つは、前記標的核酸上に存在する異なる核酸配列に相補的である。幾つかの実施形態において、前記プローブの１つ以上のセットの少なくとも１つのセットは、被験体のゲノムの固有領域に相補的である。幾つかの実施形態において、前記被験体のゲノムの固有領域は、異なる被験体のゲノムには表わされない。幾つかの実施形態において、前記複数のプローブは核酸分子を含む。幾つかの実施形態において、前記プローブの１つ以上のセットの少なくとも１つのセットは、検出装置の表面上に固定される。幾つかの実施形態において、前記表面はビーズである。幾つかの実施形態において、前記プローブの１つ以上のセットの少なくとも１つのセットは、検出装置の表面上に固定されない。幾つかの実施形態において、前記被験体に特異的な特徴は１つ以上の遺伝子特徴を含む。幾つかの実施形態において、前記１つ以上の遺伝子特徴は、以下から成る群から選択される：ゲノム、染色質、染色体、染色体座、染色体材料、対立遺伝子、遺伝子、遺伝子群、遺伝子座、遺伝的多型、遺伝子突然変異、ヌクレオチド、一塩基多型（ＳＮＰ）、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、可変タンデムリピート（ＶＴＲ）、コピー数多型（ＣＮＶ）、マイクロサテライト配列、遺伝子マーカー、配列マーカー、配列でタグ付けされた部位（ＳＴＳ）、プラスミド、転写単位、転写生成物、遺伝子発現状態、保存領域、病原性遺伝子島（ＰＩＡ）、及びそれらの任意の組み合わせ。幾つかの実施形態において、前記プローブの１つ以上のセットの少なくとも１つのセットは、１００を超えるセットのプローブを含む。幾つかの実施形態において、前記プローブの１つ以上のセットの少なくとも１つのセットは、約５０－１０００のプローブを含む。幾つかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的核酸は、検出可能なラベルで標識される。幾つかの実施形態において、検出可能なラベルは蛍光染料を含む。幾つかの実施形態において、前記少なくとも１つの標的核酸は、前記検出可能なラベルを含む検出プローブの前記少なくとも１つの標的核酸へのハイブリダイゼーションにより標識される。幾つかの実施形態において、前記複数のプローブの第１のプローブは第１の被験体に特異的な特徴を含み、前記複数のプローブの第２のプローブは第２の被験体に特異的な特徴を含み、前記第１のプローブと前記第２のプローブは、前記少なくとも１つの標的核酸にハイブリダイズする。幾つかの実施形態において、複数のプローブの少なくとも１つは検出可能なラベルで標識される。幾つかの実施形態において、検出可能なラベルは、酵素、酵素基質、抗体、抗原結合フラグメント、ペプチド、発色団、ルミフォア、フルオロフォア、クロモゲン、ハプテン、抗原、放射性同位体、磁性粒子、ナノ粒子、量子ドット、バーコード、活性部位、結合部位、酸化還元反応活性マーカー群、アプタマー、疎水性種（ｓｐｅｃｉｅ）、親水性種、結合対の１つのメンバー、ドナー染料（レポーター）、アクセプター染料（クエンチャー）、有機金属化合物、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。幾つかの実施形態において、複数のプローブの少なくとも１つは、標的特異的ガイド核酸（ｇＮＡ）：核酸に誘導されたヌクレアーゼシステムタンパク質複合体である。
幾つかの実施形態において、プローブの１つ以上のセットは反応チャンバに統合される。幾つかの実施形態において、反応チャンバは、ＰＣＲウェル、アレイスポット、ドロップレット、電極、又はマイクロ流体チャネルである。幾つかの実施形態において、前記方法の検出装置は更に複数の反応チャンバを含む。幾つかの実施形態において、電極は、金、イリジウム、白金、銅、又はこれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態において、反応チャンバは少なくとも１つの孔を含む。幾つかの実施形態において、ハイブリダイズの前に、多数の核酸が濃縮される。幾つかの実施形態において、複数の核酸は、等速電気泳動を使用して濃縮される。
幾つかの実施形態において、検出装置は第２のプローブの１つ以上のセットを更に含み、前記第２のプローブの１つ以上のセットの各セットは複数の第２のプローブを含み、前記第２のプローブの１つ以上のセットの各セットは、標的核酸付近の核酸の領域に結合する。幾つかの実施形態において、標的核酸付近の核酸の領域は、標的核酸の上流又は下流にある。幾つかの実施形態において、標的核酸付近の核酸の領域は、標的核酸から１０ｂｐ未満分離される。幾つかの実施形態において、標的核酸付近の核酸の領域は、標的核酸から１０ｂｐ未満、２０ｂｐ未満、３０ｂｐ未満、４０ｂｐ未満、５０ｂｐ未満、又は１００ｂｐ未満分離される。幾つかの実施形態において、前記第２のプローブの１つ以上のセットの少なくとも１つのセットは、検出装置の表面上に固定されない。幾つかの実施形態において、前記第２のプローブの１つ以上のセットの少なくとも１つは、検出装置の表面上に固定される。幾つかの実施形態において、第２のプローブの１つ以上のセットの少なくとも１つは、ラベルを含む。幾つかの実施形態において、ラベルは、酵素、酵素基質、抗体、抗原結合フラグメント、ペプチド、発色団、ルミフォア、フルオロフォア、クロモゲン、ハプテン、抗原、放射性同位体、磁性粒子、ナノ粒子、量子ドット、バーコード、活性部位、結合部位、酸化還元反応活性マーカー群、アプタマー、疎水性種（ｓｐｅｃｉｅ）、親水性種、結合対の１つのメンバー、ドナー染料（レポーター）、アクセプター染料（クエンチャー）、有機金属化合物、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。幾つかの実施形態において、複数の第２のプローブの少なくとも１つは、標的特異的ガイド核酸（ｇＮＡ）：核酸に誘導されたヌクレアーゼシステム複合体である。幾つかの実施形態において、第２のプローブの１つ以上のセットは、捕捉プローブの１つ以上のセットである。
幾つかの実施形態において、前記方法は更に、検出装置を光源に晒す工程を含む。幾つかの実施形態において、前記方法は更に、標的核酸を含む核酸配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行する工程を含む。幾つかの実施形態において、前記方法は、検出装置に電圧をかける工程を含む。幾つかの実施形態において、信号は、蛍光信号、電気化学式信号、又は電流インピーダンスの尺度（ｍｅａｓｕｒｅ）である。
バイオチップシステムの実施形態を例示する。図１Ａは４つの典型的な特徴を示し、各特徴は、サンプル中に同一のプローブ、及び１つの被験体からの４つの未結合の標識された標的を含む。 バイオチップシステムの実施形態を例示する。図１Ｂは、サンプル中の単一の被験体からの４つのプローブ、及び４つの未結合の標識された標的を備えた、被験体に特異的な特徴を図示する。 バイオチップシステムの実施形態を例示する。図１Ｃは、４つの異なる特徴に結合された４つの標的を示す。 バイオチップシステムの実施形態を例示する。図１Ｄは、１つの被験体に特異的な特徴に結合された４つの標的を示す。図１Ｃを図１Ｄと比較すると、複数の被験体標的に配向された複数の異なるプローブを使用した時に１つの特徴に生じ得るシグナル増幅が実証される。 バイオチップシステムの実施形態を例示する。図１Ｅは、１つの異なる特徴内での固有のプローブの順序付けた統合を含む特徴を示す。 バイオチップシステムの実施形態を例示する。図１Ｆは、特徴の中に固有のプローブの無作為統合を含む特徴を示す。 １つの特徴ごとに結合するフルオロフォアの数の増大により得ることができる相対的なシグナルを示す。 本明細書に開示される方法を実行するのに適切な、典型的なコンピュータシステムを示す。 Ｍ１３ｍｐ１８ファージベクター配列上で識別された２２の固有領域を示す。 本明細書に記載される方法を使用してＭ１３ｍｐ１８ファージベクター配列に対して設計された固有のプローブの例を示す。 トランスポソーム複合体を使用した二本鎖ＤＮＡの一工程の（ｏｎｅ－ｓｔｅｐ）断片化及び標識化の典型的な図を示す。 別個の捕捉配列及び検出配列でのハイブリダイゼーションを介した標的核酸のハイブリダイゼーション及び検出を示す。 別個の捕捉配列及び検出配列でのハイブリダイゼーションを介した標的核酸のＦＲＥＴシグナル検出を示す。 多数のハイブリダイゼーション配列を介した標的核酸のアレイへのハイブリダイゼーションを表す。 フィルタ基板（ｆｉｌｔｅｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）上のオリゴヌクレオチドアレイにおいて濃縮される核酸の典型的な概要を表す。 典型的なコンピュータシステムを表す。 コンピュータシステムの典型的な構造を表す。 コンピュータシステムの典型的なネットワークを表す。 典型的なマルチプロセッサーコンピュータシステムを表す。 ウイルス性結核対非ウイルス性結核に関するアッセイの結果を示す。 ４つのプローブを含む反応チャンバを表し、各プローブはレポーター及びクエンチャーを含んでいる。光源への曝露に際し、後のＰＣＲはプローブを加水分解し、レポーターが蛍光信号を発することを可能にする。 ブドウ球菌のＭＲＳＥ又はＭＳＳＡの菌株を検出するときの信号増加を例示する。Ｙ軸は、「バックグラウンドの標準偏差で割られる信号」として定めされる、信号対雑音比（ＳＮＲ）を示す。この例において、ＳＮＲ＞３のバックグラウンドを持つ信号の可能性が＜０．３％であるので、株は、ＳＮＲ＞３を有する時に検出されると定められる（帰無仮説試験）。図１２はまた、２つのブドウ球菌株を区別する能力を例示する。 フローセルを通ってＩＴＰの下に遊走するＤＮＡバンドの画像を示す。 フローセルを通ってＩＴＰの下に遊走するＤＮＡバンド拡大画像を示す。図１４Ａは、入口ポートを出る蛍光標識されたサンプルＤＮＡを示す。 フローセルを通ってＩＴＰの下に遊走するＤＮＡバンド拡大画像を示す。図１４Ｂは、フローセルチャネルに集中し始めるＤＮＡバンドを示す。 フローセルを通ってＩＴＰの下に遊走するＤＮＡバンド拡大画像を示す。図１４Ｃは、フローセルチャネルに形成される、集中したＤＮＡバンドを示す。 フローセルを通ってＩＴＰの下に遊走するＤＮＡバンド拡大画像を示す。図１４Ｄは、フローセルチャネルのテーパー状部分の「咽喉部」に進入するＤＮＡバンドを示す。 フローセルを通ってＩＴＰの下に遊走するＤＮＡバンド拡大画像を示す。図１４Ｅは、咽喉部を通って移動するＤＮＡバンドを示す。 フローセルを通ってＩＴＰの下に遊走するＤＮＡバンド拡大画像を示す。図１４Ｆは、咽喉部の端部に近づくＤＮＡバンドを示す。 フローセルを通ってＩＴＰの下に遊走するＤＮＡバンド拡大画像を示す。図１４Ｇは、フローセルチャネルのアレイハイブリダイゼーション領域に進入するＤＮＡバンドを示す。 フローセルを通ってＩＴＰの下に遊走するＤＮＡバンド拡大画像を示す。図１４Ｈは、フローセルチャネルのハイブリダイゼーション領域におけるＤＮＡバンドを示す。
定義
下記の用語は、当業者によるこれら用語の理解に加えて、本明細書に使用されるような用語の意味を示すために議論される。本明細書及び特許請求の範囲で使用されるように、「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、内容が他に明確に示していない限り、複数の参照を含む場合がある。例えば、用語「細胞」は、複数の細胞、そしてその混合物も含み得る。
本明細書で使用されるように、用語「エピゲノム」は、遺伝子材料の変化、又は遺伝子材料のタンパク質発現を指し、これらは、ＤＮＡメチル化、染色質の再構成又は再形成などの配列レベルでは反映されない。「トランスクリプトーム」は、特定環境条件下で有機体によって合成される遺伝子転写産物（ｍＲＮＡ）の全体を指す。トランスクリプトームのデータセットは、限定されないが、目的の遺伝子の発現の活性化又は不活性化に関する質的且つ量的な情報を含む。トランスクリプトームはまた、ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ、ｐｉｗｉＲＮＡ、構造的ＲＮＡ、タンパク質に結合するＲＮＡ、テロメラーゼＲＮＡ、及びトランスポゾンＲＮＡを含むタンパク質に対してコードしないＲＮＡ転写物（非コードＲＮＡ又はｎｃＲＮＡ）を含む。「エクソーム」は、エクソンによって形成されたゲノムの部分を指し、これは転写時に、成熟ＲＮＡ内にとどまる配列である。「マイクロバイオーム」は、種、通常は起源となる微生物にかかわらず、生体サンプル内のゲノムの全体を指す。
本明細書で使用されるように、用語「遺伝学的特徴」は、任意のゲノム、遺伝子型、ハプロタイプ、染色質、染色体、染色体遺伝子座、染色体材料、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、対立遺伝子、遺伝子、遺伝子クラスタ、遺伝子座、遺伝的多型、遺伝子突然変異、遺伝子突然変異速度、ヌクレオチド、ヌクレオチド塩基対、一塩基多型（ＳＮＰ）、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、可変タンデムリピート（ＶＴＲ）、コピー数多型（ＣＮＶ）、マイクロサテライト配列、遺伝マーカー、配列マーカー、配列タグ付き部位（ＳＴＳ）、プラスミド、転写ユニット、転写産物、遺伝子発現レベル、遺伝子発現（例えば転写）状態、リボ核酸（ＲＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、保存領域、及び病原性島を指し、これらは上述の何れかに関連付けられるヌクレオチド配列及びコードされたアミノ酸配列を含む。後成的な特徴は、遺伝子材料の任意の特徴、即ち、全てのゲノム、ベクター及びプラスミドＤＮＡ並びに染色質であり、これは、体細胞分裂中に遺伝性であり且つ生殖細胞系列伝達において時折遺伝性であるが、ＤＮＡ配列に非変異的であり、且つそれ故に基本的に可逆的である様式で、遺伝子発現に影響を及ぼすものであり、ＤＮＡヌクレオチドのメチル化及び染色質に関連するヒストンタンパク質のアセチル化を含むがこれらに限定されない。それ故、本明細書で使用されるように、遺伝子配列データは、限定されないが、ヌクレオチド配列、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列、及びリボ核酸（ＲＮＡ）配列を含み得る。
用語「被験体に特異的な特徴」は、本明細書で使用されるように、被験体を互いに区別可能な任意の特徴又は特質を指す場合がある。場合によっては、被験体に特異的な特徴は遺伝学的特徴である。遺伝学的特徴は、上述のように、被験体から単離された核酸上に存在し得る。場合によっては、被験体に特異的な特徴は、一連の機能を区別する特徴に関連し得る。このことは、例えば、プローブを、単一の遺伝子、複数の遺伝子、又はプロモーター領域などの既知のエピゲノム機能を持つゲノム領域に対し設計することにより達成することができる。被験体に特異的な特徴は、検出装置上でプローブとして表わすことができる。被験体に特異的な特徴を表わすプローブは、被験体から得られた１つ以上の標的核酸配列に結合することができる。場合によっては、被験体に特異的な特徴は、複数の同一でないプローブを含み、各々が被験体を互いに区別することができる。場合によっては、プローブの少なくとも２つの種は各々、同じ被験体に特異的である。場合によっては、微生物の株などの特異的な被験体は、検出装置上で１つ又は複数の特徴により区別することができ、この特徴は、標的株に固有である、株を含む種に固有である、株に存在する保存領域に含まれる、或いは、株内に含まれる病原性島を認識する特徴を含む。場合によっては、被験体により更に多くの試験が必要とされることを示すことができるため、単に病原性島を識別することは、有用なものであり得る。
用語「アセンブリ」は、一連の全ての配列ストリングが由来する元の配列ストリングを再構成する目的のために、シーケンサー又は質量分析計によってもたらされた配列ストリングが互いに統合される、任意の計算プロセスであり得る。幾つかの例において、アセンブリは個別の有機体に由来する。幾つかの例において、多数の個体がアセンブリを作成するために使用され得る。幾つかの例において、アセンブリは、基準配列を使用することなく新規に作成される。幾つかの例において、アセンブリは基準配列を使用して作成される。基準配列は同じ種のゲノムであり得る。基準ゲノムは、密接に関連する種のゲノムであり得る。
用語「被験体」は、本明細書で使用されるように、通常は遺伝子材料の特異的なソースを指す。被験体は生物学的実体であり得る。生物学的実体は、例えば、細菌、ウイルス、真菌類、及び原生動物を含む、植物、動物、又は微生物であり得る。被験体は臓器、組織、又は細胞であり得る。被験体はインビボで得られる、又はインビトロで培養することができる。被験体は細胞株であり得る。被験体は培養物中で伝播され得る。被験体は罹患細胞であり得る。被験体は癌細胞であり得る。被験体は哺乳動物であり得る。哺乳動物はヒトであり得る。被験体は、遺伝子材料の特異的なソースの個別の表示を意味し得る（例えば、被験体は特定の個々のヒト又は特定の菌株であり得る）。代替的に、被験体は、遺伝子材料の一種の特異的なソースの一般的な表示であり、例えば、被験体は単一の種の全てのメンバーであり得る。例えばサンプルが完全なゲノムを含んでいない場合、被験体はゲノムの一部であり得る。
本明細書で使用されるように、用語「統合された」は、サンプルへのハイブリダイゼーション前に同一でないプローブのグループ化又は混合を指す場合がある。同一でないプローブは、プローブの同じセットの一部であり得る。代替的に、プローブの２つ以上のセットからのプローブが統合され得る。統合プローブは、均等又は不均等な量で混合することができる。
「サンプル」又は「核酸サンプル」は、核酸を含有する、又は核酸を含有すると推定される、任意の物質を指す場合がある。サンプルは被験体から得た生体サンプルであり得る。核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、例えばゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又はＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡであり得る。核酸サンプル中の核酸は、ハイブリダイズされたプライマーの伸長部に対する鋳型として機能することができる。場合によっては、生体サンプルは液体サンプルである。液体サンプルは、例えば全血、血漿、血清、腹水、精液、脳脊髄液、汗、尿、涙、唾液、頬側サンプル、腔洗浄水、又は臓器洗浄水であり得る。液体サンプルは、実質的に細胞を含まない液体サンプル（例えば血漿、血清、汗、尿、涙など）であり得る。他の場合、生体サンプルは、固形生体サンプル、例えば糞便、毛髪、爪、又は組織生検、例えば腫瘍生検であり得る。サンプルはまた、インビトロの細胞培養成分（細胞培養培地における細胞、組み換え型細胞、及び細胞構成体の増殖から結果として生じる調整培地を含むがこれらに限定されない）を含み得る。サンプルは癌細胞を含むか、又はそれに由来し得る。サンプルはマイクロバイオームを含み得る。
「複合サンプル」は、本明細書で使用されるように、２つ以上の被験体を含む、又は２つ以上の被験体の材料（例えば核酸）を含む、サンプルを指す。複合サンプルは、２つ以上の被験体の遺伝子材料を含み得る。複合サンプルは、２つ以上の被験体の核酸分子を含み得る。複合サンプルは、細菌、ウイルス、真菌類などの２つ以上の菌株の核酸を含み得る。複合サンプルは、２つ以上の分解可能な被験体（即ち、互いに区別可能な２つ以上の被験体）を含み得る。場合によっては、複合サンプルは環境から得ることができる。例えば、複合サンプルは、空気サンプル、土壌又は汚物サンプル、又は水サンプル（例えば川、湖、海、廃水など）であり得る。環境サンプルは、細菌、ウイルス、原生動物、藻類、真菌類などの１つ以上の種を含み得る。複合サンプルは無細胞ＤＮＡを含み得る。
「ヌクレオチド」は核酸を形成可能な生体分子であり得る。ヌクレオチドは、既知のプリン及びピリミジンの塩基だけでなく、修飾されている他の複素環式塩基を含む部分を有し得る。そのような修飾は、メチル化プリン又はピリミジン、アシル化プリン又はピリミジン、アルキル化リボース、又は他の複素環式化合物を含む。加えて、用語「ヌクレオチド」は、ハプテン、ビオチン、又は蛍光標識を含み、且つ従来のリボース及びデオキシリボース糖類だけでなく他の糖類も同様に含み得る、部分を備えている。修飾されたヌクレオシド又はヌクレオチドはまた、糖部分の修飾を含み、例えば、ヒドロキシル基の１つ以上がハロゲン原子又は脂肪族基で置換され、エーテルやアミンなどとして官能化される。
「ヌクレオチド」はまた、ロックド核酸（ＬＮＡ）又は架橋核酸（ＢＮＡ）を含み得る。ＢＮＡ及びＬＮＡは通常、修飾リボヌクレオチドを指し、リボース部分は、２’酸素及び４’炭素を接続する架橋により修飾される。通常、架橋は、多くの場合Ａ型二本鎖に見られる３’－エンド（Ｎｏｒｔｈ）立体構造中のリボースを「ロック」する。用語「ロックド核酸」（ＬＮＡ）は通常、ＢＮＡのクラスを指し、リボース環は、２’－Ｏ原子を４’－Ｃ原子に接続するメチレン架橋により「ロック」される。ＤＮＡ及びＲＮＡに現われる６つの一般的な核酸塩基（Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ａ、Ｕ、及びｍＣ）を含むＬＮＡヌクレオシドは、標準のワトソン－クリック型塩基対の規則に従い、それらの相補的ヌクレオシドとの塩基対を形成することができる。従って、ＢＮＡ及びＬＮＡヌクレオチドは、必要な時は常に、オリゴヌクレオチド中のＤＮＡ又はＲＮＡ塩基と混合可能である。ロックドリボース立体構造は、塩基の積み重ねと骨格の事前の編成を増強する。塩基の積み重ねと骨格の事前の編成は、重複部位の熱安定性の増加（例えばＴｍの増加）及び弁別力を生じさせることができる。ＬＮＡは、他の核酸では可能でない条件下で単一塩基のミスマッチを弁別することができる。
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」、及び「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用することができる。これらは、任意の長さのヌクレオチドの重合体形態、即ち、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの何れか、或いはそのアナログを指す。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造も有し、既知又は未知の任意の機能を実行することができる。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子フラグメントのコード領域又は非コード領域、連鎖解析から定められた遺伝子座（遺伝子座）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログなどの修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾はポリマーのアセンブリの前又は後に与えられ得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分によって妨げられ得る。ポリヌクレオチドは、標識化成分との抱合によってなど、重合の後に更に修飾され得る。
「変異体」は、核酸配列（例えば遺伝子）の正常な配列における改質であり得る。幾つかの例において、遺伝子型及び相当する表現型は、変異体に関連付けられる。他の例において、変異体の既知の機能は存在しない。変異体はＳＮＰであり得る。変異体はＳＮＶであり得る。変異体は複数のヌクレオチドの挿入であり得る。変異体は複数のヌクレオチドの欠失であり得る。変異体は突然変異であり得る。変異体はコピー数変異であり得る。変異体は構造変異であり得る。変異体は、集団における２以上の個体間の核酸偏差であり得る。
用語「標的ポリヌクレオチド」又は「標的核酸」は、本明細書で使用されるように、通常は試験中の目的のポリヌクレオチドを指す。特定の場合、標的ポリヌクレオチドは、対象であり且つ研究中の１つ以上の配列を含み得る。標的ポリヌクレオチドは例えば、ゲノム配列を含み得る。標的ポリヌクレオチドは標的配列を含む場合があり、その存在、量、及び／又はヌクレオチド配列、或いはそれらの変化は決定されることが望ましい。標的ポリヌクレオチドはゲノムの非コード領域を含み得る。
用語「ゲノム」は、生物学的有機体の遺伝学的補体を指し、用語「ゲノムデータ」及び「ゲノムデータセット」は、生物学的有機体の染色体、遺伝子、又はＤＮＡの配列情報を含む。
用語「ゲノムのデータ」は、本明細書で使用されるように、１つ以上のミトコンドリア、細胞、卵子及び精子、組織、新生物、腫瘍、臓器、有機体、微生物、ウイルス、個体、又は無細胞ＤＮＡのゲノム又はエクソーム配列、或いは任意の組み合わせ又は混合物のうち１つ以上であるデータを指し、及び更には、核酸配列情報、遺伝子型情報、遺伝子発現情報、遺伝子データ、ＤＮＡメチル化、アセチル化、又は同様のＤＮＡの修飾データを含む後成的な情報、ＲＮＡ転写、スプライシング、編集、又は処理の情報、或いは医療、健康、又は表現型のデータ、或いは栄養上、食事上、又は環境条件或いは曝露の情報、又は、任意の微生物、ウイルス、細胞、組織、新生物、腫瘍、臓器、臓器系、無細胞サンプル（例えば血清又は媒体）、個体、或いはサンプル又は個体の群の他の特質データが挙げられるが、これらに限定されない。従って、用語「ゲノム配列」は、本明細書で使用されるように、ゲノムに現われる配列を指す。ＲＮＡがゲノムから転写されるので、この用語は、有機体の核ゲノムに存在する配列の他、そのようなゲノムから転写されたＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）のｃＤＮＡ複製に存在する配列も包含する。「ゲノム配列」はまた、細胞質上、又はミトコンドリア中に現われる配列であり得る。
用語「判定すること（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）」、「測定すること（ｍｅａｓｕｒｉｎｇ）」、「評価すること（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）、「評価すること（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」、「アッセイすること（ａｓｓａｙｉｎｇ）」、及び「分析すること（ａｎａｌｙｚｉｎｇ）」は、測定の任意の形態を指すように本明細書で交換可能に使用され、且つ、１つの要素の存在の有無を判定することを含み得る。このような用語は、定量的及び／又は定質的両方の判定を含み得る。評価は相対的又は絶対的な場合がある。「～の存在を評価すること」は、何らかの存在の量を判定することの他、その存在の有無を判定することを含み得る。
用語「ゲノムフラグメント」は、本明細書で使用されるように、ゲノム、例えばヒト、サル、ラット、魚類、昆虫類、又は植物のゲノムなどの動物又は植物のゲノムの領域を指す場合がある。ゲノムフラグメントは、連結されたアダプターであり、又はそうでない場合がある。ゲノムフラグメントは、連結されたアダプター（その場合、フラグメントの一端又は両端、或いは分子の少なくとも５’末端に連結されたアダプターを有する）、又は連結された非アダプターであり得る。
用語「バーコード」は、本明細書で使用されるように、一般的にはアッセイに関する情報をコード可能なヌクレオチドの配列を指す。幾つかの例において、バーコードは固有である。バーコード配列は、調べられた（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅｄ）対立遺伝子の同一性、標的ポリヌクレオチド又はゲノム遺伝子座の同一性、サンプル、被験体又はそれらの任意の組み合わせの同一性に関連する情報をコードすることができる。バーコード配列は、プライマー、レポータープローブ、又はその両方の部分であり得る。バーコード配列は、オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端であり、或いは、オリゴヌクレオチドの任意の領域に位置し得る。バーコード配列は、非天然型、例えば試験中のサンプルに現われない配列であり得る。他の例において、自然発生の配列は、バーコード又はバーコード配列の一部として使用される。幾つかの例において、核酸が結合された結合部はバーコードとして機能し得る。幾つかの例において、配列決定アダプターは、バーコード又はバーコードの一部として機能し得る。幾つかの例において、バーコードは、過剰な標的分子、例えば目的のゲノム配列である。幾つかの例において、バーコードは、無作為に、又は半無作為に標的分子に関連付けられる。幾つかの例において、バーコードは、設計により標的分子に関連付けられる。
用語「突然変異」は、本明細書で使用されるように、一般的にゲノムのヌクレオチド配列の変化を指す。突然変異は、ＤＮＡ（例えばコピー数変形）の大きな部分を含み得る。突然変異は染色体全体（例えば異数性）を含み得る。突然変異は、ＤＮＡの小さな部分を含み得る。ＤＮＡの小さな部分を含む突然変異の例は、例えば、点変異又は一塩基多型、多数の一塩基多型、挿入（例えば、座における１つ以上のヌクレオチドの挿入）、多数のヌクレオチドの変化、欠失（例えば、座における１つ以上のヌクレオチドの欠失）、及び逆転（例えば、１つ以上のヌクレオチド配列の逆転）を含む。
本明細書に使用されるように、用語「遺伝子座」は、遺伝子、ヌクレオチド、又は染色体上の配列の位置を指し得る。本明細書に使用されるように、遺伝子座の「対立遺伝子」は、遺伝子座におけるヌクレオチド又は配列の代替的な形態を指し得る。「野生型対立遺伝子」は一般的に、被験体集団において最も高い頻度を有する対立遺伝子を指す。「野生型」対立遺伝子は一般的に疾患に関連しない。「変異対立遺伝子」は一般的に、より低い頻度の「野生型対立遺伝子」を有し、且つ疾患に関連付けられ得る対立遺伝子を指す。「変異遺伝子」は疾患に関連付けられる必要のない場合もある。用語「調べられた対立遺伝子」は、一般的に、アッセイで検出するように設計された対立遺伝子を指す。
本明細書に使用されるように、用語「一塩基多型」又は「ＳＮＰ」は、ある配列内での単一のヌクレオチドの置換によってもたらされる、一種のゲノム配列変種を一般的に指す。「ＳＮＰ対立遺伝子」又は「ＳＮＰの対立遺伝子」は、一般的に特定の遺伝子座におけるＳＮＰの代替的な形態を指す。用語「調べられたＳＮＰ対立遺伝子」は、一般的に、アッセイで検出するように設計されたＳＮＰ対立遺伝子を指す。
本明細書には、サンプル中の１つ以上の被験体を識別する能力、或いは、例えば病原性、毒性、抗生物質耐性などの、被験体に関する重要な特徴を識別する能力を持つ、新規な検出装置に関する方法及びシステムが、開示される。検出装置は、１つ以上の被験体に特異的な特徴を含む複数のプローブを備え得る。用語「被験体に特異的な特徴」は、本明細書で使用されるように、被験体を互いに区別及び識別可能な複数のプローブを指す。本発明の幾つかの態様において、被験体に特異的な特徴は、複合サンプル中の被験体を識別するために利用され得る。
被験体は、有機体の種、有機体の株、有機体の分岐群、遺伝学的変異体、病原性形質、抵抗性形質、又は有機体の種の個々のメンバーであり得る。複合サンプルは、１より多くの被験体（即ち、２つ以上の被験体）の材料を含む、生物学的又はその他の任意のサンプルであり得る。場合によっては、被験体は、ウイルス、細菌、原生動物、真菌類などの有機体である。他の場合、被験体は、組織、臓器、又はそこから由来する細胞である。組織、臓器、又は細胞は、ヒトなどの動物に由来し得る。複合サンプルは複数の細胞型を含み得る。場合によっては、複合サンプルは、腫瘍生検などの組織生検を含み得る。幾つかの例において、複合サンプルは、微生物（例えば細菌、ウイルス、真菌類など）の２つ以上の株を含む。他の例において、複合サンプルは有機体の２つ以上の種を含む。有機体は微生物であり得る。場合によっては、複合サンプルは、２つ以上の被験体の、核酸などの材料を含む。被験体に特異的な特徴は、複合サンプルに存在する１つ以上の被験体の同一性を決定するために使用することができる。本明細書中の方法及びシステムは、一種の複合サンプルに限定されない。重要な態様は、複合サンプルが少なくとも１つの区別可能な特徴を持つ、１より多くの被験体を含むということである。
複合サンプルは核酸の混合物を含み得る。核酸は１つを超える被験体に由来し得る。核酸のサンプルを生成するあらゆる方法が、本開示によって許容可能である。場合によっては、生体細胞を含む複合サンプルが得られ、生体細胞はその後、溶解されて細胞から核酸を放出する。核酸は物理的方法でも生体細胞から放出することができる。他の場合、無細胞核酸が得られる。無細胞核酸は、ヒト又は動物から、例えば血液から得ることができる。無細胞核酸は、環境からも得ることができ、例えば、核酸は生物から環境へと放出される。無細胞核酸は、例えば、ウイルスのカプシド、或いは胞子内に含まれる病原体に由来し得る。幾つかの実施形態において、複合サンプルは、臨床サンプル、法医学サンプル、環境サンプル、メタゲノムサンプル、及び食物サンプルから成る群から選択される。幾つかの実施形態において、複合サンプルはヒト由来である。
複合サンプル内の核酸は標的核酸配列を含むことができる。標的核酸配列は被験体を互いに区別する核酸配列であり得る。例えば、標的核酸配列は、被験体Ｂで見られない被験体Ａの複数のゲノムの配列であり得る。こうした標的核酸配列は、被験体Ａと被験体Ｂを含む複合サンプル中で被験体Ａの存在を識別するために利用できる。同様に、標的核酸配列は、被験体Ａで見られない被験体Ｂの複数のゲノムの配列であり得る。こうした標的核酸配列は、被験体Ａと被験体Ｂを含む複合サンプル中で被験体Ｂの存在を識別するために利用できる。場合によっては、検出装置は、被験体Ｂから被験体Ａを識別することができる（即ち、被験体Ａのみを認識するプローブを有する）、被験体Ａから被験体Ｂを識別することができる（即ち、被験体Ｂのみを認識するプローブを有する）、或いは、被験体Ａと被験体Ｂの両方を識別することができる（即ち、被験体Ａを認識するプローブと被験体Ｂを認識するプローブを有する）。
場合によっては、本明細書の方法とシステムは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１００００、又は１００００を超える被験体を区別することができる。場合によっては、検出装置は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１００００、又は１００００を超える被験体に特異的な特徴を含む。場合によっては、本明細書の方法とシステムは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１００００、又は１００００を超える被験体を区別することができる。場合によっては、検出装置は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１００００、又は１００００を超える被験体に特異的な特徴を含む。
標的核酸配列は、複合サンプル内に含まれる核酸に存在する１つ以上の核酸配列であり得る。標的配列は、サンプル内のその遺伝的補体に結合する（例えば、化学的に結合する）ように設計可能である。１つ以上の核酸配列は互いに区別可能であり、それによって、サンプル内の核酸の起原を解決する能力を与える。例えば、複合サンプルは２つを超える被験体を含み得る。個々の被験体はそれぞれ核酸を含むことがあり、それ故、複合サンプルは個々の被験体の核酸を含み得る。場合によっては、本明細書の方法とシステムは、サンプルに存在する個々の被験体を識別するために使用される。例えば、被験体Ａと被験体Ｂを含むサンプルを例に取る。サンプルは、被験体Ａと被験体Ｂの両方を起源とする核酸を含み得る。核酸は、被験体Ａと被験体Ｂを、或いはその逆を区別する少なくとも１つの標的核酸配列を含み得る。本明細書の方法とシステムは、少なくとも１つの標的核酸配列を識別するために使用可能である。この情報は、複合サンプルが被験体Ａと被験体Ｂの両方を含んでいたと判定するために使用可能である。
標的核酸
標的核酸配列は、被験体を互いに識別する、或いは抗生物質耐性又は病原性などの標的の属性を区別する、任意の核酸配列であり得る。場合によっては、複合サンプルに存在する１つを超える被験体は、実質的に同一であり、且つ標準的なマイクロアレイ技術を駆使しても解決するのが難しい場合もある、ゲノムを有する。場合によっては、１つを超える被験体は、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％同一であるゲノムを有する。場合によっては、１つを超える被験体は、微生物の１つ以上の異なる菌株、例えば、細菌、ウイルス、真菌などの１つ以上の菌株である。
標的核酸配列は１つを超える遺伝的特徴を含み得る。１つを超える遺伝的特徴は、被験体を互いに区別することができる。遺伝的特徴は、ゲノム、遺伝子型、ハプロタイプ、染色質、染色体、染色体座、染色体材料、対立遺伝子、遺伝子、遺伝子群、遺伝子座、遺伝的多型、遺伝子突然変異、一塩基多型（ＳＮＰ）、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、可変タンデムリピート（ＶＴＲ）、コピー数多型（ＣＮＶ）、マイクロサテライト配列、遺伝子マーカー、配列マーカー、配列でタグ付けされた部位（ＳＴＳ）、プラスミド、転写単位、転写生成物、遺伝子発現レベル、遺伝子発現状態を含み得る。標的核酸配列は任意の既知の遺伝的特徴も本質的に含むことができる。
標的核酸はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）を含み得る。ＤＮＡはゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡであり得る。ｃＤＮＡは、当業者に知られるようなＲＮＡの逆転写によって生成可能である。標的核酸は一本鎖又は二本鎖であり得る。場合によっては、標的核酸は修飾可能である。核酸修飾は当該技術分野で知られているものを含み、標的核酸は本質的にあらゆる修飾を含み得る。有用な修飾は、限定されないが、ビオチン又はジゴキシゲニンなどのアンカーリガンドと同様に、放射標識と蛍光標識を含む。修飾は、標的の内部に、或いは５’又は３’のいずれかの末端に置くことができる。標的修飾は、ライゲーション又はポリメラーゼによる伸長などの化学反応又は酵素反応のいずれかによって、合成後に行うことができる。
標的核酸の長さは変動し得る。標的核酸は、数十から数百、又は数千もの塩基対、或いは数万又は数十万の塩基対のサイズで変動し得る。幾つかの例において、標的核酸は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１００００、又は１００００より多くの塩基対の長さである。幾つかの例において、標的核酸は、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１００００、又は１００００より多くの塩基対の長さである。幾つかの例において、標的核酸は、多くとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１００００、又は１００００より多くの塩基対の長さである。
検出装置への適用の前に、標的核酸は任意の数のサンプル調製工程を受ける場合がある。こうした工程は、当業者に知られる任意の数の断片化、増幅、修飾、或いは調製の工程を含み得る。
標的核酸は、化学溶解、超音波処理、均質化などを含む任意の技術によって生体サンプルから放出可能である。標的核酸は、更なる処理工程の前に、当該技術分野で知られる（例えば、細胞残屑、汚染物質、又は他の材料を除去するための）任意の数の精製工程を受ける場合がある。
場合によっては、標的核酸は、検出装置への適用前に標識可能である。場合によっては、標的核酸は検出装置への適用後に標識可能である。標的核酸は多重ラベルで標識可能である。核酸ラベルは核酸の検出を可能にする任意のタグであり得る。放射標識、フルオロフォア、染料、ビオチン、酵素（例えば、ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ））などを含む任意の数のラベルを用いることができる。標的核酸は５’末端、３’末端、又はその両方で標識可能である。場合によっては、標的核酸は身体標識される。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ、ｔポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼなどの酵素的技術；或いは、過ヨウ素酸酸化、５’リン酸塩の１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）活性化、又は化学的な無作為標識（例えば、光反応性標識システム、Ｋｒｅａｔｅｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓにより市販されているＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｌｉｎｋａｇｅ Ｓｙｓｔｅｍ）などの化学的技術を含む、核酸を標識する任意の方法が使用可能である。場合によっては、いかなるラベルも必要とされず、標的の結合は、陽子の放出、表面上の化学組成の変化、光路の屈折率の変化、又は、ハイブリダイゼーション事象の直接的で電気的な検出を介して、検知可能である。
標的核酸は染料又はステインで標識可能である。核酸を標識するのに適切な染料は当該技術分野で知られるものを含み得る。染料は蛍光染料であり得る。場合によっては、緩衝液はＣｙ３である。場合によっては、緩衝液はＣｙ５である。
標的核酸は５’末端、３’末端にて標識可能であるか、又は身体標識可能である。どの方法を使用するべきかに関する決定は、必要とされる標識化の程度と、ラベルが立体障害を引き起こしてプローブとの相互作用を防ぐことができるか否かに、部分的に依存することがある。
場合によっては、核酸ラベルは核酸分子の全体にわたって無作為に組み込まれる（即ち、身体標識される）。様々な方法を用いて標的核酸を身体標識することができる。身体標識プロトコルは、標識されたヌクレオチドを標的核酸に組み込むための酵素の使用を含み得る。場合によっては、身体標識された核酸は標準的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法で生成される。この方法は２つの目的に役立つことができる：１）成長している核酸鎖へと標識されたヌクレオチドを無作為に取り込むこと；及び２）鋳型核酸を増幅させること。この方法は、標的に特異的なプライマー又は無作為のプライマーの使用を含み得る。場合によっては、標的核酸は検出装置への適用前にＰＣＲによって増幅される。
場合によっては、標識されたヌクレオチドは無作為のプライマー伸長によって無作為に組み込まれる。この例において、複数の無作為のプライマー（例えば、ヘキサヌクレオチド）を用いて、一本鎖ＤＮＡ鋳型上で第１のＤＮＡ合成を無作為に刺激する。標識されたヌクレオチドのＤＮＡ合成と無作為な取り込みは、ＤＮＡポリメラーゼＩ、又はＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片の使用を含み得る。場合によっては、標識化は、例えば、二本鎖ＤＮＡ標識プロトコルを使用することにより、標的核酸のプローブへのハイブリダイゼーションの後に生じることがある。
他の場合、標識されたヌクレオチドはローリングサークル増幅によって無作為に組み込まれる。この方法は、標的核酸分子が環状であるとき（例えば、プラスミド、バクテリオファージの環状ゲノム、ウイロイドの環状ＲＮＡゲノムなど）に、特に十分に適切であり得る。ローリングサークル増幅において、ニック（ｎｉｃｋ）は、不連続鎖と連続鎖を作成する環状核酸分子の一本鎖において生成される。環状ベクターの連続鎖は、等温の増幅反応を用いて増幅される。場合によっては、ローリングサークル増幅は、高い鎖置換活性を呈するΦ２９ＤＮＡポリメラーゼを使用する。
場合によっては、標的核酸は、検出装置のプローブへのハイブリダイゼーション前には増幅されない。
場合によっては、標的核酸は検出システムへの適用前に剪断されるか、又は断片化される。剪断方法は、当該技術分野で知られるものを含み、且つ、超音波処理、針剪断、フレンチプレッシャーセル（Ｆｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｅｌｌ）の通過、ポイント－シンク（ｐｏｉｎｔ－ｓｉｎｋ）剪断、音響剪断、制限消化、断片化酵素、又はトランスポソーム媒介性の断片化を含み得る。場合によっては、標的核酸は剪断又は断片化の前に標識される。この方法は、標識法が例えば、ローリングサークル増幅を含む場合、適切であり得る。他の場合、標的核酸の剪断は標識の前に生じる。
トランスポソームを媒介とする断片化を利用して、同時に断片を生成し、且つ検出のためにその断片を標識することができる。トランスポサーゼ（Ｔｎ５など）は、合成ＤＮＡ配列を切断して、これを他のＤＮＡ分子の５’末端へ共有結合することができる。例えば、５’標識されたフルオロフォアを合成ＤＮＡに結合することにより、ＤＮＡを同時に断片化して標識することが可能である。変性後のこの断片化及び標識された（例えば、蛍光標識された）ＤＮＡは、アレイへのハイブリダイゼーションに備えることができる。例えば、図６は、ラベル（６０３）（例えば、蛍光標識）を伴うオリゴヌクレオチドを含むトランスポソーム複合体（６０２）と相互作用する二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）（６０１）の典型的な概略図を示す。インキュベーション（６０４）の後、ラベル（６０５）を備えた断片化ｄｓＤＮＡは、トランスポソーム複合体によって生成される。その後、変性（６０６）を用いて、ハイブリダイゼーション用の標識された一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）（６０７）を生成することができる。トランスポソーム媒介性の断片化を利用して、ラベルとトランスポソームからの合成ＤＮＡの小片も含有する、二本鎖又は一本鎖（例えば、変性後）の断片化ＤＮＡを生成することができる。こうした技術は、２工程プロセスの断片化及び標識と比較して、収率と効率を増加させることができる。
核酸などのサンプル材料が濃縮及び／又は精製可能である。これにより、サンプル材料の解析が補助され得る。例えば、核酸を通過させないが、イオン、タンパク質、及び他の細胞残屑を通過させる膜（例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロース紙などの分子量遮断膜（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ））を用いて、核酸を濃縮することができる。この膜上でオリゴヌクレオチド捕捉アレイをスポットし且つ固定することで、捕捉プローブ付近の標的の濃度を増加させ、標的を捕捉プローブに持ち込むことにより、アレイへのハイブリダイゼーションを加速させることができる。電場又は流量の方向は一時的に反対にされ、又はパルスされることで、表面に平行な面の流れを助長し、ハイブリダイゼーション速度を更に改善し、ハイブリダイゼーション時間を短くすることができる。例えば、図８は、フィルタ基質（８０１）上のオリゴヌクレオチドアレイに近づけたサンプルＤＮＡ（８００）の例を示す。電場が適用されると（負（８０２）、正（８０３））、サンプルＤＮＡは電気泳動を受け、アレイに集まる。代替的に、電流を（例えば、単純な分子量遮断フィルタ膜を用いて）簡単に反対にすると、核酸を膜から溶液へ移動させることができ、これを用いて、例えば、シリカ、プラスチック、ガラス、又は別の基質上に固定されたアレイにハイブリダイズすることができる。電気泳動運動の代わりに、又は電気泳動運動に加えて、膜に対して核酸を移動させるために流量を適用することにより、濃縮を行うこともできる。
酸化的損傷の遊離ラジカル又は他の供給源の核酸への濃縮が減少するように、電極（例えば、図８の（８０２）と（８０３））を互いに一定の間隔で配置することができる。この種の設計は、核酸が、例えば濃縮工程の間に経験する酸化的損傷の量を減らすことができる。
等速電気泳動（ＩＴＰ）も、電気泳動の他の形態に加えて、サンプル材料中の核酸などの分析物を濃縮及び／又は精製するために使用することができる。分析物は核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡなど）、タンパク質、代謝産物、又はそれらの組み合わせであり得る。これにより、分析物材料の解析が補助され得る。ＩＴＰにおいて、先行電解質（分析物材料よりも高いイオン移動度を持つ）及び後端電解質（ｔｒａｉｌｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ）（分析物材料未満のイオン移動度を持つ）は、電気泳動区域において分析物材料を挟むために使用することができる。例えば、等速電気泳動はサンプル中の核酸を濃縮するために使用することができる。その後、濃縮核酸は、オリゴヌクレオチドアレイなどの検出装置、又は統合プローブを利用するアレイなどの本明細書で議論される他の検出装置を通過し、或いはその他に接触することができる。この濃縮工程は、検出のパフォーマンス（例えば感度、特異性）を改善することができる。等速電気泳動は検出装置に分析物を送達するためにも使用することができ；等速電気泳動は、分析物を検出装置又はその付近へと移動させることができる。場合によっては、先行電解質及び後端電解質には、一般的な対イオンであるが異なる共イオンがある。プラトーモード、ピークモード、及び一時的なＩＴＰ（ｔＩＴＰ）を含むがこれらに限定されない、ＩＴＰの様々なモード及び形態が利用され得る。プラトーモードにおいて、分離は階段のようなプロファイルにより特徴づけることができ、各段は、電場の増加及び導電性の減少を伴う電解質又は分析物の区域を表わす。ピークモードにおいて、分析物の量は、プラトー濃度に達するために必要な量未満であり、そのような分析物は、鮮明なガウス様ピーク分布へと濃縮することができる。ピークモードにおいて、中間体イオン移動度を持つスペーサー化合物は、隣接する分析物区域を分離するために使用することができる。一時的なＩＴＰは、ゾーン電気泳動などの方法によって後に分離可能な分析物を濃縮するために使用することができる。一時的なＩＴＰは、サンプルを後端電解質と混合し、混合物を先行電解液区域で囲むことにより、又はその逆により、達成することができる。
核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ）を含むサンプル材料は、約０．０００１ナノモル（ｎＭ）、０．０００２ｎＭ、０．０００５ｎＭ、０．００１ｎＭ、０．００２ｎＭ、０．００５ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．２ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、５００ｎＭ、１マイクロモル（μＭ）、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、５００μＭ、１０００μＭ、又はそれ以上を含む入力濃度（ｉｎｐｕｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ）の範囲で処理され得る。場合によっては、サンプル材料は、少なくとも約０．０００１ナノモル（ｎＭ）、０．０００２ｎＭ、０．０００５ｎＭ、０．００１ｎＭ、０．００２ｎＭ、０．００５ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．２ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、５００ｎＭ、１マイクロモル（μＭ）、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、μＭ、１００μＭ、２００μＭ、５００μＭ、１０００μＭ、又はそれ以上の入力濃度で処理され得る。場合によっては、サンプル材料は、多くとも約０．０００１ナノモル（ｎＭ）、０．０００２ｎＭ、０．０００５ｎＭ、０．００１ｎＭ、０．００２ｎＭ、０．００５ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．２ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、５００ｎＭ、１マイクロモル（μＭ）、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、μＭ、１００μＭ、２００μＭ、５００μＭ、１０００μＭの入力濃度で処理され得る。
ＩＴＰ区域動作のモニタリング及び制御
ＩＴＰによって濃縮及び／又は制御された核酸の区域は、様々な方法によって視覚化され、又はその他にモニタリングされ得る。ＩＴＰ区域は、例えば染料（例えば蛍光染料）で核酸を標識するによって視覚的にモニタリングされ得る。染料は、特異的に標的を標識することにより（例えば、ビオチン／ストレプトアビジン相互作用により、蛍光ハイブリダイゼーションプローブにより）、或いは、一般的に標的を標識することにより（例えば、ＹＯＹＯ－１などの挿入染料（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ｄｙｅ）により、ＤＮＡなどの核酸を広く標識する他のラベルにより）核酸に加えられ得る。
蛍光シグナルなどの視覚信号は、様々な手法によって検出することができる。装置の一部又は全ては、部分的に又は完全に半透明又は透明であってもよく、それにより視覚信号の観察又は画像化を可能にする。ＣＣＤなどの視覚的検出器も、画像化を可能とする装置に連結され得る。１つ以上の個々の検出器は、例えば、ＩＴＰ区域の位置をモニタリングするために、及び／又は本明細書で議論されるようなアレイ上でハイブリダイゼーションを検出するために、装置に連結され得る。検出器は、直接的、又は１つ以上の導波管などを介して間接的に装置に連結され得る。
ＩＴＰ区域は非視覚的手段によっても検出することができる。電気センサ（例えば電圧センサ、電流センサ）は、ＩＴＰ区域における材料（例えばＤＮＡ）の帯域を検出するために使用することができる。例えば、ＩＴＰ帯域がセンサを通過した時の電圧降下の変化を検出することができる。他の電子的及び／又は表面検出方法は、ＩＴＰ帯域の位置をモニタリングする、及び／又は本明細書に議論されるようなアレイ上のハイブリダイゼーションを検出するために使用することができる。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）はアレイ特徴へのサンプル核酸のハイブリダイゼーションを検出するために使用することができる。
ＩＴＰ区域の位置は前述の較正に基づいても評価する又は仮定することができる。例えば、与えられた条件下のＩＴＰ区域の動作を観察することができ（例えば視覚的に）、その後、ＩＴＰ区域の後の動作及び制御は、（例えば視覚的に密封した装置における）以前に観察された動作の較正に基づいて評価又は仮定され得る。
微小流体フローセル
サンプル材料の濃縮に加えて、ＩＴＰは、サンプル材料をプローブ（例えばアレイ上）に接触させるために使用することができる。幾つかの例において、ＩＴＰ帯域の幅は、ＩＴＰ帯域がアレイの長さに沿って進行した時にアレイの幅全体と接触するほど十分な幅である。他の例では、ＩＴＰ帯域はアレイほど幅広くなく、ＩＴＰ帯域は、アレイの大半又は全てと接触させられるパターンでアレイにわたってスイープされ得る。場合によっては、前記方法は、サンプル材料中の分析物をプローブに結合する工程、分析物を検出する工程、又はそれらの組み合わせを含み得る。前記方法は、前記分析物を結合及び検出する工程を含むとき、約５分、１０分、１５分、２０分、３０分、４５分、又は６０分未満で実施され得る。
様々な基板が、本明細書に開示される解析及びサンプル処理のために使用され得る。典型的な基板は、ガラス、シリコン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、及び他のポリマーを含むが、これらに限定されない。フローセル及び他の流体構造はＩＴＰに適合可能な寸法を有し得る。
場合によっては、チャネル又はフローセルの高さは、約１００マイクロメートル（μｍ）、９０μｍ、８０μｍ、７０μｍ、６０μｍ、５０μｍ、４０μｍ、３０μｍ、２０μｍ、１０μｍ、５μｍ、２μｍ、又は１μｍ以下であり得る。場合によっては、チャネル高さは、大量の流体（例えばＩＴＰ帯域の中）からプローブ（例えばアレイ表面上）までの拡散距離を減らすために選択され得る。他の場合、プローブ及びサンプルは、ＩＴＰ帯域において一緒にされ、プローブに結合したサンプルはその後、捕捉及び／又は解析され得る。
場合によっては、チャネル又はフローセルの幅は、約１マイクロメートル（μｍ）、２μｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、２００μｍ、５００μｍ、１ミリメートル（ｍｍ）、２ｍｍ、５ｍｍ、１０ｍｍ、２０ｍｍ、５０ｍｍ、１００ｍｍ、２００ｍｍ、５００ｍｍ、１０００ｍｍ、又はそれ以上であり得る。場合によっては、チャネル又はフローセルの幅は、多くとも約１マイクロメートル（μｍ）、２μｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、２００μｍ、５００μｍ、１ミリメートル（ｍｍ）、２ｍｍ、５ｍｍ、１０ｍｍ、２０ｍｍ、５０ｍｍ、１００ｍｍ、２００ｍｍ、５００ｍｍ、又は１０００ｍｍであり得る。場合によっては、チャネル又はフローセルの幅は、少なくとも約１マイクロメートル（μｍ）、２μｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、２００μｍ、５００μｍ、１ミリメートル（ｍｍ）、２ｍｍ、５ｍｍ、１０ｍｍ、２０ｍｍ、５０ｍｍ、１００ｍｍ、２００ｍｍ、５００ｍｍ、１０００ｍｍ、又はそれ以上であり得る。
場合によっては、チャネル又はフローセルの長さは、約１マイクロメートル（μｍ）、２μｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、２００μｍ、５００μｍ、１ミリメートル（ｍｍ）、２ｍｍ、５ｍｍ、１センチメートル（ｃｍ）、２ｃｍ、５ｃｍ，１０ｃｍ、２０ｃｍ、５０ｃｍ、１００ｃｍ、又はそれ以上であり得る。場合によっては、チャネル又はフローセルの長さは、多くとも約１マイクロメートル（μｍ）、２μｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、２００μｍ、５００μｍ、１ミリメートル（ｍｍ）、２ｍｍ、５ｍｍ、１センチメートル（ｃｍ）、２ｃｍ、５ｃｍ，１０ｃｍ、２０ｃｍ、５０ｃｍ、１００ｃｍ、又はそれ以上であり得る。場合によっては、チャネル又はフローセルの長さは、少なくとも約１マイクロメートル（μｍ）、２μｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、２００μｍ、５００μｍ、１ミリメートル（ｍｍ）、２ｍｍ、５ｍｍ、１センチメートル（ｃｍ）、２ｃｍ、５ｃｍ，１０ｃｍ、２０ｃｍ、５０ｃｍ、１００ｃｍ、又はそれ以上であり得る。
チャネル及びフローセルは異なる幾何学的形状を有し得る。例えば、チャネル又はフローセルは直線であり、１つ以上の曲がり又は湾曲を含み、１つ以上の狭窄又はテーパーを含み、１つ以上の拡張又は拡大を含み、及び１つ以上の蛇行状の領域を含み得る。場合によっては、チャネル又はフローセルは、狭窄、テーパー、拡張、又は拡大を含まない（随意に、チャネル入口及び出口の領域は除く）。
上流及び下流での操作のＩＴＰ制御
サンプル濃縮及びプローブとの接触に加えて、ＩＴＰは、他の上流及び／又は下流での操作のために使用することができる。典型的な操作は、限定されないが、サンプル採取、細胞溶解、入力材料（例えば細胞溶解物）からのサンプル材料（例えば核酸）の精製、サンプル濃縮、サンプル標識（例えば蛍光標識）、サンプルとプローブとの接触（例えばアレイ上）、プローブからの未結合材料の除去、プローブからのサンプル材料の回復（例えばアレイから）、及びサンプル材料の他の解析及び取扱い（例えば追加のアッセイ、及び材料の保管）を含む。
ＩＴＰ操作パラメータ
ＩＴＰは、異なる電圧、電界強度、電流、サンプル入力濃度、及び演算時間を含む様々な異なる操作パラメータで実施することができる。
ＩＴＰは、約１０ボルト（Ｖ）、２０Ｖ、３０Ｖ、４０Ｖ、５０Ｖ、６０Ｖ、７０Ｖ、８０Ｖ、９０Ｖ、１００Ｖ、１５０Ｖ、２００Ｖ、２５０Ｖ、３００Ｖ、３５０Ｖ、４００Ｖ、４５０Ｖ、５００Ｖ、５５０Ｖ、６００Ｖ、６５０Ｖ、７００Ｖ、７５０Ｖ、８００Ｖ、８５０Ｖ、９００Ｖ、９５０Ｖ、１０００Ｖ、又はそれ以上の電圧で実施することができる。場合によっては、ＩＴＰは、多くとも約１０ボルト（Ｖ）、２０Ｖ、３０Ｖ、４０Ｖ、５０Ｖ、６０Ｖ、７０Ｖ、８０Ｖ、９０Ｖ、１００Ｖ、１５０Ｖ、２００Ｖ、２５０Ｖ、３００Ｖ、３５０Ｖ、４００Ｖ、４５０Ｖ、５００Ｖ、５５０Ｖ、６００Ｖ、６５０Ｖ、７００Ｖ、７５０Ｖ、８００Ｖ、８５０Ｖ、９００Ｖ、９５０Ｖ、１０００Ｖ、又はそれ以上の電圧で実施することができる。場合によっては、ＩＴＰは、少なくとも１０ボルト（Ｖ）、２０Ｖ、３０Ｖ、４０Ｖ、５０Ｖ、６０Ｖ、７０Ｖ、８０Ｖ、９０Ｖ、１００Ｖ、１５０Ｖ、２００Ｖ、２５０Ｖ、３００Ｖ、３５０Ｖ、４００Ｖ、４５０Ｖ、５００Ｖ、５５０Ｖ、６００Ｖ、６５０Ｖ、７００Ｖ、７５０Ｖ、８００Ｖ、８５０Ｖ、９００Ｖ、９５０Ｖ、１０００Ｖ、又はそれ以上の電圧で実施することができる。
ＩＴＰは、１センチメートル当たり約１０ボルト（Ｖ／ｃｍ）、２０Ｖ／ｃｍ、３０Ｖ／ｃｍ、４０Ｖ／ｃｍ、５０Ｖ／ｃｍ、６０Ｖ／ｃｍ、７０Ｖ／ｃｍ、８０Ｖ／ｃｍ、９０Ｖ／ｃｍ、１００Ｖ／ｃｍ、２００Ｖ／ｃｍ、３００Ｖ／ｃｍ、４００Ｖ／ｃｍ、５００Ｖ／ｃｍ、６００Ｖ／ｃｍ、７００Ｖ／ｃｍ、８００Ｖ／ｃｍ、９００Ｖ／ｃｍ、１０００Ｖ／ｃｍ、又はそれ以上の電界強度で実施することができる。場合によっては、ＩＴＰは、多くとも１センチメートル当たり約１０ボルト（Ｖ／ｃｍ）、２０Ｖ／ｃｍ、３０Ｖ／ｃｍ、４０Ｖ／ｃｍ、５０Ｖ／ｃｍ、６０Ｖ／ｃｍ、７０Ｖ／ｃｍ、８０Ｖ／ｃｍ、９０Ｖ／ｃｍ、１００Ｖ／ｃｍ、２００Ｖ／ｃｍ、３００Ｖ／ｃｍ、４００Ｖ／ｃｍ、５００Ｖ／ｃｍ、６００Ｖ／ｃｍ、７００Ｖ／ｃｍ、８００Ｖ／ｃｍ、９００Ｖ／ｃｍ、１０００Ｖ／ｃｍ、又はそれ以上の電界強度で実施することができる。場合によっては、ＩＴＰは、少なくとも１センチメートル当たり約１０ボルト（Ｖ／ｃｍ）、２０Ｖ／ｃｍ、３０Ｖ／ｃｍ、４０Ｖ／ｃｍ、５０Ｖ／ｃｍ、６０Ｖ／ｃｍ、７０Ｖ／ｃｍ、８０Ｖ／ｃｍ、９０Ｖ／ｃｍ、１００Ｖ／ｃｍ、２００Ｖ／ｃｍ、３００Ｖ／ｃｍ、４００Ｖ／ｃｍ、５００Ｖ／ｃｍ、６００Ｖ／ｃｍ、７００Ｖ／ｃｍ、８００Ｖ／ｃｍ、９００Ｖ／ｃｍ、１０００Ｖ／ｃｍ、又はそれ以上の電界強度で実施することができる。
ＩＴＰは、約１マイクロアンペア（μＡ）、２μＡ、３μＡ、４μＡ、５μＡ、６μＡ、７μＡ、８μＡ、９μＡ、１０μＡ、２０μＡ、３０μＡ、４０μＡ、５０μＡ、６０μＡ、７０μＡ、８０μＡ、９０μＡ、１００μＡ、１１０μＡ、１２０μＡ、１３０μＡ、１４０μＡ、１５０μＡ、１６０μＡ、１７０μＡ、１８０μＡ、１９０μＡ、２００μＡ、２５０μＡ、３００μＡ、３５０μＡ、４００μＡ、４５０μＡ、５００μＡ、５５０μＡ、６００μＡ、６５０μＡ、７００μＡ、７５０μＡ、８００μＡ、８５０μＡ、９００μＡ、９５０μＡ、１アンペア（Ａ）、又はそれ以上の電流で実施することができる。場合によっては、ＩＴＰは、多くとも約１マイクロアンペア（μＡ）、２μＡ、３μＡ、４μＡ、５μＡ、６μＡ、７μＡ、８μＡ、９μＡ、１０μＡ、２０μＡ、３０μＡ、４０μＡ、５０μＡ、６０μＡ、７０μＡ、８０μＡ、９０μＡ、１００μＡ、１１０μＡ、１２０μＡ、１３０μＡ、１４０μＡ、１５０μＡ、１６０μＡ、１７０μＡ、１８０μＡ、１９０μＡ、２００μＡ、２５０μＡ、３００μＡ、３５０μＡ、４００μＡ、４５０μＡ、５００μＡ、５５０μＡ、６００μＡ、６５０μＡ、７００μＡ、７５０μＡ、８００μＡ、８５０μＡ、９００μＡ、９５０μＡ、１アンペア（Ａ）、又はそれ以上の電流で実施することができる。場合によっては、ＩＴＰは、少なくとも約１マイクロアンペア（μＡ）、２μＡ、３μＡ、４μＡ、５μＡ、６μＡ、７μＡ、８μＡ、９μＡ、１０μＡ、２０μＡ、３０μＡ、４０μＡ、５０μＡ、６０μＡ、７０μＡ、８０μＡ、９０μＡ、１００μＡ、１１０μＡ、１２０μＡ、１３０μＡ、１４０μＡ、１５０μＡ、１６０μＡ、１７０μＡ、１８０μＡ、１９０μＡ、２００μＡ、２５０μＡ、３００μＡ、３５０μＡ、４００μＡ、４５０μＡ、５００μＡ、５５０μＡ、６００μＡ、６５０μＡ、７００μＡ、７５０μＡ、８００μＡ、８５０μＡ、９００μＡ、９５０μＡ、１アンペア（Ａ）、又はそれ以上の電流で実施することができる。場合によっては、電流は定電圧での操作中に変動する。他の場合、電圧は定電流での操作中に変動する。
ＩＴＰは、約１秒、２秒、５秒、１０秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、２１分、２２分、２３分、２４分、２５分、２６分、２７分、２８分、２９分、３０分、３１分、３２分、３３分、３４分、３５分、３６分、３７分、３８分、３９分、４０分、４１分、４２分、４３分、４４分、４５分、４６分、４７分、４８分、４９分、５０分、５１分、５２分、５３分、５４分、５５分、５６分、５７分、５８分、５９分、６０分、７０分、８０分、９０分、１００分、１１０分、１２０分、又はそれ以上の期間にわたり実施することができる。場合によっては、ＩＴＰは、多くとも約１秒、２秒、５秒、１０秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、２１分、２２分、２３分、２４分、２５分、２６分、２７分、２８分、２９分、３０分、３１分、３２分、３３分、３４分、３５分、３６分、３７分、３８分、３９分、４０分、４１分、４２分、４３分、４４分、４５分、４６分、４７分、４８分、４９分、５０分、５１分、５２分、５３分、５４分、５５分、５６分、５７分、５８分、５９分、６０分、７０分、８０分、９０分、１００分、１１０分、１２０分、又はそれ以上の期間にわたり実施することができる。場合によっては、ＩＴＰは、少なくとも約１秒、２秒、５秒、１０秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、２１分、２２分、２３分、２４分、２５分、２６分、２７分、２８分、２９分、３０分、３１分、３２分、３３分、３４分、３５分、３６分、３７分、３８分、３９分、４０分、４１分、４２分、４３分、４４分、４５分、４６分、４７分、４８分、４９分、５０分、５１分、５２分、５３分、５４分、５５分、５６分、５７分、５８分、５９分、６０分、７０分、８０分、９０分、１００分、１１０分、１２０分、又はそれ以上の期間にわたり実施することができる。
基板及びコーティング
様々な基板が、本明細書に開示される解析及びサンプル処理のために使用され得る。典型的な基板は、ガラス、シリコン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、及び他のポリマーを含むが、これらに限定されない。基板は、チャネル、フローセル、バルブ、ウェル、トラップ、他の流体構造、導波路、電気及び電子回路、金属構造、パターン化されたドーピング（例えば半導体ドーピング）、及び他の構造を含むように、（例えば石版印刷で）改変され得る。
基板は、例えば本明細書に議論されるようなアレイに、テザー分子（ｔｅｔｈｅｒｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）（例えばヌクレオチド）を含み得る。分子は、基板に直接的又は間接的（例えば、後にウェルのアレイへと堆積されるビーズなどにより第１の基板に堆積又は関連付けられる、第２の基板に取り付けることによって）に結合され得る。
そのような基板はＩＴＰのようなプロセスに適合可能である。場合によっては、基板は、ＩＴＰなどの導電性プロセスに対し本質的に導電性である。他の場合、コーティング又は他の処理が、プロセスを可能とする又は改善するために提供され得る。例えば、コーティングは、電気的な故障を減らし、及び／又はＩＰを改善するために基板に堆積され得る。絶縁体を使用して、電場から基板（例えば、導電性又は半導電性基板）を絶縁し、それら基板上のＩＴＰを可能とする又は改善することができる。絶縁体は、二酸化ケイ素、サファイア、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）、他の酸化物、ポリマー、プラスチック、セラミック、セルロース、紙、及びテフロン（登録商標）を含むがこれらに限定されない。一例において、絶縁体層は、ビーズの充填前にビーズアレイのウェル上に堆積され、それにより絶縁破壊又は電気的な短絡を予防又は減らすことができる。コーティング（例えば絶縁体）は、約１ナノメートル（ｎｍ）、２ｎｍ、５ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、１２０ｎｍ、１３０ｎｍ、１４０ｎｍ、１５０ｎｍ、１６０ｎｍ、１７０ｎｍ、１８０ｎｍ、１９０ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍ、３５０ｎｍ、４００ｎｍ、４５０ｎｍ、５００ｎｍ、５５０ｎｍ、６００ｎｍ、６５０ｎｍ、７００ｎｍ、７５０ｎｍ、８００ｎｍ、８５０ｎｍ、９００ｎｍ、９５０ｎｍ、１マイクロメートル（μｍ）、２μｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、５μｍ、１００μｍ、又はそれ以上などの様々な厚みの基板に堆積され得る。コーティング（例えば絶縁体）の厚みは、約１ナノメートル（ｎｍ）、２ｎｍ、５ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、１２０ｎｍ、１３０ｎｍ、１４０ｎｍ、１５０ｎｍ、１６０ｎｍ、１７０ｎｍ、１８０ｎｍ、１９０ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍ、３５０ｎｍ、４００ｎｍ、４５０ｎｍ、５００ｎｍ、５５０ｎｍ、６００ｎｍ、６５０ｎｍ、７００ｎｍ、７５０ｎｍ、８００ｎｍ、８５０ｎｍ、９００ｎｍ、９５０ｎｍ、１マイクロメートル（μｍ）、２μｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、５μｍ、又は１００μｍ未満であり得る。コーティング（例えば絶縁体）の厚みは、約１ナノメートル（ｎｍ）、２ｎｍ、５ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、１２０ｎｍ、１３０ｎｍ、１４０ｎｍ、１５０ｎｍ、１６０ｎｍ、１７０ｎｍ、１８０ｎｍ、１９０ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍ、３５０ｎｍ、４００ｎｍ、４５０ｎｍ、５００ｎｍ、５５０ｎｍ、６００ｎｍ、６５０ｎｍ、７００ｎｍ、７５０ｎｍ、８００ｎｍ、８５０ｎｍ、９００ｎｍ、９５０ｎｍ、１マイクロメートル（μｍｍ）、２μｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、５μｍ、１００μｍ、又はそれ以上であり得る。
一例において、ＩＴＰは、ビーズマイクロウェルアレイ（例えばＩｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＡｒｒａｙ）上で実施される。化学蒸着法を使用して、ビーズアレイ表面上に酸化ケイ素層を作成することができ、その厚みは約５００ナノメートル（ｎｍ）である。フローセルは、再び拡張する前に、長さ約４ｃｍ、幅８００μｍ、及び高さ７５μｍの寸法、及び、約２００μｍの幅へと狭まるフローセル中央にテーパー状部分を備えて、ＰＤＭＳにおいて製造される。ＰＤＭＳフローセルの下部表面は、放電棒を使用して起動され、酸化ケイ素表面へのＰＤＭＳの結合を可能とする。フローセルの入口及び出口の端部にある２つのポートにおける白金ワイヤーは、２００Ｖの電圧に設定される。ＤＮＡの充填、濃縮、ハイブリダイゼーション、及び検出に対する総時間は、約２５分である。他の例において、フローセル寸法は、長さ約０．５～８ｃｍ、幅約２００～２０００μｍに及ぶ場合があり、酸化ケイ素の厚みは＞２５０ｎｍであり、作動電圧は約５０～４００ボルトであり、ターンアラウンド・タイム（ＴＡＴ）は約５～４５分であり得る。電流は、例えば１０～２００μＡの範囲で変動し得る。サンプル調製（ｐｒｅｐ）からの核酸サンプル（例えばゲノムＤＮＡ）の長さは、約０．０００１ｎＭ～約１００μＭの入力濃度で、約１０ベース～１０ｋｂの範囲であり得る。他の場合、核酸の長さは、約１００ｂｐ～５００ｂｐ（例えば３００ｂｐ＋／－２００ｂｐの平均）である。
ＩＴＰは、本明細書に議論されるように、表面（例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ， Ａｇｉｌｅｎｔ）上に印刷され又は結合され、或いはビーズ（例えばＩｌｌｕｍｉｎａ）に付けられたＤＮＡオリゴヌクレオチドを有する、マイクロアレイなどのプローブを含む、様々な基板上で利用することができる。多くの市販のマイクロアレイが、非常に高い処理能力での適用のために設計され；従って、これらのアレイは、多くの別個の特徴（例えばプローブスポット、ビーズ）を含み、且つ、少なくとも数ミリメートル×数ミリメートルなどの領域においてかなり大きい場合があり、多くの場合、多数のそのようなアレイは、与えられたマイクロアレイチップ上にある。そのようなアレイに従来から利用されるフローセルは一般的に、約１０マイクロリットルの大きな容積、及び大きな表面積を有している。そのようなフローセルでのＩＴＰの実施は、１ｋＶ以上の電圧を必要とする場合がある。そのような電圧での動作は、絶縁破壊などの問題を生じさせる場合があり、更には非常に厚みのある絶縁（例えばＳｉＯ２）がシリコンウェハ上に存在する。更に、大きなフローセルに関して、より大きなゲノムＤＮＡサンプルが、数マイクログラムなどの入力として要求され得る。従って、ＩＴＰは通常、そのようなシリコンベースのアレイ、又は、ＤＮＡの入力量に対するそれらの適用と共には利用されない。一方、本明細書に記載される統合プローブ手法を利用する装置は、ＩＴＰとの使用に十分に適している場合がある。本明細書に記載される統合プローブ手法などの、少量のサンプルの識別を可能にする技術は、アレイの表面上での一部のプロセスによる濃縮から、利益を得ることができる。更に、そのような手法は、上述の市販のマイクロアレイに関して、＞１００，０００のプローブと比較して少数のプローブ（例えば、～１００標的に対して～１０００の異なるプローブ）を利用することができる。この少数のプローブは、より小さなフローセル（例えば、幅＜１ｍｍ、長さ１ｍｍ、高さ＜７５μｍ）に適切に適合し得る。作動電圧が更に低くなる（例えば２００Ｖ）場合があるので、これら設計パラメータは、（例えばシリコン表面にわたり絶縁体を介した）絶縁破壊などの問題に遭遇することなくＩＴＰの使用を可能とする。
特異的な例において、ＩＴＰは、既存のＩｌｌｕｍｉｎａフローセルの代わりに新たなフローセル設計を用いて、市販のアレイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ， ２４－ｓａｍｐｌｅ ＢｅａｄＡｒｒａｙ ｃｈｉｐ）上で実行された。新たなフローセル設計は、フローセルの容積を減らし、且つ、特異的にフローセルの幅と高さを下げるように機能し、低電圧でのＩＴＰ条件を可能とした。フローセルの領域の制限によりアクセス可能なビーズの数が減り、そのため、アレイ表面上でアクセス可能なプローブ／検出器の数も減る。それにもかかわらず、十分なプローブが、サンプルを調べるのに適切な情報を提供する、本明細書に記載されるプローブセット（例えば、＜１，０００の標的、及び＜１００，０００のビーズ合計）に対してアクセス可能なままであった。
拡散に加えて様々な手段によって、核酸を検出装置に近接させることができる。上記で議論されるように、電気泳動及び／又は流量を用いて、検出装置表面又はその付近で核酸を濃縮することができる。他の手法も使用できる。例えば、検出装置表面は、（例えばプローブ特徴における）その表面の全体又は一部にわたって疎水性表面化学を有する場合があり、標的核酸は疎水性部分でタグ付けされ、核酸が表面の疎水性領域をエネルギー的に優先するようになる。別の例において、標的核酸は磁粉でタグ付け可能であり、磁場を用いてアレイ表面の方へ標的核酸を近づけることができる。
容積排除（Ｖｏｌｕｍｅ－ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ）化合物を用いて、サンプルＤＮＡなどのサンプル材料を有効に濃縮することもできる。容積排除剤（ｖｏｌｕｍｅ ｅｘｃｌｕｄｅｒ）は、占有された液体体積からサンプル材料を除外するために使用可能であり、それによって、残りの液体容積中のサンプル材料を濃縮することができる。このメカニズムは、基質へのサンプル核酸のハイブリダイゼーションなどの、サンプル材料の捕捉又は結合の加速を助けることがきる。例えば、容積排除剤はハイブリダイゼーション動力学を改善するために、ハイブリダイゼーション緩衝剤に含めることができる。容積排除剤は、例えば、限定されないが、硫酸デキストラン、フィコール、及びポリエチレングリコールを含む、ビーズ又はポリマーであり得る。容積排除剤は高分子量ポリマーであり得る。容積排除剤は、例えば、核酸の容積排除剤への結合を減らすために負に帯電させることができる。
プローブ
本明細書に開示される検出装置は、複数の統合プローブを含み得る。場合によっては、検出装置は反応チャンバを含む。場合によっては、複数のプローブは反応チャンバに統合される。場合によっては、反応チャンバは、ＰＣＲウェル、アレイスポット、ドロップレット、電極、又は微小流体チャネルである。場合によっては、電極は、金、イリジウム、白金、銅、又はこれらの組み合わせを含む。場合によっては、反応チャンバは少なくとも１つの孔を含む。他の場合、本明細書に開示される検出装置は更に複数の反応チャンバを含む。場合によっては、複数の反応チャンバは、複数のＰＣＲウェル、複数のアレイスポット、複数のドロップレット、複数の電極、又は複数の微小流体チャネルである。場合によっては、検出装置は単回用装置である。
幾つかの例において、複数の反応チャンバの各々は、プローブの１つ以上のセットのうち１つを含む。場合によっては、プローブの１つ以上のセットの各セットは、複数のプローブを含む。場合によっては、１セットのプローブ内の前記複数のプローブの各々は同一である。幾つかの例において、１セットのプローブ内の前記複数のプローブの少なくとも２つが同一である。幾つかの例において、１セットのプローブ内の前記複数のプローブの少なくとも２つが異なっている。幾つかの例において、１セットのプローブ内の前記複数のプローブの各々は異なっている。
場合によっては、前記プローブの１つ以上のセットの少なくとも１つのセットは、検出装置の表面上に固定される。場合によっては、前記プローブの１つ以上のセットの少なくとも１つのセットは、検出装置の表面上に固定されない。場合によっては、表面に固定されないプローブの少なくとも１つのセットは、溶液中にある。例えば、溶液はＰＣＲ溶液であり得る。場合によっては、ＰＣＲ溶液は複数の小滴の形態である。場合によっては、表面は固形物である。他の場合、表面は半固形物である。場合によっては、表面はガラス又はシリコンである。複数のプローブは表面化学を用いて表面に固定可能である。
１つの非限定的な例において、複数のプローブは、１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）化学を用いて、検出装置の表面に固定される。この方法において、検出装置上のカルボキシル基はＥＤＣで活性化される。活性化されたカルボキシル基は第一級アミン基と反応して、安定したアミド結合を形成することができる。この例において、検出装置の表面はビーズ、場合によっては、シリカ又はガラスビーズであり得る。複数のプローブは、５’又は３’の末端でアミノ修飾される。アミノ修飾の非限定的な例としては、５’－アミノアリル－ｄＵＴＰ、５－プロパルギルアミノ－ｄＣＴＰ、Ｎ６－６－アミノヘキシル－ｄＡＴＰ、及び７－Ｄｅａｚａ－７－プロパルギルアミノ－ｄＡＴＰを含む、１つ以上のアミノ修飾されたヌクレオチドが挙げられる。プローブは、この方法を使用して、５’又は３’の末端の何れかにて検出装置に固定可能である。場合によっては、２工程方法が利用される：１）ＥＤＣによる活性化と、その後の、２）効率を改善する、又は乾燥して安定している（アミン反応性）中間体を作製するための、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）による処置。幾つかの例において、２工程のＥＤＣ処理は、固定効率を改善するために使用される。この例において、ＥＤＣの第１の濃度を検出装置に適用可能であり、その後、ＥＤＣの後の第２の濃度を適用することができる。場合によっては、ＥＤＣの第１の濃度はＥＤＣの第２の濃度よりも低い。場合によっては、この２工程のＥＤＣ処置は、プローブ固定の効率を改善する。
検出装置は複数のプローブを含み得る。複数のプローブは、検出装置の表面上に分布され得る。検出装置は、単一の固体として物理的に結合される必要のない複数の表面を含み得る。プローブを含む表面は、例えばビーズ又は一連のビーズであり得る。ビーズは同一であり得る。ビーズはマイクロビーズであり得る。ビーズは個別に溶解可能であり得る。ビーズはビーズに特異的なバーコードを含み得る。ビーズはビーズに特異的なラベルを含み得る。ビーズはビーズに特異的な結合部位を含み得る。
マイクロアレイの活性領域又はハイブリダイゼーション領域を縮小することにより、マイクロアレイの経済問題、及び必要とされるハイブリダイゼーション時間を改善することができる。この場合、小さなマイクロアレイを製作することでコストを省き、且つ、そのより小さな活性領域によって、より濃縮されたサンプルを使用できるようになり、ハイブリダイゼーション活性を促進せる。
プローブは、核酸サンプル中に存在する標的配列を持つワトソン－クリック型塩基対の形成を可能とするオリゴヌクレオチドであり得る。プローブの長さは変動し得る。幾つかの例において、遺伝的特徴内のプローブは、長さが２０％、１０％、５％、又は１％未満変動する。幾つかの例において、プローブは同じ長さである。プローブは、数十から数百又は数千の塩基対、或いは、数万又は数十万の塩基対のサイズにさえ変動し得る。場合によっては、プローブは、約２０塩基長、約２５塩基長、約３０塩基長、約３５塩基長、約４０塩基長、約４５塩基長、約５０塩基長、約５５塩基長、約６０塩基長、約６５塩基長、約７０塩基長、約７５塩基長、約８０塩基長、約８５塩基長、約９０塩基長、約９５塩基長、約１００塩基長、約１１０塩基長、約１２０塩基長、約１３０塩基長、約１４０塩基長、約１５０塩基長、約２００塩基長、約２５０塩基長、約３００塩基長、約３５０塩基長、約４００塩基長、約４５０塩基長、約５００塩基長、約６００塩基長、約７００塩基長、約８００塩基長、約９００塩基長、約１０００塩基長、又は１０００塩基長以上である。
プローブは、被験体に特異的な特徴への複数の反応チャンバへと、又は該反応チャンバ上に分配され得る。被験体に特異的な特徴は複数のプローブを含み得る。幾つかの例において、被験体に特異的な特徴は、１０、１００、１，０００、１０，０００、又は１００，０００を超える個々のプローブを含む。被験体に特異的な特徴は複数の同一のプローブを含み得る。他の例において、被験体に特異的な特徴は複数の統合された同一でないプローブを含み得る。同一でないプローブは、様々な領域において標的核酸に結合し得る。プローブは非重複領域において標的に結合し得る。場合によっては、同一でないプローブは重複配列を有する。被験体に特異的な特徴は、少なくとも１０、１００、１，０００、１０，０００、又は１００，０００以上の同一でないプローブを含み得る。幾つかの例において、検出装置は、１０、１００、１，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、１００，０００，０００、又は１，０００，０００，０００を超える個々の被験体に特異的な特徴を含む。
被験体に特異的な特徴は、別個の反応チャンバなどの中に、個々に対処可能（例えば、検出のために個々に対処可能）となるような様式で、検出装置に分布され得る。被験体に特異的な特徴に対応する複数のプローブは、プローブの１つ以上のセットへと配置され得る。プローブの各セット内では、複数のプローブは同一であってもよく、又は互いに異なってもよい。各セット内では、複数のプローブはそれぞれ被験体に特異的な特徴を含み得る。各セット内の複数のプローブは、被験体を互いに区別する１つ以上の被験体に特異的な特徴を含み得る。場合によっては、被験体に特異的な特徴は、円形、正方形、又は長方形の領域などのアレイ上のスポット又は領域であり得る。場合によっては、被験体に特異的な特徴はビーズであり得る。他の場合、被験体に特異的な特徴はマイクロウェルプレート中のウェルであり得る。他の場合、被験体に特異的な特徴は電極であり得る。場合によっては、被験体に特異的な特徴は、特徴特異的タグにより標識された一連のプローブであり得る。特徴特異的タグは、例えば、特徴特異的バーコード、又は特徴特異的ラベルのための結合部位であり得る。幾つかの例において、特徴は複製特徴を有する。幾つかの例において、複製特徴は同一である。幾つかの例において、複製特徴は、同じ標的ポリヌクレオチドを識別するように設計される。幾つかの例において、複製特徴は、同じゲノムを識別するように設計される。幾つかの例において、複製特徴は、種内のあらゆる株を識別するように設計される。場合によっては、複製特徴は、個体を識別するように設計される。
幾つかの例において、複数のプローブの少なくとも１つは、ガイド核酸（ｇＮＡ）、核酸誘導ヌクレアーゼシステムタンパク質、又はそれらの複合体を含む。場合によっては、ｇＮＡは標的核酸に結合する。場合によっては、ガイド核酸（ｇＮＡ）：核酸誘導ヌクレアーゼシステムタンパク質の複合体は、標的核酸に結合する。幾つかの実施形態において、核酸誘導ヌクレアーゼシステムタンパク質はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質である。幾つかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ－ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、及びＣｍ５から成る群から選択される。幾つかの実施形態において、核酸誘導ヌクレアーゼシステムタンパク質は、死滅した核酸誘導ヌクレアーゼシステムタンパク質である。幾つかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は、死滅したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質である。幾つかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質はｄＣａｓ９である。幾つかの実施形態において、核酸誘導ヌクレアーゼシステムタンパク質は、核酸誘導ヌクレアーゼシステムニッカーゼタンパク質である。幾つかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムニッカーゼタンパク質である。幾つかの実施形態において、核酸誘導ヌクレアーゼシステムタンパク質は、オフターゲット結合の減少を示す。場合によっては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を開き、ｇＮＡへの標的核酸を含むＤＮＡの結合を可能にする。幾つかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は室温でｄｓＲＮＡを開く。
幾つかの実施形態において、ｇＮＡはラベルを含む。幾つかの実施形態において、ヌクレイン誘導ヌクレアーゼシステムタンパク質はラベルを含む。幾つかの実施形態において、ｇＮＡ及びヌクレイン誘導ヌクレアーゼシステムタンパク質は同じラベルを含む。幾つかの実施形態において、ｇＮＡ及びヌクレイン誘導ヌクレアーゼシステムタンパク質は異なるラベルを含む。
場合によっては、複数のプローブの少なくとも１つは検出可能なラベルで標識される。場合によっては、ラベルは、酵素、酵素基質、抗体、抗原結合フラグメント、ペプチド、発色団、ルミフォア、フルオロフォア、クロモゲン、ハプテン、抗原、放射性同位体、磁性粒子、ナノ粒子（例えば金ナノ粒子）、量子ドット、バーコード（例えば核酸バーコード）、活性部位、結合部位、酸化還元反応活性マーカー群、アプタマー、疎水性種、親水性種、結合対の１つのメンバー、ドナー染料（レポーター）、アクセプター染料（クエンチャー）、有機金属化合物、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。
場合によっては、検出可能なラベルは、レポーター、クエンチャー、又はそれらの組み合わせである。レポーターの例は、限定されないが、表１に示されるレポーターを含む。幾つかの実施形態において、任意の適切なレポーターが使用される。幾つかの例において、レポーターは、キサンテン、シアニン、スクアライン、ナフタレン、クマリン、オキサジアゾール、アントラセン、ピレン、オキサジン、アクリジン、アクリルメチン（ａｃｒｙｌｍｅｔｈｉｎｅ）、テトラピロール、又はそれらの誘導体である。幾つかの例において、キサンテンはローダミン、フルオレセイン、又はそれらの誘導体である。幾つかの例において、複数のレポーターが使用される。幾つかの例において、複数のレポーターが使用されると、複数のレポーターの各々の最大発光は、少なくとも１５ｎｍ分離される。
クエンチャーの例は、限定されないが、表２のクエンチャーを含む。幾つかの実施形態において、任意の適切なクエンチャーが使用される。
幾つかの例において、クエンチャーの吸収スペクトルは、レポーターの蛍光スペクトルと重複する。
場合によっては、検出可能なラベルは有機金属化合物である。場合によっては、有機金属化合物はフェロセン又はそのアナログである。
ラベルは、それ自体で検出可能であり、又は他の検出可能な種の結合を可能とし得る。それ自体で検出不能なラベルは、後に検出可能な種と接触され得る。例えば、標的核酸をビオチンで標識し、続いて検出のためにストレプトアビジン結合フルオロフォアに結合させることができる。別の例において、標的核酸は核酸バーコードにより標識され；続いて、核酸バーコード配列が増幅且つ検出され得る。検出様式は、限定されないが、光検出（ＦＲＥＴ、蛍光寿命及び他の光学的特性を含む）、電気的検出、磁気的検出、放射性標識検出、配列決定、サイズ検出（例えば、電気泳動分離による）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ラマン分光法、及び質量分析法を含む。
特徴間の相対的なシグナルは、特徴ごとに結合するラベルの数によって判定することができる。例えば、図２に示されるように、異なる数のフルオロフォアが特徴ごとに結合することができ、結果として相対輝度が異なる。図２は、特徴ごとに１フルオロフォア（上）、特徴ごとに１０フルオロフォア（中）、及び特徴ごとに５０フルオロフォア（下）の相対輝度を示す。
図１Ａ－Ｆは、典型的なバイオチップシステムを例示する。図１Ａは、各々が同一のプローブを含む特徴を有する４つの典型的な特徴、及びサンプル中の単一の被験体からの４つの未結合の標識された標的を図示する。故に、プローブに標的を結合することにより、各特徴からの１単位のシグナルが結果として生じる。図１Ｂは、サンプル中の単一の被験体からの４つのプローブ、及び４つの未結合の標識された標的を備えた、被験体に特異的な特徴を図示する。故に、プローブに標的を結合することにより、１つの特徴から４単位のシグナルが結果として生じる。図１Ｃは、各特徴からの１単位のシグナルを結果としてもたらす、４つの異なる特徴に結合される４つの標的を図示する。図１Ｄは、１つの特徴からの４単位のシグナルを結果としてもたらす、単一の被験体に特異的な特徴に結合されている４つの標的を図示する。図１Ｃと図１Ｄとの比較は、多数の被験体標的を対象とする複数の異なるプローブを使用するときに単一の特徴に存在し得るシグナル増幅を実証する。図１Ｅは、図１Ａ及び図１Ｃに示されるもののようなアレイパフォーマンスを結果としてもたらす、別個の特徴における固有のプローブの順序付けられた統合による特徴を図示する。図１Ｆは、図１Ｂ及び図１Ｄに示されるもののような配置を結果としてもたらす、特徴中の固有のプローブの無作為な統合による特徴を図示する。
図１１は他の典型的な検出装置を例示する。図１１は、溶液中に遊離した４つのプローブを含む反応チャンバを表し、各プローブはレポーター及びクエンチャーを含んでいる。光源への曝露に際し、後のＰＣＲはプローブを加水分解し、レポーターが蛍光を発することを可能にする。
プローブセット又は被験体に特異的な特徴内の多数の固有のプローブは、検出システムの解像度以下の領域内に位置し得る。多数の固有で順序付けられたプローブによって囲まれた領域は、検出システムの解像度未満、又は検出システムの解像度と同等であり、或いは、全ての固有のプローブによって囲まれた領域は、セット中の無作為に順序付けられた固有のプローブの少なくとも２つによって囲まれた領域が検出システムの解像度とほぼ同等又はそれ未満である限り、更に大きくなり得る。この場合、多数の固有のプローブ又は特徴からのシグナルは、１又は少数のピクセル、或いは他の解像度要素において収集又は統合され得る。このような手法は、単一の特徴へと同一でないプローブを統合するものと同様の結果を達成することができる。
参考のために、マイクロアレイ光学的検出に使用される画像化システムは、ピクセル又は解像度要素につき１マイクロメートル（μｍ）～５μｍの解像度を有し得る。典型的に、直径又は長さが５である光学的に検出されたマイクロアレイ特徴は、１μｍ～５μｍの光学的解像度が可能な光学システムを用いて画像化される。別の例は、ビーズの中心間の間隔が２μｍ離れた１μｍ径のビーズで構成されるマイクロアレイである。このアレイは、０．５～１μｍの解像度光学システムを用いて画像化され得る。
一例において、個々の固有のプローブ（例えばＤＮＡフラグメント）は、プローブセットとして基板に堆積される前に統合され、個々の固有のプローブは、例えばプローブ中心間の１０ナノメートル（ｎｍ）～１０’ｓの順で、固有のプローブ間の平均距離を持つ基板に付けることができる。このプローブセットを含む単一の特徴の大きさは、例えば直径約１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、又は５μｍであり得る。その後、例えば約１μｍの解像力を持つ画像化システムは、１ピクセル又は最大２５ピクセル、或いは他の解像度要素内の多数の個々のプローブから、シグナルを収集又は統合することができる。
幾つかの設計において、特徴は、情報を含まない特徴間の空間で配置することができ、或いは、シグナルのない特徴間の領域を含まない特徴の市松模様などの、タッチ境界（ｔｏｕｃｈｉｎｇ ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ）で順序付けることができる。例えば、他の特徴に直接隣接して配置される５μｍ平方の特徴の場合、特徴を区別するために１μｍ又は２μｍの解像度が必要とされ得る。一方で５μｍのビーズが他の５μｍのビーズにより中心間で１５μｍの間隔を空けられる場合、その後、５μｍ、又は可能なら１０μｍの分解能の撮像システムが、マイクロアレイ上で異なる特徴からシグナルを区別するよう適合され得る。
別の例において、複数の同一のプローブは、撮像システムの分解能よりもサイズが小さな第１の特徴において共にグループ化され、この特徴は、同じ被験体を標的とする他の特徴に隣接して位置付けられ、そこでは、特徴内のプローブは同一であるが、第１の特徴におけるものとは異なっている。全てのプローブが検出システムの解像力により定められる領域にほぼ等しい又はそれ未満の領域内に含まれる場合、検出器は、シグナルを全てのプローブから単一のピクセル又は解像度要素へと一体化することができる。画像化システムの解像度付近又はそれ未満のサイズの領域中の同一のプローブ型の群を統合することによって、プローブのランダムに統合されたセットと同じ恩恵を受けることができる。
検出装置は多数の被験体に特異的な特徴を含み得る。幾つかの例において、検出装置は、１０、１００、１，０００、１０，０００、又は１００，０００を超える被験体に特異的な特徴を含む。場合によっては、複数の被験体に特異的な特徴は、プローブの１つ以上のセットへと配置され、プローブの各セットは異なる被験体を識別する。
プローブは標的を結合することが可能である。プローブは標的に相補的であり得る。プローブは標的に対する親和性を有し得る。プローブは３つ全ての組み合わせであり得る。異なる被験体を対象とした特徴は異なるプローブを含み得る。幾つかの例において、非複製特徴は別の特徴を備えるプローブを共有しない。幾つかの例において、非複製特徴は、別の特徴を備える０．１％、１％、５％、又は１０％未満のそのプローブを共有する。
場合によっては、プローブの各セットは、固有のプローブ型の平均的な表現を有する。場合によっては、固有のプローブ型の平均的な表現は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、又はそれ以上である。
セット内のプローブフラグメントの総数、及びセット内の単一で固有のプローブ型の平均的な表現は、プローブセットの特異性及びプローブセットのダイナミックレンジを制御するために制御され得る。一例において、プローブの総数がおよそ１０００に限定され、且つセット中の固有のプローブ型の数が２５０である場合、個々のプローブ型の平均的な表現は約４である。第１の例において、４つの被験体細胞のＤＮＡがサンプル内に存在し、４つの被験体細胞からのゲノムＤＮＡの約９０％がサンプル調製プロセス後にサンプル内にとどまり、実質的にアレイに結合する場合、シグナル強度は最大強度の約９５％になる。同様に、２つの被験体細胞からのＤＮＡが存在し、処理され、９５％の効率でハイブリダイズされた場合、シグナル強度は最大強度の約５０％であり得る。第２の例において、被験体細胞がサンプルに存在しないが、非被験体有機体が１０００を超える細胞でサンプル中に非常に豊富であり、非被験体有機体からのＤＮＡが単一のプローブ型に一致する単一の領域を含む場合、シグナルの一致したプローブ型から生成されるシグナルは、平均して最大シグナルの約１％未満であり得る。
対照的に、上記２つの例を考慮すると、固有で個々のプローブ型の数が１０にセットされ、プローブ断片の総数が１０，０００である場合、平均プローブ表現は約１０００である。このシナリオにおいて、上記例Ａを考慮すると、シグナル強度は最大シグナルの１％未満となり、場合によっては偽陰性判定を結果としてもたらす。同じシナリオではあるが上記例Ｂを考慮すると、シグナル強度は最大シグナルの約１０％となり、場合に偽陽性判定を結果としてもたらす。その後、検出の下限は、検出可能な標的細胞に関して、システムの特異性、即ち、セット内のプローブの１つ以上における結合誤差により偽陽性コールを拒絶する能力を増大するために損なわれる場合がある。
幾つかの態様において、被験体に特異的な特徴中のプローブの総数は制御される。被験体に特異的な特徴中のプローブの総数を制御する方法は、限定されないが、合計特徴サイズを制御する工程と、被験体に特異的な特徴内の個々のプローブ間隔を制御する工程と、を含む。
幾つかの態様において、プローブは、偽陽性を検出するように設計され得る。例えば、プローブはプローブセットを設計することにより設計することができ、プローブセット内の個々のプローブは、他のプローブセット中の個々のプローブにミスマッチする１つ以上の塩基と共に設計される。場合によっては、プローブセットは相補的である。他の場合、プローブセットは相補的ではない。別の例において、プローブセットは、多数の類似した株を有する被験体有機体を探すように設計され得る。この例において、標的でないが１つ以上の個々の固有の特性を備えた標的のゲノムに非常に近いゲノムを有する株内に含まれる、個々の配列を検出するために、プローブセットが追加され得る。
プローブセットの設計は、起こり得る偽陽性の挙動についてより多く学ぶために、経験的スクリーニング工程も含み得る。この工程は、自然に見出され且つハイブリダイゼーション活性に含まれる非被験体材料の一部であり得る、様々な型のゲノムＤＮＡに対する制御を追加する工程に基づき得る。これらプローブセットは、別個に又はセットとしてスクリーニングされ得る。
検出装置の特徴（例えば、アレイスポット、電極、ウェル）は、それぞれ異なることもあり、限定されないが、異なる数のプローブ、異なる型のプローブ、異なる被験体に特異的な特徴、固有のプローブの異なる平均的な表現などが挙げられる。非限定的な例において、検出装置は、多数の被験体に特異的な特徴を検出するために複数の反応チャンバを含み得る。各被験体に特異的な特徴は、プローブのセットを含む場合があり、各セットが複数の固有のプローブを含む。幾つかの特徴において、プローブのセットは、検出装置の感度を測定するために使用することができる、標的被験体に関する固有のプローブの低い平均的な表現を含み得る。同じ検出装置上の他の特徴において、プローブのセットは、サンプル中の標的核酸の存在量を測定するために使用することができる、同じ標的被験体に関する固有のプローブの高い平均的な表現を含み得る。特徴の任意の数の感度及び／又は存在量が、検出装置へと設計され得る。
検出装置は、（例えば２つの異なるマイクロバイオームのサンプルからの）異なるソースのハイブリダイゼーション強度の連続比較のために、多数のプロービング実験を受ける場合がある。例えば、検出装置は多数の連続ハイブリダイゼーション反応、及び随意に多数の読み取り反応（ｒｅａｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を受ける場合があり、各反応は、異なるプローブセットの特性に対して最適化されている。
プローブは、ポリヌクレオチド（標的核酸又は標的）を標的とするようハイブリダイズするために設計され得る。標的ポリヌクレオチドはゲノム配列であり得る。標的ポリヌクレオチドはゲノムの非コード領域であり得る。標的はゲノム特徴であり得る。標的はミトコンドリアＤＮＡであり得る。標的はプラスミドからのＤＮＡであり得る。標的は変異体であり得る。標的は、ゲノムの保存領域、又は病原性に関連する領域であり得る。
標的は、別のゲノムと区別可能なゲノムの領域であり得る。標的は、被験体の集団内の被験体に固有のポリヌクレオチドであり得る。標的は、そのマイクロバイオーム内に表現された特定の種とは別個の、マイクロバイオーム内のポリヌクレオチドであり得る。
プローブ設計の典型的なプロトコルは以下のとおりである。第一に、長さ基準（例えば３５塩基）をプローブセットに対して選択する。第二に、選択された長さのｋ－ｍｅｒのセットは、被験体のゲノムを通って連続して進むことにより、標的ゲノムから作成される。第三に、ｋ－ｍｅｒを、同じ種類の他のゲノムと比較する（例えばＢＬＡＳＴによって）。第四に、ヒト、細菌、ウイルス、及びその他などの公的に入手可能な全ての他のゲノム（即ち、同じ種ではない）と、ｋ－ｍｅｒを比較する（例えばＢＬＡＳＴによって）。場合によっては、第三及び第四の工程は共に実行可能であるが、幾つかの種（例えばＥ．ｃｏｌｉ）に対しては非常に小さなセットしか結果としてもたらすことができない。第五に、固有の候補のｋ－ｍｅｒのショートリストを作成する。加えて、これら固有のプローブの中央の塩基は、各直交塩基（１ｋ－ｍｅｒは結果として３つのミスマッチｋ－ｍｅｒをもたらす）に変更することができ、ミスマッチｋ－ｍｅｒはまた、（例えばブラスト（ｂｌａｓｔｉｎｇ）を介して）公に入手可能な全ての他のゲノム、及び／又は同じ種の他のゲノムと比較することができる。第六に、自己相補性（ｓｅｌｆ ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｉｔｙ）（即ち、プローブがそれ自体に結合するかどうか）に関して候補を試験する。第七に、融解温度を一本鎖の自由エネルギーに基づいて評価する。第八に、ｋ－ｍｅｒを、固有性のレベル（例えば固有の配列のパーセント）に基づいてランク付ける。更に、ｋ－ｍｅｒは、ＧＣ含量などの他の特徴に関してフィルタリングされ得る。例えば、場合によっては、＜６０％のＧＣ含量を有するｋ－ｍｅｒのみが含まれる。第九に、同じ種類の選択されたゲノムへとハイブリダイズすることにより、候補を経験に基づいて試験する。第十に、これら結果に基づいて、最終候補の統合を選択する。
プローブは、既知の核酸配列に相補的になるように設計することができる。場合によっては、被験体のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの配列を判定するために、プローブを設計する前に配列決定され得る。一旦、ポリヌクレオチドが配列決定されると、プローブは被験体のポリヌクレオチドを標的とするように設計することができる。場合によっては、被験体のポリヌクレオチドは、被験体のゲノムに見出される配列を含む。この例において、被験体のゲノムは配列決定され、プローブはゲノム内の標的ポリヌクレオチドに対して設計され得る。幾つかの例において、標的のリストは、２人以上の被験体間の非重複ゲノム領域を判定することにより生成され得る。場合によっては、標的はアセンブリを比較することにより識別される。配列決定法は、キャピラリー配列決定、次世代配列決定、サンガー配列決定、合成による配列決定、単一分子ナノポア配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ナノポアの流動を制限することによる配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｎａｎｏｐｏｒｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）、又はそれらの組み合わせを含み得る。合成による配列決定は、可逆的な転写終結配列決定、前進的な単一分子配列決定、連続的なヌクレオチドフロー配列決定（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｆｌｏｗ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、又はそれらの組み合わせを含み得る。連続的なヌクレオチドフロー配列決定は、パイロシークエンシング、ｐＨ媒介配列決定、半導体配列決定、又はそれらの組み合わせを含み得る。１つ以上の配列決定反応の実施は、非標的配列決定（ｕｎｔａｒｇｅｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（例えばゲノム全体の配列決定）、又は標的配列決定（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（例えばエクソーム配列決定）を含む。
配列決定法は、マクサム－ギルバート法（Ｍａｘｉｍ－Ｇｉｌｂｅｒｔ）、連鎖停止反応、又はハイスループットシステムを含み得る。代替的に又は付加的に、配列決定法は、Ｈｅｌｉｏｓｃｏｐｅ（商標）単一分子配列決定、ナノポアＤＮＡ配列決定、Ｌｙｎｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓの大規模並列シグネチャ配列決定（ＭＰＳＳ）、４５４パイロシークエンシング、単一分子リアルタイム（ＲＮＡＰ）配列決定、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）配列決定、ＳＯＬｉＤ配列決定、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）、イオン半導体配列決定、単一分子ＳＭＲＴ（商標）配列決定、ポロニー配列決定、ＤＮＡナノボール配列決定、ＶｉｓｉＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ手法、又はそれらの組み合わせを含み得る。代替的又は付加的に、配列決定法は、限定されないが、Ｉｌｌｕｍｉｎａにより提供されたＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩｘ、ＨｉＳｅｑ、ＮｅｘｔＳｅｑ、及びＭｉＳｅｑ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により提供されたＰａｃＢｉｏ ＲＳシステムなどのＳｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ（ＳＭＲＴ（商標））技術、及びＳｏｌｅｘａ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）により提供されたＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（商標）シークエンサーなどのＴｒｕｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ｔＳＭＳ（商標））技術、Ｇｅｎｉａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．により開発されたナノポアベースの配列決定プラットフォーム、並びにＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ ＭｉｎＩＯＮを含む、１つ以上の配列決定プラットフォームを含む。
場合によっては、配列又は遺伝子発現のデータベースをクエリして、標的被験体の既知の核酸配列を識別する。配列又は遺伝子発現のデータベースの非限定的な例は、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋ、ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＥＭＢＬ）、ｔｈｅ ＤＮＡ ＤａｔａＢａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）、ＥＮＳＥＭＢＬ、ｔｈｅ Ａｓｈｂｙａ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＡＧＤ）、ＢｉｏＣｙｃ、ＣｌｅａｎＥｘ、ＣＹＧＤ、Ｄｉｃｔｙｂａｓｅ、ＥｃｈｏＢａｓｅ、ＥｃｏＧｅｎｅ、ｅｕＨＣＶｄｂ、ＥｖｏＴｒａｃｅ、ＦｌｙＢａｓｅ、ＧｅｎｅＣａｒｄｓ、ＧｅｎｅＤＢ、ＧｅｎｅＦａｒｍ、ＧｅｎｏＬｉｓｔ、Ｇｒａｍｅｎｅ、ＨＧＮＣ、ＨＩｎｖ－ＤＢ、ＨＯＧＥＮＯＭ、ＫＥＧＧ、ＭａｉｚｅＧＤＢ、ＭＥＲＯＰＳ、ＭＧＤ、ＮＭＰＤＲ、ＮＣＢＩ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｂ、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ、ＰＡＮＴＨＥＲ、ＰＣＣＤＢ、ＰｅｒｏｘｉＢａｓｅ、Ｐｆａｍ、ＰｈｏｓｐｈｏＳｉｔｅＰｌｕｓ、ＰｌａｓｍｏＤＢ、ＰｐｔａｓｅＤＢ、ＰｓｅｕｄｏＣａｐ、ＲＧＤ、ＳＧＤ、ＴＡＩＲ、ＴＩＧＲ／ＳＣＶＩ、ＵｎｉＧｅｎｅ、ＶｅｃｔｏｒＢａｓｅ、ＷｏｒｍＢａｓｅ、及びＺ－ＦＩＮを含む。
場合によっては、複数のプローブの少なくとも１つはペイロード分子を含む。他の場合、複数のプローブの少なくとも１つは少なくとも２つのペイロード分子を含む。場合によっては、ペイロード分子はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はその誘導体である。幾つかの実施形態において、複数のプローブの少なくとも２つは異なるペイロード分子を含む。幾つかの実施形態において、異なるペイロード分子は異なるサイズである。幾つかの実施形態において、複数のプローブの少なくとも２つは、異なる数のペイロード分子を含む。幾つかの実施形態において、プローブは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上のペイロード分子を含み得る。例えば、２つのＰＥＧ分子が１つのプローブのセットの各プローブに付けられ、３つのＰＥＧ分子がプローブの第２のセットの各プローブに付けられる場合がある。
場合によっては、プローブは合成核酸スキャホールドに結合される。場合によっては、ペイロード分子は合成核酸スキャホールドに結合される。
幾つかの実施形態において、本明細書に記載される検出装置は、第２のプローブの１つ以上のセットを更に含み、前記第２のプローブの１つ以上のセットの各セットは複数の第２のプローブを含み、前記第２のプローブの１つ以上のセットの各セットは、標的核酸付近の核酸の領域に結合する。
幾つかの実施形態において、標的核酸付近の核酸の領域は、標的核酸の上流又は下流にある場合がある。幾つかの実施形態において、標的核酸付近の核酸の領域は、標的核酸から１０ｂｐ未満分離され得る。幾つかの実施形態において、標的核酸付近の核酸の領域は、標的核酸から１０ｂｐ未満、２０ｂｐ未満、３０ｂｐ未満、４０ｂｐ未満、５０ｂｐ未満、又は１００ｂｐ未満分離され得る。
場合によっては、第２のプローブは検出装置の表面に固定される。幾つかの実施形態において、検出装置の表面は電極である。幾つかの例において、電極は、金、イリジウム、白金、銅、又はこれらの組み合わせを含む。幾つかの例において、検出装置は更に複数の電極を含む。場合によっては、検出装置の表面はアレイである。
他の場合、第２のプローブは検出装置の表面に固定されない。
幾つかの例において、複数の第２のプローブの少なくとも１つは、ガイド核酸（ｇＮＡ）、核酸誘導ヌクレアーゼシステムタンパク質、又はそれらの複合体を含む。場合によっては、ｇＮＡは標的核酸に結合する。場合によっては、ガイド核酸（ｇＮＡ）：核酸誘導ヌクレアーゼシステムタンパク質の複合体は、標的核酸に結合する。幾つかの実施形態において、核酸誘導ヌクレアーゼシステムタンパク質はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質である。幾つかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ－ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、及びＣｍ５から成る群から選択される。幾つかの実施形態において、核酸誘導ヌクレアーゼシステムタンパク質は、死滅した核酸誘導ヌクレアーゼシステムタンパク質である。幾つかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は、死滅したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質である。幾つかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質はｄＣａｓ９である。幾つかの実施形態において、核酸誘導ヌクレアーゼシステムタンパク質は、核酸誘導ヌクレアーゼシステムニッカーゼタンパク質である。幾つかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムニッカーゼタンパク質である。幾つかの実施形態において、核酸誘導ヌクレアーゼシステムタンパク質は、オフターゲット結合の減少を示す。場合によっては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を開き、ｇＮＡへの標的核酸を含むＤＮＡの結合を可能にする。幾つかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は室温でｄｓＲＮＡを開く。
幾つかの実施形態において、ｇＮＡはラベルを含む。幾つかの実施形態において、ヌクレイン誘導ヌクレアーゼシステムタンパク質はラベルを含む。幾つかの実施形態において、ｇＮＡ及びヌクレイン誘導ヌクレアーゼシステムタンパク質は同じラベルを含む。幾つかの実施形態において、ｇＮＡ及びヌクレイン誘導ヌクレアーゼシステムタンパク質は異なるラベルを含む。
場合によっては、複数の第２のプローブの少なくとも１つは、少なくとも１つの検出可能なラベルで標識される。場合によっては、ラベルは、酵素、酵素基質、抗体、抗原結合フラグメント、ペプチド、発色団、ルミフォア、フルオロフォア、クロモゲン、ハプテン、抗原、放射性同位体、磁性粒子、ナノ粒子（例えば金ナノ粒子）、量子ドット、バーコード（例えば核酸バーコード）、活性部位、結合部位、酸化還元反応活性マーカー群、アプタマー、疎水性種、親水性種、結合対の１つのメンバー、ドナー染料（レポーター）、アクセプター染料（クエンチャー）、有機金属化合物、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。
方法
幾つかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、複数の異なる被験体を含むサンプル中の標的被験体を識別するための方法である。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、複数の異なる被験体を含むサンプル中の複数の複数の標的被験体を識別するための方法である。幾つかの実施形態において、標的被験体は少なくとも１つの標的核酸を含む。幾つかの実施形態において、複数の標的被験体は複数の標的核酸を含み、複数の標的被験体の各々は少なくとも１つの標的核酸を含む。
幾つかの態様において、本明細書に記載される方法は、複数の異なる被験体を含むサンプルを提供する工程を含む。場合によっては、サンプルは、複数の異なる被験体に由来する複数の核酸を含む。場合によっては、複数の核酸は、複数の異なる被験体の少なくとも２つ以上から得られる少なくとも１つの標的核酸を含む。
幾つかの態様において、前記方法は、複数の被験体から核酸を抽出する工程を更に含む。幾つかの態様において、前記方法は、複数の被験体から抽出された核酸を断片化する工程も含む。任意の追加の処理工程が、検出装置への適用前に核酸に対して実行され得る。場合によっては、核酸は、検出装置へのハイブリダイゼーション前に修飾され得る。例えば、本明細書に記載されるように核酸を標識することができる。付加的に、又は代替的に、例えば、捕捉プローブの使用、又は増幅工程によって、標的核酸を富化することができる。他の例において、非標的核酸は、ハイブリダイゼーション前にサンプルから枯渇され得る。
更なる態様において、前記方法は検出装置へ複数の核酸をハイブリダイズさせる工程を含む。本明細書に記載されるように検出装置を設計することができる。ハイブリダイゼーション後、前記方法は、任意の数の洗浄工程を更に含み得る。例えば、検出装置のプローブへ核酸をハイブリダイズさせた後、ハイブリダイズされない核酸を除去するために、例えば緩衝液又は洗浄液で検出装置を１回以上洗浄することができる。ハイブリダイズされない核酸は、更なる工程のために、廃棄又は収集され得る。
幾つかの態様において、ハイブリダイズした核酸は、例えば、電気伝導度、容量、又は抵抗の変化を介して検出することができる。場合によっては、検出装置は画像化される。幾つかの例において、検出前に検出装置に読み取り緩衝液（ｒｅａｄ ｂｕｆｆｅｒ）を加える。読み取り緩衝液は、ハイブリダイズした核酸に適用すると検出可能なシグナルを生成する試薬を含み得る。他の例において、核酸分子は検出可能に標識される。
幾つかの態様において、追加の特異性の工程を追加することができる。一例において、ハイブリダイゼーション後のライゲーション工程は、単一塩基のミスマッチを区別することができる。特異性はまた、捕捉、検出、又はその両方に対する追加のハイブリダイゼーション工程を加えることによって増大され得る。例えば、図７Ａは、捕捉配列（７０２）、及び、隣接する又は近隣の検出配列（７０３）を含む標的核酸（７０１）を示す。捕捉オリゴヌクレオチド（７０５）（例えば、捕捉配列に相補的な配列）を有するアレイ基板（７０４）を用いて、標的核酸にハイブリダイズしそれを捕捉（７０７）することができる。検出オリゴヌクレオチド（７０６）（例えば、蛍光標識されたもの）を用いて、標的核酸の検出配列にハイブリダイズ（７０８）させて、標的核酸の検出を可能にすることができる。検出オリゴヌクレオチドは、非標識標的核酸を有する遊離溶液中に存在し得る。標的核酸への検出オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、アレイ上での標的核酸の捕捉の前、最中、又は後に行うことができる。検出オリゴヌクレオチドは、完全に（又はほぼ完全に）相補的配列にハイブリダイズすることができる。検出は、迅速にハイブリダイズすることができるように、比較的高い濃度で存在し得る。捕捉配列及び検出された配列は近くにあるので、これらの２つの配列がＤＮＡの小さな断片上で同時発生する可能性は低くなり、それ故、検出されたシグナルが非特異的である可能性が低くなる。
場合によっては、捕捉配列及び検出配列は、それらが標的核酸の別々の断片に位置する可能性を減少させるために十分に密接に配置される。
捕捉配列及び検出された配列が隣接している場合、エネルギー移動色素の組合せ（例えばＦＲＥＴ）の使用によりバックグラウンドを減少させることができる。一例において、図７Ｂに示されるように、ドナー色素は捕捉オリゴ（７１５）の３’末端上にあり、アクセプター色素は検出オリゴヌクレオチド（７１６）の５’末端上にある。捕捉配列（７１２）及び検出された配列（７１３）を含む標的核酸（７１１）は、アレイ基板（７１４）上で捕捉することができる。捕捉オリゴヌクレオチド（７１７）及び検出されたオリゴヌクレオチド（７１８）の両方の標的核酸へのハイブリダイゼーションは、ドナー及びアクセプター色素を互いのＦＲＥＴ距離へと運ぶことができる。一旦、ＦＲＥＴ距離内に入ると、励起光（７１９）はＦＲＥＴドナーを励起して、次に共鳴エネルギー移動を介してＦＲＥＴアクセプターを励起し、ＦＲＥＴシグナル（７２０）の生成を可能にする。ドナー色素及びアクセプター色素の位置及び位置決めは変更可能である。例えば、ドナー色素は検出オリゴヌクレオチド上にあり、アクセプター色素は捕捉オリゴヌクレオチド上にあってもよい。色素は、捕捉オリゴヌクレオチド以外の位置でアレイ表面に結合することができる。これらの考えは、同じ特徴の多数の捕捉遺伝子座に対してスケーラブルである（ｓｃａｌａｂｌｅ）。
複数の捕捉及び／又は検出配列を単一の標的核酸に用いることができる。例えば、図７Ｃは、３つの捕捉配列（７３２）、（７３３）、（７３４）を含む標的核酸（７３１）の典型的な概略を示す。アレイ基板（７３５）は同様に、１つの特徴内に３つの捕捉オリゴヌクレオチド（７３６）、（７３７）、（７３８）を含む。ハイブリダイゼーション（７３９）の後、捕捉配列の各々は、対応する捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。捕捉配列の全てよりも少ない配列のハイブリダイゼーションが、標的核酸をアレイに結合したまま維持して分析の特異性を高めるには不十分となるように、局所条件（例えば、緩衝液組成、温度、ｐＨ）を構成することができる。複数の捕捉配列は、正しい標的配列が存在する場合には協調的に作動可能であるが、相互作用が非特異的である場合には独立して作動する。一旦、領域が捕捉されると、他の隣接する領域は迅速に捕捉され、（例えば、捕捉配列の局所的な高濃度により）除去するのが比較的困難となる場合がある。
同様に、複数の検出配列及び対応する検出オリゴヌクレオチドは、全ての検出オリゴヌクレオチドの存在が陽性シグナルに対して必要とされるように利用され得る。一例において、各検出オリゴヌクレオチドは異なる発光波長を有し、シグナルは、陽性シグナルを記録するために異なる発光波長ごとに検出される。別の例において、検出オリゴヌクレオチドのＦＲＥＴ対を使用することができ、標的核酸上の検出配列へのハイブリダイゼーションにより、それらを互いのＦＲＥＴ距離内に運ぶことができる。異なる検出オリゴヌクレオチドを使用して異なる特性を認識することができる。例えば、１つの検出オリゴヌクレオチドを用いて被験体の同一性（例えば、種、株、又は個体）を示すことができ、一方、別の検出オリゴヌクレオチドを用いて、被験体の遺伝子、突然変異、又は他の特徴（例えば、抗生物質耐性、ビルレンス）を示すことができる。
幾つかの態様において、元のサンプルに存在する被験体の同一性は、サンプル中の核酸の存在の検出に基づいて決定され得る。場合によっては、特定の被験体に対する標的が、特定の株を検出するように設計され得る。場合によっては、標的は、被験体の種に対する、又は、病原性に関連する保存領域を表現するなどの他の方法で固有である被験体内に含まれる他の領域に対する、プローブを含み得る。場合によっては、標的は、特定の個人などの、特定の個体を区別可能なプローブを含み得る。個々のプローブセットは特定の個体を一意的に識別することができる。他の場合、個体の識別は固有ではない場合もあるが、固有性のレベルに基づいて有用なコール信頼水準（ｃａｌｌ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｌｅｖｅｌ）を提供することができる。場合によっては、個体コールの信頼水準は、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９６％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、又は９９．９９９％であり得る。場合によっては、個体コールの信頼水準は、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９６％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、又は９９．９９９％であり得る。場合によっては、個体コールの信頼水準は、多くとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９６％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、又は９９．９９９％であり得る。
場合によっては、結果がレポートに提供される。そのレポートは、元のサンプル中の複数の被験体から識別された被験体を列挙することができる。被験体が、株特異的特徴、種特異的特徴、及び被験体内に存在する保存領域からなる特徴などの複数の特徴によって表現される場合、レポートはこれら他の特徴も検出されたかどうかを列挙することができる。次いで、最終的な陽性コールは、被験体に関連付けた特徴が全て検出されたか、全く検出されなかったか、一部が検出されたかどうかに基づいて計算された信頼水準に基づき得る。
幾つかの態様において、前記方法は、検出後に完全なサンプルを保存する能力を含む。これは、例えば、サンプル調製プロセスの時点でサンプルをＡサンプルとＢサンプルとに分離することによって達成することができる。Ａサンプルは、完全なサンプル調製プロセスを進めることができ、Ｂサンプルは、後の処理のためにリザーバに転用することができる。別の例において、サンプルのハイブリダイズされない部分は、例えば、ハイブリダイズされない核酸を除去するために検出装置を洗浄することによって、ハイブリダイゼーションプロセス後にリザーバに転用され得る。また別の例において、ハイブリダイズされた核酸は、後のクエリのために、脱ハイブリダイズ（ｄｅ－ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ）され、且つリザーバに転用され得る。
本開示の技術は、工程の一部又は全部に対して自動化された操作を使用して実施することができる。例えば、場合によっては、ユーザーが行う唯一の工程は、サンプルの充填であり、流体の取り扱い、アッセイ、検出、及び結果の報告などの他の全ての工程は、自動的に行われる。他の場合、サンプルの充填でさえ自動的に行うことができる。例えば、研究所の自動化機器又は環境サンプリング機器を使用して、解析用のデバイスにサンプルを提供することができる。
検出
本開示の幾つかの態様において、検出装置のプローブへの標的核酸の結合が検出される。検出は、当業者に既知の任意の方法を包含し得る。場合によっては、検出は、標的核酸分子、プローブ、又はその両方に存在する検出可能なラベルを検出することを含む。他の場合、検出は、標的核酸分子とプローブとの相互作用に基づいて生成されるシグナルを検出することを含む。幾つかの実施形態において、シグナルは、蛍光シグナル、電気化学シグナル、又は一定の電流インピーダンスである。
ラベルは、それ自体で検出可能であり、又は他の検出可能な種の結合を可能とし得る。それ自体で検出不能なラベルは、後に検出可能な種と接触され得る。例えば、標的核酸をビオチンで標識し、続いて検出のためにストレプトアビジン結合フルオロフォアに結合させることができる。別の例において、標的核酸は核酸バーコードにより標識され；続いて、核酸バーコード配列が増幅且つ検出され得る。検出様式は、限定されないが、光検出（ＦＲＥＴ、蛍光寿命及び他の光学的特性を含む）、電気的検出、磁気的検出、放射性標識検出、配列決定、サイズ検出（例えば、電気泳動分離による）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ラマン分光法、及び質量分析法を含む。
場合によっては、シグナルは蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づくシグナルである。この例において、標的核酸分子及びプローブの両方が１つ以上の蛍光ラベルで標識される。１つ以上の蛍光ラベルは、１つ以上のＦＲＥＴ対であり得る。１つ以上のＦＲＥＴ対は、少なくとも１つのＦＲＥＴドナー（レポーター）及び少なくとも１つのＦＲＥＴアクセプター（クエンチャー）を含むことができる。場合によっては、ＦＲＥＴドナーは標的核酸分子に付着し、ＦＲＥＴアクセプターはプローブに付着する。他の場合、ＦＲＥＴアクセプターは標的核酸分子に付着し、ＦＲＥＴアクセプターはプローブに付着する。他の場合、ＦＲＥＴアクセプター及びＦＲＥＴドナーはプローブに付着する。ＦＲＥＴドナー及びアクセプターは、標的核酸分子及びプローブの何れかの末端（３’又は５’）に付着し得る。場合によっては、ＦＲＥＴドナー（レポーター）は表１に示されるものなどの任意の適切なレポーターである。場合によっては、ＦＲＥＴアクセプター（クエンチャー）は表２に示されるものなどの任意の適切なクエンチャーである。場合によっては、ＦＲＥＴドナーはＣｙ３であり、ＦＲＥＴアクセプターはＣｙ５である。ＦＲＥＴ対の他の非限定的な例は、ＦＩＴＣ／ＴＲＩＴＣ、ＥＧＦＰ／Ｃｙ３、ＣＦＰ／ＹＦＰ、及びＥＧＦＰ／ＹＦＰを含む。
場合によっては、前記方法は更に、検出装置を光源に晒す工程を含む。場合によっては、光源は蛍光源である。光源への曝露は結果として、レポーターからクエンチャーへのエネルギー伝達をもたらす。場合によっては、検出は更に、標的核酸を含む核酸配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行する工程を含む。幾つかの例において、ＰＣＲはデジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）である。幾つかの例において、デジタルＰＣＲはデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）である。場合によっては、ＰＣＲの実行は結果として、プローブの１つ以上のセットが標的核酸に結合した時にプローブの１つ以上のセットの加水分解をもたらす。プローブの１つ以上のセットの加水分解は結果として、レポーター及びクエンチャーの分離、更にはレポーターによる蛍光シグナルの放射をもたらす。場合によっては、蛍光シグナルは、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ、又はＳＰＡＤカメラを使用して光学的に検出される。
場合によっては、前記方法は、検出装置に電圧をかける工程を更に含む。場合によっては、シグナルは電気化学シグナルである。この例において、第２（捕捉）のプローブは電極に結合され、これは標的核酸付近の核酸の領域に結合する。標的核酸がフェロセンラベルなどの検出可能なラベルを含む未結合のプローブに結合し、この複合体が続いて、電極に結合される第２のプローブに結合すると、電極への電圧の印加は結果として検出可能な電気化学シグナルをもたらすことができる。
場合によっては、反応チャンバは少なくとも１つの孔を含む。場合によっては、反応チャンバは少なくとも２つの孔を含む。場合によっては、反応チャンバは第１の孔及び第２の孔を含む。この例において、第１の孔は、第１の電圧を放射する第１の電極を含み、第２の孔は、第２の電圧を放射する第２の電極を含む。標的核酸がプローブ又はラベルに結合すると、サンプルに対する第１の孔の第１の電圧及び第２の孔の第２の電圧の印加は結果として、検出可能な電流インピーダンスのシグネチャをもたらすことができる。
他の場合、検出は、標的核酸に存在する検出可能なラベルを検出することを含む。この例において、検出可能に標識された標的核酸分子がプローブに結合されている場合にのみ、シグナルを検出することができる。場合によっては、標的核酸分子は、Ｃｙ５により５’標識される。場合によっては、非標識ハイブリダイゼーション結合は、例えば、インターフェロメトリックオシレータ上の表面状態の差の検出、光路中の屈折率差の指標、又は走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）技術を用いた直接検出によって、検出され得る。
光検出が利用される場合、検出装置は、ＣＭＯＳカメラなどの光検出器の表面であり、或いは、外部光学システムによってプローブ探索されるフローセル内にあってもよい。光学的蛍光検出の場合、蛍光共焦点顕微鏡法を含む従来の蛍光光学的検出のアーキテクチャを用いることができる。プローブがＣＭＯＳ検出器に直接固定されている場合、ＣＭＯＳ検出器は、システムの励起光を遮断し且つ選択された色素からの光の通過を可能にする、ＣＭＯＳ検出器とプローブとの間の層を有することができる。
コンピュータシステム
本開示のシステムは１つ以上のコンピュータシステムを含み得る。本開示の技術及びデバイスは、操作、自動化、サンプル処理、データ処理、データの送信、分析、結果の提示、及び他の機能に対してコンピュータシステムを使用することができる。図３は、データを受信し、サンプル中の被験体の存在又は不在を識別するなど、本開示の方法を実施するようにプログラムされた、又はそうでなければ構成される、コンピュータシステム（３０１）を示す。コンピュータシステム（３０１）は、シングルコア又はマルチコアプロセッサ、或いは並列処理のための複数のプロセッサであり得る、中央処理装置（ＣＰＵ、本明細書では「プロセッサ」及び「コンピュータプロセッサ」）（３０５）を含む。コンピュータシステム（３０１）はまた、メモリ（３１０）（例えば、ランダムアクセスメモリ、リードオンリーメモリ、フラッシュメモリ）と、電子記憶装置（３１５）（例えば、ハードディスク）と、１つ以上の他のコンピュータシステムと通信するための通信インターフェース（３２０）（例えば、ネットワークアダプタ）と、キャッシュ、他のメモリ、データストレージ、及び／又は電子ディスプレイアダプタなどの周辺装置（１２５）とを含む。メモリ（３１０）、記憶装置（３１５）、インターフェース（３２０）、及び周辺装置（３２５）は、マザーボードなどの通信バス（実線）を介してＣＰＵ（３０５）と通信する。記憶装置（３１５）は、データを記憶するための記憶装置（又はデータリポジトリ）であり得る。コンピュータシステム（３０１）は、通信インターフェース（３２０）の助けを借りてコンピュータネットワーク（「ネットワーク」）（３３０）に動作可能に連結される。ネットワーク（３３０）は、インターネット、インターネット及び／又はエクストラネット、或いはインターネットと通信しているイントラネット及び／又はエクストラネットであり得る。ネットワーク（３３０）は、場合によっては、電気通信及び／又はデータネットワークである。ネットワーク（３３０）は、クラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にする１つ以上のコンピュータサーバーを含み得る。ネットワーク（３３０）は、場合によっては、コンピュータシステム（３０１）の助けを借りて、コンピュータシステム（３０１）に連結されたデバイスがクライアント又はサーバとして挙動することを可能にする、ピアツーピアネットワークを実装することができる。コンピュータシステムは、物理的にデバイスの近くにある必要はなく；有線又は無線の様式を介してデバイスと通信することができる。
コンピュータシステム（３０１）は、処理システム（３３５）と通信することができる。処理システム（３３５）は、１つ以上の標的核酸配列の存在を識別する、又は複数の被験体をレポート上で分類するなど、本明細書に開示される方法を実施するように構成することができる。処理システム（３３５）は、ネットワーク（３３０）を通じて、又は直接（例えば、有線、無線）接続によって、コンピュータシステム（３０１と）通信することができる。処理システム（３３５）は、核酸配列分析などの分析のために構成することができる。
本明細書に記載される方法及びシステムは、例えばメモリ（３１０）又は電子記憶装置（３１５）などのコンピュータシステム（３０１）の電子記憶場所に記憶されたマシン（又はコンピュータプロセッサ）実行可能コード（又はソフトウェア）によって実行され得る。使用中に、コードはプロセッサ（３０５）によって実行することができる。幾つかの例において、コードは、記憶装置（３１５）から検索され、プロセッサ（３０５）による容易なアクセスのためにメモリ（３１０）に記憶され得る。幾つかの状況において、電子記憶装置（３１５）を排除することもでき、マシン実行可能命令はメモリ（３１０）に記憶される。
コードは、コードを実行するように適合されたプロセッサを有するマシンと共に使用するために予めコンパイルされ且つ構成され、或いは、実行中にコンパイルされ、又は実行中に解釈され得る。コードは、予めコンパイルされ、コンパイルされたまま（ａｓ－ｃｏｍｐｉｌｅｄ）、又は解釈された様式でコードを実行できるように選択され得るプログラミング言語で提供され得る。
本明細書に提供されるシステムと方法の態様はプログラミングにおいて具体化され得る。この技術の様々な態様は、一種のマシン可読媒体に搭載される又は埋め込まれるマシン（又はプロセッサ）実行可能コード及び／又は関連データの形態で、典型的には「製品」又は「製造品」とみなすことができる。マシン実行可能コードは、メモリ（例えば、リードオンリーメモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）又はハードディスクなどの電子記憶装置に記憶され得る。「記憶」型の媒体は、様々な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなどの、コンピュータやプロセッサなどの有形のメモリ、或いは、それらの関連するモジュールの何れか又は全てを含むことができ、これは、ソフトウェアプログラミングのためにいつでも非一時的な記憶を提供し得る。ソフトウェアの全て又は一部は、時には、インターネット又は様々な他の電気通信ネットワークを介して通信され得る。このような通信は、例えば、管理サーバ又はホストコンピュータからアプリケーションサーバーのコンピュータプラットフォームへなど、コンピュータ又はプロセッサから別のコンピュータ又はプロセッサへの、ソフトウェアのローディングを可能にする。故に、ソフトウェア要素を保持できる別のタイプの媒体には、ローカルデバイス間の物理インターフェースにわたり、有線及び光陸上通信線ネットワークを介して、並びに様々なエアリンク上で使用されるような、光波、電波、及び電磁波が含まれる。例えば有線又は無線リンクや光リンクなどの、このような波を運ぶ物理的要素も、ソフトウェアを保持する媒体とみなすことができる。本明細書で使用されるように、非一時的で有形の「記憶」媒体に制限されない限り、コンピュータ又はマシン「可読媒体」などの用語は、実行のためにプロセッサに命令を提供することに関与する媒体を指す。
従って、コンピュータ実行可能コードなどのマシン可読媒体は、有形記憶媒体、搬送波媒体、又は物理的伝送媒体を含むが、これに限定されない、多くの形態をとることができる。不揮発性記憶媒体には、例えば、データベースなどを実装するために使用され得るものなど、任意のコンピュータなどにおける記憶デバイスの何れかなどの、光学ディスク又は磁気ディスクが含まれる。揮発性記憶媒体は、そのようなコンピュータプラットフォームのメインメモリなどのダイナミックメモリを含む。有形送信媒体は、同軸ケーブル；コンピュータシステム内のバスを含むワイヤーを含む、銅線及び光ファイバーを含んでいる。搬送波送信媒体は、電気又は電磁信号、或いは無線周波数（ＲＦ）及び赤外線（ＩＲ）データ通信中に生成されるものなどの音響波又は光波の形態をとることができる。それ故、コンピュータ可読媒体の共通の形態は、例えば：フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、他の任意の磁気媒体、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ又はＤＶＤ－ＲＯＭ、任意の他の光学媒体、パンチカード紙テープ、穴のパターンを有する他の任意の物理記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ及びＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ－ＥＰＲＯＭ、他の任意のメモリチップ又はカートリッジ、データ又は命令を搬送する搬送波、そのような搬送波を搬送するケーブル又はリンク、或いは、コンピュータがプログラミングコード及び／又はデータを読み取ることができる他の任意の媒体が、含まれる。これら形態のコンピュータ可読媒体の多くは、実行のために１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスをプロセッサに送ることに関与し得る。
コンピュータシステム（３０１）は、例えば、本開示の方法によって分析され得る遺伝的変異体のカスタマイズ可能なメニューを提供するために、ユーザーインターフェース（ＵＩ）を含む電子ディスプレイを含むか、或いは、それと通信することができる。ＵＩの例は、限定されないが、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）及びウェブベースのユーザーインターフェースを含む。
場合によっては、コンピュータシステム（３０１）は、ユーザーに視覚情報を提供するためのディスプレイを含む。場合によっては、ディスプレイは、陰極線管（ＣＲＴ）である。場合によっては、ディスプレイは、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）である。更なる例において、ディスプレイは、薄膜トランジスタ液晶ディスプレイ（ＴＦＴ－ＬＣＤ）である。場合によっては、ディスプレイは、有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）ディスプレイである。様々な更なる例において、ＯＬＥＤディスプレイは、パッシブマトリックスＯＬＥＤ（ＰＭＯＬＥＤ）又はアクティブマトリックスＯＬＥＤ（ＡＭＯＬＥＤ）のディスプレイである。場合によっては、ディスプレイは、プラズマディスプレイである。他の場合、ディスプレイは、ビデオプロジェクターである。また更なる場合、ディスプレイは、本明細書に開示されるものなどのデバイスの組み合わせである。ディスプレイは、本明細書に記載される方法によって生成されるような１つ以上の生物医学的レポートをエンドユーザーに提供することができる。
場合によっては、コンピュータシステム（３０１）は、ユーザーから情報を受信する入力デバイスを含む。幾つかの例において、入力デバイスは、キーボードである。幾つかの例において、入力デバイスは、非限定的な例として、マウス、トラックボール、トラックパッド、ジョイスティック、ゲームコントローラ、又はスタイラスを含む、ポインティングデバイスである。場合によっては、入力デバイスは、タッチスクリーン又はマルタッチスクリーンである。他の場合、入力デバイスは、声又は他の音入力をキャプチャするマイクロフォンである。他の場合、入力デバイスは、動作又は視覚の入力をキャプチャするビデオカメラである。また更なる例において、入力デバイスは、本明細書に開示されるものなどのデバイスの組み合わせである。
コンピュータシステム（３０１）は、１つ以上のデータベースを含む、又はそれらに動作可能に連結され得る。データベースは、ゲノム、プロテオミクス、薬理ゲノミクス、生物医学、及び科学のデータベースを含み得る。データベースは、公共に利用可能なデータベースであり得る。代替的に、又は付加的に、データベースは所有者データベースを含み得る。データベースは市販のデータベースであり得る。データベースは、限定されないが、ＭｅｎｄｅｌＤＢ、ＰｈａｒｍＧＫＢ、Ｖａｒｉｍｅｄ、Ｒｅｇｕｌｏｍｅ、ｃｕｒａｔｅｄ ＢｒｅａｋＳｅｑ ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ、Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＨＧＭＤ）、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰ、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ、ＧＥＮＣＯＤＥ、ＧＯ（ｇｅｎｅ ｏｎｔｏｌｏｇｙ）、及びＫｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）を含む。
データは、データのユーザーと同じ国を含む地理的位置において生成及び／又は送信され得る。データは、例えば、１か国の地理的位置から生成及び／又は送信され、データのユーザーは異なる国に存在する場合もある。場合によっては、本開示のシステムによってアクセスされたデータは、複数の地理的位置の１つからユーザーに送信され得る。データは、例えば、ネットワーク、安全なネットワーク、不安定なネットワーク、インターネット、又はイントラネットによって複数の地理的位置の中で往復して送信され得る。
トータルシステムは、各々が個別モジュールを有する３つの主要なコンポーネントを使用することができる様々な方法で設計され得る。コンポーネントは、ユーザーインターフェース、ハードウェアプラットフォーム、及び消耗部品（ｃｏｎｓｕｍａｂｌｅ）を含み得る。一例において、ユーザーインターフェースは、システムとの直接的なインタラクションを可能にするハードウェアに組み込まれ、消耗部品は、本開示の方法を実行するのに必要な試薬を含み得る。システムインテリジェンスの全てを含む又は全く含まない遠隔の無線接続されたユーザーインターフェース、自動化又はヒューマンインタラクションを介して接続された１つ以上の複数のハードウェアコンポーネント、並びに、全ての試薬、及びアッセイに存在する生物学的情報を、処理及び報告のためにコンピュータに転送され得るデジタル又はアナログの情報に変換するのに必要とされる検出システムの全て又は一部を含む、完全に内包された消耗部品を使用して、より複雑なアーキテクチャが設計され得る。システムは、限定されないが、システムによって連続的に又は並列して処理される多数のサンプルを制御するスケジューリングモジュール、及び、生物学的制御を使用する内部機能のチェック又は試験を介してシステムが適切に動作していることを確かなものとする品質保証モジュールを含む、複数の追加のモジュールを含み得る。
図９Ａに例示されるコンピューターシステム（９００）は、固定媒体（９０７）を有しているサーバー（９０５）に随意に接続され得る媒体（９０６）及び／又はネットワークポート（９０３）からの命令を読み取ることができる論理装置として理解され得る。図９Ａに示されるシステムなどのシステムは、ＣＰＵ（９０１）、ディスクドライブ（９０２）、キーボード及び／又はマウスなどの随意の入力デバイス（９０８）、及び随意のモニター（９０４）を含み得る。データ通信は、局所又は遠隔の位置でサーバに対して示された通信媒体を通じて達成され得る。通信媒体は、データを送信及び／又は受信する任意の手段を含み得る。例えば、通信媒体は、ネットワーク接続、無線接続、又はインターネット接続であり得る。そのような接続は、ワールド・ワイド・ウェブ上での通信を提供することができる。本開示に関連するデータは、図９Ａに例示されるように当事者（９０９）による受信及び／又はレビューに対してそのようなネットワーク又は接続を介して送信され得ることが、想定される。
図９Ｂは、本開示の例となる実施形態に関連して使用され得るコンピュータシステム（９１０）の第１の例となるアーキテクチャを例示するブロック図である。図９Ｂで示されるように、例となるコンピュータシステムは、命令を処理するためのプロセッサ（９１１）を含み得る。プロセッサの非限定的な例は、以下を含む：Ｉｎｔｅｌ Ｘｅｏｎ（商標）プロセッサ、ＡＭＤ Ｏｐｔｅｒｏｎ（商標）プロセッサ、Ｓａｍｓｕｎｇ ３２－ｂｉｔ ＲＩＳＣ ＡＲＭ １１７６ＪＺ（Ｆ）－Ｓ ｖ１．０（商標）プロセッサ、ＡＲＭ Ｃｏｒｔｅｘ－Ａ８ Ｓａｍｓｕｎｇ Ｓ５ＰＣ１００（商標）プロセッサ、ＡＲＭ Ｃｏｒｔｅｘ－Ａ８ Ａｐｐｌｅ Ａ４（商標）プロセッサ、Ｍａｒｖｅｌｌ ＰＸＡ ９３０（商標）プロセッサ、又は機能的に同等なプロセッサ。複数のスレッドの実行が並列処理のために使用され得る。幾つかの実施形態において、複数のプロセッサ、又は複数のコアを持つプロセッサはまた、単一のコンピュータシステム中でも、クラスタの中でも、又は、複数のコンピュータ、携帯電話、及び／又は個人用携帯情報端末装置を含むネットワーク上のシステムにわたって分布されても、使用され得る。図９Ｂに例示されるように、近年プロセッサ（９１１）によって使用されている、又は頻繁に使用される命令又はデータのための高速メモリを提供するために、高速キャッシュ（９１２）が、プロセッサ（９１１）に接続される、又はそこに組み込まれ得る。プロセッサ（９１１）は、プロセッサバス（９１４）によってノースブリッジ（９１３）に接続される。ノースブリッジ（９１３）は、メモリバス（９１６）によってランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）（９１５）に接続され、プロセッサ（９１１）によってＲＡＭ（９１５）に対するアクセスを管理する。ノースブリッジ（９１３）はまた、チップセットバス（９１８）によってサウスブリッジ（９１７）に接続される。サウスブリッジ（９１７）は、順に、周辺バス（９１９）に接続される。周辺バスは、例えばＰＣＩ、ＰＣＩ－Ｘ、ＰＣＩ Ｅｘｐｒｅｓｓ、又は他の周辺バスであり得る。ノースブリッジ及びサウスブリッジは多くの場合、プロセッサチップセットと呼ばれ、プロセッサと、ＲＡＭと、周辺バス（９１９）上の周辺コンポーネントとの間のデータ転送を管理する。幾つかの代替的なアーキテクチャにおいて、ノースブリッジの機能性は、別個のノースブリッジチップを使用する代わりにプロセッサに組み込まれ得る。幾つかの実施形態では、システム（９１０）は、周辺バス（９１９）に付けられたアクセラレータカード（９２２）を含み得る。アクセラレータは、特定の処理を促進するためのフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）又は他のハードウェアを含み得る。例えば、アクセラレータは、適応データの再構築のために、又は、拡張設定処理に使用される代数式を評価するために使用され得る。ソフトウェア及びデータは、外部ストレージ（９２３）に記憶され、プロセッサによる使用のためにＲＡＭ（９１５）及び／又はキャッシュ（９１２）にロードされ得る。システム（９１０）は、システムリソースを管理するためのオペレーティングシステムを含み、オペレーティングシステムの非限定的な例は、以下を含む：Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、Ｗｉｎｄｏｗｓ（商標）、ＭＡＣＯＳ（商標）、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ ＯＳ（商標）、ｉＯＳ（商標）、及び他の機能的に同等なＯＳ、同様に、本開示の実施形態の例に従ってデータの記憶と最適化を管理するためのオペレーティングシステム上で実行するアプリケーションソフトウェア。この例において、システム（９１０）はまた、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）、及び並列処理の分配に使用され得る他のコンピュータシステムなどの、外部ストレージにネットワークインターフェースを提供するために周辺バスに接続されたネットワークインターフェースカード（ＮＩＣ）（９２０）及び（９２１）を含み得る。
図９Ｃは、複数のコンピュータシステム（９３１）及び（９３２）、複数の携帯電話及びパーソナルデータアシスタント（９３３）、並びにネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）（９３４）及び（９３５）を備えるネットワーク（９３０）を示す図である。例となる実施形態において、システム（９３１）、（９３２）、及び（９３３）は、データの記憶を管理し、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）（９３４）及び（９３５）に記憶されたデータに対するデータアクセスを最適化することができる。数学的モデルがこのデータに使用され、コンピュータシステム（９３１）及び（９３２）、並びに携帯電話及びパーソナルデータアシスタントのシステム（９３３）にわたる分配された並列処理を使用して評価され得る。コンピュータシステム（９３１）及び（９３２）、並びに携帯電話及びパーソナルデータアシスタントのシステム（９３３）はまた、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）（９３４）及び（９３５）に記憶されたデータの適応データの再構成のために並列処理を提供することができる。図９Ｃは、単に一例を例示するものであり、種々様々な他のコンピュータのアーキテクチャ及びシステムが、本開示の様々な実施形態とともに使用され得る。例えば、ブレードサーバーは、並列処理を提供するために使用され得る。プロセッサブレードは、並列処理を提供するためにバックプレーンを通じて接続され得る。ストレージはまた、別個のネットワークインターフェースを通ってバックプレーンに、又はネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）として接続され得る。幾つかの実施形態の例において、プロセッサは、別個のメモリ空間を維持し、ネットワークインターフェース、バックプレーン、又は他のプロセッサによる並列処理のための他のコネクターを通じてデータを伝達することができる。他の実施形態において、プロセッサの一部又は全てが、共有仮想アドレスメモリ空間を使用することができる。
図９Ｄは、例となる実施形態に係る共有仮想アドレスメモリ空間を使用したマルチプロセッサコンピュータシステム（９４０）のブロック図である。システムは、共有メモリサブシステム（９４２）にアクセス可能な複数のプロセッサ（９４１ａ）－（９４１ｆ）を含む。システムは、複数のプログラム可能なハードウェアメモリアルゴリズムプロセッサ（ＭＡＰ）（９４３ａ）－（９４３ｆ）を共有メモリサブシステム（９４２）に組み込む。ＭＡＰ（９４３ａ）－（９４３ｆ）はそれぞれ、メモリ（９４４ａ）－（９４４ｆ）及び１つ以上のフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）（９４５ａ）－（９４５ｆ）を含み得る。ＭＡＰは、設定可能な機能ユニットを提供し、特定のアルゴリズム又はアルゴリズムの一部が、それぞれのプロセッサと密に協働した処理のためにＦＰＧＡ（９４５ａ）－（９４５ｆ）に提供され得る。例えば、ＭＡＰは、データモデルに関する代数式を評価し、且つ例となる実施形態における適応データの再構築を行なうために使用され得る。この例において、各ＭＡＰは、このような目的のためにプロセッサ全てによって世界的にアクセス可能である。１つの構成において、各ＭＡＰは、関連するメモリ（９４４ａ）－（９４４ｆ）にアクセスするために直接メモリアクセス（ＤＭＡ）を使用することができ、これにより、各マイクロプロセッサ（９４１ａ）－（９４１ｆ）とは無関係に、及びそれらとは非同期的にタスクを実行することが可能になる。この構成において、ＭＡＰは、パイプライン処理（ｐｉｐｅｌｉｎｉｎｇ）及びアルゴリズムの並列の実行のために別のＭＡＰに結果を直接供給することができる。
上述のコンピュータのアーキテクチャ及びシステムは単なる例であり、様々な他のコンピュータ、携帯電話、個人用携帯情報端末のアーキテクチャ及びシステムが、一般的なプロセッサ、コプロセッサ、ＦＰＧＡ、及び他のプログラム可能論理回路の任意の組み合わせを使用するシステム、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、及び他の処理要素と論理素子を含む実施形態の例と共に使用され得る。幾つかの実施形態において、コンピュータシステムの全て又は一部は、ソフトウェア又はハードウェアに実装され得る。例えばランダムアクセスメモリ、ハードドライブ、フラッシュメモリ、テープドライブ、ディスクアレイ、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）、及び他のローカル又は分散データ記憶デバイス及びシステムを含む、様々なデータ記憶媒体が、実施形態の例と共に使用され得る。
実施形態の例において、コンピュータシステムは、上述の又は他のコンピュータのアーキテクチャ及びシステムの何れかにて実行するソフトウェアモジュールを使用して実施され得る。他の実施形態において、システムの機能は、ファームウェア、図９Ｄで言及されるようなフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）などのプログラマブルロジックデバイス、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、並びに他の処理素子及び論理素子において、部分的又は完全に実施され得る。例えば、セットプロセッサ（Ｓｅｔ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）及びオプティマイザー（Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ）が、図９Ｂに例示されるアクセラレータカード（９２２）などのハードウェアアクセラレータカードの使用によって、ハードウェアアクセラレーションと共に実施され得る。
レポート
前記方法及びシステムはレポートの作成を提供し、ここでレポートは、複合サンプルに存在する１つ以上の被験体を識別することができる。代替的に、レポートは、検出装置に含まれる全ての特徴の読み出しに関する詳細情報を提供することができる。レポートは、本明細書に記載される方法の結果がエンドユーザーに中継される技術であり得る。レポートは、スクリーン又は電子ディスプレイに表示され、或いは例えば１枚の紙に印刷され得る。場合によっては、レポートはネットワークを介して送信される。場合によっては、ネットワークはインターネットである。場合によっては、レポートは手動で作成され得る。他の場合、レポートは自動的に作成され得る。場合によっては、レポートはリアルタイムで作成され得る。場合によっては、レポートは、モバイルデバイス、スマートフォン、タブレット、又は別のネットワーク使用可能なデバイスに提供され得る。
実施例１．被験体に特異的なプローブの生成
サンプルを得る。サンプルは複数の被験体を含む。識別されるべき各被験体のゲノムを得る。被験体のゲノムの非重複領域を識別する。非重複領域に特異的なプローブを設計する。
実施例２．被験体に特異的な特徴の構築
被験体に特異的な特徴を含むバイオチップを構築する。各特徴は、個々の被験体に特異的な複数のプローブを含む。
実施例３．バイオチップを使用する被験体の存在に関する分析
多くのタイプの被験体を含む試験サンプルを得る。サンプルのＤＮＡを一斉に得る。増幅なしで、ＤＮＡをバイオチップにハイブリダイズする。複数の標的がバイオチップの表面上のプローブに結合する。十分な数のプローブが特徴内で結合されると、シグナルは検出可能であり、被験体に特異的な特徴は陽性と呼ばれる。陽性の特徴は、サンプル中の被験体の存在を示す。場合によっては、陽性シグナルは、特異的な有機体又は種の存在を示す。別の場合、陽性シグナルは、対象の特異的な遺伝子又は形質の存在を示す。
実施例４．２段階ＥＤＣプロトコルを使用するプローブの固定化の改善
２段階ＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）プロトコルを利用して、シリカビーズへのプローブの固定化を改善した。シリカビーズを、低濃度のＥＤＣで処理し、洗浄し、続いてより高濃度のＥＤＣで処理した。下記の表３は、プローブの固定化の効率に対する異なるＥＤＣ濃度の効果を実証している。
実施例５．Ｍ１３ｍｐ８配列に対するプローブ設計
プローブを、Ｍ１３バクテリオファージに由来するＭ１３ｍｐ８ファージベクターに設計した。簡単に、Ｍ１３ｍｐ８配列を、ＧｅｎＢａｎｋ Ｖｉｒｕｓｅｓ， Ｂａｃｔｅｒｉａ， ａｎｄ Ｈｕｍａｎのデータベース及び「天然」Ｍ１３バクテリオファージ配列に対してクエリした。Ｍ１３ｍｐ８が２２の固有の領域（例えば図４を参照）及び３８０の固有の３５－ｍｅｒを有することが判定された。これら配列を使用して、Ｍ１３ｍｐ８を複合サンプルと区別可能な１０のプローブを生成した。プローブを、様々なＧＣ含量／Ｔｍ及びヘアピンＴｍを有するように設計した。場合によっては、プローブを、以下を含むように修飾した：１．修飾なし；２．アミノ修飾（５’）；３．アミノ修飾（５’）＋Ｃｙ５（３’）。場合によっては、標的核酸を、修飾なし又はＣｙ３（５’）修飾のいずれかで生成した。図５は、本明細書に提供される方法を使用して設計されたプローブの例を示す。
実施例６．結核サンプルの分析
ウイルス（ＴＢＶ）及び非ウイルス（ＴＢＡ）の結核サンプルの２つのカテゴリーを、ビーズベースのプローブを使用して分析した。プローブを、異なるプールに入れて選択し、様々な多重のプローブを生成した。プローブをその後、１ミクロンのビーズ上に置いた。その後、これらのビーズを、ＴＢ株の特異的な標的（ＴＢＶ）、及びプローブが結合すべきでない非特異的標的（ＴＢＡ）を使用してハイブリダイズした。
アッセイを、以下のプロトコルに従って実行した。ハイブリダイゼーション緩衝液及び洗浄緩衝液を、表４に記載する。１０ｍｇ／ｍＬのビーズ４μＬを、１Ｘハイブリダイゼーション緩衝液と共に２００μＬの全容積へと希釈した。その後、ビーズ溶液を超音波処理し（Ｂｒａｎｓｏｎ ２５１０超音波処理器の中で１分間）、１０μＬのビーズ溶液を最終のハイブリダイゼーション溶液に加えて、０．１ｍｇ／ｍＬの終末濃度にした。最終のハイブリダイゼーション溶液は、１Ｘハイブリダイゼーション緩衝液中に２０μＬの標識されたＤＮＡ及びビーズを含んでいた。１０μＬのＤＮＡを、１Ｘハイブリダイゼーション緩衝液中の同等の望ましい細胞において、最終のハイブリダイゼーション溶液に加えた。サンプルを混合し、遠心沈殿させた。その後、温度を、５分かけて最大９５℃まで上昇させ、その後、毎分２℃の速度で４２℃まで低下させた。その後、サンプルを再び遠心沈殿させ、箔で覆い、下垂（ｎｕｔａｔｅ）反応を４２℃で一晩（約１６時間）実行した。その後、サンプルを１００μＬの１Ｘハイブリダイゼーション緩衝液中で２回洗浄し、各洗浄工程において８０μＬを除去し、各再懸濁後にボルテックスした。その後、洗浄後の残りの最終的な２０μＬを、ボルテックス及び超音波処理し、全容積をフローセルに加えた。フローセル中のサンプルを１０～１５分間インキュベートした。その後、各レーンを１５０μＬ（３×５０μＬ）の１Ｘ洗浄緩衝液で洗浄した。その後、顕微鏡での観察によって結果を集めた。平均シグナル及び平均バックグラウンドを、ハイブリダイゼーション反応ごとに少なくとも３０のビーズに対して測定した。
図１０は実験の結果を示す。Ｘ軸は、固有のプローブの数を表わすプローブの煩雑性（ｐｌｅｘｉｔｙ）（１、４、９、及び１２）を示し、ｙ軸はバックグラウンドより上の平均シグナルを示す。特異的な標的シグナル（ＴＢＶ、右）は、特異的な標的に対するプレックス（ｐｌｅｘ）因子の各々の増加に対して増加する。加えて、非特異的なシグナル（ＴＢＡ、左）は、プレックス因子の増加と横ばい状態である（ｆｌａｔ）。
本発明は，１つ以上の好ましい実施形態の観点から記載されており、当然のことながら、明確に述べられていない限り、多くの同等物、代替案、変更、及び修正が可能であり、本発明の範囲内にあることを、認識されたい。
実施例７．マイクロウェル検出装置の構築
３８４のサンプルウェルを含むマイクロウェルプレートを備えた検出装置を構築し、各ウェルは固有の被験体に特異的な特徴に相当する。各特徴は、個々の被験体に特異的な、複数の未結合の統合プローブを含む。
実施例８．マイクロウェル検出システムを使用する被験体の存在に関する分析
多くのタイプの被験体を含む試験サンプルを得る。サンプルのＤＮＡを一斉に得る。増幅なしで、ＤＮＡをマイクロウェルプレートの各ウェルに適用し、ここで、ウェルの中の相補的プローブへとハイブリダイズすることが可能であり、各プローブはレポーター及びクエンチャーを含んでおり、続くマイクロウェルプレートのＰＣＴは結果として、標的核酸がその相補的プローブにハイブリダイズするウェルにおいて、ＦＲＥＴにより生成される検出可能な蛍光シグナルをもたらす。このシグナルの検出はサンプル中の被験体の存在を示す。場合によっては、陽性シグナルは、特異的な有機体又は種の存在を示す。別の場合、陽性シグナルは、対象の特異的な遺伝子又は形質の存在を示す。
実施例９．電極検出装置の構築
５つの金電極が配置される微小流体チャネルを備えたチップを含む検出装置が構築される。固有の被験体に特異的な特徴の３０ｂｐ以内の配列に相当する第２（捕捉）のプローブを各電極に固定する。各電極は、異なる被験体に特異的な特徴を検出する。
実施例１０．電極検出システムを使用する被験体の存在に関する分析
多くのタイプの被験体を含む試験サンプルを得る。サンプルのＤＮＡを一斉に得る。増幅なしで、ＤＮＡを、５つの被験体に特異的な特徴を表現する標的核酸に相補的な複数の統合プローブと組み合わせて、微小流体チャネルに適用する。各プローブはフェロセンラベルを含み、その標的で標識されたプローブのハイブリダイゼーションは、標的核酸：フェロセンで標識されたプローブ複合体を生成する。電極上での標的核酸：フェロセンで標識されたプローブ複合体の相補的な第２のプローブへの微小流体チャネルハイブリダイゼーションへの適用後、結果として、電圧の適用後の電極により電気化学シグナルの生成がもたらされる。このシグナルの検出はサンプル中の被験体の存在を示す。場合によっては、陽性シグナルは、特異的な有機体又は種の存在を示す。別の場合、陽性シグナルは、対象の特異的な遺伝子又は形質の存在を示す。
実施例１１．ナノポア検出装置の構築
２つの孔を更に含む微小流体チャネルを含む検出装置を構築する。この例において、第１の孔は、第１の電圧を放射する第１の電極を含み、第２の孔は、第２の電圧を放射する第２の電極を含む。この二重の孔に基づくシステムを使用した検出を、複数の統合プローブに対して行うことができる。
実施例１２．ナノポア検出システムを使用する被験体の存在に関する分析
多くのタイプの被験体を含む試験サンプルを得る。サンプルのＤＮＡを一斉に得る。増幅なしで、ＤＮＡを、５つの被験体に特異的な特徴を表現する標的核酸に相補的な複数の統合プローブと組み合わせて、微小流体チャネルに適用する。各プローブは、それが５つの被験体に特異的な特徴のどれに対応するかに応じて異なる数のＰＥＧ分子を含む。例えば、第１の被験体に特異的な特徴へのプローブは１つのＰＥＧ分子を含み、第２の被験体に特異的な特徴へのプローブは２つのＰＥＧ分子を含む。孔を通ってその相補的なプローブに結合される標的核酸の継代は結果として、固有の電流インピーダンスシグナルをもたらす。このシグナルの検出はサンプル中の被験体の存在を示す。場合によっては、陽性シグナルは、特異的な有機体又は種の存在を示す。別の場合、陽性シグナルは、対象の特異的な遺伝子又は形質の存在を示す。
実施例１３．Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの株の検出、及びそれらの区別
部分的に組み立てたフローセルを、アミノシランスライドに３つのレーン（２０μｌ／レーン）感圧性接着剤（ＰＳＡ）のカットアウトを付けることにより、作成した。プローブを各株に対して生成し、プローブは各株に固有の核酸配列を含んでいた。プローブを使用して、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、メチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）、及びメチシリン耐性Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（ＭＲＳＥ）の２つの異なる株を区別した。プローブをＣＯＯＨシリカビーズに抱合した。標的を、この実験のために別個の反応において、数千もの同一のビーズにハイブリダイズして、プローブの特異性を評価した。ビーズを超音波処理し、１Ｘ ＴＥにおいて約１分間希釈した。その後、ビーズをアミノシラン表面上へと堆積させ、少なくとも１０分間インキュベートした。この堆積プロセスを、単一レーンの煩雑性及び／又は弁別の研究に対して最大３回実行した。フローセルを、ＰＳＡにフローセル上部を取り付けることにより完成させた。１Ｘ ＴＥをフローセルに通して時用紙、未結合のビーズをウォッシュアウトした。
標的混合物を、所望の標的（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの２つの株）及びＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘハイブリダイゼーション緩衝液により作成した。標的混合物を９５℃に加熱し、５分間保持し、その後、氷へと動かして、インキュベートし、フローセルに加えて、一晩インキュベートした（約１６時間）。フローセルレーンを最初にＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ緩衝液Ａで洗浄し、その後、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ洗浄緩衝液Ｂで洗浄した。
蛍光シグナルを、共焦点顕微鏡を使用して複数の同一のビーズから記録した。図１２は、ＳｔａｐｈのＭＲＳＥ及びＭＳＳＡの菌株の検出時の信号対雑音比（ＳＮＲ）の増加、加えて、３つの異なるレベルのプローブの煩雑性（即ち、ビーズ１つにつき株１つ当たり１つのプローブ、ビーズ１つにつき株１つ当たり４つのプローブ、ビーズ１つにつき株１つ当たり１７のプローブ）において株を区別する能力を示した。異なるレーンを使用して、異なるプローブを区別した。
実施例１４：シリコン基板上のフローセルにおけるＤＮＡの濃縮及び移動
ＩＴＰを、シリコン基板上で実施した（例えば図１３、図１４Ａ－１４Ｈを参照）。化学蒸着法を使用して、ビーズアレイ表面上に酸化ケイ素層を作成し、その厚みは約５００ナノメートル（ｎｍ）であった。入口（１３０２）と出口（１３０３）を持つフローセル（１３０１）は、再び拡張する前に、長さ約４ｃｍ、幅８００μｍ、及び高さ７５μｍの寸法、及び、約２００μｍの幅へと狭まるフローセル長さ中央にテーパー状部分（１３０４）を備えて、ＰＤＭＳにおいて製造された。ＰＤＭＳフローセルの下部表面は、放電棒を使用して起動され、酸化ケイ素表面へのＰＤＭＳの結合を可能とした。フローセルの入口及び出口の端部にある２つのポートにおける白金ワイヤーを２００Ｖの電圧に設定し、結果として生じる電流は約１００μＡであった。サンプルを充填し、ＤＮＡの濃縮結合（１３０５）をＣｙ３で蛍光標識し、形成し、チャネルを下って移動させた。ＤＮＡの充填、濃縮、ハイブリダイゼーション、及び検出に対する総時間は、約２５分であった。Ｃｙ３及び標的ＤＮＡの濃度は２５ｎＭであり、プロセスは０．２５ｎＭの濃度で成功裡に繰り返された。図１４Ａは、入口ポートを出る蛍光標識されたサンプルＤＮＡを示す。図１４Ｂは、フローセルチャネルに集中し始めるＤＮＡバンドを示す。図１４Ｃは、フローセルチャネルに形成される、集中したＤＮＡバンドを示す。図１４Ｄは、フローセルチャネルのテーパー状部分の「咽喉部」に進入するＤＮＡバンドを示す。図１４Ｅは、咽喉部を通って移動するＤＮＡバンドを示す。図１４Ｆは、咽喉部の端部に近づくＤＮＡバンドを示す。図１４Ｇは、フローセルチャネルのアレイハイブリダイゼーション領域に進入するＤＮＡバンドを示す。図１４Ｈは、フローセルチャネルのハイブリダイゼーション領域におけるＤＮＡバンドを示す。

Claims (16)

  1. ａ．１つ以上の分析物を含むサンプルを提供する工程、及び
    ｂ．チャネル中の等速電気泳動（ＩＴＰ）によって前記１つ以上の分析物を濃縮する又は輸送する工程を含む方法であって、
    前記チャネルの表面は、シリコン基板と前記表面に結合するアレイに配置される複数のプローブからなる工程と、
    前記アレイの単一特徴におけるプローブは、当該プローブに少なくとも２つの種を含むと共に、前記シリコン基板は絶縁層からなる工程を含み、
    ｃ．前記アレイの前記単一特徴に関連したシグナルを単一の解像度要素に統合するため、前記１つ以上の分析物の少なくとも一部の、前記プローブへの結合に関連したシグナルを検出する工程、
    を含む、ことを特徴とする方法。
  2. 前記絶縁層は酸化ケイ素を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 前記絶縁層は少なくとも約２５０ナノメートルの厚さである、ことを特徴とする請求項
    １に記載の方法。
  4. 前記表面は少なくとも１つのウェルを含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  5. 前記少なくとも１つのウェルはマイクロウェルである、ことを特徴とする請求項４に記
    載の方法。
  6. 前記少なくとも１つのウェルはウェルのアレイを含む、ことを特徴とする請求項４に記
    載の方法。
  7. 前記プローブの少なくとも２つの種は各々、同じ被験体に特異的である、ことを特徴と
    する請求項１に記載の方法。
  8. 前記被験体は、有機体の種、有機体の株、有機体の分岐群、遺伝学的変異体、病原体の
    形質、抵抗性の形質、および有機体の種の個々のメンバーからなる群から選択される、こ
    とを特徴とする請求項７に記載の方法。
  9. 前記ＩＴＰは、約８００ボルト以下の電圧で実施される、ことを特徴とする請求項１に
    記載の方法。
  10. 前記チャネルは、１００マイクロメートル以下の高さを持つ、ことを特徴とする請求項
    １に記載の方法。
  11. 前記チャネルは、狭窄部分又はテーパー状部分を含まない、ことを特徴とする請求項１
    に記載の方法。
  12. 前記チャネルは、２０００マイクロメートル以下の幅を持つ、ことを特徴とする請求項
    １に記載の方法。
  13. 前記分析物は核酸を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  14. 前記分析物を前記表面上のプローブに結合する工程を更に含む、ことを特徴とする請求
    項１に記載の方法。
  15. 前記分析物を検出する工程を更に含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  16. 前記分析物を前記表面上のプローブに結合する工程、及び前記分析物を検出する工程を
    更に含み、ここで、前記方法は約６０分以下で実施される、ことを特徴とする請求項１に
    記載の方法。
JP2019561279A 2017-05-09 2018-05-08 遺伝子サンプルを識別且つ区別するためのシステムと方法 Active JP7430301B2 (ja)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762503502P 2017-05-09 2017-05-09
US62/503,502 2017-05-09
US201762546929P 2017-08-17 2017-08-17
US62/546,929 2017-08-17
US201762586760P 2017-11-15 2017-11-15
US62/586,760 2017-11-15
PCT/US2018/031636 WO2018208804A1 (en) 2017-05-09 2018-05-08 Systems and methods for identifying and distinguishing genetic samples

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2020519254A JP2020519254A (ja) 2020-07-02
JP2020519254A5 JP2020519254A5 (ja) 2021-07-26
JP7430301B2 true JP7430301B2 (ja) 2024-02-13

Family

ID=64104982

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019561279A Active JP7430301B2 (ja) 2017-05-09 2018-05-08 遺伝子サンプルを識別且つ区別するためのシステムと方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US11939638B2 (ja)
EP (1) EP3622085A4 (ja)
JP (1) JP7430301B2 (ja)
CN (1) CN110869512A (ja)
AU (1) AU2018266675A1 (ja)
CA (1) CA3063106A1 (ja)
WO (1) WO2018208804A1 (ja)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11725233B2 (en) 2015-11-16 2023-08-15 Revere Biosensors, Llc Systems and methods for identifying and distinguishing genetic samples
CN110869512A (zh) 2017-05-09 2020-03-06 雷瑞生物传感器有限责任公司 鉴别并区分遗传样品的系统及方法
US20220195504A1 (en) * 2018-11-30 2022-06-23 Illumina, Inc. Analysis of multiple analytes using a single assay
US20220403451A1 (en) * 2019-10-31 2022-12-22 President And Fellows Of Harvard College On-chip assay strategy for the development of electrochemical readout for crispr-cas diagnostics
CN114807316B (zh) * 2022-03-11 2023-02-03 北京科技大学 一种无核酸扩增可视化的rna定量检测方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005509127A (ja) 2000-11-27 2005-04-07 インテリジェント メディカル ディバイシーズ エル．エル． シー． 臨床的にインテリジェントな診断装置および方法
JP2006524319A (ja) 2003-04-14 2006-10-26 カリパー・ライフ・サイエンシズ・インク． 移動度シフトアッセイ干渉の低減
WO2007027495A1 (en) 2005-09-02 2007-03-08 Wako Pure Chemical Industries, Ltd Complex formation method and separation method
WO2015079446A1 (en) 2013-11-29 2015-06-04 Technion Research & Development Foundation Limited Metod and device for accelerated surface-based reactions
WO2016187234A1 (en) 2015-05-18 2016-11-24 Karius, Inc. Compositions and methods for enriching populations of nucleic acids

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0502271A1 (en) 1989-04-17 1992-09-09 The Standard Oil Company 16s rRNA oligonucleotide probes for the identification of sulfate-reducing bacteria
US5143854A (en) * 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
SE470347B (sv) * 1990-05-10 1994-01-31 Pharmacia Lkb Biotech Mikrostruktur för vätskeflödessystem och förfarande för tillverkning av ett sådant system
US6051380A (en) * 1993-11-01 2000-04-18 Nanogen, Inc. Methods and procedures for molecular biological analysis and diagnostics
US5547861A (en) 1994-04-18 1996-08-20 Becton, Dickinson And Company Detection of nucleic acid amplification
US6800452B1 (en) 1994-08-08 2004-10-05 Science Applications International Corporation Automated methods for simultaneously performing a plurality of signal-based assays
US6852487B1 (en) 1996-02-09 2005-02-08 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
CA2300940A1 (en) 1997-08-15 1999-02-25 Hyseq, Inc. Methods and compositions for detection or quantification of nucleic acid species
EP1121471A1 (en) 1998-10-13 2001-08-08 Clontech Laboratories, Inc. Nucleic acid arrays
US6821770B1 (en) * 1999-05-03 2004-11-23 Gen-Probe Incorporated Polynucleotide matrix-based method of identifying microorganisms
US6465183B2 (en) 1999-07-01 2002-10-15 Agilent Technologies, Inc. Multidentate arrays
US20020187490A1 (en) 2001-06-07 2002-12-12 Michigan State University Microbial identification chip based on DNA-DNA hybridization
CA2428646A1 (en) 2003-04-30 2004-10-30 National Research Council Of Canada Array and uses thereof
US20050136395A1 (en) 2003-05-08 2005-06-23 Affymetrix, Inc Methods for genetic analysis of SARS virus
US8694263B2 (en) 2003-05-23 2014-04-08 Cold Spring Harbor Laboratory Method of identifying virtual representations of nucleotide sequences
ATE358733T1 (de) 2003-06-02 2007-04-15 Check Points Holding B V Schnell-verfahren zur detektion von mikroorganismen in lebensmittelproben
US20050255459A1 (en) 2003-06-30 2005-11-17 Yuriy Fofanov Process and apparatus for using the sets of pseudo random subsequences present in genomes for identification of species
US8105471B1 (en) * 2004-07-19 2012-01-31 Han Sang M Nanofluidics for bioseparation and analysis
EP2069537B1 (en) 2006-09-01 2011-08-31 Ventana Medical Systems, Inc. Method for producing nucleic acid probes
US8999634B2 (en) 2007-04-27 2015-04-07 Quest Diagnostics Investments Incorporated Nucleic acid detection combining amplification with fragmentation
CN101157952B (zh) * 2007-10-12 2011-12-21 广州阳普医疗科技股份有限公司 一种功能化微流控芯片及其用于pcr产物分析的方法
EP2669387B1 (en) 2009-08-25 2016-07-20 Illumina, Inc. Methods for selecting and amplifying polynucleotides
PT106942B (pt) 2013-05-15 2020-09-10 STAB VIDA, Investigação e Serviços em Ciências Biológicas, Lda Biochip (1) e bouquet de 16 antigénios (2) para a deteção da doença de lyme aguda e crónica
IL228026B (en) * 2013-08-19 2018-05-31 Technion Res & Dev Foundation Discovery of genetic sequences using pna sensors and isotachophoresis
US9574232B2 (en) * 2014-02-25 2017-02-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Devices and methods for controlling reversible chemical reactions at solid-liquid interfaces by rapid preconcentration and phase replacement
CN104677972B (zh) * 2015-02-10 2017-02-22 四川大学 毛细管等速微通道电泳芯片
US11725233B2 (en) 2015-11-16 2023-08-15 Revere Biosensors, Llc Systems and methods for identifying and distinguishing genetic samples
JP6527594B2 (ja) 2015-12-01 2019-06-05 株式会社日立ハイテクノロジーズ 細胞解析デバイス、装置およびそれを用いた細胞解析方法
AU2017212754B2 (en) * 2016-01-29 2023-06-29 Purigen Biosystems, Inc. Isotachophoresis for purification of nucleic acids
CN110869512A (zh) 2017-05-09 2020-03-06 雷瑞生物传感器有限责任公司 鉴别并区分遗传样品的系统及方法
WO2020180670A1 (en) 2019-03-01 2020-09-10 Revere Biosensors, Llc Systems and methods for separating decoded arrays

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005509127A (ja) 2000-11-27 2005-04-07 インテリジェント メディカル ディバイシーズ エル．エル． シー． 臨床的にインテリジェントな診断装置および方法
JP2006524319A (ja) 2003-04-14 2006-10-26 カリパー・ライフ・サイエンシズ・インク． 移動度シフトアッセイ干渉の低減
WO2007027495A1 (en) 2005-09-02 2007-03-08 Wako Pure Chemical Industries, Ltd Complex formation method and separation method
WO2015079446A1 (en) 2013-11-29 2015-06-04 Technion Research & Development Foundation Limited Metod and device for accelerated surface-based reactions
WO2016187234A1 (en) 2015-05-18 2016-11-24 Karius, Inc. Compositions and methods for enriching populations of nucleic acids

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Adv. Funct. Mater.，2015年，vol.25, p.6725-6732

Also Published As

Publication number Publication date
US20200172985A1 (en) 2020-06-04
EP3622085A1 (en) 2020-03-18
CA3063106A1 (en) 2018-11-15
EP3622085A4 (en) 2020-12-16
AU2018266675A1 (en) 2019-12-05
US11939638B2 (en) 2024-03-26
CN110869512A (zh) 2020-03-06
WO2018208804A1 (en) 2018-11-15
JP2020519254A (ja) 2020-07-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7430301B2 (ja) 遺伝子サンプルを識別且つ区別するためのシステムと方法
JP7504854B2 (ja) 個別的エピゲノミクスのための天然クロマチンへの転移
JP7434243B2 (ja) 遺伝子サンプルを識別且つ区別するためのシステムと方法
US20210102197A1 (en) Designing sensitive, specific, and optimally active binding molecules for diagnostics and therapeutics
Zahid et al. Sequence-specific recognition of microRNAs and other short nucleic acids with solid-state nanopores
ES2902401T3 (es) Métodos y procesos para la evaluación no invasiva de variaciones genéticas
JP6473744B2 (ja) 遺伝子の変動の非侵襲的評価のための方法および処理
CN105189748B (zh) 测序免疫组库的方法
US11492610B2 (en) Sample multiplexing for single-cell RNA sequencing
JP2023153898A (ja) 核酸の検知
US20210277472A1 (en) Methods for determining carrier status
JP6556705B2 (ja) ポリヌクレオチドの分析
US20220359040A1 (en) Systems and methods for determining sequence
US20200082913A1 (en) Systems and methods for determining sequence
Wu et al. CoID-LAMP: color-encoded, intelligent digital LAMP for multiplex nucleic acid quantification
US20240218431A1 (en) Systems and methods for identifying and distinguishing genetic samples
Wang et al. Bead-Based Flow Cytometric miRNA Expression Profiling

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200227

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210507

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20210507

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20220210

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20220214

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20220513

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220712

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20221024

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20230120

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20230320

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230424

RD12 Notification of acceptance of power of sub attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7432

Effective date: 20230428

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20230428

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230718

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20231002

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20231016

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20231115

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20231211

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240109

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7430301

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150