CN112566895A

CN112566895A - 用于肽合成的可切割接头

Info

Publication number: CN112566895A
Application number: CN201980053578.4A
Authority: CN
Inventors: F·贝格曼; S·F·洛伊布尔; S·J·庞普伦
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2018-08-09
Filing date: 2019-08-07
Publication date: 2021-03-26
Anticipated expiration: 2039-08-07
Also published as: EP3833655A1; US20230159584A1; JP2021534107A; WO2020030663A1; AU2019319032A1; US20210155654A1; CN112566895B; US11548911B2; JP7377257B2; CA3108931A1; CA3108931C; AU2019319032B2

Abstract

本发明提供了一种用于肽合成的新型结构单元，其引入切割位点，该切割位点可用于在肽序列之后生成可切割片段。

Description

用于肽合成的可切割接头

技术领域

本发明涉及肽合成的技术领域。更精确地，本发明提供了将可切割接头引入化学合成的肽中，从而产生新的肽缀合物的新可能性。

背景技术

可切割接头，其定义为通过可切割键连接两个官能团的化学部分，是固相合成(SPS)和化学生物学中的重要工具。尤其在固相肽合成(SPPS)中，这些接头可以帮助解决有关肽的理化性质，处理和纯化的问题：通过可切割接头，肽可以用功能标签(例如，溶解度增强部分)修饰，并且在对接头切割后，释放所需肽，其带有或不带有接头的残基。可切割接头广泛用于有机合成和固相合成中(参见例如，Leriche等人，Bioorg.Med.Chem.2012，20，571-582；Scott等人，Eur.J.Org.Chem.2006，2251-2268)。切割可以通过化学(亲核试剂、碱性试剂、亲电试剂、酸性试剂、还原剂、氧化剂、有机金属和金属催化剂)、通过光化学或酶促手段进行。在肽合成中，可切割接头主要用于将新生肽与树脂连接，其可在固相肽合成完成后被切割掉(参见例如，Novabiochem Peptide Synthesis Catalogue，Merck；Jensen等人(编辑)，Peptide Synthesis and Application，Methods in Molecular Biology，Vol.1047，Springer Protocols，Humana Press，Springer，New York，2013)。

为了内部掺入肽序列中，还描述了可切割接头结构单元。用于肽合成的基于α，γ-二氨基-β-羟丁酸的接头结构单元和基于γ-氨基-α，β-二羟基丁酸的接头结构单元已由Amore等人，ChemBioChem 2013，14，123-131进行了描述。这些接头可通过氧化手段，即使用高碘酸钠进行切割。不利的可能是肽内的氧化敏感组分(如半胱氨酸或蛋氨酸残基)的氧化。

已经由Kim等人，Synlett 2013，24，733-736描述的肽合成的可光切割接头结构单元是另一个实例。光致辐照的缺点可能是不完全的接头切割和自由基反应引起的副反应。基于[2-(氨基甲基)苯基]乙酸的醇的可环状切割接头已经由Xiao等人，J.Comb.Chem.1999，1，379-382描述。此接头仅通过使用固体支持物而应用于醇的合成和释放。尚未描述可用于在肽合成中内部掺入的衍生物。已经使用不同的化学反应和切割条件描述了应用可切割增溶标签的肽合成(参见例如：Jacobsen等人，JACS 2016，138，11777-11782；WO 2016047794)。

已经使用不同的化学反应和切割条件描述了应用可切割纯化标签的肽合成(参见例如：Funakoshi等人，Proceedings of the National Academy of Sciences 1991，88，6981-6985；Funakoshi等人，J.Chromatogr.1993，638，21-27；Canne等人，TetrahedronLetters 1997，38，3361-3364；Vizzavona等人，Tetrahedron Letters 2002，43，8693-8696；Hara等人，Joumal of Peptide Science，2009，15，369-376；Aucagne等人，Angewandte Chemie International Edition 2012，51，11320-11324；Reimann等人，Angewandte Chemie International Edition 2015，54，306-310；Hara等人，JournalofPeptide Science，2016，15，379-382；Patents：Aucagne等人，WO2011058188，Zitterbart等人，WO 2017129818 A1)。在这种方法中，接头通常在SPPS的最后一个循环中附接至正在生长的肽链的N末端，从而能够将所需全长肽选择性固定化在固体支持物上。通过洗涤固体支持物去除副产物，并最终通过切割接头释放靶肽。用于肽的非色谱纯化的可切割接头通常需要强碱性条件。在这些条件下，可能发生不希望的副反应，例如，外消旋化。经常使用的磺酸根消除接头的主要问题是在切割反应期间生成的高反应性亲电试剂。这些中间体与亲核侧链基团(例如，精氨酸，半胱氨酸)迅速反应，并因此限制了基于磺酸根的可切割接头的应用。来自Vizzavona等人(Tetrahedron Letters 2002，43，8693-8696)的可氧化切割纯化接头的罕见实例规避了上述问题，但是很可能与含有蛋氨酸或半胱氨酸的肽不相容。

异酰基二肽是在Fmoc SPPS中用于增强合成效率的工具(Y.Sohma等人，Chem.Commun.2004，124-125)。异酰基二肽由Boc保护的丝氨酸或苏氨酸衍生物组成，其中β-羟基基团被Fmoc保护的氨基酸酰化。在肽序列中掺入异酰基二肽结构单元后，该肽的二级结构被改变，从而能够更有效地合成。此外，在切割和脱保护之后，可以通过HPLC纯化肽的异酰基形式。在pH 7.4，O→N分子内酰基发生迁移，生成规则的酰胺连接的肽。应用这些异酰基二肽结构单元时，不能进行切割反应。

肽-寡核苷酸缀合物是用于治疗和诊断应用的新兴类别。然而，这些缀合物的合成仍然是主要挑战(参见以下的评论：N.Venkatesan等人，Chemical Reviews 2006，106，3712-3761和K.Lu等人，Bioconjugate Chemistry 2010，21，187-202)。直接的方法是借助于基于固相的合成将所需肽-寡核苷酸缀合物组装在聚合支持物上。不幸地，固相寡核苷酸和肽合成的既定方法并不完全相容。肽的固相合成需要使用强酸，并且从而由于寡核苷酸在酸性条件下的不稳定性而阻止了肽-寡核苷酸缀合物的合成。这就是为什么肽-寡核苷酸缀合物的分步合成通常通过以下步骤进行的原因：在同一固体支持物上首先组装肽，随后进行寡核苷酸合成。虽然这个策略已成功地应用于较简单的肽-寡核苷酸缀合物的合成，但所述方法仍然缺乏可相容的保护基团的全谱来解决氨基酸侧链的挑战性化学反应。最终，还没有用于肽-寡核苷酸缀合物的分步基于固相的合成的可靠且一般应用方法。因此，肽-寡核苷酸缀合物的合成通常采用收敛策略进行。在此，肽和寡核苷酸片段是分别通过使用常规的结构单元和固相合成流程合成的。纯化后，将两个片段缀合，并在附加的纯化步骤后分离出所需肽-寡核苷酸缀合物。低总产率、增加的时间花费和高成本是该策略的主要缺点，这是由上述许多纯化步骤和中间体冻干程序造成的。此外，基于HPLC的纯化步骤和中间体冻干阻碍了借助于自动化实现肽-寡核苷酸缀合物的高通量合成的可能性。如果需要合成大量的肽-寡核苷酸缀合物，则这些缺点变得特别麻烦，例如，合成大量的肽-寡核苷酸缀合物是在已知的反义寡核苷酸上筛选合适的转染肽所需要的。一种理想的方法是将已建立的固相合成的简便性和合成后的缀合结合起来，而无需任何基于HPLC的纯化。

然而，所有以上公开的用于将可切割接头应用于肽合成的方法都具有几个缺点，像掺入或切割效率低、苛刻的破坏性切割条件、复杂的试剂合成或使用受限。

发明内容

因此，本发明提供了一种包含如下结构的结构单元：

其中2≤n≤24，m＝2或3，并且A和B为保护基。通常，A和B是在不同条件下切割的正交保护基。在一个实施例中，A为酸不稳定保护基，并且

B为标签或碱不稳定保护基。在一个特定实施例中，A为Boc和/或B为Fmoc。

在第二方面，本发明提供了一种包含如下结构的化合物：

其中2≤n≤24，m＝2或3，X为肽或固体支持物，Y选自由以下各项组成的组：肽、官能团、标签和含有官能团或标签的肽。

在一个实施例中，Y为溶解度增强标签、固定化标签或固相。例如，Y可以选自由以下各项组成的组：PEG、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚谷氨酸和聚天冬氨酸。Y还可以选自由以下各项组成的组：生物素、肼、氨氧基、叠氮化物、炔基、烯基、醛、酮、吡咯丙氨酸、羧基和硫醇。

在第三方面，本发明提供一种方法，其包括以下步骤：

在固体支持物上合成肽，所述肽包括末端氨基基团，

提供如上公开的结构单元，以及

将所述结构单元与所述肽偶联

所述方法可以进一步包括以下步骤：

去除保护基B，以及

将至少一个氨基酸结构单元与末端氨基基团偶联

替代地，所述方法可以进一步包括以下步骤：

去除保护基B，

任选地将至少一个氨基酸结构单元与所述末端氨基基团偶联，以及

将标签或官能团与末端氨基基团偶联

所述官能团或标签可选自由以下各项组成的组：PEG、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、生物素、肼、氨氧基、叠氮化物、炔基、烯基、醛、吡咯丙氨酸、羧基和硫醇。

另外，以上公开的方法可进一步包括以下步骤：

在pH≤6去除保护基A，从而也去除存在于所述肽上的其他保护基并从所述固体支持物上切割所述肽，这可以在pH≥8发生。

在一个实施例中，本发明提供一种方法，其包括以下步骤：

a)在固体支持物上合成肽，所述肽包括末端氨基基团，

b)提供如上公开的结构单元，以及

c)将所述结构单元与所述肽偶联

d)去除保护基B，

e)任选地将至少一个氨基酸结构单元与所述末端氨基基团偶联，以及

f)将增溶标签或固定化标签与末端氨基基团偶联，

并进一步包括以下步骤

g)在pH≤6去除保护基A，从而也去除存在于所述肽上的其他保护基并从所述固体支持物上切割所述肽

h)纯化所述肽，并且

i)在pH≥8切割掉所述增溶标签，或

h)经由所述固定化标签将所述肽固定化在固体支持物上

i)任选地将所述肽缀合至附加的化学实体，和

j)在pH≥8切割掉所述固定化标签。

所述化学实体可以是碳水化合物、蛋白质、肽、染料、半抗原等。特别地，所述化学实体可以是含有核酸、寡核苷酸或核苷酸的化合物，优选为核苷-六磷酸。

附图说明

图1

包括引入根据实例3的接头1的肽合成

a)肽合成

b)在0.05M NaHCO₃溶液(pH＝8.2)中溶解，触发环化

c)LC-MS显示随着时间，肽AB切割为A和B

图2

根据实例4的疏水肽的合成

a)从不溶性肽12切割聚赖氨酸标签

b)H-KKKKK1AhaGISFSIRFAIWIRFG-NH2(10)的LC-MS

c)不溶性肽12的MS(ESI)

图3

根据实例5的亲和纯化

a)SPPS和从树脂上切割后的粗肽混合物

b)30分钟后的上清液

c)与0.02M NH₄HCO₃(pH=8.8)孵育30分钟后的上清液

图4

方案：根据实例7的核苷-肽缀合物的快速合成

a)通过固体支持的缀合和非色谱纯化合成肽和核苷-肽缀合物

图5

实例7中获得的缀合物的HPLC分析

具体实施方式

定义和缩写列表：

Fmoc：芴基甲氧基羰基

BOC：叔丁氧羰基

SPPS：固相肽合成

SPS：固相合成

TFA：三氟乙酸

DBU：1，8-二-氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯

DMF：N，N-二甲基甲酰胺

DAB：二氨基丁酸

EDC：N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺

DMAP：N，N-二甲基吡啶-4-胺

HATU：1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸盐

DIPEA：N，N-二异丙基乙胺

THPTA：三(3-羟基丙基三唑基甲基)胺

Pra：炔丙基甘氨酸

Aha：叠氮高丙氨酸

TIS：三异丙基硅烷

定义：

标签：在本发明的上下文中，标签是改变分子的化学或物理性质和/或使分子可识别的化学部分。例如，纯化标签可以促进分子的纯化。标签可以是固定化标签，即可以附接至固体支持物的化学部分。标签还可以是溶解度增强标签，其意指化学基团，如果其存在，会增加某一分子的溶解度。

官能团：官能团是分子内原子或键的特定化学基团(部分)，其负责那些分子的特征性化学反应。官能团是分子内特定取代基或部分，其负责那些分子的特征性化学反应。相同的官能团将经历相同或相似的化学反应，而不管其所属分子的大小如何。这允许系统地预测化学反应和化合物的行为以及化学合成的设计。此外，可以通过邻近的其他官能团来修饰官能团的反应性。在有机合成中，官能团的相互转化是转化的基本类型之一。官能团是具有不同化学性质的一个或多个原子的基团，无论它们附接至什么。官能团的原子通过共价键相互连接并且与分子的其余部分连接。对于聚合物的重复单元，官能团附接至其碳原子的非极性核，并且因此在碳链上增加了化学特性。官能团也可以是带电荷的。

保护基团：

如本文所用，术语“保护基”或其同义词“保护基团”表示选择性阻断多功能化合物中的反应位点以便在合成化学中通常与之相关的另一未保护的反应位点上选择性发生化学反应的基团。保护基团可以在适当的时间点被去除。保护基团是氨基保护基团、羧基保护基团或羟基保护基团。通过官能团的化学修饰将保护基团或保护基或阻断基引入分子中，以在随后的化学反应中获得化学选择性。引入保护基团以阻断或至少降低官能团的反应性。脱保护是去除保护基团的化学步骤。肽合成领域中的相关保护基是碱不稳定保护基团和酸不稳定保护基团。在7.5至12之间的pH，但优选在8.0至10之间的pH，碱不稳定保护基团被切割掉。在6.5至3之间的pH，但优选在6.0至5之间的pH，酸不稳定保护基被切割掉。对于本发明，氨基保护基团是特别重要的。氨基保护基团是旨在保护氨基基团的基团，并且包括苄基、苄氧基羰基(羰基苄氧基，CBZ)、Fmoc(9-芴基甲氧羰基)、对甲氧基苄氧基羰基、对硝基苄氧基羰基、叔丁氧基羰基(BOC)和三氟乙酰基。这些基团的实例可以见于T.W.Greene和P.G.M.Wuts，“Protective Groups in Organic Synthesis”，第2版，John Wiley&Sons，Inc.，New York，N.Y.，1991，第5章；E.Haslam，“Protective Groups in OrganicChemistry”，J.G.W.McOmie，编辑，Plenum Press，New York，N.Y.，1973，第5章，和T.W.Greene，“Protective Groups in Organic Synthesis”，John Wiley and Sons，NewYork，NY，1981，第5章。

肽：肽是通过酰胺键连接的氨基酸结构单元的链，其长度为2至120个残基。

已经开发了用于肽合成的新型可切割接头。切割在弱碱性条件下发生。接头基于4-氨基丁酸酯核心，其在pH≥8经历分子内内酰胺化，通过释放N末端醇和C末端内酰胺两个片段来切割酯键(方案1a)。作为N_α-Fmoc-Nγ-Boc-保护的结构单元(方案1b)，该氨基丁酸酯可切割接头可用于固相肽合成中。事实证明，氨基丁酸酯接头1在常规肽合成期间是稳定的，并且令人惊讶地在连续氨基酸的Fmoc脱保护期间，没有观察到环化成6元二酮哌嗪和相应的分解肽。

方案1

a)接头的环状切割(n＞1)。

b)受保护的可切割接头的通式(n＞1)。

在固相肽合成期间，N_γ-Boc保护的氨基基团不反应，并且氨基丁酸酯接头保持完整。在酸性条件下的从固体支持物上肽的切割和保护基团的脱保护导致氨基丁酸酯接头的N_γ-Boc保护基团的去除。由于氨基基团在酸性切割和脱保护条件下被质子化，因此内酰胺化反应被完全抑制，并且氨基丁酸酯接头保持完整。因此，还可以在酸性条件下(即，水/乙腈/三氟乙酸洗脱液)纯化含有完整氨基丁酸酯接头的肽。在弱碱性条件下，氨基丁酸酯接头的切割借助于分子内环化反应进行，释放出两种肽，一种为N醇，并且另一种为C末端内酰胺。方案2中显示了一般概念，其显示了具有氨基丁酸酯接头(n＞1)的固相肽合成以及最终的切割并释放了两个肽片段。

方案2

已经发现，n＝1的可切割接头是不合适的，因为在固相肽合成期间发生了副反应(即，酯切割)。然而，n＝2和n＝3的可切割接头与固相肽合成相容，并产生了所需含接头的肽，其可在弱碱性条件下切割。因此，上述结构单元可用于向肽的N末端加入各种官能团，其可在随后的工艺步骤中去除。

加入可切割官能团的一种应用是将亲水性标签引至疏水性肽的N末端上，以便能够纯化(即，通过HPLC)这种疏水肽。纯化后，可在弱碱性条件下切割掉增溶标签，以便释放纯化的疏水靶肽。

该方法还可用于寡核苷酸-肽缀合物的改进的合成。如果该肽含有许多疏水残基，则这是特别感兴趣的。例如，首先可以合成疏水肽，其含有用于附接寡核苷酸例如叠氮高丙氨酸的缀合位点。然后将可切割氨基丁酸酯接头偶联，随后引入增溶标签序列。切割和脱保护后，可以通过HPLC纯化肽，并且最后将其缀合至用缀合位点官能化的寡核苷酸。例如，所述缀合位点可以是炔基基团。此后，可以纯化缀合物，并可以在弱碱性条件下切割掉增溶标签。

另一个应用是引入纯化标签，其可以在肽的N末端引入。生物素是这种纯化标签的突出实例。首先，在每次偶联后，经由包括封端步骤的SPPS合成肽。之后，将可切割接头偶联至肽的N-末端，并且最后将生物素偶联至可切割接头上。在酸性条件下切割和脱保护后，生物素标记的肽可以与链霉亲和素包被的珠粒结合，所述珠粒优选为磁珠。SPPS的非生物素化副产物(即，失效序列，缺失)可以通过洗涤去除。此后，可以通过在弱碱性处理下切割接头，从链霉亲和素珠粒中释放出纯化的肽。

用于收敛合成肽-寡核苷酸缀合物的现代方法需要多个纯化步骤。因此，众多肽-寡核苷酸缀合物的筛选是一项费时且费成本的工作。本发明的方法能够快速合成肽-(寡)核苷酸缀合物。使用本发明的可切割接头结构单元的本发明方法通过化学选择性的反应性单元和可切割纯化标签的组合并允许温和切割目的分子而避免了对冗长的HPLC纯化步骤的需要。这种非色谱纯化方法能够以良好的产率和纯度并行合成许多缀合物。

如在实例中将显示的，本发明的可切割接头易于合成，允许有效掺入肽中并在弱碱性、非破坏性条件下温和切割。

实例

实例1：接头1的合成(m＝2；n＝3)

方案3

化合物2的合成：

4-羟基丁酸烯丙酯

向γ-丁内酯(5.00g，58.1mmol)在DMF(17ml)中的溶液中加入H₂O(13.6g，13.6ml，755mmol)和DBU(8.85g，8.67ml，58.1mmol)。在r.t搅拌1小时后，将烯丙基溴(10.5g，7.53ml，87.2mmol)加入溶液。在1小时后，通过加入sat.aq.NH₄Cl溶液(30ml)猝灭反应，并且将水相用乙酸乙酯(3x 100ml)提取。合并的有机层经Na₂SO₄干燥，并在减压下去除溶剂。经SiO₂柱色谱(正己烷/乙酸乙酯＝1∶1)得到呈无色油状的所需产物(5.90g，40.9mmol，71％)。

R_f(正己烷/乙酸乙酯＝1∶1)＝0.33(KMnO₄)

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)：δ＝6.06-5.86(m，1H)，5.42-5.04(m，2H)，4.59(td，J＝1.4，5.7Hz，1H)，4.35(t，J＝7.0Hz，1H)，4.25-4.06(m，1H)，3.73-3.67(m，1H)，2.55-2.41(m，2H)，2.34-2.16(m，1H)，1.99-1.83(m，1H)，1.62(s，1H)。

化合物3的合成：

2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁酸4-(烯丙氧基)-4-氧代丁酯

将可商购的Fmoc-Dab(Boc)-OH(1.00g，2.27mmol)和化合物2(360mg，2.50mmol)溶解于CH₂Cl₂(7.5ml)中，并且冷却至0℃。将EDC-HCl(479mg，2.50mmol)和DMAP(28mg，0.227mmol)加入溶液。在r.t搅拌1小时后，将sat.aq.NaCl溶液(25ml)加入反应混合物，然后将其用CH2Cl2(3x 50ml)提取。将合并的有机层经Na₂SO₄干燥，并且将溶剂减压去除，得到呈无色树脂状的所需产物(1.27g，2.24mmol，99％)。

Rf(正己烷/乙酸乙酯＝1∶1)＝0.63

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)：δ＝7.80-7.72(m，2H)，7.64-7.56(m，2H)，7.44-7.36(m，2H)，7.35-7.28(m，2H)，5.95-5.84(m，1H)，5.68-5.57(m，1H)，5.34-5.20(m，2H)，5.10-4.98(m，1H)，4.61-4.55(m，2H)，4.46-4.32(m，3H)，4.26-4.15(m，3H)，3.47-3.30(m，1H)，3.02-2.93(m，J＝5.3，5.3，8.3，14.0Hz，1H)，2.46-2.37(m，2H)，2.12-1.94(m，3H)，1.82-1.72(m，1H)，1.51-1.35(m，9H)。

MS(ESI)：发现的567.3[M+H]⁺，467.3[M+H-Boc]⁺，经计算的567.3[M+H]⁺接头1的合成：

4-((2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁酰基)氧基)丁酸

向2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁酸4-(烯丙氧基)-4-氧代丁基酯3(4.5g，87.94mmol)在CH₂Cl₂/乙酸乙酯2∶1(75ml)中的溶液中加入四(三苯基膦)钯(0)(275mg，0.238mmol)、三苯基膦(104mg，0.395mmol)和2-乙基己酸钠(1.97g，11.9mmol)。在r.t，将反应物搅拌3小时。然后加入1M HCl(50ml)。将反应混合物用CH₂Cl₂(3x 150ml)提取。合并的有机层经Na₂SO₄干燥，并在减压下去除溶剂。经SiO₂柱色谱(乙酸乙酯+1％甲醇)得到呈无色固体状的所需产物1。

Rf(乙酸乙酯)＝0.38

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)：δ＝7.79-7.73(m，2H)，7.64-7.55(m，2H)，7.44-7.37(m，2H)，7.35-7.28(m，2H)，5.70-5.54(m，1H)，5.18-5.02(m，1H)，4.47-4.33(m，3H)，4.28-4.16(m，3H)，3.43-3.32(m，1H)，3.04-2.94(m，1H)，2.55-2.25(m，3H)，2.15-1.98(m，3H)，1.48-1.38(m，9H)。

MS(ESI)：发现的527.3[M+H]⁺，427.2[M+H-Boc]⁺，经计算的527.2[M+H]⁺

实例2：接头4的合成(m＝2；n＝2)

方案

化合物5的合成：

2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁酸3-(苄氧基)-3-氧代丙酯

将可商购的Fmoc-Dab(Boc)-OH(2.5g，5.68mmol)和3-羟基丙酸苄酯(1.12g，6.25mmol)溶解于CH2Cl₂(20ml)中，并且冷却至0℃。向此溶液加入EDC-HCl(1.20g，6.25mmol)和DMAP(70.0mg，0.568mmol)。在1小时后，加入sat.aq.NaCl溶液(25ml)，分离有机相，并且将水相用CH₂Cl₂(3x 50ml)提取。合并的有机层经Na₂SO₄干燥，并在减压下去除溶剂。经SiO₂柱色谱(正己烷/EtOAc 6∶4)得到呈无色树脂状的所需产物(2.84g，4.71mmol，83％)。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ＝7.78-7.74(m，2H)，7.65-7.58(m，2H)，7.35(s，9H)，5.77-5.66(m，1H)，5.17-5.14(m，2H)，5.13-5.04(m，1H)，4.54-4.46(m，1H)，4.45-4.30(m，4H)，4.26-4.20(m，1H)，3.91-3.87(m，1H)，3.46-3.33(m，1H)，2.97-2.88(m，1H)，2.77-2.70(m，2H)，2.05-2.03(m，1H)，2.01-1.92(m，1H)，1.79-1.70(m，1H)，1.47-1.42(m，9H)。

化合物4的合成：

3-((2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁酰基)氧基)丙酸

将化合物4(2.8g，4.65mmol)溶解于MeOH(50ml)。将碳载钯(Pd/C 10％，742mg，0.69mmol)加入溶液，并且将H2鼓泡到反应混合物中。在1小时后，将反应用CH₂Cl₂稀释，并且通过硅胶塞过滤。将溶剂减压去除，得到呈无色固体状的所需产物(0.6g，1.17mmol，25％)。

MS(ESI)：513.0[M+H]，经计算的513.2[M+H]⁺。

实例3：应用接头1的肽合成

通过固相肽合成来合成具有序列H-KATSG-(接头1)-GLF-NH₂(7)(SEQ.ID.No：1)的肽，并通过制备型HPLC纯化。接头1在肽合成期间是稳定的，并且令人惊讶地在连续氨基酸(位置5的Gly)的哌啶的Fmoc脱保护期间也是稳定的。未观察到环化成6元二酮哌嗪和相应的分解肽(图1a)。然后将纯化的肽(图1b中的AB)溶解于0.05M NaHCO₃溶液(pH＝8.2)中，其触发分子内环化反应，释放出两个片段8和9(图1b中的A和B)，通过LC-MS鉴定(图1c)。

实例4：疏水肽的合成：

H-AhaGISFSIRFAIWIRFG-NH₂(Aha＝叠氮高丙氨酸)(SEQ.ID.NO：2)是一种极疏水肽，其不溶于水中，合成后几乎不可能进行处理和HPLC纯化。为了提高这种肽的溶解度，制备了一个变体，其中在肽序列后合成了可切割N末端聚赖氨酸标签，并掺入了可切割接头1：H-KKKKK-(接头1)AhaGISFSIRFAIWIRFG-NH₂(10)(SEQ.ID.No：3)。根据实例3，此修饰的肽的合成和纯化顺利进行(图2b)。将纯肽10溶解于0.05M NaHCO₃水溶液，并且在r.t摇动2小时(图2a)。切割反应释放了两种肽11和12：尽管聚赖氨酸标签11是水溶性的，但是肽12在反应条件下沉淀并且可以容易地通过离心以高纯度分离。

图2b)：H-KKKKK(接头1)-AhaGISFSIRFAIWIRFG-NH2(10)的LC-MS，MS(ESI)：545.4[M+5H]⁵⁺，681.6[M+4H]⁴⁺，908.3[M+3H]³⁺，1362.0[M+2H]²⁺。

图2c)：不溶性肽12的MS(ESI)(MS(ESI)：661.5[M+3H]³⁺，991.3[M+2H]²⁺，1322.0[3M+2H]²⁺，1983.1[M+H]⁺)。

实例5：经由生物素/链霉亲和素相互作用的亲和纯化

N末端亲和标记的引入与在每个偶联步骤后应用加帽的肽合成方法联合，能够亲和纯化全长产物。将全长肽捕获在链霉亲和素包被的磁珠上，通过过滤去除副产物(较短序列)，并释放纯全长肽。

在靶肽的SPPS之后，首先将接头1，然后将Fmoc-Glu(生物素基-PEG)-OH偶联至该肽的N末端。这产生了H-Glu生物素基PEG-1-IIKKSTALL-NH₂(13)(SEQ.ID.NO：4)。由于该肽序列含有几个空间上需要的氨基酸，因此从树脂上切割后，获得全长肽和乙酰化较短片段的复杂混合物。将粗产物溶解于pH＝6.2的磷酸盐缓冲液中，并与链霉亲和素包被的磁珠一起孵育30分钟。将上清液通过LC-MS进行分析，表明从混合物中完全去除生物素化的肽。去除含有副产物的缓冲溶液，并用磷酸盐缓冲液(pH＝6.2)洗涤珠粒几次。之后，将挥发性可切割缓冲液(NH₄HCO₃，0.02M，pH＝8.8)加入珠粒中，并在孵育30分钟后，所需肽14从珠粒中释放。

方案5

结果示出于图3中。图3a显示了SPPS和从树脂上切割后获得的粗肽混合物。图3b显示了在pH＝6.2的磷酸盐缓冲液中链霉亲和素包被的磁珠上粗肽混合物的30分钟孵育后的上清液。N末端含有生物素标签的肽13被链霉亲和素完全捕获。c)洗去乙酰化的肽副产物并将链霉亲和素磁珠与NH₄HCO₃在pH 8.8孵育30分钟以释放所需肽HO(CH2)₃CO-IIKKSTALL-NH₂(14)(SEQ.ID.NO：4)

实例6：采用肽上的可切割增溶标签的DNA-肽缀合物的合成

方案6

通过SPPS(Aha＝叠氮高丙氨酸)合成具有序列H-PEG10(接头1)Aha AFDYLAQYHGG-NH₂(15)(SEQ ID No：5)的肽。通过点击化学进行与己炔基修饰的核酸的缀合。将叠氮基修饰的肽15(4mM在DMSO/tBuOH中3∶1，50μl)的溶液与根据标准固相亚磷酰胺方法合成的5′-己炔基-dT₂₀-3′(0.55mM在H2O中，180μl)的溶液混合。将CuBr(100mM在DMSO/tBuOH中3∶1，10μl)和THPTA(100mM在H₂O中，20μl)分别混合，并且将预先形成的复合物加入寡核苷酸-肽溶液中。在37℃摇动1小时后，完成链接反应。加入NaHCO₃(0.1M在H₂O中，3ml)，获得增溶PEG接头的切割。对该溶液(MWCO 1000透析膜)进行透析，得到所需产物16。

5’-hex-T₂₀-3’：MS(ESI)：发现的1544.3[M-4H]^4-，经计算的1544.5[M-4H]^4-。

肽X-5’-hex-T₂₀-3’：MS(ESI)：发现的1647.7[M-5H]^5-，经计算的1648.0[M-5H]^5-。

产物16：肽X-5’-hex-T₂₀-3’(脱聚乙二醇修饰的)：MS(ESI)：发现的1525.6[M-5H]^-5，经计算的1525.9[M-5H]^-5。

实例7：使用可切割固定化接头通过固体支持的缀合和非色谱纯化的快速合成肽和核苷-肽缀合物

此实例中公开的反应方案在图4中示出，并且包括两个替代途径A和B。

使用自动Fmoc-SPPS在rink-amide树脂上合成该肽WWWWEAAAEAAAEAAAEAAAEAAAEAAAEAAAEAAAEAAAEAAAEA AAEAAAEEEEE(SEQ.ID.No：6)。接下来，Fmoc-Pra-OH(N-α-(9-氟烯基甲氧基羰基)-L-炔丙基甘氨酸)、Fmoc保护的可切割接头1、Fmoc-O2Oc-OH(8-(9-氟烯基甲氧基羰基-氨基)-3，6-二氧杂辛酸)和三-Boc-肼乙酸借助于SPPS逐步偶联至树脂结合的肽上，产生所需肽17。

将肽从具有TFA/TIS/H₂O(95/2.5/2.5)的混合物的树脂中切割。在2小时后，将溶液浓缩，并且加入冷乙醚的溶液中。从上清液中分离出沉淀的肽，将其溶解于H₂O/ACN(1/1)的混合物中并冷冻干燥。将粗物质溶解于0.25M NaOAc/AcOH水性缓冲液(pH 4.2)和乙腈(20vol.％)的混合物中。加入氰基硼氢化钠，并将溶液转移到醛琼脂糖树脂上。在室温搅拌悬浮液，并通过HPLC监测固定化反应的进程(参见图5A、图5B)。在固定化后(约1小时)，将树脂用0.25M NaOAc/AcOH水性缓冲液(pH 4.2)、H₂O/ACN(2/1)的混合物和水洗涤。使树脂结合的含炔丙基甘氨酸的肽18与叠氮化物修饰的六磷酸胸苷(Fuller等人，PNAS 2016，113(19)，p.5233-4238)在存在CuSO₄、THPTA、抗坏血酸和氨基胍的情况下在含有20vol.％DMSO的0.2M NaH₂PO₄水性缓冲液(pH 6.5)的混合物中进行反应(参见图4，途径A)。将悬浮液在37℃搅拌16小时。将树脂用0.2M NaHPO4水性缓冲液(pH 6.5)和H₂O/ACN(2/1)的混合物洗涤。在室温，通过用0.2M Na₂HPO₄水性缓冲液(pH 8.5)处理树脂16小时，可以以高纯度释放所需核苷-肽缀合物20。

(HO(CH₂)₃CONH-Pra(N₃(CH2)₁₁O(PO₂)₆dT)

WWWWEAAAEAAAEAAAEAAAEAAAEAAAEAAAEAAAEAAAEAAAEA AAEAAAEEEEE-NH₂：

MS(ESI)：发现的1101.3[M-6H]^6-，经计算的1101.2[M-6H]^6-；发现的944.0[M-7H]^7-，经计算的943.8[M-7H]^7-。

替代地，甚至在核苷缀合步骤之前，也可以在弱碱性条件下(0.2M Na₂HPO₄缓冲液，pH 8.5，r.t，16小时)从琼脂糖树脂中释放树脂结合的肽18(参见图4，途径B)。在这些条件下，将未修饰的肽19

HO(CH₂)₃CONH-Pra

WWWWEAAAEAAAEAAAEAAAEAAAEAAAEAAAEAAAEAAAEAAAEA AAEAAAEEEEE-NH2以高纯度分离。

通过HPLC分析监测产物生成。图5显示了粗SPPS产物(5A)，固定化后的上清液(5B)，根据途径B生成的纯化的肽19(5D)和核苷-肽缀合物20(5C)的HPLC分析。

Claims

1.一种包含如下结构的结构单元：

其中2≤n≤24，m＝2或3，

A为酸不稳定保护基，并且

B为标签或碱不稳定保护基。

2.根据权利要求1所述的结构单元，其中A为Boc和/或B为Fmoc。

3.一种包含如下结构的化合物：

其中

其中2≤n≤24，m＝2或3，

X为肽或固体支持物，并且

Y选自由以下各项组成的组：肽、官能团、标签和含有官能团的肽。

4.根据权利要求3所述的化合物，其中Y为溶解度增强标签或固定化标签。

5.根据权利要求4所述的化合物，其中Y选自由以下各项组成的组：PEG、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚谷氨酸和聚天冬氨酸。

6.根据权利要求4所述的化合物，其中Y选自由以下各项组成的组：生物素、肼、氨氧基、叠氮化物、炔基、烯基、醛、吡咯丙氨酸、羧基和硫醇。

7.一种方法，其包括以下步骤：

a)在固体支持物上合成肽，所述肽包括末端氨基基团，

b)提供根据权利要求1-2所述的结构单元

c)将所述结构单元与所述肽偶联。

8.根据权利要求7所述的方法，其进一步包括以下步骤：

d)去除保护基B，以及

e)将至少一个氨基酸结构单元与所述末端氨基基团偶联。

9.根据权利要求7所述的方法，其进一步包括以下步骤：

d)去除保护基B，

f)将标签或官能团与所述末端氨基基团偶联。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述官能团或标签选自由以下各项组成的组：PEG、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、生物素、肼、氨氧基、叠氮化物、炔基、烯基、醛、吡咯丙氨酸、羧基和硫醇。

11.根据权利要求7-10所述的方法，其进一步包括以下步骤：

g)在pH≤6去除保护基A，从而也去除存在于所述肽上的其他保护基并从所述固体支持物上切割所述肽。

12.根据权利要求11所述的方法，其进一步包括以下步骤：

d)在pH≥8切割所生成的肽。

13.根据权利要求9-10所述的方法，其中所述标签或官能团是增溶标签，所述方法进一步包括以下步骤：

h)纯化所述肽，并且

i)在pH≥8切割掉所述增溶标签。

14.根据权利要求9-10所述的方法，其中所述标签或官能团为固定化标签，所述方法进一步包括以下步骤：

h)经由所述固定化标签将所述肽固定化在固体支持物上

i)任选地将所述肽缀合至附加的化学实体

j)在pH≥8切割掉所述固定化标签。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述化学实体为核酸、寡核苷酸或核苷酸，其优选地为六磷酸核苷。