JP7344140B2 - 細胞分析方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞分析方法に関するものである。

被検体を分析する方法として、該被検体に励起光を照射したときに発生するラマン散乱光のスペクトルに基づく方法が知られている。ラマン散乱スペクトルは被検体の分子振動を反映したものであることから、ラマン散乱スペクトルの形状に基づいて被検体を分析することができる。しかし、この分析方法では、通常、ラマン散乱の効率が非常に小さく、被検体が微量である場合には分析が困難である。このことから、従来、この分析方法が実用的に適用される被検体は、鉱物や高密度なプラスチックなどの物質に限定されてきた。

一方、表面増強ラマン散乱（Surface Enhanced Raman Scattering：ＳＥＲＳ）分光は、ラマン散乱効率の大幅な向上により高感度の測定が可能であり、低濃度試料の分析が可能であるとして注目されている。ＳＥＲＳ分光では、励起光が照射された金属微小構造において増強された電場（光子場）を発生させること（第１条件）、および、その増強された電場が到達する金属微小構造のごく近傍に定常的に被検体が存在すること（第２条件）、の２つの主条件が満たされることにより、被検体から高強度のラマン散乱光を発生させることができる。

第１条件を効率よく達成するために、ナノメートルオーダーのサイズの多様な形状の金属微小構造配列体が設計され、この金属微小構造配列体を表面に備える基板（ＳＥＲＳ基板）を利用し、このＳＥＲＳ基板に被検体を滴下するなどして、ＳＥＲＳ分光による被検体の分析を行うことが提案されている。また、金属コロイド（例えば、銀コロイド粒子、金コロイド粒子）が分散した分散液を利用し、この金属コロイド分散液に被検体を入れることで、ＳＥＲＳ分光による被検体の分析を行うことが提案されている。

ＳＥＲＳ基板を利用する場合および金属コロイド分散液を利用する場合の何れにおいても、ＳＥＲＳ分光による被検体の分析を行うには上記第２条件が満たされることが必要である。すなわち、増強された電場が得られる領域は、金属微小構造に依存して空間的に制限されており、多くの場合は金属微小構造の間隙に位置する。したがって、第２条件をも満たしてＳＥＲＳ光を効率よく発生させるためには、この制限された間隙に被検体が存在することが必要である。

第２条件を満たすためには、被検体は、金属微小構造を構成する金属に対して親和性が高く吸着し易いことが必要である。しかし、増強された電場を効率よく発生させることができるＳＥＲＳ基板により第１条件を満たすことができたとしても、金属微小構造を構成する金属に対して親和性が低く吸着し難い被検体は、金属微小構造の狭隘な間隙に入り込むことができず、第２条件を満たすことができないので、ＳＥＲＳ分光による被検体の分析を行うことが困難である。

ＳＥＲＳ基板や金属コロイド分散液を利用して行うＳＥＲＳ分光による被検体の分析は、予めＳＥＲＳ基板や金属コロイド分散液を用意しておく必要がある。ＳＥＲＳ光は特に銀（Ａｇ）を用いる場合に効率よく発生するものの、銀は酸化し易い。分光測定時にＳＥＲＳ基板上の銀の微小構造や銀コロイドの表面に酸化膜が形成されていると、効率的なＳＥＲＳ分光による被検体の分析ができない。また、分光測定時までにＳＥＲＳ基板や金属コロイドが汚染されないようにする必要があり、これらの扱いは容易でない。

特許文献１には、以上のような従来技術が有する問題点を解消することを意図した発明が開示されている。この文献に開示された発明は、高効率なＳＥＲＳ分光による分析を容易に行うことができる。

また、非特許文献１には、被検体である菌を金属コロイド粒子に付着させてＳＥＲＳ分光を行うことで、菌に由来するラマン散乱スペクトルが得られた旨が記載されている。

特開２０１８－２５４３１号公報

Pamela A. Mosier-Boss, "Reviewon SERS of Bacteria," Biosensors 2017, 7, 51.

特許文献１に開示された発明は、高効率なＳＥＲＳ分光による被検体の分析を容易に行うことができるものの、分析の対象となる被検体が限られており、菌などを含む細胞を被検体として分析することができない。

非特許文献１に記載された技術は、金属コロイド分散液を用いることから、ＳＥＲＳ分光による被検体（菌などを含む細胞）の分析を高効率かつ容易に行うことができない。

本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、被検体である細胞について高効率なＳＥＲＳ分光による分析を容易に行うことができる方法を提供することを目的とする。

本発明の第１態様の細胞分析方法は、(1) 被検体である細胞、金属イオンの溶液および還元剤を混合して混合液を作製する混合ステップと、(2) 混合液中の還元剤の還元作用により混合液中の金属イオンを還元して金属微小構造を支持体上に生成させるとともに、細胞または細胞由来の物質を金属微小構造に付着させる金属微小構造生成ステップと、(3) 金属微小構造生成ステップの後に支持体を乾燥させる乾燥ステップと、(4) 乾燥ステップの後に、支持体上の金属微小構造に励起光を照射し、その励起光照射により発生したラマン散乱光のスペクトルを測定する測定ステップと、を備える。

本発明の第２態様の細胞分析方法は、(1) 被検体である細胞、金属イオンの溶液および還元剤を混合して混合液を作製する混合ステップと、(2) 混合液中の還元剤の還元作用により混合液中の金属イオンを還元して金属微小構造を支持体上に生成させるとともに、細胞または細胞由来の物質を金属微小構造に付着させる金属微小構造生成ステップと、(3) 金属微小構造生成ステップの後に支持体を乾燥させる乾燥ステップと、(4) 乾燥ステップの後に支持体を洗浄する洗浄ステップと、(5) 洗浄ステップの後に、支持体上の金属微小構造に励起光を照射し、その励起光照射により発生したラマン散乱光のスペクトルを測定する測定ステップと、を備える。

本発明の細胞分析方法は、混合ステップにおいて、ｐＨ調整剤をも混合して混合液を作製するのが好適である。

本発明によれば、被検体である細胞について高効率なＳＥＲＳ分光による分析を容易に行うことができる。

図１は、第１実施形態の細胞分析方法のフローチャートである。 図２は、第２実施形態の細胞分析方法のフローチャートである。 図３は、各実施例の測定ステップにおいてＳＥＲＳ光スペクトルの測定の際に用いた顕微分光装置１の光学系を示す図である。 図４は、各実施例で用いた試料を纏めた表である。 図５は、実施例１で得られたＳＥＲＳ光スペクトルを示す図である。 図６は、実施例２で得られたＳＥＲＳ光スペクトルを示す図である。 図７は、実施例３で得られたＳＥＲＳ光スペクトルを示す図である。 図８は、実施例４で得られたＳＥＲＳ光スペクトルを示す図である。 図９は、実施例５で得られたＳＥＲＳ光スペクトルを示す図である。 図１０は、比較例の明視野像の写真である。 図１１は、実施例２において測定ステップの際の明視野像の写真である。 図１２は、実施例３において測定ステップの際の明視野像の写真である。 図１３は、実施例４において測定ステップの際の明視野像の写真である。

以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。本発明は、これらの例示に限定されるものではなく、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。

本実施形態の細胞分析方法は、金属イオンの溶液および還元剤を混合して混合液を作製し、この混合液中の還元剤の還元作用により混合液中の金属イオンを還元して金属微小構造を支持体上に生成させるとともに、この金属微小構造に細胞または細胞由来の物質を付着させる。そして、支持体上の金属微小構造に励起光を照射して当該励起光照射により発生したラマン散乱光のスペクトルを測定し、そのラマン散乱光のスペクトルに基づいて細胞を分析する。以下に、第１および第２の実施形態の細胞分析方法について説明する。

被検体である細胞には原核細胞および真核細胞が含まれる。原核細胞には細菌および古細菌が含まれる。真核細胞には原生生物、植物、動物および真菌が含まれる。単細胞であってもよいし多細胞であってもよく、また、培養細胞であってもよい。細胞由来の物質は、細胞の分解により生成されたものであり、例えば、細胞に含まれていた核酸や核酸塩基などの内容物や、その代謝物である。

図１は、第１実施形態の細胞分析方法のフローチャートである。第１実施形態の細胞分析方法は、混合ステップＳ１１、金属微小構造生成ステップＳ１２、乾燥ステップＳ１３、測定ステップＳ１５および分析ステップＳ１６を順に行うことで細胞の分析を行う。

混合ステップＳ１１では、細胞を含む被測定溶液、金属イオンの溶液および還元剤を十分に混合して、混合液を作製する。更にｐＨ調整剤をも混合して混合液を作製してもよい。被測定溶液、金属イオン溶液、還元剤およびｐＨ調整剤の混合の仕方または順序として様々な態様があり得る。被測定溶液、金属イオン溶液、還元剤およびｐＨ調整剤を同時に混合してもよい。また、被測定溶液、金属イオン溶液および還元剤を混合して中間混合液を作製し、次に、この中間混合液およびｐＨ調整剤を混合して最終的な混合液を作製してもよい。また、更に塩をも混合してもよい。ｐＨ調整剤を加えた後に完全な金属微小構造の生成を待たずに被測定溶液を加えてもよい。

細胞を含む被測定溶液は、例えば、液体培地にて培養した後に遠心分離により回収した細胞を水（好適には純水）中へ分散させたものである。金属イオンは、還元剤の還元作用により還元され得るものであれば任意であり、例えば金イオンや銀イオン等である。還元剤は、例えば、グルコース水溶液、硫酸鉄(II)水溶液、水素化ホウ素ナトリウム水溶液、ホルムアルデヒド水溶液などである。ｐＨ調整剤は、混合液をアルカリ性とするために混合されるものであり、例えば水酸化カリウム水溶液などである。塩は、金属微粒子の凝集を促すために混合されるものであり、例えば塩化ナトリウムなどである。最終的な混合液として混合される金属イオン溶液、還元剤およびｐＨ調整剤それぞれの量および濃度は、被測定溶液の量および被測定溶液中の細胞の濃度に応じて適切に調製される。

金属微小構造生成ステップＳ１２では、混合液中の還元剤の還元作用により混合液中の金属イオンを還元して金属微小構造を支持体上に生成させるとともに、細胞または細胞由来の物質を金属微小構造に付着させる。支持体上の金属微小構造とは、金属微粒子が析出してその凝集体が支持体上に島状に分布している構造である。このとき、混合液の蒸発を防止するために加湿環境下で支持体を所定時間に亘って静置するのが好ましい。

支持体は、中間混合液または混合液を作製する際に用いた容器であってもよいが、容器とは別に用意された基板であってもよく、基板として例えばスライドガラスであってもよい。また、所定パターンで撥水処理したスライドガラスを用いて、このスライドガラス上の撥水処理していない領域において混合液を作製して金属微小構造を生成させてもよい。容器とは別に用意された基板を支持体として用いる場合には、中間混合液およびｐＨ調整剤それぞれを適量だけ基板上に滴下して、マイクロピペット等を用いて基板上で中間混合液とｐＨ調整剤とを十分に混合して最終的な混合液を作製し、基板上で金属微小構造を生成させる。

乾燥ステップＳ１３では、金属微小構造が生成された支持体を乾燥させる。この乾燥により、細胞または細胞由来の物質が付着した金属微小構造が支持体上の限られた領域に凝集する。

測定ステップＳ１５では、支持体上の金属微小構造に励起光を照射し、その励起光照射により発生したラマン散乱光のスペクトルを測定する。励起光照射方向に対してラマン散乱光測定方向は任意であり、後方散乱光および前方散乱光の何れを測定してもよいし、他の方向への散乱光を測定してもよい。また、測定光学系の途中に、ラマン散乱光を選択的に透過させる光フィルタを設けるのが好ましい。励起光は好適にはレーザ光である。励起光が照射された金属微小構造において増強された電場が発生し（第１条件）、その増強された電場が到達する金属微小構造に細胞または細胞由来の物質が付着している（第２条件）ので、測定されるラマン散乱光は、細胞または細胞由来の物質から発生したＳＥＲＳ光である。

支持体上の狭い領域に金属微小構造が生成されている場合には、顕微分光装置を用いて励起光を照射するとともにＳＥＲＳ光スペクトルを測定するのが好ましい。支持体上の金属微小構造が生成されている領域が乾燥している状態で、励起光を照射してＳＥＲＳ光スペクトルを測定する。

分析ステップＳ１６では、ラマン散乱光（ＳＥＲＳ光）のスペクトルに基づいて細胞を分析する。具体的には、得られたＳＥＲＳ光スペクトルにおいてピークが現れるラマンシフト量の位置および該ピークの高さに基づいて、細胞を分析する。

図２は、第２実施形態の細胞分析方法のフローチャートである。第２実施形態の細胞分析方法は、混合ステップＳ１１、金属微小構造生成ステップＳ１２、乾燥ステップＳ１３、洗浄ステップＳ１４、測定ステップＳ１５および分析ステップＳ１６を順に行うことで細胞の分析を行う。

第１実施形態の細胞分析方法と比較すると、第２実施形態の細胞分析方法は、乾燥ステップＳ１３と測定ステップＳ１５との間に洗浄ステップＳ１４を行う点で相違する。洗浄ステップＳ１４では、乾燥ステップＳ１３で乾燥させた支持体を水（好適には純水）で洗浄して、反応混合物中に残存していた塩を除去し、その後に再び支持体を乾燥させる。この乾燥により、細胞または細胞由来の物質が付着した金属微小構造が支持体上の限られた領域に凝集する。

次に、実施例１～５について説明する。図３は、各実施例の測定ステップにおいてＳＥＲＳ光スペクトルの測定の際に用いた顕微分光装置１の光学系を示す図である。何れの実施例においても、金属微小構造を支持する支持体としてスライドガラスを用いた。支持体（スライドガラス）２１の表面に、金属微粒子が析出してその凝集体が島状に分布している金属微小構造２２を形成した。この金属微小構造２２に細胞（または細胞由来の物質）２３を付着させた。

励起光源１１として、波長６４０ｎｍのレーザ光を励起光Ｌ_Ｐとして出力する半導体レーザ光源を用いた。励起光源１１から出力された励起光Ｌ_Ｐは、ダイクロイックミラー１２により反射された後、対物レンズ１３を経て金属微小構造２２および細胞２３に照射された。対物レンズ１３として、倍率が１００倍で開口数が０.９であるもの、または、倍率が５０倍で開口数が０.５であるものを用いた。対物レンズ１３を経て試料面に照射されたレーザ光のパワーは６０μＷであった。

励起光Ｌ_Ｐの照射により発生して対物レンズ１３により捕集されたラマン散乱光（ＳＥＲＳ光）Ｌ_Ｓは、ダイクロイックミラー１２および光フィルタ１４を透過して、分光器１５に入射された。分光器１５は冷却ＣＣＤ検出器を備えたものであり、この分光器１５によりＳＥＲＳ光のスペクトルが測定された。

図４は、各実施例で用いた試料を纏めた表である。各実施例において、被検体である細胞として大腸菌（ＤＨ５αコンピテントセル）を用い、この細胞を超純水中に分散させて被測定溶液を作製した。

実施例１では、金属イオン溶液として硝酸銀水溶液（濃度０.２ｍＭ）を用い、還元剤としてヒドロキシルアミン塩酸塩水溶液（濃度２０ｍＭ）を用い、ｐＨ調整剤として水酸化カリウム水溶液（濃度２５ｍＭ）を用いた。実施例１の手順は、第１実施形態の細胞分析方法（図１）によるものであり、次のとおりであった。

混合ステップＳ１１では、被測定溶液、金属イオン溶液およびｐＨ調整剤それぞれを所定濃度に調整した。支持体としてのスライドガラス上に金属イオン溶液２μＬを滴下し、この滴下スポットに対して被測定溶液２μＬを更に滴下して、これらをスライドガラス上で混合した。この滴下スポットに対して還元剤２μＬを更に滴下して、これらをスライドガラス上で混合した。そして、この滴下スポットに対してｐＨ調整剤２μＬを更に滴下して、これらをスライドガラス上で混合して混合液を作製した。

金属微小構造生成ステップＳ１２では、加湿環境下でスライドガラス上の液滴を１時間に亘って静置して、混合液中において還元剤の還元作用により金属イオンを還元して金属微小構造をスライドガラス上に生成させるとともに、細胞または細胞由来の物質を金属微小構造に付着させた。金属微小構造生成ステップＳ１２における１時間の静置の後、乾燥ステップＳ１３においてスライドガラスを乾燥させた。

測定ステップＳ１５では、スライドガラス上の金属微小構造に励起光を照射し、その励起光照射により発生したラマン散乱光（ＳＥＲＳ光）のスペクトルを測定した。このとき、顕微分光装置を用い、対物レンズを介して金属微小構造に励起光を照射するとともに、該対物レンズを介してＳＥＲＳ光のスペクトルを測定した。

実施例２～４では、実施例１の測定条件と比べると、金属イオン溶液およびｐＨ調整剤それぞれの濃度の点で相違する。実施例２～４における金属イオン溶液（硝酸銀水溶液）の濃度は１.０ｍＭであった。実施例２～４における還元剤（ヒドロキシルアミン塩酸塩水溶液）の濃度は実施例１と同じく２０ｍＭであった。実施例２におけるｐＨ調整剤（水酸化カリウム水溶液）の濃度は１０ｍＭであり、実施例３におけるｐＨ調整剤の濃度は１５ｍＭであり、実施例４におけるｐＨ調整剤の濃度は２０ｍＭであった。

また、実施例２～４では、実施例１の測定条件と比べると、第２実施形態の細胞分析方法（図２）の手順を採用した点（すなわち、洗浄ステップＳ１４を行った点）で相違する。実施例２～４における混合ステップＳ１１，金属微小構造生成ステップＳ１２，乾燥ステップＳ１３および測定ステップＳ１５の手順は、実施例１と同様であった。

実施例５では、実施例４の測定条件と比べると、還元剤としてグルコース水溶液（濃度２ｍＭ）を用いた点で相違する。金属イオン溶液として硝酸銀水溶液（濃度１.０ｍＭ）を用い、還元剤としてグルコース水溶液（濃度２ｍＭ）を用い、ｐＨ調整剤として水酸化カリウム水溶液（濃度２０ｍＭ）を用いた。実施例５の手順は、実施例２～４と同様であった。

図５は、実施例１で得られたＳＥＲＳ光スペクトルを示す図である。図６は、実施例２で得られたＳＥＲＳ光スペクトルを示す図である。図７は、実施例３で得られたＳＥＲＳ光スペクトルを示す図である。図８は、実施例４で得られたＳＥＲＳ光スペクトルを示す図である。図９は、実施例５で得られたＳＥＲＳ光スペクトルを示す図である。これらの図において、横軸はラマンシフト量（単位ｃｍ^-1）を表し、縦軸はラマン散乱強度（任意単位）を表す。

非特許文献１の記載によれば、金属コロイド粒子を利用することによっても細胞由来の物質のＳＥＲＳ光スペクトルが得られる。測定されたＳＥＲＳ光は、細胞に含まれていた核酸や核酸塩基などの内容物や代謝物で生じたものであり、取得されたＳＥＲＳ光スペクトルは、これらの情報を有していると考えられる。

図１０は、比較例の明視野像の写真である。この比較例では、金属微小構造を生成することなく、被測定溶液を滴下したスライドガラスを乾燥させ、そのスライドガラスを洗浄し、その洗浄後の試料を撮影した。図１１は、実施例２において測定ステップの際の明視野像の写真である。図１２は、実施例３において測定ステップの際の明視野像の写真である。図１３は、実施例４において測定ステップの際の明視野像の写真である。これらの実施例では、被検体である細胞の形状を確認することができる。

比較例の写真（図１０）では、スライドガラスに付着した細胞の形状を確認することができる。これに対して、実施例の写真（図１１～図１３）では、被検体である細胞の形状を確認することができず、細胞が分解していると考えられる。また、実施例の写真（図１１～図１３）では、分解した細胞の一部と銀微粒子とによる輝点が認められる。

実施例１のＳＥＲＳ光スペクトル（図５）と比較すると、実施例２～５のＳＥＲＳ光スペクトル（図６～図９）は、ピーク数が多い。これは、実施例２～５では、ｐＨ調整剤により混合液をアルカリ性にしたことにより、明視野像の写真（図１１～図１３）に示されるように細胞の溶解が促進され、その内容物が多く観測されたことに因ると考えられる。

以上のとおり、本実施形態の細胞分析方法は、混合液中の還元剤の還元作用により混合液中の金属イオンを還元して金属微小構造を支持体上に生成させ、この金属微小構造に細胞または細胞由来の物質を付着させ、これに対する励起光照射により発生するラマン散乱光（ＳＥＲＳ光）のスペクトルを測定して、このスペクトルに基づいて細胞を分析する。従来の分析方法と比べると、本実施形態の細胞分析方法は簡便かつ迅速に分析を行うことができる。

従来の分析方法においては、ＳＥＲＳ分光が可能な被検体は、金属微小構造を構成する金属に対して親和性が高く吸着し易いものに限られている。また、特許文献１に開示された発明では、ＳＥＲＳ分光が可能な被検体は還元作用を有するものに限られている。これに対して、本実施形態の細胞分析方法では、金属微小構造を構成する金属に対して親和性が低く吸着し難い細胞であっても、また、還元作用を有しない細胞であっても、金属微小構造を作製することができ、その金属微小構造の狭隘な間隙に細胞または細胞由来の物質が入り込むことができ、第２条件を満たすことができるので、ＳＥＲＳ分光による細胞の分析を行うことが可能となる。

従来の分析方法においては、ＳＥＲＳ光スペクトル測定に際して事前にＳＥＲＳ基板や金属コロイドを用意しておくことが必要である。これに対して、本実施形態の細胞分析方法は、ＳＥＲＳ光スペクトル測定の直前に、金属微小構造の生成および細胞（または細胞由来の物質）の金属微小構造への付着を行うことができる。したがって、本実施形態の細胞分析方法は、酸化しやすい銀による金属微小構造を生成する場合であっても、銀の酸化の問題を抑制することができ、効率的なＳＥＲＳ分光を行うことができる。

本実施形態の細胞分析方法は、ＳＥＲＳ基板や金属コロイドの事前用意が不要であるので、これらの汚染が問題となることはなく、細胞の分析を容易に行うことができる。また、本実施形態の細胞分析方法は、ＳＥＲＳ基板や金属コロイドと比べて安価に入手可能な金属イオン溶液を用いるので、この点でも容易に細胞の分析を行うことができる。

非特許文献１に記載された金属コロイド分散液を利用する分析方法は、細胞が微量である場合にはＳＥＲＳ分光が困難である。これに対して、本実施形態の細胞分析方法は、細胞が微量であってもＳＥＲＳ分光が可能である。

また、非特許文献１に記載された分析方法は、細胞を金属コロイドで覆ってＳＥＲＳ光スペクトル測定を行うものであり、その測定時には細胞を顕微鏡下で探し出す必要があることから、測定が容易でない。これに対して、本実施形態（特に第２実施形態）の細胞分析方法では、細胞を溶解させ更に乾固させ洗浄して、細胞由来の内容物を金属微小構造に吸着させ、ＳＥＲＳ光スペクトル測定を行うので、測定が容易である。

１…顕微分光装置、１１…励起光源、１２…ダイクロイックミラー、１３…対物レンズ、１４…光フィルタ、１５…分光器、２１…支持体、２２…金属微小構造、２３…細胞（または細胞由来の物質）。

Claims (3)

1. 被検体である細胞、金属イオンの溶液および還元剤を混合して混合液を作製する混合ステップと、
   前記混合液中の前記還元剤の還元作用により前記混合液中の前記金属イオンを還元して金属微小構造を支持体上に生成させるとともに、前記細胞または前記細胞由来の物質を前記金属微小構造に付着させる金属微小構造生成ステップと、
   前記金属微小構造生成ステップの後に前記支持体を乾燥させる乾燥ステップと、
   前記乾燥ステップの後に、前記支持体上の前記金属微小構造に励起光を照射し、その励起光照射により発生したラマン散乱光のスペクトルを測定する測定ステップと、
   を備える細胞分析方法。
2. 被検体である細胞、金属イオンの溶液および還元剤を混合して混合液を作製する混合ステップと、
   前記混合液中の前記還元剤の還元作用により前記混合液中の前記金属イオンを還元して金属微小構造を支持体上に生成させるとともに、前記細胞または前記細胞由来の物質を前記金属微小構造に付着させる金属微小構造生成ステップと、
   前記金属微小構造生成ステップの後に前記支持体を乾燥させる乾燥ステップと、
   前記乾燥ステップの後に前記支持体を洗浄する洗浄ステップと、
   前記洗浄ステップの後に、前記支持体上の前記金属微小構造に励起光を照射し、その励起光照射により発生したラマン散乱光のスペクトルを測定する測定ステップと、
   を備える細胞分析方法。
3. 前記混合ステップにおいて、ｐＨ調整剤をも混合して前記混合液を作製する、
   請求項１または２に記載の細胞分析方法。

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