JP7329588B2 - 低温高圧酵素を反応させたカラーベースおよび抽出液を含有する色調化粧料組成物 - Google Patents

Description

本発明は、低温高圧酵素を反応させた海綿骨片粉末、低温高圧酵素を反応させたカラーベース、ならびに低温高圧酵素を反応させた松葉、トウニレ根、月見草、および葛根の混合抽出液、を混合した混合物を有効成分として含有する化粧料組成物に関し、本発明の化粧料組成物は、長期保存安定性に優れ、保湿力、カバー力、発色力、密着感などの効果に優れた利点がある。

メイクアップ化粧料の一般的な機能としては、皮膚への栄養供給、収れん効果、保湿機能などのスキンケア機能と、肌の欠点をカバーし、肌のキメを整え、色相により肌を美しく美化する機能などがあり、このうち、皮膚の欠点をカバーする機能と色相を与えて肌を美しくする機能は、大部分のメイクアップ化粧料のうちのファンデーション類により行われていると言える。

皮膚は、身体の外部を覆っている１つの膜であり、人体で最も広い部位を占めており、外部環境から身体を保護する機能をする。皮膚は大きく分けて表皮（Ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）、真皮（Ｄｅｒｍｉｓ）、皮下脂肪（Ｈｙｐｏｄｅｒｍｉｓ）の三層で構成されており、それぞれの層は、特殊な細胞で構成されており、血管、リンパ管、神経組織を介して内部の臓器と密接な関係を有して有機的に作用して内部の臓器やその他の体内器官を保護し、調節する役割をする。

表皮の最も表面にある角質層は、約２０層程度に積み重なっており、生命力のない無色無核の平たい灰白色の組織である。これは、皮膚の類型と肌の状態により、個人ごとに多くの差があり、絶えず入れ替わりや脱落を繰り返す。角質層は、皮膚表面に近いほど細胞間の接着力が低下して間隔が生じ、通常、うろこ状の薄い片として目に見えないように一つずつ落ちていく。古い角質を除去しなければ、肌のトーンがくすみ、新しい細胞が作られる過程が遅くなることによって、全体的な肌の老化を促進することとなる。

老化した肌の特徴は、死んだ細胞を脱落させる能力が減少して、細胞の再生回転周期が増加し、かつ肌が活力と弾性とを失い、肌の真皮層の弾力繊維とコラーゲン繊維が変性して、弾力が低下する。一般的に、外部の要因に関わらず、加齢により発生する内因性の老化と長期間の紫外線露出により誘発される光老化に区分される。内因性の老化によって損傷した皮膚は、乾燥して弾力性が低下し、小ジワが増加する。一方、光老化は、皮膚の粗さと太いシワを増加させ、皮膚の萎縮および弾力性消失などの特徴を示す。また、光老化はコラーゲン繊維を減少させ、弾力繊維は量的に増加させ、当該組織に小ジワおよび太いシワを発生させて不規則な色素沈着を誘発する。特に紫外線に繰り返し露出される場合、コラーゲンの分解要素であるＭａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓが異常に増加して、皮膚のコラーゲンを分解し、活性酸素種とＤＮＡの損傷を誘発して、肌の老化を促進させる。

これを改善するために、基底層の細胞再生を刺激して、弾力のある肌に戻そうとする努力が活発に進められている。

上記の問題を解決するための発明として、本発明者が開発し、特許登録された韓国特許番号第１０－２１５０７９８号（登録日：２０２０年０８月２６日）のヒト臍帯血細胞培養液の含浸凍結乾燥コーティングによる海綿骨片パウダーの製造方法、ならびにこれを用いた化粧料組成物および化粧品の製造方法が特許登録されている。

上記特許発明は、ａ）海綿動物を乾燥および粉砕して海綿粉末を準備するステップ、ｂ）上記海綿粉末を蒸留水と混合するステップ、ｃ）この混合物と酵素とを酵素反応器で反応させるステップ、ｄ）反応させた混合物を遠心分離してから、洗浄するステップ、ｅ）ステップｄ）の混合物を電気炉で加熱して海綿骨片を得るステップ、およびｆ）上記海綿骨片に肌の有効物質をスプレー噴射しながら、エアミックスしてコーティングするステップを含む。

しかし、上記特許発明は、非化学的な方法である高温高圧酵素分解工法により精製され、多孔が確保された針状海綿骨片粉末を、幹細胞由来の物質および皮膚の有効成分が混合された溶液に浸漬させてコーティングした後に凍結乾燥する方法であり、高温で分解される工法であるため、幹細胞由来の物質および皮膚の有効成分が混合された溶液の無駄が多く、製造工程が複雑な問題がある。

より効果的なシワおよび老化防止製品の開発のためには、精度と回収率が高く、溶液の無駄の最小化と実行が簡単な製造工程とを必要とする。また、老化現象によるターンオーバー周期を正常化させ、皮膚再生による角質の除去が同時に必要である。上述のように、効果が究明された有効成分の安定的な維持と皮膚の奥深くまでの効果的な伝達が克服すべき課題である。

このような背景下において本発明は、従来、シワおよび老化防止効果があると知られているヒト臍帯血幹細胞培養液の皮膚中への伝達の効率を最大化し、安全性を確保するために、混合物に溶解されたり懸濁された化合物を物理的特性に基づいて混合物の他の化合物と分離する技術である酵素分解、および所望の試料成分のみを吸着するＳＰＥ（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）方法を用いたＣ１８カートリッジ方法によって精製された海綿骨片に凍結乾燥してコーティングすることにより、皮膚に直接骨片とともに伝達して、従来の効果を最大化させることは勿論、刺激により自己免疫力を増加させ、皮膚のターンオーバー周期を正常化して、美しく健康な皮膚再生のための機能を同時に完成することができる。

本発明は、このように皮膚の有効物質をコーティングした海綿骨片粉末を用いた化粧料組成物の製造方法を開示するためのものであって、以下のような目的を有する。

本発明は、上記のような要求により導出されたものであり、本発明においては、化粧料組成物に含まれる海綿骨片粉末、カラーベースおよび混合抽出液を低温および高圧の条件で酵素反応させることによって、保存安定性と品質に優れた化粧料組成物を提供することにある。

上記課題を解決するために、本発明は、ブロメライン酵素処理してから、精製した海綿骨片粉末をミキサー内に投入した後、ここにヒト臍帯血細胞培養液を追加で投入し、ミックスされた状態で凍結乾燥させて製造されたヒト臍帯血細胞培養液がコーティングされた海綿骨片パウダー、低温高圧酵素を反応させたカラーベース、ならびに温高圧酵素を反応させた松葉、トウニレ根、月見草、および葛根の混合抽出液、を混合した混合物を有効成分として含有する肌の保湿用化粧料組成物を提供する。

本発明の酵素分解およびＣ１８カートリッジ精製方法による海綿骨片粉末にヒト臍帯血細胞培養液でコーティングする過程により、化学的処理なく海綿を加工処理することができ、シワおよび老化防止効果があると知られている人体臍帯血幹細胞培養液の皮膚中への伝達の効率を最大化させるために、非化学的な活性方法で精製された針状海綿骨片に凍結乾燥してコーティングすることにより、上記人体臍帯血幹細胞培養液を皮膚中に直接針状海綿骨片とともに伝達して、従来の効果を最大化させることは勿論、刺激により自己免疫力を増加させ、皮膚のターンオーバー周期を正常化して、美しく健康な皮膚再生のための機能を同時に達成することができる。

また、化粧料組成物に有効成分である海綿骨片粉末だけでなく、カラーベース（Ｃｏｌｏｒ Ｂａｓｅ Ｎ－３０）、混合抽出液（Ｅｘｔｒａｃｔ Ｎ－３０）は、低温および高圧の条件で酵素を反応させることにより、皮膚浸透を容易にし、低温熟成過程を経て、安全な有効成分の含有量を増加させることができる効果がある。

本発明の目的を達成するために、本発明は、ブロメライン酵素処理してから、精製した海綿骨片粉末をミキサー内に投入した後、ここにヒト臍帯血細胞培養液を追加で投入し、ミックスされた状態で凍結乾燥させて製造されたヒト臍帯血細胞培養液がコーティングされた海綿骨片パウダー、低温高圧酵素を反応させたカラーベース、ならびに、低温高圧酵素を反応させた松葉、トウニレ根、月見草、および葛根の混合抽出液、を混合した混合物を有効成分として含有する化粧料組成物に関する。

本発明の化粧料組成物において、主要構成成分である海綿骨片パウダー（スピキュール）は、淡水に生息する海綿動物の１つの綱である硬骨海綿類（Ｓｃｌｅｒｏｓｐｏｎｇｉａ）の針骨（ｓｐｉｃｕｌｅ）に由来すると言われており、別名スポンジ（ｓｐｏｎｇｅ－ｓｐｉｃｕｌｅ）と呼ばれる。この構造物は、微細針の形態をしており、炭酸カルシウムとケイ酸塩、そしてゼリー状のコラーゲンマットレス骨格などからなっている。スピキュールは、表面に多数の多孔が観察されるが、この多孔で摂食し、共生する緑藻類が出入りするようになる。また、スピキュールは、長さが０．０１ｍｍから１．０ｍｍ以上のものもあり、その形状や大きさが多様である。スピキュールを用いて剥皮する場合、皮膚の新陳代謝を促進し、有効物質の吸収率を高めるなどにより皮膚再生を促進させ、正常な角化現象を誘導して、皮膚の状態を改善するのに効果的である。本発明においても、これによる皮膚再生および正常な角化周期の誘導、小ジワおよび広がった毛穴の改善効果などの様々な肌の改善効果を説明している。

本発明の化粧料組成物において、本発明における幹細胞（臍帯血細胞）は、胚または成体にある、数種類の組織に分化することができる未分化細胞を意味する。幹細胞は、主に初期分裂段階の胚から採取される。この段階の細胞はまだ臓器形成能力がないため、事前の入力によって、特定して選択された細胞系に培養することができる。

本発明において、ヒト臍帯血細胞培養液（ＵＳＣ１９９４－ＦＰＢＮ）は、胎児と産婦を繋ぐへその緒中の血液の「臍帯血」の幹細胞を培養して得られた８９種のタンパク質を含む複合成分である。

ブロメライン酵素処理してから、精製した海綿骨片粉末の具体的な製造方法は、下記のとおりである。

淡水で採取した海綿を水分率８％未満になるように乾燥して粉砕し、７０ｍｅｓｈのフィルタで分離して海綿粉末を前処理するステップ、上記前処理された海綿粉末５０ｇにＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｂｕｆｆｅｒ）１００ｍＬを投入して希釈し、ＤＴＴ（０．１２％ ｗ／ｖ）を用いて沈殿させるステップ、上記沈殿された粉末を４℃、１５分、１６，２００ｒｐｍで遠心分離してから、９５℃で３分間、熱変性処理するステップ、上記熱変性処理後にブロメライン（Ｂｒｍｅｌａｉｎ）酵素１０ｍＬを添加して、３７℃で２４時間、分解するステップ、および、上記分解した粉末をＣ１８カートリッジを用いて有機物を精製し、有効成分が残っている固定相を沈殿させた後に、沈殿させた粉末を電気炉に入れ、１５０℃で２０分、３５０℃で３０分、７５０℃で５０分間、順次昇温させるステップにより製造することができる。

また、本発明の化粧料組成物において、上記ヒト臍帯血細胞培養液は、ヒト臍帯血細胞培養液をｍａｎｎｉｔｏｌ、ｎｉａｃｉｎａｍｉｄｅ、ｈｕｍａｎ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉａ、ｓｏｄｉｕｍ ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅで混合したＵＳＣ １９９４－ＦＰＢＮ粉末を１：２の重量比で蒸留水に溶解させたものであってもよいが、これに限定されない。

また、本発明の化粧料組成物において、エアミキサー（Ａｉｒ Ｍｉｘｅｒ）は、減圧と冷却窒素投入を試運転して、エアミキサーの内部の温度を２０℃にセットしたエアミキサーであってもよいが、これに限定されない。

また、本発明の化粧料組成物において、上記ミックスは、具体的には海綿骨片粉末１００ｇをエアミキサーに投入してエアゾールの形態になるように冷却窒素を投入しながら分散させてから、エアミキサーの内部を肉眼で確認し、円滑な分散がなされたときに、ヒト臍帯血細胞培養液を３ｍｌ／ｍｉｎでスプレー噴射した後、エアミックスできるが、これに限定されない。

上記のような条件で、海綿骨片粉末にヒト臍帯血由来の細胞培養液を含浸して有効成分を伝達するシステムにより、剥皮ではなく皮膚細胞の再生力を増進させて、効果的に肌を管理することができた。また、非化学的な方法で抽出され、安全性が向上するという利点がある。

上述した本発明のヒト臍帯血細胞培養液がコーティングされた海綿骨片パウダーの製造方法は、シワ、および老化防止効果があると知られているヒト臍帯血幹細胞培養液の皮膚中への伝達の効率を最大化させるために、非化学的な活性方法で精製された針状海綿骨片に凍結乾燥してコーティングすることにより、上記ヒト臍帯血幹細胞培養液を皮膚中に直接針状海綿骨片とともに伝達して、従来の効果を最大化させることは勿論、刺激により自己免疫力を増加させ、皮膚のターンオーバー周期を正常化して、美しく健康な皮膚再生のための機能を同時に達成した。

本発明のヒト臍帯血細胞培養液がコーティングされた海綿骨片パウダーを有効成分として含む化粧品は、人体の皮膚再生だけでなく、針状海綿骨片パウダーの物理的な刺激による炎症反応を伴った後の自己免疫の改善による皮膚再生、シワ改善、美白、肌の弾力改善、肌の老化防止、肌の保湿改善、シミの除去、にきび治療および傷の除去効果を示し、より詳細には、平均２００マイクロサイズの針状海綿骨片が基底上層部まで吸収され、刺激が皮膚の表皮細胞の分裂を促進させ、表皮細胞のターンオーバー周期を、一般的に２８日であることを、７２時間前後に短縮させながら、皮膚を再生させることを確認した。また、上記針状海綿骨片に含浸コーティングされたヒト臍帯血由来の細胞培養液が凍結乾燥コーティングされた有効成分が針状海綿骨片に吸収されている約２４～３６時間の間に、表皮に有効物質が直接伝達される。さらに、刺激による血流量の増加と代謝促進のために、有効成分の吸収と転移は、一般的な肌への塗布による吸収よりも優れ、このような皮膚再生の過程において、シワ、弾力、老化防止および傷の除去、角質脱落などの総称皮膚再生を誘導する。

本発明の化粧料組成物において、上記カラーベースは、チタニウムジオキサイド、マイカ、ジンクオキサイド、黄色酸化鉄、赤色酸化鉄、黒色酸化鉄、トリエトキシカプリリルシラン、ウルトラマリン、ヒドロゲンジメチコンおよびジメチコンからなるものであってもよい。より具体的には、カラーベースの総重量基準で、チタニウムジオキサイド７０～７５重量％、マイカ８～１２重量％、ジンクオキサイド７～９重量％、黄色酸化鉄３．５～４．５重量％、赤色酸化鉄１．８～２．２重量％、黒色酸化鉄０．８～１．２重量％、トリエトキシカプリリルシラン０．８～１．２重量％、ウルトラマリン０．６～０．８重量％、ヒドロゲンジメチコン０．３～０．５重量％およびジメチコン０．１～０．３重量％からなるものであってもよく、より具体的には、チタニウムジオキサイド７２．７重量％、マイカ１０重量％、ジンクオキサイド８重量％、黄酸化鉄４重量％、赤色酸化鉄２重量％、黒色酸化鉄１重量％、トリエトキシカプリリルシラン１重量％、ウルトラマリン０．７重量％、ヒドロゲンジメチコン０．４重量％およびジメチコン０．２重量％からなるものであってもよい。

また、本発明の化粧料組成物において、上記カラーベースの低温高圧酵素反応は、好ましくは、カラーベースに、カラーベース重量に対して水１８～２２重量％を混合した後に、プロタメックス（Ｐｒｏｔａｍｅｘ）およびアルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）を添加して、３０～４５℃の低温かつ５０～７０ＭＰａの高圧で２０～２８時間の間反応させるものであってもよく、より好ましくは、カラーベースに、カラーベース重量に対して水２０重量％を混合した後に、プロタメックス（Ｐｒｏｔａｍｅｘ）およびアルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）を添加して、３０～４５℃の低温かつ６０ＭＰａの高圧で２４時間反応させたものであってもよい。

また、本発明の化粧料組成物において、上記混合抽出液は、好ましくは、松葉抽出液、トウニレ根抽出液、月見草抽出液、および葛根抽出液を２０～３０：２０～３０：２０～３０：２０～３０重量比率で混合した混合抽出液を１～８℃で２～５日間熟成させた後に、プロタメックス（Ｐｒｏｔａｍｅｘ）およびアルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）を添加して、４５～５５℃の低温かつ５０～７０ＭＰａの高圧で２０～２８時間反応させたものであり得、より好ましくは、松葉抽出液、トウニレ根抽出液、月見草抽出液、および葛根抽出液を２５：２５：２５：２５の重量比率で混合した混合抽出液を、１～８℃で２～５日間熟成させた後に、プロタメックス（Ｐｒｏｔａｍｅｘ）およびアルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）を添加して、５０℃の低温かつ６０ＭＰａの高圧で２４時間反応させたものであり得る。

また、本発明の化粧料組成物において、上記化粧料組成物は、プロピレングリコール、エチルヘキシルメトキシシンナメート、乳化安定剤、カプリリック／カプリックトリグリセリド、スクアラン、セチルエチルヘキサノエート、ジメチコン、アルブチン、エチルヘキシルサリチレート、フェニルトリメチコン、ジイソステアリルマレエート、ホホバ種子油、マグネシウムスルフェート、ジステアジモニウムヘクトライト、ビーズワックス、ヒドロキシアセトフェノン、パンテノール、カルシウムステアレート、香料、アロエベラ葉汁、トコフェリルアセテート、カプリリルグリコール、アラントイン、アデノシン、マンニトール、ヘキシルシンナマル、ブチルフェニルメチルプロピオナール、ナイアシンアミド、シトロネロール、リモネン、ヒト臍帯血細胞培養液、ソディウムヒアルロネート、ニコチノイルジペプチド－２２および水からなる群から選択される１つ以上の材料をさらに含み得るが、これに限定されない。

また、本発明の化粧料組成物は、好ましくは、色調化粧料に使用され、その種類としては、フェイスパウダー、コンパクト、パウダーファンデーション、ツーウェイケーキ、メークアップベース、リキッドファンデーション、クリームファンデーション、アイシャドウおよびパウダーブラッシュからなる群から選択される１つの色調化粧料であり得るが、これに限定されない。

上記化粧料組成物の製造方法は、より具体的には、化粧品組成物を、水相と油相１および２をそれぞれ区分して準備するステップ、水相にそれぞれの油相を乳化機を用いて７５℃、３，０００ｒｐｍでそれぞれ３分ずつホモミキシング（Ｈｏｍｏ Ｍｉｘｉｎｇ）するステップ、それぞれの添加物を１０℃ずつ下げながら順次投入かつ溶解し、２０ｒｐｍで分散させるステップ、温度を３５℃に下げた状態で、ヒト臍帯血細胞培養液がコーティング含浸された針状海綿骨片（スピキュール）を蒸留水とグリセリンを溶媒として、分散された添加物を準備するステップ、上記ヒト臍帯血細胞培養液がコーティング含浸されたスピキュールを蒸留水とグリセリンを溶媒として、分散された添加物を乳化機に投入してから、５分間、１５ｒｐｍで分散させるステップ、分散された添加物を室温に冷却するステップ、上記添加物を２日ないし３日間熟成させるステップ、および、上記添加物の熟成期間の間、微生物、重金属、ｐＨ、粘度などのテストを行うステップを含む。

以下、本発明を製造例および実施例により詳細に説明する。ただし、下記の製造例および実施例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の製造例および実施例に限定されるものではない。

製造例１：酵素分解およびＣ１８カートリッジ精製方法による海綿骨片粉末の製造

（１）淡水で採取した海綿を水分率８％未満になるように乾燥して粉砕し、７０ｍｅｓｈフィルタで分離して海綿粉末を前処理した。前処理された海綿粉末５０ｇにＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｂｕｆｆｅｒ）１００ｍＬを投入して希釈し、ＤＴＴ（０．１２％ ｗ／ｖ）を使用して沈殿させた。沈殿した粉末を４℃、１５分、１６，２００ｒｐｍで遠心分離し、遠心分離後に９５℃で３分間熱変性処理した。熱変性処理してからブロメライン（Ｂｒｏｍｅｌａｉｎ）酵素１０ｍＬを添加して、３７℃で２４時間分解した。この後、Ｃ１８カートリッジを用いて有機物を精製し、有効成分が残っている固定相を沈殿させてから、沈殿させた粉末を電気炉に入れ、１５０℃で２０分、３５０℃で３０分、７５０℃で５０分間、順次昇温させ、海綿骨片粉末１００ｇを準備した。

（２）ヒト臍帯血細胞培養液をｍａｎｎｉｔｏｌ、ｎｉａｃｉｎａｍｉｄｅ、ｈｕｍａｎ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉａ、ｓｏｄｉｕｍ ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅで混合したＵＳＣ １９９４－ＦＰＢＮ粉末を１：２の重量比で蒸留水に溶解させた。

（３）ホモミキサー（Ｈｏｍｏ Ｍｉｘｅｒ）内の減圧と冷却窒素の投入を試運転し、ホモミキサーの内部の温度を２０℃にセットした。上記セットしたホモミキサー内に上記（１）のステップの準備した海綿骨片粉末１００ｇを投入して冷却窒素を投入しながら分散させた後に、ホモミキサーの内部を肉眼で確認し、円滑な分散がなされたときに、上記（２）のステップの溶解されたヒト臍帯血細胞培養液を３ｍｌ／ｍｉｎでスプレー噴射させた。スプレー噴射が完了した後、ミックスを維持し、ミックスは維持しつつ冷却窒素ガスは減らし、相対的に空気の量を増やして３時間室温に合わせた。さらに、噴射は停止しても、減圧とパルスは５分間維持してからミキサーの運転を停止した後、凍結乾燥した白色粉末を得て、減圧デシケーターに保管した。

製造例２：低温高圧酵素反応カラーベース（Ｃｏｌｏｒ Ｂａｓｅ Ｎ－３０）の製造

カラーベース（Ｃｏｌｏｒ Ｂａｓｅ Ｎ－３０）は、チタニウムジオキサイド、マイカ、ジンクオキサイド、黄色酸化鉄、赤色酸化鉄、黒色酸化鉄、ウルトラマリン、トリエトキシカプリリルシラン、ヒドロゲンジメチコン、ジメチコンを含み、表１のように配合して製造したＣｏｌｏｒ Ｂａｓｅ Ｎ－３０に２０重量％の精製水を混合した。次に、プロタメックスおよびアルカラーゼを１：１の重量比で３ｇ添加した。色素の安定性のために酵素反応器の温度を３０～４５℃に下げ、６０ＭＰａに設定した後、約２４時間酵素反応を行った。

製造例３：低温高圧酵素反応抽出液（Ｅｘｔｒａｃｔ Ｎ－３０）の製造

抽出液（Ｅｘｔｒａｃｔ Ｎ－３０）は、大王松葉抽出液、トウニレ根抽出液、月見草抽出液、葛根抽出液をすべて混合したものであり、配合比は下記の表２のとおりである。

それぞれの材料に精製水を１０倍（ｖ／ｗ）添加した後に、１００～１３０℃で４～６時間熱水抽出した大王松葉抽出液、トウニレ根抽出液、月見草抽出液、葛根抽出液を混合して、ブリックスを４～６ブリックスに調整し、１～８℃で２～５日間熟成させた後に、プロタメックスおよびアルカラーゼを１：１の重量比で３ｇ添加して混合した。酵素反応器の条件を５０℃、６０ＭＰａに合わせて、約２４時間酵素反応を行った。

実施例１．ファンデーション

製造例１の酵素分解およびＣ１８カートリッジの精製方法による海綿骨片粉末、製造例２の低温高圧酵素反応で精製されたカラーベース（Ｃｏｌｏｒ Ｂａｓｅ Ｎ－３０）、 製造例３の低温高圧酵素反応で精製された抽出液（Ｅｘｔｒａｃｔ Ｎ－３０）を用いて、下記の表３の配合比で配合した後に、１～８℃で７２時間、低温熟成ステップを経た化粧品である。

比較例１．ファンデーション

製造例１の酵素分解およびＣ１８カートリッジの精製方法による海綿骨片粉末、製造例２の低温高圧酵素反応で精製されたカラーベース（Ｃｏｌｏｒ Ｂａｓｅ Ｎ－３０）、 製造例３の低温高圧酵素反応で精製された抽出液（Ｅｘｔｒａｃｔ Ｎ－３０）を用いて、下記の表３の配合比で配合した後に、低温熟成ステップを経ていない化粧品である。

比較例２．ファンデーション

化学的な工法（塩酸に入れ、不純物を除去して乾燥する工法）で精製された海綿骨片粉末、製造例２の方法で製造し、低温高圧酵素反応を経ていないカラーベース（Ｃｏｌｏｒ Ｂａｓｅ Ｎ－３０）、製造例３の方法で製造し、低温高圧酵素反応を経ていない抽出液（Ｅｘｔｒａｃｔ Ｎ－３０）を用いて、下記の表３の配合比で配合した後に、低温熟成ステップを経ていない化粧品である。

実験例１．抽出液の細胞毒性

ＨａＣａＴ細胞は、３７℃、５％のＣＯ₂条件で、１０％のＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）と１％のペニシリン－ストレプトマイシン（ＰＳ、Ｇｉｂｃｏ）が含有されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）で培養した。

上記培養したＨａＣａＴ細胞（ヒト角質形成細胞株）に２４時間、それぞれの試料を濃度別に希釈して処理し、ＭＴＳアッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ ３－（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－５－（３－ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－２－（４－ｓｕｌｆｏｐｈｙｎｙｌ）－２Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，ｉｎｎｅｒ ｓａｌｔ；ＭＴＳ，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）技法で細胞生存能を４９０ｎｍでマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で測定して試験した。

その結果、表４に示したように、本発明の製造例３の抽出液を処理しても、何も処理していない対照群を基準として、細胞生存率（％）の変化がほとんどなく、本発明の抽出液は、細胞毒性がないことを確認した。

実験例２．抽出液のヒアルロン酸含有量変化の分析

上記製造例３の方法で製造された抽出液、上記製造例３の方法で抽出液を製造し低温高圧酵素反応させていない抽出液、低温高圧酵素反応させた大王松葉単独の抽出液、低温高圧酵素反応させたトウニレ根単独の抽出液、低温高圧酵素反応させた月見草単独の抽出液、低温高圧酵素反応させた葛根単独の抽出液によりヒアルロン酸含有量を比較した。

実験方法は、上記ＨａＣａＴ細胞に２４時間、それぞれの試料を処理し、紫外線（ＵＶ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ、Ｕｌｔｒａ Ｌｕｍ）を２０ｍＪ／ｃｍ²で３０分間照射した後に、培養物の上澄液を収集し、ヒアルロン酸ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）を用いて、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）の含有量を測定した。反応物は吸光アッセイを行った。

その結果、表５に比較したように、紫外線照射により、ヒアルロン酸の含有量は減少したが、本発明の抽出液処理によりヒアルロン酸の含有量が増加し、処理区中では、製造例３の混合抽出液処理区がヒアルロン酸の含有量が最も増加したことを確認した。

実験例３．肌の保湿効果試験

実施例１と比較例１および２のファンデーションにより、肌の保湿効果を調べるために、皮膚の伝導度を測定した結果、実施例１で最も高く示された。

実験例４．皮膚色度の測定試験

Ｃｈｒｏｍａｍｅｔｅｒを用いて、明度（皮膚の明るさ）を表すＬ＊値を測定、評価した結果、実施例１が最も高く示された。

実験例５．長期保存安定性

実施例１および比較例のファンデーション化粧品組成物を温度３０±２℃／相対湿度６６±５％の条件で１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月保管して、乳化状態および分散状態の分離現象を観察し、点数で評価した。
５点：良好（○）、４点：概ね良好（△～○）、３点：普通（△）、２点：やや不良（×～△）、１点：不良（×）

その結果、実施例１のファンデーションは、６ヶ月保管しても乳化状態が良好であり、かつ分離現象が起きず、長期保存安定性が高いことを確認できた。

実験例６．化粧品の使用評価

年齢２５歳以上５９歳以下の女性３０名を対象に、顔にファンデーションを塗布した後の肌の密着感、保湿力、カバー力、保持力、カラー発色、全体的な嗜好度を評価した。０～１０点で評価し、下記の評価点数は、３０名の応答の平均値である（ただし、カラー発色は明るいほど１０点に近い）。

その結果、実施例１の化粧品は、すべての項目で９点以上の高い得点を示し、使用感に優れていることを確認した。

Claims (7)

1. 肌の保湿用化粧料組成物を製造するための肌の保湿用化粧料組成物の製造方法であって、
   ブロメライン酵素を処理してから、精製した海綿骨片粉末をミキサー内に投入した後、ここにヒト臍帯血細胞培養液を追加で投入し、ミックスされた状態で凍結乾燥させて製造されたヒト臍帯血細胞培養液がコーティングされた海綿骨片パウダー、低温高圧酵素反応させたカラーベース、ならびに低温高圧酵素反応させた大王松葉、トウニレ根、月見草、および葛根の混合抽出液、を混合した後に、低温熟成する、
   肌の保湿用化粧料組成物の製造方法。
2. 前記カラーベースは、チタニウムジオキサイド、マイカ、ジンクオキサイド、黄色酸化鉄、赤色酸化鉄、黒色酸化鉄、トリエトキシカプリリルシラン、ウルトラマリン、ヒドロゲンジメチコンおよびジメチコンからなる、
   ことを特徴とする請求項１に記載の肌の保湿用化粧料組成物の製造方法。
3. 前記低温高圧酵素反応させたカラーベースは、前記カラーベースに対して水１８～２２重量％を混合し、３０～４５℃の低温かつ５０～７０ＭＰａの高圧で２０～２８時間反応させる、
   ことを特徴とする請求項１に記載の肌の保湿用化粧料組成物の製造方法。
4. 前記混合抽出液は、大王松葉抽出液、トウニレ根抽出液、月見草抽出液、および葛根抽出液を２０～３０：２０～３０：２０～３０：２０～３０重量比率で混合した混合抽出液を１～８℃で２～５日間熟成させ、４５～５５℃の低温かつ５０～７０ＭＰａの高圧で２０～２８時間反応させる、
   ことを特徴とする請求項１に記載の肌の保湿用化粧料組成物の製造方法。
5. ブロメライン酵素を処理してから、精製した海綿骨片粉末をエアミキサー内に投入した後、ここにヒト臍帯血細胞培養液を追加で投入し、ミックスされた状態で凍結乾燥させて製造されたヒト臍帯血細胞培養液がコーティングされた海綿骨片パウダー、
   チタニウムジオキサイド、マイカ、ジンクオキサイド、黄色酸化鉄、赤色酸化鉄、黒色酸化鉄、トリエトキシカプリリルシラン、ウルトラマリン、ヒドロゲンジメチコンおよびジメチコンからなるカラーベースに、カラーベースに対して水１８～２２重量％を混合してから、３０～４５℃の低温かつ５０～７０ＭＰａの高圧で２０～２８時間反応させた低温高圧酵素反応させたカラーベース、および
   大王松葉抽出液、トウニレ根抽出液、月見草抽出液、および葛根抽出液を２０～３０：２０～３０：２０～３０：２０～３０重量比率で混合した混合抽出液を１～８℃で２～５日間熟成させてから、４５～５５℃の低温かつ５０～７０ＭＰａの高圧で２０～２８時間反応させた混合抽出液、を混合した後に、１～８℃で７２時間低温熟成した混合物を有効成分として含有する、
   肌の保湿用化粧料組成物の製造方法。
6. 前記肌の保湿用化粧料組成物が、色調化粧料に使用される、
   ことを特徴とする請求項１に記載の肌の保湿用化粧料組成物の製造方法。
7. 前記低温熟成は、１～８℃で実施する、
   ことを特徴とする請求項１に記載の肌の保湿用化粧料組成物の製造方法。