JP7348888B2 - 化合物の光遺伝学的分析 - Google Patents
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Description
この出願は、2014年4月22日に出願された、米国仮特許出願第61/982,589号の利益および優先権を主張し、その内容は、参照によって援用される。
本発明は、化合物を、ニューロン細胞に対するそれらの効果について光学的にスクリーニングする方法に関する。
者または国による、一生にわたるケアを必要とする。自閉症は、遺伝学的特徴と強く結びついているが、また、環境因子の影響を受ける場合もある。自閉症は、神経細胞およびそれらのシナプスが、接続され、組織化される様式を変化させることにより、脳内の情報処理に影響を及ぼすが、正確な機構は未知である。
できた。このような補正剤分子は、ミトコンドリアの機能障害およびニューロンの機能不全を低減しうることが仮定されている。しかし、このような仮説について調べるには、この疾患を研究するための、扱いやすいモデルが必要とされる。神経疾患のモデル化への主要な障害は、臨床的に関与性の細胞モデルの入手である。このため、補正剤分子または他の任意の化合物により、アルツハイマー病による損傷から細胞を保護しうるのかどうかは、今後の課題である。
「Dravet syndrome patient-derived neurons suggest a novel epilepsy mechanism」、Ann Neurol.、74巻:128~139頁)。残念ながら、ニューロン(例えば、細胞内カルシウムレベルの変化または活動電位の発生)についての、詳細な、in vitroにおけるモニタリングは、複雑かつ困難である。
neurons, reduced myelination, seizure activity, and limited survival」
、J Neurosci.、27巻(21号):5546~58頁;Meikleら、2008年、「Response of a neuronal model of tuberous sclerosis to mammalian target of
rapamycin (mTOR) inhibitors: effects on mTORCl and Akt signaling lead
to improved survival and function」、J Neurosci.、28巻(21号):54
22~32頁;Normandら、2013年、「Temporal and mosaic Tscl deletion in
the developing thalamus disrupts thalamocortical circuitry, neural function, and behavior」、Neuron、5;78巻(5号):895~909頁;Kimら、2
010年、「Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin」、Dis Model
Mech.、4巻(2号):255~67頁を参照されたい。しかし、動物研究は、費用が
かさみ、時間がかかり、ヒト疾患機構を正確にモデル化できない可能性がある。結節性硬化症についての細胞モデルは限定的なものであるが、TSC2ang1については、将来性が示されている。その全体において組み込まれる、Wlodarskiら、2008年、「Tuberin-heterozygous cell line TSC2angl as a model for tuberous sclerosis-associated skin lesions」、Int J Mol Med.、21巻(2号):245~50頁を参照されたい。残念ながら、ニューロン(例えば、細胞内カルシウムレベルの変化または活動電位の発生)についての、詳細な、in vitroにおけるモニタリングは、複雑かつ困難である。結節性硬化症およびそのニューロンへの影響をよりよく理解するために、より優れた手法が必要とされている。
についての光レポーターを発現するステップと、前記化合物の提示の後で、試料中の光依存性イオンチャネル(light-gated ion channel)の光学的刺激に応答して光レポータ
ーにより発せられる光シグナルを、(顕微鏡検査システムを介して)受け取るステップとを含む。前記光シグナルに基づき、化合物を、神経学的状態を処置するための候補として同定する。光依存性イオンチャネルは、複数のニューロンのうちの少なくとも1つとシナプス連絡した第2のニューロンによって発現される藻類チャネルロドプシンを含みうる。光依存性イオンチャネルは、複数のニューロンのうちの少なくとも1つによって発現される藻類チャネルロドプシンを含みうる。膜電位についての光レポーターは、微生物型ロドプシン(例えば、微生物型ロドプシンの野生型形態と比べて1~10の間のアミノ酸置換を有する)を含みうる。一部の実施形態では、複数のニューロンのうちの少なくとも1つはまた、細胞内カルシウムレベルについての遺伝子コード型インジケーターも発現する。受け取られた光シグナルは、細胞内カルシウムレベルについての遺伝子コード型インジケーターからのシグナルを含みうる。神経学的状態は、自閉症、てんかん、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、および結節性硬化症のうちの1つでありうる。
1.自閉症
resource for autism research」、Nucleic Acids Res.(データベース号):D
832~D836頁を参照されたい。
ッピングするのにも使用することができる。方法は、観察されたシグナルと予測されるシグナルとの間の差異を、観察および分析するステップを含みうる。差異は、対照と比べた細胞の刺激に応答する電位スパイクの確率の減少または増大、細胞内のシグナルの伝播の変化、シナプス伝達のときのシグナル変換の変化、または活動電位の波形の変化として顕在化しうる。
動物細胞のうちの少なくとも一部は、遺伝子コード型Ca++インジケーターを発現しうる。
2.てんかん
3.アルツハイマー病
4.筋萎縮性側索硬化症
5.結節性硬化症
6.イオンチャネルモジュレーター
7.単一因子細胞
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
アルツハイマー病を処置するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
化合物を、アルツハイマー病の1または複数の表現型特徴または遺伝子型特徴を有するニューロン細胞を含む試料へと提示するステップであって、該ニューロン細胞が、膜電位についての光レポーターおよび光依存性イオンチャネルを発現するステップと;
該化合物の提示の後で、該試料の光学的刺激に応答して該光レポーターにより発せられる光シグナルを、顕微鏡検査システムを介して受け取るステップと;
該光シグナルに基づき、該化合物を、アルツハイマー病を処置するための候補として同定するステップと
を含む方法。
(項目2)
前記表現型特徴が、アミロイドβおよび過リン酸化タウタンパク質の細胞外沈着から選択される、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記遺伝子型特徴が、アミロイド前駆体タンパク質(APP)、プレセニリン1(PS1)、およびプレセニリン2(PS2)からなる群から選択される遺伝子における変異を含む、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記顕微鏡検査システムが、前記光学的刺激をもたらすディジタル式マイクロミラーデバイスを含む、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記顕微鏡検査システムが、前記ニューロン細胞からの前記光シグナルを捕捉するように構成された電荷結合素子カメラをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記ニューロン細胞がまた、細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質も発現する、項目1に記載の方法。
(項目7)
前記ニューロン細胞を、前記光依存性イオンチャネルを発現する第2のニューロン細胞により刺激する、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記第2のニューロン細胞がまた、膜電位についての前記光レポーターも発現する、項目7に記載の方法。
(項目9)
前記光依存性イオンチャネルが、藻類チャネルロドプシンを含み;
細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質が、GCaMPバリアントを含む、
項目6に記載の方法。
(項目10)
前記ニューロン細胞が、hiPSC由来のニューロンである、項目1に記載の方法。
(項目11)
前記ニューロン細胞を前記化合物へと曝露したときのAP波形の変化および前記細胞内カルシウムレベルの変化を検出するステップをさらに含む、項目6に記載の方法。
(項目12)
複数のニューロン細胞を、基材上の細胞培養物において、空間的にパターン化させるステップをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目13)
前記光シグナルを得るステップを、光学顕微鏡検査システムを使用して実施する、項目1に記載の方法。
(項目14)
前記光学顕微鏡検査システムが、少なくとも1つのディジタル式マイクロミラーデバイスを含む、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記光シグナルを分析するステップが、前記化合物のAP波形に対する効果を検出することを含む、項目1に記載の方法。
(項目16)
前記細胞培養物を、β-アミロイド1~42ならびに前記化合物へと曝露するステップと、作用物質を有する前記化合物の前記ニューロンに対する効果を決定するステップとをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目17)
光遺伝学的アクチュエーターを発現する第1のニューロンと;
該第1のニューロンと電気的に近接する第2のニューロンであって、活動についての遺伝子コード型光レポーターを発現する第2のニューロンと
を含み、
該第1のニューロンまたは該第2のニューロンのうちの少なくとも1つが、アルツハイマー病の1または複数の表現型特徴または遺伝子型特徴を有する、
細胞培養物。
(項目18)
前記表現型特徴が、アミロイドβおよび過リン酸化タウタンパク質の細胞外沈着から選択される、項目17に記載の細胞培養物。
(項目19)
前記遺伝子型特徴が、アミロイド前駆体タンパク質(APP)、プレセニリン1(PS1)、およびプレセニリン2(PS2)からなる群から選択される遺伝子における変異を含む、項目17に記載の細胞培養物。
(項目20)
前記光遺伝学的アクチュエーターが、チャネルロドプシンを含む、項目17に記載の細胞培養物。
(項目21)
活動についての前記遺伝子コード型光レポーターが、膜電位についての微生物型光レポーターを含む、項目17に記載の細胞培養物。
(項目22)
前記第2のニューロンが、遺伝子コード型Ca++インジケーターを発現する、項目21に記載の細胞培養物。
(項目23)
前記遺伝子コード型Ca++インジケーターが、GCaMP6f、jRCaMP1a、jRGECO1a、およびRCaMP2からなるリストから選択される少なくとも1つを含む、項目22に記載の細胞培養物。
(項目24)
前記第1のニューロンが、前記第2のニューロンから空間的に分けられているが、該第2の運動ニューロンと電気的に接触している、項目17に記載の細胞培養物。
(項目25)
活動についての前記遺伝子コード型光レポーターが、膜電位についての微生物型光レポーターを含む、項目24に記載の細胞培養物。
(項目26)
前記第2のニューロンが、遺伝子コード型Ca++インジケーターを発現する、項目25に記載の細胞培養物。
(項目27)
前記遺伝子コード型Ca++インジケーターが、GCaMP6f、jRCaMP1a、jRGECO1a、およびRCaMP2からなるリストから選択される少なくとも1つを含む、項目26に記載の細胞培養物。
(項目28)
自閉症を処置するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
化合物を、自閉症の1または複数の表現型特徴または遺伝子型特徴を有するニューロンを含む試料へと提示するステップであって、該ニューロンが、膜電位についての光レポーターおよび光依存性イオンチャネルを発現するステップと;
該化合物の提示の後で、該試料の光学的刺激に応答して該光レポーターにより発せられる光シグナルを、顕微鏡検査システムを介して受け取るステップと;
該光シグナルに基づき、該化合物を、自閉症を処置するための候補として同定するステップと
を含む方法。
(項目29)
前記表現型特徴が、無病ニューロンと比較したSHANK3タンパク質の発現の低減、無病ニューロンと比較したシナプス機能の低下、無病ニューロンと比較した樹状突起棘の数の低減および長さの増大、ならびに無病ニューロンと比較したシナプス後肥厚部の厚さおよび長さの低減からなる群から選択される、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記遺伝子型特徴が、SHANK3、CDH9、CDH10、MAPK3、SERT、CACNA1G、GABRB3、GABRA4、EN2、3q25~27遺伝子座、SLC25A12、HOXA1、HOXA2、PRKCB1、MECP2、UBE3A、NLGN3、MET、CNTNAP2、FOXP2、GSTP1、PRL、PRLR、およびOXTRからなる群から選択される遺伝子における変異を含む、項目28に記載の方法。
(項目31)
前記顕微鏡検査システムが、前記光学的刺激をもたらすディジタル式マイクロミラーデバイスを含む、項目28に記載の方法。
(項目32)
前記顕微鏡検査システムが、前記ニューロンからの前記光シグナルを捕捉するように構成された電荷結合素子カメラをさらに含む、項目28に記載の方法。
(項目33)
前記ニューロンがまた、細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質も発現する、項目28に記載の方法。
(項目34)
前記ニューロンを、前記光依存性イオンチャネルを発現する第2のニューロンにより刺激する、項目33に記載の方法。
(項目35)
前記第2のニューロンがまた、膜電位についての前記光レポーターも発現する、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記光依存性イオンチャネルが、藻類チャネルロドプシンを含み;
細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質が、GCaMPバリアントを含む、
項目33に記載の方法。
(項目37)
細胞内カルシウムレベルの変化を報告する前記タンパク質が、jRCaMP1a、jRGECO1a、およびRCaMP2からなる群から選択される、項目33に記載の方法。
(項目38)
前記ニューロンが、hiPSC由来のニューロンである、項目28に記載の方法。
(項目39)
前記ニューロンを前記化合物へと曝露したときのAP波形の変化および前記細胞内カルシウムレベルの変化を検出するステップをさらに含む、項目33に記載の方法。
(項目40)
複数のニューロンを、基材上の細胞培養物において、空間的にパターン化させるステップをさらに含む、項目28に記載の方法。
(項目41)
前記光依存性イオンチャネルが、<450nmの波長で励起極大を有する青方偏移アクチュエーターを含み、前記細胞内カルシウムレベルの前記変化を報告する前記タンパク質が、端点を含む520nm~570nmの間で励起極大を有する赤方偏移カルシウムインジケーターを含む、項目33に記載の方法。
(項目42)
前記同定するステップが、前記試料の前記光シグナルを、対照細胞から得られる光シグナルと比較することを含む、項目28に記載の方法。
(項目43)
膜電位についての前記光レポーターが、微生物型ロドプシンを含む、項目28に記載の方法。
(項目44)
前記微生物型ロドプシンが、QuasAr1またはQuasAr2を含む、項目43に記載の方法。
(項目45)
前記微生物型ロドプシンを、前記ニューロンへと組み入れられた遺伝子から発現させる、項目43に記載の方法。
(項目46)
前記光依存性イオンチャネルが、青方偏移アクチュエーターを含む、項目28に記載の方法。
(項目47)
前記青方偏移アクチュエーターが、TsChRまたはPsChRを含む、項目46に記載の方法。
(項目48)
光依存性イオンチャネルを発現する第1のニューロンと;
該第1のニューロンと電気的に近接する第2のニューロンであって、活動についての遺伝子コード型光レポーターを発現する第2のニューロンと
を含み、
該第1のニューロンまたは該第2のニューロンのうちの少なくとも1つが、自閉症の1または複数の表現型特徴または遺伝子型特徴を含む、
細胞培養物。
(項目49)
前記表現型特徴が、無病ニューロンと比較したSHANK3タンパク質の発現の低減、無病ニューロンと比較したシナプス機能の低下、無病ニューロンと比較した樹状突起棘の数の低減および長さの増大、ならびに無病ニューロンと比較したシナプス後肥厚部の厚さおよび長さの低減からなる群から選択される、項目48に記載の細胞培養物。
(項目50)
前記遺伝子型特徴が、SHANK3、CDH9、CDH10、MAPK3、SERT、CACNA1G、GABRB3、GABRA4、EN2、3q25~27遺伝子座、SLC25A12、HOXA1、HOXA2、PRKCB1、MECP2、UBE3A、NLGN3、MET、CNTNAP2、FOXP2、GSTP1、PRL、PRLR、およびOXTRからなる群から選択される遺伝子における変異を含む、項目48に記載の細胞培養物。
(項目51)
前記光依存性イオンチャネルが、チャネルロドプシンを含む、項目48に記載の細胞培養物。
(項目52)
前記第2のニューロンが、遺伝子コード型Ca++インジケーターを発現する、項目48に記載の細胞培養物。
(項目53)
てんかんを処置するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
化合物を、てんかんの1または複数の表現型特徴または遺伝子型特徴を有するニューロンを含む試料へと提示するステップであって、該ニューロンが、膜電位についての光レポーターおよび光依存性イオンチャネルを発現するステップと;
該化合物の提示の後で、該試料の光学的刺激に応答して該光レポーターにより発せられる光シグナルを、顕微鏡検査システムを介して受け取るステップと;
該光シグナルに基づき、該化合物を、てんかんを処置するための候補として同定するステップと
を含む方法。
(項目54)
前記表現型特徴が、無病ニューロンと比較した電位依存性ナトリウムチャネル機能の減損および過剰興奮性からなる群から選択される、項目53に記載の方法。
(項目55)
前記遺伝子型特徴が、SCN1A、WWOX、PRRT2、KCNC1、STX1B、CARS2、STXB1、KCNQ2、CDKL5、ARX、SPTAN、BRAT1、KCNQ3、SCN2A、GABA受容体、NIPA2、CDKL5、PCDH19、およびNAV1.1からなる群から選択される遺伝子における変異を含む、項目53に記載の方法。
(項目56)
前記顕微鏡検査システムが、前記光学的刺激をもたらすディジタル式マイクロミラーデバイスを含む、項目53に記載の方法。
(項目57)
前記顕微鏡検査システムが、前記ニューロンからの前記光シグナルを捕捉するように構成された電荷結合素子カメラをさらに含む、項目53に記載の方法。
(項目58)
前記ニューロンがまた、細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質も発現する、項目53に記載の方法。
(項目59)
前記ニューロンを、前記光依存性イオンチャネルを発現する第2のニューロンにより刺激する、項目58に記載の方法。
(項目60)
前記第2のニューロンがまた、膜電位についての前記光レポーターも発現する、項目59に記載の方法。
(項目61)
前記光依存性イオンチャネルが、藻類チャネルロドプシンを含み;
細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質が、GCaMPバリアントを含む、
項目60に記載の方法。
(項目62)
細胞内カルシウムレベルの変化を報告する前記タンパク質が、jRCaMP1a、jRGECO1a、およびRCaMP2からなる群から選択される、項目58に記載の方法。
(項目63)
前記ニューロンが、hiPSC由来のニューロンである、項目53に記載の方法。
(項目64)
前記ニューロンを前記化合物へと曝露したときのAP波形の変化および前記細胞内カルシウムレベルの変化を検出するステップをさらに含む、項目58に記載の方法。
(項目65)
複数のニューロンを、基材上の細胞培養物において、空間的にパターン化させるステップをさらに含む、項目53に記載の方法。
(項目66)
前記化合物が、ラコサミドまたはレベチラセタムを含む、項目53に記載の方法。
(項目67)
前記同定するステップが、前記試料の前記光シグナルを、対照細胞から得られる光シグナルと比較することを含む、項目53に記載の方法。
(項目68)
膜電位についての前記光レポーターが、微生物型ロドプシンを含む、項目53に記載の方法。
(項目69)
前記微生物型ロドプシンが、QuasAr1またはQuasAr2を含む、項目68に記載の方法。
(項目70)
前記微生物型ロドプシンを、前記ニューロンへと組み入れられた遺伝子から発現させる、項目68に記載の方法。
(項目71)
前記光依存性イオンチャネルが、青方偏移アクチュエーターを含む、項目53に記載の方法。
(項目72)
前記青方偏移アクチュエーターが、TsChRまたはPsChRを含む、項目71に記載の方法。
(項目73)
前記光依存性イオンチャネルが、<450nmの波長で励起極大を有する青方偏移アクチュエーターを含み、前記細胞内カルシウムレベルの前記変化を報告する前記タンパク質が、端点を含む520nm~570nmの間で励起極大を有する赤方偏移カルシウムインジケーターを含む、項目58に記載の方法。
(項目74)
光依存性イオンチャネルを発現する第1のニューロンと;
該第1のニューロンと電気的に近接する第2のニューロンであって、活動についての遺伝子コード型光レポーターを発現する第2のニューロンと
を含み、
該第1のニューロンまたは該第2のニューロンのうちの少なくとも1つが、てんかんの1または複数の表現型特徴または遺伝子型特徴を含む、
細胞培養物。
(項目75)
前記表現型特徴が、無病ニューロンと比較した電位依存性ナトリウムチャネル機能の減損および過剰興奮性からなる群から選択される、項目74に記載の細胞培養物。
(項目76)
前記遺伝子型特徴が、SCN1A、WWOX、PRRT2、KCNC1、STX1B、CARS2、STXB1、KCNQ2、CDKL5、ARX、SPTAN、BRAT1、KCNQ3、SCN2A、GABA受容体、NIPA2、CDKL5、PCDH19、およびNAV1.1からなる群から選択される遺伝子における変異を含む、項目74に記載の細胞培養物。
(項目77)
前記光依存性イオンチャネルが、チャネルロドプシンを含む、項目74に記載の細胞培養物。
(項目78)
前記第2のニューロンが、遺伝子コード型Ca++インジケーターを発現する、項目74に記載の細胞培養物。
(項目79)
前記遺伝子コード型Ca++インジケーターが、GCaMP6f、jRCaMP1a、jRGECO1a、およびRCaMP2からなるリストから選択される少なくとも1つを含む、項目78に記載の細胞培養物。
(項目80)
前記第1のニューロンが、前記第2のニューロンから空間的に分けられ、かつ、該第2の運動ニューロンと電気的に接触している、項目74に記載の細胞培養物。
(項目81)
結節性硬化症を処置するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
化合物を、結節性硬化症の1または複数の表現型特徴または遺伝子型特徴を有するニューロンを含む試料へと提示するステップであって、該ニューロンが、膜電位についての光レポーターおよび光依存性イオンチャネルを発現するステップと;
該化合物の提示の後で、該試料の光学的刺激に応答して該光レポーターにより発せられる光シグナルを、顕微鏡検査システムを介して受け取るステップと;
該光シグナルに基づき、該化合物を、結節性硬化症を処置するための候補として同定するステップと
を含む方法。
(項目82)
前記表現型特徴が、無病ニューロンと比較したサイズの肥大、ホスホ-S6発現の増大、顕著なリソソーム、無病ニューロンと比較したより多いマイクロフィラメントおよび微小管、無病ニューロンと比較したより少ないリポフスチン顆粒、およびTSC2遺伝子産物、ツベリン、ビメンチン、またはグリア線維性酸性タンパク質に対する免疫反応性からなる群から選択される、項目81に記載の方法。
(項目83)
前記遺伝子型特徴が、TSC1またはTSC2からなる群から選択される遺伝子における変異を含む、項目81に記載の方法。
(項目84)
前記顕微鏡検査システムが、前記光学的刺激をもたらすディジタル式マイクロミラーデバイスを含む、項目81に記載の方法。
(項目85)
前記顕微鏡検査システムが、前記ニューロンからの前記光シグナルを捕捉するように構成された電荷結合素子カメラをさらに含む、項目81に記載の方法。
(項目86)
前記ニューロンがまた、細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質も発現する、項目81に記載の方法。
(項目87)
前記ニューロンを、前記光依存性イオンチャネルを発現する第2のニューロンにより刺激する、項目86に記載の方法。
(項目88)
前記第2のニューロンがまた、膜電位についての前記光レポーターも発現する、項目87に記載の方法。
(項目89)
前記光依存性イオンチャネルが、藻類チャネルロドプシンを含み;
細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質が、GCaMPバリアントを含む、
項目88に記載の方法。
(項目90)
細胞内カルシウムレベルの変化を報告する前記タンパク質が、jRCaMP1a、jRGECO1a、およびRCaMP2からなる群から選択される、項目86に記載の方法。
(項目91)
前記ニューロンが、hiPSC由来のニューロンである、項目81に記載の方法。
(項目92)
前記ニューロンを前記化合物へと曝露したときのAP波形の変化および前記細胞内カルシウムレベルの変化を検出するステップをさらに含む、項目86に記載の方法。
(項目93)
複数のニューロンを、基材上の細胞培養物において、空間的にパターン化させるステップをさらに含む、項目81に記載の方法。
(項目94)
前記光依存性イオンチャネルが、<450nmの波長で励起極大を有する青方偏移アクチュエーターを含み、前記細胞内カルシウムレベルの前記変化を報告する前記タンパク質が、端点を含む520nm~570nmの間で励起極大を有する赤方偏移カルシウムインジケーターを含む、項目86に記載の方法。
(項目95)
前記同定するステップが、前記試料の前記光シグナルを、対照細胞から得られる光シグナルと比較することを含む、項目81に記載の方法。
(項目96)
膜電位についての前記光レポーターが、微生物型ロドプシンを含む、項目81に記載の方法。
(項目97)
前記微生物型ロドプシンが、QuasAr1またはQuasAr2を含む、項目96に記載の方法。
(項目98)
前記微生物型ロドプシンを、前記ニューロンへと組み入れられた遺伝子から発現させる、項目96に記載の方法。
(項目99)
前記光依存性イオンチャネルが、青方偏移アクチュエーターを含む、項目81に記載の方法。
(項目100)
化合物の神経学的状態に対する効果を決定するための方法であって、
化合物を、複数のニューロンを含む試料へと提示するステップであって、該複数のニューロンのうちの少なくとも1つが、膜電位についての光レポーターを発現するステップと;
該化合物の提示の後で、該試料中の光依存性イオンチャネルの光学的刺激に応答して該光レポーターにより発せられる光シグナルを、顕微鏡検査システムを介して受け取るステップと;
該光シグナルに基づき、該化合物を、該神経学的状態を処置するための候補として同定するステップと
を含む方法。
(項目101)
前記光依存性イオンチャネルが、前記複数のニューロンのうちの前記少なくとも1つとシナプス連絡した第2のニューロンによって発現される藻類チャネルロドプシンを含み、膜電位についての前記光レポーターが、微生物型ロドプシンの野生型形態と比べて1~10の間のアミノ酸置換を有する微生物型ロドプシンを含む、項目100に記載の方法。
(項目102)
前記複数のニューロンのうちの前記少なくとも1つがまた、細胞内カルシウムレベルについての遺伝子コード型インジケーターも発現し、
前記受け取られた光シグナルが、細胞内カルシウムレベルについての該遺伝子コード型インジケーターからのシグナルを含み、さらに、前記神経学的状態が、自閉症、てんかん、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、および結節性硬化症のうちの1つである、
項目101に記載の方法。
(項目103)
光依存性イオンチャネルを発現する第1のニューロンと;
該第1のニューロンと電気的に近接する第2のニューロンであって、活動についての遺伝子コード型光レポーターを発現する第2のニューロンと
を含み、
該第1のニューロンまたは該第2のニューロンのうちの少なくとも1つが、結節性硬化症の1または複数の表現型特徴または遺伝子型特徴を含む、
細胞培養物。
(項目104)
前記表現型特徴が、無病ニューロンと比較したサイズの肥大、ホスホ-S6発現の増大、顕著なリソソーム、無病ニューロンと比較したより多いマイクロフィラメントおよび微小管、無病ニューロンと比較したより少ないリポフスチン顆粒、およびTSC2遺伝子産物、ツベリン、ビメンチン、またはグリア線維性酸性タンパク質に対する免疫反応性からなる群から選択される、項目103に記載の細胞培養物。
(項目105)
前記遺伝子型特徴が、TSC1またはTSC2からなる群から選択される遺伝子における変異を含む、項目103に記載の細胞培養物。
(項目106)
前記光依存性イオンチャネルが、チャネルロドプシンを含む、項目103に記載の細胞培養物。
(項目107)
前記第2のニューロンが、遺伝子コード型Ca++インジケーターを発現する、項目103に記載の細胞培養物。
(項目108)
前記遺伝子コード型Ca++インジケーターが、GCaMP6f、jRCaMP1a、jRGECO1a、およびRCaMP2からなるリストから選択される少なくとも1つを含む、項目107に記載の細胞培養物。
(項目109)
前記第1のニューロンが、前記第2のニューロンから空間的に分けられ、かつ、該第2の運動ニューロンと電気的に接触している、項目103に記載の細胞培養物。
(項目110)
ALSを処置するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
化合物を、ALSの1または複数の表現型特徴または遺伝子型特徴を有する運動ニューロンを含む試料へと提示するステップであって、該運動ニューロンが、膜電位についての光レポーターおよび光依存性イオンチャネルを発現するステップと;
該化合物の提示の後で、該試料の光学的刺激に応答して該光レポーターにより発せられる光シグナルを、顕微鏡検査システムを介して受け取るステップと;
該光シグナルに基づき、該化合物を、ALSを処置するための候補として同定するステップと
を含む方法。
(項目111)
前記表現型特徴が、ブニナ小体、レビー小体様封入体(LBI)、スケイン様封入体(SLI)の存在、変性の徴候、神経突起の短縮または非存在、細胞体の空胞化、核の断片化、および切断型カスパーゼ3からなる群から選択される、項目110に記載の方法。
(項目112)
前記遺伝子型特徴が、C9orf72、SOD1、TARDBP、FUS、UBQL2、ALS2、およびSETXからなる群から選択される遺伝子における変異を含む、項目110に記載の方法。
(項目113)
前記顕微鏡検査システムが、前記光学的刺激をもたらすディジタル式マイクロミラーデバイスを含む、項目110に記載の方法。
(項目114)
前記顕微鏡検査システムが、前記運動ニューロンからの前記光シグナルを捕捉するように構成された電荷結合素子カメラをさらに含む、項目110に記載の方法。
(項目115)
前記運動ニューロンがまた、細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質も発現する、項目110に記載の方法。
(項目116)
前記運動ニューロンを、前記光依存性イオンチャネルを発現する第2のニューロンにより刺激する、項目115に記載の方法。
(項目117)
前記第2のニューロンがまた、膜電位についての前記光レポーターも発現する、項目116に記載の方法。
(項目118)
前記光依存性イオンチャネルが、藻類チャネルロドプシンを含み;
細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質が、GCaMPバリアントを含む、
項目117に記載の方法。
(項目119)
細胞内カルシウムレベルの変化を報告する前記タンパク質が、jRCaMP1a、jRGECO1a、およびRCaMP2からなる群から選択される、項目115に記載の方法。
(項目120)
前記運動ニューロンが、hiPSC由来の運動ニューロンである、項目110に記載の方法。
(項目121)
前記運動ニューロンを前記化合物へと曝露したときのAP波形の変化および前記細胞内カルシウムレベルの変化を検出するステップをさらに含む、項目115に記載の方法。
(項目122)
複数のニューロンを、基材上の細胞培養物において、空間的にパターン化させるステップをさらに含む、項目110に記載の方法。
(項目123)
前記光依存性イオンチャネルが、<450nmの波長で励起極大を有する青方偏移アクチュエーターを含み、前記細胞内カルシウムレベルの前記変化を報告する前記タンパク質が、端点を含む520nm~570nmの間で励起極大を有する赤方偏移カルシウムインジケーターを含む、項目115に記載の方法。
(項目124)
前記同定するステップが、前記試料の前記光シグナルを、対照細胞から得られる光シグナルと比較することを含む、項目110に記載の方法。
(項目125)
膜電位についての前記光レポーターが、微生物型ロドプシンを含む、項目110に記載の方法。
(項目126)
前記微生物型ロドプシンが、QuasAr1またはQuasAr2を含む、項目125に記載の方法。
(項目127)
前記微生物型ロドプシンを、前記運動ニューロンへと組み入れられた遺伝子から発現させる、項目125に記載の方法。
(項目128)
前記光依存性イオンチャネルが、青方偏移アクチュエーターを含む、項目110に記載の方法。
(項目129)
前記青方偏移アクチュエーターが、TsChRまたはPsChRを含む、項目128に記載の方法。
(項目130)
光依存性イオンチャネルを発現する第1の運動ニューロンと;
該第1のニューロンと電気的に近接する第2のニューロンであって、活動についての遺伝子コード型光レポーターを発現する第2のニューロンと
を含み、
前記第1の運動ニューロンまたは前記第2の運動ニューロンのうちの少なくとも1つが、ALSの1または複数の表現型特徴または遺伝子型特徴を含む、
細胞培養物。
(項目131)
前記表現型特徴が、ブニナ小体、レビー小体様封入体(LBI)、スケイン様封入体(SLI)、変性の徴候、神経突起の短縮または非存在、細胞体の空胞化、核の断片化、および切断型カスパーゼ3からなる群から選択される、項目130に記載の細胞培養物。
(項目132)
前記遺伝子型特徴が、C9orf72、SOD1、TARDBP、FUS、UBQL2、ALS2、およびSETXからなる群から選択される遺伝子における変異を含む、項目130に記載の細胞培養物。
(項目133)
前記光依存性イオンチャネルが、チャネルロドプシンを含む、項目130に記載の細胞培養物。
(項目134)
前記第2の運動ニューロンが、遺伝子コード型Ca++インジケーターを発現する、項目130に記載の細胞培養物。
(項目135)
前記遺伝子コード型Ca++インジケーターが、GCaMP6f、jRCaMP1a、jRGECO1a、およびRCaMP2からなるリストから選択される少なくとも1つを含む、項目134に記載の細胞培養物。
(項目136)
前記第1の運動ニューロンが、前記第2の運動ニューロンから空間的に分けられ、かつ、該第2の運動ニューロンと電気的に接触している、項目130に記載の細胞培養物。
(項目137)
イオンチャネルモジュレーターをスクリーニングするための方法であって、
化合物を、電気興奮性細胞を含む試料へと提示するステップであって、該電気興奮性細胞が、膜電位についての光レポーターとして発現するステップと;
該化合物の提示の後で、該試料の光学的刺激に応答して該光レポーターにより発せられる光シグナルを、検出システムを介して受け取るステップと;
該光シグナルを分析して、該化合物の該電気興奮性細胞に対する効果を決定するステップと
を含む方法。
(項目138)
前記光シグナルを分析して、前記化合物の前記電気興奮性細胞に対する効果を決定するステップが、該化合物がイオンチャネルモジュレーターとして機能することを決定することを含む、項目137に記載の方法。
(項目139)
前記化合物のイオンチャネルモジュレーション効果を定量するステップをさらに含む、項目137に記載の方法。
(項目140)
前記ステップを、少なくとも90の細胞培養物に対して並列的に実施することをさらに含む、項目137に記載の方法。
(項目141)
前記電気興奮性細胞が、哺乳動物ニューロンである、項目137に記載の方法。
(項目142)
前記ニューロンがまた、光依存性イオンチャネルも発現する、項目141に記載の方法。
(項目143)
前記ニューロンがまた、細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質も発現する、項目141に記載の方法。
(項目144)
前記ニューロンがまた、光依存性イオンチャネルも発現し、細胞内カルシウムレベルの変化を報告する前記タンパク質、光依存性イオンチャネル、および膜電位についての前記光レポーターの各々が、微生物型ロドプシンによりもたらされる、項目143に記載の方法。
(項目145)
前記電気興奮性細胞が、哺乳動物ニューロンであり、光依存性イオンチャネルを発現する第2の電気興奮性細胞により刺激される、項目137に記載の方法。
(項目146)
前記哺乳動物ニューロンがまた、細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質も発現する、項目145に記載の方法。
(項目147)
前記光依存性イオンチャネルが、藻類チャネルロドプシンを含み;
細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質が、GCaMPバリアントを含む、
項目146に記載の方法。
(項目148)
前記哺乳動物ニューロンが、hiPSC由来のニューロンである、項目141に記載の方法。
(項目149)
前記ニューロンを前記化合物へと曝露したときのAP波形の変化および前記細胞内カルシウムレベルの変化を検出するステップをさらに含む、項目143に記載の方法。
(項目150)
複数のニューロンを、基材上の細胞培養物において、空間的にパターン化させるステップをさらに含む、項目137に記載の方法。
(項目151)
前記光シグナルを得るステップを、光学顕微鏡検査システムを使用して実施する、項目137に記載の方法。
(項目152)
前記光学顕微鏡検査システムが、前記細胞培養物を照射するのに使用される光を空間的にパターン化させるために使用される少なくとも1つのディジタル式マイクロミラーデバイスを含む、項目151に記載の方法。
(項目153)
前記光シグナルを分析するステップが、前記化合物のAP波形に対する効果を検出することを含む、項目137に記載の方法。
(項目154)
電気的に活性な細胞を用意するステップと;
該電気的に活性な細胞へと、光活性化因子と、電気活動についての光レポーターとを組み込むステップと;
該細胞を、少なくとも1つの化合物へと曝露するステップと;
該細胞の光学的刺激に応答して該光レポーターにより発せられるシグネチャーを得るステップと;
該得られたシグネチャーに基づき、該少なくとも1つの化合物の細胞表現型に対する効果を同定するステップと
を含む化合物スクリーニング法。
(項目155)
複数の前記電気的に活性な細胞を、複数の異なる化合物へと曝露する、項目154に記載の方法。
(項目156)
前記効果が、細胞の活動を表す、項目155に記載の方法。
(項目157)
前記電気的に活性な細胞の各々に、前記光活性化因子および前記電気活動についての光レポーターの両方を発現させる、項目154に記載の方法。
(項目158)
前記組み込むステップが、前記電気的に活性な細胞を、前記光活性化因子および前記電気活動についての光レポーターをコードする核酸を含むベクターで形質転換することを含む、項目154に記載の方法。
(項目159)
前記電気的に活性な細胞が、ニューロン、心筋細胞、およびグリア細胞からなる群から選択される、項目154に記載の方法。
(項目160)
前記光活性化因子が、前記光学的刺激に応答して、活動電位を惹起する、項目154に記載の方法。
(項目161)
前記細胞の前記刺激が、前記光活性化因子を照射することを含む、項目160に記載の方法。
(項目162)
前記細胞を前記用意するステップが、多能性幹細胞を、前記電気的に活性な細胞へと転換することを含む、項目154に記載の方法。
(項目163)
前記同定するステップが、電気シグネチャーを、対照細胞から得られる対照シグネチャーと比較することを含む、項目154に記載の方法。
(項目164)
対照細胞と前記電気的に活性な細胞とが、該電気的に活性な細胞における変異を除き同系となるように、該電気的に活性な細胞のゲノムを編集して、該対照細胞を作製するステップをさらに含む、項目154に記載の方法。
(項目165)
前記得るステップが、細胞のクラスターを顕微鏡で観察すること、およびコンピュータを使用して、前記光レポーターにより発せられたシグナルを、細胞のクラスターに由来する複数のシグナルの中から単離することを含む、項目154に記載の方法。
(項目166)
前記コンピュータで、独立成分分析を実施すること、および1つの単一細胞によって生じたスパイク列を同定することにより、前記シグナルを単離する、項目165に記載の方法。
(項目167)
イオンチャネルモジュレーターのアッセイにおける使用のための細胞であって、真核生物ゲノムを含み、電位を示す微生物型ロドプシンおよび光依存性イオンチャネルを発現する細胞。
(項目168)
前記微生物型ロドプシンが、膜電位についての光レポーターを含む、項目167に記載の細胞。
(項目169)
前記微生物型ロドプシンが、QuasAr1およびQuasAr2からなるリストから選択される微生物型ロドプシンである、項目168に記載の細胞。
(項目170)
前記細胞がまた、細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質も発現する、項目167に記載の細胞。
(項目171)
前記細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質が、GCaMPバリアントを含む、項目170に記載の細胞。
(項目172)
細胞内カルシウムレベルの変化を報告する前記タンパク質が、jRCaMP1a、jRGECO1a、およびRCaMP2からなるリストから選択されるタンパク質である、項目167に記載の細胞。
(項目173)
前記光依存性イオンチャネルが、<450nmの波長で励起極大を有する青方偏移アクチュエーターを含み、前記細胞内カルシウムレベルの前記変化を報告する前記タンパク質が、端点を含む520nm~570nmの間で励起極大を有する赤方偏移カルシウムインジケーターを含む、項目170に記載の細胞。
(項目174)
前記光依存性イオンチャネルが、藻類チャネルロドプシンを含む、項目167に記載の細胞。
(項目175)
前記光依存性イオンチャネルが、TsChRおよびPsChRからなるリストから選択される青方偏移アクチュエーターである青方偏移アクチュエーターを含む、項目167に記載の細胞。
(項目176)
前記微生物型ロドプシンが、QuasAr1およびQuasAr2からなるリストから選択される微生物型ロドプシンである、項目175に記載の細胞。
(項目177)
前記微生物型ロドプシンを、前記真核生物ゲノムへと組み入れられた遺伝子から発現させる、項目167に記載の細胞。
(項目178)
前記微生物型ロドプシンが、QuasArタンパク質を含み、前記光依存性イオンチャネルが、チャネルロドプシンを含み、前記細胞が、コード型カルシウムインジケーターをさらに発現する、項目167に記載の細胞。
(項目179)
前記コード型カルシウムインジケーターが、GCaMP6f、jRCaMP1a、jRGECO1a、およびRCaMP2からなる群から選択されるコード型カルシウムインジケーターである、項目178に記載の細胞。
(項目180)
前記光依存性イオンチャネルが、紫励起光遺伝学的アクチュエーターを含み、細胞が、赤方偏移遺伝子コード型カルシウムインジケーターをさらに含む、項目167に記載の細胞。
(項目181)
前記紫励起光遺伝学的アクチュエーターが、チャネルロドプシンを含み、前記赤方偏移遺伝子コード型カルシウムインジケーターが、jRCaMP1a、jRGECO1a、およびRCaMP2からなる群から選択される赤方偏移遺伝子コード型カルシウムインジケーターを含む、項目180に記載の細胞。
(項目182)
前記細胞が、心筋細胞である、項目167から181のいずれかに記載の細胞。
(項目183)
前記細胞が、ニューロンである、項目167から181のいずれかに記載の細胞。
(項目184)
前記細胞が、ヒト人工多能性幹細胞である、項目167から181のいずれかに記載の細胞。
(項目185)
細胞を特徴付けるための方法であって、
幹細胞に転写因子を発現させることにより、該幹細胞をニューロンへと転換するステップと;
該ニューロンへと、膜電位についての光レポーターおよび光依存性イオンチャネルを組み込むステップと;
該ニューロンの刺激に応答する該光レポーターからのシグナルを得るステップと;
該シグナルを評価し、これにより、該ニューロンを特徴付けるステップと
を含む方法。
(項目186)
前記転写因子が、NgN2である、項目185に記載の方法。
(項目187)
膜電位についての前記光レポーターが、微生物型ロドプシンを含む、項目186に記載の方法。
(項目188)
前記微生物型ロドプシンが、QuasAr1およびQuasAr2からなるリストから選択される微生物型ロドプシンである、項目187に記載の方法。
(項目189)
前記ニューロンがまた、細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質も発現する、項目185に記載の方法。
(項目190)
前記細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質が、GCaMPバリアントを含む、項目189に記載の方法。
(項目191)
細胞内カルシウムレベルの変化を報告する前記タンパク質が、jRCaMP1a、jRGECO1a、およびRCaMP2からなるリストから選択されるタンパク質である、項目189に記載の方法。
(項目192)
前記光依存性イオンチャネルが、<450nmの波長で励起極大を有する青方偏移アクチュエーターを含み、前記細胞内カルシウムレベルの前記変化を報告する前記タンパク質が、端点を含む520nm~570nmの間で励起極大を有する赤方偏移カルシウムインジケーターを含む、項目189に記載の方法。
(項目193)
前記ニューロンの前記刺激が、ディジタル式マイクロミラーデバイスを使用して、前記ニューロンを選択的に照射するように、光を空間的にパターン化することを含む、項目189に記載の方法。
(項目194)
前記光依存性イオンチャネルが、藻類チャネルロドプシンを含む、項目185に記載の方法。
(項目195)
前記光依存性イオンチャネルが、TsChRおよびPsChRからなるリストから選択される青方偏移アクチュエーターである青方偏移アクチュエーターを含む、項目185に記載の方法。
(項目196)
前記微生物型ロドプシンを、ニューロンへと組み入れられた遺伝子から発現させる、項目185に記載の方法。
(項目197)
前記微生物型ロドプシンが、QuasArタンパク質を含み、前記光依存性イオンチャネルが、チャネルロドプシンを含み、前記ニューロンが、コード型カルシウムインジケーターをさらに発現する、項目185に記載の方法。
(項目198)
前記ニューロンの前記刺激が、該ニューロンと第2の細胞との間にシナプスを形成することと、ディジタル式マイクロミラーデバイスを使用して、該第2の細胞を選択的に照射するように、光を空間的にパターン化することとを含む、項目185に記載の方法。
(項目199)
前記光依存性イオンチャネルが、紫励起光遺伝学的アクチュエーターを含み、前記ニューロンが、赤方偏移遺伝子コード型カルシウムインジケーターをさらに含む、項目185に記載の方法。
(項目200)
前記紫励起光遺伝学的アクチュエーターが、チャネルロドプシンを含み、前記赤方偏移遺伝子コード型カルシウムインジケーターが、jRCaMP1a、jRGECO1a、およびRCaMP2からなる群から選択される赤方偏移遺伝子コード型カルシウムインジケーターを含む、項目199に記載の方法。
(項目201)
外因性転写因子、膜電位についての光レポーター、および光依存性イオンチャネルを発現するニューロンであって、該転写因子もまた内因的に発現しているニューロン。
(項目202)
前記転写因子が、NgN2である、項目201に記載のニューロン。
(項目203)
膜電位についての前記光レポーターが、微生物型ロドプシンを含む、項目202に記載のニューロン。
(項目204)
前記微生物型ロドプシンが、QuasAr1である、項目203に記載のニューロン。
(項目205)
細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質も発現する、項目203に記載のニューロン。
(項目206)
前記細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質が、GCaMPバリアントを含む、項目205に記載のニューロン。
(項目207)
細胞内カルシウムレベルの変化を報告する前記タンパク質が、jRCaMP1a、jRGECO1a、およびRCaMP2からなるリストから選択されるタンパク質である、項目205に記載のニューロン。
(項目208)
前記光依存性イオンチャネルが、<450nmの波長で励起極大を有する青方偏移アクチュエーターを含み、前記細胞内カルシウムレベルの前記変化を報告する前記タンパク質が、端点を含む520nm~570nmの間で励起極大を有する赤方偏移カルシウムインジケーターを含む、項目205に記載のニューロン。
expression in iPSC-derived neurons」、Human Molecular Genetics、近刊;Kondoら、2013年、「Modeling Alzheimer’s disease with iPSCs reveals stress phenotypes associated with intracellular Abeta and differential drug responsiveness」、Cell Stem Cell、12巻(4号):487~496頁;およびShi
ら、2012年、「A human stem cell model of early Alzheimer’s disease
pathology in Down syndrome」、Sci Transl Med、4巻(124号):124~
129頁において論じられている。本発明のシステムおよび方法を使用して、補正剤分子などの化合物を、アルツハイマー病に罹患した細胞に対するそれらの効果について評価することができる。
代替法をもたらす。本発明の方法および光遺伝学的構築物は、イオンチャネルのハイスループットスクリーニング(HTS)のために使用することができる。
1.細胞を得る
leads to deficits in synaptic function, social interaction, and social communication」、Mol Autism、1巻(1号):15頁;Pecaら、2011年、「Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction」、Nature、472巻(7344号):437~42頁)。
induced pluripotent stem cells」、Mol Brain、6巻:19頁において論じられ
ている。てんかんの他の形態は、ドラベ症候群、乳児重症ミオクロニーてんかん辺縁群(SMEB)、および小児難治性てんかん(IEC)を含むと考えられる、全般てんかん熱性痙攣プラス(GEFS+)を含む。てんかんと関連するさらなる神経発達障害であって、本発明の細胞および方法により研究しうる神経発達障害は、アンゲルマン症候群、ローランドてんかん、常染色体優性夜間前頭葉てんかん、小児良性後頭葉てんかん、パネヨートポーラス症候群(Panalyiotopoulos syndrome)、小児欠神てんかん、女性におけるてんかん-知的障害、熱性痙攣および側頭葉てんかん(febrile lobe epilepsy)、若年性ミオクロニーてんかん、レノックス-ガストー症候群、大田原症候群、光感受性てんかん、ピリドキシン依存性てんかん、ウンフェルリヒト-ルントボルグ病、赤色ぼろ線維ミオクローヌスてんかん症候群、ラフォラ病、ラスムッセン脳炎、環状第20染色体症候群、側頭葉てんかん、結節性硬化症、およびウェスト症候群を含む。てんかんと関連するさらなる遺伝子であって、本発明の細胞および方法により研究しうる遺伝子は、WWOX、PRRT2、KCNC1、STX1B、CARS2、STXB1、KCNQ2、CDKL5、ARX、SPTAN、BRAT1、KCNQ3、SCN2A(NAV1.2)、GABA受容体、NIPA2、CDKL5、PCDH19、およびNAV1.1を含む。
and function」、J Neurosci.、28巻(21号):5422~32頁;Normandら、2013年、「Temporal and mosaic Tscl deletion in the developing thalamus disrupts thalamocortical circuitry, neural function, and behavior」、Neuron、5;78巻(5号):895~909頁;Kimら、2010年、「Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin」、Dis Model Mech.、4巻(2号):2
55~67頁;およびWlodarskiら、2008年、「Tuberin-heterozygous cell line
TSC2angl as a model for tuberous sclerosis-associated skin lesions」、Int J Mol Med.、21巻(2号):245~50頁において論じられている。
「Identification and rescue of α-synuclein toxicity in Parkinson patient-derived neurons」、Science、342巻(6161号):983~7頁;Seiblerら、2011年、「Mitochondrial Parkin recruitment is impaired in neurons derived from mutant PINK1 induced pluripotent stem cells」、J Neurosci、3
1巻(16号):5970~6頁;Sanchez-Danesら、2012年、「Disease-specific
phenotypes in dopamine neurons from human iPS-based models of genetic
and sporadic Parkinson’s disease」、EMBO Mol Med、4巻(5号):380~395頁;Sandersら、2013年、「LRRK2 mutations cause mitochondrial DNA damage in iPSC-derived neural cells from Parkinson’s disease patients:
reversal by gene correction」、Neurobiol Dis、62巻:381~6頁;およびReinhardtら、2013年、「Genetic correction of a LRRK2 mutation in human iPSCs links parkinsonian neurodegeneration to ERK-dependent changes in
gene expression」、Cell Stem Cell、12巻(3号):354~367頁;LRRK2
mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to
oxidative stressにおいて論じられている。
012年、「Evidence for premature aging due to oxidative stress in iPSCs from Cockayne syndrome」、Hum Mol Genet、21巻:3825~3834頁に
おいて論じられている。
cell model of early Alzheimer’s disease pathology in Down syndrome」、Sci Transl Med、4巻(124号):124~129頁において論じられている。
、2009年、「Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs」、Nature、461巻:402~406頁におい
て論じられている。
in iPSC-derived fragile X premutation neurons」、Hum Mol Genet、21巻
:3795~3805頁において論じられている。
cells model intergenerational GAA.TTC triplet repeat instability」、Cell
Stem Cell、7巻(5号):631~7頁;Duら、2012年、「Role of mismatch
repair enzymes in GAA.TTC triplet-repeat expansion in Friedreich ataxia induced pluripotent stem cells」、J Biol Chem、287巻(35号):29
861~29872頁;およびHickら、2013年、「Neurons and cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells as a model for mitochondrial defects in Friedreich’s ataxia」、Dis Model Mech、6巻(3号):608~21頁において論じられている。
Cells、32巻(2号):414~23頁において論じられている。
0巻(7378号):543~546頁において論じられている。
、Nature、503巻(7475号):267~71頁において論じられている。
たい。
、「Charcot Marie Tooth disease and pathways to molecular based therapies」、Clin Genet、DOI: 10.1111/cge.12393を参照されたい。
、2009年、「Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient」、Nature、457巻(7227号):277~80頁;Sareenら、2012年、「Inhibition of apoptosis blocks human motor neuron cell death in a stem cell model of spinal muscular atrophy」、PLoS One、7巻(6号):e39113頁;およびCortiら、2012年、「Genetic correction of human
induced pluripotent stem cells from patients with spinal muscular atrophy」、Sci Transl Med、4巻(165号):165~162頁において論じられている。
activity-dependent dendritic retraction in rodent and human neurons」、Nat Neurosci、16巻(2号):201~9頁において論じられている。
patients with a DISC1 mutation」、Molecular Psych、16巻:358~360頁において論じられている。
Molecular Genetics、近刊;Kondoら、2013年、「Modeling Alzheimer’s disease with iPSCs reveals stress phenotypes associated with intracellular Abeta and differential drug responsiveness」、Cell Stem Cell、12巻(4号):487~496頁;およびShiら、2012年、「A human stem cell model of
early Alzheimer’s disease pathology in Down syndrome」、Sci Transl Med、4巻(124号):124~129頁において論じられている。
失語症(PNFA)を含むように細分化される)を含み、脳の前頭葉および側頭葉の萎縮と関連する障害群の名称である。前頭側頭葉変性症は、それらの各々の内容が参照により組み込まれる、Almeidaら、2013年、「Modeling key pathological features of
frontotemporal dementia with C9ORF72 repeat expansion in iPSC-derived human neurons」、Acta Neuropathol、126巻(3号):385~399頁;Almeidaら、2012年、「Induced pluripotent stem cell models of progranulin-deficient frontotemporal dementia uncover specific reversible neuronal defects」、Cell Rep、2巻(4号):789~798頁;およびFongら、2013年、「Genetic correction of tauopathy phenotypes in neurons derived from human induced pluripotent stem cells」、Stem Cell Reports、1巻(3号):1~9頁
において論じられている。
46巻(1号):41~51頁において論じられている。
differentiation of patient specific iPS cells as a novel approach to
study the pathophysiology of multiple sclerosis」、Stem Cell Res、8巻
(2号):259~73頁において論じられている。
spinal and bulbar muscular atrophy」、J Biol Chem、288巻(12号):
8043~52頁において論じられている。
in vitro disease model」、PLoS One、6巻(9号):e25255頁において論じられている。
;Waingerら、2014年、「Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons」、Cell Reports、7巻(1号):1~11頁;Donnellyら、2013年、「RNA toxicity from the ALS/FTD
C9orf72 expansion is mitigated by antisense intervention」、Neuron、80巻(2号):415~28頁;Alami、2014年、「Microtubule-dependent transport of TDP-43 mRNA granules in neurons is impaired by ALS-causing mutations」、Neuron、81巻(3号):536~543頁;Donnellyら、2013年、「RNA
toxicity from the ALS/FTD C9ORF72 expansion is mitigated by antisense
intervention」、Neuron、80巻(2号):415~428頁;Bilicanら、2012
年、「Mutant induced pluripotent stem cell lines recapitulate aspects of
TDP-43 proteinopathies and reveal cell-specific vulnerability」、PNAS、109巻(15号):5803~5808頁;Egawaら、2012年、「Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells」、Sci Transl Med、4巻(145号):145~104頁;およびYangら、2013年、「A small molecule screen in stem-cell-derived motor neurons identifies a kinase inhibitor as a candidate therapeutic for ALS」、Cell Stem Cell、12巻(6号):713~726頁において論じられている。
の組織培養法を使用することができる。
2.細胞をニューロンまたは特異的な神経亜型へと転換する
2a.細胞のiPSへの転換およびiPSの特異的細胞型への転換
from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors」、Cell、126巻:663~676頁;ならびにTakahashiら、2007年、「Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors」、Cell、131巻:861~872頁において論じられている方法などの方法
により、iPSCへと転換する。
巻:861頁を参照されたい。その後、hES細胞様コロニーを拾い、酵素による消化を伴わずに、機械的に小さな塊へと分解する。各細胞は、大きな核と少量の細胞質を特徴とする、ヒトES細胞の形状と類似する形状を呈示するものとする。HDFを形質導入した後の細胞は、ヒトiPS細胞である。DNAフィンガープリンティング、シークェンシング、または他のアッセイを実施して、iPS細胞系が、ドナーと遺伝子的にマッチすることを検証することができる。
、「Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can
be differentiated into motor neurons」、Science、321巻(5893号):
1218~21頁;Amorosoら、2013年、「Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells」、J Neurosci、
33巻(2号):574~86頁;およびBoultingら、2011年、「A functionally
characterized test set of human induced pluripotent stem cells」、Nat
Biotech、29巻(3号):279~286頁において記載されている方法を参照され
たい。
ら、2013年、「Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells」、Neuron、78巻(5号):785~798頁を参
照されたい。転写因子は、レンチウイルスの感染(下記でより詳細に論じられる)により導入することができる。Zhang、2013年において報告されている通り、選択のために
、ピューロマイシン耐性遺伝子を、Ngn2と共に共発現させることができる。ES細胞またはiPS細胞は、-2日目に播種し、-1日目にレンチウイルスを感染させ、0日目にNgn2の発現を誘導する。1日目に、24時間にわたるピューロマイシン選択期間を開始し、2日目に、マウスグリア(主に、星状細胞)を添加して、シナプス形成を増強する。Zhang、2013年において報告されている通り、1週間未満のうちに、Ngn2の
強制的発現により、ES細胞およびiPS細胞を、ニューロン様細胞へと転換し、2週間未満のうちに、見かけ上の成熟ニューロン形状をもたらす。
ができる。
2b.細胞の特異的細胞型への直接的な転換
to make spinal motor neurons」、Development、141巻:491頁;Graf、2
011年、「Historical origins of transdifferentiation and reprogramming」
、Cell Stem Cell、9巻:504~516頁を参照されたい。一連の神経系列特異的転写因子またはBAM因子は、線維芽細胞の人工ニューロン(iN)細胞への転換をもたらすことが示されている(Vierbuchen、2010年、Nature、463巻:1035頁)。マイクロRNAおよびNeuroD1を含むさらなる前ニューロン因子を、ヒト線維芽細胞のニューロンへの転換の間に、BAM因子と協調させることもでき、BAM因子を置きかえることもできる。例えば、Ambasudhanら、2011年、「Direct reprogramming of
adult human fibroblasts to functional neurons under defined conditions」、Cell Stem Cell、9巻:113~118頁;Pangら、2011年、「Induction of human neuronal cells by defined transcription factors」、Nature、476巻:220~223頁を参照されたい。また、Yooら、2011年、「MicroRNA mediated conversion of human fibroblasts to neurons」、Nature、476巻:228~231頁も参照されたい。
2c.分化細胞の維持
3.ゲノム編集
の点では同系の系(line)をもたらすことができる。この後、上記で記載した方法に従い、胚様体を使用して、疾患iPS細胞および補正iPS細胞を、運動ニューロンへと分化させることができる。
specific modifications of the Drosophila genome by means of an easy
TALEN strategy」、J. Genet. Genomics、39巻:209~215頁を参照された
い。直鎖化された発現ベクター(例えば、NotIにより)を、mRNAを合成するための鋳型として使用する。Life Technologies(Carlsbad、CA)社製のmMESSAGE mMACHINE SP6転写キットなど、市販のキットを使用することができる。JoungおよびSander、2013年、「TALENs: a wideliy applicable technology for targeted genome editing」、Nat Rev Mol Cell Bio、14巻:49~55頁を参照されたい。
465~472頁;Hwangら、2013年、「Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system」、Nat. Biotechnol、31巻:227~229頁;Xiaoら、2013年、「Chromosomal deletions and inversions mediated by TALENS and CRISPR/Cas in zebrafish」、Nucl Acids Res、1~11頁を参照された
い。
selection of novel Cys2His2 zinc finger proteins」、Ann. Rev. Biochem
、70巻:313~340頁;Isalanら、2001年、「A rapid generally applicable method to engineer zinc fingers illustrated by targeting the HIV-1
promoter」、Nat. Biotechnol、19巻:656~660頁;ならびにSantiagoら、2008年、「Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases」、PNAS、105巻:5809~5814頁を参照されたい
。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、自然発生のジンクフィンガータンパク質と比較して新規の結合特異性を有しうる。操作法は、合理的デザインおよび多様な種類の選択を含むがこれらに限定されない。ジンクフィンガー結合ドメインは、ジンクフィンガー認識領域(すなわち、ジンクフィンガー)を介して、標的DNA配列を認識するようにデザインすることができる。例えば、参照により組み込まれる、米国特許第6,607,882号;同第6,534,261号、および同第6,453,242号を参照されたい。ジンクフィンガー認識領域を選択する例示的な方法は、ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムを含むことが可能であり、それらの各々が参照により組み込まれる、米国特許第5,789,538号;米国特許第5,925,523号;米国特許第6,007,988号;米国特許第6,013,453号;米国特許第6,410,248号;米国特許第6,140,466号;米国特許第6,200,759号;および米国特許第6,242,568号において開示されている。
1027頁を参照されたい。
388頁を参照されたい。切断ドメインは、切断活性のために二量体化を必要とする酵素から得ることができる。各ヌクレアーゼは、活性の酵素二量体のうちの単量体を含むので、切断には、2つのジンクフィンガーヌクレアーゼが必要とされる場合がある。代替的に、単一のジンクフィンガーヌクレアーゼは、活性の酵素二量体を作り出すように、両方の単量体を含む場合もある。存在する制限エンドヌクレアーゼは、結合部位または結合部位の近傍における、DNAの配列特異的な結合および切断が可能でありうる。ある特定の制限酵素(例えば、IIS型)は、DNAを、認識部位から除去される部位において切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、二量体として活性のIIS型酵素であるFokIは、DNAの二本鎖切断を、一方の鎖上のその認識部位から9ヌクレオチドであり、かつ、他方の鎖上のその認識部位から13ヌクレオチドの位置において触媒する。ジンクフィンガーヌクレアーゼにおいて使用されるFokI酵素は、切断単量体と考えることができる。したがって、FokI切断ドメインを使用する、ターゲティング型二本鎖切断では、各々がFokI切断単量体を含む、2つのジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して、活性の酵素二量体を再構成することができる。各々が参照により組み込まれる、Wahら、1998年、「Structure of FokI has implications for DNA cleavage」、PNAS、95巻:10564~10569頁;米国特許第5,356,
802号;同第5,436,150号、および同第5,487,994号を参照されたい。ある特定の実施形態では、切断ドメインは、例えば、各々が参照により組み込まれる、米国特許公開第2005/0064474号、同第2006/0188987号、および同第2008/0131962号において記載されている通り、ホモ二量体化を最小化するかまたは防止する、1または複数の操作された切断単量体を含みうる。
location in the human genome using designed zinc finger nucleases」、PNAS、104巻:3055~3060頁;Urnovら、2005年、「Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases」、Nature、435巻(7042号):646~51頁;およびLombardoら、2007年、「Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery」、Nat Biotechnol、25巻(11号):1298~306頁において記載されている。当業者は、当技術分野では、細胞を培養するための方法が公知であり、条件に応じて変化する可能性があり、変化することを察知している。ジンクフィンガーヌクレアーゼが発現すると、標的配列は編集されている。細胞が、発現するジンクフィンガーヌクレアーゼの他、ドナー(または交換)ポリヌクレオチドも含む場合、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、染色体内の標的配列を認識し、これに結合し、これを切断する。ジンクフィンガーヌクレアーゼにより導入される二本鎖切断では、ドナーポリヌクレオチド内の配列を、染色体配列へと組み入れる(または染色体配列の部分を、交換ポリヌクレオチド内の配列へと転換する)ように、ドナー(または交換)ポリヌクレオチドによる相同組換えを介して修復する。結果として、配列を、染色体配列へと組み入れることができる(または染色体配列の部分を改変することができる)。
(BDNF) gene associated with late-onset Alzheimer’s disease」、Mol Psych、6巻(1号):83~86頁に従い、アルツハイマー病関連変異が疑われる)を有す
る細胞系を作り出すことができる。任意のこのような技術を使用しうるが、以下では、ジンクフィンガーヌクレアーゼを介するゲノム編集を例証する。
4.細胞に光遺伝学的系を発現させる4a.細胞に光遺伝学的レポーターを発現させる
、「A genetically targetable fluorescent probe of channel gating with rapid kinetics」、Biophys J、82巻:509~516頁);およびVSFP1(Sakaiら、2001年、「Design and characterization of a DNA encoded, voltage-sensitive fluorescent protein」、Euro J Neuroscience、13巻:2314~2318頁)を含む。電位依存性ホスファターゼのパドルドメインに基づく遺伝子コード型電位インジケーターは、CiVSP(Murataら、2005年、「Phosphoinositide phosphatase activity coupled to an intrinsic voltage sensor」、Nature、435巻:1239~1243頁)である。別のインジケーターは、膜リーフレットを介するジピクリルアミン(DPA)の電位依存性移動を、膜ターゲティング型GFPによる「ダークFRET」(蛍光共鳴エネルギー移動)へと変換する、ハイブリッドhVOSインジケーター(Chandaら、2005年、「A hybrid approach to measuring electrical activity in genetically specified neurons」、Nat Neuroscience、8巻:1619~1626頁)である。
sodomenseに由来する微生物型ロドプシンタンパク質である、アーキロドプシン3(Arch)の内因性蛍光を使用するインジケーターを含む。Archは、大きなシグナル対ノイズ(SNR)および小さな光毒性で活動電位を分離する。Archの変異体形態であるD95Nは、一部のインジケーターと関連する過分極電流を呈示しないことが示されている。QuasAr1およびQuasAr2と称する、Archの他の変異体形態は、輝度、電位に対する感度、応答速度、およびニューロン細胞膜へのトラフィッキングの改善を呈示することが示されている。Archおよび上述のバリアントは、真核細胞膜をターゲティングし、培養された哺乳動物ニューロンにおける単一の活動電位および閾値未満の脱分極をイメージングしうる。Kraljら、2012年、「Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin」、Nat Methods、9巻:90~95頁を参照されたい。したがって、Arch、およびArch(D95N)など、Archバリアントは、本発明の実施形態に従う、良好な、神経活動についての光レポーターをもたらしうる。
6年、「Crystal structures of archaerhodopsin-1 and -2: Common structural
motif in Archaeal light-driven proton pumps」、J Mol Bio.、358巻:675~685頁において記載されている)に基づく、Quasar1の構造モデルを提示する。変異であるT80SおよびF161Vは、タンパク質の周縁部に位置するが、P60Sは、レチナール発色団のシッフ塩基に近接する。それらの位置を踏まえると、T80S置換およびF161V置換は、タンパク質の光物理的特性に対して直接的な影響を有する可能性が低く、フォールディング効率の改善において役割を果たす可能性が高い。これに対し、P60S置換がシッフ塩基に近接することは、この変異が、光物理的特性に対してより直接的な影響を有することを示唆する。QuasArインジケーターは、電位感度、応答反応速度、膜トラフィッキングの、Archと比べた改善と、輝度の照射強度に対する依存性の、Archと比べた低下とを呈示しうる。可溶化させたQuasAr1およびQuasAr2の蛍光量子収率は、非輸送型電位インジケーターであるArch(D95N)と比べて、それぞれ、19倍および10倍の増強でありうる。QuasAr1の輝度は、野生型Archの15倍であることが可能であり、QuasAr2の輝度は、3.3倍でありうる。いずれの変異体も、野生型タンパク質において見られる光学的非直線性を示さない。Arch、QuasAr1、およびQuasAr2の蛍光は、-100mV~+50mVの間の膜電位で、ほぼ直線的に増大する。Kraljら、2012年、「Optical
recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial
rhodopsin」、Nat Methods、9巻:90~95頁において記載されている通り、蛍光
の記録は、落射蛍光顕微鏡上で得ることができる。
action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin」、Nat Methods、9巻:90~95頁;およびHochbaumら、「All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins」、Nature
Methods、11巻、825~833頁(2014年)を参照されたい。したがって、A
rchおよびArchのバリアントは、本発明の実施形態に従う、良好な、電気活動についての光レポーターをもたらしうる。
Methods、11巻、825~833頁(2014年)において記載されている、落射蛍
光顕微鏡上で得ることができる。
、「Archaerohodopsin variants with enhanced voltage-sensitive fluorescence
in mammalian and Caenorhabditis elegans neurons」、Nat Comm、5巻:48
94頁において報告されているバリアントを含む。Archer1およびArcher2は、Arch WTと比較して、655nmの光に応答する放射輝度の増強を呈示し、3~5倍の蛍光および55~99分の1の光電流を示す。Archer1(D95EおよびT99C)およびArcher2(D95E、T99C、およびA225M)は、電位センシングに使用することができる。これらの変異体は、最近報告されたArchバリアントの9分の1の光強度(655nmのときに、880mWmm-2)でイメージングしても、大きなベースライン蛍光(Arch WTの3~5倍)、長時間の照射時間にわたり安定的な、大きな感度ダイナミックレンジ(Archer1およびArcher2のそれぞれについて、100mV当たり85%のDF/Fおよび60%のDF/F)、および迅速な反応速度を呈示する。Archer1の特徴は、in vitroにおいて、単一のニューロン全体の膜電位の迅速な変化、およびニューロンの集団全体の膜電位の迅速な変化をモニタリングする、その使用を可能とする。Archer1は、蛍光を励起するために使用される波長(655nm)では、最小限の輸送を示すが、低波長(560nm)では、強力なプロトン輸送電流を維持する。Archer1は、赤色光による電位センシングおよび緑色光による阻害能の両方を有する二機能性ツールをもたらす。Archer1は、感覚刺激に応答する小さな電位の変化を検出することが可能である。
(6号):e66959頁において報告されている、Arch-EENおよびArch-EEQと呼ばれるArch変異体も含む。このようなレポーターは、二重の変異である、D95N-D106E(Arch-EEN)およびD95Q-D106E(Arch-EEQ)を有するArchバリアントを含みうる。
the optical resolution of action potentials firing at 60 Hz by a genetically encoded fluorescent sensor of membrane potential」、J Neurosci、35巻(1号):372~385頁において記載されている、ArcLight由来のプローブを含みうる。
4b.細胞に光遺伝学的アクチュエーターを発現させる
、MelkonianおよびPreisig、1986年、「A light and electron microscopic study of Scherffelia dubia, a new member of the scaly green flagellates
(Prasinophyceae)」、Nord. J. Bot.、6巻:235~256頁も参照されたい。S
dChRは、良好な感度および青色の作用スペクトルをもたらしうる。
~346頁(2014年) を参照されたい)である。このチャネルロドプシンアクチュエーターは、ピークを435nmとする、青方偏移作用スペクトルを有する。別の好ましい紫色チャネルロドプシンアクチュエーターは、Platymonas subcordiformisに由来するPsChR(Govorunova, Elenaら、2013年、「Characterization of a highly efficient blue-shifted channelrhodopsin from the marine alga Platymonas subcordiformis」、J Biol Chem、288巻(41号):29911~29922頁を参照されたい)である。PsChrは、ピークを437nmとする、青方偏移作用スペクトルを有する。PsChRおよびTsChRは、赤方偏移Ca2+インジケーターと対にすると有利であり、これらの赤方偏移Ca2+インジケーターと同じ細胞内または同じ視野内で、光学的クロストークを伴わずに使用することができる。
4c.光遺伝学的系を発現させるためのベクター
、外部から適用することにより、調節的作用物質または調節的刺激へと曝露する。誘導性プロモーターは、調節的作用物質または調節的刺激の存在下だけで転写を惹起する。誘導性プロモーターの例は、ベータ-インターフェロン遺伝子、熱ショック遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、またはステロイドホルモン応答性遺伝子から得られ得る任意の遺伝子に由来する、テトラサイクリン応答エレメントおよびプロモーターを含む。本発明の方法を実施するときに使用しうる誘導性プロモーターは、ホルモンおよびプロゲステロン、エクジソン、およびグルココルチコイドなどのホルモン類似体により調節される誘導性プロモーターの他、テトラサイクリン、熱ショック、重金属イオン、インターフェロン、およびラクトースオペロン活性化化合物により調節されるプロモーターも含む。GingrichおよびRoder、1998年、「Inducible gene expression in the nervous system of transgenic mice」、Annu Rev Neurosci、21巻:377~405頁を参照されたい
。遺伝子発現の分野では、組織特異的な発現が十分に特徴付けられており、当技術分野では、組織特異的プロモーターおよび誘導性プロモーターが周知である。これらのプロモーターは、標的細胞へと導入した後で、外来遺伝子の発現を調節するのに使用する。ある特定の実施形態では、細胞型特異的プロモーターまたは組織特異的プロモーターを使用する。細胞型特異的プロモーターは、主に1つの細胞型内では、選択された核酸の発現を調節するが、他の細胞での発現もまたもたらす、漏出性細胞型特異的プロモーターを含みうる。具体的に、ニューロン細胞において外因性遺伝子を発現させるためには、ニューロン特異的エノラーゼプロモーターを使用することができる。Forss-Petterら、1990年、「Transgenic mice expressing beta-galactosidase in mature neurons under neuron specific enolase promoter control」、Neuron、5巻:187~197頁を参照されたい。ドーパミン作動性ニューロンにおいて外因性遺伝子を発現させるためには、チロシンヒドロキシラーゼプロモーターを使用することができる。
11年、「An optogenetic toolbox designed for primates」、Nat Neurosci、14巻(3号):387~97頁において論じられている。培養されたラット海馬ニューロン内のCamKIIαプロモーター下で発現させる場合、光パッチ構築物は、CheRiffおよびQuasAr2の両方について、高度な発現および良好な膜トラフィッキングを呈示する。
5166~70頁;およびSternbergおよびHamilton、1981年、「Bacteriophage P1
site-specific recombination. I. Recombination between LoxP sites」、J Mol Biol、150巻:467~86頁)。方法では、チャネルロドプシン-2(ChR2)などのツールを、信頼できる光刺激を可能とするのに十分な発現レベルを有する特異的なニューロンへとターゲティングするために、Creリコンビナーゼ依存性ウイルスベクターを使用することができる。こうして、mCherryなどの蛍光タンパク質をタグ付けされたChR2(例えば、ChR2mCherry)などの光遺伝学的ツール、または本明細書で論じられるツールのうちの他のいずれかを、これらの細胞の特徴付けにおける使用のための1または複数の細胞へと送達する。
243~3248頁において論じられている。
in the mouse」、Nat Biotechnol、21巻:562~565頁において論じられて
いる。FLEXスイッチでは、2対の異型でアンチパラレルのLoxP型組換え部位を使用し、まず、これらに、コード配列の反転を施した後、2つの部位の切出しにより、反対向きに配向され、さらなる組換えが不可能な、直交する各組換え部位のうちの1つをもたらす。FLEXスイッチは、高効率および不可逆性をもたらす。したがって、一部の実施形態では、方法では、rAAV-FLEX-rev-ChR2mCherryを含むウイルスベクターを使用する。加えて、または代替的に、ベクターは、FLEXおよび他の任意の本明細書で論じられる光遺伝学的ツール(例えば、rAAV-FLEX-QuasAr、rAAV-FLEX-CheRiff)も含みうる。rAAV-FLEX-rev-ChR2mCherryを、例示的な例として使用すると、ChR2mCherryコード配列のCre媒介型反転の結果として、Creが、配列を反転させ、ChR2mCherryの転写をオンにするまでは、誤った配向(すなわち、rev-ChR2mCherry)にあるコード配列がもたらされる。FLEXスイッチベクターは、Atasoyら、2009年、「A FLEX switch targets channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping」、J Neurosci、28巻(28号):7025~7030頁において論じられている。
、71巻(1号):9~34頁;Cardinら、2010年、「Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2」、Nat Protoc、5巻(2号):247~54頁;Rothermelら、2013年、「Transgene expression in target-defined neuron populations mediated by retrograde infection with adeno-associated viral vectors」、J Neurosci、33巻(38号):195~206頁;およびSaundersら、2012年、「Novel recombinant adeno-associated viruses for Cre activated and
inactivated transgene expression in neurons」、Front Neural Circuits、6巻:47頁において見出すことができる。
頁;Zangiら、2013年、「Modified mRNA directs the fate of heart protenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction」、Nat Biotech、31巻:898~907頁を参照されたい。
4d.電位およびCa2+の同時的な測定のための光遺伝学的構築物および播種スキーム
ングに使用する。QuasAr2は、赤色レーザー光を介して励起する。GCaMP6fは、青色レーザー光を介して励起する。細胞には、CheRiffベクターまたはCaViarベクターにより、個別に形質導入する。
4e.マルチモードセンシング/マルチプレックス化
reveals chamber-specific developmental transitions in ionic currents」、Frontiers in physiology、5巻を参照されたい)。また、本明細書において教示され
る概念を使用するマルチモードイメージングの他の形態を可能とする、他のタンパク質ベースの蛍光インジケーターとの融合体も使用することができる。微生物型ロドプシンをコードする核酸を、さらなる分析物感受性蛍光インジケーターへと作動可能に連結するかもしくは融合させる場合;または微生物型ロドプシンと、さらなる分析物感受性蛍光インジケーターとを、同じ細胞内で共発現させる場合は、ナトリウム、カリウム、クロライド、およびカルシウムなどのイオン濃度も、同時に測定することができる。
Masatoshiら、「Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2」、Nature methods、12巻、1号(2015年):64~70頁を参照されたい)、jRCaMP1a(Addgene製のプラスミド:61562)、およびjRGECO1a(Addgene製のプラスミド:61563)を含む。これらのカルシウムインジケーターは、540~560nmの間の波長により励起され、570~620nmの間の波長で発光し、これにより、紫励起チャネルロドプシンアクチュエーターおよびArchベースの電位インジケーターからのスペクトル分離を可能とする。
4f.光学的リードアウト
4g.空間的分離
4h.パターン化した照射
4j.同時的な電位イメージングおよびカルシウムイメージングのための平板の調製
5.イメージング活動アッセイ
5a.画像の捕捉
6902頁;およびPopovicら、2011年、「The spatio-temporal characteristics
of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons: a voltage imaging study」、J. Physiol.、589巻:4167~4187頁において見出すことができる。
する補遺において記載されている倒立蛍光顕微鏡と同様の倒立蛍光顕微鏡である。略述すると、640nmで140mWの赤色レーザー(Coherent製のObis 637-140 LX)からの照射を拡大し、開口数を1.45とする、60倍の油浸対物レンズ(Olympus 1-U2B616)の後焦点面に焦点を絞る。
505上のピクセルを、カメラ上のピクセルへとマッピングする。DMDは、既知の寸法の一連のドットを、試料へと投影する。カメラは、蛍光画像を取得する。特注のソフトウェアは、画像内のドットの中心を位置特定し、DMD座標をカメラピクセル座標へとマッピングするアフィン変換を作出する。
3/0170026号において論じられている。
5b.動画からの蛍光の抽出
ら、2012年、「Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin」、Nat Methods、9巻:90~95頁において記載されている、最大尤度ピクセル重み付けアルゴリズムを使用する。略述すると、各ピクセルにおける蛍光を、全視野平均蛍光と相関させる。平均値に対してより強い相関を示したピクセルを、優先的に重み付けする。このアルゴリズムは、最も多くの情報を保有するピクセルを自動的に見出し、バックグラウンドピクセルの強調を抑制する。
6.シグナルの処理
6a.シグナルを細胞と関連させる、独立成分分析によるシグナルの処理
analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data」、Neuron、63巻:747~760頁による手法から改変された独立成分分析(ICA)ベースの手法を使用して、分離を半自動的に実施する。ICA分析により、個別の細胞の画像シグナルを、画像から単離することができる。
6b.サブナイキスト活動電位タイミング (SNAPT)を介するシグナルの処理
initial segment and propagate through axon collaterals reliably in cerebellar Purkinje neurons」、J. Neurosci、30巻、6891~6902頁;およ
びPopovicら、2011年、「The spatio-temporal characteristics of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons: a voltage imaging study」、J. Physiol.、589巻、4167~4187頁による補間法に基づくアルゴリズムなど、サブナイキスト活動電位タイミングに基づくアルゴリズムを使用して、スパイク列を同定することができる。
グマップを、高時間解像度のSNAPT動画へと転換することができる。以下の通りに、SNAPTによる当てはめを、APの伝播を示す動画へと転換する。各ピクセルは、そのピクセルにおいて、使用者により選択されるAP特徴のタイミングと一致するように時間設定された短時間の閃光を除き、暗く保つ。閃光の後に、振幅が局所的AP振幅と等しく、持続時間が細胞平均時間解像度と等しい、ガウス時間経過である、σを経過させた。SNAPT動画におけるフレーム時間は、σの約2分の1となるように選択する。タイミングマップのSNAPT動画への転換は、視覚化のために行い、伝播情報は、タイミングマップ内にある。
。
7.疾患モデル
i.自閉症
217巻(1号):47~54頁を参照されたい。自閉症などの疾患についてのニューロンモデルは、以下の遺伝子:SHANK3(ProSAP2)、CDH9、CDH10、MAPK3、SERT(SLC6A4)、CACNA1G、GABRB3、GABRA4、EN2、3q25~27遺伝子座、SLC25A12、HOXA1、HOXA2、PRKCB1、MECP2、UBE3A、NLGN3、MET、CNTNAP2、FOXP2、GSTP1、PRL、PRLR、およびOXTRのうちの1または複数に対する変異などの遺伝子型特徴に基づき、選択することができる。
2年、「Disease-specific phenotypes in dopamine neurons from human iPS-based models of genetic and sporadic Parkinson’s disease」、EMBO Mol Med、4巻:380~395頁を参照されたい。本発明の細胞は、膜電位についての光レポーター、細胞内カルシウムレベルについてのレポーター、光依存性イオンチャネル、またはこれらの組合せで形質転換することができる。細胞は、自閉症など、対象状態のニューロンへの影響を調べるために、疾患の進行のときの活動電位および細胞内カルシウムレベルの変化を誘導および観察することにより、経時的にモニタリングすることができる。疾患モデルの対象細胞はまた、それらの有効性を評価するために、多様な治療を適用する前および適用した後にもモニタリングすることができる。
ii.てんかん
2年、「Disease-specific phenotypes in dopamine neurons from human iPS-based models of genetic and sporadic Parkinson’s disease」、EMBO Mol Med、4巻:380~395頁を参照されたい。本発明の細胞は、膜電位についての光レポーター、細胞内カルシウムレベルについてのレポーター、光依存性イオンチャネル、またはこれらの組合せで形質転換することができる。細胞は、てんかんなど、対象状態のニューロンへの影響を調べるために、疾患の進行のときの活動電位および細胞内カルシウムレベルの変化を誘導および観察することにより、ある期間にわたり、モニタリングすることができる。疾患モデルの対象細胞はまた、それらの有効性を評価するために、多様な治療を適用する前および適用した後にもモニタリングすることができる。
iii.ALS
7~54頁;Kawashimaら、1998年、「Skein-like inclusions in the neostriatum from a case of amyotrophic lateral sclerosis with dementia」、Acta
Neuropathol、96巻(5号):541~5頁;Okamotoら、1993年、「Bunina bodies in amyotrophic lateral sclerosis immunostained with rabbit anti-cystatin C serum」、Neurosci Lett.、162巻(1~2号):125~8頁を参照されたい。ALSなどの疾患についてのニューロンモデルは、以下の遺伝子:C9orf72、SOD1、TARDBP、FUS、UBQL2、ALS2、およびSETXのうちの1または複数に対する変異などの遺伝子型特徴に基づき、選択することができる。
いての光レポーター、細胞内カルシウムレベルについてのレポーター、光依存性イオンチャネル、またはこれらの組合せで形質転換することができる。細胞は、ALSなど、対象状態のニューロンへの影響を調べるために、疾患の進行のときの活動電位および細胞内カルシウムレベルの変化を誘導および観察することにより、ある期間にわたり、モニタリングすることができる。疾患モデルの対象細胞はまた、それらの有効性を評価するために、多様な治療を適用する前および適用した後にもモニタリングすることができる。
iv.結節性硬化症
2年、「Disease-specific phenotypes in dopamine neurons from human iPS-based models of genetic and sporadic Parkinson’s disease」、EMBO Mol Med、4巻:380~395頁を参照されたい。本発明の細胞は、膜電位についての光レポーター、細胞内カルシウムレベルについてのレポーター、光依存性イオンチャネル、またはこれらの組合せで形質転換することができる。細胞は、結節性硬化症など、対象状態のニューロンへの影響を調べるために、疾患の進行のときの活動電位および細胞内カルシウムレベルの変化を誘導および観察することにより、ある期間にわたり、モニタリングすることができる。疾患モデルの対象細胞はまた、それらの有効性を評価するために、多様な治療を適用する前および適用した後にもモニタリングすることができる。
v.NGN2ニューロン
8.診断
スパイク列(対照シグネチャー)における極大点をまず同定し、次いで、対照シグネチャー内のその点における確率を、同じ点における患者の被験シグネチャーにおける確率と比較し、報告可能な差異(例えば、少なくとも5%異なる)を探索するようにプログラムすることもできる。当業者は、被験シグネチャーの、対照シグネチャーとの比較では、任意の適切な基準を使用しうることを認識する。ある特定の実施形態では、コンピュータシステムを、機械学習により訓練する(例えば、既知の健常者および既知の患者についての多数の例を入力し、コンピュータシステムにより、これらの間の平均の差異、または疾患シグネチャーの平均シグネチャーパターンを測定する)。コンピュータシステムにより、疾患表現型についてのシグネチャーパターンを保存する場合、コンピュータシステムにより、被験シグネチャーと対照シグネチャーとの間の合致(例えば、いくつかの点における差異またはある距離にわたり積分するときの差異が<5%または1%未満であること)が見出されれば、診断が裏付けられる。患者からのゲノム編集された細胞系に由来する対照シグネチャーを得ることについて論じてきたが、当業者は、対照シグネチャーは、本発明のコンピュータシステム内に保存された鋳型の場合もあり、記録された対照シグネチャーの場合もあることを認識する。
9.さらなる方法
9.本発明のシステム
参照による組込み
同等物
SOD1遺伝子における単一遺伝子性変異(SOD1A4V)に由来する、筋萎縮性側索硬化症(ALS)の運動ニューロンモデルの光学的分化
年、「Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis?」、Brain、136巻:2342~2358頁を参照されたい。SOD1変異以外の他の遺伝子欠損も、ALSを引き起こしうることが公知である。PasinelliおよびBrown、2006年、「Molecular biology of amyotrophic lateral sclerosis: insights from genetics」、Nat Rev Neurosci、7巻:710~723頁;ならびにBlokhuisら、2013年、「Protein aggregation in amyotrophic lateral sclerosis」、Acta Neuropathol、125巻:777~794頁を参照されたい。したがって、単一の変異の存在を同定するだけでは、患者を診断および処置するのに不十分であると判明し得、このような変異の表現型帰結を、患者の実際の遺伝的帰結と共に研究することが貴重であることが判明し得る。今日の研究は、公知の遺伝子、生理学的経路、およびタンパク質をターゲティングすることにより、疾患の進行を遅らせることを目的とする処置戦略を支持する。さらなる議論については、Gordon、2013年、「Amyotrophic later sclerosis:
an update for 2013 clinical features, pathophysiology, management, and
therapeutic trials」、Aging and Disease、4巻(5号):295~310頁を参照されたい。以下のプロトコールにより、SOD1A4Vを有することが公知のALS診断を有する人間に由来する細胞系における運動ニューロンに対するSOD1A4Vの効果を記録した。
(1)線維芽細胞は、ALSを有すると診断され、SOD1における変異を確認された患者から採取した。
(2)線維芽細胞を、人工多能性幹(iPS)細胞へと転換した。
(3)ジンクフィンガードメインを使用して、第2の遺伝子補正細胞系(Sod1V4A)を生成する結果として、2つの、他の点では同系の細胞系をもたらした。
(4)胚様体を使用して、疾患iPS細胞および補正iPS細胞を、運動ニューロンへと分化させた。
(5)分化させた運動ニューロンを解離させ、ポリ-d-リシンおよびラミニンでコーティングされたガラス製カバースリップへと播種した。
(6)運動ニューロンに、N2、B27、GDNF、BDNF、およびCTNFを補充したneurobasal培地を供給した。
(7)培養の4日後、ニューロンに、遺伝子コード型蛍光電位レポーター(QuasAr2)および光電位アクチュエーター(CheRiff)を保持するレンチウイルスを感染させた。
(8)ニューロンを、感染後8~10日間にわたり、さらに成熟させた。
(9)ニューロンを、高解像度の顕微鏡上で、電位イメージングのための640nmのレーザー(600W/cm)によりイメージングし、488nmのレーザー(20~200mW/cm)で励起した。
(10)赤色光および青色光のパルス列を使用して、電位についての光学的刺激の増大下における活動電位を記録した(図6)。
(11)疾患運動ニューロンおよび補正運動ニューロンに由来する細胞集団を測定した。(12)独立成分分析を使用して、視野内の個別の細胞を単離した(図7~10)。
(13)光退色を除去し、中央値フィルタリングされた出力波形を差し引き、ノイズ閾値を上回るデータを単離することにより、活動電位を同定した。
(14)細胞の興奮性は、各青色光刺激の間にスパイクが発生する確率と、無刺激(自発発火)の間にスパイクが発生する確率とにより測定した(図19)。
Claims (16)
- てんかんを処置するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
化合物を、てんかんの1または複数の表現型特徴または遺伝子型特徴を有するニューロンを含む試料へと提示するステップであって、該ニューロンが、膜電位についての光レポーター、細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質、および光依存性イオンチャネルを発現するステップと;
該化合物の提示の後で、顕微鏡検査システムを介して、該光依存性イオンチャネルの該顕微鏡検査システムからの光学的刺激に応答して該光レポーターにより発せられる光シグナル、および、該試料中の該細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質からの光シグナルを受け取るステップであって、ここで、該光学的刺激は、該膜電位についての光レポーターの蛍光を誘導せず、該膜電位と細胞内カルシウムレベルについてのレポーターをイメージングするのに使用される光は、光依存性イオンチャネルを作動させず、そして、該レポーターにより発せられる光シグナルは識別可能であり、ここで、
前記膜電位についての光レポーターは微生物型ロドプシンを含み、そして、前記微生物型ロドプシンが、QuasAr1またはQuasAr2を含み;
前記光依存性イオンチャネルが、藻類チャネルロドプシンを含み;かつ
前記細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質が、GCaMPバリアントを含む、受け取るステップと;
対照と比べたAP波形の変化および細胞内カルシウムレベルの変化を分析して、該光シグナルに基づき、該化合物を、てんかんを処置するための候補として同定するステップとを含む方法。 - 前記ニューロンが、SCN1A、WWOX、PRRT2、KCNC1、STX1B、CARS2、STXB1、KCNQ2、CDKL5、ARX、SPTAN、BRAT1、KCNQ3、SCN2A、GABA受容体、NIPA2、CDKL5、PCDH19、およびNAV1.1からなる群から選択される遺伝子における変異を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記顕微鏡検査システムが、前記光学的刺激をもたらすディジタル式マイクロミラーデバイスを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記顕微鏡検査システムが、前記ニューロンからの前記光シグナルを捕捉するように構成された電荷結合素子カメラをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ニューロンが、無病ニューロンと比較した電位依存性ナトリウムチャネル機能の減損および過剰興奮性からなる群から選択される表現型特徴を発現する、請求項1に記載の方法。
- 前記ニューロンを、前記光依存性イオンチャネルを発現する第2のニューロンにより刺激する、請求項1に記載の方法。
- 前記第2のニューロンがまた、膜電位についての前記光レポーターも発現する、請求項6に記載の方法。
- 細胞内カルシウムレベルの変化を報告する前記タンパク質が、jRCaMP1a、jRGECO1a、およびRCaMP2からなる群から選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記ニューロンが、hiPSC由来のニューロンである、請求項1に記載の方法。
- 複数のニューロンを、基材上の細胞培養物において、空間的にパターン化させるステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記化合物が、ラコサミドまたはレベチラセタムを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記分析するステップが、前記試料の前記光シグナルを、対照細胞から得られる光シグナルと比較することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記微生物型ロドプシンを、前記ニューロンへと組み入れられた遺伝子から発現させる、請求項1に記載の方法。
- 前記光依存性イオンチャネルが、青方偏移アクチュエーターを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記青方偏移アクチュエーターが、TsChRまたはPsChRを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記光依存性イオンチャネルが、<450nmの波長で励起極大を有する青方偏移アクチュエーターを含み、前記細胞内カルシウムレベルの前記変化を報告する前記タンパク質が、端点を含む520nm~570nmの間で励起極大を有する赤方偏移カルシウムインジケーターを含む、請求項5に記載の方法。
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