JP2017518738A - 化合物の光遺伝学的分析 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、2014年4月22日に出願された、米国仮特許出願第61/982,589号の利益および優先権を主張し、その内容は、参照によって援用される。
本発明は、化合物を、ニューロン細胞に対するそれらの効果について光学的にスクリーニングする方法に関する。
1.自閉症
2.てんかん
3.アルツハイマー病
4.筋萎縮性側索硬化症
5.結節性硬化症
6.イオンチャネルモジュレーター
7.単一因子細胞
1.細胞を得る
2.細胞をニューロンまたは特異的な神経亜型へと転換する
2a.細胞のiPSへの転換およびiPSの特異的細胞型への転換
2b.細胞の特異的細胞型への直接的な転換
2c.分化細胞の維持
3.ゲノム編集
4.細胞に光遺伝学的系を発現させる
4a.細胞に光遺伝学的レポーターを発現させる
4b.細胞に光遺伝学的アクチュエーターを発現させる
4c.光遺伝学的系を発現させるためのベクター
4d.電位およびCa2+の同時的な測定のための光遺伝学的構築物および播種スキーム
4e.マルチモードセンシング/マルチプレックス化
4f.光学的リードアウト
4g.空間的分離
4h.パターン化した照射
4i.電位イメージングのための平板の調製
4j.同時的な電位イメージングおよびカルシウムイメージングのための平板の調製
5.イメージング活動アッセイ
5a.画像の捕捉
5b.動画からの蛍光の抽出
6.シグナルの処理
6a.シグナルを細胞と関連させる、独立成分分析によるシグナルの処理
6b.サブナイキスト活動電位タイミング (SNAPT)を介するシグナルの処理
7.疾患モデル
i.自閉症
ii.てんかん
iii.ALS
iv.結節性硬化症
v.NGN2ニューロン
8.診断
9.さらなる方法
9.本発明のシステム
参照による組込み
同等物
SOD1遺伝子における単一遺伝子性変異(SOD1A4V)に由来する、筋萎縮性側索硬化症(ALS)の運動ニューロンモデルの光学的分化
(1)線維芽細胞は、ALSを有すると診断され、SOD1における変異を確認された患者から採取した。
(2)線維芽細胞を、人工多能性幹(iPS)細胞へと転換した。
(3)ジンクフィンガードメインを使用して、第2の遺伝子補正細胞系(Sod1V4A)を生成する結果として、2つの、他の点では同系の細胞系をもたらした。
(4)胚様体を使用して、疾患iPS細胞および補正iPS細胞を、運動ニューロンへと分化させた。
(5)分化させた運動ニューロンを解離させ、ポリ−d−リシンおよびラミニンでコーティングされたガラス製カバースリップへと播種した。
(6)運動ニューロンに、N2、B27、GDNF、BDNF、およびCTNFを補充したneurobasal培地を供給した。
(7)培養の4日後、ニューロンに、遺伝子コード型蛍光電位レポーター(QuasAr2)および光電位アクチュエーター(CheRiff)を保持するレンチウイルスを感染させた。
(8)ニューロンを、感染後8〜10日間にわたり、さらに成熟させた。
(9)ニューロンを、高解像度の顕微鏡上で、電位イメージングのための640nmのレーザー(600W/cm)によりイメージングし、488nmのレーザー(20〜200mW/cm)で励起した。
(10)赤色光および青色光のパルス列を使用して、電位についての光学的刺激の増大下における活動電位を記録した(図6)。
(11)疾患運動ニューロンおよび補正運動ニューロンに由来する細胞集団を測定した。
(12)独立成分分析を使用して、視野内の個別の細胞を単離した(図7〜10)。
(13)光退色を除去し、中央値フィルタリングされた出力波形を差し引き、ノイズ閾値を上回るデータを単離することにより、活動電位を同定した。
(14)細胞の興奮性は、各青色光刺激の間にスパイクが発生する確率と、無刺激(自発発火)の間にスパイクが発生する確率とにより測定した(図19)。
Claims (208)
- アルツハイマー病を処置するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
化合物を、アルツハイマー病の1または複数の表現型特徴または遺伝子型特徴を有するニューロン細胞を含む試料へと提示するステップであって、該ニューロン細胞が、膜電位についての光レポーターおよび光依存性イオンチャネルを発現するステップと;
該化合物の提示の後で、該試料の光学的刺激に応答して該光レポーターにより発せられる光シグナルを、顕微鏡検査システムを介して受け取るステップと;
該光シグナルに基づき、該化合物を、アルツハイマー病を処置するための候補として同定するステップと
を含む方法。 - 前記表現型特徴が、アミロイドβおよび過リン酸化タウタンパク質の細胞外沈着から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記遺伝子型特徴が、アミロイド前駆体タンパク質(APP)、プレセニリン1(PS1)、およびプレセニリン2(PS2)からなる群から選択される遺伝子における変異を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記顕微鏡検査システムが、前記光学的刺激をもたらすディジタル式マイクロミラーデバイスを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記顕微鏡検査システムが、前記ニューロン細胞からの前記光シグナルを捕捉するように構成された電荷結合素子カメラをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ニューロン細胞がまた、細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質も発現する、請求項1に記載の方法。
- 前記ニューロン細胞を、前記光依存性イオンチャネルを発現する第2のニューロン細胞により刺激する、請求項6に記載の方法。
- 前記第2のニューロン細胞がまた、膜電位についての前記光レポーターも発現する、請求項7に記載の方法。
- 前記光依存性イオンチャネルが、藻類チャネルロドプシンを含み;
細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質が、GCaMPバリアントを含む、
請求項6に記載の方法。 - 前記ニューロン細胞が、hiPSC由来のニューロンである、請求項1に記載の方法。
- 前記ニューロン細胞を前記化合物へと曝露したときのAP波形の変化および前記細胞内カルシウムレベルの変化を検出するステップをさらに含む、請求項6に記載の方法。
- 複数のニューロン細胞を、基材上の細胞培養物において、空間的にパターン化させるステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記光シグナルを得るステップを、光学顕微鏡検査システムを使用して実施する、請求項1に記載の方法。
- 前記光学顕微鏡検査システムが、少なくとも1つのディジタル式マイクロミラーデバイスを含む、請求項13に記載の方法。
- 前記光シグナルを分析するステップが、前記化合物のAP波形に対する効果を検出することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞培養物を、β−アミロイド1〜42ならびに前記化合物へと曝露するステップと、作用物質を有する前記化合物の前記ニューロンに対する効果を決定するステップとをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 光遺伝学的アクチュエーターを発現する第1のニューロンと;
該第1のニューロンと電気的に近接する第2のニューロンであって、活動についての遺伝子コード型光レポーターを発現する第2のニューロンと
を含み、
該第1のニューロンまたは該第2のニューロンのうちの少なくとも1つが、アルツハイマー病の1または複数の表現型特徴または遺伝子型特徴を有する、
細胞培養物。 - 前記表現型特徴が、アミロイドβおよび過リン酸化タウタンパク質の細胞外沈着から選択される、請求項17に記載の細胞培養物。
- 前記遺伝子型特徴が、アミロイド前駆体タンパク質(APP)、プレセニリン1(PS1)、およびプレセニリン2(PS2)からなる群から選択される遺伝子における変異を含む、請求項17に記載の細胞培養物。
- 前記光遺伝学的アクチュエーターが、チャネルロドプシンを含む、請求項17に記載の細胞培養物。
- 活動についての前記遺伝子コード型光レポーターが、膜電位についての微生物型光レポーターを含む、請求項17に記載の細胞培養物。
- 前記第2のニューロンが、遺伝子コード型Ca++インジケーターを発現する、請求項21に記載の細胞培養物。
- 前記遺伝子コード型Ca++インジケーターが、GCaMP6f、jRCaMP1a、jRGECO1a、およびRCaMP2からなるリストから選択される少なくとも1つを含む、請求項22に記載の細胞培養物。
- 前記第1のニューロンが、前記第2のニューロンから空間的に分けられているが、該第2の運動ニューロンと電気的に接触している、請求項17に記載の細胞培養物。
- 活動についての前記遺伝子コード型光レポーターが、膜電位についての微生物型光レポーターを含む、請求項24に記載の細胞培養物。
- 前記第2のニューロンが、遺伝子コード型Ca++インジケーターを発現する、請求項25に記載の細胞培養物。
- 前記遺伝子コード型Ca++インジケーターが、GCaMP6f、jRCaMP1a、jRGECO1a、およびRCaMP2からなるリストから選択される少なくとも1つを含む、請求項26に記載の細胞培養物。
- 自閉症を処置するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
化合物を、自閉症の1または複数の表現型特徴または遺伝子型特徴を有するニューロンを含む試料へと提示するステップであって、該ニューロンが、膜電位についての光レポーターおよび光依存性イオンチャネルを発現するステップと;
該化合物の提示の後で、該試料の光学的刺激に応答して該光レポーターにより発せられる光シグナルを、顕微鏡検査システムを介して受け取るステップと;
該光シグナルに基づき、該化合物を、自閉症を処置するための候補として同定するステップと
を含む方法。 - 前記表現型特徴が、無病ニューロンと比較したSHANK3タンパク質の発現の低減、無病ニューロンと比較したシナプス機能の低下、無病ニューロンと比較した樹状突起棘の数の低減および長さの増大、ならびに無病ニューロンと比較したシナプス後肥厚部の厚さおよび長さの低減からなる群から選択される、請求項28に記載の方法。
- 前記遺伝子型特徴が、SHANK3、CDH9、CDH10、MAPK3、SERT、CACNA1G、GABRB3、GABRA4、EN2、3q25〜27遺伝子座、SLC25A12、HOXA1、HOXA2、PRKCB1、MECP2、UBE3A、NLGN3、MET、CNTNAP2、FOXP2、GSTP1、PRL、PRLR、およびOXTRからなる群から選択される遺伝子における変異を含む、請求項28に記載の方法。
- 前記顕微鏡検査システムが、前記光学的刺激をもたらすディジタル式マイクロミラーデバイスを含む、請求項28に記載の方法。
- 前記顕微鏡検査システムが、前記ニューロンからの前記光シグナルを捕捉するように構成された電荷結合素子カメラをさらに含む、請求項28に記載の方法。
- 前記ニューロンがまた、細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質も発現する、請求項28に記載の方法。
- 前記ニューロンを、前記光依存性イオンチャネルを発現する第2のニューロンにより刺激する、請求項33に記載の方法。
- 前記第2のニューロンがまた、膜電位についての前記光レポーターも発現する、請求項34に記載の方法。
- 前記光依存性イオンチャネルが、藻類チャネルロドプシンを含み;
細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質が、GCaMPバリアントを含む、
請求項33に記載の方法。 - 細胞内カルシウムレベルの変化を報告する前記タンパク質が、jRCaMP1a、jRGECO1a、およびRCaMP2からなる群から選択される、請求項33に記載の方法。
- 前記ニューロンが、hiPSC由来のニューロンである、請求項28に記載の方法。
- 前記ニューロンを前記化合物へと曝露したときのAP波形の変化および前記細胞内カルシウムレベルの変化を検出するステップをさらに含む、請求項33に記載の方法。
- 複数のニューロンを、基材上の細胞培養物において、空間的にパターン化させるステップをさらに含む、請求項28に記載の方法。
- 前記光依存性イオンチャネルが、<450nmの波長で励起極大を有する青方偏移アクチュエーターを含み、前記細胞内カルシウムレベルの前記変化を報告する前記タンパク質が、端点を含む520nm〜570nmの間で励起極大を有する赤方偏移カルシウムインジケーターを含む、請求項33に記載の方法。
- 前記同定するステップが、前記試料の前記光シグナルを、対照細胞から得られる光シグナルと比較することを含む、請求項28に記載の方法。
- 膜電位についての前記光レポーターが、微生物型ロドプシンを含む、請求項28に記載の方法。
- 前記微生物型ロドプシンが、QuasAr1またはQuasAr2を含む、請求項43に記載の方法。
- 前記微生物型ロドプシンを、前記ニューロンへと組み入れられた遺伝子から発現させる、請求項43に記載の方法。
- 前記光依存性イオンチャネルが、青方偏移アクチュエーターを含む、請求項28に記載の方法。
- 前記青方偏移アクチュエーターが、TsChRまたはPsChRを含む、請求項46に記載の方法。
- 光依存性イオンチャネルを発現する第1のニューロンと;
該第1のニューロンと電気的に近接する第2のニューロンであって、活動についての遺伝子コード型光レポーターを発現する第2のニューロンと
を含み、
該第1のニューロンまたは該第2のニューロンのうちの少なくとも1つが、自閉症の1または複数の表現型特徴または遺伝子型特徴を含む、
細胞培養物。 - 前記表現型特徴が、無病ニューロンと比較したSHANK3タンパク質の発現の低減、無病ニューロンと比較したシナプス機能の低下、無病ニューロンと比較した樹状突起棘の数の低減および長さの増大、ならびに無病ニューロンと比較したシナプス後肥厚部の厚さおよび長さの低減からなる群から選択される、請求項48に記載の細胞培養物。
- 前記遺伝子型特徴が、SHANK3、CDH9、CDH10、MAPK3、SERT、CACNA1G、GABRB3、GABRA4、EN2、3q25〜27遺伝子座、SLC25A12、HOXA1、HOXA2、PRKCB1、MECP2、UBE3A、NLGN3、MET、CNTNAP2、FOXP2、GSTP1、PRL、PRLR、およびOXTRからなる群から選択される遺伝子における変異を含む、請求項48に記載の細胞培養物。
- 前記光依存性イオンチャネルが、チャネルロドプシンを含む、請求項48に記載の細胞培養物。
- 前記第2のニューロンが、遺伝子コード型Ca++インジケーターを発現する、請求項48に記載の細胞培養物。
- てんかんを処置するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
化合物を、てんかんの1または複数の表現型特徴または遺伝子型特徴を有するニューロンを含む試料へと提示するステップであって、該ニューロンが、膜電位についての光レポーターおよび光依存性イオンチャネルを発現するステップと;
該化合物の提示の後で、該試料の光学的刺激に応答して該光レポーターにより発せられる光シグナルを、顕微鏡検査システムを介して受け取るステップと;
該光シグナルに基づき、該化合物を、てんかんを処置するための候補として同定するステップと
を含む方法。 - 前記表現型特徴が、無病ニューロンと比較した電位依存性ナトリウムチャネル機能の減損および過剰興奮性からなる群から選択される、請求項53に記載の方法。
- 前記遺伝子型特徴が、SCN1A、WWOX、PRRT2、KCNC1、STX1B、CARS2、STXB1、KCNQ2、CDKL5、ARX、SPTAN、BRAT1、KCNQ3、SCN2A、GABA受容体、NIPA2、CDKL5、PCDH19、およびNAV1.1からなる群から選択される遺伝子における変異を含む、請求項53に記載の方法。
- 前記顕微鏡検査システムが、前記光学的刺激をもたらすディジタル式マイクロミラーデバイスを含む、請求項53に記載の方法。
- 前記顕微鏡検査システムが、前記ニューロンからの前記光シグナルを捕捉するように構成された電荷結合素子カメラをさらに含む、請求項53に記載の方法。
- 前記ニューロンがまた、細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質も発現する、請求項53に記載の方法。
- 前記ニューロンを、前記光依存性イオンチャネルを発現する第2のニューロンにより刺激する、請求項58に記載の方法。
- 前記第2のニューロンがまた、膜電位についての前記光レポーターも発現する、請求項59に記載の方法。
- 前記光依存性イオンチャネルが、藻類チャネルロドプシンを含み;
細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質が、GCaMPバリアントを含む、
請求項60に記載の方法。 - 細胞内カルシウムレベルの変化を報告する前記タンパク質が、jRCaMP1a、jRGECO1a、およびRCaMP2からなる群から選択される、請求項58に記載の方法。
- 前記ニューロンが、hiPSC由来のニューロンである、請求項53に記載の方法。
- 前記ニューロンを前記化合物へと曝露したときのAP波形の変化および前記細胞内カルシウムレベルの変化を検出するステップをさらに含む、請求項58に記載の方法。
- 複数のニューロンを、基材上の細胞培養物において、空間的にパターン化させるステップをさらに含む、請求項53に記載の方法。
- 前記化合物が、ラコサミドまたはレベチラセタムを含む、請求項53に記載の方法。
- 前記同定するステップが、前記試料の前記光シグナルを、対照細胞から得られる光シグナルと比較することを含む、請求項53に記載の方法。
- 膜電位についての前記光レポーターが、微生物型ロドプシンを含む、請求項53に記載の方法。
- 前記微生物型ロドプシンが、QuasAr1またはQuasAr2を含む、請求項68に記載の方法。
- 前記微生物型ロドプシンを、前記ニューロンへと組み入れられた遺伝子から発現させる、請求項68に記載の方法。
- 前記光依存性イオンチャネルが、青方偏移アクチュエーターを含む、請求項53に記載の方法。
- 前記青方偏移アクチュエーターが、TsChRまたはPsChRを含む、請求項71に記載の方法。
- 前記光依存性イオンチャネルが、<450nmの波長で励起極大を有する青方偏移アクチュエーターを含み、前記細胞内カルシウムレベルの前記変化を報告する前記タンパク質が、端点を含む520nm〜570nmの間で励起極大を有する赤方偏移カルシウムインジケーターを含む、請求項58に記載の方法。
- 光依存性イオンチャネルを発現する第1のニューロンと;
該第1のニューロンと電気的に近接する第2のニューロンであって、活動についての遺伝子コード型光レポーターを発現する第2のニューロンと
を含み、
該第1のニューロンまたは該第2のニューロンのうちの少なくとも1つが、てんかんの1または複数の表現型特徴または遺伝子型特徴を含む、
細胞培養物。 - 前記表現型特徴が、無病ニューロンと比較した電位依存性ナトリウムチャネル機能の減損および過剰興奮性からなる群から選択される、請求項74に記載の細胞培養物。
- 前記遺伝子型特徴が、SCN1A、WWOX、PRRT2、KCNC1、STX1B、CARS2、STXB1、KCNQ2、CDKL5、ARX、SPTAN、BRAT1、KCNQ3、SCN2A、GABA受容体、NIPA2、CDKL5、PCDH19、およびNAV1.1からなる群から選択される遺伝子における変異を含む、請求項74に記載の細胞培養物。
- 前記光依存性イオンチャネルが、チャネルロドプシンを含む、請求項74に記載の細胞培養物。
- 前記第2のニューロンが、遺伝子コード型Ca++インジケーターを発現する、請求項74に記載の細胞培養物。
- 前記遺伝子コード型Ca++インジケーターが、GCaMP6f、jRCaMP1a、jRGECO1a、およびRCaMP2からなるリストから選択される少なくとも1つを含む、請求項78に記載の細胞培養物。
- 前記第1のニューロンが、前記第2のニューロンから空間的に分けられ、かつ、該第2の運動ニューロンと電気的に接触している、請求項74に記載の細胞培養物。
- 結節性硬化症を処置するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
化合物を、結節性硬化症の1または複数の表現型特徴または遺伝子型特徴を有するニューロンを含む試料へと提示するステップであって、該ニューロンが、膜電位についての光レポーターおよび光依存性イオンチャネルを発現するステップと;
該化合物の提示の後で、該試料の光学的刺激に応答して該光レポーターにより発せられる光シグナルを、顕微鏡検査システムを介して受け取るステップと;
該光シグナルに基づき、該化合物を、結節性硬化症を処置するための候補として同定するステップと
を含む方法。 - 前記表現型特徴が、無病ニューロンと比較したサイズの肥大、ホスホ−S6発現の増大、顕著なリソソーム、無病ニューロンと比較したより多いマイクロフィラメントおよび微小管、無病ニューロンと比較したより少ないリポフスチン顆粒、およびTSC2遺伝子産物、ツベリン、ビメンチン、またはグリア線維性酸性タンパク質に対する免疫反応性からなる群から選択される、請求項81に記載の方法。
- 前記遺伝子型特徴が、TSC1またはTSC2からなる群から選択される遺伝子における変異を含む、請求項81に記載の方法。
- 前記顕微鏡検査システムが、前記光学的刺激をもたらすディジタル式マイクロミラーデバイスを含む、請求項81に記載の方法。
- 前記顕微鏡検査システムが、前記ニューロンからの前記光シグナルを捕捉するように構成された電荷結合素子カメラをさらに含む、請求項81に記載の方法。
- 前記ニューロンがまた、細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質も発現する、請求項81に記載の方法。
- 前記ニューロンを、前記光依存性イオンチャネルを発現する第2のニューロンにより刺激する、請求項86に記載の方法。
- 前記第2のニューロンがまた、膜電位についての前記光レポーターも発現する、請求項87に記載の方法。
- 前記光依存性イオンチャネルが、藻類チャネルロドプシンを含み;
細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質が、GCaMPバリアントを含む、
請求項88に記載の方法。 - 細胞内カルシウムレベルの変化を報告する前記タンパク質が、jRCaMP1a、jRGECO1a、およびRCaMP2からなる群から選択される、請求項86に記載の方法。
- 前記ニューロンが、hiPSC由来のニューロンである、請求項81に記載の方法。
- 前記ニューロンを前記化合物へと曝露したときのAP波形の変化および前記細胞内カルシウムレベルの変化を検出するステップをさらに含む、請求項86に記載の方法。
- 複数のニューロンを、基材上の細胞培養物において、空間的にパターン化させるステップをさらに含む、請求項81に記載の方法。
- 前記光依存性イオンチャネルが、<450nmの波長で励起極大を有する青方偏移アクチュエーターを含み、前記細胞内カルシウムレベルの前記変化を報告する前記タンパク質が、端点を含む520nm〜570nmの間で励起極大を有する赤方偏移カルシウムインジケーターを含む、請求項86に記載の方法。
- 前記同定するステップが、前記試料の前記光シグナルを、対照細胞から得られる光シグナルと比較することを含む、請求項81に記載の方法。
- 膜電位についての前記光レポーターが、微生物型ロドプシンを含む、請求項81に記載の方法。
- 前記微生物型ロドプシンが、QuasAr1またはQuasAr2を含む、請求項96に記載の方法。
- 前記微生物型ロドプシンを、前記ニューロンへと組み入れられた遺伝子から発現させる、請求項96に記載の方法。
- 前記光依存性イオンチャネルが、青方偏移アクチュエーターを含む、請求項81に記載の方法。
- 化合物の神経学的状態に対する効果を決定するための方法であって、
化合物を、複数のニューロンを含む試料へと提示するステップであって、該複数のニューロンのうちの少なくとも1つが、膜電位についての光レポーターを発現するステップと;
該化合物の提示の後で、該試料中の光依存性イオンチャネルの光学的刺激に応答して該光レポーターにより発せられる光シグナルを、顕微鏡検査システムを介して受け取るステップと;
該光シグナルに基づき、該化合物を、該神経学的状態を処置するための候補として同定するステップと
を含む方法。 - 前記光依存性イオンチャネルが、前記複数のニューロンのうちの前記少なくとも1つとシナプス連絡した第2のニューロンによって発現される藻類チャネルロドプシンを含み、膜電位についての前記光レポーターが、微生物型ロドプシンの野生型形態と比べて1〜10の間のアミノ酸置換を有する微生物型ロドプシンを含む、請求項100に記載の方法。
- 前記複数のニューロンのうちの前記少なくとも1つがまた、細胞内カルシウムレベルについての遺伝子コード型インジケーターも発現し、
前記受け取られた光シグナルが、細胞内カルシウムレベルについての該遺伝子コード型インジケーターからのシグナルを含み、さらに、前記神経学的状態が、自閉症、てんかん、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、および結節性硬化症のうちの1つである、
請求項101に記載の方法。 - 光依存性イオンチャネルを発現する第1のニューロンと;
該第1のニューロンと電気的に近接する第2のニューロンであって、活動についての遺伝子コード型光レポーターを発現する第2のニューロンと
を含み、
該第1のニューロンまたは該第2のニューロンのうちの少なくとも1つが、結節性硬化症の1または複数の表現型特徴または遺伝子型特徴を含む、
細胞培養物。 - 前記表現型特徴が、無病ニューロンと比較したサイズの肥大、ホスホ−S6発現の増大、顕著なリソソーム、無病ニューロンと比較したより多いマイクロフィラメントおよび微小管、無病ニューロンと比較したより少ないリポフスチン顆粒、およびTSC2遺伝子産物、ツベリン、ビメンチン、またはグリア線維性酸性タンパク質に対する免疫反応性からなる群から選択される、請求項103に記載の細胞培養物。
- 前記遺伝子型特徴が、TSC1またはTSC2からなる群から選択される遺伝子における変異を含む、請求項103に記載の細胞培養物。
- 前記光依存性イオンチャネルが、チャネルロドプシンを含む、請求項103に記載の細胞培養物。
- 前記第2のニューロンが、遺伝子コード型Ca++インジケーターを発現する、請求項103に記載の細胞培養物。
- 前記遺伝子コード型Ca++インジケーターが、GCaMP6f、jRCaMP1a、jRGECO1a、およびRCaMP2からなるリストから選択される少なくとも1つを含む、請求項107に記載の細胞培養物。
- 前記第1のニューロンが、前記第2のニューロンから空間的に分けられ、かつ、該第2の運動ニューロンと電気的に接触している、請求項103に記載の細胞培養物。
- ALSを処置するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
化合物を、ALSの1または複数の表現型特徴または遺伝子型特徴を有する運動ニューロンを含む試料へと提示するステップであって、該運動ニューロンが、膜電位についての光レポーターおよび光依存性イオンチャネルを発現するステップと;
該化合物の提示の後で、該試料の光学的刺激に応答して該光レポーターにより発せられる光シグナルを、顕微鏡検査システムを介して受け取るステップと;
該光シグナルに基づき、該化合物を、ALSを処置するための候補として同定するステップと
を含む方法。 - 前記表現型特徴が、ブニナ小体、レビー小体様封入体(LBI)、スケイン様封入体(SLI)の存在、変性の徴候、神経突起の短縮または非存在、細胞体の空胞化、核の断片化、および切断型カスパーゼ3からなる群から選択される、請求項110に記載の方法。
- 前記遺伝子型特徴が、C9orf72、SOD1、TARDBP、FUS、UBQL2、ALS2、およびSETXからなる群から選択される遺伝子における変異を含む、請求項110に記載の方法。
- 前記顕微鏡検査システムが、前記光学的刺激をもたらすディジタル式マイクロミラーデバイスを含む、請求項110に記載の方法。
- 前記顕微鏡検査システムが、前記運動ニューロンからの前記光シグナルを捕捉するように構成された電荷結合素子カメラをさらに含む、請求項110に記載の方法。
- 前記運動ニューロンがまた、細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質も発現する、請求項110に記載の方法。
- 前記運動ニューロンを、前記光依存性イオンチャネルを発現する第2のニューロンにより刺激する、請求項115に記載の方法。
- 前記第2のニューロンがまた、膜電位についての前記光レポーターも発現する、請求項116に記載の方法。
- 前記光依存性イオンチャネルが、藻類チャネルロドプシンを含み;
細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質が、GCaMPバリアントを含む、
請求項117に記載の方法。 - 細胞内カルシウムレベルの変化を報告する前記タンパク質が、jRCaMP1a、jRGECO1a、およびRCaMP2からなる群から選択される、請求項115に記載の方法。
- 前記運動ニューロンが、hiPSC由来の運動ニューロンである、請求項110に記載の方法。
- 前記運動ニューロンを前記化合物へと曝露したときのAP波形の変化および前記細胞内カルシウムレベルの変化を検出するステップをさらに含む、請求項115に記載の方法。
- 複数のニューロンを、基材上の細胞培養物において、空間的にパターン化させるステップをさらに含む、請求項110に記載の方法。
- 前記光依存性イオンチャネルが、<450nmの波長で励起極大を有する青方偏移アクチュエーターを含み、前記細胞内カルシウムレベルの前記変化を報告する前記タンパク質が、端点を含む520nm〜570nmの間で励起極大を有する赤方偏移カルシウムインジケーターを含む、請求項115に記載の方法。
- 前記同定するステップが、前記試料の前記光シグナルを、対照細胞から得られる光シグナルと比較することを含む、請求項110に記載の方法。
- 膜電位についての前記光レポーターが、微生物型ロドプシンを含む、請求項110に記載の方法。
- 前記微生物型ロドプシンが、QuasAr1またはQuasAr2を含む、請求項125に記載の方法。
- 前記微生物型ロドプシンを、前記運動ニューロンへと組み入れられた遺伝子から発現させる、請求項125に記載の方法。
- 前記光依存性イオンチャネルが、青方偏移アクチュエーターを含む、請求項110に記載の方法。
- 前記青方偏移アクチュエーターが、TsChRまたはPsChRを含む、請求項128に記載の方法。
- 光依存性イオンチャネルを発現する第1の運動ニューロンと;
該第1のニューロンと電気的に近接する第2のニューロンであって、活動についての遺伝子コード型光レポーターを発現する第2のニューロンと
を含み、
前記第1の運動ニューロンまたは前記第2の運動ニューロンのうちの少なくとも1つが、ALSの1または複数の表現型特徴または遺伝子型特徴を含む、
細胞培養物。 - 前記表現型特徴が、ブニナ小体、レビー小体様封入体(LBI)、スケイン様封入体(SLI)、変性の徴候、神経突起の短縮または非存在、細胞体の空胞化、核の断片化、および切断型カスパーゼ3からなる群から選択される、請求項130に記載の細胞培養物。
- 前記遺伝子型特徴が、C9orf72、SOD1、TARDBP、FUS、UBQL2、ALS2、およびSETXからなる群から選択される遺伝子における変異を含む、請求項130に記載の細胞培養物。
- 前記光依存性イオンチャネルが、チャネルロドプシンを含む、請求項130に記載の細胞培養物。
- 前記第2の運動ニューロンが、遺伝子コード型Ca++インジケーターを発現する、請求項130に記載の細胞培養物。
- 前記遺伝子コード型Ca++インジケーターが、GCaMP6f、jRCaMP1a、jRGECO1a、およびRCaMP2からなるリストから選択される少なくとも1つを含む、請求項134に記載の細胞培養物。
- 前記第1の運動ニューロンが、前記第2の運動ニューロンから空間的に分けられ、かつ、該第2の運動ニューロンと電気的に接触している、請求項130に記載の細胞培養物。
- イオンチャネルモジュレーターをスクリーニングするための方法であって、
化合物を、電気興奮性細胞を含む試料へと提示するステップであって、該電気興奮性細胞が、膜電位についての光レポーターとして発現するステップと;
該化合物の提示の後で、該試料の光学的刺激に応答して該光レポーターにより発せられる光シグナルを、検出システムを介して受け取るステップと;
該光シグナルを分析して、該化合物の該電気興奮性細胞に対する効果を決定するステップと
を含む方法。 - 前記光シグナルを分析して、前記化合物の前記電気興奮性細胞に対する効果を決定するステップが、該化合物がイオンチャネルモジュレーターとして機能することを決定することを含む、請求項137に記載の方法。
- 前記化合物のイオンチャネルモジュレーション効果を定量するステップをさらに含む、請求項137に記載の方法。
- 前記ステップを、少なくとも90の細胞培養物に対して並列的に実施することをさらに含む、請求項137に記載の方法。
- 前記電気興奮性細胞が、哺乳動物ニューロンである、請求項137に記載の方法。
- 前記ニューロンがまた、光依存性イオンチャネルも発現する、請求項141に記載の方法。
- 前記ニューロンがまた、細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質も発現する、請求項141に記載の方法。
- 前記ニューロンがまた、光依存性イオンチャネルも発現し、細胞内カルシウムレベルの変化を報告する前記タンパク質、光依存性イオンチャネル、および膜電位についての前記光レポーターの各々が、微生物型ロドプシンによりもたらされる、請求項143に記載の方法。
- 前記電気興奮性細胞が、哺乳動物ニューロンであり、光依存性イオンチャネルを発現する第2の電気興奮性細胞により刺激される、請求項137に記載の方法。
- 前記哺乳動物ニューロンがまた、細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質も発現する、請求項145に記載の方法。
- 前記光依存性イオンチャネルが、藻類チャネルロドプシンを含み;
細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質が、GCaMPバリアントを含む、
請求項146に記載の方法。 - 前記哺乳動物ニューロンが、hiPSC由来のニューロンである、請求項141に記載の方法。
- 前記ニューロンを前記化合物へと曝露したときのAP波形の変化および前記細胞内カルシウムレベルの変化を検出するステップをさらに含む、請求項143に記載の方法。
- 複数のニューロンを、基材上の細胞培養物において、空間的にパターン化させるステップをさらに含む、請求項137に記載の方法。
- 前記光シグナルを得るステップを、光学顕微鏡検査システムを使用して実施する、請求項137に記載の方法。
- 前記光学顕微鏡検査システムが、前記細胞培養物を照射するのに使用される光を空間的にパターン化させるために使用される少なくとも1つのディジタル式マイクロミラーデバイスを含む、請求項151に記載の方法。
- 前記光シグナルを分析するステップが、前記化合物のAP波形に対する効果を検出することを含む、請求項137に記載の方法。
- 電気的に活性な細胞を用意するステップと;
該電気的に活性な細胞へと、光活性化因子と、電気活動についての光レポーターとを組み込むステップと;
該細胞を、少なくとも1つの化合物へと曝露するステップと;
該細胞の光学的刺激に応答して該光レポーターにより発せられるシグネチャーを得るステップと;
該得られたシグネチャーに基づき、該少なくとも1つの化合物の細胞表現型に対する効果を同定するステップと
を含む化合物スクリーニング法。 - 複数の前記電気的に活性な細胞を、複数の異なる化合物へと曝露する、請求項154に記載の方法。
- 前記効果が、細胞の活動を表す、請求項155に記載の方法。
- 前記電気的に活性な細胞の各々に、前記光活性化因子および前記電気活動についての光レポーターの両方を発現させる、請求項154に記載の方法。
- 前記組み込むステップが、前記電気的に活性な細胞を、前記光活性化因子および前記電気活動についての光レポーターをコードする核酸を含むベクターで形質転換することを含む、請求項154に記載の方法。
- 前記電気的に活性な細胞が、ニューロン、心筋細胞、およびグリア細胞からなる群から選択される、請求項154に記載の方法。
- 前記光活性化因子が、前記光学的刺激に応答して、活動電位を惹起する、請求項154に記載の方法。
- 前記細胞の前記刺激が、前記光活性化因子を照射することを含む、請求項160に記載の方法。
- 前記細胞を前記用意するステップが、多能性幹細胞を、前記電気的に活性な細胞へと転換することを含む、請求項154に記載の方法。
- 前記同定するステップが、電気シグネチャーを、対照細胞から得られる対照シグネチャーと比較することを含む、請求項154に記載の方法。
- 対照細胞と前記電気的に活性な細胞とが、該電気的に活性な細胞における変異を除き同系となるように、該電気的に活性な細胞のゲノムを編集して、該対照細胞を作製するステップをさらに含む、請求項154に記載の方法。
- 前記得るステップが、細胞のクラスターを顕微鏡で観察すること、およびコンピュータを使用して、前記光レポーターにより発せられたシグナルを、細胞のクラスターに由来する複数のシグナルの中から単離することを含む、請求項154に記載の方法。
- 前記コンピュータで、独立成分分析を実施すること、および1つの単一細胞によって生じたスパイク列を同定することにより、前記シグナルを単離する、請求項165に記載の方法。
- イオンチャネルモジュレーターのアッセイにおける使用のための細胞であって、真核生物ゲノムを含み、電位を示す微生物型ロドプシンおよび光依存性イオンチャネルを発現する細胞。
- 前記微生物型ロドプシンが、膜電位についての光レポーターを含む、請求項167に記載の細胞。
- 前記微生物型ロドプシンが、QuasAr1およびQuasAr2からなるリストから選択される微生物型ロドプシンである、請求項168に記載の細胞。
- 前記細胞がまた、細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質も発現する、請求項167に記載の細胞。
- 前記細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質が、GCaMPバリアントを含む、請求項170に記載の細胞。
- 細胞内カルシウムレベルの変化を報告する前記タンパク質が、jRCaMP1a、jRGECO1a、およびRCaMP2からなるリストから選択されるタンパク質である、請求項167に記載の細胞。
- 前記光依存性イオンチャネルが、<450nmの波長で励起極大を有する青方偏移アクチュエーターを含み、前記細胞内カルシウムレベルの前記変化を報告する前記タンパク質が、端点を含む520nm〜570nmの間で励起極大を有する赤方偏移カルシウムインジケーターを含む、請求項170に記載の細胞。
- 前記光依存性イオンチャネルが、藻類チャネルロドプシンを含む、請求項167に記載の細胞。
- 前記光依存性イオンチャネルが、TsChRおよびPsChRからなるリストから選択される青方偏移アクチュエーターである青方偏移アクチュエーターを含む、請求項167に記載の細胞。
- 前記微生物型ロドプシンが、QuasAr1およびQuasAr2からなるリストから選択される微生物型ロドプシンである、請求項175に記載の細胞。
- 前記微生物型ロドプシンを、前記真核生物ゲノムへと組み入れられた遺伝子から発現させる、請求項167に記載の細胞。
- 前記微生物型ロドプシンが、QuasArタンパク質を含み、前記光依存性イオンチャネルが、チャネルロドプシンを含み、前記細胞が、コード型カルシウムインジケーターをさらに発現する、請求項167に記載の細胞。
- 前記コード型カルシウムインジケーターが、GCaMP6f、jRCaMP1a、jRGECO1a、およびRCaMP2からなる群から選択されるコード型カルシウムインジケーターである、請求項178に記載の細胞。
- 前記光依存性イオンチャネルが、紫励起光遺伝学的アクチュエーターを含み、細胞が、赤方偏移遺伝子コード型カルシウムインジケーターをさらに含む、請求項167に記載の細胞。
- 前記紫励起光遺伝学的アクチュエーターが、チャネルロドプシンを含み、前記赤方偏移遺伝子コード型カルシウムインジケーターが、jRCaMP1a、jRGECO1a、およびRCaMP2からなる群から選択される赤方偏移遺伝子コード型カルシウムインジケーターを含む、請求項180に記載の細胞。
- 前記細胞が、心筋細胞である、請求項167から181のいずれかに記載の細胞。
- 前記細胞が、ニューロンである、請求項167から181のいずれかに記載の細胞。
- 前記細胞が、ヒト人工多能性幹細胞である、請求項167から181のいずれかに記載の細胞。
- 細胞を特徴付けるための方法であって、
幹細胞に転写因子を発現させることにより、該幹細胞をニューロンへと転換するステップと;
該ニューロンへと、膜電位についての光レポーターおよび光依存性イオンチャネルを組み込むステップと;
該ニューロンの刺激に応答する該光レポーターからのシグナルを得るステップと;
該シグナルを評価し、これにより、該ニューロンを特徴付けるステップと
を含む方法。 - 前記転写因子が、NgN2である、請求項185に記載の方法。
- 膜電位についての前記光レポーターが、微生物型ロドプシンを含む、請求項186に記載の方法。
- 前記微生物型ロドプシンが、QuasAr1およびQuasAr2からなるリストから選択される微生物型ロドプシンである、請求項187に記載の方法。
- 前記ニューロンがまた、細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質も発現する、請求項185に記載の方法。
- 前記細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質が、GCaMPバリアントを含む、請求項189に記載の方法。
- 細胞内カルシウムレベルの変化を報告する前記タンパク質が、jRCaMP1a、jRGECO1a、およびRCaMP2からなるリストから選択されるタンパク質である、請求項189に記載の方法。
- 前記光依存性イオンチャネルが、<450nmの波長で励起極大を有する青方偏移アクチュエーターを含み、前記細胞内カルシウムレベルの前記変化を報告する前記タンパク質が、端点を含む520nm〜570nmの間で励起極大を有する赤方偏移カルシウムインジケーターを含む、請求項189に記載の方法。
- 前記ニューロンの前記刺激が、ディジタル式マイクロミラーデバイスを使用して、前記ニューロンを選択的に照射するように、光を空間的にパターン化することを含む、請求項189に記載の方法。
- 前記光依存性イオンチャネルが、藻類チャネルロドプシンを含む、請求項185に記載の方法。
- 前記光依存性イオンチャネルが、TsChRおよびPsChRからなるリストから選択される青方偏移アクチュエーターである青方偏移アクチュエーターを含む、請求項185に記載の方法。
- 前記微生物型ロドプシンを、ニューロンへと組み入れられた遺伝子から発現させる、請求項185に記載の方法。
- 前記微生物型ロドプシンが、QuasArタンパク質を含み、前記光依存性イオンチャネルが、チャネルロドプシンを含み、前記ニューロンが、コード型カルシウムインジケーターをさらに発現する、請求項185に記載の方法。
- 前記ニューロンの前記刺激が、該ニューロンと第2の細胞との間にシナプスを形成することと、ディジタル式マイクロミラーデバイスを使用して、該第2の細胞を選択的に照射するように、光を空間的にパターン化することとを含む、請求項185に記載の方法。
- 前記光依存性イオンチャネルが、紫励起光遺伝学的アクチュエーターを含み、前記ニューロンが、赤方偏移遺伝子コード型カルシウムインジケーターをさらに含む、請求項185に記載の方法。
- 前記紫励起光遺伝学的アクチュエーターが、チャネルロドプシンを含み、前記赤方偏移遺伝子コード型カルシウムインジケーターが、jRCaMP1a、jRGECO1a、およびRCaMP2からなる群から選択される赤方偏移遺伝子コード型カルシウムインジケーターを含む、請求項199に記載の方法。
- 外因性転写因子、膜電位についての光レポーター、および光依存性イオンチャネルを発現するニューロンであって、該転写因子もまた内因的に発現しているニューロン。
- 前記転写因子が、NgN2である、請求項201に記載のニューロン。
- 膜電位についての前記光レポーターが、微生物型ロドプシンを含む、請求項202に記載のニューロン。
- 前記微生物型ロドプシンが、QuasAr1である、請求項203に記載のニューロン。
- 細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質も発現する、請求項203に記載のニューロン。
- 前記細胞内カルシウムレベルの変化を報告するタンパク質が、GCaMPバリアントを含む、請求項205に記載のニューロン。
- 細胞内カルシウムレベルの変化を報告する前記タンパク質が、jRCaMP1a、jRGECO1a、およびRCaMP2からなるリストから選択されるタンパク質である、請求項205に記載のニューロン。
- 前記光依存性イオンチャネルが、<450nmの波長で励起極大を有する青方偏移アクチュエーターを含み、前記細胞内カルシウムレベルの前記変化を報告する前記タンパク質が、端点を含む520nm〜570nmの間で励起極大を有する赤方偏移カルシウムインジケーターを含む、請求項205に記載のニューロン。
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