JP7308329B1

JP7308329B1 - Ｇａｂａを有効成分とするサルコペニア予防または改善剤

Info

Publication number: JP7308329B1
Application number: JP2022069343A
Authority: JP
Inventors: 絵理子上原
Original assignee: 三和酒類株式会社
Priority date: 2022-04-20
Filing date: 2022-04-20
Publication date: 2023-07-13
Anticipated expiration: 2042-04-20
Also published as: JP2023159578A

Abstract

【課題】日常的に継続して摂取することができ、効果的に筋肉量を増加させ筋力の低下を抑制して、サルコペニアの予防や改善をすることが可能な筋合成関連遺伝子発現促進用、筋合成促進用、筋萎縮関連遺伝子発現抑制用、筋萎縮抑制用、または筋タンパク質分解抑制用の剤を提供する。【解決手段】ＧＡＢＡを有効成分として含む、サルコペニア予防または改善剤を提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、筋肉量の減少や筋力の低下を抑制するための、筋肉量の増加または筋力の維持にかかわる技術分野に関する。

日本人の平均寿命は男女とも８０歳以上であるものの、元気に自立して過ごせる期間の「健康寿命」は、男女とも７０歳台であり、何かしらの介護が必要となる期間が１０年程度あるといわれている。高齢者が要介護状態になる原因として、「認知症」や「転倒」と並んで「高齢による衰弱」があるため、「転倒」および「高齢による衰弱」のリスク因子としての、老化に伴う筋肉量の減少が注目されている。

サルコペニアとは、加齢や運動不足等による筋肉量の低下に加え、筋肉の質、すなわち筋力の低下を示す症候群をいい、これに対して、ロコモティブシンドロームとは、骨、関節、軟骨、椎間板、筋肉という運動器のうち、一つまたは複数に障害が起こり、立つ、歩くといった機能が低下している状態をいう。ロコモティブシンドロームが運動器全般の症状を含む症候群であるのに対し、サルコペニアは、ロコモティブシンドロームの一要因である筋肉という運動器において、その筋肉量が減少し筋力が低下した状態である。
筋力の低下は４０歳位から始まるといわれ、サルコペニアの有症率は年齢と共に増加して、７５歳以上で男女共１０％を超え、８０歳以上で２５％を超える。一般に中年以降では筋肉量が１年間に１％ずつ減少するが、高齢期での２週間の寝たきり生活は、７年間で失う筋肉量に相当する量を失うとも言われている。

サルコペニアは、筋蛋白質の合成と分解のアンバランスによる筋蛋白質の減少と、さらに筋蛋白質の減少による筋線維の萎縮が原因となっている（非特許文献１）。
サルコペニア発症のメカニズムにおいて、筋芽細胞(Myoblast)の増殖抑制が関与する可能性が示唆されている（非特許文献２）。また、単核の筋芽細胞は互いに融合して多核の筋管細胞(Myotube;幼若な新生筋線維)を形成し、細胞内に筋タンパク質を蓄積させて新しい線維筋へと成長(肥大・伸長)する。そのため、筋芽細胞の融合は筋線維の形成に不可欠であるが、筋芽細胞融合の重要なスイッチとしてＭｙｏＤが特定された（非特許文献３）。ＭｙｏＤは非筋細胞を筋細胞へ転換する強力な転写因子であり（非特許文献４）、ＭｙｏＤの発現が減少することにより、筋肉量が減少してサルコペニアになる（非特許文献５）という報告がある。

ＭｙｏＤは筋肉の合成を促進し、一方、ＰＧＣ－１αはミトコンドリアの生合成を促進し、酸化ストレスを軽減することで筋肉分解を抑制し、また、Ｍｙｏｓｔａｔｉｎは筋委縮を誘導すること（非特許文献６）が報告され、ＰＧＣ－１αについては、ミトコンドリア生合成を活性化する因子であり、身体運動により速やかに発現が増加すること（非特許文献７）、ＰＧＣ－１αは加齢により発現が減少し、サルコペニアに影響を与えること（非特許文献８）が報告されている。

また、骨格筋から分泌され、骨格筋の増殖を抑制するＭｙｏｓｔａｔｉｎ（非特許文献９）については、その発現を低下させることがサルコペニアの新たな治療法につながる可能性がある（非特許文献１０）こと、Ｍｙｏｓｔａｔｉｎは加齢に伴って発現が増加し、サルコペニアの原因の１つとなる（非特許文献１１）こと、Ｍｙｏｓｔａｔｉｎの発現量が増大して筋萎縮を引き起こす（非特許文献１２）ことが報告されている。
また、筋タンパク質分解の中心的役割を担うＡｔｒоｇｉｎ－1（非特許文献１３）のｍＲＮＡ発現を、Ｍｙｏｓｔａｔｉｎが有意に増加させる（非特許文献１４）ことが報告されている。

一方、γ-アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）は、自然界に広く分布する非タンパク質構成アミノ酸で、哺乳類の中枢神経系に多く存在する抑制性の神経伝達物質である。２００１年の食薬区分改正により食品としての利用が可能となり、自律神経バランスの改善によるストレス緩和や睡眠の質改善作用、肌の弾力性の維持など、多岐に亘る生理活性が報告されている。
また、ＧＡＢＡには、成長ホルモンの分泌を促進する作用が報告されており（非特許文献１５）、特許文献１には、グルタミン酸ソーダ、グルタミン酸、小麦グルテン及び焼酎粕タンパクから選ばれる少なくとも１種をグルタミン酸原として、ラクトバチルスヒルガルディーＫ－３株（ＦＥＲＭＢＰ－１０４８７）から発酵法で生産されるＧＡＢＡを含有する、乳酸菌発酵ＧＡＢＡ組成物を有効成分とする成長ホルモン分泌促進用組成物が記載されている。

特許文献２には、トレーニングによる持久力の向上効果を増強させるための、ＧＡＢＡを含有する筋持久力向上用組成物が記載されている。この持久力向上効果は、ＧＡＢＡ摂取時にトレーニングによる運動負荷を伴う場合に限定され、運動負荷のないＧＡＢＡ摂取では、効果がないことが記載されている。
このように、ＧＡＢＡによる持久力向上や成長ホルモン分泌促進効果に関する報告はなされているものの、運動負荷の有無に関係なく、ＧＡＢＡが筋肉増加に関連した細胞や遺伝子発現に直接作用して、筋肉量の増大や筋萎縮を抑制することは、知られていない。

特許第４５９６３０４号公報特開２０２１－１３２６４５号公報

Jpn. J. Rehabil. Med. (2007), Vol.44, No.3, p.144-170 千葉科学大学紀要 (2019) Vol.12, p.47-54 SCIENCE ADVANCES (2020) Vol.6, eabc4062, p.1-13 Cell (1987) Vol.51, p.987-1000 BMC Complementary and Alternative Medicine (2019) Vol.19, Article number 287,p.1-8 Molecules (2021) Vol.26, No.4887, p.1-32 体力科学 (2005) Vol.54, No.1, p.27 第48回日本理学療法学術大会抄録集 (2013) Vol.40, Suppl. No.2 Gerontology (2014) Vol.60, p.289-293 Arterial Stiffness (2016) Vol.22, p.10-12 J. Phys. Fitness Sports Med. (2018) Vol.7, No.4, p.221-227 ファルマシア (2015) Vol.51, No.11, p.1058-1062 旗影会2020年度研究報告概要集（2020）畜産, p.12 J. Poult. Sci. (2019) Vol.56, p.224-230 European Society of Endocrinology (1980) Vol.93, p.149-154 Food & Function (2021) Vol.12, No.1, p.144-153 イルシー (2009) No.96, p.10-22

本発明の解決しようとする課題は、日常的に継続して摂取することができ、効果的に筋肉量を増加させ筋力の低下を抑制して、サルコペニアの予防や改善をすることが可能な筋合成関連遺伝子発現促進用、筋合成促進用、筋萎縮関連遺伝子発現抑制用、筋萎縮抑制用、または筋タンパク質分解抑制用の剤を提供することである。

本発明者は鋭意研究した結果、γ-アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）が、筋芽細胞の増殖促進作用、筋合成を促進する作用、筋肉量を増加させる作用、筋萎縮を抑制する作用、筋タンパク質の分解を抑制する作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明は、以下（１）～（６）のサルコペニア予防または改善剤に関する。
（１）ＧＡＢＡを有効成分とするサルコペニア予防または改善剤（ただし、トレーニングを伴うものを除く）。
（２）筋合成関連遺伝子発現促進用、筋合成促進用、筋萎縮関連遺伝子発現抑制用、筋萎縮抑制用、または筋タンパク質分解抑制用の、上記（１）に記載の剤。
（３）筋芽細胞の細胞増殖を促進するための、分化制御因子ＭｙｏＤおよび／または転写コアクチベーターＰＧＣ－１αの発現を増加させるための、または、筋肉増殖抑制因子Ｍｙｏｓｔａｔｉｎの発現を抑制するための、上記（１）または（２）に記載の剤。
（４）食品添加剤である、上記（１）または（２）に記載の剤。
（５）経口投与される製剤である、上記（１）または（２）に記載の剤。
（６）ＧＡＢＡの一日摂取量が１０～３０００ｍｇである、上記（１）または（２）に記載の剤。

また、本発明は、以下（７）～（１０）の飲食品組成物に関する。
（７）上記（１）または（２）に記載の剤を含む、サルコペニア予防または改善用飲食品組成物（ただし、トレーニングを伴うものを除く）。
（８）上記（１）または（２）に記載の剤を含む、筋量増加用飲食品組成物（ただし、トレーニングを伴うものを除く）。
（９）筋芽細胞の細胞増殖を促進するための、分化制御因子ＭｙｏＤおよび／または転写コアクチベーターＰＧＣ－１αの発現を増加させるための、または筋肉増殖抑制因子Ｍｙｏｓｔａｔｉｎの発現を抑制するための、上記（７）に記載の飲食品組成物。
（１０）筋芽細胞の細胞増殖を促進するための、分化制御因子ＭｙｏＤおよび／または転写コアクチベーターＰＧＣ－１αの発現を増加させるための、または筋肉増殖抑制因子Ｍｙｏｓｔａｔｉｎの発現を抑制するための、上記（８）に記載の飲食品組成物。

本発明によれば、新たな筋合成関連遺伝子発現促進剤、筋合成促進剤、筋萎縮関連遺伝子発現抑制剤、筋萎縮抑制剤、または筋タンパク質分解抑制剤を提供できる。
これまでに副作用の報告がなく、食品としての利用が可能である安全なＧＡＢＡを有効成分とするため、長期間の継続投与および継続摂取が可能である。その結果、筋肉の機能の低下を抑え、最終的に筋萎縮あるいはサルコペニアの進行を抑制し、寝たきりを予防するための健康食品、飲食品、または医薬として利用できる。

Ｃ２Ｃ１２の細胞増殖に対するＧＡＢＡの効果を示す。細胞を１～１０００μｇ／ｍｌの濃度のＧＡＢＡで培養し、細胞生存率はＣｅｌｌｃｏｕｔｉｎｇｋｉｔ-８を使用して決定した。各データは３回の独立した実験の平均値±ＳＤを表し、棒グラフ上のａまたはｂはグループ間の有意差を示す（ｐ＜０．０５）。（Ａ）ＭｙｏＤｍＲＮＡ発現に対するＧＡＢＡの効果（リアルタイム－ＰＣＲ）。各データポイントは平均値と標準偏差を表す（ｎ＝９）。棒グラフ上の異なる文字（ａ、ｂ、またはｃ）は、グループ間の有意差を示す（ｐ＜０．０５）。（Ｂ）ＭｙｏＤタンパク質発現に対するＧＡＢＡの効果。各データポイントは、平均値と標準偏差を表す（ｎ＝３）。棒グラフ上の異なる文字（ａ、ｂ、またはｃ）は、グループ間の有意差を示す。（ｐ＜０．０５）（Ａ）ＰＧＣ－１α ｍＲＮＡ発現に対するＧＡＢＡの効果（リアルタイム－ＰＣＲ）。各データポイントは、平均値と標準偏差を表す（ｎ＝９）。棒グラフ上の異なる文字（ａ、ｂ、またはｃ）は、グループ間の有意差を示す（ｐ＜０．０５）。（Ｂ）ＰＧＣ－１αタンパク質発現に対するＧＡＢＡの効果。各データポイントは、平均値と標準偏差を表す（ｎ＝３）。棒グラフ上の異なる文字（ａ、ｂ、またはｃ）は、グループ間の有意差を示す（ｐ＜０．０５）。（Ａ）ＭｙｏｓｔａｔｉｎｍＲＮＡ発現に対するＧＡＢＡの効果（リアルタイム－ＰＣＲ）。各データポイントは、平均値と標準偏差を表す（ｎ＝９）。棒グラフ上の異なる文字（ａ、ｂ、またはｃ）は、グループ間の有意差を示す（ｐ＜０．０５）。（Ｂ）Ｍｙｏｓｔａｔｉｎタンパク質発現に対するＧＡＢＡの効果。各データポイントは、平均値と標準偏差を表す（ｎ＝３）。棒グラフ上の異なる文字（ａ、ｂ、またはｃ）は、グループ間の有意差を示す（ｐ＜０．０５）。

本発明のＧＡＢＡとは、γ-ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄ（γ-アミノ酪酸）の略称である。動植物等広く分布するアミノ酸の一種で、哺乳動物の脳や脊髄に存在する抑制系の神経伝達物質である。ＧＡＢＡは脳の血流を改善し酸素供給量を増加させ脳代謝を亢進させる働きを持つことから、脳卒中や頭部外傷後遺症、脳動脈後遺症による頭痛、耳鳴り、欲求低下等の治療に応用される。またその他の生理効果として、学習能力の向上、腎機能の活性化が知られている。ＧＡＢＡは主に生体の脳髄に存在し、中枢神経の神経伝達物質として関与しており、神経の主要な抑制性伝達物質として知られ、間脳の血流を活発にして脳細胞の代謝機能を高めるとともに、ストレスによる自律神経を緩和させることを目的として利用されている。

本発明におけるＧＡＢＡは、野菜、果物、穀類などに含まれるＧＡＢＡ、またはそれらから抽出されたＧＡＢＡ、発酵食品から生産されるＧＡＢＡ、有機合成から生産されたＧＡＢＡである。
上記野菜、果物、穀類とは、かぼちゃ、なす、とまと、きゅうり、米、玄米、麦芽、大豆などをいい、発酵食品とは、乳酸菌、酵母、納豆菌由来のキムチ・漬物・発酵乳・納豆などの発酵食品をいう。胚芽米、緑茶、米ぬかの乳酸菌による発酵、グルタミン酸から乳酸菌を用いて発酵することにより得ることができ、さらに、自然界に存在するグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）を用い、グルタミン酸および／またはグルタミン酸ナトリウムを原料に酵素変換したもの、さらには発酵食品中の細菌を単離し、培養液中で調製したものであってもよい。

本発明のサルコペニア予防または改善剤の実施の形態は、経口組成物用、飲食品（サプリメント）、食品添加物用の用途で利用されることが好ましい。本発明のサルコペニア予防または改善剤をサプリメント、医薬として利用する場合には、実施の形態として賦形剤を含有する錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤などの経口用組成物とすることが好ましい。経口用組成物は、舌下薬（錠剤だけでなく、オブラートのようなシート、ペースト）やゼリー、微粉末を懸濁させたドリンク剤でもよい。また、飲食品組成物、医薬組成物は、ヒト用に限定されず、ペットや家畜として飼育されている犬や猫などの哺乳動物用を含む。

ＧＡＢＡはそれを豊富に含む飲食品の形態のものを利用しても良い。当該飲食品の形態としては、特に限定するものではないが、粉末状、顆粒状、カプセル、錠剤に成形しても良い。また、その他の形態としては、食品素材、食品添加剤としても良く、あるいは、シロップ剤、懸濁剤、ドリンク剤、流動食、清涼飲料、乳飲料、乳酸菌飲料、機能性調味料、ゲル状食品、プリン、ヨーグルト、菓子・ケーキ類、パン類、麺類、パスタ、チョコレート、キャンディ、チューインガム等の形態にしても良い。
また、飲食品には、通常の飲食品の他、サプリメントや健康食品、経腸栄養食品、機能性表示食品、特定保健用食品などが含まれる。

本発明のＧＡＢＡの飲食品または医薬としての一日摂取量は１０～３０００ｍｇが好ましく、ＧＡＢＡを有効成分として含む飲食品としては１０～９０重量％、好ましくは２５～５０重量％のＧＡＢＡを有効成分として含有してもよい。当該飲食品の成人１人当たり１日の摂取量は１０～５０００ｍｇ、好ましくは２５０～３５００ｍｇの範囲である。

サルコペニア（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）とは、加齢に伴い骨格筋が萎縮し、骨格筋量及び骨格筋力の低下を伴う症候群である。サルコペニアは、国や地域などによって異なる多く診断基準が存在しているが、日本では、筋肉量の低下を必須項目とし、筋力または身体能力の低下のいずれかに該当した場合にサルコペニアと診断される（サルコペニアの診断・病態・治療、日本老年医学会雑誌（２０１５）Ｖｏｌ．５２，Ｎｏ．４，ｐ．３４３－３４９））。

骨格筋の発生は、間葉系幹細胞が筋芽細胞へと分化し、筋芽細胞が相互に融合して多核の筋管細胞へと分化を遂げ、筋管細胞が最終的に合胞体を形成して収縮能力を有する筋線維へと成熟する。
筋芽細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔ）は筋線維の由来となる単核の細胞であり、この細胞が多数細胞融合して多核細胞である筋管細胞（ｍｙｏｔｕｂｅ）に分化する。この筋芽細胞の分化には筋分化特異的位遺伝子群（ｍｕｓｃｌｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｆａｃｔｏｒｓ；ＭＲＦｓ）と呼ばれる遺伝子群が重要な役割を果たし、ＭｙｏＤファミリーはその一つである。
筋管細胞はさらに分化して合胞体を形成し、収縮能力を有する筋線維（ｍｙｏｆｉｂｅｒ）へと成熟する。また、筋線維は加齢に伴うミオスタチン（ｍｙｏｓｔａｔｉｎ）の発現増加により、筋萎縮、筋タンパク質分解が起こることで、サルコペニアを引き起こすことが知られている。

本発明者は、筋肉の元となる筋芽細胞にＧＡＢＡを曝露し、ＧＡＢＡが直接的に筋肉細胞に与える影響を調べた。評価項目は、筋芽細胞の細胞増殖と、ＭｙｏＤ、ＰＧＣ－１α、およびＭｙｏｓｔａｔｉｎの遺伝子およびタンパク質の発現量とした。
ＭｙｏＤは筋肉細胞への分化因子として重要視されており、たとえば、線維芽細胞といった非筋肉細胞にＭｙｏＤを何らかの方法で強制的に発現させると筋肉細胞に変化することが知られている。転写コアクチベーターＰＧＣ－１αはミトコンドリア生合成を活性化する因子であり、筋管細胞から筋線維への分化にも関連しているといわれている。Ｍｙｏｓｔａｔｉｎは骨格筋の増殖を抑制する筋肉増殖抑制因子であり、発現増加により筋萎縮、筋タンパク質分解を引き起こす。

実験の結果、ＧＡＢＡは筋芽細胞の細胞増殖を有意に促進すること、筋芽細胞におけるＭｙｏＤおよびＰＧＣ－１αの発現を有意に増加させること、およびＭｙｏｓｔａｔｉｎの発現を有意に減少させることが確認された。ＧＡＢＡを筋細胞に供給することができれば、筋肉量の増加を促進し、筋肉量の減少を抑制することにより、健康寿命に大きな影響を与えるサルコペニアを予防あるいは改善する効果が期待される。

ＧＡＢＡは、筋芽細胞の細胞増殖を促進する作用を有しているため、筋合成促進剤、筋量増加剤として用いることが可能である。
また、ＧＡＢＡは筋合成関連遺伝子の発現を促進する作用を有しているため、筋合成関連遺伝子発現促進剤、筋合成促進剤、筋量増加剤として用いることが可能である。ＧＡＢＡによって発現が促進される筋合成関連遺伝子の例としては、分化制御因子ＭｙｏＤや転写コアクチベーターＰＧＣ－１αが例示される。
また、ＧＡＢＡは筋萎縮関連遺伝子の発現を抑制する作用を有しているため、筋萎縮関連遺伝子発現抑制剤、筋萎縮抑制剤、筋タンパク質分解抑制剤として用いることが可能である。ＧＡＢＡによって発現が促進される筋萎縮関連遺伝子の例としては、筋肉増殖抑制因子Ｍｙｏｓｔａｔｉｎが例示される。

本発明において、筋量増加とは、筋量（筋肉量）を増加させることをいい、筋量の増加は、例えば、筋量計などにより筋肉量を測定することで評価することができる。筋量の増加の対象となる筋は骨格筋が好ましい。
上記非特許文献３～１４の他にも、野生雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに２．５％イソロイシン液を５週間投与した場合、非投与群に比べＭｙｏＤ発現が有意に増加し、その結果、筋形成が促進され、筋肉量が有意に増加したこと（非特許文献１６）、運動を繰り返し行うことによって、ＰＧＣ－１α発現が増加し、筋肉量が増加すること（非特許文献１７）、２４カ月齢のＷｉｓｔａｒ系ラット（オス）では、７週齢および１２か月齢の同ラットに比べ、筋肉組織中のＭｙｏｓｔａｔｉｎの発現量が有意に高値を示し、体重あたりの筋肉量が有意に低値を示したこと（非特許文献１１）等、が報告されており、ＭｙｏＤおよびＰＧＣ－１α、またはＭｙｏｓｔａｔｉｎ発現の増加、または減少によって、筋肉量が増加し、または減少すると推認される。
筋萎縮とは、筋細胞の減少や縮小により筋量が低下することをいい、加齢に伴うもの（サルコペニア）や、長期間の安静臥床や骨折等のためのギプス固定によるものが挙げられる。筋萎縮の抑制とは、加齢や不活動に伴う筋量の低下を抑制することをいう。

次に、本発明の具体例を、以下の実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

［マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２の増殖に与える影響］
ＤＭＥＭ培地＋ＦＢＳ１０％＋Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎＳｏｌｕｔｉｏｎ１％にて５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製したＣ２Ｃ１２懸濁液を９６穴平底マイクロプレート(ＦＡＬＣＯＮ，ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ)に１００μｌ/ｗｅｌｌずつ播種した（ｎ＝６）。またブランクとして、培地のみ１００μｌ/ｗｅｌｌずつ滴下した。その後、３７℃、５％炭酸ガス存在下で培養した。
培養２４時間後に、培地を吸引除去した後、ＤＭＥＭ培地＋ＦＢＳ１％＋Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎＳｏｌｕｔｉｏｎ１％を１００μｌ/ｗｅｌｌずつ注入した。一方、対照区は滅菌済ＰＢＳを１％含むよう添加した。試験区はＧＡＢＡ（９９．０％，ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ）溶液（ＰＢＳ）を所定濃度となるように添加した。３７℃、５％炭酸ガス存在下で２４時間培養した。
翌日、同様に培地交換を行い、ＰＢＳもしくはＧＡＢＡ溶液を添加した。３７℃、５％炭酸ガス存在下で２４時間培養した。

Ｃｅｌｌｃｏｕｔｉｎｇｋｉｔ－８（株式会社同仁化学研究所）溶液を１０μｌ/ｗｅｌｌずつ添加し、３７℃、５％炭酸ガス存在下で２時間反応させた。
反応終了後、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ)で４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。細胞増殖に関する数値は、細胞を播種したｗｅｌｌの測定値から、ブランクのｗｅｌｌの測定値を引いて算出した。
結果を図１に示す。ＧＡＢＡ１００μｇ／ｍＬ以上の濃度では、筋芽細胞の増殖は１．３倍以上となり、ＧＡＢＡは筋芽細胞の増殖を有意に促進することが確認された。

［マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２における標的ｍＲＮＡの発現量測定(リアルタイムＰＣＲ)］
ＤＭＥＭ培地＋ＦＢＳ１０％＋Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎＳｏｌｕｔｉｏｎ１％にて８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した細胞懸濁液を、２４ｗｅｌｌｐｌａｔｅに１ｍＬずつ播種した。
培養２４時間後に培地を吸引除去して、ＤＭＥＭ培地＋ＦＢＳ１％＋Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎＳｏｌｕｔｉｏｎ１％を１ｍＬずつｗｅｌｌに注入した。一方、対照区には滅菌済ＰＢＳを１０％含むよう添加した。試験区にはＧＡＢＡ（９９．０％，ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ）溶液（ＰＢＳ）を所定濃度となるように添加した。３７℃、５％炭酸ガス存在下で２４時間培養した。
翌日、同様に培地交換を行い、ＰＢＳもしくはＧＡＢＡ溶液を添加した。３７℃、５％炭酸ガス存在下で２４時間培養した。
２４時間後に、ＴＲＩｚｏｌＰｌｕｓＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ５０ｐｒｅｐｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、細胞から総ＲＮＡを抽出した。その後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔIＶＶＩＬＯＭａｓｔｅｒＭｉｘｗｉｔｈｅｚＤＮａｓｅＥｎｚｙｍｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、ｃＤＮＡを合成した。

ＦａｓｔＳｔａｒｔＥｓｓｅｎｔｉａｌＤＮＡＧｒｅｅｎｍａｓｔｅｒ（ロシュ）にて調製し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）９６Ｓｙｓｔｅｍを用いてリアルタイム－ＰＣＲ法にて、ＭｙｏＤ、ＰＧＣ－１α、およびＭｙｏｓｔａｔｉｎのｍＲＮＡ発現量の測定を行った。ＰＣＲ反応は９５℃にて６００秒間初期変性を行った後、３ｓｔｅｐＡｍｐｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、４５ｃｙｃｌｅｓ、９５℃・１０ｓ、６０℃・１０ｓ、７２℃・１５ｓ、Ｍｅｌｔｉｎｇのプログラムで実施した。内部標準はＧＡＰＤＨを用いた。各遺伝子のプライマーは表１に示す。ｍＲＮＡ発現量は、ＧＡＰＤＨｍＲＮＡ発現量に対する割合として求めた。

結果を図２～４の（Ａ）に示す。
筋芽細胞におけるＭｙｏＤおよびＰＧＣ－１αにおいて、ＧＡＢＡ濃度依存的にｍＲＮＡ発現量が有意に高値を示した（図２（Ａ）、図３（Ａ））。一方、ＭｙｏｓｔａｔｉｎｍＲＮＡ発現量は、ＧＡＢＡ濃度依存的に有意に低値を示した（図４（Ａ））。

［マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２における標的タンパク質の発現量測定（ウェスタンブロッティング法）］
ＤＭＥＭ培地＋ＦＢＳ１０％＋Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎＳｏｌｕｔｉｏｎ１％にて８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した細胞懸濁液を、２４ｗｅｌｌｐｌａｔｅに１ｍＬずつ播種した。
培養２４時間後に培地を吸引除去して、ＤＭＥＭ培地＋ＦＢＳ１％＋Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎＳｏｌｕｔｉｏｎ１％を１ｍＬずつｗｅｌｌに注入した。一方、対照区には滅菌済ＰＢＳを１０％含むよう添加した。試験区にはＧＡＢＡ（９９．０％，ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ）溶液（ＰＢＳ）を所定濃度となるように添加した。３７℃、５％炭酸ガス存在下で２４時間培養した。
翌日、同様に培地交換を行い、ＰＢＳもしくはＧＡＢＡ溶液を添加した。３７℃、５％炭酸ガス存在下で２４時間培養した。
翌日、同様に培地交換を行い、ＰＢＳもしくはＧＡＢＡ溶液を添加した。３７℃、５％炭酸ガス存在下で２４時間培養した。
細胞上清を除去して、ＰｒｏｔｅａｓｅａｎｄＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒを添加したＭ－ＰＥＲＲｅａｇｅｎｔにてタンパク質を抽出した。抽出したタンパク質量をＢｒａｄｆｏｒｄＡｓｓａｙで測定した。
タンパク質液にＢｏｌｔＬＤＬＳａｍｐｌｅＢｕｆｆｅｒおよびＲｅｄｕｃｉｎｇＡｇｅｎｔを添加して７０℃、１０分間熱処理を行った。

ＢｏｌｔＭＥＳＳＤＳＲｕｎｎｉｎｇＢｕｆｆｅｒと１５ｗｅｌｌゲルを用い、電気泳動(２００Ｖ,２２分間)を行った後、ゲルを取り出してｉＢｌｏｔ２ドライブロッティングシステムによって転写を行った。
ｉＢｉｎｄＷｅｓｔｅｒｎＳｙｓｔｅｍを用いて、ＧＡＰＤＨとＭｙｏＤ、ＰＧＣ－１α、およびＭｙｏｓｔａｔｉｎタンパク質の抗原抗体反応を行った。一次抗体は、ＧＡＰＤＨＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡＮＴＩＢＯＤＹｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ６０００４－１－Ｉｇ(ｍｏｕｓｅ)、ＭｙｏＤ１ＰｏｌｙｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙ(ｒａｂｂｉｔ)、およびＡｎｔｉ－ＰＧＣ１ α, Ｒａｂｂｉｔ－Ｐｏｌｙｂｓ－１８３２Ｒ、ＧＤＦ８／ＭＳＴＮＰｏｌｙｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＢＳ－１２８８Ｒ(ｒａｂｂｉｔ)を、二次抗体は、Ｇｏａｔａｎｔｉ－ＭｏｕｓｅＩｇＧ (Ｈ＋Ｌ) ＳｅｃｏｎｄａｒｙＡｎｔｉｂｏｄｙ, ＨＲＰ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｇｏａｔａｎｔｉ－ＲａｂｂｉｔＩｇＧ (Ｈ＋Ｌ) ＳｅｃｏｎｄａｒｙＡｎｔｉｂｏｄｙ，ＨＲＰを用いた。
メンブレンを洗浄後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌｗｅｓｔＤｕｒａに含まれる２種類の試薬をそれぞれ１．０ｍＬずつ混合してメンブレンに５分間反応させた。
メンブレンをＢＩＯＲＡＤのｃｈｅｍｉＤｏｃＸＲＳ＋システムに挿入して、イメージングを行った。また、画像解析ソフトを用い、検出されたバンドの濃淡を数値化した。

結果を、図２～４の（Ｂ）に示す。
筋芽細胞におけるＭｙｏＤおよびＰＧＣ－１αタンパク質においては、ＧＡＢＡ濃度依存的に発現が有意に高値を示した（図２（Ｂ）、図３（Ｂ））。一方、Ｍｙｏｓｔａｔｉｎタンパク質においては、ＧＡＢＡ濃度依存的に発現が有意に低値を示した（図４（Ｂ））。

ＧＡＢＡは、ＭｙｏＤおよびＰＧＣ－１αのｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を有意に増加させ、ＭｙｏｓｔａｔｉｎのｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を有意に減少させた。ＧＡＢＡの筋芽細胞の増殖および融合促進効果と、筋線維への成長促進効果、さらに筋肉量減少抑制効果を示すことを細胞実験によって明らかにした。
ＧＡＢＡを筋芽細胞等の筋細胞に供給すれば、筋肉量の増加を促進し、筋肉量の減少を抑制することにより、サルコペニアを予防あるいは改善する効果が期待される。

Claims

ＧＡＢＡを有効成分とするサルコペニア予防または改善剤（ただし、トレーニングを伴うものを除く）。
筋合成関連遺伝子発現促進用、筋合成促進用、筋萎縮関連遺伝子発現抑制用、筋萎縮抑制用、または筋タンパク質分解抑制用の、請求項１に記載の剤。
筋芽細胞の細胞増殖を促進するための、分化制御因子ＭｙｏＤおよび／または転写コアクチベーターＰＧＣ－１αの発現を増加させるための、または、筋肉増殖抑制因子Ｍｙｏｓｔａｔｉｎの発現を抑制するための、請求項１または２に記載の剤。
食品添加剤である、請求項１または２に記載の剤。
経口投与される製剤である、請求項１または２に記載の剤。
ＧＡＢＡの一日摂取量が１０～３０００ｍｇである、請求項１または２に記載の剤。
請求項１または２に記載の剤を含む、サルコペニア予防または改善用飲食品組成物（ただし、トレーニングを伴うものを除く）。
請求項１または２に記載の剤を含む、筋量増加用飲食品組成物（ただし、トレーニングを伴うものを除く）。
筋芽細胞の細胞増殖を促進するための、分化制御因子ＭｙｏＤおよび／または転写コアクチベーターＰＧＣ－１αの発現を増加させるための、または筋肉増殖抑制因子Ｍｙｏｓｔａｔｉｎの発現を抑制するための、請求項７に記載の飲食品組成物。
筋芽細胞の細胞増殖を促進するための、分化制御因子ＭｙｏＤおよび／または転写コアクチベーターＰＧＣ－１αの発現を増加させるための、または筋肉増殖抑制因子Ｍｙｏｓｔａｔｉｎの発現を抑制するための、請求項８に記載の飲食品組成物。