JP7377257B2

JP7377257B2 - ペプチド合成のための開裂可能なリンカー

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Publication number: JP7377257B2
Application number: JP2021506666A
Authority: JP
Inventors: ベルクマン，フランク; ポンプルン，ゼーバスティアン・ヨハネス; ロイブル，ジーモン・フェルディナント
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2018-08-09
Filing date: 2019-08-07
Publication date: 2023-11-09
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Description

本発明は、ペプチド合成の技術分野に関する。より正確には、本発明は、開裂可能なリンカーを化学的に合成されたペプチドに導入する新たな可能性を提供し、それにより、新たなペプチドコンジュゲートを作成する。

開裂可能な結合を介して２つの官能基を接続する化学部分として定義される開裂可能なリンカーは、固相合成（ＳＰＳ）および化学生物学において重要なツールである。とりわけ固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）において、これらのリンカーは、ペプチドの物理化学的特性、取り扱いおよび精製に関する問題の解決に役立つことができる：開裂可能なリンカーを介して、ペプチドを、機能性タグ（例えば、溶解度増強部分）で修飾することができ、リンカーの開裂後、リンカーの残基を伴ってまたは伴わずに、所望のペプチドが放出される。開裂可能なリンカーは、有機合成および固相合成において広く使用されている（例えば、Ｌｅｒｉｃｈｅｅｔａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１２，２０，５７１－５８２；Ｓｃｏｔｔｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００６，２２５１－２２６８を参照）。開裂は、化学物質（求核試薬、塩基性試薬、求電子試薬、酸性試薬、還元試薬、酸化試薬、有機金属および金属触媒）によって、光化学的または酵素的手段によって実施されてもよい。ペプチド合成において、開裂可能なリンカーは、新生ペプチドを樹脂と連結するために主に使用され、これは、固相ペプチド合成の完了後に切断することができる（例えば、ＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓＣａｔａｌｏｇｕｅ，Ｍｅｒｃｋ；Ｊｅｎｓｅｎｅｔａｌ．（Ｅｄ．），ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０４７，ＳｐｒｉｎｇｅｒＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，２０１３を参照）。

ペプチド配列への内部組み込みのために、開裂可能なリンカービルディングブロックも記述されている。ペプチド合成のためのα，γ－ジアミノ－β－ヒドロキシブタン酸およびγ－アミノ－α，β－ジヒドロキシブタン酸ベースのリンカービルディングブロックは、Ａｍｏｒｅｅｔａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ２０１３，１４，１２３－１３１によって記述されている。これらのリンカーは、酸化的手段によって、すなわち、過ヨウ素酸ナトリウムを使用して、開裂することができる。システインまたはメチオニン残基のようなペプチド内の酸化感受性成分の酸化が不利点となり得る。

Ｋｉｍｅｔａｌ．，Ｓｙｎｌｅｔｔ２０１３，２４，７３３－７３６によって記述されているペプチド合成のための光開裂可能なリンカービルディングブロックがもう１つの例である。光照射の不利点は、ラジカル反応から生じる不完全なリンカー開裂および副反応であり得る。［２－（アミノメチル）フェニル］酢酸をベースとするアルコールのための周期的に開裂可能なリンカーが、Ｘｉａｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．１９９９，１，３７９－３８２によって記述されている。このリンカーは、固体支持体を使用するアルコールの合成および放出にのみ適用されてきた。ペプチド合成における内部組み込みに使用され得る誘導体については、記述されていない。異なる化学および開裂条件を使用し、開裂可能な可溶化タグを適用するペプチド合成が記述されている（例えば、Ｊａｃｏｂｓｅｎｅｔａｌ．，ＪＡＣＳ２０１６，１３８，１１７７７－１１７８２；国際公開第２０１６０４７７９４号パンフレットを参照）。

異なる化学および開裂条件を使用し、開裂可能な精製タグを適用するペプチド合成が記述されている（例えば、Ｆｕｎａｋｏｓｈｉｅｔａｌ．，ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ１９９１，８８，６９８１－６９８５；Ｆｕｎａｋｏｓｈｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１９９３，６３８，２１－２７；Ｃａｎｎｅ，ｅｔａｌ．ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ１９９７，３８，３３６１－３３６４；Ｖｉｚｚａｖｏｎａｅｔａｌ．，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ２００２，４３，８６９３－８６９６；Ｈａｒａｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｅｐｔｉｄｅＳｃｉｅｎｃｅ，２００９，１５，３６９－３７６；Ａｕｃａｇｎｅｅｔａｌ．，ＡｎｇｅｗａｎｄｔｅＣｈｅｍｉｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＥｄｉｔｉｏｎ２０１２，５１，１１３２０－１１３２４；Ｒｅｉｍａｎｎｅｔａｌ．，ＡｎｇｅｗａｎｄｔｅＣｈｅｍｉｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＥｄｉｔｉｏｎ２０１５，５４，３０６－３１０；Ｈａｒａｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｅｐｔｉｄｅＳｃｉｅｎｃｅ，２０１６，１５，３７９－３８２；Ｐａｔｅｎｔｓ：Ａｕｃａｇｎｅｅｔａｌ．国際公開第２０１１０５８１８８号パンフレット、Ｚｉｔｔｅｒｂａｒｔｅｔａｌ．国際公開第２０１７１２９８１８Ａ１号パンフレットを参照）。このアプローチにおいて、リンカーは、通常、ＳＰＰＳの最後のサイクルで成長中のペプチド鎖のＮ末端に結合され、所望の全長ペプチドの固体支持体上への選択的固定を可能にする。副生成物は、固体支持体を洗浄することによって除去され、最終的には、標的ペプチドはリンカーの開裂によって放出される。ペプチドの非クロマトグラフ的精製に使用される開裂可能なリンカーは、通常、強塩基性条件を必要とする。これらの条件下では、望ましくない副反応、例えばラセミ化が起こるかもしれない。頻繁に使用されるスルホネート排除リンカーの主な問題は、高度に反応性の求電子試薬であり、これは、開裂反応中に生成される。これらの中間体は、求核性側鎖基（例えば、アルギニン、システイン）と迅速に反応し、その結果として、スルホネートベースの開裂可能なリンカーの適用を限定する。Ｖｉｚｚａｖｏｎａｅｔａｌ．（ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ２００２，４３，８６９３－８６９６）による酸化的に開裂可能な精製リンカーの非常に希少な例は、前述の問題を回避しているが、メチオニンまたはシステイン含有ペプチドと適合しない可能性が最も高い。

イソアシルジペプチドは、ＦｍｏｃＳＰＰＳにおいて合成効率を増強するためのツールである（Ｙ．Ｓｏｈｍａｅｔａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００４，１２４－１２５）。イソアシルジペプチドは、β－ヒドロキシル基がＦｍｏｃ保護アミノ酸によってアシル化されている、Ｂｏｃ保護セリンまたはトレオニン誘導体からなる。ペプチドの配列内へのイソアシルジペプチドビルディングブロックの組み込み後、ペプチドの二次構造が変化し、より効率的な合成が可能になる。さらに、開裂および脱保護後、ペプチドのイソアシル形態をＨＰＬＣによって精製することができる。ｐＨ７．４において、Ｏ→Ｎ分子内アシル移動が行われて、規則的にアミド連結されたペプチドを生成する。これらのイソアシルジペプチドビルディングブロックを適用すると、開裂反応を実施することができない。

ペプチド－オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、治療および診断用途のための新興クラスである。しかしながら、これらのコンジュゲートの合成は、依然として大きな課題のままである（例えば、Ｎ．Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎｅｔａｌ．，ＣｈｅｍｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ２００６，１０６，３７１２－３７６１およびＫ．Ｌｕｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２０１０，２１，１８７－２０２の総説を参照）。率直なアプローチは、固相ベースの合成を活用して、ポリマー支持体上に所望のペプチド－オリゴヌクレオチドコンジュゲートを構築することであろう。残念なことに、固相オリゴヌクレオチドおよびペプチド合成の確立された方法は、完全に適合するわけではない。ペプチドの固相合成は、強酸の使用を必要とし、それにより、酸性条件下でのオリゴヌクレオチドの不安定性によるペプチド－オリゴヌクレオチドコンジュゲートの合成を防止する。これは、ペプチド－オリゴヌクレオチドコンジュゲートの段階的合成が、通常最初にペプチドを構築すること、続いて、同じ固体支持体上でのオリゴヌクレオチド合成によって進むからである。この戦略は、非常に単純なペプチド－オリゴヌクレオチドコンジュゲートの合成に首尾よく適用されてきたにもかかわらず、方法は、アミノ酸側鎖の困難な化学に対処するための適合性の保護基の全領域を依然として欠いている。最終的に、ペプチド－オリゴヌクレオチドコンジュゲートの段階的固相ベースの合成のための信頼性が高くかつ一般的な適用可能な方法は、利用不可能である。したがって、ペプチド－オリゴヌクレオチドコンジュゲートの合成は、通常、収束戦略を用いることによって進む。ここで、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドフラグメントは、通常用いられるビルディングブロックおよび固相合成のプロトコールを使用することによって、別個に合成される。精製後、２つのフラグメントをコンジュゲートし、追加の精製ステップ後に、所望のペプチド－オリゴヌクレオチドコンジュゲートを単離する。低い全収率、時間消費の増大および高いコストがこの戦略の主な不利点であり、これらは、前述の多数の精製ステップおよび中間体凍結乾燥手順によって生じる。その上、ＨＰＬＣベースの精製ステップおよび中間体凍結乾燥は、自動化を活用してペプチド－オリゴヌクレオチドコンジュゲートのハイスループット合成を達成する可能性を妨げる。これらの欠点は、例えば、公知のアンチセンスオリゴヌクレオチド上の好適なトランスフェクションペプチドをスクリーニングするために必要とされる、多数のペプチド－オリゴヌクレオチドコンジュゲートを合成する必要がある場合には特に厄介になる。完全な方法は、あらゆるＨＰＬＣベースの精製の必要性を無視しながら、確立された固相合成および合成後コンジュゲーションの容易さを組み合わせるものであろう。

しかしながら、ペプチド合成に開裂可能なリンカーを適用するための上記で開示した方法はすべて、非効率的な組み込みもしくは開裂、過酷な、損傷を与える開裂条件、複雑な試薬合成または使用制限のような、いくつかの不利点を有する。

したがって、本発明は、構造
［式中、２≦ｎ≦２４、ｍ＝２または３であり、ＡおよびＢは、保護基である］を含むビルディングブロック（building block：構成要素）を提供する。通常、ＡおよびＢは、異なる条件下で開裂される直交保護基である。一実施形態では、Ａは、酸に不安定な保護基であり、
Ｂは、タグまたは塩基に不安定な保護基である。１つの特定の実施形態では、Ａは、Ｂｏｃであり、かつ／またはＢは、Ｆｍｏｃである。

第２の態様では、本発明は、構造
［式中、２≦ｎ≦２４、ｍ＝２または３であり、Ｘは、ペプチドまたは固体支持体であり、Ｙは、ペプチド、官能基、タグ、および官能基またはタグを含有するペプチドからなる群から選択される］を含む化合物を提供する。

一実施形態では、Ｙは、溶解度増強タグ、固定タグまたは固相のいずれかである。例えば、Ｙは、ＰＥＧ、ポリ－リジン、ポリ－アルギニン、ポリ－グルタミン酸およびポリ－アスパラギン酸からなる群から選択されてよい。Ｙは、ビオチン、ヒドラジン、アミノオキシ、アジド、アルキニル、アルケニル、アルデヒド、ケトン、ピロロアラニン、カルボキシおよびチオールからなる群から選択されてもよい。

第３の態様では、本発明は、
固体支持体上でペプチドを合成するステップであって、前記ペプチドが末端アミノ基を含むステップと、
上記で開示した通りのビルディングブロックを提供するステップと、
前記ビルディングブロックを前記ペプチドとカップリングするステップとを含む、方法を提供する。

前記方法は、
保護基Ｂを除去するステップと、
少なくとも１つのアミノ酸ビルディングブロックを末端アミノ基とカップリングするステップとをさらに含んでよい。

代替として、前記方法は、
保護基Ｂを除去するステップと、
場合により少なくとも１つのアミノ酸ビルディングブロックを末端アミノ基とカップリングするステップと、
タグまたは官能基を末端アミノ基とカップリングするステップとをさらに含んでよい。

前記官能基またはタグは、ＰＥＧ、ポリ－リジン、ポリ－アルギニン、ポリ－グルタミン酸、ポリ－アスパラギン酸、ビオチン、ヒドラジン、アミノオキシ、アジド、アルキニル、アルケニル、アルデヒド、ピロロアラニン、カルボキシおよびチオールからなる群から選択されてよい。

加えて、上記で開示した方法は、
ｐＨ≦６で保護基Ａを除去し、それにより、前記ペプチド上に存在する他の保護基も除去するステップと、ｐＨ≧８で起こり得る、固体支持体から前記ペプチドを開裂するステップとをさらに含んでよい。

一実施形態では、本発明は、
ａ）固体支持体上でペプチドを合成するステップであって、前記ペプチドが末端アミノ基を含むステップと、
ｂ）上記で開示した通りのビルディングブロックを提供するステップと、
ｃ）前記ビルディングブロックを前記ペプチドとカップリングするステップとを含む、方法を提供する。
ｄ）保護基Ｂを除去するステップと、
ｅ）場合により少なくとも１つのアミノ酸ビルディングブロックを末端アミノ基とカップリングするステップと、
ｆ）可溶化または固定化タグを末端アミノ基とカップリングするステップとを含み、
さらに、
ｇ）ｐＨ≦６で保護基Ａを除去し、それにより、前記ペプチド上に存在する他の保護基も除去するステップと、固体支持体から前記ペプチドを開裂するステップと、
ｈ）前記ペプチドを精製するステップと、
ｉ）前記可溶化タグをｐＨ≧８で切断するステップ、または、
ｊ）ｐＨ≦６で保護基Ａを除去し、それにより、前記ペプチド上に存在する他の保護基も除去するステップと、固体支持体から前記ペプチドを開裂するステップと、
ｋ）固体支持体上の前記固定化タグを介して前記ペプチドを固定するステップと、
ｌ）場合により前記ペプチドを追加の化学実体とコンジュゲートするステップと、
ｍ）前記可溶化タグをｐＨ≧８で切断するステップとを含む、方法を提供する。

前記化学実体は、炭水化物、タンパク質、ペプチド、染料、ハプテン等であってよい。特に、前記化学実体は、核酸、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオチド含有化合物、好ましくはヌクレオシド－六リン酸であってよい。

実施例３に従うリンカー１の導入を含むペプチド合成ペプチド合成０．０５ＭＮａＨＣＯ_３溶液（ｐＨ＝８．２）中の溶媒和、環化をトリガーするＬＣ－ＭＳは、ペプチドＡＢの、ＡおよびＢへの開裂を経時的に示す実施例４に従う疎水性ペプチドの合成不溶性ペプチド１２からのポリ－リジンタグの開裂。Ｈ－ＫＫＫＫＫ１ＡｈａＧＩＳＦＳＩＲＦＡＩＷＩＲＦＧ－ＮＨ２（１０）のＬＣ－ＭＳ不溶性ペプチド１２のＭＳ（ＥＳＩ）実施例５に従う親和性精製ＳＰＰＳおよび樹脂からの開裂後の粗ペプチド混合物３０分後の上清０．０２ＭＮＨ_４ＨＣＯ_３（ｐＨ＝８．８）とともに３０分間にわたってインキュベーション後の上清スキーム：実施例７に従うヌクレオシド－ペプチドコンジュゲートの迅速合成ａ）固体支持コンジュゲーションおよび非クロマトグラフ的精製によるペプチドおよびヌクレオシド－ペプチドコンジュゲートの合成実施例７において得られたコンジュゲートのＨＰＬＣ分析実施例７において得られたコンジュゲートのＨＰＬＣ分析実施例７において得られたコンジュゲートのＨＰＬＣ分析実施例７において得られたコンジュゲートのＨＰＬＣ分析

定義および略語のリスト：
Ｆｍｏｃ：フルオレニルメチルオキシカルボニル
Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル
ＳＰＰＳ：固相ペプチド合成
ＳＰＳ：固相合成
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＤＢＵ：１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＤＡＢ：ジアミノ酪酸
ＥＤＣ：Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ′－エチルカルボジイミド
ＤＭＡＰＮ，Ｎ－ジメチルピリジン－４－アミン
ＨＡＴＵ：１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート
ＤＩＰＥＡ：Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＴＨＰＴＡ：トリス（３－ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン
Ｐｒａ：プロパルギルグリシン
Ａｈａ：アジドホモアラニン
ＴＩＳ：トリイソプロピルシラン

定義：
タグ：本発明の文脈では、タグは、分子の化学的もしくは物理的特性を改変し、かつ／または分子を認識可能にする、化学部分である。例えば、精製タグは、分子の精製を容易にし得る。タグは、固定タグ、すなわち、固体支持体に結合し得る化学部分であってよい。タグは、存在する場合、ある特定の分子の溶解度を増大させる化学基を意味する、溶解度増強タグであってもよい。

官能基：官能基は、それらの分子の特徴的な化学反応を司る、分子内の原子または結合の特異的な化学基（部分）である。官能基は、それらの分子の特徴的な化学反応を司る、分子内の特異的な置換基または部分である。同じ官能基は、それがその一部である分子のサイズにかかわらず、同じまたは同様の化学反応を受けることになる。これは、化学反応および化学化合物の挙動の体系的予測ならびに化学合成の設計を可能にする。さらに、官能基の反応性は、近隣の他の官能基によって修飾することができる。有機合成において、官能基相互変換は、転換の基本型の１つである。官能基は、それらが何に結合していようとも、独特の化学的特性の１個または複数の原子の基である。官能基の原子は、共有結合によって、互いにおよび分子の残りと連結している。ポリマーの繰り返し単位について、官能基は、それらの炭素原子の非極性コアに結合しており、故に、炭素鎖に化学的特徴を付加する。官能基は、荷電されることもできる。

保護基：用語「保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｇｒｏｕｐ）」またはその同義語「保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇｇｒｏｕｐ）」は、化学反応が、合成化学において慣用的に関連する意味において、別の保護されていない反応部位で選択的に行われ得るように、多官能性化合物中の反応部位を選択的にブロックする基を意味する。保護基は、適切なポイントで削除することができる。保護基は、アミノ保護基、カルボキシ保護基、またはヒドロキシ保護基である。保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇｇｒｏｕｐ）または保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｇｒｏｕｐ）またはブロッキング基は、官能基の化学修飾によって分子に導入されて、その後の化学反応において化学選択性を得る。保護基は、官能基の反応性をブロックするまたは少なくとも低減させるために導入される。脱保護は、保護基の除去の化学的ステップである。ペプチド合成の分野における関連する保護基は、塩基に不安定な保護基および酸に不安定な保護基である。塩基に不安定な保護基は、７．５から１２の間のｐＨであるが、好ましくは８．０から１０の間のｐＨで切断される。酸に不安定な保護基は、６．５から３の間のｐＨであるが、好ましくは６．０から５の間のｐＨで切断される。本発明では、アミノ保護基が特に重要である。アミノ保護基は、アミノ基を保護するように意図されている基であり、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル（カルボベンジルオキシ、ＣＢＺ）、Ｆｍｏｃ（９－フルオレニルメチルオキシカルボニル）、ｐ－メトキシベンジルオキシカルボニル、ｐ－ニトロベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）およびトリフルオロアセチルを含む。これらの基の例は、Ｔ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅａｎｄＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，“ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ”，２ｎｄｅｄ．，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９１，ｃｈａｐｔｅｒ５；Ｅ．Ｈａｓｌａｍ，“ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｊ．Ｇ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ，Ｅｄ．，ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９７３，Ｃｈａｐｔｅｒ５，およびＴ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，“ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ”，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ，１９８１，Ｃｈａｐｔｅｒ５において見られる。

ペプチド：ペプチドは、２から１２０残基の長さを持つアミド結合を介して連結しているアミノ酸ビルディングブロックの鎖である。

ペプチド合成のための新規開裂可能なリンカーが開発された。開裂は、弱塩基性条件下で起こる。リンカーは、４－アミノブタノエートコアをベースとし、これがｐＨ≧８で分子内ラクタム化を受けて、２つのフラグメント、Ｎ末端アルコールおよびＣ末端ラクタムを放出することにより、エステル結合を開裂する（スキーム１ａ）。Ｎ_α－Ｆｍｏｃ－Ｎ_γ－Ｂｏｃ保護ビルディングブロック（スキーム１ｂ）として、このアミノブタノエート開裂可能なリンカーを、固相ペプチド合成において用いることができる。アミノブタノエートリンカー１は、従来のペプチド合成中、および驚いたことに、連続アミノ酸のＦｍｏｃ脱保護中に安定であることが判明し、６員ジケトピペラジンおよび対応する崩壊ペプチドへの環化は観察されなかった。
スキーム１

ａ）リンカーの周期的開裂（ｎ＞１）。
ｂ）保護された開裂可能なリンカーの一般式（ｎ＞１）。

固相ペプチド合成中、Ｎ_γ－Ｂｏｃ保護アミノ基は非反応性であり、アミノブタノエートリンカーはインタクトなままである。固体支持体からのペプチドの開裂および酸性条件下での保護基の脱保護は、アミノブタノエートリンカーのＮ_γ－Ｂｏｃ保護基の除去につながる。アミノ基は、酸性開裂および脱保護条件下でプロトン化されることから、ラクタム化反応は完全に抑制され、アミノブタノエートリンカーはインタクトなままである。したがって、インタクトなアミノブタノエートリンカーを含有するペプチドは、酸性条件（すなわち、水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸溶離液）下で精製されることもできる。弱塩基性条件下、アミノブタノエートリンカーの開裂は、分子内環化反応を活用して進み、２つのペプチドを、一方はＮ－アルコールとして、および他方はＣ末端ラクタムとして放出する。アミノブタノエートリンカー（ｎ＞１）を用いる固相ペプチド合成および２つのペプチドフラグメントの放出を伴う最終開裂を示すスキーム２において、一般概念を示す。
スキーム２

ｎ＝１を持つ開裂可能なリンカーは、固相ペプチド合成中に副反応（すなわち、エステル開裂）を起こしたことから適していないことが分かっている。しかしながら、ｎ＝２およびｎ＝３を持つ開裂可能なリンカーは、固相ペプチド合成に適合し、所望のリンカー含有ペプチドを産出し、これは、弱アルカリ性条件下で開裂することができた。したがって、上記で言及したビルディングブロックを使用して、様々な官能基をペプチドのＮ末端に付加することができ、これは、後のプロセスステップで除去することができる。

開裂可能な官能基を付加する１つの用途は、そのような疎水性ペプチドの精製（すなわちＨＰＬＣによる）を可能にするために、疎水性ペプチドのＮ末端に親水性タグを導入することである。精製後、精製された疎水性標的ペプチドを放出するために、可溶化タグを弱塩基性条件下で切断することができる。

方法は、オリゴヌクレオチド－ペプチドコンジュゲートの改善された合成に適用することもできる。これは、ペプチドが多くの疎水性残基を含有する場合、特に興味深い。例えば、アジドホモアラニン等、オリゴヌクレオチドの結合のためのコンジュゲーション部位を含有する疎水性ペプチドが最初に合成され得る。次いで、開裂可能なアミノブタノエートリンカーがカップリングされ、続いて、可溶化タグ配列が導入される。開裂および脱保護後、ペプチドをＨＰＬＣによって精製し、最後に、コンジュゲーション部位で官能基化されたオリゴヌクレオチドとコンジュゲートすることができる。前記コンジュゲーション部位は、例えば、アルキン基であってよい。その後、コンジュゲートを精製することができ、可溶化タグを弱アルカリ性条件下で切断することができる。

別の用途は、ペプチドのＮ末端に導入され得る精製タグの導入である。ビオチンは、そのような精製タグの顕著な例である。最初に、各カップリング後にキャッピングステップを含むＳＰＰＳを介して、ペプチドを合成する。その後、開裂可能なリンカーをペプチドのＮ末端とカップリングし、最後にビオチンを開裂可能なリンカーとカップリングする。酸性条件下での開裂および脱保護後、ビオチン標識されたペプチドを、好ましくは磁性ビーズであるストレプトアビジンコーティングされたビーズと結合させることができる。ＳＰＰＳの非ビオチン化副産物（すなわち、失敗配列、欠失）は、洗浄によって除去することができる。その後、弱アルカリ処理下でリンカーを開裂することによって、精製されたペプチドをストレプトアビジンビーズから放出することができる。

ペプチド－オリゴヌクレオチドコンジュゲートの収束合成のための現代的方法は、複数の精製ステップを必要とする。したがって、多数のペプチド－オリゴヌクレオチドコンジュゲートのスクリーニングは、時間とコストのかかる努力である。本発明の方法は、ペプチド－（オリゴ）ヌクレオチドコンジュゲートの迅速合成を可能にする。本発明の開裂可能なリンカービルディングブロックを使用する本発明の方法は、化学選択的反応性単位および開裂可能な精製タグの組合せにより冗長なＨＰＬＣ－精製ステップの必要性を回避し、関心対象の分子の穏やかな開裂を可能にする。この非クロマトグラフ的精製アプローチは、多数のコンジュゲートの並列合成を良好な収率および純度で可能にする。

実施例内で示す通り、本発明の開裂可能なリンカーは、合成し易く、わずかにアルカリ性の非破壊的な条件下で、ペプチドへの効率的な組み込みおよび穏やかな開裂を可能にする。

実施例１：リンカー１（ｍ＝２、ｎ＝３）の合成
スキーム３

化合物２の合成：４‐ヒドロキシ酪酸アリル

ＤＭＦ（１７ｍｌ）中のγ－ブチロラクトン（５．００ｇ、５８．１ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｈ_２Ｏ（１３．６ｇ、１３．６ｍｌ、７５５ｍｍｏｌ）およびＤＢＵ（８．８５ｇ、８．６７ｍｌ、５８．１ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１時間撹拌した後、臭化アリル（１０．５ｇ、７．５３ｍｌ、８７．２ｍｍｏｌ）を溶液に添加した。１時間後、飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液（３０ｍｌ）の添加によって反応物をクエンチし、水性相を酢酸エチル（３×１００ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。ＳｉＯ_２上でのカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝１：１）により、所望生成物（５．９０ｇ、４０．９ｍｍｏｌ、７１％）を無色油として生じさせた。
Ｒ_ｆ（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝１：１）＝０．３３（ＫＭｎＯ_４）
^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝６．０６－５．８６（ｍ，１Ｈ），５．４２－５．０４（ｍ，２Ｈ），４．５９（ｔｄ，Ｊ＝１．４，５．７Ｈｚ，１Ｈ），４．３５（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ），４．２５－４．０６（ｍ，１Ｈ），３．７３－３．６７（ｍ，１Ｈ），２．５５－２．４１（ｍ，２Ｈ），２．３４－２．１６（ｍ，１Ｈ），１．９９－１．８３（ｍ，１Ｈ），１．６２（ｓ，１Ｈ）．

化合物３の合成：
４－（アリルオキシ）－４－オキソブチル２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－４－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）ブタノエート

市販のＦｍｏｃ－Ｄａｂ（Ｂｏｃ）－ＯＨ（１．００ｇ、２．２７ｍｍｏｌ）および化合物２（３６０ｍｇ、２．５０ｍｍｏｌ）をＣＨ_２Ｃｌ_２（７．５ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却した。ＥＤＣ－ＨＣｌ（４７９ｍｇ、２．５０ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（２８ｍｇ、０．２２７ｍｍｏｌ）を溶液に添加した。室温で１時間撹拌した後、飽和ＮａＣｌ水溶液（２５ｍｌ）を反応混合物に添加し、次いでこれを、ＣＨ２Ｃｌ２（３×５０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去して、所望生成物（１．２７ｇ、２．２４ｍｍｏｌ、９９％）を無色の樹脂として生じさせた。
Ｒ_ｆ（ｎ－ヘキサン／酢酸エチル＝１：１）＝０．６３
^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝７．８０－７．７２（ｍ，２Ｈ），７．６４－７．５６（ｍ，２Ｈ），７．４４－７．３６（ｍ，２Ｈ），７．３５－７．２８（ｍ，２Ｈ），５．９５－５．８４（ｍ，１Ｈ），５．６８－５．５７（ｍ，１Ｈ），５．３４－５．２０（ｍ，２Ｈ），５．１０－４．９８（ｍ，１Ｈ），４．６１－４．５５（ｍ，２Ｈ），４．４６－４．３２（ｍ，３Ｈ），４．２６－４．１５（ｍ，３Ｈ），３．４７－３．３０（ｍ，１Ｈ），３．０２－２．９３（ｍ，Ｊ＝５．３，５．３，８．３，１４．０Ｈｚ，１Ｈ），２．４６－２．３７（ｍ，２Ｈ），２．１２－１．９４（ｍ，３Ｈ），１．８２－１．７２（ｍ，１Ｈ），１．５１－１．３５（ｍ，９Ｈ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）：実測値５６７．３［Ｍ＋Ｈ］^＋，４６７．３［Ｍ＋Ｈ－Ｂｏｃ］^＋，計算値５６７．３［Ｍ＋Ｈ］^＋
リンカー１：の合成
４－（（２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－４－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）ブタノイル）オキシ）ブタン酸

ＣＨ_２Ｃｌ_２／酢酸エチル２：１（７５ｍｌ）中の４－（アリルオキシ）－４－オキソブチル２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－４－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）ブタノエート３（４．５ｇ、８７．９４ｍｍｏｌ）の溶液に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（２７５ｍｇ、０．２３８ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（１０４ｍｇ、０．３９５ｍｍｏｌ）および２－エチルヘキサン酸ナトリウム（１．９７ｇ、１１．９ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を、室温で３時間撹拌した。次いで、１ＭＨＣｌ（５０ｍｌ）を添加した。反応混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２（３×１５０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。ＳｉＯ_２上でのカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル＋１％メタノール）により、所望生成物１を無色固体として生じさせた。
Ｒ_ｆ（酢酸エチル）＝０．３８
^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝７．７９－７．７３（ｍ，２Ｈ），７．６４－７．５５（ｍ，２Ｈ），７．４４－７．３７（ｍ，２Ｈ），７．３５－７．２８（ｍ，２Ｈ），５．７０－５．５４（ｍ，１Ｈ），５．１８－５．０２（ｍ，１Ｈ），４．４７－４．３３（ｍ，３Ｈ），４．２８－４．１６（ｍ，３Ｈ），３．４３－３．３２（ｍ，１Ｈ），３．０４－２．９４（ｍ，１Ｈ），２．５５－２．２５（ｍ，３Ｈ），２．１５－１．９８（ｍ，３Ｈ），１．４８－１．３８（ｍ，９Ｈ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）：実測値５２７．３［Ｍ＋Ｈ］^＋，４２７．２［Ｍ＋Ｈ－Ｂｏｃ］^＋，計算値５２７．２［Ｍ＋Ｈ］^＋

実施例２：リンカー４（ｍ＝２、ｎ＝２）の合成
スキーム

化合物５の合成：
３－（ベンジルオキシ）－３－オキソプロピル２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－４－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）ブタノエート

市販のＦｍｏｃ－Ｄａｂ（Ｂｏｃ）－ＯＨ（２．５ｇ、５．６８ｍｍｏｌ）および３－ヒドロキシプロパン酸ベンジル（１．１２ｇ、６．２５ｍｍｏｌ）をＣＨ_２Ｃｌ_２（２０ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却した。この溶液に、ＥＤＣ－ＨＣｌ（１．２０ｇ、６．２５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（７０．０ｍｇ、０．５６８ｍｍｏｌ）を添加した。１時間後、飽和ＮａＣｌ水溶液（２５ｍｌ）を添加し、有機相を分離し、水性相をＣＨ_２Ｃｌ_２（３×５０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。ＳｉＯ_２上でのカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン／ＥｔＯＡｃ６：４）により、所望生成物（２．８４ｇ、４．７１ｍｍｏｌ、８３％）を無色樹脂として生じさせた。
^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ＝７．７８－７．７４（ｍ，２Ｈ），７．６５－７．５８（ｍ，２Ｈ），７．３５（ｓ，９Ｈ），５．７７－５．６６（ｍ，１Ｈ），５．１７－５．１４（ｍ，２Ｈ），５．１３－５．０４（ｍ，１Ｈ），４．５４－４．４６（ｍ，１Ｈ），４．４５－４．３０（ｍ，４Ｈ），４．２６－４．２０（ｍ，１Ｈ），３．９１－３．８７（ｍ，１Ｈ），３．４６－３．３３（ｍ，１Ｈ），２．９７－２．８８（ｍ，１Ｈ），２．７７－２．７０（ｍ，２Ｈ），２．０５－２．０３（ｍ，１Ｈ），２．０１－１．９２（ｍ，１Ｈ），１．７９－１．７０（ｍ，１Ｈ），１．４７－１．４２（ｍ，９Ｈ）．

化合物４の合成：
３－（（２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－４－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）ブタノイル）オキシ）プロパン酸

化合物４（２．８ｇ、４．６５ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（５０ｍｌ）に溶解した。パラジウム炭素（Ｐｄ／Ｃ１０％、７４２ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）を溶液に添加し、Ｈ_２を反応混合物に通して発泡させた。１時間後、反応物をＣＨ_２Ｃｌ_２で希釈し、シリカプラグでフィルタにかけた。溶媒を減圧下で除去して、所望生成物（０．６ｇ、１．１７ｍｍｏｌ、２５％）を無色固体として生じさせた。
ＭＳ（ＥＳＩ）：５１３．０［Ｍ＋Ｈ］，計算値５１３．２［Ｍ＋Ｈ］^＋．

実施例３：リンカー１を適用するペプチド合成：
配列Ｈ－ＫＡＴＳＧ－（リンカー１）－ＧＬＦ－ＮＨ_２（７）（配列番号１）を持つペプチドを、固相ペプチド合成によって合成し、分取ＨＰＬＣによって精製した。リンカー１は、ペプチド合成中、および驚いたことに、連続アミノ酸（５位のＧｌｙ）のピペリジンによるＦｍｏｃ脱保護中も、安定であった。６員ジケトピペラジンおよび対応する崩壊ペプチドへの環化は観察されなかった（図１ａ）。次いで、精製されたペプチド（図１ｂ中のＡＢ）を０．０５ＭＮａＨＣＯ_３溶液（ｐＨ＝８．２）に溶解し、これにより、分子内環化反応をトリガーして、２つのフラグメント８および９（ＡおよびＢ、図１ｂ）を放出し、ＬＣ－ＭＳによって同定した（図１ｃ）。

実施例４：疎水性ペプチドの合成：
Ｈ－ＡｈａＧＩＳＦＳＩＲＦＡＩＷＩＲＦＧ－ＮＨ_２（Ａｈａ＝アジドホモアラニン）（配列番号２）は、極めて疎水性のペプチドであり、これは、水に不溶性であり、合成後の取り扱いおよびＨＰＬＣ精製を事実上不可能にする。このペプチドの溶解度を増強するために、ペプチド配列および開裂可能なリンカー１組み込みの後に開裂可能なＮ末端ポリ－リジンタグが合成された、バリアントを調製した：Ｈ－ＫＫＫＫＫ－（リンカー１）ＡｈａＧＩＳＦＳＩＲＦＡＩＷＩＲＦＧ－ＮＨ_２（１０）（配列番号３）。この修飾ペプチドの合成および精製は、実施例３に従って順調に進んだ（図２ｂ）。純粋なペプチド１０を０．０５ＭＮａＨＣＯ_３水溶液に溶解し、室温で２時間振とうした。（図２ａ）。開裂反応は、２つのペプチド１１および１２を放出した：ポリ－リジンタグ１１は水溶性であるが、ペプチド１２は反応条件下で沈殿し、遠心分離によって高純度で簡単に単離され得る。
図２ｂ）：Ｈ－ＫＫＫＫＫ（リンカー１）－ＡｈａＧＩＳＦＳＩＲＦＡＩＷＩＲＦＧ－ＮＨ２（１０）のＬＣ－ＭＳ、ＭＳ（ＥＳＩ）：５４５．４［Ｍ＋５Ｈ］^５＋，６８１．６［Ｍ＋４Ｈ］^４＋，９０８．３［Ｍ＋３Ｈ］^３＋，１３６２．０［Ｍ＋２Ｈ］^２＋．
図２ｃ）：不溶性ペプチド１２のＭＳ（ＥＳＩ）（ＭＳ（ＥＳＩ）：６６１．５［Ｍ＋３Ｈ］^３＋，９９１．３［Ｍ＋２Ｈ］^２＋，１３２２．０［３Ｍ＋２Ｈ］^２＋，１９８３．１［Ｍ＋Ｈ］^＋）．

実施例５：ビオチン／ストレプトアビジン相互作用を介する親和性精製
各カップリングステップ後にキャッピングを適用するペプチド合成方法と組み合わせたＮ末端親和性標識の導入は、全長生成物の親和性精製を可能にする。全長ペプチドがストレプトアビジンコーティングされた磁性ビーズ上で捕捉され、副産物（より短い配列）がフィルタにかけることによって除去され、純粋な全長ペプチドが放出される。

標的ペプチドのＳＰＰＳ後、最初にリンカー１、次いでＦｍｏｃ－Ｇｌｕ（ビオチニル－ＰＥＧ）－ＯＨを、ペプチドのＮ末端とカップリングした。これは、Ｈ－ＧｌｕビオチニルＰＥＧ－１－ＩＩＫＫＳＴＡＬＬ－ＮＨ_２（１３）（配列番号４）をもたらした。ペプチド配列は、いくつかの立体的にかさ高いアミノ酸を含有するため、樹脂からの開裂後に、全長ペプチドおよびアセチル化されたより短いフラグメントの複雑な混合物が得られた。粗生成物をｐＨ＝６．２のリン酸緩衝液に溶解し、ストレプトアビジンコーティングされた磁性ビーズとともに３０分間インキュベートした。上清をＬＣ－ＭＳによって分析すると、混合物からのビオチン化ペプチドの完全な除去を指し示した。副産物含有緩衝溶液を除去し、ビーズをリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．２）で数回洗浄した。その後、揮発性開裂緩衝液（ＮＨ_４ＨＣＯ_３、０．０２Ｍ、ｐＨ＝８．８）をビーズに添加し、３０分間のインキュベーション後、所望のペプチド１４がビーズから放出された。
スキーム５

結果を図３に示す。図３ａは、ＳＰＰＳおよび樹脂からの開裂後に得られた粗ペプチド混合物を示す。図３ｂは、ｐＨ＝６．２のリン酸緩衝液中のストレプトアビジンコーティングされた磁性ビーズ上での粗ペプチド混合物の３０分間のインキュベーション後の上清を示す。Ｎ末端でビオチンタグ含有ペプチド１３は、ストレプトアビジンによって完全に捕捉される。ｃ）アセチル化されたペプチド副産物を洗い流し、磁性ストレプトアビジンビーズをｐＨ８．８のＮＨ_４ＨＣＯ_３とともに３０分間インキュベートした後、所望のペプチドＨＯ（ＣＨ_２）_３ＣＯ－ＩＩＫＫＳＴＡＬＬ－ＮＨ_２（１４）（配列番号４）を放出する

実施例６：ペプチド上で開裂可能な可溶化タグを用いるＤＮＡ－ペプチドコンジュゲートの合成
スキーム６

配列Ｈ－ＰＥＧ１０（リンカー１）ＡｈａＡＦＤＹＬＡＱＹＨＧＧ－ＮＨ_２（１５）（配列番号５）を持つペプチドを、ＳＰＰＳ（Ａｈａ＝アジドホモアラニン）によって合成した。ヘキシニル修飾核酸とのコンジュゲーションを、クリックケミストリーによって実施した。アジド修飾ペプチド１５の溶液（ＤＭＳＯ／ｔＢｕＯＨ３：１中４ｍＭ、５０μｌ）を、標準的な固相ホスホルアミダイトアプローチに従って合成した５’－ヘキシニル－ｄＴ_２０－３’の溶液（Ｈ２Ｏ中０．５５ｍＭ、１８０μｌ）と混合した。ＣｕＢｒ（ＤＭＳＯ／ｔＢｕＯＨ３：１中１００ｍＭ、１０μｌ）およびＴＨＰＴＡ（Ｈ_２Ｏ中１００ｍＭ、２０μｌ）を別個に混合し、あらかじめ形成された複合体をオリゴヌクレオチド－ペプチド溶液に添加した。３７℃で１時間振とうした後、クリック反応は完了した。可溶化ＰＥＧリンカーの開裂は、ＮａＨＣＯ_３（Ｈ_２Ｏ中０．１Ｍ、３ｍｌ）を添加して得られた。この溶液の透析（ＭＷＣＯ１０００透析膜）により、所望生成物１６が生じた。
５’－ヘキサ－Ｔ_２０－３’：ＭＳ（ＥＳＩ）：実測値１５４４．３［Ｍ－４Ｈ］^４－，計算値１５４４．５［Ｍ－４Ｈ］^４－．
ペプチドＸ－５’－ヘキサ－Ｔ_２０－３’：ＭＳ（ＥＳＩ）：実測値１６４７．７［Ｍ－５Ｈ］^５－，計算値１６４８．０［Ｍ－５Ｈ］^５－．
生成物１６：ペプチドＸ－５’－ヘキサ－Ｔ_２０－３’（脱ペグ化）：ＭＳ（ＥＳＩ）：実測値１５２５．６［Ｍ－５Ｈ］^－５，計算値１５２５．９［Ｍ－５Ｈ］^－５．

実施例７：開裂可能な固定リンカーを使用する、固体支持コンジュゲーションおよび非クロマトグラフ的精製によるペプチドおよびヌクレオシド－ペプチドコンジュゲートの迅速合成
この実施例で開示される反応スキームは、図４に例証され、２つの代替経路ＡおよびＢを含む。

ペプチドＷＷＷＷＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＥＥＥＥ（配列番号６）は、自動Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳを使用してリンクアミド樹脂上で合成した。次に、Ｆｍｏｃ－Ｐｒａ－ＯＨ（Ｎ－アルファ－（９－フルオレニルメチルオキシカルボニル）－Ｌ－プロパルギルグリシン）、Ｆｍｏｃ保護開裂可能なリンカー１、Ｆｍｏｃ－Ｏ２Ｏｃ－ＯＨ（８－（９－フルオレニルメチルオキシカルボニル－アミノ）－３，６－ジオキサオクタン酸）およびＴｒｉ－Ｂｏｃ－ヒドラジン酢酸を、ＳＰＰＳを活用して樹脂結合ペプチドと段階的にカップリングして、所望のペプチド１７を産出した。

ＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ_２Ｏ（９５／２．５／２．５）の混合物を用いて、ペプチドを樹脂から開裂した。２時間後、溶液を濃縮し、冷エーテルの溶液に添加した。沈殿したペプチドを上清から分離し、Ｈ_２Ｏ／ＡＣＮ（１／１）の混合物に溶解し、フリーズドライした。粗材料を、０．２５ＭＮａＯＡｃ水溶液／ＡｃＯＨ緩衝液（ｐＨ４．２）およびアセトニトリル（２０体積％）の混合物に溶解した。シアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、溶液をアルデヒドアガロース樹脂上に移した。懸濁液を室温でかき混ぜ、固定反応の進行をＨＰＬＣによってモニターした（図５Ａ、Ｂを参照）。固定（約１時間）後、樹脂を、０．２５ＭＮａＯＡｃ水溶液／ＡｃＯＨ緩衝液（ｐＨ４．２）、Ｈ_２Ｏ／ＡＣＮ（２／１）および水の混合物で洗浄した。樹脂結合プロパルギルグリシン含有ペプチド１８を、アジド修飾チミジン六リン酸（Ｆｕｌｌｅｒｅｔａｌ．ＰＮＡＳ２０１６，１１３（１９），ｐ．５２３３－４２３８）と、ＣｕＳＯ_４，ＴＨＰＴＡ、アスコルビン酸およびアミノグアニジンの存在下、２０体積％ＤＭＳＯを含有する０．２ＭＮａＨ_２ＰＯ_４緩衝液水溶液（ｐＨ６．５）の混合物中で反応させた（図４、経路Ａを参照）。懸濁液を３７℃で１６時間かき混ぜた。樹脂を、０．２ＭＮａＨＰＯ４緩衝液水溶液（ｐＨ６．５）およびＨ_２Ｏ／ＡＣＮ（２／１）の混合物で洗浄した。所望のヌクレオシド－ペプチドコンジュゲート２０は、樹脂の、０．２ＭＮａ_２ＨＰＯ_４緩衝液水溶液（ｐＨ８．５）による、室温で１６時間にわたる処理によって、高純度で放出された。
（ＨＯ（ＣＨ_２）_３ＣＯＮＨ－Ｐｒａ（Ｎ_３（ＣＨ_２）_１１Ｏ（ＰＯ_２）_６ｄＴ）
ＷＷＷＷＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＥＥＥＥ－ＮＨ_２：
ＭＳ（ＥＳＩ）：実測値１１０１．３［Ｍ－６Ｈ］^６－，計算値１１０１．２［Ｍ－６Ｈ］^６－；実測値９４４．０［Ｍ－７Ｈ］^７－，計算値９４３．８［Ｍ－７Ｈ］^７－．
代替として、樹脂結合ペプチド１８を、ヌクレオシド－コンジュゲーションステップの前であっても、弱塩基性条件（０．２ＭＮａ_２ＨＰＯ_４緩衝液、ｐＨ８．５、室温、１６時間）下、アガロース樹脂から放出することもできる（図４、経路Ｂを参照）。これらの条件下、未修飾ペプチド１９

ＨＯ（ＣＨ_２）_３ＣＯＮＨ－Ｐｒａ
ＷＷＷＷＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＡＡＡＥＥＥＥＥ－ＮＨ２が高純度で単離された。

生成物発生をＨＰＬＣ分析によってモニターした。図５は、粗ＳＰＰＳ生成物のＨＰＬＣ分析（５Ａ）、固定後の上清（５Ｂ）、経路Ｂに従って生成された精製ペプチド１９（５Ｄ）およびヌクレオシド－ペプチドコンジュゲート２０（５Ｃ）を示す。

Claims

構造

［式中、２≦ｎ≦２４、ｍ＝２または３であり、
Ａは保護基Ｂｏｃであり、
Ｂは保護基Ｆｍｏｃである］を含む、ビルディングブロック。
構造

［式中、
２≦ｎ≦２４、ｍ＝２または３であり、
Ｘは、ペプチド、または固体支持体であり、
Ｙは、ペプチド、およびタグからなる群から選択され、
ここで、前記ペプチドは、２から１２０残基の長さを持つアミド結合を介して連結しているアミノ酸の鎖であり、
前記タグはＮ－ポリ－リジン、ビオチン、ＰＥＧ、またはヒドラジンである］を含む、化合物。
開裂可能なリンカーを化学的に合成されたペプチドに導入する方法であって、
ａ）固体支持体上でペプチドを合成するステップであって、前記ペプチドが末端アミノ基を含むステップと、
ｂ）請求項１記載のビルディングブロックを提供するステップと、
ｃ）前記ビルディングブロックを前記ペプチドとカップリングするステップとを含む、方法。
さらに、
ｄ）保護基Ｂを除去するステップと、
ｅ）少なくとも１つのアミノ酸ビルディングブロックを末端アミノ基とカップリングするステップとを含む、請求項３に記載の方法。
さらに、
ｄ）保護基Ｂを除去するステップと、
ｅ）場合により少なくとも１つのアミノ酸ビルディングブロックを末端アミノ基とカップリングするステップと、
ｆ）タグを末端アミノ基とカップリングするステップとを含み、前記タグはＮ－ポリ－リジン、ビオチン、ＰＥＧ、またはヒドラジンである、請求項３に記載の方法。
さらに、
ｇ）ｐＨ≦６で保護基Ａを除去し、それにより、前記ペプチド上に存在する他の保護基も除去するステップと、固体支持体から前記ペプチドを開裂するステップとを含む、請求項３～５のいずれか一項に記載の方法。
さらに、
ｄ）生成されたペプチドをｐＨ≧８で開裂するステップを含む、請求項６に記載の方法。
前記タグが、可溶化タグであり、さらに、
ｇ）ｐＨ≦６で保護基Ａを除去し、それにより、前記ペプチド上に存在する他の保護基も除去するステップと、固体支持体から前記ペプチドを開裂するステップと、
ｈ）前記ペプチドを精製するステップと、
ｉ）前記可溶化タグをｐＨ≧８で切断するステップとを含む、請求項５に記載の方法。
前記タグが、固定化タグであり、さらに、
ｇ）ｐＨ≦６で保護基Ａを除去し、それにより、前記ペプチド上に存在する他の保護基も除去するステップと、固体支持体から前記ペプチドを開裂するステップと、
ｈ）固体支持体上の前記固定化タグを介して前記ペプチドを固定するステップと、
ｉ）場合により前記ペプチドを追加の化学成分とコンジュゲートするステップと、
ｊ）前記固定化タグをｐＨ≧８で切断するステップとを含む、請求項５に記載の方法。
前記化学成分が、核酸、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオチドである、請求項９に記載の方法。
前記化学成分がヌクレオシド－六リン酸である、請求項９に記載の方法。