JP7366242B2 - Ｃｄ３結合のための相補性決定領域およびそのｃｄｒを含む二重特異性抗原結合分子 - Google Patents

Ｃｄ３結合のための相補性決定領域およびそのｃｄｒを含む二重特異性抗原結合分子 Download PDF

Info

Publication number
JP7366242B2
JP7366242B2 JP2022512437A JP2022512437A JP7366242B2 JP 7366242 B2 JP7366242 B2 JP 7366242B2 JP 2022512437 A JP2022512437 A JP 2022512437A JP 2022512437 A JP2022512437 A JP 2022512437A JP 7366242 B2 JP7366242 B2 JP 7366242B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
antigen
binding
cell
protein molecule
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2022512437A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2022545041A (ja
Inventor
アレクサンドル アレクサンドロヴィチ ピスクノフ、
スベツラナ ジョルジェブナ アバソバ、
アントン ニコラエヴィチ モロゾフ、
アレクサンドル ミカイロヴィチ シュスター、
ピーター スラブニィー、
ダニエル グリフィス、
イザベラ カジンスカ、
ジョン マッカファティ、
マイケル ダイソン、
Original Assignee
ジョイント－ストック カンパニー “ジェネリウム”
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ジョイント－ストック カンパニー “ジェネリウム” filed Critical ジョイント－ストック カンパニー “ジェネリウム”
Publication of JP2022545041A publication Critical patent/JP2022545041A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7366242B2 publication Critical patent/JP7366242B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

本発明は、免疫学およびバイオテクノロジーの分野に関し、治療特性を有する新規の有効な高分子量化合物の創製にも関する。
ヒト細胞CD3受容体に特異的なタンパク質分子における抗原結合フラグメントの相補性決定領域（CDR）のアミノ酸配列のバリアントが提示される。これらのフラグメントのCD3抗原への結合を提供する、提示されたCDR配列は、ファージディスプレイ技術を用いて作製された。提示されるCDRは、CD3を有する細胞との特異的相互作用を必須の機能とする種々の抗原結合分子を作製するために使用できる。これらのCDRが、最初にCD19受容体に結合する抗体様分子の組成物に含まれる場合、ヒト細胞のCD3およびCD19受容体に特異的に結合する二重特異性分子も構築される。一実施形態において、二重特異性分子は、2つのポリペプチド鎖から構成され、その各々が、CD3抗原に特異的な軽鎖可変ドメイン（VL CD3）、CD19抗原に特異的な重鎖可変ドメイン（VH CD19）、CD19抗原に特異的な軽鎖可変ドメイン（VL CD19）、およびCD3抗原に特異的な重鎖可変ドメイン（VH CD3）を含む。ドメインは以下の順序で配列される：VL CD3－VH CD19－VL CD19－VH CD3。ポリペプチドのN末端からC末端への、抗原結合分子における可変ドメインのこの配列は、このような分子が2つの異なる抗原に同時に結合する可能性を提供し、それはT細胞およびB細胞によってそれぞれ発現されるヒトCD3およびCD19受容体の細胞外部分への選択的結合によりその治療有効性を決定する。分子がCD3受容体とCD19受容体の細胞外部分に同時に結合すると、T細胞とB細胞の間の接触が起こり、それがT細胞の活性化、細胞溶解性シナプスの形成、およびCD19陽性標的細胞を破壊するタンパク質分解酵素の放出をもたらす。二重特異性分子の抗原結合領域の配列の提示された構造は、様々な種類の細胞によって発現されるCD3およびCD19受容体の細胞外部分に効果的に結合する分子を形成することを可能にする。そのような分子は、腫瘍抗原（CD19）を発現する標的細胞との相互作用に応答してT細胞を活性化し、その結果、それらの細胞溶解をもたらす。提示される発明群は、提示される14の抗原結合フラグメントのいずれかに含まれるCDRの組み合わせに基づいて、腫瘍疾患、特にB細胞悪性腫瘍に関連する血液疾患を治療するための医薬の創出に適した組換えモノクローナル二重特異性治療抗体を作製することを可能にする。
ヒトCD19陽性細胞株へのBSAB調製物結合の有効性：A) Namalwa（ATCC（登録商標）CRL1432TM）細胞株；B) Daudi（ATCC（登録商標）CCL-213TM）細胞株；C) NALM6（ATCC（登録商標）CRL-3273TM）細胞株；D) Ramos（ATCC（登録商標）CRL-1596TM）細胞株；E) Toledo（ATCC（登録商標）CRL-2631TM）細胞株；F) Raji (ATCC（登録商標）CCL-86TM）細胞株。 CD3陽性細胞株に対するBSAB調製物結合の有効性：A) HUT78（ATCC（登録商標）TIB-161TM）細胞株；B) CCRF-CEM（ATCC（登録商標）CCL-119TM）細胞株；C) Jurkat（ATCC（登録商標）TIB-152TM）細胞株。 種々の濃度のBSAB調製物の存在下における、条件的に健康なドナー（Donor）のCD19陽性PBMCと、ヒトCD19受容体の細胞外部分に対するFITCコンジュゲート抗体（HD37クローン）（Millipore milli-mark, Cat. No. FCMAB184F）との間の相互作用。 条件的に健康なドナー（Donor）におけるCD3陽性PBMCとBSABとの相互作用。 条件的に健康なドナー（Donor）の活性化PBMCをエフェクター細胞として用いる場合の、BSAB調製物によるヒトRaji株CD19陽性細胞の細胞溶解（lysis）の有効性。 ヒトRaji株の細胞およびJurkat-LUCIA-NFAT（Promega）レポーター株のエフェクター細胞を用いる場合の、CD3およびCD19に同時に結合するBSABの能力。 Jurkat株細胞の活性化の分析における二重特異性IgG様分子の活性と特異性の評価。IgG様分子をタイトレートし、Jurkat株のレポーター細胞においてNFAT転写を活性化するそれらの能力を評価した。青色の線は、標的細胞（Raji株細胞）の存在下でのエフェクター細胞（Jurkat株細胞の遺伝子工学によって改変されたもの）の活性化を示す；赤色の線は、標的細胞の非存在下でのエフェクター細胞の活性化を示す。クローンは、右から左へそして上から下へ番号付けされている：309_ 01_A02; 309_01_G04; 309_01_G12; 309_02_A08; 309_02_F01; 309_04_A04; 309_05_B08; コントロール1; コントロール2; 400_01_D06; 400_03_H07; 410_01_C03; 410_01_C09; 418_01_C05; 418_03_E12; 418_03_H01; ネガティブコントロール。 CD3に対するIgG様抗体によるJurkat株細胞への結合の、フローサイトメトリー法による解析。Y軸は平均蛍光強度を示し、X軸は二重特異性IgG様分子濃度の対数を示す。独立した実験において得られたデータは別々に示されている（上パネルと下パネル）。表記：MFI（FU）―平均蛍光強度（蛍光単位）。IBC Generium BiM―二重特異性IgG様分子、陽性対照、およびBiM―二重特異性IgG様分子、陰性対照。 ヒトRaji株細胞およびJurkat-LUCIA-NFAT（Promega）市販レポーター株のエフェクター細胞を使用した、CD3およびCD19に同時に結合する本発明の309-02-F08二重特異性抗体およびBIMSA2治療用抗体の能力比較。 条件的に健康なドナーの活性化PBMCをエフェクター細胞として用いた場合の、BSABバリアントの調製物によるヒトRaji株CD19陽性細胞の細胞溶解の有効性。A：クローン309_01_G04；B：クローン309_01_A02；C：クローン309_02_F01；D：クローン309_01_G12；E：クローン309_02_A08；F：クローン309_05_B08。 BSABの可能な折りたたみのスキーム。
略語および用語：
PBMC―末梢血単核細胞
TDCC―T細胞依存性細胞傷害活性
BSAB―二重特異性抗体
MFI―平均蛍光強度
V―可変ドメイン
VL―軽鎖可変ドメイン
VH―重鎖可変ドメイン
CDR―相補性決定領域
Fc断片―Fc、fragment crystallizable領域、Fc領域
抗体―対応する抗原が存在する免疫グロブリンの分子
親和性―抗原と抗体の間の相互作用の力を定量的に記述する熱力学的特性；質量作用の法則に従って、成分濃度の積に対する抗原抗体複合体の濃度比として定義され得る。
アビディティ―抗原抗体複合体の総合的安定性の特性；抗原に対する抗体の親和性、抗体分子内の抗原結合部位の数、および、複合体形成に関して立体障害を生み出す抗原空間構造の特質によって決定される。抗原と抗体の間の単一相互作用の力を定量的に記述する熱力学的パラメータである親和性とは異なり、アビディティは協調的なアフィン（affine）相互作用の力を記述する。
抗体の抗原結合領域―エピトープを認識する抗体部分。いくつかの名称がある：抗体の活性部位または抗原結合部位、抗決定因子（antideterminant）、またはパラトープ。
二重特異性抗体―1つの分子内に、2つの異なる抗原に対する抗原結合領域を組み合わせる免疫グロブリン分子。二重特異性抗体は2つの抗原に同時に結合することができる。
本発明において、B細胞悪性腫瘍とは、以下のものを意味する：
- B細胞前駆細胞腫瘍
- 前駆Bリンパ芽球性リンパ腫／白血病（B前駆細胞急性リンパ芽球性白血病）
- 成熟リンパ球の表現型を示すB細胞腫瘍
1. 慢性リンパ球性白血病／リンパ球性リンパ腫
2. B細胞前リンパ球性白血病
3. リンパ形質細胞性リンパ腫
4. 脾性辺縁帯リンパ腫
5. 有毛細胞白血病
6. 骨髄腫または形質細胞腫（孤立性および骨外性）
7. 粘膜関連リンパ組織の節外性辺縁帯B細胞リンパ腫（MALTリンパ腫）
8. 節性辺縁帯B細胞リンパ腫（単球様B細胞を伴うまたは伴わない）
9. 濾胞性リンパ腫
10. マントル細胞リンパ腫
11. びまん性大細胞型B細胞リンパ腫
12. 縦隔大細胞型B細胞リンパ腫
13. 漿液性体腔の原発性リンパ腫
14. バーキットリンパ腫／白血病
B細胞枯渇―特定の抗原を発現する細胞の数の減少。
抗体相補性―抗原と特異的に相互作用する抗体の能力。まれな例外を除いて、抗体はその形成を誘導した抗原とのみ相互作用し、空間構造によってそれに適合する。
相補性決定領域―抗体分子の抗原結合部位を形成する、可変鎖の超可変領域。
腫瘍抗原―がん細胞によって産生され、体の免疫反応を引き起こすことができる抗原。これらは癌細胞の変化したゲノムの発現の結果である。
急性リンパ芽球性白血病―造血系の悪性疾患であり、未成熟リンパ系細胞（リンパ芽球）の無制御な増殖を特徴とする。
B細胞リンパ腫―様々な非ホジキンリンパ腫。この疾患は、身体の細胞や組織を異物として認識するBリンパ球の無制御な分裂を背景にして現れる。
特異性―異なる抗原に対して異なる親和性を示す抗体の能力。
エピトープ、あるいは抗原決定基―抗原巨大分子の一部であり、それに特異的な抗体と相互作用する抗原分子の小領域。この領域は免疫系の細胞や分子（すなわち、抗体、B-リンパ球、T-リンパ球）によって認識される。
CD3（Cluster of Differentiation 3）―Tリンパ球の表面に存在する多タンパク質複合体；哺乳類では、4つのサブユニットすなわちCD3γ、CD3δ、および2つのCD3εから形成される。
CD19、あるいはBリンパ球抗原CD19―Bリンパ球の表面に存在するタンパク質。
本願において使用される全ての用語および略語は、技術水準において適用可能な意味を有し、当業者によって理解される。上記の定義は、不一致を除去するために提示されている。
抗体は、免疫グロブリン（Ig）としても知られており、血液および組織液の可溶性糖タンパク質である。古典的な抗体は、2つの同一の重（H）鎖と2つの同一の軽（L）鎖を組み合わせた多量体タンパク質である。H鎖の方は、1つの可変ドメイン（VH）、および3つの定常（CH1、CH2、CH3）ドメイン、ならびにCH1ドメインとCH2ドメインの間のヒンジ領域で構成される。L鎖は、可変ドメインVLと定常ドメインCLからなる。これら4本の鎖は、非共有結合および共有結合（ジスルフィド結合）によって1つの分子へと組み合わされている。重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの相補性決定領域（CDR）の組み合わせが抗原結合領域を形成する一方、可変ドメインの抗体フレームワーク領域（FR）と定常ドメインは、抗原の認識に直接関与しない。可変領域は、軽鎖の一次構造中では互いに遠く離れて位置しているが、三次元構造が形成されると互いに近接して配置される。可変ドメインの空間構造では、超可変配列はポリペプチド鎖折り畳みの領域に位置しており、それはもう一つの鎖のVドメインの対応する領域に向けられている（すなわち、軽鎖と重鎖のCDRは互いの方に向けられている）。H鎖とL鎖の可変ドメインの相互作用の結果、Ig抗原結合領域（活性部位）が形成される。超可変領域の構築によって条件づけられるこの空洞の空間構造が、空間的適合性（抗体特異性）に基づいて特異的分子を認識し結合する抗体の能力を決定する。Vドメインの超可変領域は完全には活性部位の組成に入らず、抗原結合領域表面は、CDRの約30%をカバーするだけである。CDRhの個々のアミノ酸残基が抗原エピトープと特異的に相互作用する。
重鎖および軽鎖の可変ドメインがリンカー配列によって連結される単鎖構造（scFv）は、古典的抗体の抗原結合フラグメントの最小化された誘導体である。抗原結合領域は、抗原に対する各抗体特異性について異なる空間配置を有する。抗原が抗体に接触すると、抗原の複数の補欠的（prosthetic）基が、抗体の同様の基と鏡のように対応し、それによって、抗体と抗原との間に迅速かつ緊密な結合がもたらされる。抗体が高度に特異的である場合、抗体と抗原との間の結合は、疎水結合、水素結合、イオン引力、ファンデルワールス力などのいくつかの相互作用形態によって一度にもたらされ得る。抗原を結合するための2つの可変領域を有する抗体は、二価と呼ばれる。二重特異性抗体は、2つの異なる抗原に同時に結合する能力を有する。実際のタスクに応じて、開発者は、抗体のサイズ、特異性、親和性、価数を変化させ、免疫原性を低下させ、薬物動態学的特性およびエフェクター機能を最適化させ得る。さらに、抗体は、別の特異性の抗体、サイトカイン、タンパク質毒素および放射性同位体、酵素、蛍光タンパク質を含む組換え的に組み合わされたタンパク質の形態で産生される（Deyev S.M. and Lebedenko Ye.N.「臨床用の非天然抗体の創出のための最新技術」Acta Naturae（ロシア語版）, V. 1, No. 1, 2009, pp. 32-50参照）。各抗体は、その抗原に対して固有の特異性および高い親和性（KD 10-8～10-11 M）を有し、これは、抗原分子のある領域（エピトープ）に対するそのような抗体の抗原結合領域の相補性に基づく。種々の抗体は、1つ、2つまたはそれ以上の抗原に同時に結合する能力を有する。現在、治療に使用される抗体の親和性は、ほとんどのタスクに最適なナノモーラー濃度（10-8～10-10 M）の範囲にある。治療用抗体の分子サイズは、腎臓からのそれらの排泄の可能性、そしてひいては身体からのその排泄速度を決定する重要な因子である。腎臓を通じたタンパクの排泄の半減期は、分子の大きさと相関する。治療用抗体の最適な表面電荷は、それらの等電点が5～9である範囲である。正と負の電荷の増加はどちらも、標的細胞への抗体結合を悪化させる。
本発明において提示される、CD3受容体複合体を発現する細胞の表面上の該受容体複合体に結合することができる14個の機能性抗体の特性を表1に示す。標準対照としてOKT3抗体が含められている。これらの抗体は、本発明において提示されるCDRの組合せのうちの1つ、およびCD19受容体に対する抗原結合フラグメントを含む。表は、抗体を特徴づける軽鎖および重鎖CDR3配列、細胞との相互作用の分析による活性、ならびに発現生産性などの産業的生産適合性指標に関する情報を示す。すべての抗体の配列は、重鎖および軽鎖CDR3配列のユニークな組合せによって、およびCD19を発現する標的細胞との相互作用に応答してJurkat株細胞（活性化T細胞核内因子（NFAT）によって制御されるレポーター遺伝子を有する）を活性化する能力によって、特徴付けられる。標的細胞の非存在下では、Jurkat株細胞の非特異的活性化は低いか、または認められなかった（二重特異性JgG様分子の濃度が1 nM以上において）。Jurkat株細胞の活性化に関する活性のデータを表1に示す。Jurkat株細胞表面の天然CD3への結合をフローサイトメトリー法で測定した。
表１：発現細胞の表面のCD3受容体複合体に結合することができる、提示された機能的抗体の特性
二重特異性分子とCD3およびCD19受容体の細胞外部分との同時相互作用の際に、T細胞とB細胞との間の接触が起こり、その結果、T細胞の活性化、細胞溶解性シナプスの形成、およびCD19陽性標的細胞を破壊するタンパク質分解酵素の放出が生じる。現在、CD3-CD19に対する二重特異性抗体は、主にB細胞悪性腫瘍の治療またはB細胞の枯渇（例えば、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ芽球性白血病などの治療のためのもの）のために開発されている。二重特異性抗体（BSAB：bispecific antibodies）は、T細胞を腫瘍CD19陽性標的細胞と物理的に連結してその細胞溶解を開始させるアダプターの機能を果たす。CD3は汎T細胞受容体であり、すなわち、すべてのTリンパ球に発現されている。したがって、二重特異性抗体を用いると、T細胞のさまざまな亜集団が腫瘍細胞に引き寄せられる。CD19受容体は、Bリンパ球細胞（腫瘍細胞を含む）のみによって安定かつ均一に発現されることができる。CD19はB細胞以外では実質的にどこにも合成されないので、療法が特異的となることを提供した。BSABは、CD3と標的抗原との両方に同時に結合することにより、T細胞と癌細胞を連結する。このような場合、T細胞は活性化されて増殖し、細胞傷害性顆粒の放出を伴う細胞傷害性シナプスが形成され、サイトカインが分泌される。癌細胞の誘導性溶解は、チャンネル形成タンパク質の関与を伴う標的細胞膜の穿孔化、続いてグランザイムにより誘導されるアポトーシスを含む。標的細胞の不在下でBSABがT細胞のみに結合しても、T細胞の活性化は起こらない。
当技術分野で公知である二重特異性抗体の例（Blood, (ASH Annual Meeting Abstracts), 2009, 114:840）は、多価抗体の使用に基づいて製造される調製物の有効治療濃度が、古典的な抗体ベースの抗癌薬と比較して有意に低いという事実を証明している。それは、副作用のリスクを低減しつつ、良好な耐容性、長期治療の可能性に寄与する。
現在、CD19およびCD3に関して特異的な種々のポリペプチド、ならびにB細胞の枯渇およびB細胞疾患の治療のための医薬の成分としてのそれらの使用が知られている。RU 2228202に記載された発明は、式VLCD19-VHCD19-VHCD3-VLCDSで表される、CD19およびCD3抗原に特異的な単鎖多機能性ポリペプチド、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにこのポリペプチドを産生するための発現ベクター、細胞培養株、方法、B細胞悪性腫瘍を治療するための医薬組成物、診断用組成物<、T細胞の活性化または刺激の活性化因子または阻害因子を同定する方法、B細胞悪性腫瘍を治療するための医薬組成物を調製する方法、B細胞悪性腫瘍を治療することまたはB細胞を枯渇させることのための方法、ならびに病理学的状態の発生を抑制するための方法を開示している。特許RU 2651776には、ジスルフィド結合によって連結された2つの鎖（chains）を含む組換えモノクローナル二重特異性抗体が記載されており、それらの各々は、以下のドメイン：VL(CD3)-L1-VH(CD19)-L2-VL(CD19)-L3-VH(CD3)-H-CH2-CH3(IgG2)から構成され、ここで、VL (CD3) およびVH (CD3)。この抗体は、B細胞悪性腫瘍に関連する血液学的疾患を治療するために使用することができる。
二つの異なる抗原に同時に結合することが意図されたタンデム型ダイアボディー（diabody）の二量体性抗原結合分子は、当該技術分野で公知であり、RU 2613368に記述されている。この分子は2つの同一のポリペプチド鎖から構成される。
提示される本発明において、二重特異性分子の各ポリペプチド鎖は、CD3に特異的な軽鎖可変ドメインである第1のVL CD3ドメイン、CD19に特異的な重鎖可変ドメインである第2のVH CD19ドメイン、CD19に特異的な軽鎖可変ドメインである第3のVL CD19ドメイン、およびCD3に特異的な重鎖可変ドメインである第4のVH CD3ドメインから構成される。これらのドメインは、ポリペプチド鎖の各々において、N末端からC末端に向かって、VLCD3-VHCD19-VLCD19-VHCD3の順に配列されている。第1のVLCD3ドメインは、第1のリンカーL1によって第2のVHCD19ドメインに連結され、第2のVHCD19ドメインは、第2のリンカーL2によって第3のVLCD19ドメインに連結され、第3のVLCD19ドメインは、第3のリンカーL3によって第4のVHCD3ドメインに連結される。リンカーL2は、15以下のアミノ酸残基から構成される。二重特異性分子を形成するにあたって、第1のポリペプチド鎖（chain）の第1のVLCD3ドメインが第1のポリペプチド鎖の第4のVHCD3ドメインに連結するようになって、CD3のための抗原結合部位が形成され、第1のポリペプチド鎖の第2のVHCD19ドメインが第1ポリペプチド鎖の第3のVLCD19ドメインと連結して、CD19のための抗原結合部位が形成される（図11）。図解の目的のため、概略図中、CD3結合ドメインをA記号で示し、CD19結合ドメインをB記号で示している。分子へのFc領域の追加は、新生児FcRn受容体への結合により、その分子が血流中に存在する時間を延長し、それによって薬物の排泄半減期を増加させる（Hmila I., et al.. Mol. Immunol. England, 2008, V. 45, No. 14, pp. 3847-3856）。古典的な抗体の折りたたみ過程の結果として、2つの鎖から完全な分子が形成される。抗体の三次構造を形成する過程で、重鎖の定常領域の間にジスルフィド結合が形成される。1つの鎖でも完全に機能的である。二量体は単量体よりも安定であり、分子量が大きいため、それが血液中により長く循環することを可能にする。
本発明の説明で使用される用語「リンカー」は、ペプチドリンカーに関する。リンカーの長さおよび／または配列は、二重特異性分子の安定性および／または溶解性に影響する。リンカーは、生成される結合分子の柔軟性を改善し得、および／または立体障害を減少させることにより標的抗原に対するその結合を改善し得る。リンカーの長さおよび配列は、連結される配列および配列長に依存する。当業者は、種々のリンカーの適合性を試験するための方法をよく知っている。例えば、連結する分子の特性は、種々のリンカー型を用いてその連結親和性を分析することによって容易に試験することができる。製造された分子の安定性は、例えば、研究対象のタンパク質材料をタンパク質分子量および流体力学的特性に応じて画分へと分離する高速液体クロマトグラフィーなど、当技術分野で知られる方法によって測定することができる。
少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または100%が小さなアミノ酸（例えばグリシン、セリン、およびアラニン）から構成されるペプチドであるリンカーがより好ましい。グリシンおよびセリン分子のみから構成されるリンカーが最も好ましい。好ましくは、本発明におけるリンカー配列は、5～15個のアミノ酸から構成される。より好ましくは、本発明におけるCD3-CD19に対する抗体のリンカーLI、L2、L3は、以下の配列から選択される：
LI : (XXS)k、ここでk=2～3である；L2: (XXS)n、ここでn =4～5である：L3: (XXS)m、ここでm=2～3である；X=G。
本発明の一実施形態によれば、リンカーLI、L2、L3は、配列番号17、配列番号18、配列番号19に対応する配列によって表され得る。
別の実施形態によれば、上記の鎖の各々が、短いヒンジ領域によってヒトIgG2のFc配列に連結される。二重特異性分子は、Fcフラグメントおよびヒンジ領域の非存在下でも、CD3およびCD19抗原に結合し、その低分子量のためにFc受容体と相互作用せず、したがって血流から迅速に排出される。
ヒンジ領域は、天然免疫グロブリンにおいてCH1ドメインをFcフラグメントのCH2-CH3領域に連結する配列である。本発明の抗体において使用されるヒンジ領域は、好ましくは、天然免疫グロブリン領域と相同であり、通常は、天然免疫グロブリンにおけるように、ジスルフィド結合によって2つの重鎖を連結するシステイン残基を含む。ヒトおよびマウスの免疫グロブリンのヒンジ領域の典型的な配列は、“Antibody Engineering, a Practical Guide”（Borrebaeck, ed., W. H. Freeman and Co., 1992）に見出され得る。本発明の適切なヒンジ領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4および他の免疫グロブリンイソタイプに由来し得る。提供される実施形態において、本発明の抗体構築は、配列番号15に示される配列を有するIgG1ヒンジ領域を使用する。
Fcフラグメントは免疫グロブリン分子の末端部分で、細胞表面のFc受容体や補体系のいくつかのタンパク質と相互作用する。重鎖定常領域のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMのクラスに細分され、それらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4、IgA1およびIgA2に細分され得る。重鎖の定常領域に従って、種々の免疫グロブリンクラスはそれぞれ[アルファ]、[デルタ]、[イプシロン]、[ガンマ]および[ミュー]と呼ばれる。ヒトIgGの4つのアイソタイプは、新生児Fc受容体、活性化Fc受容体ガンマ、FcgRI、FcgRIIaおよびFcgRIIIa、阻害受容体FcgRIIbおよびClqのような種々の受容体に異なる親和性で結合し、種々の活性を獲得する。しかしながら、本発明における用語「Fc配列」は、特に、対応する受容体に対する親和性を変化させるために改変されたFc配列に関係する。本発明の抗体は、半減期を延長するために、Fc部分を含む。好ましくは、そのようなFc配列はヒト起源を有する。より好ましくは、それはIgG抗体、より好ましくはIgG2のヒトFc配列である。一実施形態において、この配列は配列番号16に対応する。IgG2型のFc配列のそのような選択は、Fc配列によって条件付けられるエフェクター負荷の減少を確実にし、したがって本発明の抗体の指向性毒性を減少させることを可能にする。
したがって、本発明において提示される、CD3抗原の新規な抗原結合領域を含む分子は、軽鎖および重鎖の可変ドメインが3つのリンカー領域によって一定の順序で連結されている単一のフレームワークに基づいて構築される。この分子は、ヒンジ領域によって連結されたFcフラグメントに起因してさらなる機能特性を獲得する。
提示されたCD3抗原結合フラグメントに基づいて、本発明者らは、上記の単一スキームに従い、CD3フラグメントに結合するための軽鎖および重鎖可変領域の異なる配列が二重特異性分子へと組み合わされたものを有する抗体のセットを作製した。一連の抗体様分子が産生され、その全配列は配列表の番号1～14に提供されている。CD19に結合するためのCDR配列は、既知のHD37抗体に基づいて創出され、すべての二重特異性抗体に共通であり、重鎖については以下の通りであり：
CDRH1: GYAFSSY
CDRH2: WIGQIWPGDGDTNYNGKFKG
CDRH3: RETTTVGRYYYAMDY
軽鎖については以下の通りである：
CDRL1: KASQSVDYDGDSYLN
CDRL2: DASNLVS
CDRL3: QQSTEDPWT。
CD3抗原に結合する分子を提供するCDR配列は、各抗体について、表2に示されている。
表２：二重特異性分子の組成における軽鎖および重鎖のCD3結合領域の組合せのバリアント
産生された抗体の活性および特異性は、多くの例において確認されている。
機能的に活性な二重特異性IgG様分子を、T細胞受容体複合体の組成においてJurkat株細胞の表面に存在するCD3内因性タンパク質へのそれらの結合を決定するためにスクリーニングした。最初に、二重特異性IgG様分子の一つの濃度（100 nM）について、Jurkat株細胞への結合をフローサイトメトリー技術によって評価した。14個の二重特異性IgG様分子はすべて、細胞への結合を示した。各クローンによる細胞への結合のプロファイルをさらに決定するために、二重特異性IgG様候補分子をタイトレートし、Jurkat株細胞への濃度依存性結合を評価した（結果を図8に示す）。これらの実験は、CD3に対する抗体クローンの2つの独立したシリーズについて別々に行われた。比較のために、CD3に結合するフラグメントとしてOKT3を含みCD19に結合するHD37を含む、陽性対照として使用された2つの二重特異性IgG様分子に関するデータが提示されている。陰性対照としてはBiM8_D1.3を用い、これは、CD3に対する抗体の単鎖可変断片（scFv）を、リゾチームに対する抗体（D 1.3）の単鎖可変断片（scFv）で置換したものである。CD3に対する全ての抗体は、細胞表面の天然CD3に結合することができたが、最大活性とシグナルはクローン間で有意に異なっていた。予想されるように、対照BiM_D1.3は、試験された濃度のいずれにおいても細胞に結合しない。
図9は、ヒトRaji株細胞およびエフェクターレポーター細胞を用いて、CD3とCD19に同時に結合する本発明の二重特異性抗体および特許RU 2651776からの治療用抗体の能力比較を示す。
クレームされた構造を有する抗体の全セットを、レポーターTDCC試験によって、CD19陽性標的細胞に関する細胞溶解活性について試験した。条件的に健康なドナーの活性化されたPBMCをエフェクター細胞として使用した場合の、提示されたBSABの種々のバリアントの調製物による、ヒトRaji株のCD19陽性細胞の細胞溶解の有効性を、図10に示す。
CD19陽性標的細胞との接触に応答してCD3陽性細胞の活性化および増殖を引き起こし、T細胞による抗炎症性サイトカインの放出を引き起こす、二重特異性抗体の能力が確認された。
従って、提供されたデータは、提示されたCDRバリアントを用いて創出された分子が、細胞培養において効率的に産生され、既知のCD3-およびCD19-指向性二重特異性分子のものに劣らない機能的特性を有し、したがって、B細胞疾患を治療するために使用される医薬製剤の開発において使用され得ることを示している。
CD3抗原に結合する二重特異性分子に基づく調製物は、表2に記載されたCDRを含む軽鎖および重鎖バリアントを導入することによって提供され、プレB細胞のフィラデルフィア染色体陰性の再発性または難治性の急性リンパ芽球性白血病の治療に使用され得る。その作用機序は、BSABがBリンパ球表面のCD19受容体とエフェクターTリンパ球表面のCD3受容体とに結合することによって保証され、それはT細胞の活性化を開始させ、CD19陽性B細胞の溶解をもたらす。
フローサイトメトリーを用いて、上記抗体について、CD3およびCD19陽性ヒト細胞株との相互作用の特異性および有効性を決定した。提示された分子は、CD3陽性細胞株（Jurkat、HUT-78、CCRF-CEM）とCD19陽性細胞株（Raji、NALM6、Daudi、Namalwa、Ramos等）に特異的に結合した。インビトロ実験は、本発明の分子が、代替的ドメイン構造を有する分子と比較して7倍高い細胞傷害活性を示し得ることを証明した。
提示された分子の生理活性を確認するために、以下の実験を行った：条件的に健康なドナーのPBMCを用いることにより、CD3受容体およびCD19受容体の50%が二重特異性分子と複合体を形成するところの調製物濃度を決定した。条件的に健康なドナーの活性化PBMCをエフェクター細胞として用いて、ヒト腫瘍株のCD19陽性標的細胞に関して調製物の細胞溶解性T細胞媒介活性を測定した。CD3とCD19に同時に結合する能力は、Raji細胞株およびJurkat-LUCIA-NFAT（Promega）市販レポーター細胞株のものを用いて確認した。
実施例1～4は、本発明の抗体が、標的のCD3およびCD19陽性ヒト細胞株に対してサブナノモーラー範囲の高い親和性を有することを示す。条件的に健康なドナーのPBMCとインキュベートされた場合に、50%の遊離CD3受容体が同定された濃度は、52.1から66.5 nMまで変動した。50%遊離CD19受容体が同定された濃度はドナーに依存して0.02から0.06 nMまで変動した。BSAB調製物は、条件的に健康なドナーのPBMCをエフェクター細胞として用いた場合、ヒトRaji株のCD19陽性標的細胞に対してT媒介性細胞溶解活性を示した。EC50は1.3 pMから3.1 pMまで変動し、標的細胞の最大溶解のパーセントはドナーに依存して41から100までであった。レポーター試験では、EC50は2.3 pMであった。どちらの方法も、本発明の309_02_A08調製物によるCD3およびCD19陽性細胞への同時結合を確認している。
本発明の全ての分子は、既知の一次構造を有する治療用タンパク質分子を製造するために現在使用されているルーチンの方法を使用することによって製造することができる。提示されたアミノ酸配列のいずれか1つを有するポリペプチド鎖をコードする遺伝子は、重複する化学合成オリゴヌクレオチドを焼成することによって作製され得、次いで、pMT1638発現ベクターにクローニングされ得る。生成されたpMT1638ベクターは、制限マッピングおよび配列決定によって確認される。その後、トランスフェクションを行い、標準的な技術を用いてピューロマイシン耐性選択を行う。トランスフェクションは、懸濁増殖に適合された市販のCHO-K1株を用いて行われる。産生細胞株の選択は、ヒトタンパク質が合成されるときに最適なグリコシル化プロファイルを形成する必要性によって、そしてそれらの安定性、安全性、およびこの細胞株を培養するための懸濁条件の使用可能性によって、条件付けられ、これらは治療用抗体を産生するための最も重要なパラメーターである。増殖培地BalanCD CHO Growth A（Irvine Scientific）および栄養添加剤BalanCD（登録商標）CHO Feed 4（Irvine Scientific）を用いて、インキュベーター気相を5% CO2とし温度37℃（第1日～第6日）、32℃（第7日～第11日）で11日間、流加培養モードで生産体培養を行う。培養後、遠心分離により培養液を清澄化する。
培養液から標的生成物を単離および精製するために、種々の抗体精製方法を用いることができる。例えば、Aタンパク質ベースの溶媒および吸着材上の高速陽イオン交換クロマトグラフィーの使用によるアフィン工程を含むスキームを使用することができ、これはタンパク質標的形態およびそのオリゴマー形態の効果的な分離を提供する。
本開示は以下の実施形態を含む。
［１］
軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含む少なくとも1つの抗原結合フラグメントを含む、CD3受容体複合体に結合することができるタンパク質分子であって、重鎖相補性決定領域HCDR1、HCDR2およびHCDR3、ならびに軽鎖相補性決定領域LCDR1、LCDR2およびLCDR3が、表2に示されるバリアント1～14からなる群より選択されることを特徴とする、タンパク質分子。
［２］
ヒトTリンパ球に位置するCD3に単価的かつ特異的に結合する、［１］に記載のタンパク質分子。
［３］
CD3に特異的な軽鎖可変ドメインに含有されるLCDR1、LCDR2およびLCDR3が、以下のリストから選択される抗体の配列に含有されるLCDR1、LCDR2およびLCDR3と同一である、［１］に記載のタンパク質分子：>309_01_A02；>309_01_G04；>309_01_G12；>309_02_A08；>309_02_F01；>309_04_A04；>309_05_B08；>400_01_D06；>400_03_H07；>410_01_C03；>410_01_C09；>418_01_C05；>418_03_E12；>418_03_H01。
［４］
CD3に特異的な重鎖可変ドメインに含有されるHCDR1、HCDR2およびHCDR3が、以下のリストから選択される抗体の配列に含有されるHCDR1、HCDR2およびHCDR3と同一である、［１］に記載のタンパク質分子：>309_01_A02；>309_01_G04；>309_01_G12；>309_02_A08；>309_02_F01；>309_04_A04；>309_05_B08；>400_01_D06；>400_03_H07；>410_01_C03；>410_01_C09；>418_01_C05；>418_03_E12；>418_03_H01。
［５］
二重特異性抗原結合分子の一部を形成する、［１］～［４］のいずれか一項に記載のタンパク質分子。
［６］
ヒトBリンパ球上に位置するCD19に単価的かつ特異的に結合する第2の抗原結合ポリペプチド構築物を含有する、［１］～［５］のいずれか一項に記載のタンパク質分子。
［７］
前記タンパク質分子の配列が、（ａ）［１］～［５］のいずれか一項に記載の分子の抗原結合領域を含む第1のドメイン、および（ｂ）ヒトB細胞のCD19に対して抗原を特異的に認識する免疫グロブリンまたは抗体鎖の抗原結合領域を含む第2のドメインを含み、前記抗原結合領域を形成するこれらのドメインが、VLСD3-VHСD19-VHСD19-VLCD3の順序で配列されている、［１］～［６］のいずれか一項に記載のタンパク質分子。
［８］
Fcフラグメントをさらに含む、［１］～［７］のいずれか一項に記載のタンパク質分子。
［９］
二重特異性抗体フォーマットにおいてT細胞の活性化を誘導することができる、［１］～［８］のいずれか一項に記載のタンパク質分子。
［１０］
前記タンパク質分子のアミノ酸配列が、以下のリストから選択される配列を含む、［１］～［９］のいずれか一項に記載のタンパク質分子：配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14。
［１１］
B細胞悪性腫瘍を治療する用途の、またはB細胞を枯渇させる用途の、医薬を作製するための［１］～［１０］のいずれか一項に記載の分子の使用。
［１２］
前記医薬が有効量の［１］～［１０］のいずれか一項に記載の分子を含み、任意で、この用途の組成物において伝統的に使用される担体の範囲内からの中性担体を含む、［１１］に記載の使用。
［１３］
前記B細胞悪性腫瘍が急性リンパ芽球性白血病およびB細胞リンパ腫から選択される、［１１］に記載の使用。
［１４］
疾患が難治性または再発性の形態で進行するものである、［１３］に記載の使用。
［実施例１：ヒトCD3およびCD19陽性細胞とのBSAB分子相互作用の特異性および有効性の決定］
2×106細胞/mLの濃度を有するCD19陽性細胞株（NALM 6（ATCC（登録商標）CRL-3273TM）、Toledo（ATCC（登録商標）CRL-2631TM）、Namalwa（ATCC（登録商標）CRL-1432TM）、Daudi（ATCC（登録商標）CCL-213TM）、Ramos（RA 1）（ATCC（登録商標）CRL-1596TM）、Raji（ATCC（登録商標）CCL-86TM））およびCD3陽性細胞株（HuT 78（ATCC（登録商標）TIB-161TM）、CCRF-CEM（ATCC（登録商標）CCL-119TM）、Jurkat（ATCC（登録商標）TIB-152TM））の細胞懸濁液を、30μLごとに、V字形底を有する96ウェルプレート（コーニング社、カタログ番号3894）に導入した。30μLの309_02_A08 BSABクローン溶液を、200 nM～0.003 nMの連続的3倍希釈で各ウェルに入れ（最終濃度は100 nM～0.0016 nM）、氷上で60分間インキュベートした。インキュベーションが終了したら、細胞をFACS緩衝液で二回洗浄し、1000 rpmおよび（4±2）℃で遠心分離することによって沈殿させた。1:200の比率で希釈したFITC標識抗ヒトIgG抗体（ロバF(ab)2抗ヒトIgG、Abcam、カタログ番号Ab102437）の溶液30μLを各ウェル中の沈殿細胞に添加し、暗所において30分間氷上でインキュベートし、続いてFACS緩衝液で三回洗浄した。次いで、各ウェル中の細胞沈殿物を150μLのFIX緩衝液（ホルマリンの1%溶液を伴うリン酸緩衝生理食塩水）中に再懸濁することによって細胞を固定した。FITCチャンネルにおける細胞蛍光強度を、Canto IIサイトメーターを用いて測定した。
表３：CD19およびCD3陽性細胞株へのBSAB結合の有効性
BSABはナノモーラー未満の親和性でCD19およびCD3陽性細胞株に特異的に結合することが示された。実験結果を図1および図2ならびに表3に示す。
［実施例２：条件的に健康なドナーのPBMCを用いた、CD3およびCD19受容体の50%が抗体と複合体を形成するBSAB調製物濃度の決定］
［末梢血単核細胞 (PBMC) の単離］
条件的に健康なドナーから、ヘパリンを伴うバキュテイナー（Greiner Bio-One、カタログ番号455084）中に無菌状態で血液を採取した。血液を、同じ体積のリン酸緩衝生理食塩水（ECO-Servis、カタログ番号В-60201）で希釈し、フィコール密度勾配（ρ=1.077 g/cm3）（"Pan-Eco"、カタログ番号Р052）上に積層にし、800 g、20±2℃で30分間遠心分離した。PBMCを相境界において採取し、等張リン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄した。細胞沈殿物を、10%ウシ胎児血清（GE Healthcare、カタログ番号SV30160）を伴うDMEM/F12培地（Sigma、カタログ番号D8900-10L）15 mL中に再懸濁し、単球を付着させるために培養バイアル（SPL Life Sciences Co、カタログ番号70075）中で37±2℃にて4時間インキュベートした。インキュベーション後、非付着細胞を収集し、細胞懸濁液を遠心分離し、細胞沈殿物を、B細胞膜上に露出されたFc受容体の非特異的結合を阻害するために1:100 Fcブロック溶液（BD Pharmingen（商標）、カタログ番号564220）を伴うFACS緩衝液中に再懸濁させた。4×106/mLの細胞濃度を有する調製されたPBMC懸濁液を、V字型底を有する96ウェルプレート（Corning Inc、カタログ番号3894）に50μL（ウェル当たり2×105細胞）ずつ導入した。
［条件的に健康なドナーのCD19陽性末梢血単核細胞へのBSAB結合］
50μLの309_02_A08 BSABクローン溶液を、200 nM～0.003 nMの1:100 Fcブロック（最終濃度は100 nM～0.0016 nM）を加えたFACS緩衝液中の連続的3倍希釈液で細胞に添加し、37±2℃で60分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を氷冷FACS緩衝液で二回洗浄し、1300 rpm、5±3℃で10分間遠心分離することによって細胞を沈殿させた。次いで、細胞沈殿物を100μLのFACS緩衝液に再懸濁し、FITC標識抗体（Millipore milli-mark、カタログ番号FCMAB184F）を10μLの容量で、ヒトCD-19受容体の細胞外部分へと添加して、最終希釈を1:150とし、5±3℃で30分間インキュベートし、続いて三重洗浄した。細胞を、250μLのFIX緩衝液（ホルマリンの1%溶液を含むリン酸緩衝生理食塩水）に再懸濁することによって固定した。FITCチャンネルにおける細胞蛍光強度を、Canto IIサイトメーターを用いて測定した。このようにして得られたデータを検証するために、少なくとも5万のイベントが収集された。
［条件的に健康なドナーのCD3陽性末梢血単核細胞へのBSAB結合］
50μLの309_02_A08 BSABクローン溶液を、8,700 nM～0.04 nMの1:100 Fcブロック（最終濃度は2,900 nM～0.01 nM）を加えたFACS緩衝液中での連続的3倍希釈で細胞に添加した。次いで、300 nMの濃度のビオチンコンジュゲートBSABの溶液を調製し、細胞を有するウェルに50μLずつ導入した（調製物の最終濃度は100 nM）。細胞を37±2℃にて60分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を氷冷FACS緩衝液で二回洗浄し、1300 rpm、5±3℃で10分間遠心分離することによって細胞を沈殿させた。細胞沈殿物をFACS緩衝液100μLに再懸濁し、10μLのPE-ストレプトアビジンコンジュゲート（BD Pharmingen、カタログ番号554061）を添加し（最終希釈は1:200）、続いて5±3℃で30分間インキュベートし、３回洗浄した。細胞を、250μLのFIX緩衝液（ホルマリンの1%溶液を含むリン酸緩衝生理食塩水）に再懸濁することによって固定した。PEチャンネルにおける細胞蛍光強度をCanto IIサイトメーターを用いて測定した。このようにして得られたデータを検証するために、少なくとも5万のイベントが収集された。
得られたデータは、FlowJo、ExcelおよびGraphPad Prism 6.0ソフトウェア、用量依存性阻害の4パラメータロジスティック関数、ならびに上部および下部漸近線とシグモイド曲線ヒルスロープ（hill slope）の値のための「constrain-shared value」関数を用いて処理した。半最大阻害濃度（IC50）および関数近似の信頼係数（R2）を決定した。
［結果］
50%のCD19受容体がフリーであり対応して50%のCD19受容体が抗体と複合体を形成するところのBSAB濃度は、ドナー（Donor）に応じて0.02から0.06 nMの間で変動すること測定された（図3）。
50%のCD3受容体がフリーであり対応して50%のCD3受容体が抗体と複合体を形成するところのBSAB濃度は、ドナー（Donor）に応じて52.1から66.5 nMの間で変動することが測定された（図4）。
表４：条件的に健康なドナーのPBMCを用いて測定された、CD3およびCD19受容体の50%が抗体と複合体を形成するところのBSAB調製物濃度
［実施例３：条件的に健康なドナーの活性化PBMCをエフェクター細胞として使用した場合の、ヒト腫瘍株のCD19陽性標的細胞に関するBSABのT細胞媒介性細胞溶解活性の決定］
［末梢血単核細胞 (PBMC) の単離と活性化］
条件的に健康なドナーのPBMCを実施例2に記載したように単離した。IL-2（Abcam、カタログ番号ab155694）を、10%ウシ胎児血清（GE Healthcare、カタログ番号SV30160）を含むDMEM/F12（Sigma、カタログ番号D8900-10L）培地中2×106細胞/mLの濃度のPBMC懸濁液5 mLに添加して、最終濃度5 ng/mLとし、ヒトCD3およびCD28受容体に対する抗体を有するDynabeads磁性粒子を65μLの容量の添加して、ヒトTリンパ球（Gibco、カタログ番号11131D）を活性化した。細胞を37±2℃にて5.0±0.5% CO2雰囲気中で5～7日間インキュベートし、毎日細胞数を計数した。必要ならば、ウシ胎児血清（GE Healthcare、カタログ番号SV30160）10%を含むDMEM/F12（Sigma、カタログ番号D8900-10L）培地お呼び5 ng/mLの濃度のIL-2を添加した。
［技術のシナリオ］
ヒトRaji株（ATCC（登録商標）CCL-86TM）の標的細胞を、等張リン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄して培地を除去し、1300 rpm、22±2℃で10分間遠心分離することによって細胞を沈殿させた。細胞沈殿物を等張リン酸緩衝生理食塩水に再懸濁させ、10μLの1 mMカルセイン溶液（Molecular Probes、カタログ番号C3100MP）を、100万細胞につきカルセイン溶液10μLの量で添加し、40分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、等張リン酸緩衝生理食塩水で遊離カルセインから三回洗浄した。ADCF-Mab培地（GE Healthcare Life Sciences、カタログ番号SH30349.02）を用いて細胞懸濁液の密度を1 mL中2×105細胞とし、100X容量のプロベネシド溶液（Sigma-Aldrich、カタログ番号P8761-25G）の1/100を添加した。
活性化されたIL-2/CD3/CD28 T細胞を、1300 rpm、22±2℃で10分間遠心分離することによって沈殿させ、そして等張リン酸緩衝生理食塩水で一度洗浄した。細胞沈殿物をADCFMab培地中に再懸濁し、産生された細胞懸濁液を1 mL中4×106細胞の濃度に調整した。
309_02_A08 BSABクローンについて100から0.0005 pMまでの12個の連続3倍希釈を行い、各溶液を50μLずつ、96ウェル平底プレート（Corning Inc、カタログ番号3599）のウェルに三複製で導入した。次いで、50μLのIL-2/CD3/CD28活性化T細胞および50μLのRaji細胞を各プレートウェルに導入した（T細胞/Raji細胞比は10:1であった）。さらに、1) カルセイン標識標的細胞（カルセイン自発的放出のコントロール）、2) エフェクター細胞を伴うカルセイン標識標的細胞（309_02_A08調製物の添加なしでエフェクター細胞の細胞溶解活性によって条件づけられる細胞溶解）、3) Triton X100溶液（Sigma-Aldrich、カタログ番号Х100-1L）によるその後の処理のためのカルセイン標識標的細胞を、プレートウェルに導入した。細胞を37±2℃で3時間インキュベートした。
三時間以内に、細胞の完全な溶解（MFI_max）を達成するために、カルセイン標識Raji細胞を有するウェルに20μLのTriton X100溶液を添加し、細胞を37±2℃で1時間インキュベートした。
インキュベーション後、プレートを1300 rpmで5分間遠心分離し、細胞を捕捉しないように注意しながらマルチチャンネルピペットを用いて各ウェルから120μLの上清を非透明白色プラスチック製プレート（Corning Inc、カタログ番号3912）に移し、蛍光を測定した。蛍光は、Tecan Infinite M 200プレートリーダーで、励起波長488 nmおよび発光518 nmにおいて測定した。得られたデータをExcelにエクスポートし、各実験ウェルにおける溶解を以下の式に従って計算した。
特異的溶解のパーセント = (MFIexp- MFI_min) / ( MFI_max- MFI_min)*100%
得られたデータを、GraphPad Prism 6.0ソフトウェア、4パラメータロジスティック関数、および「constrain - shared value」関数を用いて、上漸近線および下漸近線ならびにシグモイド曲線ヒルスロープの値についてさらに処理した。半最大阻害濃度 (IC50) および関数近似の信頼係数 (R2) を決定した。
［結果］
BSAB調製物は、条件的に健康なドナーのPBMCをエフェクター細胞として使用した場合に、ヒトRaji株のCD19陽性標的細胞に関して細胞溶解活性を示した。ドナー（Donor）に応じてEC50は1.3 pMから3.1 pMの間で変動し、標的細胞最大溶解（lysis）パーセントは41から100の間で変動した。実験結果を図5に示す。
表５：条件的に健康なドナーの活性化PBMCをエフェクター細胞として使用した場合に、ヒトRaji株のCD19陽性細胞の50%細胞溶解効果が測定されたBSAB調製物濃度
［実施例４：エフェクター細胞としてJurkat-LUCIA-NFAT（Promega）市販レポーター株を使用したT細胞媒介性BSAB活性の決定］
技術の説明
Raji細胞株（ATCC（登録商標）CCL-86TM）を、製造業者の推奨に従って培養した。等張リン酸緩衝生理食塩水を用いたヒトRaji株（ATCC（登録商標）CCL-86TM）標的細胞の二回洗浄で培養培地を洗い落とし、1300 rpm、22±2℃で10分間遠心分離することによって細胞を沈殿させた。細胞沈殿物を試験培地（5%ウシ胎児血清（GE Healthcare、カタログ番号SV30160）を含みフェノールレッドを含まないRPMI-1640（Lonza、カタログ番号BE12918F））中に再懸濁させた。2 x 105細胞/mLの濃度で5 mLの細胞懸濁液を調製した。
Jurkat-Luc-NFAT細胞株（エフェクター細胞）（Promega、カタログ番号jktl-nfat）を37±2℃の水浴上で解凍した。アンプルの内容物を、試験培地5 mLを含有する遠心管に移し、1000 rpmで5分間遠心した。細胞沈殿物を試験培地に再懸濁させた。5 mLの細胞懸濁液を、2.5 x 106細胞/mLの濃度で作製した。
1200 pM～0.02 pMの範囲で309_02_A08 BSABクローンの11個連続の3倍希釈液を試験培地中で調製した（最終濃度は400～0.007 pM）。
40μLの調製溶液を、U字型96ウェル培養プレート（Corning Inc、カタログ番号3799）の各A2-H12ウェルに最小濃度から出発して三連で導入した。40μLの培地を、各A1-H1ウェルに導入した。調製したRaji細胞およびJurkat-Luc-NFAT細胞の懸濁液を混合し、プレートのA1-H12ウェルにそれぞれ80μL導入した。プレートを37±2℃で18時間インキュベートした。
インキュベーション後、プレートウェルの内容物を再懸濁し、非透明白色プラスチック製の96ウェル平底プレート（Corning Inc、カタログ番号3912）の各ウェル中に40μL移した。次に、室温（20±5℃）に加熱されたQUANTI-LucTMLuciaTM基質（Invivogen、カタログ番号rep-qlc1, rep-qlc2）25μLを各ウェルに入れた。ウェルの内容物を注意深く攪拌した。化学ルミネセンス強度をTecan Infinite M 200プレートリーダーで測定した。
得られたデータをGraphPad Prism 6.0ソフトウェアを用いて処理した。BSAB調製物濃度の十進対数に対する化学ルミネセンスレベルの依存性を4パラメータ対数関数方程式で近似した。EC50とR2が自動的に決定された。
結果
Raji株の細胞をBSABの存在下でJurkat-Luc-NFAT細胞と一緒に培養すると、化学ルミネセンス（chemiluminescence）シグナルの用量依存的増加が観察された；EC50は2.3 pMであった。実験結果を図6に示す。
［実施例５：Jurkat細胞の活性化を分析することによる二重特異性抗体の機能的活性および特異性の評価］
プロメガ社から購入した、レポーター遺伝子を有するJurkat株細胞を用いてT細胞の活性を測定した。CD3に対する14種の二重特異性IgG様抗体の活性 (EC50) のデータを表1に、用量反応依存性の全曲線を図7に示す。調べた二重特異性IgG様分子を滴定し、CD19を発現する標的細胞の存在下または非存在下でJurkat株のエフェクター細胞においてNFAT転写を誘導するそれらの能力を評価した（すなわち、標的依存性および標的非依存性の活性化が評価された）。この分析において、全ての二重特異性IgG様分子は高い標的依存性活性を示した。また、陽性対照として使用された2つの異なる二重特異性IgG様分子に関するデータも示されており、そこでは、CD3に結合する断片としてOKT3が使用された（対照1および2）。陰性対照としてBiM 8_D1.3を使用した（CD3に対する抗体の単鎖可変フラグメント（scFv）を、D1.3ニワトリ卵リゾチームに対する抗体の同様なフラグメントで置き換えたもの）。本解析では、活性化T細胞核内因子（NFAT）の応答エレメントにより制御されるルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定的に発現する遺伝子工学的改変Jurkat系細胞を用いた。これらのレポーター細胞をCD3/CD19に対する機能的二重特異性抗体の存在下でCD19発現Raji細胞と一緒に培養すると、T細胞受容体複合体の活性化がもたらされ、NFAT応答エレメントの活性化によって条件づけられたルシフェラーゼ活性の増加がもたらされる。
解凍後にすぐに使用できるGloResponseTMNFAT-Re-luc 2 Jurkat細胞（Promega、カタログ番号CS176403）を37℃の水浴で2分間解凍し、10%ウシ胎児血清（HyClone、カタログ番号SH30070.03）を添加した予備加熱RPMI 1640培地（Gibco、カタログ番号22400）4 mLに注意深く移した。再懸濁した細胞25μLを、分析用白色96ウェルプレート（Costar、カタログ番号3917）の各ウェルに入れ、各ウェル中のJurkat株細胞の総数を1×105とした。分析培地中2×106/mLの濃度でRaji株細胞懸濁液を調製し、25μLの懸濁液を、Jurkat株のレポーター細胞を含有する各ウェルに添加した（各ウェル中のRaji株細胞の数は5×104）。さらに、被験二重特異性IgG様分子（または場合によっては対照として使用溶媒）5.5μLを加え、試料を37℃で5時間インキュベートした（静置インキュベーター、5% CO2）。インキュベーション後、プレートを室温（21℃）で15分間放置し、次いで、55μLのBio-Glo試薬（Promega、カタログ番号G7940）を各ウェルに添加した。試薬は製造会社の指示に従って溶解した。最後に、プレートを5分間（21℃）インキュベートし、BMG Pherastarプレートリーダーにより発光を測定した。
Jurkat株細胞の低いレベルの標的非依存性活性化は、提示される二重特異性IgG様分子の全クローンの非常に有望な特性である。

Claims (11)

  1. 軽鎖可変ドメイン（VLCD3）および重鎖可変ドメイン（VHCD3）を含む少なくとも1つの抗原結合フラグメントを含む、CD3受容体複合体に結合することができるタンパク質分子であって、前記少なくとも1つの抗原結合フラグメントは重鎖相補性決定領域HCDR1に配列番号72、HCDR2に配列番号73およびHCDR3に配列番号74、ならびに軽鎖相補性決定領域LCDR1に配列番号75、LCDR2に配列番号76およびLCDR3に配列番号77のアミノ酸配列を有することを特徴とする、タンパク質分子。
  2. ヒトTリンパ球に位置するCD3に特異的に結合する、請求項１に記載のタンパク質分子。
  3. 二重特異性抗原結合分子の一部を形成する、請求項１または２に記載のタンパク質分子。
  4. ヒトBリンパ球上に位置するCD19に特異的に結合する第2の抗原結合ポリペプチド構築物を含有する、請求項１～３のいずれか一項に記載のタンパク質分子。
  5. 前記タンパク質分子の配列が、（ａ）VLCD3およびVHCD3を含有する抗原結合領域を含む第1のドメイン、および（ｂ）ヒトB細胞のCD19に対して抗原を特異的に認識する免疫グロブリンまたは抗体鎖の抗原結合領域を含む第2のドメインを含み、前記第2のドメインの抗原結合領域は軽鎖可変ドメイン（VLCD19）および重鎖可変ドメイン（VHCD19）を含有し、
    前記抗原結合領域を形成するこれらのドメインが、VLCD19-VHCD3-VLCD3-VHCD19の順序で配列されている、請求項１～３のいずれか一項に記載のタンパク質分子。
  6. Fcフラグメントをさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のタンパク質分子。
  7. 二重特異性抗体フォーマットにおいてT細胞の活性化を誘導することができる、請求項１～６のいずれか一項に記載のタンパク質分子。
  8. 前記タンパク質分子のアミノ酸配列が、配列番号4を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のタンパク質分子。
  9. B細胞悪性腫瘍を治療する用途の、またはB細胞を枯渇させる用途の、請求項１～８のいずれか一項に記載の分子を含む医薬。
  10. 前記B細胞悪性腫瘍が急性リンパ芽球性白血病およびB細胞リンパ腫から選択される、請求項９に記載の医薬。
  11. 疾患が難治性または再発性の形態で進行するものである、請求項１０に記載の医薬。
JP2022512437A 2019-08-21 2020-08-20 Ｃｄ３結合のための相補性決定領域およびそのｃｄｒを含む二重特異性抗原結合分子 Active JP7366242B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019126380 2019-08-21
RU2019126380A RU2738802C1 (ru) 2019-08-21 2019-08-21 Определяющие комплементарность участки для связывания cd3 и содержащая их биспецифическая антигенсвязывающая молекула
PCT/RU2020/050195 WO2021034227A1 (ru) 2019-08-21 2020-08-20 Определяющие комплементарность участки для связывания cd3 и содержащая их биспецифическая антигенсвязывающая молекула

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2022545041A JP2022545041A (ja) 2022-10-24
JP7366242B2 true JP7366242B2 (ja) 2023-10-20

Family

ID=73834967

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022512437A Active JP7366242B2 (ja) 2019-08-21 2020-08-20 Ｃｄ３結合のための相補性決定領域およびそのｃｄｒを含む二重特異性抗原結合分子

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20230212288A1 (ja)
EP (1) EP4036115A4 (ja)
JP (1) JP7366242B2 (ja)
CN (1) CN114364698B (ja)
AU (1) AU2020334700A1 (ja)
CA (1) CA3149929A1 (ja)
RU (1) RU2738802C1 (ja)
WO (1) WO2021034227A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR102020009679A2 (pt) * 2020-05-14 2021-11-23 Fundação Universidade Federal Do Abc - Ufabc Anticorpos recombinantes humanos para inibição da calicreína tecidual humana 7 (klk7) e uso em doenças relacionadas ao processo de descamação da pele

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005517392A (ja) 2001-11-14 2005-06-16 アフィメート テラポイティクス アーゲー 二重特異性抗ｃｄ１９×抗ｃｄ１６抗体およびその使用
JP2013543869A (ja) 2010-11-15 2013-12-09 メディミューン，エルエルシー Ｂ細胞リンパ腫のための併用療法
JP2014504272A (ja) 2010-11-10 2014-02-20 アムジェン リサーチ （ミュニック） ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ｃｄ３特異的結合ドメインによって引き起こされる有害作用の予防
JP2014509861A (ja) 2011-03-16 2014-04-24 アルゲン−エックス ビー．ブイ． Ｃｄ７０に対する抗体
JP2015535828A (ja) 2012-09-21 2015-12-17 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 抗ｃｄ３抗体、ｃｄ３及びｃｄ２０に結合する二重特異性抗原結合分子、並びにそれらの使用
JP2017526350A (ja) 2014-07-31 2017-09-14 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハーＡＭＧＥＮ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｍｕｎｉｃｈ）ＧｍｂＨ 最適化された種間特異的二重特異性単鎖抗体コンストラクト
JP2017529061A (ja) 2014-07-16 2017-10-05 ユーシービー バイオファルマ エスピーアールエル Ｃｄ４５及びｃｄ７９に対する特異性を有する分子

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI9909860B8 (pt) * 1998-04-21 2021-05-25 Amgen Res Munich Gmbh polipeptídeo multifuncional de cadeia simples, polinucleotídeo, vetor, célula procariótica, de levedura ou unicelular, composição, usos de polipeptídeo e polinucleotídeo e métodos para preparo do referido polipeptídeo e para identificação de ativadores ou inibidores de ativação ou estimulação das células t
RU2179862C1 (ru) * 2000-12-26 2002-02-27 Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственный центр "МедБиоСпектр" Лекарственное средство для предотвращения отторжения трансплантата, моноклональное антитело к cd3-антигену т-лимфоцитов человека, гибридома и способ лечения больных, имеющих реакцию острого отторжения трансплантата после пересадки почки
CN102250245B (zh) * 2010-05-27 2014-05-14 四川大学 抗b细胞淋巴瘤的双特异性抗体及其用途
AU2011373925B2 (en) 2011-07-22 2016-04-28 Affimed Therapeutics Ag Multivalent antigen-binding Fv molecule
CN104592393B (zh) * 2015-01-21 2018-09-28 武汉友芝友生物制药有限公司 一种双特异性抗体cd19×cd3的构建及应用
SG11201705476WA (en) * 2015-02-12 2017-09-28 Seattle Genetics Inc Combination therapy using a cd19-adc and vincristine
RU2651776C2 (ru) * 2015-12-01 2018-04-23 Общество с ограниченной ответственностью "Международный биотехнологический центр "Генериум" ("МБЦ "Генериум") Биспецифические антитела против cd3*cd19
CN107903324B (zh) * 2017-11-15 2021-01-29 北京绿竹生物技术股份有限公司 一种结合人cd19和cd3的双特异性抗体

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005517392A (ja) 2001-11-14 2005-06-16 アフィメート テラポイティクス アーゲー 二重特異性抗ｃｄ１９×抗ｃｄ１６抗体およびその使用
JP2014504272A (ja) 2010-11-10 2014-02-20 アムジェン リサーチ （ミュニック） ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ｃｄ３特異的結合ドメインによって引き起こされる有害作用の予防
JP2013543869A (ja) 2010-11-15 2013-12-09 メディミューン，エルエルシー Ｂ細胞リンパ腫のための併用療法
JP2014509861A (ja) 2011-03-16 2014-04-24 アルゲン−エックス ビー．ブイ． Ｃｄ７０に対する抗体
JP2015535828A (ja) 2012-09-21 2015-12-17 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 抗ｃｄ３抗体、ｃｄ３及びｃｄ２０に結合する二重特異性抗原結合分子、並びにそれらの使用
JP2017529061A (ja) 2014-07-16 2017-10-05 ユーシービー バイオファルマ エスピーアールエル Ｃｄ４５及びｃｄ７９に対する特異性を有する分子
JP2017526350A (ja) 2014-07-31 2017-09-14 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハーＡＭＧＥＮ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｍｕｎｉｃｈ）ＧｍｂＨ 最適化された種間特異的二重特異性単鎖抗体コンストラクト

Also Published As

Publication number Publication date
EP4036115A1 (en) 2022-08-03
CN114364698A (zh) 2022-04-15
EP4036115A4 (en) 2023-11-08
JP2022545041A (ja) 2022-10-24
RU2738802C1 (ru) 2020-12-17
CN114364698B (zh) 2024-05-28
CA3149929A1 (en) 2021-02-25
AU2020334700A1 (en) 2022-03-31
US20230212288A1 (en) 2023-07-06
WO2021034227A1 (ru) 2021-02-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11945879B2 (en) Multispecific antigens binding fragments and multispecific antibodies
JP6702893B2 (ja) 多重特異的抗原結合タンパク質
JP7118332B2 (ja) Ｖｉｓｔａ抗原結合性分子
US11873346B2 (en) VISTA antigen-binding molecules
Schiller et al. CD19-specific triplebody SPM-1 engages NK and γδ T cells for rapid and efficient lysis of malignant B-lymphoid cells
JP2017521400A (ja) 多重特異的ＮＫｐ４６結合タンパク質
JP2022538718A (ja) 二重特異性抗体及びその調製方法、使用
JP7365654B2 (ja) 抗ｃｌｄｎ４－抗ｃｄ１３７二重特異性抗体
JP2024511115A (ja) ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２０、及びＣＤ３を標的とする三重特異性抗体
JP7366242B2 (ja) Ｃｄ３結合のための相補性決定領域およびそのｃｄｒを含む二重特異性抗原結合分子
US20180371089A1 (en) Asymmetric heterodimeric fc-scfv fusion anti-globo h and anti-cd3 bispecific antibody and uses thereof in caner therapy
EA043994B1 (ru) Определяющие комплементарность участки для связывания cd3 и содержащая их биспецифическая антигенсвязывающая молекула
WO2024111635A1 (ja) 血液がんに対する抗体
US20240209108A1 (en) Anti-cldn4/anti-cd137 bispecific antibody
WO2024089622A1 (en) Adgre2 chimeric receptor nk cell compositions and methods of use

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220406

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20220406

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230328

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230628

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20230912

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20231010

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7366242

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150