JP7357950B2 - 新規のc-met及びtmx2抗体 - Google Patents
新規のc-met及びtmx2抗体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7357950B2 JP7357950B2 JP2021526745A JP2021526745A JP7357950B2 JP 7357950 B2 JP7357950 B2 JP 7357950B2 JP 2021526745 A JP2021526745 A JP 2021526745A JP 2021526745 A JP2021526745 A JP 2021526745A JP 7357950 B2 JP7357950 B2 JP 7357950B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- antibodies
- met
- human
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 101000851425 Homo sapiens Thioredoxin-related transmembrane protein 2 Proteins 0.000 title description 38
- 102100036927 Thioredoxin-related transmembrane protein 2 Human genes 0.000 title description 38
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 112
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 64
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 48
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 46
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 46
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 claims description 42
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 claims description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 41
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 29
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 claims description 29
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 19
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 19
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 18
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 13
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 12
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 11
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 31
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 24
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 22
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 20
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 20
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 20
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 18
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 18
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 18
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 16
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 16
- 108010089836 Proto-Oncogene Proteins c-met Proteins 0.000 description 16
- 102000008022 Proto-Oncogene Proteins c-met Human genes 0.000 description 16
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 12
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 12
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 12
- 102100030703 Interleukin-22 Human genes 0.000 description 11
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 11
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 108010074108 interleukin-21 Proteins 0.000 description 11
- 102400000432 CD40 ligand, soluble form Human genes 0.000 description 10
- 101800000267 CD40 ligand, soluble form Proteins 0.000 description 10
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 10
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 10
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 10
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 9
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 9
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 9
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 9
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 8
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 8
- 101000680015 Homo sapiens Thioredoxin-related transmembrane protein 1 Proteins 0.000 description 7
- 102100022169 Thioredoxin-related transmembrane protein 1 Human genes 0.000 description 7
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 7
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 7
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 7
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 6
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 101150047070 Ighg gene Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 4
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 4
- FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 238000003211 trypan blue cell staining Methods 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 101100504121 Mus musculus Ighg gene Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 2
- 230000037453 T cell priming Effects 0.000 description 2
- YTAHJIFKAKIKAV-XNMGPUDCSA-N [(1R)-3-morpholin-4-yl-1-phenylpropyl] N-[(3S)-2-oxo-5-phenyl-1,3-dihydro-1,4-benzodiazepin-3-yl]carbamate Chemical compound O=C1[C@H](N=C(C2=C(N1)C=CC=C2)C1=CC=CC=C1)NC(O[C@H](CCN1CCOCC1)C1=CC=CC=C1)=O YTAHJIFKAKIKAV-XNMGPUDCSA-N 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 210000005006 adaptive immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- 208000030270 breast disease Diseases 0.000 description 2
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 2
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N (8S)-8-amino-7-oxononanoic acid zwitterion Chemical compound C[C@H](N)C(=O)CCCCCC(O)=O GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 3-(2-methoxyethoxy)benzohydrazide Chemical compound COCCOC1=CC=CC(C(=O)NN)=C1 GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 102000011068 Cdc42 Human genes 0.000 description 1
- 108050001278 Cdc42 Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000972946 Homo sapiens Hepatocyte growth factor receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 206010020843 Hyperthermia Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 1
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 1
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 1
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 206010053159 Organ failure Diseases 0.000 description 1
- 102000038030 PI3Ks Human genes 0.000 description 1
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 238000010806 PrimeScriptTM RT Reagent kit Methods 0.000 description 1
- 101150058540 RAC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 102100022122 Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 Human genes 0.000 description 1
- 101500027983 Rattus norvegicus Octadecaneuropeptide Proteins 0.000 description 1
- 108010017324 STAT3 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100024040 Signal transducer and activator of transcription 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710203061 Thioredoxin-related transmembrane protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000004970 cd4 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000010001 cellular homeostasis Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000004041 dendritic cell maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- -1 e.g. Substances 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 102000057421 human MET Human genes 0.000 description 1
- 102000051632 human TMX2 Human genes 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036031 hyperthermia Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000002625 monoclonal antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 1
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0635—B lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2304—Interleukin-4 (IL-4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2306—Interleukin-6 (IL-6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/231—Interleukin-10 (IL-10)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2321—Interleukin-21 (IL-21)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/25—Tumour necrosing factors [TNF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/505—CD4; CD8
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
- C12N2502/1121—Dendritic cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells
- C12N2506/115—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells from monocytes, from macrophages
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
a)好ましくは血液から、末梢血単核細胞を単離するステップ;
b)単離された前記末梢血単核細胞から単核細胞を作製するステップ;
c)作製された前記単核細胞から未成熟樹状細胞を作製するステップ;
d)好ましくは血液から、CD4+細胞及びCD19+細胞を単離するステップ;
e)任意選択で、前記所定の抗原で、少なくとも、作製された前記未成熟樹状細胞をパルスするステップ;
f)前記未成熟樹状細胞、前記CD4+細胞及び前記CD19+細胞を共培養するステップ;
g)少なくとも前記所定の抗原で、少なくとも、共培養された前記未成熟樹状細胞、前記CD4+細胞及び前記CD19+細胞をパルスするステップ;
h)前記未成熟樹状細胞、前記CD4+細胞及び前記CD19+細胞をさらに共培養することにより、前記未成熟樹状細胞から成熟樹状細胞を作製するステップ;
i)プラズマ細胞の形成を誘導するステップ;
j)形成された前記プラズマ細胞においてIgクラススイッチを誘導するか又は誘導しないステップ
を含むプロセスを一般に提供することが本発明の目的である。
a)前記試料を上記の抗体と接触させるステップ、及び
b)前述した試料において前記抗体と前記ヒトc-metにより形成される抗体-抗原複合体の有無を検出するステップ
を含む方法を提供することが本発明のさらなる目的である。
c)前記試料を上記の抗体と接触させるステップ、及び
d)前述した試料において前記抗体と前記ヒトTMX-2により形成される抗体-抗原複合体の有無を検出するステップ
を含む方法を提供することが本発明のさらなる目的である。
a)好ましくは血液から、末梢血単核細胞を単離するステップ;
b)単離された前記末梢血単核細胞から単核細胞を作製するステップ;
c)作製された前記単核細胞から未成熟樹状細胞を作製するステップ;
d)好ましくは血液から、CD4+細胞及びCD19+細胞を単離するステップ;
e)任意選択で、前記所定の抗原で、少なくとも、作製された前記未成熟樹状細胞をパルスするステップ;
f)前記未成熟樹状細胞、前記CD4+細胞及び前記CD19+細胞を共培養するステップ;
g)少なくとも前記所定の抗原で、少なくとも、共培養された前記未成熟樹状細胞、前記CD4+細胞及び前記CD19+細胞をパルスするステップ;
h)前記未成熟樹状細胞、前記CD4+細胞及び前記CD19+細胞をさらに共培養することにより、前記未成熟樹状細胞から成熟樹状細胞を作製するステップ;
i)プラズマ細胞の形成を誘導するステップ;
j)形成された前記プラズマ細胞においてIgクラススイッチを誘導するか又は誘導しないステップ
を含むプロセスを一般に提供する。
IgGの判定
ELISAによるIgG分泌
分泌されたIgGは、ヒトIgG Elisa定量セット(Bethyl社製)により製造業者の使用説明書に従って判定した。簡潔に言えば、既知の濃度のヒト血清IgGを使用して標準曲線を作図した。それぞれの上澄み100μlを使用し、得られた標準曲線に基づいて、IgG濃度を算出した。使用した抗体はヒトIgGと特異的に反応し、他のヒト免疫グロブリン又は他のヒト血清タンパク質とは反応しない。吸光度は、uQuant Elisaマイクロプレート分光光度計を使用して450nmで読み取った。TMX2抗体についても同様に、同じプロトコルを使用した。ng/mlでのIgG濃度は、既知の濃度のヒトIgGに基づいてElisa免疫アッセイを使用して決定した。共培養上澄み中の平均IgG濃度は、4ng/mlであることが分かった。TMX2では、IgG濃度は50ng/mlであった。
次に、IgG分泌は標準ウェスタンブロットを使用して上澄みにおいて判定した。電気泳動後、試料はニトロセルロース膜上に転写した。膜はトリス緩衝生理食塩水(TBS)/Tween 20中において、5%ウシ血清アルブミン(BSA)で1時間ブロッキングし、次にヤギ抗ヒトIgG抗体を用いてプローブした。トリス緩衝生理食塩水(TBS)/Tween 20で洗浄後、適切な抗ヒトIgG-AP二次抗体と共に、膜をインキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)/Tweenで膜を再び洗浄し、発色現像が生じるまで、BCIP/NBT溶液を使用してシグナルを検出した。Image Labソフトウェアを使用して結果を検出し分析した。IgGの検出可能レベルは、抗体分泌を示す共培養上澄みにおいて見出した。
細胞由来の全RNAはRNeasyミニキットを使用して抽出し、DNA除去はDNaseを使用して実施した。試料は分光光度法で評価した。次に、1μgのそれぞれのRNA試料を、PrimeScript RT試薬キットを使用するcDNA合成用の鋳型として使用した。次に、リアルタイムqPCRを、KAPA SYBR Fast Master Mix(2×)Universalを使用して実施した。マーカーごとの特異的プライマー及び参照遺伝子(ACTB)は、Gene Expression 1.1ソフトウェアを使用して設計した。プライマー配列はBLASTサーチングにより評価して、望ましくない遺伝子を増幅すると考えられる配列を排除した(表1)。PCRプログラムは以下の通りである:95℃で3分間最初の変性、95℃で5秒間の変性を40サイクル、続いて59℃で10秒間のアニーリング。融解曲線分析は、それぞれのステップで、5秒間で0.5℃単位で、70℃から90℃まで実施した。qPCR産物をアガロースゲル上に流して結果を確認した。IGHG遺伝子発現に関しては、共培養の第1週中のほうが高く、第2週中に85%まで減少した。
ELISAにより
抗c-met試料の活性を、ELISAにより、市販の抗体と比較して決定した。簡潔に言えば、96ウェルプレートを、炭酸塩/重炭酸塩バッファー中でc-metタンパク質と共にインキュベートし、4℃で一晩インキュベートした。ウェルは洗浄バッファーで洗浄し、ブロッキングバッファーでブロッキングした。次に、100μlの上澄み又はc-met市販抗体を、それぞれのウェルに添加し、4℃で一晩インキュベートした。ウェルは洗浄バッファーで洗浄し、HRPコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG抗体又はHRPコンジュゲートヤギ抗マウスIgG抗体を添加した。次に、ウェルを洗浄バッファーで洗浄した。100μlのTMB基質溶液をそれぞれのウェルに添加し、暗所で30分間インキュベートした。反応は100μlの停止溶液を添加することにより停止させ、吸光度は、uQuantマイクロプレート分光光度計を使用して、450nmで測定した。TMX2抗体についても同様に、同じプロトコルを使用した。c-metタンパク質に対する共培養抗体を用いた吸光度は、同じ濃度のc-metに対する市販の抗体の吸光度と比較して決定した。結果は、100%最適結合効率として、市販の抗体の吸光度を使用して算出した。共培養抗体(Ab)の平均結合効率は12.7%であった。TMX2では、結合効率は20%であった。
5μgの組換えヒトc-metタンパク質を前述したのと同じように変性し電気泳動した。移動は10Vで1時間実施し、1時間ブロッキングした後、ブロッキングバッファーにおける培養上澄み(1対50)又は市販のヒトHGFR/c-metヤギポリクローナル抗体(Ab)により、膜をインキュベートした。インキュベーションは4℃で一晩実行した。適切なAP二次抗体を使用し、Image Labソフトウェアを使用して結果を分析した。本発明の抗体がシグナルバンドを生じるのに対して、市販のポリクローナル抗体は多数の部位を認識する。
抗体産生が可能であるプラズマ細胞作製では、最初の未成熟樹状細胞を単核細胞から作製し、適切なペプチドでパルスした。次に、未成熟樹状細胞を、CD4細胞及びCD19細胞の存在下で完全に成熟させた。CD4細胞は活性化し、CD19細胞は抗体産生プラズマ細胞に形質転換した。全手順の間中、細胞は、炎症性環境を模倣しIgGクラススイッチを促進する成長因子の存在下でインキュベートした。本発明の手順の概略図を図8に示す。
溶離したIgG/c-met陽性試料から採取した2mlを、200μlに濃縮するまで非熱、低乾燥速度で4時間スピードバック(speed vac)した。microBCAにより測定されたタンパク質含有量は12μg/mlであった。100μlはウェスタンブロットによるc-metタンパク質検出のために使用し、200μlはフローサイトメトリー用に使用した。簡潔に言えば、Abcam社製FITCコンジュゲーションキットを製造業者の使用説明書に従って使用して、200μlの濃縮試料をFITCにコンジュゲートした。次に、コンジュゲートした抗体(Ab)は、フローサイトメトリー分析用に使用した。
クロマトグラフィーカラムから得られた精製上澄みをウェスタンブロット実験の一次抗体として使用した。5μgのc-metタンパク質を10%のポリアクリルアミドゲルに流した。全体の手順は既に述べた通りに実施した。上澄みは、ブロッキングバッファーに1対50の割合で希釈した。結果はImage Labソフトウェアを使用して分析した。本発明の抗体は、やはり1つのc-metバンドだけを検出しており、抗体の高い選択性を実証している。
融合したCD138陽性細胞及びHUNS1からの上澄みを毎週収集し、c-met検出のために、Elisa及びウェスタンブロットを使用して同様に試験した。
100μlの融合上澄みを、既に述べた通りにElisaを使用して、c-met活性について試験した。融合抗体(Ab)の平均結合効率は9.3±3.8%ng/mlであった。融合細胞におけるIgG判定は、HUNS1が同様にIgGを分泌するという事実が原因で、行うことが出来なかった。
融合培養物から採取した上澄みは、既に記載したように、ウェスタンブロット実験の一次抗体として使用した。この場合も先と同様に、本発明の抗体は、c-metについて1つのバンドを検出した。
MCF-7細胞株を使用して抗体効率を試験した。細胞増殖に対する産生抗体の効果はMTTアッセイにより分析した。簡潔に言えば、10,000細胞/ウェルを、96ウェル組織培養プレートのそれぞれのウェルに添加し、付着させるために一晩放置した。細胞は、数週間連続で収集した融合CD138上澄みの存在下又は非存在下で肝細胞増殖因子(HGF)100ng/mlを用いて24時間処理した。インキュベーション期間後、20μl(5mg/ml)MTT試薬を添加し、ホルマザン結晶形成までインキュベーター内に3時間放置した。結晶は100μlのジメチルスルホキシド(DMSO)の添加により溶解させ、uQuant Elisa Readerを使用して、吸光度を570nmで読み取った。細胞生存率は、非処理の対照群と比較した、処理群における生存細胞の割合として表した。上澄み単独で、MCF-7の増殖において有意な減少が生じた(対照対融合上澄み、100±3.4%対55.3±3.3%、p=0.000005)。肝細胞増殖因子(HGF)の添加は、高い細胞密度が原因で、おそらく細胞増殖に影響を与えなかったが、肝細胞増殖因子(HGF)の存在下での融合上澄みの添加により、細胞増殖において有意な減少が生じた(肝細胞増殖因子(HGF)対肝細胞増殖因子(HGF)+融合上澄み、97.3±1.5%対65.1±3.9%、p=0.00015)。
図1の右から左へ順に説明する。
レーン1:分子量マーカー(santacruz社製)
レーン2:対照上澄み
レーン3:従前のプロトコル上澄み
レーン4:改良されたプロトコル上澄み
図3の右から左へ順に説明する。
レーン1:分子量マーカー(BioRad社製)
レーン2:市販のポリクローナル抗体
レーン3~6:種々の実験から得られた共培養上澄み
図5aの右から左へ順に説明する。
レーン1:分子量マーカー(santacruz社製)
レーン2~5:種々の精製抗c-met IgG抗体調製物
図5bの左から右へ順に説明する。
レーン1:分子量マーカー(santacruz社製)
レーン2:精製抗c-met IgG抗体調製物
レーン3:認識されたすべての種々のバンドを識別するために、c-metタンパク質を過剰に使用した市販のポリクローナル抗体
図6の右から左へ順に説明する。
レーン1:分子量マーカー(BioRad社製)
レーン2~4:種々の融合されたCD138上澄み
レーン5:市販の抗体
レーン6~9;種々の融合されたCD138上澄み
(対照例)対(融合された上澄み) p=0.000005、(肝細胞増殖因子(HGF))対(肝細胞増殖因子(HGF)+融合された上澄み) p=0.00015。
(対照例)対(実施例1のTMX-2抗体) p=0.004
(対照例)対(実施例1のTMX-2抗体) p=0.018
(対照例)対(TMX 0.1%):100対100.9、p値=NS
(対照例)対(TMX 0.5%):100対1005.9、p値=0.0007
(対照例)対(TMX 1%):100対101.1、p値=NS
(対照例)対(TMX 10%):100対114.7、p値=0.0001
(対照例)対(0.5% TMX) p=0.03
(対照例)対(0.1% TMX) p=0.0006
(対照例)対(0.05 % TMX) p=0.01
Claims (2)
- 所定の抗原に対するモノクローナルヒト抗体のヒト細胞による産生のためのプロセスであって、
a)血液から、末梢血単核細胞を単離するステップ;
b)単離された前記末梢血単核細胞から単核細胞を作製するステップ;
c)作製された前記単核細胞から未成熟樹状細胞を作製するステップ;
d)血液から、CD4+細胞及びCD19+細胞を単離するステップ;
e)任意選択で、前記所定の抗原で、少なくとも、作製された前記未成熟樹状細胞をパルスするステップ;
f)GM-CSF、IL-4、TNF-α、sCD40L、IL-6、IL-21、IL-10及び抗ヒトIgMの組合せを含む培養培地で、前記未成熟樹状細胞、前記CD4+細胞及び前記CD19+細胞を共培養するステップ;
g)少なくとも前記所定の抗原で、少なくとも、共培養された前記未成熟樹状細胞、前記CD4+細胞及び前記CD19+細胞をパルスするステップ;
h)前記未成熟樹状細胞、前記CD4+細胞及び前記CD19+細胞をさらに共培養することにより、前記未成熟樹状細胞から成熟樹状細胞を作製するステップ;
i)プラズマ細胞の形成を誘導するステップ;
j)形成された前記プラズマ細胞においてIgG発現に向けてIgクラススイッチを誘導するか又は誘導しないステップ
を含むプロセス。 - 前記形成されたプラズマ細胞が、がん細胞株との融合により、続いて不死化される、請求項1に記載のプロセス。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP18206795 | 2018-11-16 | ||
EP18206795.9 | 2018-11-16 | ||
PCT/EP2019/081597 WO2020099674A2 (en) | 2018-11-16 | 2019-11-18 | Novel c-met and tmx2 antibodies |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2022507621A JP2022507621A (ja) | 2022-01-18 |
JPWO2020099674A5 JPWO2020099674A5 (ja) | 2022-05-10 |
JP7357950B2 true JP7357950B2 (ja) | 2023-10-10 |
Family
ID=64604423
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021526745A Active JP7357950B2 (ja) | 2018-11-16 | 2019-11-18 | 新規のc-met及びtmx2抗体 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220002421A1 (ja) |
EP (1) | EP3880700A2 (ja) |
JP (1) | JP7357950B2 (ja) |
AU (1) | AU2019382143A1 (ja) |
CA (1) | CA3118418A1 (ja) |
WO (1) | WO2020099674A2 (ja) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011023705A1 (en) | 2009-08-24 | 2011-03-03 | Jansen, Gabriele | Production of monoclonal antibodies in vitro |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
HN2004000285A (es) * | 2003-08-04 | 2006-04-27 | Pfizer Prod Inc | ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET |
RU2008142833A (ru) * | 2006-03-30 | 2010-05-10 | Новартис АГ (CH) | КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ АНТИТЕЛ К c-Met |
US20130196380A1 (en) * | 2010-02-05 | 2013-08-01 | Wolfgang Lüeke | In vitro process for the preparation of antibodies of the igg type |
KR20120140097A (ko) * | 2011-06-20 | 2012-12-28 | 김현기 | 암 진단 및 치료용 조성물 및 방법 |
EP2574666A1 (en) * | 2011-09-23 | 2013-04-03 | Protealmmun GmbH | Method for producing antigen-specific antibodies via in vitro immunisation |
CA2877573A1 (en) * | 2012-06-21 | 2013-12-27 | Sorrento Therapeutics, Inc. | Antigen binding proteins that bind c-met |
-
2019
- 2019-11-18 US US17/292,907 patent/US20220002421A1/en active Pending
- 2019-11-18 JP JP2021526745A patent/JP7357950B2/ja active Active
- 2019-11-18 CA CA3118418A patent/CA3118418A1/en active Pending
- 2019-11-18 EP EP19816210.9A patent/EP3880700A2/en active Pending
- 2019-11-18 AU AU2019382143A patent/AU2019382143A1/en active Pending
- 2019-11-18 WO PCT/EP2019/081597 patent/WO2020099674A2/en unknown
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011023705A1 (en) | 2009-08-24 | 2011-03-03 | Jansen, Gabriele | Production of monoclonal antibodies in vitro |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Anticancer Research,2016年,Vol.36,pp.4613-4622,https://ar.iiarjournals.org/content/36/9/4613.longのPDFファイルを参照。 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3880700A2 (en) | 2021-09-22 |
WO2020099674A3 (en) | 2020-06-25 |
AU2019382143A1 (en) | 2021-05-20 |
WO2020099674A2 (en) | 2020-05-22 |
JP2022507621A (ja) | 2022-01-18 |
CA3118418A1 (en) | 2020-05-22 |
US20220002421A1 (en) | 2022-01-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20210095012A1 (en) | Anti-semaphorin 3a antibody and treatment of alzheimer's disease and inflammatory immune diseases using same | |
CA2696597C (en) | Foxm1 peptide and medicinal agent comprising the same | |
Chames et al. | TCR-like human antibodies expressed on human CTLs mediate antibody affinity-dependent cytolytic activity | |
JP2021514930A (ja) | 新型なscFvアミノ酸配列、それを含むキメラ抗原受容体、およびその使用 | |
TW201945544A (zh) | 靶向ctla-4抗體、其製備方法和用途 | |
Takenaka et al. | Dendritic cells derived from murine colonic mucosa have unique functional and phenotypic characteristics | |
EP1712563A1 (en) | Method of isolating monocytes | |
Erickson et al. | Tightly regulated induction of the adhesion molecule necl‐5/CD155 during rat liver regeneration and acute liver injury | |
Yagi et al. | Influence of retinoic acid on the differentiation pathway of T cells in the thymus | |
JP7357950B2 (ja) | 新規のc-met及びtmx2抗体 | |
JP2023525931A (ja) | 新規なcov-2抗体 | |
WO2022004805A1 (ja) | Nk細胞と抗体との結合を安定化する方法、及びその利用 | |
CN114917329A (zh) | 抗cd87抗体与抗pd1抗体联合治疗胃癌 | |
CN109529040A (zh) | LGR4和R-spondin结合抑制剂及其在肿瘤治疗中的用途 | |
WO2023195532A1 (ja) | ヒトtim-3およびヒトcd39に対する二重特異性抗体およびその用途 | |
Hatzidaki et al. | A novel platform for the production of autologous human antibodies | |
Cojocaru et al. | Characterization of BAY 1905254, an immune checkpoint inhibitor targeting the immunoglobulin-like domain containing receptor 2 (ILDR2) | |
CN116457018A (zh) | Herv-k抗体治疗剂 | |
Muramatsu et al. | Biology of Blood and Marrow Transplantation | |
Middelburg et al. | The MHC-E Peptide Ligand of Checkpoint NKG2A Is Governed by Inflammatory Signals and High Turnover | |
Gauldie et al. | Dendritic Cells Derived from Murine Colonic |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220414 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220414 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220426 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230322 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20230329 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230531 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230822 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230920 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7357950 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |