JP7410154B2 - 遺伝的に変異された細胞の死滅誘導組成物及び該組成物を用いた遺伝的に変異された細胞の死滅誘導方法 - Google Patents

遺伝的に変異された細胞の死滅誘導組成物及び該組成物を用いた遺伝的に変異された細胞の死滅誘導方法 Download PDF

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Description

本発明は、ヌクレアーゼ及び切断因子を含む、ゲノム配列の変異を含む細胞の死滅誘導組成物、及びゲノム配列の変異を含む細胞の死滅誘導方法に関する。
遺伝子又は遺伝体が損傷した細胞は、生物体又は生物の器官が生きていったり作動する上で問題をもたらす。このような細胞の選択的な死滅を誘導する方法は、様々であるが、その大部分は正常細胞までも損傷させる場合が多いため、臨床的に使用し難い現状である。
遺伝子又は遺伝体が損傷した細胞として、生物体の生存や生物の器官に問題を招く最も代表的なものが癌細胞である。ＤＮＡ損傷（ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ）が人間の全体ゲノムにおいて非常に少ない部分を占めても、ＤＮＡ損傷が原腫瘍遺伝子（ｐｒｏｔｏ－ｏｎｃｏｇｅｎｅ）又は抑制遺伝子（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ）に起きると、結局は癌につながる可能性が高い（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｌｏｄｉｓｈ Ｈ，Ｂｅｒｋ Ａ，Ｚｉｐｕｒｓｋｙ ＳＬ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ；２０００，“Ｓｅｃｔｉｏｎ １２．４ＤＮＡ Ｄａｍａｇｅ ａｎｄ Ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ”）。
癌特異的変異に対する研究及び分析は、癌治療剤開発における主要基盤であるといえる。例えば、癌変異に対する研究によって、特異遺伝的変異をターゲットする治療剤が開発され、変異プロファイルと薬物反応性との相関性も確認可能になっている。
癌は遺伝子変異の蓄積によって発生し、これが生殖細胞を通じて遺伝されたり、細胞周期において体細胞内に獲得されることになる。このような腫瘍遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、ＤＮＡ修復遺伝子の変化は、細胞が成長及び調節メカニズムから逸脱して癌を発症するようにする。
このような過程によって発生した癌では、正常細胞には発見されない新しいＤＮＡ配列が挿入されたり（Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ：ＩＮ）、正常細胞のＤＮＡの一部が欠失（Ｄｅｌｅｔｉｏｎ：Ｄｅｌ）される現象が多数観察される。このような癌細胞ＤＮＡに見られる特異的挿入又は欠失ＤＮＡ（ＩＮＤＥＬ）は、正常細胞に存在しないＤＮＡ配列であるため、それらを正常細胞と癌細胞の差別的な攻撃ターゲットに設定することができる。
一方、ＤＮＡ二重鎖切断は、細胞レベルで最も深刻な損傷の一つであり、損傷したＤＮＡは非相同末端連結（ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ）、相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によって修復されるが、修復されなかったＤＮＡは遺伝情報の損傷又は再配列を起こし、細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）が誘導されることがある。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓは、ＲＮＡガイドを用いた遺伝子矯正ツールであり、バクテリア誘導エンドヌクレアーゼのＣａｓ９（又は、突然変異ニッカーゼ）とガイドＲＮＡを用いて、ガイドＲＮＡとゲノムＤＮＡ間の配列をマッチングさせ、ゲノム内特定位置に二重（又は単一）鎖ブレーキを導入することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子ノックアウトは、ＲＮＡ干渉媒介遺伝子ノックダウン（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）に比べてより効率的なものと予想され、遺伝子機能を研究するための有用な実験ツールを提供している。
哺乳動物細胞においてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが作動できるという研究が報告されており、微生物の適応免疫から始まった遺伝子編集技術は、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９：ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ）及びガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ，ｇＲＮＡ）を含む。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ）を含み、Ｃａｓ９に結合してターゲット配列に対する塩基対結合によって目的とするゲノム配列に案内し、二重螺旋切断（Ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ，ＤＳＢ）が生成される。ターゲット配列を定義する唯一の基準は、ＰＡＭ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）の存在するか否かであり、ＰＡＭ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）はこれを認識するＣａｓタンパク質によって配列が異なる特徴があり、例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９は、５’－ＮＧＧ－３’（Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれか一つ）；Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９は、５’－ＮＮＡＧＡＡＷ－３’；Ｃ ｊｅｊｕｎｉ由来のＣａｓ９は、５’－ＮＮＮＮＲＹＡＣ－３’と知られており、人間のゲノム上に上記配列が一定間隔で配列されているので、遺伝子編集に活用することができる。
一方、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを人間の癌治療に適用できることが報告されている（Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６ Ｍａｒ １５；７（１１）：１２３０５－１７）。ところで、これは、癌の誘発と相関性を持つ複数の遺伝子変異に基づいてゲノム中の一つ以上の部分を修正又は切除することが、癌への強力な治療を提供する可能性を高めるということを提示している。
このような技術的背景下で、本出願の発明者らは、全ての癌細胞のようなゲノム配列の変異を含む細胞には、ゲノム配列の変異を含む細胞固有のＩＮＤＥＬ配列があり、これに基づいて作製された切断因子及びヌクレアーゼを用いて特定ＤＮＡ部位にＤＳＢ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ）を誘導し、細胞内に複数箇所のＤＮＡ ＤＳＢが起こると、ゲノム配列の変異を含む細胞が死滅し得ることを確認し、本発明を完成するに至った。
本発明の目的は、ヌクレアーゼ及び切断因子を含む、ゲノム配列の変異を含む細胞の死滅誘導用組成物を提供することにある。
本発明の目的は、ヌクレアーゼ及び切断因子を含む、癌治療用組成物を提供することにある。
本発明の目的は、ヌクレアーゼ及び切断因子を含む、ゲノム配列の変異を含む細胞の死滅誘導方法を提供することにある。
本発明の目的は、ヌクレアーゼ及び切断因子を用いて癌治療方法を提供することにある。
上記の目的を達成するために、本発明は、ヌクレアーゼ及びゲノム配列の変異を含む細胞固有の変異配列を特異的に認識する切断因子を含む、ゲノム配列の変異を含む細胞の死滅誘導用組成物を提供する。
本発明はまた、ヌクレアーゼ及び癌特異的挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）及び／又は欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子を含む、癌治療用組成物を提供する。
本発明はまた、ヌクレアーゼ及びゲノム配列の変異を含む細胞固有の変異配列を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子を、ゲノム配列の変異を含む細胞に処理する段階を含む、ゲノム配列の変異を含む細胞の死滅誘導方法を提供する。
本発明はまた、ゲノム配列の変異を含む細胞と正常細胞のＷＧＳ（ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎｇ）を行う段階；
ゲノム配列の変異を含む細胞と正常細胞のＷＧＳを比較して、ゲノム配列の変異を含む細胞特異的な変異配列を選別する段階；
前記選別された変異配列を認識する切断因子を製造する段階；
前記切断因子とヌクレアーゼを含む組成物を調製する段階；及び
ヌクレアーゼ及び切断因子を含む組成物を、ゲノム配列の変異を含む細胞に印加する段階を含む、ゲノム配列の変異を含む細胞の死滅誘導方法を提供する。
本発明はまた、ゲノム配列の変異を含む細胞と正常細胞のＷＧＳ（ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎｇ）を行う段階；
ゲノム配列の変異を含む細胞と正常細胞のＷＧＳを比較して、ゲノム配列の変異を含む細胞特異的なｉｎｄｅｌを選別する段階；
前記選別されたｉｎｄｅｌを認識する切断因子を製造する段階；
前記切断因子とヌクレアーゼを含む組成物を調製する段階；及び
ヌクレアーゼ及び切断因子を含む組成物を、ゲノム配列の変異を含む細胞に印加する段階を含む、ゲノム配列の変異を含む細胞の死滅誘導方法を提供する。
本発明はまた、ヌクレアーゼ及び癌特異的挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）及び／又は欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子を個体に投与する段階を含む、癌治療方法を提供する。
本発明はさらに、ヌクレアーゼ及び癌特異的挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）及び／又は欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子の発現カセットを含むベクターを癌細胞に処理することを含む癌の治療方法を提供する。
本発明はさらに、ヌクレアーゼ及び患者の癌細胞固有の挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）及び／又は欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子を含む、患者カスタマイズ型癌治療用組成物に関する。
本発明はさらに、患者の癌細胞から癌細胞特異的なｉｎｄｅｌを選別し、これを認識する切断因子を製造して、ヌクレアーゼ及び切断因子を含む組成物を患者に伝達することを含む、患者オーダーメイド型の癌治療方法に関する。
ＤＮＡ ＤＳＢ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ）が同時多発的に発生したとき、細胞が死滅するか否かを確認した結果である。 ガイドＲＮＡを用いてＣＲＩＰＳＲシステムによるＤＮＡの切断がなされるか否かを確認した結果である。 大腸癌及び骨肉腫の細胞に３０個の特異的ＲＮＰ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）を形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）してＤＮＡ ＤＳＢを誘導した後、細胞の生長率をコロニー形成アッセイ（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ａｓｓａｙ）によって確認した結果である。 免疫蛍光（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）及び流細胞分析（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いてＡＡＶの細胞感染率を測定した結果である。 免疫蛍光法を用いて、ＡＡＶ粒子が形質感染されたことを確認した結果である。 ３０個のＵ２ＯＳ細胞株特異的ｃｒＲＮＡを使用してＵ２ＯＳ特異的ｃｒＲＮＡ依存性細胞死滅結果を確認したものである。 Ｕ２ＯＳ細胞特異的ｓａＣＡＳ９ ＡＡＶシステム作動の有無、Ｕ２ＯＳ細胞における細胞死滅の結果を確認したものである。 癌特異的ＩＮＤＥＬによる細胞死滅ベース細胞生存比率を測定した結果である。 ＡＡＶ依存性細胞死滅がｃｒＲＮＡ特異的細胞株のみにおいて誘導されるかを確認した結果である。 膠芽細胞腫において選択的癌細胞死滅が起きるか否かを確認した結果である。 ＡＴＭキナーゼ抑制剤を含有又は非含有するＡＡＶ粒子を使用する場合、細胞死滅効果の差異を確認した結果である。 肺癌特異的ＩＮＤＥＬ誘導細胞死滅（ＣＩＮＤＥＬＡ）効果を確認した結果である。
特に断りのない限り、本明細書で使われる全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家に通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書における命名法は、この技術分野においてよく知られており、通常使われるものである。
本発明は、一観点において、ヌクレアーゼ、及びゲノム配列の変異を含む細胞固有の変異配列を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子を含む、ゲノム配列の変異を含む細胞の死滅誘導用組成物に関する。
本発明は、ヌクレアーゼ、及び癌特異的挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）及び／又は欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子を含む、癌治療用組成物に関する。
また、本発明は、ヌクレアーゼ、及びゲノム配列の変異を含む細胞固有の変異配列を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子を、ゲノム配列の変異を含む細胞に処理する段階を含む、ゲノム配列の変異を含む細胞の死滅誘導方法に関する。
前記ゲノム配列の変異を含む細胞は、 配列の変化によって細胞の活性が正常細胞と異なっている細胞を意味し、例えば、遺伝的変異による疾患発病状態の細胞、具体的に、癌細胞を意味できる。
前記癌は、例えば、黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝癌、甲状腺腫瘍、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、膠芽細胞腫、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸癌、膵癌、食道癌腫、頭頚部癌、中皮腫、肉腫、骨肉腫、胆管癌又は表皮癌などが挙げられるが、これに制限されるものではない。
全ての癌細胞には、正常細胞から発見されない新しいＤＮＡ配列が挿入されたり（Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ：ＩＮ）、正常細胞のＤＮＡの一部が欠失（Ｄｅｌｅｔｉｏｎ：Ｄｅｌ）される現象が多数観察され、各癌細胞ごとに特異的に挿入／欠失されたＤＮＡ配列が存在し得る。
細胞はＤＮＡ二重螺旋が切断されると、これを修復しようとするＤＮＡ損傷修復機序がある。しかし、このような損傷修復機序は、ＤＮＡ二重螺旋切断の数が少ない場合には効果的に修復するが、その数が多くなると死滅する。バクテリアの場合、１本のＤＮＡ二重螺旋切断でバクテリアが死滅することがあるが、動物細胞では、それよりも多いＤＳＢが必要であると知られている。
本発明によれば、上の事実に基づき、ゲノム配列の変異を含む細胞、例えば、癌細胞の複数のＩｎＤｅｌを見つけてそれを認識できる異なる複数の切断因子を作製し、ヌクレアーゼを用いて、ゲノム配列の変異を含む細胞、例えば、癌細胞などを特異的に死滅するように誘導することができる。
このようなＤＮＡ二重螺旋切断の手段であるヌクレアーゼは、制限酵素（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ）、ＺＮＦＮ（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）又はＣａｓタンパク質またはこれをコードする核酸であるが、これに制限されるものではない。前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ３、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１（ＣＲＩＳＰＲ ｆｒｏｍ Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １）、Ｃａｓ６、Ｃ２ｃ１２又はＣ２ｃ２であり得るが、これに制限されるものではない。
前記Ｃａｓタンパク質は、コリネバクター（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アゾスピリラム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ネイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パービバキュラム（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ニトラティフラクター（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及びカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選ばれるＣａｓタンパク質のオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）を含む微生物属に由来し、これらから単純分離されたもの又は組み換えられたものであり得る。
他の観点において、本発明は、ゲノム配列の変異を含む細胞と正常細胞のＷＧＳ（ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎｇ）を行う段階；ゲノム配列の変異を含む細胞と正常細胞のＷＧＳを比較して、ゲノム配列の変異を含む細胞特異的な変異配列を選別する段階；前記選別された変異配列を認識する複数の切断因子を製造する段階；前記切断因子とヌクレアーゼを含む組成物を調製する段階；及びヌクレアーゼ及び切断因子を含む組成物をゲノム配列の変異を含む細胞に印加する段階を含む、ゲノム配列の変異を含む細胞の死滅誘導方法に関する。
他の観点において、本発明は、ゲノム配列の変異を含む細胞、例えば癌細胞と正常細胞のＷＧＳ（ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎｇ）を行う段階；ゲノム配列の変異を含む細胞と正常細胞のＷＧＳを比較して、ゲノム配列の変異を含む細胞特異的なｉｎｄｅｌを選別する段階；前記選別されたｉｎｄｅｌを認識する複数の切断因子を製造する段階；前記切断因子とヌクレアーゼを含む組成物を調製する段階；及びヌクレアーゼ及び切断因子を含む組成物をゲノム配列の変異を含む細胞に印加する段階を含む、ゲノム配列の変異を含む細胞の死滅誘導方法に関する。
切断因子のターゲットであるＩｎＤｅｌのマッピングは、ＷＧＳ（ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、又は差引き混成化（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）及びシーケンシングの方法によって行われてよく、このとき、導出されたＩｎＤｅｌは、癌から発見された挿入の場合は、直ちにガイドＲＮＡを作製し、欠失の場合は、切断地点（ｂｒｅａｋ ｐｏｉｎｔ）をマッピングした後、切断地点を含むガイドＲＮＡを作製して使用することができる。
ＷＧＳとは、次世代シーケンシング（ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）による全長遺伝体シーケンシングを用いて１０Ｘ、２０Ｘ、４０Ｘのように様々な倍数で遺伝体を読む方法を意味する。“次世代シーケンシング”は、チップ（Ｃｈｉｐ）ベース、そしてＰＣＲベースのペアドエンド（ｐａｉｒｅｄ ｅｎｄ）形式で全長遺伝体を切り、これらの切片を化学的な反応（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）に基づいて超高速でシーケンシングを行う技術を意味する。
差引き混成化は、複数の組織又は細胞間に発現の差がある遺伝子のクローニングに用いられる方法である。試験する細胞のＤＮＡ試料特異的遺伝子を検出することができる。試験する細胞のＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに変性させた後にアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）させる。アニーリング条件を調節することによって、試験する細胞特異的ＤＮＡ配列を２本鎖ＤＮＡに分離できる。
ゲノム配列の変異を含む細胞の一種である癌細胞固有のＩｎＤｅｌを含む核酸配列は、例えば、ＩｎＤｅｌをターゲットとしてヌクレアーゼによって核酸配列内ＤＮＡのＤＳＢが起こる遺伝子部位を意味するもので、核酸配列内ヌクレアーゼが特異的に認識する配列、例えばヌクレアーゼがＣａｓ９である場合、Ｃａｓ９タンパク質が認識するＰＡＭ配列の５’末端及び／又は３’末端に隣接して位置する約１７ｂｐ～２３ｂｐ長の核酸配列を意味できる。
ゲノム配列の変異を含む細胞である癌細胞固有のＩｎＤｅｌを含む核酸配列は、当該配列部位の２本のＤＮＡ鎖のうちＰＡＭ配列が位置する鎖の核酸配列で表示される。このとき、実際にガイドＲＮＡが結合するＤＮＡ鎖は、ＰＡＭ配列が位置する鎖の相補的鎖であるため、前記ガイドＲＮＡに含まれた標的化配列は、ＲＮＡ特性のためＴをＵに変更する以外は、ＩｎＤｅｌを含む核酸配列と同じ核酸配列を有する。
前記Ｃａｓ９タンパク質がストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のものである場合、前記ＰＡＭ配列は、５’－ＮＧＧ－３’（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、又はＣ）であり、ゲノム配列の変異を含む細胞固有のＩｎＤｅｌを含む核酸配列は、配列内５’－ＮＧＧ－３’配列の５’末端及び／又は３’末端に隣接して位置する遺伝子部位であり、例えば、最大長が約５０ｂｐ又は約４０ｂｐである遺伝子部位であり得る。
前記Ｃａｓ９タンパク質がストレプトコッカスサーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のものである場合、前記ＰＡＭ配列は、５’－ＮＮＡＧＡＡＷ－３’（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、又はＣ）であり、ゲノム配列の変異を含む細胞固有のＩｎＤｅｌを含む核酸配列は、配列内５’－ＮＮＡＧＡＡＷ－３’配列の５’末端及び／又は３’末端に隣接して位置する遺伝子部位であり、例えば、最大長が約５０ｂｐ又は約４０ｂｐである遺伝子部位であり得る。
前記Ｃａｓ９タンパク質がスタフィロコッカスアウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のものである場合、前記ＰＡＭ配列は、５’－ＮＮＧＲＲＴ－３’（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、又はＣで、ＲはＡ又はＧである。）であり、ゲノム配列の変異を含む細胞固有のＩｎＤｅｌを含む核酸配列は、配列内５’－ＮＮＧＲＲＴ－３’配列の５’末端及び／又は３’末端に隣接して位置する遺伝子部位であり、例えば、最大長が約５０ｂｐ又は約４０ｂｐである遺伝子部位であり得る。
前記Ｃａｓ９タンパク質がカンピロバクタージェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来のものである場合、前記ＰＡＭ配列は、５’－ＮＮＮＮＲＹＡＣ－３’（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、又はＣで、ＲはＡ又はＧで、ＹはＣ又はＴである。）であり、ゲノム配列の変異を含む細胞固有のＩｎＤｅｌを含む核酸配列は、配列内５’－ＮＮＮＮＲＹＡＣ－３’配列の５’末端及び／又は３’末端に隣接して位置する遺伝子部位であり、例えば、最大長が約５０ｂｐ又は約４０ｂｐである遺伝子部位であり得る。
本発明において切断因子とは、正常細胞と比較してゲノム配列の変異を含む細胞の核酸配列のうち変異して変わった部分を認識して切断可能にする塩基配列を指す。
本発明において前記切断因子は、正常細胞の塩基配列と比較して細胞の死滅を誘導できる別の配列の十分な数の複数個でなければならず、好ましくは１個～３０個、より好ましくは１０個～３０個、さらに好ましくは１６個～３０個であり得るが、細胞の種類又は切断因子にしたがって数字が変わってもよい。
ゲノム配列の変異を含む細胞、例えば癌細胞固有のＩｎＤｅｌを含む核酸配列を特異的に認識する切断因子は、例えばガイドＲＮＡでよい。前記ガイドＲＮＡは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ）、及び単一ガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ；ｓｇＲＮＡ）からなる群から選ばれる１種以上でよく、具体的に、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとが結合した二重鎖ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体、又はｃｒＲＮＡ又はその一部とｔｒａｃｒＲＮＡ又はその一部とがオリゴヌクレオチドリンカーで連結された単一鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよい。
ゲノム配列の変異を含む細胞固有のＩｎＤｅｌを含む核酸配列を特異的に認識するガイドＲＮＡは、ＰＡＭ配列が位置するＤＮＡ鎖の相補的な鎖のヌクレオチド配列と９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列相補性を有するヌクレオチド配列を意味するものであり、前記相補的鎖のヌクレオチド配列と結合可能である。
前記ガイドＲＮＡは、次のような段階によって作製可能である：癌細胞と一般細胞のＷＧＳ結果データを比較して癌細胞特異的なＩｎＤｅｌを探す。これに基づいて、ガイドＲＮＡ作製条件を満たす癌細胞特異的なガイドＲＮＡを設計する。その後、ＩｎＤｅｌサイトの長さを考慮して任意的順位を付与し、全ての染色体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）に均一にガイドＲＮＡが設計されるようにして、最終ガイドＲＮＡ組合せを完成する。
ガイドＲＮＡ作製条件は、次の通りである。（ａ）ＰＡＭサイト以外のガイドＲＮＡの塩基配列長は２０塩基対（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）である。（ｂ）ガイドＲＮＡに存在するグアニン（ｇｕａｎｉｎｅ）とシトシン（ｃｙｔｏｓｉｎｅ）との和の比率が、４０％～６０％である。（ｃ）ＩｎＤｅｌがＰＡＭサイト近傍のすぐ前の領域に存在する。（ｄ）最大単一重合体（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒ）長が４塩基対（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）以下である。（ｅ）一般細胞のＷＧＳ結果データに一つの不一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）を許容するマッピングをしたとき、マッピング結果があってはいけない。
これに基づいて作製された前記ガイドＲＮＡは、例えば、配列番号１～１６３からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むことができる。癌細胞死滅を誘導できるガイドＲＮＡの数は、複数個であって、具体的に、約１～４０余個、約１５～２５個、又は約１０～２０個でよい。前記ガイドＲＮＡは、例えば、配列番号１～３０からなる群から選ばれる一つ以上の配列、配列番号３１～６０からなる群から選ばれる一つ以上の配列、配列番号６１～９０からなる群から選ばれる一つ以上の配列、配列番号９１～１２０からなる群から選ばれる一つ以上の配列、配列番号１２１～１３６からなる群から選ばれる一つ以上の配列、配列番号１３７～１６３からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むことができる。
一実施例において、前記癌は大腸癌であり、大腸癌特異的挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）及び／又は欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子は、配列番号１～３０の配列からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むガイドＲＮＡでよい。
一実施例において、前記癌は骨肉腫であり、骨肉腫特異的挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）及び／又は欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子は、例えば、配列番号３１～６０の配列からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むガイドＲＮＡ又は配列番号９１～１２０の配列からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むガイドＲＮＡでよい。
一実施例において、正常細胞固有の挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）及び／又は欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子は、配列番号６１～９０の配列からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むガイドＲＮＡでよい。
一実施例において、前記癌は膠芽細胞腫であり、膠芽細胞腫特異的挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）及び／又は欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子は、例えば、配列番号１２１～１３６からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むガイドＲＮＡでよい。
一実施例において、前記癌は肺癌であり、肺癌特異的挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）及び／又は欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子は、例えば、配列番号１３７～１６３からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むガイドＲＮＡでよい。
本発明の実施例によれば、大腸癌細胞株であるＨＣＴ１１６、骨肉腫細胞株であるＵ２ＯＳ、膠芽細胞腫細胞株であるＧＢＬ－６７、肺癌組織及び正常細胞を不死化（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）した細胞株ＲＥＰ１細胞のそれぞれにおいて癌特異的ＩｎＤｅｌを確認し、これを特異的に認識するガイドＲＮＡを作製してＤＮＡ ＤＳＢを誘導した後、細胞生長を確認した。具体的に、大腸癌細胞株であるＨＣＴ１１６のＩｎＤｅｌを特異的に認識するガイドＲＮＡは、配列番号１～３０の配列を含み、骨肉腫細胞株であるＵ２ＯＳのＩｎＤｅｌを特異的に認識するガイドＲＮＡは、配列番号３１～６０又は配列番号９１～１２０の配列を含み、膠芽細胞腫であるＧｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａのＩｎＤｅｌを特異的に認識するガイドＲＮＡは、配列番号１２１～１３６からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含み、肺癌組織のＩｎＤｅｌを特異的に認識するガイドＲＮＡは、配列番号１３７～１６３からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含み、正常細胞株であるＲＥＰ１のＩｎＤｅｌを特異的に認識するガイドＲＮＡは、配列番号６１～９０の配列を含む。
細胞株特異的なＩｎＤｅｌを全長遺伝体解読（ＷＧＳ）によって確認した後、当該領域を強く結合するＰＡＭサイト領域に含むようにガイドＲＮＡを設計する。設計されたガイドＲＮＡは、正常を代表するヒト標準遺伝体に確認して、非特異的反応がないことを確認する。その後、ＩｎＤｅｌサイトの長さを考慮して任意的順位を付与し、これに基づいて全ての染色体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）に均一にガイドＲＮＡが設計され得るようにし、最終ガイドＲＮＡ組合せを完成する。この実施例において３０個のガイドＲＮＡを使用しているが、この数字は、癌細胞の種類及びＤＳＢを起こす実験方法にしたがって調整可能である。
本発明に係るヌクレアーゼ及び切断因子、例えばガイドＲＮＡは、（ａ）異なる配列の複数のガイドＲＮＡ及びヌクレアーゼ、例えばＣａｓタンパク質を発現させる核酸配列を含むベクター、（ｂ） 異なる配列の複数の複数のガイドＲＮＡ及びヌクレアーゼ、例えばＣａｓタンパク質で構成されたリボ核タンパク質（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＲＮＰ）又はＲＧＥＮ（ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ）、又は（ｃ）一つ以上のガイドＲＮＡ及びヌクレアーゼ、例えばＣａｓタンパク質でコードされるｍＲＮＡの構成によって細胞内に伝達されてよいが、これに限定されない。
一実施例において、前記ベクターはウイルスベクターでよい。前記ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルスパルボウイルス（例えば、アデノ関連（ａｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ウイルス（ＡＡＶ））、コロナウイルス、オルトミクソウイルス（ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）のような陰性鎖ＲＮＡウイルス（例えば、インフルエンザーウイルス）、ラブドウイルス（ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、例えば狂犬病及び小胞性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）（例えば、麻疹及びセンダイ（Ｓｅｎｄａｉ））、アルファウイルス（ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）及びピコルナウイルス（ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ））のような陽性鎖ＲＮＡウイルス、及びヘルペスウイルス（例えば、単純疱疹（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ）ウイルスタイプ１及び２、エプスタイン（Ｅｐｓｔｅｉｎ）・バー（Ｂａｒｒ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ））、アデノウイルスを含む二重鎖のＤＮＡウイルス、ポックスウイルス（ｐｏｘｖｉｒｕｓ）（例えば、牛痘（ｖａｃｃｉｎｉａ）、鶏痘（ｆｏｗｌｐｏｘ）又はカナリア痘瘡（ｃａｎａｒｙｐｏｘ））などでよい。
前記ベクターはそれぞれ、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リポフェクション、ウイルスベクター、ナノパーティクル（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）の他、ＰＴＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）融合タンパク質方法などによって生体内又は細胞内に伝達されてよい。
場合によって、ＤＮＡ二重螺旋切断によって細胞死滅効率を上げるために、ＤＮＡ二重螺旋修復を阻害するよう、例えば、Ｃａｆｆｅｉｎｅ、Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ、ＣＰ－４６６７２２、ＫＵ－５５９３３、ＫＵ－６００１９、ＫＵ－５５９４０３からなる群から選ばれる一つ以上のＡＴＭ（Ａｔａｘｉａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ ｍｕｔａｔｅｄ）阻害剤、Ｓｃｈｉｓａｎｄｒｉｎ Ｂ、ＮＵ６０２７、ＮＶＰ－ＢＥＺ２３５、ＶＥ－８２１、ＶＥ－８２２（ＶＸ－９７０）、ＡＺ２０、ＡＺＤ６７３８からなる群から選ばれる一つ以上のＡＴＲ（Ａｔａｘｉａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ ａｎｄ Ｒａｄ－３ ｍｕｔａｔｅｄ）阻害剤、又はＤＮＡ－ＰＫｃｓ（ＤＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｓｕｂｕｎｉｔ）のＤＮＡ二重螺旋修復阻害剤をさらに含むことができる。
本発明は、ヌクレアーゼ及び癌細胞固有の挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）及び／又は欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子を含む癌治療用組成物に関する。また、本発明は、ヌクレアーゼ及び癌細胞固有の挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）及び／又は欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子を個体に投与する段階を含む癌治療方法に関する。
また、本発明によれば、患者の癌細胞固有の挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）及び／又は欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子及びヌクレアーゼを含む、患者オーダーメイド型の癌治療用組成物に関する。
患者固有とは、患者別の特性又は患者の疾病特性を十分に反映して効果的に癌を治療できることを意味する。患者オーダーメイド型の癌治療用組成物を、治療剤の選別及び治療方法の選択などに有用に使用することができる。
前記ゲノム配列の変異を含む細胞は、 配列の変化によって細胞の活性が正常細胞と異なっている細胞を意味し、例えば、遺伝的変異による疾患発病状態の細胞、具体的に、癌細胞を意味できる。
前記癌は、例えば、黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝癌、甲状腺腫瘍、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、乳癌、前立腺癌、膠芽細胞腫、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸癌、膵癌、食道癌腫、頭頚部癌、中皮腫、肉腫、骨肉腫、胆管癌又は表皮癌などであり得るが、これに制限されるものではない。
全ての癌細胞には、正常細胞に見られない新しいＤＮＡ配列が挿入されたり（Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ：ＩＮ）、正常細胞のＤＮＡ一部が欠失される（Ｄｅｌｅｔｉｏｎ：Ｄｅｌ）現象が多数観察され、各癌細胞ごとに特異的に挿入／欠失されたＤＮＡ配列が存在し得る。
細胞は、ＤＮＡ二重螺旋が切断すると、これを修復しようとするＤＮＡ損傷修復機序がある。しかし、このような損傷修復機序は、ＤＮＡ二重螺旋切断の数が少ない場合には効果的に修復するが、その数が多くなると死滅することになる。バクテリアの場合、１個のＤＮＡ二重螺旋切断でバクテリアが死滅するが、動物細胞では、それよりも多いＤＳＢが必要であると知られている。
本発明によれば、上の事実に基づき、ゲノム配列の変異を含む細胞、例えば癌細胞のＩｎＤｅｌを見つけてそれを認識できる切断因子を作製し、ヌクレアーゼを用いてゲノム配列の変異を含む細胞、例えば癌細胞などを特異的に死滅するように誘導することができる。
このようなＤＮＡ二重螺旋切断の手段であるヌクレアーゼは、制限酵素（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ）、ＺＮＦＮ（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）又はＣａｓタンパク質であるが、これに制限されるものではない。前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ３、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１（ＣＲＩＳＰＲ ｆｒｏｍ Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １）、Ｃａｓ６、Ｃ２ｃ１２又はＣ２ｃ２であり得るが、これに制限されるものではない。
前記Ｃａｓタンパク質は、コリネバクター（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アゾスピリラム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ネイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パービバキュラム（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ニトラティフラクター（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及びカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選ばれるＣａｓタンパク質のオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）を含む微生物属に由来し、これらから単純分離されたもの又は組み換えられたものであり得る。
ゲノム配列の変異を含む細胞の一種である癌細胞固有のＩｎＤｅｌを含む核酸配列は、例えば、ＩｎＤｅｌをターゲットとしてヌクレアーゼによって核酸配列内ＤＮＡのＤＳＢが起こる遺伝子部位を意味するもので、核酸配列内ヌクレアーゼが特異的に認識する配列、例えばヌクレアーゼがＣａｓ９である場合、Ｃａｓ９タンパク質が認識するＰＡＭ配列の５’末端及び／又は３’末端に隣接して位置する約１７ｂｐ～２３ｂｐ長の核酸配列を意味することができる。
ゲノム配列の変異を含む細胞である、癌細胞固有のＩｎＤｅｌを含む核酸配列は、当該配列部位の２本のＤＮＡ鎖のうち、ＰＡＭ配列が位置する鎖の核酸配列で表示される。この時、実際にガイドＲＮＡが結合するＤＮＡ鎖は、ＰＡＭ配列が位置する鎖の相補的鎖であるため、前記ガイドＲＮＡに含まれた標的化配列は、ＲＮＡ特性のためＴをＵに変更する以外は、ＩｎＤｅｌを含む核酸配列と同じ核酸配列を有する。
前記Ｃａｓ９タンパク質がストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のものである場合、前記ＰＡＭ配列は、５’－ＮＧＧ－３’（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、又はＣ）であり、ゲノム配列の変異を含む細胞固有のＩｎＤｅｌを含む核酸配列は、配列内５’－ＮＧＧ－３’配列の５’末端及び／又は３’末端に隣接して位置する遺伝子部位であり、例えば、最大長が約５０ｂｐ又は約４０ｂｐである遺伝子部位であり得る。
前記Ｃａｓ９タンパク質がストレプトコッカスサーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のものである場合、前記ＰＡＭ配列は、５’－ＮＮＡＧＡＡＷ－３’（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、又はＣ）であり、ゲノム配列の変異を含む細胞固有のＩｎＤｅｌを含む核酸配列は、配列内５’－ＮＮＡＧＡＡＷ－３’配列の５’末端及び／又は３’末端に隣接して位置する遺伝子部位であり、例えば、最大長が約５０ｂｐ又は約４０ｂｐである遺伝子部位であり得る。
前記Ｃａｓ９タンパク質がスタフィロコッカスアウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のものである場合、前記ＰＡＭ配列は、５’－ＮＮＧＲＲＴ－３’（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、又はＣで、ＲはＡ又はＧである。）であり、ゲノム配列の変異を含む細胞固有のＩｎＤｅｌを含む核酸配列は、配列内５’－ＮＮＧＲＲＴ－３’配列の５’末端及び／又は３’末端に隣接して位置する遺伝子部位であり、例えば、最大長が約５０ｂｐ又は約４０ｂｐである遺伝子部位であり得る。
前記Ｃａｓ９タンパク質がカンピロバクタージェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来のものである場合、前記ＰＡＭ配列は、５’－ＮＮＮＮＲＹＡＣ－３’（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、又はＣで、ＲはＡ又はＧで、ＹはＣ又はＴである。）であり、ゲノム配列の変異を含む細胞固有のＩｎＤｅｌを含む核酸配列は、配列内５’－ＮＮＮＮＲＹＡＣ－３’配列の５’末端及び／又は３’末端に隣接して位置する遺伝子部位であり、例えば、最大長が約５０ｂｐ又は約４０ｂｐである遺伝子部位であり得る。
本発明で切断因子とは、正常細胞と比較してゲノム配列の変異を含む細胞の核酸配列のうち変異して変わった部分を認識して切断を誘導することができる塩基配列を指す。
本発明において前記切断因子は、正常細胞の塩基配列と比較して細胞の死滅を誘導できる別の配列の十分な数の複数個でなければならず、好ましくは１個～３０個、より好ましくは１０個～３０個、さらに好ましくは１６個～３０個であり得るが、細胞の種類又は切断因子にしたがって数字が変わってもよい。
ゲノム配列の変異を含む細胞、例えば癌細胞固有のＩｎＤｅｌを含む核酸配列を特異的に認識する切断因子は、例えばガイドＲＮＡでよい。前記ガイドＲＮＡは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ）、及び単一ガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ；ｓｇＲＮＡ）からなる群から選ばれる１種以上でよく、具体的に、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとが結合した二重鎖ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体、又はｃｒＲＮＡ又はその一部とｔｒａｃｒＲＮＡ又はその一部とがオリゴヌクレオチドリンカーで連結された単一鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよい。
ゲノム配列の変異を含む細胞固有のＩｎＤｅｌを含む核酸配列を特異的に認識するガイドＲＮＡは、ＰＡＭ配列が位置するＤＮＡ鎖の相補的な鎖のヌクレオチド配列と９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列相補性を有するヌクレオチド配列を意味するものであり、前記相補的鎖のヌクレオチド配列と結合可能である。
前記ガイドＲＮＡは、次のような段階によって作製可能である：癌細胞と一般細胞のＷＧＳ結果データを比較して癌細胞特異的なＩｎＤｅｌを探す。これに基づいて、ガイドＲＮＡ作製条件を満たす癌細胞特異的なガイドＲＮＡを設計する。その後、ＩｎＤｅｌサイトの長さを考慮して任意的順位を付与し、全ての染色体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）に均一にガイドＲＮＡが設計され得るようにして、最終ガイドＲＮＡ組合せを完成する。
ガイドＲＮＡ作製条件は、次の通りである。（ａ）ＰＡＭサイト以外のガイドＲＮＡの塩基配列長は、２０塩基対（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）である。（ｂ）ガイドＲＮＡに存在するグアニン（ｇｕａｎｉｎｅ）とシトシン（ｃｙｔｏｓｉｎｅ）との和の比率が、４０％～６０％である。（ｃ）ＩｎＤｅｌがＰＡＭサイト近傍のすぐ前の領域に存在する。（ｄ）最大単一重合体（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒ）長が４塩基対（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）以下である。（ｅ）一般細胞のＷＧＳ結果データに一つの不一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）を許容するマッピングをしたとき、マッピング結果があってはいけない。
これに基づいて作製された前記ガイドＲＮＡは、例えば、配列番号１～１６３からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むことができる。癌細胞死滅を誘導できるガイドＲＮＡの数は、具体的に、約１～４０余個、約１５～２５個、又は約１０～２０個でよい。前記ガイドＲＮＡは、例えば、配列番号１～３０からなる群から選ばれる一つ以上の配列、配列番号３１～６０からなる群から選ばれる一つ以上の配列、配列番号６１～９０からなる群から選ばれる一つ以上の配列、配列番号９１～１２０からなる群から選ばれる一つ以上の配列、配列番号１２１～１３６からなる群から選ばれる一つ以上の配列、配列番号１３７～１６３からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むことができる。
一実施例において、前記癌は大腸癌であり、大腸癌特異的挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）及び／又は欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子は、配列番号１～３０の配列からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むガイドＲＮＡでよい。
一実施例において、前記癌は骨肉腫であり、骨肉腫特異的挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）及び／又は欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子は、例えば、配列番号３１～６０の配列からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むガイドＲＮＡ又は配列番号９１～１２０の配列からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むガイドＲＮＡでよい。
一実施例において、正常細胞固有の挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）及び／又は欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子は、配列番号６１～９０の配列からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むガイドＲＮＡでよい。
一実施例において、前記癌は膠芽細胞腫であり、膠芽細胞腫特異的挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）及び／又は欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子は、例えば、配列番号１２１～１３６からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むガイドＲＮＡでよい。
一実施例において、前記癌は肺癌であり、肺癌特異的挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）及び／又は欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子は、例えば、配列番号１３７～１６３からなる群から選ばれる一つ以上の配列を含むガイドＲＮＡでよい。
本発明に係るヌクレアーゼ及び切断因子、例えばガイドＲＮＡは、（ａ） 異なる配列の複数のガイドＲＮＡ及びヌクレアーゼ、例えばＣａｓタンパク質を発現させる核酸配列を含むベクター、（ｂ） 異なる配列の複数のガイドＲＮＡ及びヌクレアーゼ、例えばＣａｓタンパク質で構成されたリボ核タンパク質（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＲＮＰ）又はＲＧＥＮ（ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ）、又は（ｃ）一つ以上のガイドＲＮＡ及びヌクレアーゼ、例えばＣａｓタンパク質にコードされるｍＲＮＡの構成によって細胞内に伝達されてよいが、これに限定されない。
一実施例において、前記ベクターはウイルスベクターでよい。前記ウイルスベクターはレトロウイルス、アデノウイルスパルボウイルス（例えば、アデノ関連（ａｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ウイルス（ＡＡＶ））、コロナウイルス、オルトミクソウイルス（ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）のような陰性鎖ＲＮＡウイルス（例えば、インフルエンザーウイルス）、ラブドウイルス（ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、例えば、狂犬病及び小胞性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）（例えば、麻疹及びセンダイ（Ｓｅｎｄａｉ））、アルファウイルス（ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）及びピコルナウイルス（ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ））のような陽性鎖ＲＮＡウイルス、及びヘルペスウイルス（例えば、単純疱疹（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ）ウイルスタイプ１及び２、エプスタイン（Ｅｐｓｔｅｉｎ）・バー（Ｂａｒｒ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ））、アデノウイルスを含む二重鎖のＤＮＡウイルス、ポックスウイルス（ｐｏｘｖｉｒｕｓ）（例えば、牛痘（ｖａｃｃｉｎｉａ）、鶏痘（ｆｏｗｌｐｏｘ）又はカナリア痘瘡（ｃａｎａｒｙｐｏｘ））などでよい。
前記ベクターはそれぞれ、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リポフェクション、ウイルスベクター、ナノパーティクル（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）の他、ＰＴＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）融合タンパク質方法などによって生体内又は細胞内に伝達されてよい。
場合によって、ＤＮＡ二重螺旋切断を用いて細胞死滅効率を上げるために、ＤＮＡ二重螺旋修復を阻害するよう、例えば、Ｃａｆｆｅｉｎｅ、Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ、ＣＰ－４６６７２２、ＫＵ－５５９３３、ＫＵ－６００１９、ＫＵ－５５９４０３からなる群から選ばれる一つ以上のＡＴＭ（Ａｔａｘｉａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ ｍｕｔａｔｅｄ）阻害剤、Ｓｃｈｉｓａｎｄｒｉｎ Ｂ、ＮＵ６０２７、ＮＶＰ－ＢＥＺ２３５、ＶＥ－８２１、ＶＥ－８２２（ＶＸ－９７０）、ＡＺ２０、ＡＺＤ６７３８からなる群から選ばれる一つ以上のＡＴＲ（Ａｔａｘｉａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ ａｎｄ Ｒａｄ－３ｍｕｔａｔｅｄ）阻害剤、又はＤＮＡ－ＰＫｃｓ（ＤＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｓｕｂｕｎｉｔ）のＤＮＡ二重螺旋修復阻害剤をさらに含むことができる。
さらに、本発明によれば、患者の癌細胞から癌細胞特異的なｉｎｄｅｌを選別し、これを認識する切断因子を製造してヌクレアーゼ及び切断因子を含む組成物を患者に伝達することを含む患者オーダーメイド型の癌治療方法に関する。
本発明の組成物、方法及び用途は、それを必要とする対象体に充分量又は有効量で投与されてよい。‘有効量’又は‘充分量’は、単一又は多重容量で単独で又は一つ以上の他の治療用組成物、プロトコル、又は治療療法との組合せにより、任意の期間において対象体に有益さを与えたり、或いは対象体に予想又は要望される結果を提供しりたする量のことを指す。製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病態、投与時間、投与経路、排出速度、及び反応感応性のような要因によって様々に処方可能である。
ヌクレアーゼ及びこれをコードする核酸及びゲノム配列の変異を含む細胞、例えば癌細胞固有の挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）及び／又は欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を含む核酸配列を特異的に認識する切断因子の発現カセットを含むベクター、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、又はアグロバクテリウムベクターが伝達のために用いられてよい。具体的に、ウイルスベクターであるＡＡＶ（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）ベクターが伝達のために用いられてよい。
治療学的効果を達成するためのＡＡＶベクター容量は、ベクター遺伝体容量／体重ｋｇ（ｖｇ／ｋｇ）で提供されてよいが、（ａ）投与経路、（ｂ）治療学的効果を達成するために要求される治療遺伝子の発現レベル、（ｃ）ＡＡＶベクターに対する任意の宿主免疫反応、（ｄ）発現したタンパク質の安定度のような要件によって変動されもよい。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
実施例１．ＤＳＢによる細胞死滅効果確認
数個のＤＳＢが細胞死滅を誘導でき、全ての癌細胞は固有のＩｎ／Ｄｅｌ配列を有するということから、ＨＣＴ１１６、Ｕ２ＯＳ、及びＲＥＰ１細胞において固有のＩｎ／Ｄｅｌ配列をＷＧＳ（ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって確認した。その後、次の表１～表３のように、癌細胞が持つ固有のＤＮＡ挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）配列中に６～８ｂｐｄｍｌ挿入サイズで染色体上に均一に広がっている部位を３０個選定して細胞株別ｃｒＲＮＡを作製し、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰ複合体で細胞に形質感染させた後、ｃｒＲＮＡ特異性及び細胞生存度を確認した。
Figure 0007410154000001
Figure 0007410154000002
Figure 0007410154000003
Figure 0007410154000004
Figure 0007410154000005
Figure 0007410154000006
まず、ＤＮＡ ＤＳＢが同時多発的に発生したとき、細胞が死滅するか否かを確認するために実験を行った。ＡｓｉＳＩ制限酵素にエストロゲン受容体（ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）のドメインを挿入して作った細胞に４－ＯＨＴ（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）を処理した時に細胞の死滅を確認し、その結果を図１に示した。
ＡｓｉＳＩ制限酵素は、４－ＯＨＴを処理すると、核中に入って特定配列を認識してＤＮＡ ＤＳＢ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ）を作るが、およそ１００個のＤＳＢが作られる。ＤＳＢの生成による細胞生存率をコロニー形成アッセイ（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ａｓｓａｙ）によって確認した。２００個の細胞をシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）し、２日後から４－ＯＨＴを周期的に処理（２～３日に１回ずつ培養培地に処理）してＤＳＢｓを作り、２週後にコロニーが形成されるか否かをメチレンブルー染色（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）によって確認した。また、細胞ごとにコロニーの大きさが異なるため、染色したサンプルを脱染色（ｄｅｓｔａｉｎ）して相対的細胞生存度（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ）も確認したとき、染色時に確認した結果と類似することが分かった。
実施例２．ＣＲＩＳＰＲシステムのｉｎ ｖｉｔｒｏ作動有無の確認
実施例１で作製されたｃｒＲＮＡを用いてＣＲＩＳＰＲシステムが作動するか否かを調べるために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断アッセイ（ｃｌｅａｖａｇｅ ａｓｓａｙ）を行った。まず、ＰＣＲによって挿入配列（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の前後部分のＤＮＡを５００ｂｐサイズに増幅して精製後に、作製されたｃｒＲＮＡを用いてＣＲＩＰＳＲシステムによるＤＮＡの切断がなされるか確認した。
ＲＰＥ１、Ｕ２ＯＳ、ＨＣＴ１１６細胞においてゲノムＤＮＡをＱｉａｍｐ ＤＮＡミニキッドを用いて抽出し、ガイドＲＮＡを中心に約５００ｂｐ長となるようにする両方向のプライマーを注文作製した。ｉＰｒｏｏｆ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼを用いてアニーリング温度にしてゲノムＤＮＡを増幅した後、１％アガロースゲルで増幅されたＤＮＡを切断した後、Ｑｉａｇｅｎ ＱｉＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて抽出（ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）を行った。
１０ｕＭ ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｅｒＲＮＡ複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）を作るために、９５℃で５分間置いた後、常温で熱が蒸発するまで待つ。その後、ＲＮＰ複合体を生成するために、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｅｒＲＮＡ複合体とＣａｓ９ヌクレアーゼを１ｕＭ濃度に、ＰＢＳを用いて調整した後、常温で１０分間インキュベーションする。
１０Ｘ Ｃａｓ９ヌクレアーゼ反応バッファー（２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１Ｍ Ｎａｃｌ、５０ｍＭ Ｍｇｃｌ（２）、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ６．５）、１ｕＭ Ｃａｓ９ ＲＮＰ、１００ｎＭ ＤＮＡ基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ヌクレアーゼフリー水（Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ）を混合し、３７℃で３時間分解（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）をする。３時間後、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼからＤＮＡ基質をリリース（ｒｅｌｅａｓｅ）するために、２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ １ｕｌ添加後に、５６℃で１０分間インキュベーションする。分割された（ｃｌｅａｖｅｄ）ゲノムＤＮＡを１％アガロースゲルで確認した。
その結果を図２に示し、アガロースゲル上で元来の５００ｂｐサイズと３００ｂｐサイズの２つのＤＮＡ切片が確認された。このことから、作製されたｃｒＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲシステムがよく作動していることを確認した。
実施例３．ＤＮＡ ＤＳＢ誘導後の細胞の生長率確認
大腸癌ＨＣＴ１１６細胞と骨肉腫Ｕ２ＯＳ細胞に３０個の特異的ＲＮＰ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）複合体を形質感染してＤＮＡ ＤＳＢを誘導した後、細胞の生長率をコロニー形成アッセイ（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ａｓｓａｙ）によって確認した。
それぞれ５００個と１０００個の細胞を分注した後、細胞株別特異的ＲＮＰ複合体を形質感染した。Ｕ２ＯＳ細胞は６０ｍｍ皿に１０００個、ＨＣＴ１１６細胞は５００個分注した後、２日間安定化させ、ガイドＲＮＡ形質転換する準備をする。１ｕＭ ｃｒＲＮＡと１ｕＭ ｔｒａｃｅｒＲＮＡ複合体を作るために、９５℃５分間置いた後、常温で熱が蒸発するまで待つ。その後、ＲＮＰ複合体を生成するために、９６ウェル皿に１ｕＭ ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｅｒＲＮＡ複合体１．５ｕｌと１ｕＭ Ｃａｓ９ヌクレアーゼ１．５ｕｌ、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地２２ｕｌを常温で５分間反応する。２５ｕｌ体積のＲＮＰ複合体３０個とＲＮＡｉｍａｘトランスフェクション試薬１．２ｕｌの３０倍、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地２３．８ｕｌの３０倍と、総体積１．５ｍｌを２０分間常温で置いて形質転換複合体を作る。また、細胞株別特異的ｃｒＲＮＡを用いたＤＳＢの誘導が他の細胞株では引き起こされないということを確認するために、大腸癌細胞に骨肉腫細胞固有のＲＮＰ複合体を形質感染し、同様に骨肉腫細胞に大腸癌特異的ＲＮＰ複合体を形質感染した。このとき、細胞内のＤＳＢ修復システム（ＤＳＢ ｒｅｐａｉｒ ｓｙｓｔｅｍ）を抑制するために、ＡＴＭ阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）である２ｕＭ ＫＵ ５５９３３を共に処理した。その後、細胞の生長を観察しつつ３日ごとに培地を入れ換え、ＡＴＭ阻害剤を共に処理してくれた。２週後にメチレンブルー（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｂｌｕｅ）染色によって細胞の生長を確認した。染色されたコロニーは、Ｉｍａｊｅ Ｊプログラムを用いてコロニー個数と領域（ａｒｅａ）を互いに比較して結果をまとめる。
その結果を図３に示した。それぞれの細胞株に固有なＲＮＰ複合体を形質感染した実験群では、ＤＳＢによって細胞が殆ど死滅したことが確認でき、特異的ＲＮＰ複合体は他の細胞株ではＤＳＢを引き起こさず、細胞が生長し続くことを確認した。
ただし、骨肉腫では大腸癌特異的ＲＮＰ複合体を形質感染したとき、細胞の生長がある程度阻害される現象が見られた。これは、多量（３０個）の形質感染によって細胞の成長が阻害されたものと考えられる。これを補完し、且つ細胞死滅のための最小限のＲＮＰ複合体を定めるために、ＨＣＴ１１６及びＵ２ＯＳ ｇＲＮＡをＲＰＥ１細胞に形質感染させてｃｒＲＮＡ特異度を確認し、最小ｇＲＮＡ数を各癌細胞当たりに２０個程度に適正化させる。
実施例４．癌特異的ＩＮＤＥＬによる細胞死滅（Ｃａｎｃｅｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩＮｓｅｒｔｉｏｎ－ＤＥＬｅｔｉｏｎｓ ｉｎｄｕｃｅｄ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ＣＩＮＤＥＬＡ）効果確認
ＷＧＳ（ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を用いて、ｓａＣａｓ９に対する新規なＵ２ＯＳ細胞株特異的ｃｒＲＮＡを設計してＡＡＶにパッケージングした。Ｕ２ＯＳ細胞株特異的ｃｒＲＮＡの具体的配列は、次の通りである。
Figure 0007410154000010
Figure 0007410154000011
免疫蛍光（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）及び流細胞分析（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いて、ＡＡＶの細胞感染率を測定した。ＨＡ細胞内染色は、６０ｍｍ皿に０．１Ｍ細胞を含め（０日目）、ＨＡを含めないか、或いは０．２５ｍｌ、０．５ｍｌ、１ｍｌのＨＡを含めてＡＡＶを感染させ（２日目）、細胞を収穫した後に染色した（３日目）。ＨＡ（１：３００）は２時間室温条件、マウス４８８（１：５００）は１時間室温条件に置き、Ｒｎａｓｅ Ａは３７℃、３０分条件、ＰＩは室温、１０分条件に置いた。その結果を図４に示した。。核ＨＡタグ陽性細胞の比率は、１日目に約８０％程度と示され、比率は、２日目及び３日目にさらに減少した。
８＊１０４ Ｕ２ＯＳ細胞ウェルをチャンバースライドに播種して一晩成長させた。細胞を冷たいＰＢＳ（ｉｃｅ－ｃｏｌｄ ＰＢＳ）で２回洗浄した。１ｍｌの冷たい透過溶液（ＣＳＫバッファー＋０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）を１０分間適用した。細胞を１ｍｌの冷たいＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳに４％パラホルムアルデヒド５００μｌを使用して室温で１５分間細胞を固定した。
定着液を除去し、１ｍｌの１００％メタノールを添加した後、－２０℃で１０分間インキュベーションした。細胞を１ｍｌ ＰＢＳで２回洗浄した。
ＰＢＳを１０％ ＦＢＳ ５００μｌで３０分間遮断し、遮断溶液を除去した後、適切な１次抗体を１時間遮断溶液に追加した。細胞をＰＢＳ中で０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で５分間３回洗浄した。暗条件において室温で３０分間２次抗体を加えた後、ＰＢＳに０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００細胞を５分間３回洗浄し、ＰＢＳ及びＤＷに追加洗浄工程を行った。周囲のチャンバーは、スライドから除去した。
マウンティング試薬（ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ）を１滴ずつ各サンプルに塗布し、カバーガラスで覆った。その状態で乾燥し、スライドを完全に密閉した。ＬＳＭ ８８０（ＺＥＩＳＳ）及びＺＥＮソフトウェア（ＺＥＩＳＳ）を用いて焦点を感知して視角化した。
その結果を図５に示した。免疫蛍光法から、ＡＡＶ粒子が十分に形質感染され、表７のｃｒＲＮＡはＤＮＡ ＤＳＢに該当するｒＨ２ＡＸフォーカスを生成できることが明らかになった。
３０個のＵ２ＯＳ細胞株特異的ｃｒＲＮＡを用いて、ｓａＣＡＳ９ ＡＡＶシステムを開発し、ＡＡＶ粒子をＵ２ＯＳ細胞に形質導入した。８＊１０４ Ｕ２ＯＳ細胞を６ウェルプレートにプレーティングして一晩インキュベーションし、９＊１０９ＡＡＶ粒子が細胞にそれぞれ形質導入された。図６によれば、２４時間後に、ＥＶＯＳ細胞イメージングシステムによってＵ２ＯＳ特異的ｃｒＲＮＡ依存性細胞死滅が観察された。しかし、非特異的ｃｒＲＮＡ、ＨＣＴ１１６細胞特異的ｃｒＲＮＡは、細胞死滅を誘導することができなかった。図６の結果から、ＡＡＶシステムによって細胞株特異的な選択的細胞死滅が誘導できることが確認された。
正常細胞であるＲＰＥ１細胞株においても細胞株特異的な選択的細胞死滅があるか確認した。図７によれば、実施例２と同様に、Ｕ２ＯＳ細胞特異的ｓａＣＡＳ９ ＡＡＶシステムは作動し、Ｕ２ＯＳ細胞において細胞死滅を誘導できるが、ＲＰＥ１細胞においてＵ２ＯＳ細胞株特異的ＡＡＶシステムによって誘導される細胞死滅はなかった。
癌特異的ＩＮＤＥＬによる細胞死滅（Ｃａｎｃｅｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩＮｓｅｒｔｉｏｎ－ＤＥＬｅｔｉｏｎｓ ｉｎｄｕｃｅｄ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ＣＩＮＤＥＬＡ）による細胞生存（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）比率を測定した。７２時間後、ＡＡＶ粒子が形質導入された細胞を室温で１０分間１％メチレンブルーで染色した。細胞をＰＢＳで３回１０分間洗浄し、室温で乾燥させた。細胞を５００ｕｌの１０％酢酸溶液で脱色し、ＯＤ値を測定した。癌細胞細胞生存率（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）に対する結果を図８に示した。
流細胞分析を用いて細胞生存率を時間依存的方式で測定した。Ｕ２ＯＳ及びＲＰＥ１細胞の両方にＵ２ＯＳ細胞特異的ｃｒＲＮＡ ＡＡＶ粒子を形質導入した。アジ化物（ａｚｉｄｅ）を含まないａｂｄ血清／タンパク質を含まないＰＢＳを用いて、細胞を１＊１０６／ｍｌに再懸濁した。１ｍｌ細胞当たりに１ｕｌ ｐｆ ＦＶＤを入れて直ちにボルテックスした。４℃で３０分間インキュベーションし、光を遮断した。ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳ ＶＥＲＳＥ（ＢＤ Ｉｎｃ．）機械を確認した。図９によれば、ＡＡＶ依存性細胞死滅は、ｃｒＲＮＡ特異的細胞株のみにおいて誘導されることが確認された。
実施例５．膠芽細胞腫特異的ＩＮＤＥＬによる細胞死滅効果確認
患者由来膠芽細胞腫からＩＮＤＥＬによる細胞死滅効果を確認した。細胞を低酸素チャンバーで培養した以外は、実施例４と同じ方法で実験した。膠芽細胞腫に使用可能な配列は１６個だけであった。１６個の膠芽細胞腫特異的配列による選択的細胞死滅を確認するということは、１６個のＤＮＡ ＤＳＢのみを生成させることができることを意味する。
Figure 0007410154000012
１６個の膠芽細胞腫特異的配列に対する連続的形質導入を行った。ＮＳＣ－１０細胞を正常対照群として用いた。図１０によれば、膠芽細胞腫において選択的癌細胞死滅が起こることが確認できる。
実施例６．ＡＴＭキナーゼを含むことによる細胞死滅効果
ＡＴＭキナーゼ抑制剤を含有又は非含有するＡＡＶ粒子を実施例５の膠芽細胞腫細胞に形質導入し、実施例４及び実施例５と同じ方法で実験した。２４時間の形質導入後、細胞を室温で１０分間１％メチレンブルーで染色した。細胞をＰＢＳで３回１０分間洗浄し、室温で乾燥させた。細胞を５００ｕｌの１０％酢酸溶液で脱色し、ＯＤを測定した。結果を図１１に示した。
実施例７．肺癌特異的ＩＮＤＥＬによる細胞死滅効果確認
癌特異的ＩＮＤＥＬ誘導細胞死滅（ＣＩＮＤＥＬＡ）効果を確認するために、患者由来の肺癌組織をマウス異種移植に使用した。患者由来の肺癌組織をマウスに挿入し、２８個の肺癌組織特異的ｃｒＲＮＡを含むＡＡＶ粒子をマウスに連続して注射した。
Figure 0007410154000013
Figure 0007410154000014
ＡＡＶ粒子を２日ごと注入し、腫瘍サイズを測定した。その結果を、図１２に示した。図１２によれば、正常細胞は時間依存的に成長したが、癌細胞は２回のＡＡＶ注射で成長しなかった。
以上、本発明の内容における特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は単に好ましい実施様態であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項とそれらの等価物によって定義されるといえよう。

Claims (12)

  1. Ｃａｓ又はＣａｓをコードする核酸、及び
    ゲノム配列の変異を含む細胞固有の変異配列を含む複数の核酸配列を特異的に認識する、別の核酸配列を有する１０～３０のガイドＲＮＡ
    を含む、ゲノム配列の変異を含む細胞の死滅誘導における使用のための組成物。
  2. 前記Ｃａｓ又は前記Ｃａｓをコードする核酸又はガイドＲＮＡが、ベクター及び／又はリボ核タンパク質の形態で伝達される、請求項１に記載の使用のための組成物。
  3. 前記ガイドＲＮＡが癌特異的挿入及び／又は欠失を含む核酸配列を特異的に認識する、請求項1に記載の使用のための組成物。
  4. 前記細胞が、正常細胞には見られないゲノム配列の変異を有する、請求項1に記載の使
    用のための組成物。
  5. 前記ガイドＲＮＡのターゲットが、ゲノム配列の変異を含む細胞及び正常細胞の全ゲノムシークエンス（ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；ＷＧＳ）を行うことによって選択される、請求項1に記載の使用のための組成物。
  6. ゲノム配列の変異を有する細胞が、癌細胞である、請求項1に記載の使用のための組成
    物。
  7. 前記Ｃａｓは、Ｃａｓ９であり、そして、前記Ｃａｓ９は、コリネバクター（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アゾスピリラム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パービバキュラム（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラティフラクター（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及びカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選ばれるＣａｓ９のオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）を含む微生物属に由来し、これらから分離されたもの又は組み換えられたものであることを特徴とする、請求項１に記載の使用のための組成物。
  8. 前記組成物は、ゲノム配列の変異を含む細胞固有の挿入及び／又は欠失を含む核酸配列部位に二重鎖切断（Ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｂｒｅａｋ，ＤＳＢ）を誘導して細胞を死滅させることを特徴とする、請求項１に記載の使用のための組成物。
  9. Ｃａｆｆｅｉｎｅ、Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ、ＣＰ－４６６７２２、ＫＵ－５５９３３、ＫＵ－６００１９、及びＫＵ－５５９４０３からなる群から選ばれる一つ以上のＡＴＭ（Ａｔａｘｉａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ ｍｕｔａｔｅｄ）阻害剤、Ｓｃｈｉｓａｎｄｒｉｎ Ｂ、ＮＵ６０２７、ＮＶＰ－ＢＥＺ２３５、ＶＥ－８２１、ＶＥ－８２２（ＶＸ－９７０）、ＡＺ２０、及びＡＺＤ６７３８からなる群から選ばれる一つ以上のＡＴＲ（Ａｔａｘｉａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ ａｎｄ Ｒａｄ－３ｍｕｔａｔｅｄ）阻害剤、又はＤＮＡ－ＰＫｃｓ（ＤＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｓｕｂｕｎｉｔ）のＤＮＡ二重螺旋修復阻害剤をさらに含む、請求項１に記載の使用のための組成物。
  10. Ｃａｓ又は前記Ｃａｓをコードする核酸、及び
    ゲノム配列の変異を含む細胞固有の変異配列を含む複数の核酸配列を特異的に認識する、別の核酸配列を有する１０～３０のガイドＲＮＡ
    を含む、組成物の製造方法であって、
    前記ガイドＲＮＡが、
    ゲノム配列の変異を含む細胞及び正常細胞の全ゲノムシークエンス（ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；ＷＧＳ）を行うこと；
    ゲノム配列の変異を含む細胞及び正常細胞の全ゲノムシークエンス（ＷＧＳ）を比較して、ゲノム配列の変異を含む細胞特異的な変異配列を選別すること；及び
    前記選別された変異配列を認識するガイドＲＮＡを製造すること、
    によって選択される、組成物の製造方法。
  11. Ｃａｓ又は前記Ｃａｓをコードする核酸、及びゲノム配列の変異を含む細胞固有の変異配列を含む複数の核酸配列を特異的に認識する、別の核酸配列を有する１０～３０のガイドＲＮＡを含む、組成物の製造方法であって、
    前記ガイドＲＮＡが、
    ゲノム配列の変異を含む細胞及び正常細胞の全ゲノムシークエンス（ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；ＷＧＳ）を行うこと；
    ゲノム配列の変異を含む細胞及び正常細胞の全ゲノムシークエンス（ＷＧＳ）を比較して、ゲノム配列の変異を含む細胞特異的な挿入及び／又は欠失を選別すること；及び
    前記選別されたゲノム配列の変異を含む細胞特異的な挿入及び／又は欠失を認識するガイドＲＮＡを製造すること、
    によって選択される、組成物の製造方法。
  12. Ｃａｓ又は前記Ｃａｓをコードする核酸、及び
    患者のゲノム配列の変異を含む細胞固有の変異配列を含む複数の核酸配列を特異的に認識する、別の核酸配列を有する１０～３０のガイドＲＮＡ
    を含む、患者特異的癌の治療における使用のための組成物。
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