JP7402164B2 - ウイルス核酸を解析する方法 - Google Patents

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Description

相互参照
[001] 本願は、２０１８年１月１２日出願の米国仮特許出願第６２／６１７，０７９号及び２０１８年８月１３日出願の米国仮特許出願第６２／７１８，２９０号（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に対する優先権を主張する。
背景
[002] 鼻咽頭がん（ＮＰＣ）は、中国南部及び東南アジアで最も一般的ながんの１つである（Tang et al. Cancer Lett 2016;374:22-30)。ＮＰＣの病理発生は、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）感染に密接に関連し得る。エンデミック地域では、ほとんどすべての患者のＮＰＣがん細胞でＥＢＶゲノムを検出可能である。血漿中の循環細胞フリーＥＢＶ ＤＮＡは、ＮＰＣのバイオマーカーであり得る（Lo et al. Cancer Res 1999;59:1188-91）。血漿中ＥＢＶ ＤＮＡ解析は、ＮＰＣの検出、モニタリング及び予後予測に有用であり得る。
[003] しかしながら、サンプル中のＥＢＶ細胞フリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の量は、各種の対象依存因子（例えば、現在の喫煙習慣）及び対象非依存因子（例えば、周囲温度）に依存して変化する可能性がある。ＮＰＣ検出の偽陽性率を低減するために、ＥＢＶ ｃｆＤＮＡレベルに影響を及ぼす因子を説明し得るとともに、この情報をＮＰＣの存在についてのスクリーニングに組み込み得る、改善された方法、システム及びコンピューター可読媒体の必要性が存在する。
概要
[004] 本明細書に開示されるのは、対象における腫瘍の存在についてスクリーニングする方法であり、本方法は、ａ）対象からの生物学的サンプル中のウイルス由来の細胞フリー核酸の量を決定すること、ｂ）対象の年齢、対象の喫煙状態及び周囲温度からなる群から選択される属性に基づいて細胞フリー核酸の閾値を決定すること、及びｃ）ウイルス由来の細胞フリー核酸の量を閾値と比較し、それにより腫瘍について対象をスクリーニングすることを含む。
[005] 閾値は、対象の喫煙状態に基づいて決定され得る。対象の喫煙状態が喫煙者である場合、閾値は、対象の喫煙状態が喫煙者でない場合よりも高く設定され得る。閾値は、対象の年齢に基づいて決定され得る。閾値は、対象の年齢との正の相関を含み得る。閾値は、周囲温度に基づいて決定され得る。閾値は、周囲温度と負に相関され得る。周囲温度は、対象からサンプルが取得された位置から５０ｋｍ以内の位置で測定された温度であり得る。周囲温度は、対象からサンプルが取得された日の平均周囲温度であり得る。閾値は、対象の年齢及び対象の喫煙状態に基づいて決定され得る。閾値は、対象の年齢及び周囲温度に基づいて決定され得る。閾値は、対象の喫煙状態及び周囲温度に基づいて決定され得る。閾値は、対象の年齢、対象の喫煙状態及び周囲温度に基づいて決定され得る。いくつかの実施形態では、閾値は、対象が糖尿病を有するか、アルコールを摂取するか、運動するか、高血圧を有するか、高脂血症を有するか又は虚血性心疾患を有するかどうかに基づいて決定されない。
[006] ウイルス由来の細胞フリー核酸の量を、属性に基づく閾値と比較することは、細胞フリー核酸の量を、属性に基づかない閾値と比較することと比べてスクリーンの偽陽性率を低減し得る。量は、１ミリリットル当たりのウイルス由来の細胞フリー核酸のコピー数（コピー／ｍＬ）を含み得る。本方法は、生物学的サンプル中のウイルス由来の細胞フリー核酸の量が閾値を上回る場合、腫瘍の存在について第２のスクリーンを実施することをさらに含み得る。第２のスクリーンは、第２の生物学的サンプル中のウイルス由来の細胞フリー核酸のサイズを決定することを含み得る。第２の生物学的サンプルは、その生物学的サンプルと同一であり得る。第２の生物学的サンプルは、その生物学的サンプルと異なり得る。第２のスクリーンは、ウイルスに由来し、且つ所与の範囲内のサイズを有する細胞フリー核酸の量を、対象からの第２の生物学的サンプルから決定することを含み得る。ウイルスに由来し、且つ所与の範囲内のサイズを有する細胞フリー核酸の量を決定することは、第２の生物学的サンプル中の細胞フリー核酸の大規模並列シーケンシングを行って、配列リードを生成することを含み得る。
[007] 生物学的サンプルは、血漿又は血清を含み得る。量を決定することは、細胞フリー核酸の増幅を含み得る。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含み得る。ＰＣＲは、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を含み得る。腫瘍は、鼻咽頭がんであり得る。ウイルスは、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）であり得る。本方法は、スクリーンが、対象に腫瘍が存在することを示すとき、腫瘍について対象を治療することをさらに含み得る。
[008] 本明細書にさらに開示されるのは、本明細書に記載の方法のいずれかの操作を実施するようにコンピューターシステムを制御するための複数の命令を記憶するコンピューター可読媒体を含むコンピューター製品である。
[009] 加えて、本明細書にさらに開示されるのは、本明細書に記載のコンピューター製品のいずれかと、コンピューター可読媒体に記憶された命令を実行するための１つ以上のプロセッサーとを含むシステムである。
参照による組込み
[0010] 本明細書に挙げた刊行物、特許及び特許出願のすべては、あたかも個々の刊行物、特許又は特許出願が具体的且つ個別的に明示されて参照により組み込まれたのと同程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
図面の簡単な説明
[0011] 本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に特定的に示される。本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明及び添付の図面を参照すれば、本発明の特徴及び利点のよりよい理解が得られるであろう。
[0012]非ＮＰＣ対象における年齢と、血漿中エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ＤＮＡの検出率との間の相関を例示する。 [0013]非ＮＰＣ対象におけるスクリーニング日の平均周囲温度と、血漿中ＥＢＶ ＤＮＡの検出率との間の相関を例示する。 [0014]本明細書に提供される方法を実現するようにプログラムされた又は他に構成されたコンピューターシステムを例示する。 [0015]サンプルから検出されたＥＢＶ細胞フリー核酸のレベルに基づいてＮＰＣを検出する方法のフローチャートを例示する。 [0016]第１のｑＰＣＲアッセイを実施すること、及び場合により第２の次世代シーケンシング（ＮＧＳ）ベースアッセイを実施することを含む本開示の例示的方法のフローチャートを示す。
詳細な説明
[0017] 概要
[0018] 本明細書に開示されるのは、対象からの生物学的サンプル、例えば血漿中のウイルス、例えばエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）由来の細胞フリー核酸、例えばＤＮＡの量を決定すること、対象の年齢、対象の喫煙状態及び周囲温度からなる群から選択される属性に基づいて細胞フリー核酸の閾値を決定すること、及びウイルス由来の細胞フリー核酸の量を閾値と比較し、それにより腫瘍について対象をスクリーニングすることを含む、腫瘍、例えば鼻咽頭がんの存在のスクリーニングの方法、システム及びコンピューター可読媒体である。
[0019] 本明細書に記載の方法は、１つ以上の属性に基づいて細胞フリー核酸の閾値を決定又は調整することが可能である。１つ以上の属性（本明細書では特徴ともいう）に基づいて閾値を決定又は調整することは、１つ以上の属性に基づいて閾値を決定又は調整しないことと比べてスクリーンの偽陽性率を低減し得る。偽陽性とは、病態（例えば、腫瘍）を有していないが、本開示のスクリーン若しくは方法又は他のアッセイにより病態を有すると同定される対象を意味し得る。
[0020] 閾値の決定
[0021] 本明細書に提供される方法、システム及びコンピューター可読媒体では、閾値は、対象における腫瘍又は腫瘍のリスクの指標となるウイルス起源の細胞フリー核酸の量であり得る。閾値は、部分的には、ＰＣＴ国際公開第２０１８０８１１３０号又は米国特許出願公開第２０１８０２３７８６３号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように決定可能である。閾値は、腫瘍、例えば鼻咽頭がんを有することが知られる１名以上の対象からの生物学的サンプルのセットと、腫瘍、例えば鼻咽頭がんを有していないことが知られる１名以上の対象からの生物学的サンプルのセットとを含むトレーニングセットを解析することにより決定可能である。閾値は、腫瘍、例えば鼻咽頭がんを有することが知られる対象からの生物学的サンプルの１００％、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％又は少なくとも５０％が、閾値を超えるウイルス（例えば、ＥＢＶ）起源の細胞フリー核酸の量を有するように設定され得る。対象の年齢、対象の喫煙状態及び周囲温度からなる群から選択される属性に基づいて、ベースライン閾値を確立することができるとともに、ベースライン閾値を調整することができる。
[0022] 閾値は、細胞フリー核酸の量であり得る。細胞フリー核酸の量は、米国特許出願公開第２０１８０２３７８６３号に記載の核酸（例えば、ウイルス核酸、ＥＢＶ核酸）の量であり得る。例えば、閾値は、血漿中ＥＢＶ ＤＮＡ濃度などの血漿中ＥＢＶ ＤＮＡの量であり得る。量は、サンプルから決定可能である。細胞フリー核酸は、ウイルス起源の細胞フリー核酸であり得る。ウイルス起源の細胞フリー核酸の量は、サンプルのウイルスロードの指標となり得る。ウイルス起源の細胞フリー核酸の量は、対象における腫瘍又は腫瘍のリスクの指標となり得る。ウイルス起源の細胞フリー核酸の量は、腫瘍の存在の指標となる量であり得る。
[0023] 量は、単位体積（例えば、ミリリットル（コピー／ｍＬ））当たりのウイルス起源の細胞フリー核酸のコピー数、単位体積（例えば、ミリリットル）当たりのウイルス起源の細胞フリー核酸の特異的配列のコピー数、非ウイルス起源の全細胞フリー核酸に対するウイルス起源の全細胞フリー核酸の割合又は非ウイルス起源の全細胞フリー核酸に対するウイルス起源の細胞フリー核酸の特異的配列の割合であり得る。細胞フリー核酸の量は、細胞フリー核酸の数量、質量（例えば、グラム、ナノグラム）、分子数（例えば、１、２、３、４個）、レベル、規格化量、濃度（例えば、コピー／ｍＬ）、パーセント又は比であり得る。細胞フリー核酸の量は、例えば、サンプル中のウイルス細胞フリー核酸と非ウイルス細胞フリー核酸との比、サンプル中の特定のサイズ範囲内のウイルス細胞フリー核酸と同一又は異なるサイズ比の非ウイルス細胞フリー核酸との比であり得る。サイズ比の例は、例えば、米国特許出願公開第２０１８０２３７８６３号に見出され得る。
[0024] 量は、サンプル中のウイルス起源の細胞フリー核酸の割合であり得る。ウイルス起源の細胞フリー核酸の割合は、あるサイズ範囲内のウイルス起源のｃｆＤＮＡの割合であり得る。割合は、細胞フリー核酸のサイズ比の決定に使用可能である。サイズ比は、あるサイズ範囲内の常染色体細胞フリー核酸の割合に対する、そのサイズ範囲内のウイルス起源の細胞フリー核酸の割合であり得る。一例では、ＥＢＶ ＤＮＡサイズ比は、８０～１１０ｂｐのサイズを有する常染色体細胞フリーＤＮＡの割合に対する、８０～１１０ｂｐのサイズを有するＥＢＶ ＤＮＡの割合である。他の一例では、ＥＢＶ ＤＮＡサイズ比は、１８０ｂｐ未満の常染色体細胞フリーＤＮＡの割合に対する、１８０ｂｐ未満のＥＢＶ ＤＮＡの割合である。一例では、ＥＢＶ ＤＮＡサイズ比は、１５０ｂｐ未満の常染色体細胞フリーＤＮＡの割合に対する、１５０ｂｐ未満のＥＢＶ ＤＮＡの割合である。
[0025] ウイルス起源の特異的配列は、潜在的膜タンパク質（ＬＭＰ）、エプスタイン・バーウイルス核抗原（ＥＢＮＡ）、エプスタイン・バーウイルスコード低分子ＲＮＡ（ＥＢＥＲ）、ＥＢＶポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、ＥＢＶポリメラーゼアクセサリータンパク質、ＢａｍＨＩ断片又はそれらの組合せをコードする配列であり得る。
[0026] 閾値は、約１コピー／ｍＬ、５コピー／ｍＬ、１０コピー／ｍＬ、５０コピー／ｍＬ、１００コピー／ｍＬ、２００コピー／ｍＬ、３００コピー／ｍＬ、５００コピー／ｍＬ、１０００コピー／ｍＬ、１０，０００コピー／ｍＬ又は１００，０００コピー／ｍＬであり得る。閾値は、０～４０００コピー／ｍＬであり得る。閾値は、少なくとも５０コピー／ｍＬであり得る。閾値は、５０～５００コピー／ｍＬであり得る。閾値は、１００～５００コピー／ｍＬであり得る。閾値は、２００～５００コピー／ｍＬであり得る。閾値は、５０～２００コピー／ｍＬであり得る。閾値は、５００コピー／ｍＬまでであり得る。代替的に、閾値は、２０，０００～５０，０００コピー／ｍＬであり得る。
[0027] いくつかの場合、閾値は、調整されたベースライン閾値又は初期閾値であり得る。その場合、あらかじめ決められたベースライン閾値は、１つ以上の対象依存属性又は対象非依存属性に基づいて調整される。一例では、ベースライン閾値は、対象の年齢、対象の喫煙状態、サンプル採取時の温度又はそれらの組合せに基づいて調整される。いくつかの場合、閾値は、例えば、アルゴリズムを用いて、少なくとも１つの対象依存属性又は対象非依存属性に基づいて決定可能である。
[0028] 属性は、対象依存属性又は対象非依存属性であり得る。対象依存属性の例としては、年齢、現在の喫煙状態、現在の飲酒状態、運動習慣及び併存症状態が挙げられる。対象非依存属性の例としては、周囲温度が挙げられる。
[0029] いくつかの場合、閾値は、対象の年齢に基づいて決定される。いくつかの場合、血漿中ＥＢＶ ＤＮＡ濃度の閾値は、対象の年齢に基づいて決定される。例えば、若年者では老年者よりも低いカットオフ（閾値）を使用可能である。他の一例では、老年者では、若年者よりも高いカットオフ（閾値）を使用可能である。対象の年齢は、生物学的サンプルが採取されたときの対象の年齢であり得る。対象の年齢は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６０、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９又は１２０歳であり得る。対象の年齢は、１２歳以下、１３歳～１９歳、２０歳～３５歳、３６歳～４５歳、４６歳～５９歳、６０歳～７９歳又は８０歳超であり得る。閾値は、年齢による正の補正を含み得る（例えば、図１を参照されたい）。いくつかの場合、老年対象（例えば、ＮＰＣでない老年対象）は、若年対象（例えば、ＮＰＣでない若年対象）よりも生物学的サンプル中のＥＢＶ由来のｃｆＤＮＡを多量に有し得る。例えば、５歳の年齢増加は、ＮＰＣでない対象間で血漿中ＥＢＶ ＤＮＡの陽性率の０．６％増加に関連し得る（例えば、図１を参照されたい）。いくつかの場合、対象の年齢は、ベースライン年齢と比較される。ベースライン年齢は、何らかの後続の調整が行われるあらかじめ決められた年齢であり得る。いくつかの場合、対象の年齢がベースライン年齢を上回る場合、対象がベースライン年齢を上回る各年齢に対して閾値を少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％又は１０％上昇させる。いくつかの場合、対象の年齢がベースライン年齢を下回る場合、対象がベースライン年齢を下回る各年齢に対して閾値を少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％又は１０％低下させる。いくつかの場合、対象の年齢がベースライン年齢を上回る場合、対象がベースライン年齢を上回る５又は１０歳の各ブロックに対して閾値を少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％又は１０％上昇させる。例えば、ベースライン年齢が５０歳であり、対象の年齢が６２歳であり、且つ５歳ごとに閾値を２％上昇させる場合、対象に対する閾値を５０歳の閾値と比較して６％上昇させることが可能である。いくつかの場合、対象の年齢がベースライン年齢を下回る場合、対象がベースライン年齢を下回る５又は１０歳の各ブロックに対して閾値を少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％又は１０％低下させる。
[0030] いくつかの場合、閾値は、対象の喫煙状態に基づいて決定される。いくつかの場合、血漿中ＥＢＶ ＤＮＡ濃度の閾値は、対象の喫煙状態に基づいて決定される。対象の喫煙状態は、喫煙者又は非喫煙者であり得る。対象が喫煙者である場合、対象が喫煙者でない場合よりも閾値を高く設定し得る。いくつかの場合、喫煙状態は、対象が現喫煙者であるか又は現喫煙者でないかの指標となる。現喫煙者は、過去１日間、１週間、１ヶ月間又は１年間以内に喫煙に関与した（例えば、少なくとも１、１０又は１００本のシガレットを喫煙した）対象であり得る。喫煙は、いずれかのタバコ製品又はマリファナ製品の喫煙であり得る。タバコ製品又はマリファナ製品は、例えば、シガー、ブラント、シガリロ、リトルシガー、シガレット又はクレテックであり得る。喫煙は、電子シガレットなどのハンドヘルド電子デバイスにより助長され得る。電子デバイスは、ニコチンを含むエアロゾル又は蒸気を生成し得る。いくつかの場合、現喫煙者又は元喫煙者は、平均で１日約１、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０又は約７５本のシガレットを喫煙する／喫煙した。いくつかの場合、現喫煙者／元喫煙者は、１日約１～約１０、約１０～約２０、約２０～約３０、約３０～約４０、約４０～約５０、約５０～約６０又は約６０～約７５本のシガレットを喫煙する／喫煙した。いくつかの場合、現喫煙者又は元喫煙者は、１日７５本超のシガレットを喫煙する／喫煙した。いくつかの場合、対象が喫煙者である場合、閾値を少なくとも約１％、２％、５％、１０％、２０％又は２５％上昇させる。いくつかの場合、対象が非喫煙者である場合、閾値を少なくとも約１％、２％、５％、１０％、２０％又は２５％低下させる。非喫煙者は、過去１日間、１週間、１ヶ月間又は１年間以内に喫煙（例えば、少なくとも１、１０又は１００本のシガレットの喫煙）に関与しなかった対象であり得る。
[0031] いくつかの場合、閾値は、周囲温度に基づいて決定される。いくつかの場合、血漿中ＥＢＶ ＤＮＡ濃度の閾値は、周囲温度に基づいて決定される。例えば、より寒い日に採取されたサンプルでは、より暖かい日に採取されたサンプルに使用される閾値よりも高い閾値を使用可能である。他の一例では、より暖かい日に採取されたサンプルでは、より寒い日に採取されたサンプルに使用される閾値よりも低い閾値を使用可能である。周囲温度は、対象から生物学的サンプルが採取されたときの温度であり得る。周囲温度は、サンプル採取位置又はそれに近い位置で決定可能である。サンプル採取位置に近い位置は、サンプル採取位置から１キロメートル（ｋｍ）、１０ｋｍ、１００ｋｍ、２００ｋｍ、３００ｋｍ、４００ｋｍ又は５００ｋｍ以内の位置であり得る。周囲温度は、サンプル採取日のサンプル採取位置又はその近くの環境の温度であり得る。周囲温度は、平均周囲温度であり得る。平均周囲温度は、サンプル採取日の平均周囲温度、サンプル採取時の直前の２４時間にわたる平均周囲温度又はサンプル採取時の直前の１週間の平均周囲温度であり得る。周囲温度は、サンプル採取日のサンプル採取位置又はそれに近い位置の高温又は低温であり得る。周囲温度は、サンプル採取日の特定の時間（例えば、午前、正午、午後、夕方）のサンプル採取位置又はそれに近い位置の温度であり得る。周囲温度は、サンプルが採取される地方自治体又は国の公的気象観測所で決定可能である。周囲温度は、米国国立気象局（U.S. National Weather Service）又は香港観測所（Hong Kong Observatory）により決定可能である。周囲温度は、アナログ又はディジタル温度計を用いて決定可能である。
[0032] 閾値は、周囲温度との負の相関を含み得る（例えば、図２を参照されたい）。いくつかの場合、周囲温度は、ベースライン温度と比較される。ベースライン温度は、何らかの後続の調整が行われるあらかじめ決められた温度であり得る。いくつかの場合、周囲温度がベースライン温度を上回る場合、周囲温度がベースライン温度を上回る各（摂氏）度に対して閾値を少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％又は１０％低下させる。いくつかの場合、周囲温度がベースライン温度を下回る場合、周囲温度がベースライン温度を上回る各（摂氏）度に対して閾値を少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％又は１０％上昇させる。いくつかの場合、周囲温度がベースライン温度を下回る場合、周囲温度がベースライン温度を上回る２、３、４又は５度の各ブロックに対して閾値を少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％又は１０％上昇させる。例えば、ベースライン温度が２４℃であり、対象からサンプルを採取する日の平均周囲温度が１９℃であり、且つ３度ごとに閾値を１％低下させ得る場合、対象に対する閾値を２４℃の温度の閾値と比較して２％低下させることが可能である。いくつかの場合、周囲温度がベースライン温度を上回る場合、温度がベースライン温度を上回る２、３、４又は５度の各ブロックに対して閾値を少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％又は１０％上昇させることが可能である。
[0033] いくつかの場合、閾値は、対象の年齢及び対象の喫煙状態に基づいて決定される。いくつかの場合、閾値は、対象の年齢及び周囲温度に基づいて決定される。いくつかの場合、閾値は、対象の喫煙状態及び周囲温度に基づいて決定される。いくつかの場合、閾値は、対象の年齢、対象の喫煙状態及び周囲温度に基づいて決定される。
[0034] いくつかの場合、閾値は、対象の併存症状態、対象の現在の飲酒状態、対象の運動習慣又はそれらのいずれかの組合せに基づいて決定されない。
[0035] いくつかの場合、対象の現在の飲酒状態は、対象が現アルコール飲酒者であるか又は現アルコール飲酒者でないかの指標となる。現飲酒者は、過去１日間、１週間、１ヶ月間又は１年間以内にアルコール飲酒に関与した（例えば、アルコールを摂取した）対象であり得る。
[0036] いくつかの場合、対象の運動習慣は、対象が運動のレギュラー参加者であるかの指標となる。運動のレギュラー参加者は、少なくとも１、２又は３日間／週で少なくとも１５分間（ｍｉｎ）、３０分間、４５分間又は６０分間の適度な運動に取り組む対象であり得る。いくつかの場合、運動のレギュラー参加者は、少なくとも２日間／週で少なくとも３０分間の適度な運動に取り組む対象であり得る。
[0037] いくつかの場合、対象の併存症状態は、対象における１つ以上の併存症の存在又は不在である。１つ以上の併存症は、糖尿病、高血圧症、高脂血症、虚血性心疾患又はそれらの組合せを含み得る。
[0038] 本明細書に提供される腫瘍の存在についてスクリーニングする方法は、ウイルス由来の細胞フリー核酸の量を閾値と比較することをさらに含み得る。ウイルス由来の細胞フリー核酸の量を閾値と比較することは、腫瘍について対象をスクリーニングするために使用可能である。
[0039] 決定された閾値、例えばトレーニングセットを用いて決定された閾値は、未知の腫瘍状態を有する１名以上の対象からの１つ以上の生物学的サンプルからのウイルス起源の細胞フリー核酸の量と比較され得る。一例では、対象が閾値を上回る量のＥＢＶ血漿中ｃｆＤＮＡを有する場合、その対象は、ＮＰＣを有するか又はそれを有するリスクがあると判定される。他の一例では、対象が閾値を下回る量のＥＢＶ血漿中ｃｆＤＮＡを有する場合、その対象は、ＮＰＣを有していないか又はそれを有するリスクがないと判定される。ＥＢＶ細胞フリー核酸の検出量を閾値と比較して対象がＮＰＣを有するかを判定する例示的ワークフローは、図４に例示される。
[0040] ウイルス由来の細胞フリー核酸の量の決定
[0041] ウイルス由来の細胞フリー核酸の量は、例えば、米国特許出願公開第２０１８０２３７８６３号に記載のように決定可能である。いくつかの場合、ウイルス由来の細胞フリー核酸の量を決定することは、ウイルス由来の細胞フリー核酸を増幅することを含む。増幅は、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲともいう）などのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含み得る。増幅は、逆転写ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、定量リアルタイムＰＣＲ、ディジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）、ディジタルエマルジョンＰＣＲ（ｄｅＰＣＲ）、クローンＰＣＲ、増幅断片長多型ＰＣＲ（ＡＦＬＰ ＰＣＲ）、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、アセンブリーＰＣＲ、非対称ＰＣＲ（選択された鎖に対するプライマーを大過剰で使用可能である）、鎖置換増幅、多重置換増幅、ローリングサークル増幅、コロニーＰＣＲ、ヘリカーゼ依存増幅（ＨＤＡ）、ホットスタートＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応、逆ＰＣＲ（ＩＰＣＲ）、インサイチューＰＣＲ、ロングＰＣＲ（約５キロ塩基超のＤＮＡの伸長）、ヘリカーゼ依存増幅、分岐増幅法、マルチプレックスＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ（１対超のプライマーを使用する）、単一細胞ＰＣＲ、タッチダウンＰＣＲ、ループ媒介等温ＰＣＲ（ＬＡＭＰ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）又は核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）を含み得る。増幅は、全ゲノム増幅又は標的増幅を含み得る。いくつかの場合、細胞フリー核酸は、増幅前に生物学的サンプルから単離される。細胞フリー核酸は、所与のサイズの細胞フリー核酸断片を選択することにより生物学的サンプルから単離可能である。１５０塩基対（ｂｐ）、２００ｂｐ又は３００ｂｐよりも短い長さの細胞フリー核酸を生物学的サンプルから単離可能である。いくつかの場合、１５０ｂｐ～３００ｂｐの細胞フリー核酸が単離される。いくつかの場合、１５０ｂｐ～２００ｂｐの細胞フリー核酸が単離される。いくつかの場合、１８０ｂｐ～２００ｂｐの細胞フリー核酸が単離される。いくつかの場合、８０ｂｐ～１１０ｂｐの細胞フリー核酸が単離される。
[0042] ウイルス由来の細胞フリー核酸の量は、例えば、分光測光（例えば、ＵＶ分光測光、例えばNANODROP）、蛍光測定（例えば、QUANTIFLUOR色素を用いたもの）、マイクロアレイ（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ）、質量分析、シーケンシング、例えば次世代シーケンシングにより決定可能である。シーケンシングは、チェーンターミネーションシーケンシング、ハイブリダイゼーションシーケンシング、４５４シーケンス（ROCHE）、可逆ターミネーター色素を用いたシーケンシング（ILLUMINAシーケンシング）、半導体シーケンシング（THERMOFISHER ION TORRENT）、質量分光測光シーケンシング、大規模並列シグネチャーシーケンシング（ＭＰＳＳ）、マキサム・ギルバートシーケンシング、ナノポアシーケンシング（例えば、OXFORD NANOPORE又はGENIAの技術を用いたもの）、単一分子電子検出シーケンシング（例えば、核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）がナノギャップを通り抜けるときにナノ電極を介してトンネル電流を測定して電流差を計算するもの、例えばQUANTUM BIOSYSTEMS製のQUANTUM SEQUENCINGを用いたもの）、マイクロドロップレット単一分子シーケンス、例えば加ピロリン酸分解を用いたもの（例えば、BASE4の技術を用いたもの）、ポロニーシーケンシング、パイロシーケンシング、ショットガンシーケンシング、単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シーケンシング（PACIFIC BIOSCIENCES）、GENAPSYSのGenapSys Gene Electronic Nano-Integrated Ultra-Sensitive（GENIUS）技術、QIAGEN製のGENEREADER又はSOLiDシーケンシングを含み得る。
[0043] 本方法は、シーケンシング前にサンプルからのウイルスから細胞フリー核酸を富化することを含み得る。富化は、ハイブリダイゼーションプローブを用いてウイルスから細胞フリー核酸をキャプチャーすることを含み得る。いくつかの場合、本方法は、シーケンシング前にサンプルからのウイルスから細胞フリー核酸を富化することを必要としない。本方法は、シーケンシングライブラリーをアセンブルすることを含み得る。例えば、シーケンシングライブラリーは、すでに記載のように構築可能である（例えば、Lam et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2018 May 29; 115(22): E5115-E5124を参照されたい）。
[0044] 例えば、ROCHE製のSEQCAPを用いて１つ以上の標的を富化することが可能である。核酸、例えばＤＮＡ、例えばゲノミックＤＮＡは、例えば、超音波処理により断片化可能である。断片化ＤＮＡは、キャプチャープローブにアニール可能である。キャプチャープローブは、標識可能である。プローブは、ストレプトアビジンで被覆された磁気ビーズなどの固形担体に結合可能である。キャプチャーされた標的は、放出、増幅及びシーケンスすることが可能である。
[0045] 例えば、AGILIENT TECHNOLOGIES製のHALOPLEX Target Enrichment Systemを用いて、１つ以上の標的を富化することが可能である。核酸、例えばＤＮＡ、例えばゲノミックＤＮＡは、例えば、制限酵素消化により断片化することが可能である。環化された、且つ１つ以上のインデックスが組み込まれた、且つILLUMINAシーケンシングなどのシーケンシングプラットフォームに有用な１つ以上のシーケンシングモチーフを任意選択的に有するＤＮＡ断片を生成するために、インデクシングプライマーカセットの存在下でプローブを使用することが可能である。プローブは、ビオチン化などにより付加可能なビオチンなどの標識を含み得る。標識プローブは、ストレプトアビジン被覆ビーズ（例えば、磁気ビーズ）などを用いてキャプチャー可能である。キャプチャーされた標的は、ＰＣＲなどにより増幅するとともに、例えば次世代シーケンシングなどのシーケンシングにより解析することが可能である。
[0046] １つ以上の標的は、１つ以上のキャプチャープローブを用いて、例えばAGILENT TECHNOLOGIES製のSURESELECT Target Enrichmentを用いて富化可能である。核酸、例えばＤＮＡ、例えばゲノミックＤＮＡは、例えば、超音波処理により断片化可能である。１つ以上の標的は、約１０～約２００塩基、約２０～約１７５塩基、約２５～約１５０塩基又は約１２０塩基の１つ以上のプローブ、例えば１つ以上のｃＲＮＡプローブを用いて富化可能である。１つ以上のプローブ、例えば１つ以上のｃＲＮＡプローブは、ビオチンなどの標識で標識可能であるとともに、標識は、例えば、ストレプトアビジンなどの結合部分を介してビーズ（例えば、磁気ビーズ）などの固形担体に結合可能である。ビーズ、例えば磁気ビーズなどの固形担体は、例えば、磁石を用いてキャプチャー可能である。１つ以上のキャプチャーされた標的は、固形担体からの脱結合（例えば、ｃＲＮＡプローブの消化により）、ＰＣＲなどによる増幅及び次世代シーケンシングなどのシーケンシングによる解析が可能である。
[0047] １つ以上の標的は、例えば、トランスポザーゼを用いて、例えばＮＥＸＴＥＲＡタグメンテーションを用いて富化可能である。１つ以上の標的は、転位によるアダプターの付加、次いでアダプターにアニールするプライマーを用いたＰＣＲによる増幅により富化可能である。
[0048] １つ以上の標的は、NUGENのSingle Primer Enrichment Technology（ＳＰＥＴ）を用いて富化可能である。アダプターは、核酸断片に装着可能である。３’アダプターを含むプライマーは、標的配列へのアニーリング及び伸長が可能である。伸長産物は、アダプター配列に対するプライマーを用いて増幅可能であり、且つ増幅産物は、次世代シーケンシングなどのシーケンシングにより解析可能である。
[0049] ウイルス由来の細胞フリー核酸の量を決定することは、ウイルス由来の細胞フリー核酸のコピー数を決定することを含み得る。例えば、生物学的サンプルの単位体積（例えば、ｍＬ）当たりの特定のウイルス細胞フリー核酸（例えば、ｃｆＤＮＡ）配列のコピー数を決定可能である。ウイルス由来の細胞フリー核酸の量を決定することは、生物学的サンプル（例えば、血漿）の単位体積（例えば、ミリリットル）当たりのウイルス（例えば、ＥＢＶ）ゲノムのコピー数を決定することを含み得る。
[0050] ウイルス由来の細胞フリー核酸の量を決定することは、少なくとも１つのウイルス配列を増幅することを含み得る。ウイルス配列は、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）から導出可能である。ＥＢＶ配列は、潜在的膜タンパク質（ＬＭＰ）、エプスタイン・バーウイルス核抗原（ＥＢＮＡ）、エプスタイン・バーウイルスコード低分子ＲＮＡ（ＥＢＥＲ）、ＥＢＶポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、ＥＢＶポリメラーゼアクセサリータンパク質（例えば、ＢＭＲＦ１）、ＢａｍＨＩ断片又はそれらの組合せをコードする配列であり得る。ＬＭＰの例としては、ＬＭＰ－１、ＬＭＰ－２Ａ及びＬＭＰ－２Ｂが挙げられる。ＥＢＮＡの例としては、ＥＢＮＡ－１、ＥＢＮＡ－２、ＥＢＮＡ－３ａ、ＥＢＮＡ－３ｂ及びＥＢＮＡ－３ｃが挙げられる。ＥＢＥＲの例としては、ＥＢＥＲ－１及びＥＢＥＲ－２が挙げられる。ＢａｍＨＩ断片の例としては、ＢａｍＨＩ－Ａ、ＢａｍＨＩ－Ｃ及びＢａｍＨＩ－Ｗが挙げられる。いくつかの場合、ウイルス由来の細胞フリー核酸の量を決定することは、１、２、３、４、５つ又は５つ超のウイルス配列の量を決定することを含む。
[0051] いくつかの場合、細胞フリー核酸の量を決定することは、ウイルス由来の細胞フリー核酸をシーケンスすることを含む。シーケンスすることにより配列リードを生成可能である。配列リードをヒトゲノム又はウイルスゲノムにアライメントすることにより、ヒトゲノム（例えば、対象のゲノム）を起源とする配列と、非ヒトゲノム（例えば、ウイルスのゲノム）を起源とする配列とを識別することが可能である。シーケンシングは、全ゲノムシーケンシング又は標的シーケンシングを含み得る。標的シーケンシングは、例えば、本明細書に記載のように、少なくとも１つのウイルス配列を増幅することを含み得る。シーケンシングは、大規模並列シーケンシングであり得る。シーケンシングは、核酸断片のクローン拡大分子又は非増幅単一分子のシーケンシングを含み得る。シーケンシングは、チェーンターミネーションシーケンシング、ハイブリダイゼーションシーケンシング、Illumina（登録商標）シーケンシング（例えば、可逆ターミネーティング色素を用いたもの）、Ion Torrent（商標）（例えば、半導体）シーケンシング、質量分光測光シーケンシング、大規模並列シグネチャーシーケンシング（ＭＰＳＳ）、マキサム・ギルバートシーケンシング、ナノポアシーケンシング、ポロニーシーケンシング、パイロシーケンシング、ショットガンシーケンシング、単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シーケンシング、SOLiD（登録商標）シーケンシング（例えば、蛍光標識二塩基プローブを用いたもの）、ユニバーサルシーケンシング又はそれらのいずれかの組合せを含み得る。いくつかの実施形態では、増幅は、ディジタルＰＣＲを含み得る。シーケンシングは、Illumina（登録商標）NextSeq 500プラットフォーム又はNextSeq 550プラットフォームを用いて行うことが可能である。
[0052] ウイルス及び腫瘍
[0053] ウイルスは、がんに関連するウイルスであり得る。限定されるものではないが、対象においてがんの原因となり得る又はそれに関連し得るウイルスの例としては、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、カポジ肉腫、頸がん、非ホジキンリンパ腫、肛門がん、ホジキン病、肺がん、口腔がん、中咽頭がん、皮膚がん及び肝がんに関連するもの）、ヒトヘルペスウイルス８型（例えば、カポジ肉腫、血液がん、原発性滲出液リンパ腫及びキャッスルマン病に関連するもの）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス－１（例えば、リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫及び成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫に関連するもの）並びにメルケル細胞ポリオーマウイルス（例えば、メルケル細胞がんなどの皮膚がんに関連するもの）が挙げられる。ウイルスは、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）であり得る。腫瘍は、ウイルスに起因するか又はウイルスに関連する腫瘍であり得る。腫瘍は、エプスタイン・バーウイルスに起因するか又はエプスタイン・バーウイルスに関連する腫瘍であり得る。ＥＢＶに起因するか又はＥＢＶに関連する腫瘍の例としては、鼻咽頭がん、リンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫又はホジキンリンパ腫）及び胃がんが挙げられる。ある場合には、腫瘍は、鼻咽頭がん（ＮＰＣ）である。
[0054] 生物学的サンプル及び核酸
[0055] 生物学的サンプルは、全血、血漿、血清、尿、胸水又はリンパ液であり得る。いくつかの場合、生物学的サンプルは、血漿である。生物学的サンプルは、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み得る。生物学的サンプルは、生物学的サンプル中に見出されるが、インタクト細胞内に含まれないいずれかの核酸であり得る細胞フリー核酸を含み得る。細胞フリー核酸は、細胞フリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）又は細胞フリーＲＮＡであり得る。細胞フリー核酸は、循環核酸、例えば循環ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。生物学的サンプル中の細胞フリー核酸の少なくとも一部分は、ウイルス起源であり得、及び／又は腫瘍に由来し得る。血流中に見出される腫瘍に由来する細胞フリー核酸は、循環腫瘍核酸、例えば循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）と呼ばれ得る。細胞フリー核酸の例は、血漿中ＤＮＡであり得る。ウイルスに由来する細胞フリー核酸の例は、血漿中ＥＢＶ ＤＮＡであり得る。
[0056] 対象
[0057] 生物学的サンプルは、対象から採取可能である。対象は、ヒトであり得る。代替的に、対象は、非ヒト霊長動物（例えば、ゴリラ、チンパンジー、ボノボ、サル、オランウータン、キツネザル若しくはヒヒ）、イヌ、ネコ、ヤギ、モルモット、ハムスター、マウス、ブタ、ヤギ、ウシ、ラクダ又はゼブラフィッシュであり得る。対象は、腫瘍についてスクリーニングされる対象であり得る。サンプルは、侵襲的（例えば、外科的手段）又は非侵襲的（例えば、採血、スワブ又は排出サンプル採取）に対象から得ることが可能である。
[0058] 追加のアッセイ
[0059] いくつかの実施形態では、本開示の方法は、２つ以上のアッセイ（例えば、第１のアッセイ及び第２のアッセイ）を実施することを含む。アッセイ（例えば、第１のアッセイ及び／又は第２のアッセイ）は、米国特許出願公開第２０１８０２３７８６３号に記載のアッセイであり得る（例えば、図５を参照されたい）。例えば、血液サンプルは、対象から得ることが可能であり、且つ細胞は、例えば、遠心分離を連続して２回実施することにより、細胞フリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含有する血漿から取り出すことが可能である５２０２。遠心分離は、血漿サンプルから血小板及び細胞を枯渇させるように２，０００×ｇで１０分間実施可能である。採取された２つの血液サンプルの一方からの約０．８ミリリットルの血漿は、サンプル中の腫瘍由来ＤＮＡ（ＥＢＶ ＤＮＡ）のコピー数を検出するためにｑＰＣＲ解析に使用可能である５２０３。ｃｆＤＮＡ抽出は、ｃｆＤＮＡに関して血漿サンプルを富化するとともにｑＰＣＲ解析のためのサンプルを準備するために血漿サンプルに対して実施可能である５２０４。ｑＰＣＲ解析のための変性、アニーリング及び伸長の温度は、（例えば、使用されるプライマーの長さ／ＧＣ含有率及び／又はサンプル中の全ｃｆＤＮＡの濃度に基づいて）決定可能であり５２０５、且つｑＰＣＲ解析は、サンプル中の腫瘍由来ｃｆＤＮＡの量を検出するために実施可能である５２０６。ＥＢＶ ＤＮＡを検出するために、ゲノムのＢａｍＨＩ配列にフランキングするプライマーを使用可能である。閾値は、対象からサンプルが採取されたときの対象の年齢及び／又は喫煙状態及び／又は周囲温度に基づいて確立可能である。検出されたＥＢＶ ＤＮＡの量が閾値を下回る場合５２０７、陰性の結果が提供され得るとともに、いくつかの場合には第２のアッセイが実施されない。検出されたｃｆＤＮＡの量が閾値であるか又はそれを上回る場合５２０８、採取された第２の血液サンプルからの血漿を用いて第２のアッセイが実施され得る。例えば、サンプル中のｃｆＤＮＡのサイズプロファイルを決定するために、約４ミリリットルの血漿が次世代シーケンシングに使用され得る５２０９。ｃｆＤＮＡ抽出は、ｃｆＤＮＡに関して血漿サンプルを富化するとともに、次世代シーケンシング解析のためのサンプルを準備するために第２の血漿サンプルに対して実施可能である５２１０。ライブラリー作製は、シーケンスされるサンプル中のｃｆＤＮＡ断片にアダプターオリゴヌクレオチドをライゲートするために実施可能である５２１１。ｃｆＤＮＡは、下流プラットフォームに最適な長さに断片化可能である。いくつかの場合、ＤＮＡ断片化は均一な平滑末端断片をもたらさないため、各分子がフリーな突出一本鎖であり、５‘一リン酸及び３’ヒドロキシル基を含有することを確かにするために末端修復を使用可能である。平滑末端ＤＮＡ断片の３’末端への非鋳型デオキシアデノシン５’－一リン酸（ｄＡＭＰ）の組込み（ｄＡテーリングとして知られるプロセス）を実施可能である。ＥＢＶ ＤＮＡの標的富化を実施可能であり５２１２、ＥＢＶ ＤＮＡの標的富化は、全ゲノムの代わりに対象の特定領域のシーケンシングを可能にし得る。次世代シーケンシングは、富化サンプルに対して実施可能である５２１３。富化血漿サンプル中のシーケンスされたｃｆＤＮＡに対応する配列リードを得ることが可能であり、任意選択的に参照ゲノムにアライメントすることが可能である。解析を実施可能であり、例えばＥＢＶ量を評価可能であり、且つＥＢＶ ＤＮＡ断片のサイズプロファイルを生成可能である５２１４。サンプルが得られた対象が鼻咽頭がんを有するかの指標となるレポートを出力可能である５２１５。
[0060] 一例では、第１のアッセイは、療法の施行前に対象に対するウイルス起源の核酸のベースライン量を設定するために実施可能である一方、第２のアッセイは、療法の施行後に同一対象からのサンプルで実施可能である。他の一例では、第１のアッセイは、対象がウイルス由来の細胞フリー核酸を有するかを判定するための対象からのサンプルでの定性アッセイであり得る一方、第２のアッセイは、対象が検出される腫瘍に関して偽陽性であるかを判定するための同一対象からのサンプルでの定量アッセイであり得る（例えば、場合により本明細書に記載の対象非依存属性又は対象依存属性を考慮して閾値を調整した後、細胞フリー核酸の量は、閾値を下回る）。さらに他の一例では、第１のアッセイは、対象が検出される腫瘍に関して偽陽性であるかを判定するために対象からのサンプルで実施可能である（例えば、場合により本明細書に記載の対象非依存属性又は対象依存属性を考慮して閾値を調整した後、細胞フリー核酸の量は閾値を下回る）一方、第２のアッセイは、腫瘍の存在を確認するために対象からのサンプルで実施可能である。
[0061] いくつかの場合、生物学的サンプルの第１の部分は、第１のアッセイに使用され、且つ生物学的サンプルの第２の部分は、第２のアッセイに使用される。他の場合、第１のアッセイに使用された生物学的サンプル及び第２の生物学的サンプルが第２のアッセイに使用され、この場合、第２の生物学的サンプルは、第１の生物学的サンプルと異なる時点で同一対象から採取される。第２の生物学的サンプルは、第１の生物学的サンプルの少なくとも１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、１週間後、２週間後、３週間後、１ヶ月後、２ヶ月後、３ヶ月後、４ヶ月後、５ヶ月後、６ヶ月後、１年後、２年後、３年後、４年後又は５年後に採取可能である。
[0062] いくつかの場合、本方法は、細胞フリー核酸の量が、対象が腫瘍を有するか又は有する疑いがあるかの指標となる場合、腫瘍について第２のスクリーンを実施することをさらに含む。例えば、対象は、血漿中ＥＢＶ ｃｆＤＮＡの量が閾値を上回る場合、腫瘍を有する疑いがあり得る。第２のスクリーンは、例えば、ウイルス由来の細胞フリー核酸を増幅することにより、サンプル中のウイルス由来の細胞フリー核酸の量を決定するための第２のアッセイであり得る。第２のスクリーンは、内視鏡検査、鼻鏡検査、生検、Ｘ線検査、コンピュータートモグラフ（ＣＴ若しくはＣＡＴ）スキャン、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、超音波診断、骨スキャン、神経学的試験、聴力試験、ポジトロンエミッショントモグラフ（ＰＥＴ）又はＰＥＴ－ＣＴスキャン或いはそれらの組合せを対象で実施することを含み得る。第２のスクリーンは、対象において腫瘍の存在又は不在を確認可能である。
[0063] 治療
[0064] いくつかの場合、本明細書に提供される方法は、スクリーン、第２のスクリーン又はそれらの組合せが、対象に腫瘍が存在することを示す場合、腫瘍について対象を治療することをさらに含む。腫瘍について対象を治療することは、療法の施行を含み得る。療法は、化学療法、放射線療法、手術、標的療法又はそれらの組合せであり得る。いくつかの場合、ブラキ療法を用いて放射線療法が施行される。いくつかの場合、手術は、鼻咽頭切除である。標的療法は、モノクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体は、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）を標的とする抗体であり得る。モノクローナル抗体は、ベバシズマブ、セツキシマブ又はニボルマブであり得る。標的療法は、チェックポイント阻害剤、例えば抗ＰＤＬ１抗体又は抗ＰＤ１抗体であり得る。
[0065] いくつかの場合、本明細書に提供される方法は、対象に予防療法を施行することをさらに含む。いくつかの場合、本明細書に提供される方法は、対象を、腫瘍に関する追加の調査に付すことをさらに含む。対象が腫瘍に関するリスク因子を有し、スクリーンが閾値を上回るＥＢＶ ＤＮＡの存在の指標となり、且つ第２のスクリーンが腫瘍の存在の指標とならない場合、予防療法を対象に施行可能であるか、又は対象を腫瘍に関する追加の調査に付すことが可能である。ＮＰＣに関するリスク因子は、アジア系、アルコール摂取、喫煙、ＮＰＣを有していた親族の存在及びそれらの組合せであり得る。腫瘍に関する追加の調査は、本明細書に記載の第２のスクリーンを含み得る。追加の調査は、対象に対して５年に１回、４年に１回、３年に１回、２年に１回、１年に１回、１年に２回、１年に３回、１年に４回、１年に５回又は１年に６回行うことが可能である。追加の調査は、本明細書に記載の腫瘍の存在のスクリーニングと組み合わせて行うことが可能である。
[0066] 偽陽性率の低減
[0067] 腫瘍検出の偽陽性率は、本明細書に記載のように、対象依存属性又は対象非依存属性に基づいて、腫瘍の指標となるウイルス起源の細胞フリー核酸の閾値レベルを調整することにより減少させることが可能である。いくつかの場合、腫瘍は、鼻咽頭がんであり、且つ鼻咽頭がんは、閾値を上回る血漿中ＥＢＶ ＤＮＡの存在に基づいてスクリーニング可能である。
[0068] いくつかの場合、閾値を調整しないと約５．５％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整しないと５．５％超の偽陽性率をもたらす。
[0069] いくつかの場合、閾値を調整すると、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、約２．０％、約２．１％、約２．２％、約２．３％、約２．４％、約２．５％、約２．６％、約２．７％、約２．８％、約２．９％、約３．０％、約３．１％、約３．２％、約３．３％、約３．４％、約３．５％、約３．６％、約３．７％、約３．８％、約３．９％、約４．０％、約４．１％、約４．２％、約４．３％、約４．４％、約４．５％、約４．６％、約４．７％、約４．８％、約４．９％、約５．０％、約５．１％、約５．２％、約５．３％又は約５．４％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると、０．５％未満、０．６％未満、０．７％未満、０．８％未満、０．９％未満、１．０％未満、１．１％未満、１．２％未満、１．３％未満、１．４％未満、１．５％未満、１．６％未満、１．７％未満、１．８％未満、１．９％未満、２．０％未満、２．１％未満、２．２％未満、２．３％未満、２．４％未満、２．５％未満、２．６％未満、２．７％未満、２．８％未満、２．９％未満、３．０％未満、３．１％未満、３．２％未満、３．３％未満、３．４％未満、３．５％未満、３．６％未満、３．７％未満、３．８％未満、３．９％未満、４．０％未満、４．１％未満、４．２％未満、４．３％未満、４．４％未満、４．５％未満、４．６％未満、４．７％未満、４．８％未満、４．９％未満、５．０％未満、５．１％未満、５．２％未満、５．３％未満又は５．４％未満の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると５．５％未満の偽陽性率をもたらす。
[0070] いくつかの場合、閾値を調整すると約０．５％～約５．０％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約１．０％～約５．０％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約１．５％～約５．０％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約２．０％～約５．０％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約２．５％～約５．０％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約３．０％～約５．０％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約３．５％～約５．０％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約４．０％～約５．０％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約４．５％～約５．０％の偽陽性率をもたらす。
[0071] いくつかの場合、閾値を調整すると約０．５％～約４．５％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約１．０％～約４．５％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約１．５％～約４．５％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約２．０％～約４．５％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約２．５％～約４．５％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約３．０％～約４．５％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約３．５％～約４．５％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約４．０％～約４．５％の偽陽性率をもたらす。
[0072] いくつかの場合、閾値を調整すると約０．５％～約４．０％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約１．０％～約４．０％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約１．５％～約４．０％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約２．０％～約４．０％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約２．５％～約４．０％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約３．０％～約４．０％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約３．５％～約４．０％の偽陽性率をもたらす。
[0073] いくつかの場合、閾値を調整すると約０．５％～約３．５％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約１．０％～約３．５％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約１．５％～約３．５％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約２．０％～約３．５％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約２．５％～約３．５％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約３．０％～約３．５％の偽陽性率をもたらす。
[0074] いくつかの場合、閾値を調整すると約０．５％～約３．０％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約１．０％～約３．０％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約１．５％～約３．０％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約２．０％～約３．０％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約２．５％～約３．０％の偽陽性率をもたらす。
[0075] いくつかの場合、閾値を調整すると約０．５％～約２．５％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約１．０％～約２．５％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約１．５％～約２．５％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約２．０％～約２．５％の偽陽性率をもたらす。
[0076] いくつかの場合、閾値を調整すると約０．５％～約２．０％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約１．０％～約２．０％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約１．５％～約２．０％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約０．５％～約１．５％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約１．０％～約１．５％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約０．５％～約１．０％の偽陽性率をもたらす。いくつかの場合、閾値を調整すると約３．８％～約４．５％の偽陽性率をもたらす。
[0077] 一例では、周囲温度に基づいて腫瘍の指標となるウイルス起源の細胞フリー核酸の閾値レベルを調整すると約４．５％の偽陽性率をもたらし得る。３０℃超の温度の日にサンプルが採取された場合、約４．５％の偽陽性率を達成し得る。他の一例では、年齢に基づいて腫瘍の指標となるウイルス起源の細胞フリー核酸の閾値レベルを調整すると約３．８％の偽陽性率をもたらし得る。４５歳以下の対象からサンプルが採取された場合、約３．８％の偽陽性率を達成し得る。
[0078] 血漿中ＥＢＶ ＤＮＡスクリーニングの偽陽性率を低減するために、異なるストラテジーを使用可能である。スクリーニングセッションは、夏などのより高い温度の日にスケジュールされることもある。周囲温度に起因する予測偽陽性率の差異に基づいて解析料金の調整を行うことが可能である。一実現形態は、冬に偽陽性率が高くなるため、それほど正確でない試験に対する冬のより低い需要を考慮して、より低い試験料金を冬に及びより高い試験料金を夏に課すことであり得る。代替実現形態は、より多くの人々が夏にスクリーニングを受けるように促して試験の全体的確度を向上させるために、より高い試験料金を冬に及びより低い試験料金を夏に課すことであり得る。スクリーニングを受ける対象には、スクリーニング試験を受ける前の数日にわたり温かく保つように又は低温への暴露を回避するように助言することが可能である。調整は、例えば、試験が行われる年若しくは月の時間又はその日若しくは週の実際の温度に対して行うことが可能である。また、例えば赤道に近い地域ではより低い試験料金を課すなど、試験場所の地理的位置に基づいて構成を調整することも可能である。定量閾値は、血漿中ＤＮＡのレベルに適用可能である。定量閾値は、周囲温度に応じて調整可能である。例えば、周囲温度がより低い場合、より高い閾値（例えば、陽性の結果を規定するためにより高い濃度の血漿中ＥＢＶ ＤＮＡが必要とされる）を使用可能である一方、周囲温度がより高い場合、より低い閾値（例えば、陽性の結果を規定するためにより低い濃度の血漿中ＥＢＶ ＤＮＡが必要とされる）を使用可能である。
[0079] 対象の年齢と対象からの血漿中のＥＢＶ ＤＮＡ濃度との間の正の関係を考慮して、スクリーニングプログラムの費用効果を向上させるようにストラテジーを開発可能である。例えば、試験料金の削減によりスクリーニングに参加するように若年群を促すことが可能である。この構成は、血漿中ＥＢＶ ＤＮＡの試験で陽性を示した対象に経鼻内視鏡検査又は磁気共鳴イメージングなどのさらなる検査のコストを払い戻すことが可能な場合に有用であり得る。払戻しは、保険に結び付けることが可能である。定量閾値は、血漿中ＤＮＡのレベルに適用可能である。定量閾値は、スクリーニングされる対象の年齢に応じて調整可能である。例えば、老年群に対してより高い閾値（例えば、陽性の結果を規定するためにより高濃度の血漿中ＥＢＶ ＤＮＡが必要とされる）を使用可能である一方、若年群に対してより低い閾値（例えば、陽性の結果を規定するためにより低濃度の血漿中ＥＢＶ ＤＮＡが必要とされる）を使用可能である。
[0080] 喫煙者と非喫煙者との間で試験料金を調整するように類似のストラテジーを使用可能である。より高い偽陽性率を考慮してより高い試験料金を喫煙者に課すことが可能である。この料金構成は、血漿中ＥＢＶ ＤＮＡの試験で陽性を示す対象にさらなる検査のコストが払い戻される場合に有用であり得る。定量閾値は、血漿中ＤＮＡのレベルに適用可能である。定量閾値は、スクリーニングされる対象の喫煙習慣に応じて調整可能である。例えば、喫煙者に対してより高い閾値（例えば、陽性の結果を規定するためにより高濃度の血漿中ＥＢＶ ＤＮＡが必要とされる）を使用可能である一方、非喫煙者に対してより低い閾値（例えば、陽性の結果を規定するためにより低濃度の血漿中ＥＢＶ ＤＮＡが必要とされる）を使用可能である。
[0081] コンピューターシステム
[0082] 本明細書に開示されるのは、特定の場合、本明細書に記載の方法のいずれか１つの操作を実施するようにコンピューターシステムを制御するための複数の命令を記憶するコンピューター可読媒体を含むコンピューター製品である。本明細書にさらに開示されるのは、特定の場合、本明細書に記載のコンピューター製品と、コンピューター可読媒体に記憶された命令を実行するための１つ以上のプロセッサーとを含むシステムである。
[0083] 図３は、本開示のコンピューターシステムと通信してその各種の態様を制御するようにプログラムされた又は他に構成されたコンピューターシステム３０１を示す。
[0084] コンピューターシステム３０１は、例えば、対象において腫瘍の指標となるウイルス起源のＤＮＡの閾値を決定又は調整するなど、本開示の各種の態様を制御することが可能である。コンピューターシステム３０１は、ユーザーの電子デバイス又は電子デバイスに対して遠隔に位置するコンピューターシステムであり得る。電子デバイスは、モバイル電子デバイスであり得る。
[0085] コンピューターシステム３０１は、シングルコア若しくはマルチコアプロセッサー又は並列処理のための複数のプロセッサーであり得る中央処理ユニット（ＣＰＵ、本明細書では「プロセッサー」及び「コンピュータープロセッサー」ともいう）３０５を含み得る。コンピューターシステム３０１は、メモリー又はメモリーロケーション３１０（例えば、ランダムアクセスメモリー、リードオンリーメモリー、フラッシュメモリー）、電子記憶ユニット３１５（例えば、ハードディスク）、１つ以上の他のシステムと通信するための通信インターフェース３２０（例えば、ネットワークアダプター）並びに周辺デバイス３２５、例えばキャッシュ、他のメモリー、データ記憶装置及び／又は電子ディスプレイアダプターを含み得る。メモリー３１０、記憶ユニット３１５、インターフェース３２０及び周辺デバイス３２５は、マザーボードなどの通信バス（実線）を介してＣＰＵ３０５と通信可能である。記憶ユニット３１５は、データを記憶するためのデータ記憶ユニット（又はデータリポジトリー）であり得る。コンピューターシステム３０１は、通信インターフェース３２０を利用してコンピューターネットワーク（「ネットワーク」）３３０に作動結合可能である。ネットワーク３３０は、インターネット、インターネット及び／又はエクストラネット或いはインターネットと通信するイントラネット及び／又はエクストラネットであり得る。ネットワーク３３０は、いくつかの場合、テレコミュニケーション及び／又はデータネットワークである。ネットワーク３３０は、クラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にし得る１つ以上のコンピューターサーバーを含み得る。ネットワーク３３０は、コンピューターシステム３０１を利用するいくつかの場合、コンピューターシステム３０１に結合されたデバイスがクライアント又はサーバーとして動作できるようにし得るピアツーピアネットワークを実現可能である。
[0086] ＣＰＵ３０５は、プログラム又はソフトウェアで具現化可能な機械可読命令のシーケンスを実行可能である。命令は、メモリー３１０などのメモリーロケーションに記憶可能である。命令は、ＣＰＵ３０５に方向付けることが可能であり、続いてＣＰＵ３０５が本開示の方法を実現するようにプログラムするか又は他に構成することが可能である。ＣＰＵ３０５により実施される操作の例としては、フェッチ、デコード、実行及びライトバックが挙げられ得る。
[0087] ＣＰＵ３０５は、集積回路などの回路の一部であり得る。システム３０１の１つ以上の他のコンポーネントは、回路に含まれ得る。いくつかの場合、回路は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）である。
[0088] 記憶ユニット３１５は、ドライバー、ライブラリー、保存プログラムなどのファイルを記憶可能である。記憶ユニット３１５は、ユーザー選好及びユーザープログラムなどのユーザーデータを記憶可能である。コンピューターシステム３０１は、いくつかの場合、イントラネット又はインターネットを介してコンピューターシステム３０１と通信するリモートサーバー上に位置するなど、コンピューターシステム３０１の外部にある１つ以上の追加のデータ記憶ユニットを含み得る。
[0089] コンピューターシステム３０１は、ネットワーク３３０を介して１つ以上のリモートコンピューターシステムと通信が可能である。例えば、コンピューターシステム３０１は、ユーザーのリモートコンピューターシステムと通信可能である。リモートコンピューターシステムの例としては、パーソナルコンピューター（例えば、ポータブルＰＣ）、スレートＰＣ又はタブレットＰＣの（例えば、Apple（登録商標）iPad、Samsung（登録商標）Galaxy Tab）、電話機、スマートフォン（例えば、Apple（登録商標）iPhone、Android対応デバイス、Blackberry（登録商標））又はパーソナルディジタルアシスタントが挙げられる。ユーザーは、ネットワーク３３０を介してコンピューターシステム３０１にアクセス可能である。
[0090] 本明細書に記載の方法は、コンピューターシステム３０１の電子記憶ロケーション、例えばメモリー３１０又は電子記憶ユニット３１５などに記憶された機械（例えば、コンピュータープロセッサー）実行可能コードを介して実現可能である。機械実行可能コード又は機械可読コードは、ソフトウェアの形態で提供可能である。使用時、コードは、プロセッサー３０５により実行可能である。いくつかの場合、コードは、記憶ユニット３１５を検索してプロセッサー３０５により即時アクセスされるメモリー３１０に記憶可能である。いくつかの状況では、電子記憶ユニット３１５は、排除可能であり、且つ機械実行可能命令は、メモリー３１０に記憶可能である。
[0091] コードは、コードの実行に適合したプロセッサーを有するマシンで使用するようにプレコンパイル及び構成可能であるか又は実行時にコンパイル可能である。コードは、プレコンパイル方式又はアズコンパイル方式でコードが実行され得るように選択可能なプログラミング言語で供給可能である。
[0092] コンピューターシステム３０１などの本明細書に提供されるシステム及び方法の態様は、プログラミングで具現化可能である。技術の各種の態様は、典型的には、あるタイプの機械可読媒体で保持又は具現化される機械（又はプロセッサー）実行可能コード及び／又は関連データの形態の「製品」又は「製造品」と見なすことが可能である。機械実行可能コードは、メモリー（例えば、リードオンリーメモリー、ランダムアクセスメモリー、フラッシュメモリー）又はハードディスクなどの電子記憶ユニットに記憶可能である。「記憶」型媒体としては、コンピューター、プロセッサーなど、又はそれらの関連モジュールのタンジブルメモリー、例えばソフトウェアプログラミングのいずれかの時点で非一時記憶を提供可能な各種の半導体メモリー、テープドライブ、ディスクドライブなどのいずれか又はすべてが挙げられ得る。ソフトウェアの全部又は一部は、ときに、インターネット又は各種の他のテレコミュニケーションネットワークを介して通信可能である。かかる通信は、例えば、一方のコンピューター又はプロセッサーから他方のものへの、例えば管理サーバー又はホストコンピューターからアプリケーションサーバーのコンピュータープラットフォームへのソフトウェアのローディングを可能にし得る。そのため、ソフトウェアエレメントを保持可能な他のタイプの媒体は、ローカルデバイス間の物理インターフェースを横切って、有線又は光地上通信線ネットワークを介して及び各種のエアリンクを介して使用されるような光波、電波及び電磁波を含む。かかる波を搬送する物理エレメント、例えば有線リンク又は無線リンク、光リンクなどもソフトウェアを保持する媒体とみなされ得る。本明細書で用いられる場合、非一時タンジブル「記憶」媒体に限定されない限り、コンピューター又は機械「可読媒体」などの用語は、実行のためにプロセッサーへの命令の提供に関与するいずれかの媒体を意味する。
[0093] そのため、コンピューター実行可能コードなどの機械可読媒体は、限定されるものではないが、タンジブル記憶媒体、搬送波媒体又は物理伝送媒体を含めて多くの形態をとり得る。不揮発性記憶媒体としては、例えば、光学ディスク又は磁気ディスク、例えばいずれかのコンピューターなどの記憶デバイスのいずれか、例えば図面に示されるデータベースなどの実現に使用可能なものが挙げられる。揮発性記憶媒体としては、ダイナミックメモリー、例えばかかるコンピュータープラットフォームのメインメモリーが挙げられる。タンジブル伝送媒体としては、コンピューターシステム内のバスを含むワイヤーを含めて、同軸ケーブル、銅ワイヤー及び光ファイバーが挙げられる。搬送波伝送媒体は、電気信号若しくは電磁信号又は音波若しくは光波、例えば高周波（ＲＦ）及び赤外線（ＩＲ）データ通信時に生成されるものなどの形態をとり得る。したがって、コンピューター可読媒体の通常の形態としては、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、いずれかの他の磁気媒体、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ若しくはＤＶＤ－ＲＯＭ、いずれかの他の光学媒体、パンチカード、紙テープ、ホールのパターンを有するいずれかの他の物理記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ及びＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ－ＥＰＲＯＭ、いずれかの他のメモリーチップ若しくはカートリッジ、データ若しくは命令を伝送する搬送波、かかる搬送波を伝送するケーブル若しくはリンク又はコンピューターがプログラムコード及び／又はデータを読み取り得るいずれかの他の媒体が挙げられる。これらの形態のコンピューター可読媒体の多くは、実行のためにプロセッサーへの１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスの搬送に関与し得る。
[0094] コンピューターシステム３０１は、対象種及び対象種に由来する対象遺伝子を選択する能力などの使用を提供するためにユーザーインターフェース（ＵＩ）３４０を含む電子ディスプレイ３３５を含み得るか又はそれと通信し得る。ＵＩの例としては、限定されるものではないが、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）及びウェブベースユーザーインターフェースが挙げられる。
[0095] 本明細書に挙げられるコンピューターシステムはいずれも、いずれかの好適な数のサブシステムを利用可能である。いくつかの場合、コンピューターシステムは、サブシステムがコンピューター装置のコンポーネントであり得る単一コンピューター装置を含む。他の場合、コンピューターシステムは、各々が内部コンポーネントを有するサブシステムである複数のコンピューター装置を含み得る。コンピューターシステムは、デスクトップコンピューター、ラップトップコンピューター、タブレット、モバイルフォン、ウェアラブルデバイス又はそれらのいずれかの組合せを含み得る。
[0096] サブシステムは、システムバスを介して相互接続可能である。追加のサブシステムは、ディスプレイアダプターに結合可能なプリンター、キーボード、記憶デバイス及びモニターを含み得る。Ｉ／Ｏコントローラーに結合可能な周辺及び入力／出力（Ｉ／Ｏ）デバイスは、入力／出力（Ｉ／Ｏ）ポート（例えば、ＵＳＢ、FireWire（登録商標））などの当技術分野で公知のいずれかの数の接続によりコンピューターシステムに接続可能である。例えば、Ｉ／Ｏポート又は外部インターフェース（例えば、Ethernet、Wi-Fiなど）は、インターネットなどの広域ネットワーク、マウス入力デバイス又はスキャナーにコンピューターシステムを接続するために使用可能である。システムバスを介する相互接続は、セントラルプロセッサーと各サブシステムとの通信を可能にしたり、システムメモリー又は記憶デバイス（例えば、ハードドライブ又は光ディスクなどの固定ディスク）からの複数の命令の実行、さらにサブシステム間の情報交換を制御したりし得る。システムメモリー及び／又は記憶デバイスは、コンピューター可読媒体を具現化可能である。他のサブシステムは、データ収集デバイス、例えばカメラ、マイクロフォン、加速度計などであり得る。本明細書に挙げられるデータはいずれも、一方のコンポーネントから他方のコンポーネントに出力可能であるとともにユーザーに出力可能である。
[0097] 実施形態の態様は、ハードウェア（例えば、特定用途向け集積回路又はフィールドプログラマブルゲートアレイ）を用いて及び／又はモジュラー方式若しくはインテグレート方式の一般的プログラマブルプロセッサーによりコンピューターソフトウェアを用いて、制御ロジックの形態で実現可能である。本明細書で用いられる場合、プロセッサーは、シングルコアプロセッサー、同一インテグレートチップ上のマルチコアプロセッサー又はシングル回路ボード上の又はネットワーク接続の複数のプロセッシングユニットを含み得る。本明細書に提供される開示及び教示に基づいて、当業者であれば、ハードウェア及びハードウェアとソフトウェアとの組合せを用いて本明細書に記載の実施形態を実現する他の手段及び／又は方法を知って理解するであろう。
[0098] 本願に記載のソフトウェアコンポーネント又は機能はいずれも、例えば、従来技術又はオブジェクト指向技術を用いたいずれかの好適なコンピューター言語、例えばJava、C、C++、C#、Objective-C、Swiftなど、又はPerl若しくはPythonなどのスクリプト言語を用いてプロセッサーにより実行されるソフトウェアコードとして実現可能である。ソフトウェアコードは、記憶用及び／又は伝送のためのコンピューター可読媒体に一連の命令又はコマンドとして記憶可能である。
[0099] 特定の用語
[00100] 本明細書で用いられる用語は、特定の場合を説明することを目的としたものにすぎず、限定を意図したものではない。以下の用語は、当業者によるこうした用語の理解のために加えて、本明細書で用いられる用語の意味の例示のために考察される。本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形の「１つの（a）」、「１つの（an）」及び「その（the）」は、特に文脈上明確に規定されない限り複数の指示対象を含む。いずれの任意選択的要素も除外するように特許請求の範囲を起草し得ることにさらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求要素の記述に関する「単独」、「のみ」などのような排他的用語の使用、又は「否定的」限定の使用のための先行詞として機能することが意図される。
[00101] 特定の範囲は、本明細書では、「約」という用語を数値の前に付けて提示される。「約」という用語は、本明細書では、それが前に付いた厳密な数、さらにその用語が前に付いた数の近傍の数又は近似の数に対して事実に即した裏付けを提供するために用いられる。数が特定的に挙げられた数の近傍又は近似であるかを判定する場合、近傍又は近似の挙げられない数は、それが提供された文脈で特定的に挙げられた数に実質的に均等な数を提供する数であり得る。値の範囲が提供された場合、その範囲の上限と下限との間の各介在値（文脈上明らかに異なる規定がない限り下限の１／１０単位まで）及びその指定範囲内のいずれかの他の指定値又は介在値は、本明細書に記載の方法及び組成物の範囲内に包含されるものと理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、そのより小さい範囲に独立して含まれ得るとともに、その指定範囲内の任意の特定的に除外された限界の制約を受けて、本明細書に記載の方法及び組成物の範囲内に包含される。指定範囲が一方又は両方の限界を含む場合、それらの含まれる一方又は両方の限界を除外した範囲も本明細書に記載の方法及び組成物に含まれる。
[00102] 「者」、「患者」又は「対象」という用語は、同義的に用いられ得る。これらの用語は、ヘルスケアワーカー（例えば、医師、正看護師、ナースプラクティショナー、医師助手、オーダリー又はホスピスワーカー）のスーパービジョン（例えば、定常的又は間欠的なもの）により特徴付けられる状況をまったく必要としないか又はそれに限定されない。さらに、これらの用語は、ヒト又は動物の対象を意味し得る。
[00103] 「治療すること」又は「治療」とは、標的病理学的病態又は障害を予防又は遅延（軽減）することを目的とし得る治療処置及び予防手段の両方を意味し得る。治療を必要とする者としては、すでに障害を有する者、さらに障害を起こしやすい者又は障害を予防すべき者が挙げられ得る。例えば、対象（例えば、哺乳動物）は、療法を受けた後、対象が次の点、すなわちがん細胞の数の低減又はがん細胞の不在、腫瘍サイズの低減、軟組織及び骨へのがんの広がりをはじめとする末梢器官へのがん細胞の浸潤の阻害（すなわちある程度の遅延、好ましくは停止）、腫瘍転移の阻害（すなわちある程度の遅延、好ましくは停止）、腫瘍成長のある程度の阻害及び／又は特定のがんに関連する症状の１つ以上のある程度の軽減、罹患率及び／又は死亡率の低減並びに生活の質の問題の改善の１つ以上の観測可能及び／又は測定可能な低減又は不在を示す場合、腫瘍に関して成功裏に「治療」可能である。
[00104] 以下の実施例は、限定されるものではないが本発明の特定の態様の例示を提供する。
実施例
実施例１．非ＮＰＣ対象における血漿中ＥＢＶ ＤＮＡの検出率に影響を及ぼす因子の決定
[00105] ＮＰＣでない参加者において血漿中ＥＢＶ ＤＮＡの陽性率に影響を及ぼすおそれのある因子を調べた。この対象群は、さらなる検査を伴うフォローアップを受けることが可能であり、且つＮＰＣスクリーニングとの関連で偽陽性スクリーニング事例を呈した。非ＮＰＣ対象における検出可能な血漿中ＥＢＶ ＤＮＡに関連した因子の同定は、偽陽性スクリーニング結果の数を低減するために使用可能である。
[00106] この試験では、ＮＰＣスクリーニング試験に登録したが、スクリーニング後３年以内にＮＰＣを有していなかった２０，１３８名の参加者（年齢４０～６２歳の男性）を解析した。そのデモグラフィックデータ、併存症、さらにスクリーニング日の平均周囲温度を解析した。周囲温度は、香港観測所から入手した。最初に単変量解析を実施し、続いて多変量ロジスティック回帰を行って、検出可能な血漿中ＥＢＶ ＤＮＡに独立して関連する因子を同定した。
[00107] 単変量解析は、血漿中ＥＢＶ ＤＮＡの検出率に及ぼす個々の因子の影響を調べるために行った。個別に試験された因子は、年齢、現在の喫煙状態、現在の飲酒状態、運動習慣、糖尿病状態、高血圧症状態、高脂血症状態及び虚血性心疾患であった。
[00108] 年齢と検出可能な血漿中ＥＢＶ ＤＮＡとの間に正の相関が存在した（Ｐ＜０．００１、Ｒ＝０．６５１、線形回帰、図１参照）。年齢が５歳増加するごとに、血漿中ＥＢＶ ＤＮＡの陽性率の０．６％増加に関連付けられた。
[00109] 現在の喫煙状態と検出可能な血漿中ＥＢＶ ＤＮＡとの間に統計的に有意な関係が存在した（Ｐ＜０．００１、χ２検定、表１）。オッズ比は、１．４８であった。
[00110] アルコール摂取と検出可能な血漿中ＥＢＶ ＤＮＡとの間に統計的に有意な関係は存在しなかった（Ｐ＝０．９０８６、χ２検定、表２）。
[00111] 運動習慣と検出可能な血漿中ＥＢＶ ＤＮＡとの間に相関は存在しなかった（Ｐ＝０．７４４１、χ２検定、表３）。レギュラー運動は、少なくとも２日／週で少なくとも３０分間の適度な運動を行うこととして定義した。
[00112] 糖尿病と検出可能な血漿中ＥＢＶ ＤＮＡとの間に統計的に有意な影響が存在した（Ｐ＝０．０１２、χ２検定、表４）。
[00113] 高血圧症と検出可能な血漿中ＥＢＶ ＤＮＡとの間に統計的に有意な関係が存在した（Ｐ＝０．００９、χ２検定、表５）。
[00114] 高脂血症と検出可能な血漿中ＥＢＶ ＤＮＡとの間に統計的に有意な関係は存在しなかった（Ｐ＝０．１８、χ２検定、表６）。
[00115] 虚血性心疾患と検出可能な血漿中ＥＢＶ ＤＮＡとの間に統計的に有意な関係は存在しなかった（Ｐ＝０．０６、χ２検定、表７）。
[00116] 温度と検出可能な血漿中ＥＢＶ ＤＮＡとの間に負の相関が存在した（Ｐ＜０．００１、Ｒ＝０．６５１、線形回帰、図２）。平均周囲温度が５℃低下するごとに、血漿中ＥＢＶ ＤＮＡの陽性率の０．８５％増加に関連付けられた。
[00117] これらの因子が、検出可能な血漿中ＥＢＶ ＤＮＡに独立して関連付けられるかをさらに調べるために、多変量ロジスティック回帰分析を実施した。
[00118] 多変量ロジスティック回帰分析では、年齢、現在の喫煙状態及び周囲温度のみが血漿中ＥＢＶ ＤＮＡの検出率の増加に独立して関連付けられた（表８）。血漿中ＥＢＶ ＤＮＡに及ぼす糖尿病及び高血圧症の影響は、これらの２つの状態が老年群でより多く見られるため、年齢により妨げられた可能性がある。多変量解析に基づいて、喫煙者は、検出可能な血漿中ＥＢＶ ＤＮＡを有する可能性が非喫煙者の１．５９倍であった。
[00119] 非ＮＰＣ対象における血漿中ＥＢＶ ＤＮＡの陽性率の増加は、一過性ウイルス複製の存在に起因する可能性があった。ＮＰＣスクリーニングとの関連では、非ＮＰＣ対象における検出可能な血漿中ＥＢＶ ＤＮＡの存在は、偽陽性スクリーニング結果を呈し得るとともに、経鼻内視鏡検査及びＭＲＩを用いた検査を必要とし得る。したがって、非ＮＰＣ対象における血漿中ＥＢＶ ＤＮＡの検出率の低減は、スクリーニングプログラムの費用効果を向上させ得る。Chan et al. (2018) Ambient Temperature and Screening for Nasopharyngeal Cancer. NEJM 378: 962-963)を参照されたい。
実施例２．血漿中ＥＢＶの検出
[00120] 血漿サンプルは、鼻咽頭がん（ＮＰＣ）を有する疑いのある喫煙習慣のある６０歳の女性から採取される。血漿サンプル中のＥＢＶ ＤＮＡの濃度は、ＥＢＶゲノムのＢａｍＨＩ－Ｗ領域のリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて測定される。β－グロビン遺伝子のリアルタイム定量ＰＣＲも対照として行われる。各ｑＰＣＲ反応の３回のレプリケートが行われる。検量線は、標準としてＥＢＶ陽性細胞株由来のＤＮＡを用いて、各ｑＰＣＲに対して並行して求められる。血漿中ＥＢＶ ＤＮＡの濃度は、決定されて、血漿１ミリリットル当たりのＥＢＶゲノムのコピー数として表される。
[00121] ベースライン閾値の血漿中ＥＢＶ ＤＮＡレベルは、１００，０００コピー／ｍＬに設定される。しかしながら、女性が喫煙者であることを考慮して、閾値は、１１０，０００コピー／ｍＬに対して１０％高く設定される。女性で検出された血漿中ＥＢＶ ＤＮＡの量は、１００，５００コピー／ｍＬである。これが調整閾値未満であることを考慮して、この女性は、ＮＰＣを有する疑いがなく、さらなるスクリーニングは実施されない。
[00122] 本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し且つ説明してきたが、かかる実施形態が例として提供されているにすぎないことが当業者に明らかであろう。現時点では、当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多くの変形形態、変更形態及び置換形態が想到されるであろう。本発明を実施する際、本明細書に記載される本発明の実施形態の各種の代替形態を利用し得ることを理解すべきである。以下の請求項が本発明の範囲を規定すること、且つこれらの請求項及びそれらの均等物の範囲内の方法及び構造がそれらにより包含されることが意図される。

Claims (28)

  1. 対象からのサンプルを、がん細胞由来のエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）細胞フリー核酸の存在について分析する方法であって、
    ａ）前記対象からの生物学的サンプル中のエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）由来の細胞フリー核酸の量を決定すること、及び
    ｂ）前記ＥＢＶ由来の細胞フリー核酸の前記量を、あらかじめ決められたベースライン閾値よりも高い調整された閾値と比較し、
    ここで、
    （ｉ）前記対象は、ベースライン年齢を上回る年齢を有する、
    （ｉｉ）前記対象は、喫煙者である、又は
    （ｉｉｉ）前記生物学的サンプルが取得された日における、取得位置から５０ｋｍ以内の位置における平均周囲温度が、ベースライン温度を下回り、
    ここで、前記あらかじめ決められたベースライン閾値は、（ｉ）前記ベースライン年齢以下の年齢を有する、（ｉｉ）非喫煙者である、（ｉｉｉ）参照生物学的サンプルを提供した、及び（ｉｖ）知られているがん状態を有する、参照対象を含む参照集団についてのサンプルにおける前記がん細胞からのＥＢＶ細胞フリー核酸の存在の指標である、ＥＢＶ細胞フリー核酸の閾値量であり、
    ここで、１つ以上の参照生物学的サンプルが取得された日における、それぞれ１つ以上の参照生物学的サンプルの取得位置から５０ｋｍ以内の位置における平均周囲温度は、ベースライン温度以上の温度であり、
    前記がん細胞が、鼻咽頭がん細胞であり、
    前記知られているがん状態を有する参照対象が、鼻咽頭がんを有する第１の参照対象と、鼻咽頭がんを有していない第２の参照対象を含み、
    それにより前記がん細胞由来のＥＢＶ細胞フリー核酸の存在について前記サンプルを分析すること
    を含む方法。
  2. 前記対象は、喫煙者である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記調整された閾値は、対象が喫煙者でなかった場合よりも高く設定される、請求項２に記載の方法。
  4. 前記対象の前記年齢が、ベースライン年齢を上回る、請求項１に記載の方法。
  5. 前記調整された閾値は、対象年齢との正の相関を含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記生物学的サンプルが取得された日における、取得位置から５０ｋｍ以内の位置における前記平均周囲温度が、ベースライン温度を下回る、請求項１に記載の方法。
  7. 前記調整された閾値は、平均周囲温度と負に相関される、請求項６に記載の方法。
  8. 前記ベースライン温度は、３０℃である、請求項１に記載の方法。
  9. 前記ベースライン年齢は、４５歳である、請求項１に記載の方法。
  10. 前記対象の前記年齢は、ベースライン年齢を上回り、前記対象は、喫煙者である、請求項１に記載の方法。
  11. 前記対象の前記年齢は、ベースライン年齢を上回り、前記生物学的サンプルが取得された日における、取得位置から５０ｋｍ以内の位置における前記平均周囲温度は、ベースライン温度を下回る、請求項１に記載の方法。
  12. 前記対象は、喫煙者であり、前記生物学的サンプルが取得された日における、取得位置から５０ｋｍ以内の位置における前記平均周囲温度は、ベースライン温度を下回る、請求項１に記載の方法。
  13. 前記対象の年齢は、ベースライン年齢を上回り、前記対象は、喫煙者であり、前記生物学的サンプルが取得された日における、取得位置から５０ｋｍ以内の位置における前記平均周囲温度は、ベースライン温度を下回る、請求項１に記載の方法。
  14. 前記調整された閾値は、前記対象が糖尿病を有するか、アルコールを摂取するか、運動するか、高血圧症を有するか、高脂血症を有するか又は虚血性心疾患を有するかどうかに基づいて決定されない、請求項１に記載の方法。
  15. 前記ＥＢＶ由来の細胞フリー核酸の前記量を、前記調整された閾値と比較することは、細胞フリー核酸の前記量を、前記ベースライン閾値と比較することと比べてスクリーンの偽陽性率を低減する、請求項１に記載の方法。
  16. 前記量は、１ミリリットル当たりの前記ＥＢＶ由来の細胞フリー核酸のコピー数（コピー／ｍＬ）を含む、請求項１に記載の方法。
  17. 前記生物学的サンプル中の前記ＥＢＶ由来の細胞フリー核酸の前記量が前記調整された閾値を上回る場合、前記がん細胞由来のＥＢＶ細胞フリー核酸の存在を検出するための第２の分析を実施することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  18. 前記第２の分析は、第２の生物学的サンプル中の前記ＥＢＶ由来の細胞フリー核酸のサイズを決定することを含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記第２の生物学的サンプルは、前記生物学的サンプルと同一である、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記第２の生物学的サンプルは、前記生物学的サンプルと異なる、請求項１８に記載の方法。
  21. 前記第２の分析は、前記ＥＢＶに由来し、且つ所与の範囲内のサイズを有する細胞フリー核酸の量を、前記対象からの前記第２の生物学的サンプルから決定することを含む、請求項１８に記載の方法。
  22. 前記ＥＢＶに由来し、且つ所与の範囲内のサイズを有する前記細胞フリー核酸の前記量を決定することは、前記第２の生物学的サンプル中の前記細胞フリー核酸の大規模並列シーケンシングを行って、配列リードを生成することを含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記生物学的サンプルは、血漿又は血清を含む、請求項１に記載の方法。
  24. 前記量を決定することは、前記細胞フリー核酸の増幅を含む、請求項１に記載の方法。
  25. 前記増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記ＰＣＲは、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法の操作を実施するようにコンピューターシステムを制御するための複数の命令を記憶するコンピューター可読媒体を含むコンピューター製品。
  28. 請求項２７に記載のコンピューター製品と、前記コンピューター可読媒体に記憶された命令を実行するための１つ以上のプロセッサーとを含むシステム。
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