JP7305344B2 - 痰試料を処理するための組成物 - Google Patents

Description

本発明は、生物学的試料、例えば細菌を含有する試料の処理の分野に属する。この分野内で、それは、痰試料を処理するための組成物および方法に関する。

背景
生物学的物質、例えば核酸またはタンパク質の、例えば臨床試料のような複雑な生物学的混合物からの単離は、特に診断目的に関してかなりの重要性を有してきた。

生物学的試料調製の診断的適用に関する例は、ウイルスまたは細菌標的の調製およびその後の検出を含む。特に、臨床環境において、そのような技法は、しばしば高度に病原性の物質、例えば生きている細菌細胞の取り扱いを必要とし、それは、調製を実施する人に重大な感染の危険をもたらす可能性がある。従って、安全対策としてそれぞれの病原体を不活性化することが重要である可能性がある。多くの場合において、そのような不活性化は、問題の分析物の富化のためのさらなる手段が適用され得る前にウイルス粒子または細菌細胞がそれぞれの内容物が放出されるように溶解される典型的な調製工程により達成されることができる。一般的なウイルス粒子および細菌細胞のほとんどに関する標準的な溶解手順は、十分に確立されており、当業者に既知である。

しかし、以下で“マイコバクテリア”とも呼ばれるマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）群（ＭＴＢＣ）の種を含む特定の病原体は、不活性化の成功のためにより過酷な処理を必要とする。これらの細菌は、比較的厚く複雑な細胞壁により覆われており（ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ）、それは、ほとんどの他の臨床的に関連する細菌において見られるそれらの対応物よりもかなり高い堅牢性を示す。

追加の難題は、マイコバクテリアの診断に通常必要とされる試料により提供される。ＭＴＢＣ種は、典型的には痰中で検出され、それは、本来、例えば血漿のような多くの他の臨床試料タイプよりも複雑な処理を必要とする要求の厳しい試料マトリックスである。生の痰は、しばしばそれが処理され得る前に液化を必要とする高度に粘性の物質である傾向がある。

当該技術で適用されている関連するアプローチは、例えば様々な界面活性剤、カオトロープ、緩衝剤、洗浄剤および他の構成要素を含有する組成物の使用を教示している米国特許第８６２７８２号を含む。実際の使用は、本明細書の下記のように、マイコバクテリアの不活性化が常に最適ではない可能性があることを示してきた。

本開示は、マイコバクテリアを含有することが疑われる痰試料を処理するための向上したアプローチを記載する。
要旨
第１側面において、マイコバクテリアを含有することが疑われる痰試料を処理するための組成物が、開示される。組成物は、そうしなければ特に一般的な液体取り扱いシステム、例えばピペッターではしばしば取り扱うことが難しい痰の液化を提供する。組成物は、さらに、試料中に存在する場合にマイコバクテリアの不活性化を可能にする。その有効成分は、チモール、線状または分枝状アルコール、カオトロピック剤、還元剤、洗浄剤および緩衝剤を含む。組成物のｐＨ値は、８．５～１０である。

本明細書で開示される別の側面は、マイコバクテリアを含有することが疑われる痰試料を処理するための方法である。簡潔には、痰は、本明細書で記載される組成物と接触させられ、混合され、次いで痰の液化およびマイコバクテリアの不活性化のための適切な条件下でインキュベートされる。

本明細書で開示されるさらなる側面は、マイコバクテリアを含有することが疑われる痰試料を処理するための本明細書で記載される組成物の使用である。

本明細書で記載される第１側面は、マイコバクテリアを含有することが疑われる痰試料を処理する組成物であり、組成物は、以下の構成要素を含み：
－チモール
－線状または分枝状アルコール
－カオトロピック剤
－還元剤
－洗浄剤
－緩衝剤
ここで、組成物は、８．５～１０のｐＨ値を有する。

結核（ＴＢ）は、上記のマイコバクテリウム・ツベルクローシス群（ＭＴＢＣ）の種により引き起こされる細菌感染症である。ＴＢは、死因トップ１０の間に位置している主な世界的健康問題のままであり、Ｍ．ツベルクローシスの薬剤耐性株の出現は、世界的に増大しつつある脅威である。ＴＢの診断は、臨床試料からの－肺結核に関しては呼吸試料、例えば痰からのＭ．ツベルクローシス桿菌の回収により確証される。上記のように、それらの試料は、試料に本来備わる干渉性物質の高い負荷のため、生物安全性、高い試料の粘性による自動化された作業の流れにおけるさらなる処理および診断試験に関する適合性の点で主な難題を構成する。現在、上記の難題の全ての釣り合いを十分に取る利用可能な商業的試薬は、存在しない。本明細書で記載される組成物は、５Ｅ＋０７ ＣＦＵ／ｍＬに至るまでのマイコバクテリウム・ツベルクローシス群桿菌を有効に不活性化することを可能にし、呼吸試料を液化させ、分子診断において用いられ得る自動化された試料抽出の作業の流れと適合性であり、１８ヵ月以上の試薬の安定性を有する。

“痰”は、咳嗽により下気道（気管支および肺）から吐き出される濃い粘液（ｍｕｃｕｓ）または粘液（ｐｈｌｅｇｍ）であり；それは、唾液でもつばでもない。典型的には、痰は、かなりの量の糖タンパク質痰を含む。試料収集プロセスにおいて、試料は、下気道から回収され、上気道からは回収されない。未処理の痰の試料は、本明細書において“生の痰”とも呼ばれる。本明細書で記載されるある態様において、痰試料は、生の痰試料である。あるいは、患者から収集された痰は、例えば一般的な緩衝液、例えばトリス、シトレート等で希釈されることができる。そのような緩衝液は、典型的には、痰試料の困難な取り扱いの特性を変えることに実質的には寄与せず、すなわち、痰は、希釈液内でなお粘性かつほとんど非混和性の物質のままであり得る。そのような場合、痰が従来の液体取り扱いデバイスおよび方法によるさらなる処理を受けられるようにするために、本明細書で開示される組成物のような組成物の添加が、必要とされるであろう。

本明細書で開示される組成物、ある態様において水溶液は、患者試料の液化（ムチンに富む呼吸試料のジスルフィド結合の還元剤による還元による試料マトリックスの消化）ならびに洗浄剤、カオトロピック剤、線状または分枝状アルコールおよび強い抗微生物特性を有する天然存在殺生物剤としてのチモールによる細胞壁の損傷、タンパク質変性および他の機序によるＭ．ツベルクローシス桿菌の不活性化を可能にする異なる機能活性を有する様々な化学化合物を含む。臨床的に関連する生物学的物質、特にマイコバクテリアの核酸の完全性は、それが下流の分析を受けることができるように、実質的に維持される。試薬のｐＨは、それが核酸の安定性および試料に本来備わる物質、例えばムチンタンパク質のｐＨ依存性の立体構造変化による干渉特徴の低減の間の釣り合いを取るように、８．５～１０の値を有する。

“チモール”（２－イソプロピル－５－メチルフェノール）は、タイムの油の中に存在する天然のシメンのモノテルペンフェノール誘導体であり、タイム・ブルガリス（Ｔｈｙｍｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）（コモンタイム）および様々な他の種類の植物から白色の結晶質物質として抽出される。それは、中性ｐＨにおいて水中でごくわずかに可溶性であるが、アルコール類および他の有機溶媒中で高度に可溶性である。それは、強アルカリ性水溶液中でもフェノール部分の脱プロトン化により可溶性である。

チモールは、本明細書で記載される組成物中にある範囲の異なる濃度で存在することができる。ある態様において、それは、０．７５％、１％または１．５％～２％、３．５％または５％の濃度（ｗ／ｖ）で適用される。より具体的な態様において、チモールは、約１％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。本発明者らが示してきたように、チモールは、ＭＴＢＣのメンバーの不活性化の状況において本明細書で開示される組成物の一部として非常に有効であることが証明されている。

“線状または分枝状アルコール”も、特にチモールとの組み合わせで、痰試料中に存在し得るマイコバクテリアの不活性化に寄与する。本明細書で記載される状況において有用な線状または分枝状アルコール類には、例えば１０炭素原子までの鎖長を有する短鎖アルカノール類がある。それは、第一級、第二級または第三級アルコールであることができる。特定の態様において、それは、第二級アルコールであることができる。より具体的な態様において、アルカノール鎖は、１～５炭素原子を有し、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールもしくはペンタノールまたはそれらの分枝状誘導体のいずれかである。さらにもっと具体的な態様において、アルカノールは、プロパノールおよびその誘導体の群から選択される。より具体的な態様において、アルカノールは、イソプロパノールである。イソプロパノール（イソプロピルアルコールとも呼ばれる）は、化学式Ｃ_３Ｈ_８Ｏを有する化合物である。それは、強い臭いを有する無色の可燃性の化学化合物である。ヒドロキシル基に連結されたイソプロピル基として、それは第二級アルコールの最も単純な例であり、ここで、ヒドロキシル基を担持する１個の炭素原子が、２個の他の炭素原子に結合している。

線状または分枝状アルコールは、本明細書で記載される組成物中に２０％、３０％または４５％～５０％、６０％、７０％または８０％（ｖ／ｖ）の範囲の濃度で存在することができる。ある態様において、濃度は、４５％～６０％である。より具体的な態様において、濃度は、６０％である。

“カオトロピック剤”は、一般に溶液中の水分子の規則正しい構造ならびに分子中および分子間の非共有結合的な力を乱す物質である。それらは、試料調製の手順にいくつかの寄与をなし得る。他には、カオトロピック剤は、生物学的な膜、例えば存在する場合に細胞膜または細胞小器官の膜の破壊に寄与する。カオトロピック剤の限定的でない例は、グアニジニウム塩、例えばチオシアン酸グアニジン、グアニジン塩酸塩、塩化グアニジウムまたはイソチオシアン酸グアニジン、尿素、過塩素酸塩、例えば過塩素酸カリウム、他のチオシアン酸塩またはヨウ化カリウムもしくはヨウ化ナトリウムである。本明細書で記載されるある態様において、カオトロピック剤は、グアニジニウム塩である。より具体的な態様において、カオトロピック剤は、チオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）である。

カオトロピック剤は、本明細書で記載される組成物中に０．５Ｍ、１Ｍまたは１．２Ｍ～２Ｍ、３．５Ｍまたは５Ｍの濃度範囲で存在することができる。より具体的な態様において、濃度は、１．２Ｍ～２Ｍの範囲であることができる。さらにもっと具体的な態様において、濃度は、約１．６Ｍであることができる。

“還元剤”は、本明細書で用いられる際、望まれない構成要素の変性にも寄与し得る。特に、還元剤は、当該技術で広く知られるように、多くのタンパク質の三次構造に特に重要である分子間および分子内ジスルフィド結合を切断する。本明細書で記載される状況において、痰の主な構成要素である高分子量ムチン糖タンパク質のジスルフィド結合は、試料の全体的な粘性が低下するように壊される。本発明の状況において有用であるのは、例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）のような還元剤であるが、例えば２－メルカプトエタノールのような当該技術で既知の他の還元剤も、用いられることができる。ある態様において、還元剤は、ＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン）である。上記の他の薬剤と比較して、ＴＣＥＰは、無臭のより強力な還元剤、（ＴＣＥＰは再生しない－ＴＣＥＰに媒介されるジスルフィド切断の最終産物は、実際は２個の遊離チオール類／システイン類であるという意味で）不可逆的還元剤、より親水性かつ空気中での酸化により耐性であるという利点を有する。それはまた、固定化金属親和性クロマトグラフィーにおいて用いられる金属を還元しない。ＴＣＥＰは、本明細書で記載される組成物において、例えば塩酸塩として用いられることができる。

還元剤は、本明細書で記載される組成物中に１ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭまたは１０ｍＭ～７５ｍＭ、１００ｍＭ、２５０ｍＭまたは５００ｍＭの範囲の濃度で存在することができる。より具体的な態様において、範囲は、５ｍＭ～７５ｍＭである。さらにもっと具体的な態様において、濃度は、約５０ｍＭである。

本明細書で記載される組成物の構成要素として用いられる“洗浄剤”も、細胞膜または細胞壁構成要素の変性、特定のタンパク質の変性等のような作用に寄与する。本明細書で記載される状況において有用な洗浄剤は、イオン性洗浄剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシル硫酸リチウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、Ｎ－ラウロイルザルコシンまたはそれらのあらゆる組み合わせを含む。本明細書で記載されるある態様において、洗浄剤は、非イオン性洗浄剤、例えばＴｗｅｅｎ－２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、ＣＨＡＰｓ、Ｂｒｉｊ系列のメンバーまたはＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００である。より具体的な態様において、洗浄剤は、Ｔｗｅｅｎ－２０である。非イオン性洗浄剤は、親水性の頭部基を有し、それは、非荷電であり、脂質－脂質および脂質－タンパク質相互作用を壊すそれらの能力に関して好ましい。それらは、タンパク質－タンパク質相互作用を壊す限られた能力を有し、しばしば非変性洗浄剤と呼ばれ、生物学的に活性な膜タンパク質を単離するために用いられる。

洗浄剤は、本明細書で記載される組成物中に０．０１％、０．０５％または０．１％～０．５％、１％、２．５％、５％または１０％（ｗ／ｖまたはｖ／ｖ）の範囲の濃度で存在することができる。ある態様において、濃度は、０．１％～１％の範囲である。より具体的な態様において、濃度は、約０．４％である。

“緩衝剤”は、主に特定のｐＨ値または範囲の確立および維持を提供する。本明細書で記載される状況における適切な緩衝剤は、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、シトレート、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸、１，３－ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ビカーボネート、ホスフェートまたはそれらのあらゆる組み合わせを含む。より具体的な態様において、緩衝剤は、トリス（Ｔｒｉｚｍａ、Ｔｒｉｚｍａ塩基、ＴＨＡＭまたは他の同意語としても知られている）である。

緩衝剤は、本明細書で記載される組成物中に１ｍＭ、１０ｍＭ、１００ｍＭまたは２５０ｍＭ～７５０ｍＭ、１Ｍ、２Ｍまたは５Ｍの範囲の濃度で存在することができる。より具体的な態様において、濃度範囲は、３７５ｍＭ～６３５ｍＭであることができる。さらにもっと具体的な態様において、濃度は、約５００ｍＭである。

本明細書で開示される組成物のｐＨ値は、８．５～１０の範囲であることができる。ある態様において、それは、約８．５、９、９．５または１０であることができる。より具体的な態様において、それは、８．７～９．３の範囲である。さらにもっと具体的な態様において、それは、約９である。

ｐＨ値を調節するための手段および試薬は、当該技術で周知である。本明細書で記載される組成物は、アルカリ性のｐＨを有するため、例えばアルカリ塩基のような塩基が、適切な物質に含まれる。ある態様において、アルカリ水酸化物が、塩基として用いられる。より具体的な態様において、水酸化ナトリウムが、用いられる。本明細書で開示される組成物中のそのような塩基の濃度は、１ｍＭ、１０ｍＭまたは１００ｍＭ～１５０ｍＭ、２５０ｍＭまたは５００ｍＭの範囲であることができる。より具体的な態様において、濃度は、約１００ｍＭまたは約１１２ｍＭであることができる。

特定の態様において、本明細書で記載される組成物は、以下の構成要素を含む：
－チモール ０．７５％～５％
－イソプロパノール ４５～６０％（ｖ／ｖ）
－ＧｕＳＣＮ １．２Ｍ～２Ｍ
－ＴＣＥＰ ５ｍＭ～７５ｍＭ
－Ｔｗｅｅｎ－２０ ０．４％
－Ｔｒｉｚｍａ ３７５ｍＭ～６２５ｍＭ。

本明細書において、マイコバクテリアを含有することが疑われる痰試料を処理するための方法も、記載され、その方法は、以下の工程を含む：
ａ）痰試料を本明細書で開示される組成物と接触させ、
ｂ）結果として得られた流体を混合し、
ｃ）その混合物を、試料を液化し、試料中に存在する場合にマイコバクテリアを不活性化するために十分な期間の間および条件の下でインキュベートする。

本明細書で開示される組成物の態様は、本明細書で記載される方法にも適用される。
特に痰の液化およびマイコバクテリアの不活性化の点で痰試料を処理するために本明細書で開示される組成物を用いることの利益は、本開示の他の箇所において記載されている。

本明細書で記載される方法は、本明細書で開示される組成物の文脈において詳述されているように、痰試料が生の痰である場合に特に有用である。本明細書で記載される方法および組成物を用いて、生の痰でさえも、事前の希釈なしでうまく処理されることができる。しかし、そのような希釈が実施される場合、本明細書で記載される方法は、希釈された、または他の方法で前処理された痰にも適用可能である。

痰試料を本明細書で開示される組成物と接触させ、それをそれと共に混合することは、同じ工程内で実施されることができる。例えば、痰を収容している容器は、振盪器上に、組成物が添加された際に試料の撹拌が容易に実施されることができるように置かれることができる。あるいは、痰は、組成物を収容している容器に、前記の容器がボルテックスまたは他の方法で撹拌されている間に添加されることができる。そのような作業の流れは、時間および潜在的に空間を節約することにより、方法を能率的にすることができる。従って、本明細書で開示される方法のある態様において、工程ａ）および工程ｂ）は、同じ時点で実施される。

しかし、その方法の他の態様において、痰試料および組成物は、まず互いと接触させられ、次いで例えば振盪器、撹拌器等に移され、その後混合されることができる。従って、本明細書で記載される方法のある態様において、工程ａ）および工程ｂ）は、時間的および／または位置的に分離されている。

混合を実施するための手段は、当業者に既知である。上記のように、振盪器またはボルテックスは、この目的のための最も一般的なデバイスに含まれる。ある態様において、混合物は、５～６０秒間振盪またはボルテックスされる。ある態様において、この期間は、約３０秒間である。

試料／組成物混合物のインキュベーションは、様々な条件下で、そして異なる長さの時間の間実施されることができる。
ある態様において、工程ｃ）におけるインキュベーションは、本質的に室温で実施され、恒温設備に関する必要性を排除する。室温は、通常は当該技術において２０℃～２５℃の範囲として定義される。ある態様において、インキュベーション温度は、約２５℃である。

また、ある態様において、工程ｃ）におけるインキュベーションに関する期間は、少なくとも３０分間である。ある態様において、それは、３０～９０分間である。より具体的な態様において、それは、約５０分間であり、他の態様において、約６０分間である。

インキュベーションは、追加の手段、例えば超音波処理と組み合わせられる、またはそれで補完されることができる。超音波の混合物への適用は、上記の両方の作用（痰試料の液化および試料中に存在する場合にマイコバクテリアの不活性化を意味する）に寄与することができる。適切な超音波処理器は、商業的に入手可能であり、当業者に既知である。それらは、従来の多目的超音波処理器または本明細書で記載された目的に関するテイラーメイドであることができる。

従って、本明細書で開示される方法のある態様において、工程ｃ）は、インキュベーションの間または後のどちらかでの混合物の超音波処理を含む。
ある態様において、本明細書で記載される方法は、さらに、工程ｃ）の後に以下の工程の１以上を含む：
ｄ）生物学的標的物質を、試料中に存在する場合に不活性化されたマイコバクテリアから単離し、
ｅ）その生物学的標的物質を分析する。

本開示の文脈において、生物学的標的物質の“単離”、“精製”または“抽出”という用語は、以下のことに関する：例えば核酸のような生物学的標的物質が増幅等による診断アッセイにおいて分析され得る前に、それらは、典型的には異なる構成要素の複雑な混合物を含有する生物学的試料から精製、単離または抽出されなければならない。本明細書で記載される状況において、痰試料中に存在する場合、マイコバクテリアは、様々な異なる生体分子を含有し、多くの場合、これらの分子の部分群のみが所与のタイプの分析に関する対象である。例えば、下流のプロセスにおいてＰＣＲにより分析されるべき核酸は、本明細書で開示される方法の工程ｄ）を施される混合物中に存在する他の生体分子から分離される必要がある可能性がある。単離に関する適切な方法は、当業者に既知である。

典型的には、最初の工程の１つは、細胞またはウイルス粒子の内容物を、例えば酵素および／または化学試薬を用いることにより放出させることを含む。このプロセスは、一般に溶解と呼ばれる。溶解物中の問題の分析物の富化に関して、核酸を結合させるための１つの有用な手順は、カオトロピック塩溶液中での結合粒子、例えば磁性粒子のガラスまたはシリカ表面への核酸の選択的結合およびその核酸の汚染物質、例えばアガロース、タンパク質または細胞破砕片からの分離を伴う。本明細書で用いられる組成物は、核酸がガラス表面に結合している場合に、組成物が既にそのような結合に通常必要であるカオトロピック剤を含有しているため、特に有用であり得る。

本明細書で開示される方法の工程ｅ）において実施されているような生物学的標的物質の下流の分析は、核酸のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）もしくは配列決定、またはタンパク質に関する抗体に媒介されるアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ等を含むことができる。本明細書で記載される方法のある態様において、分析は、増幅による核酸の定性的および／または定量的検出を含む。ある態様において、増幅技法は、ＰＣＲである。他の増幅技法、例えば等温増幅（ＬＡＭＰ、ＴＭＡ等）、ＬＣＲ等が、標的核酸を分析するために適用されることができる。

本明細書で記載される組成物およびそれを用いる方法によれば、本開示の別の側面は、マイコバクテリアを含有することが疑われる痰試料を処置するための本明細書で記載される組成物の使用である。安全な取り扱いおよび液体取り扱いデバイスの使用が望まれる場合、使用は、痰試料を液化させるため、そして試料中に存在する場合にマイコバクテリアを不活性化するためである。

本明細書で開示される組成物および方法の態様は、本明細書で記載される使用にも適用される。
典型的な態様
以下の実施例は、本明細書で開示される組成物、方法および使用の特定の態様を説明することが意図されているが、それらは限定的ではない。

実施例１－液体の取り扱い：
特に生の痰（しかししばしば希釈された痰も）は、取り扱うのが難しく、容易にピペット操作することができない物質である。

しかし、本明細書で開示される組成物を結果として１：２の比率をもたらすように添加すると、痰は、消化され、試料は、その後容易にピペット操作されることができる。
この実施例では、組成物は、以下の通りである：１．６Ｍ ＧｕＳＣＮ、０．４％ Ｔｗｅｅｎ－２０、５０ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）ＨＣｌ、５００ｍＭ Ｔｒｉｚｍａ塩基（トリス）、１１２ｍＭ ＮａＯＨ、６０％ ２－イソプロパノール、１％チモール、ｐＨ９。

実施例２－２つの異なるＭＴＢ株の様々な濃度レベル（２Ｅ＋０６～５Ｅ＋０７ ＣＦＵ／ｍＬ）における不活性化が、３つの異なる試験施設において実証された：
実験設定：
２つの異なる定量化されたＭＴＢ培養物（野生型ＭＴＢおよび実験室株Ｈ３７ｖ）が、５Ｅ＋０７ ＣＦＵ／ｍＬ、１Ｅ＋０７ ＣＦＵ／ｍＬおよび２Ｅ＋０６ ＣＦＵ／ｍＬの意図された標的濃度まで希釈された。培養物の０．５ｍＬの分割量が、１ｍＬの本明細書で記載された組成物（１．６Ｍ ＧｕＳＣＮ、０．４％ Ｔｗｅｅｎ－２０、５０ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）ＨＣｌ、５００ｍＭ Ｔｒｉｚｍａ塩基（トリス）、１１２ｍＭ ＮａＯＨ、６０％ ２－イソプロパノール、１％チモール、ｐＨ９）と混合された。室温で６０分間のインキュベーション時間の後、溶液は、３０００ｇで１５分間遠心分離され、上清が廃棄され、ペレットがＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水）で２回洗浄された後、それは、０．５ｍＬ ＤＰＢＳ中で懸濁された。商業的に入手可能なＭＧＩＴシステム（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ））中での培養のため、その溶液は、増殖をモニターするためにＭＧＩＴチューブ中に０．８ｍＬのＢＤ増殖培地と一緒に移された。固体培養に関して、その溶液は、インキュベーター中で保管されたＬｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ－Ｊｅｎｓｅｎ培地上に分配された。ＭＧＩＴシステムに関しては、増殖は、酸素の減少に基づいて検出され、固体培養では、増殖は、コロニー形成により検出される。

この試験は、本明細書で記載された組成物の２つの独特のバッチを用いて実施され、それぞれの濃度レベルに関する未処理の試料が、増殖対照として含まれた：
・多数の複製が、Ｔ０において本明細書で開示された組成物のバッチ１またはバッチ２のどちらかを用いて処理され、意図された期間および温度に関するインキュベーションの後、細胞は、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄され、増殖が、ＭＧＩＴシステムに関して用いられる手順に従うか、または固体培地タイプにおける確立された手順によるかのどちらかで開始された。

・増殖対照として、２つの複製が、手順を模倣するようにＰＢＳのみで処理された。
結果の概要が、表１において与えられている。

試験の時間経過（５２日間）にわたって、本明細書で開示された組成物で処理された複製では増殖は検出されず、一方で全ての増殖対照は、濃度に無関係に検出可能な増殖を有していた。

実施例３－ｐＨ値の液化に対する作用
ムチンは、痰試料中で豊富な糖タンパク質ファミリーであり、一例として自動化された核酸抽出に関して阻害性であることが知られている。これらの阻害作用は、ｐＨ値に依存して異なるタンパク質の立体構造により影響を受ける可能性がある。本明細書で記載された組成物の最適なｐＨ変種（ｖａｒｉａｎｔｓ）を決定するため、異なるｐＨレベルが、試験された：ｐＨ７．５、８．０、８．５、９．０、９．５および１０．０。

実験設定：
阻害条件下でのＭＴＢ複合体ＤＮＡの抽出および増幅を試験するため、５００ＣＦＵ／ｍＬのマイコバクテリウム・ボビス カルメット・ゲラン桿菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕeｒｉｎ）（ＢＣＧ）が、１％ムチンを含有するマトリックス中に添加され（ｓｐｉｋｅｄ）、本明細書で記載された組成物の異なるｐＨ変種の１つで処理された。性能は、５つの複製をｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００システム（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）においてｃｏｂａｓ（登録商標）ＭＴＢ試験（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を製造業者の説明書に従って用いて試験することにより評価された。

結果が、表２において示されている：

標的チャンネルならびに内部対照のチャンネルに関する比較可能なＣｔおよびＲＦＩにより示されるように、ｐＨ≧８．５および≦１０．０を有するあらゆる溶液の性能が、適切である。

実施例４－構成要素の最適濃度
本明細書で開示された組成物の個々の構成要素の濃度の許容範囲が、決定された。それらの範囲を決定するため、溶液の異なる変種が、生成され、それが、２つの参照バッチに対して試験された。

ａ）４種類の構成要素が、核酸の安定性および検出ならびにマトリックス中に存在するタンパク質により引き起こされる干渉のレベルに影響を及ぼす可能性があるため、試験された：チオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）、Ｔｒｉｚｍａ塩基（トリス）、ＮａＯＨおよび結果としてもたらされるｐＨ値。結果として、以下の組成物が、試験された：

実験設定：
ＭＴＢに関して低陽性の臨床沈降物パネルが、本明細書で記載された組成物の１つ（“溶液”と表される、下記参照）または２種類の参照溶液の一方と１：９で混合された。それぞれの希釈された試料が、３０秒間ボルテックスされ、室温で５０分間インキュベートされ、超音波処理され、３０００ｇで１分間遠心分離された後、試料がｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００システム上に装填された。

試験された全ての条件に関して、全ての試験された複製が陽性であり、ＲＦＩもＣｔも有意差を一切示さず、従って性能は同等であると考えられた。
ｂ）３種類の構成要素が、本明細書で記載された組成物の不活性化特性に影響を及ぼす可能性があるため、試験された：チオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）、イソプロパノールおよびチモール。以下の組成物が、試験された：

実験設定：
２種類の異なる定量化されたＭＴＢ培養物（野生型ＭＴＢおよび実験室株Ｈ３７ｖ）が、５Ｅ＋０７ ＣＦＵ／ｍＬおよび２Ｅ＋０６ ＣＦＵ／ｍＬの意図された標的濃度に希釈された。培養物の０．５ｍＬの分割量が、溶液または参照溶液のどちらかと混合された。室温で５０分間のインキュベーション時間の後、混合物は、３０００ｇで１５分間遠心分離され、上清が廃棄され、ペレットがＤＰＢＳで２回洗浄された後、それは、０．５ｍＬのＤＰＢＳ中で懸濁された。ＭＧＩＴシステム（ＢＤ）中での培養のため、溶液は、増殖をモニターするためにＭＧＩＴチューブ中に０．８ｍＬのＢＤ増殖培地と一緒に移された。この試験は、本明細書で記載された組成物およびその変種の５種類の２つの独特のバッチを用いて実施され、それぞれの濃度レベルに関する未処理の試料が、増殖対照として含まれた。
・多数の複製が、Ｔ０において組成物のそれぞれのバッチを用いて処理された。意図された期間および温度でのインキュベーション後、細胞は、ＰＢＳで洗浄され、増殖が、ＢＤ ＭＧＩＴシステムに関して用いられる手順に従うか、または固体培地タイプにおける確立された手順によるかのどちらかで開始された。

・増殖対照として、２つの複製が、手順を模倣するようにＰＢＳのみで処理された。
結果の概要が、表３において与えられている。

試験の時間経過（５２日間）にわたって、ＭＩＳまたはＭＩＳ変種で処理された複製では増殖は検出されず、一方で全ての増殖対照は、濃度に無関係に検出可能な増殖を有しており、従って、不活性化能力は、全ての試験された配合物に関して等しいと考えられる。

ｃ）痰試料の液化への主な寄与を有する還元剤であるＴＣＥＰが、ＴＣＥＰ濃度のみが用量設定された７種類の追加の溶液において試験された：
・０ｍＭ ＴＣＥＰ
・２．５ｍＭ ＴＣＥＰ
・５ｍＭ ＴＣＥＰ
・１０ｍＭ ＴＣＥＰ
・２０ｍＭ ＴＣＥＰ
・３０ｍＭ ＴＣＥＰ
・４０ｍＭ ＴＣＥＰ
・７５ｍＭ ＴＣＥＰ
・１００ｍＭ ＴＣＥＰ
本明細書で記載された組成物の全ての他の構成要素は、用いられた参照（１．６Ｍ ＧｕＳＣＮ、０．４％ Ｔｗｅｅｎ－２０、５０ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）ＨＣｌ、５００ｍＭ Ｔｒｉｚｍａ塩基（トリス）、１１２ｍＭ ＮａＯＨ、６０％ ２－イソプロパノール、１％チモール、ｐＨ９）と同じままであった。

実験設定：
生の痰において見られる条件を模倣するために用いられた１２％ムチン溶液が、本明細書で開示された組成物の異なる変種の１つと混合され、３０秒間ボルテックスされ、室温で５０分間インキュベートされた。液化能力が、インキュベーション後に評価された。５ｍＭ ＴＣＥＰで既に試料の良好な液化を示すために十分であった。

全用量設定試験が、用いられた構成要素の以下の濃度範囲が良好な液化をもたらすことを実証した。
・ＧｕＳＣＮ １．２Ｍ～２．０Ｍ
・Ｔｗｅｅｎ－２０ ０．４％（ｗ／ｖ）
・ＴＣＥＰ ＨＣｌ ５～７５ｍＭ
・イソプロパノール４５～６０％ （ｖ／ｖ）
・ＮａＯＨ １１２ｍＭ
・Ｔｒｉｚｍａ塩基 ３７５～６２５ｍＭ
・チモール ０．７５～５％
・ｐＨ８．７～９．３
実施例５－既存の製品に対する不活性化の比較が、企業ＬｏｎｇＨｏｒｎにより商業的に入手可能なＰｒｉｍｅ Ｓｔｏｒｅ溶液に対して直接実施された。

実験設定：
２種類の異なる定量化されたＭＴＢ培養物（野生型ＭＴＢおよび実験室株Ｈ３７ｖ）が、５Ｅ＋０７ ＣＦＵ／ｍＬおよび２Ｅ＋０６ ＣＦＵ／ｍＬの意図された標的濃度に希釈された。培養物の０．４ｍＬの分割量が、０．８ｍＬの本明細書で開示された組成物またはＰｒｉｍｅ ｓｔｏｒｅ溶液のどちらかと混合された。室温で５０分間のインキュベーション時間の後、溶液は、３０００ｇで１５分間遠心分離され、上清が廃棄され、ペレットがＤＰＢＳで２回洗浄された後、それは、０．５ｍＬのＤＰＢＳ中で懸濁された。ＭＧＩＴシステム（ＢＤ）中での培養のため、溶液は、増殖をモニターするためにＭＧＩＴチューブ中に０．８ｍＬのＢＤ増殖培地と一緒に移された。この試験は、本明細書で記載された組成物の２つの独特のバッチを用いて実施され、それぞれの濃度レベルに関する未処理の試料が、増殖対照として含まれた：
・多数の複製が、Ｔ０において本明細書で記載された組成物またはＰｒｉｍｅ Ｓｔｏｒｅのどちらかを用いて処理された。意図された期間および温度でのインキュベーション後、細胞は、ＰＢＳで洗浄され、増殖が、ＢＤ ＭＧＩＴシステムに関して用いられる手順に従うか、または固体培地タイプにおける確立された手順によるかのどちらかで開始された。

・増殖対照として、２つの複製が、手順を模倣するようにＰＢＳのみで処理された。
結果の概要が、表４において与えられている。

試験の時間経過（５２日間）にわたって、本明細書で開示された組成物で処理された複製では増殖は検出されず、一方で全ての増殖対照およびＰｒｉｍｅ Ｓｔｏｒｅで処理された複製は、濃度に無関係に検出可能な増殖を有しており、従って、不活性化性能は、既存の製品と比較して優れていると考えられ得る。

Claims (14)

1. マイコバクテリアを含有することが疑われる痰試料を処理するための組成物であって、該組成物が、以下の構成要素：
   －チモール
   －線状または分枝状アルコール
   －カオトロピック剤
   －還元剤
   －洗浄剤
   －緩衝剤、
   を含み、
   該組成物が、８．５～１０のｐＨ値を有する
   前記組成物。
2. 前記アルコールがイソプロパノールである、請求項１に記載の組成物。
3. 前記カオトロピック剤が、チオシアン酸グアニジン、グアニジン塩酸塩、塩化グアニジウムまたはイソチオシアン酸グアニジン、尿素、過塩素酸塩、例えば過塩素酸カリウム、他のチオシアン酸塩またはヨウ化カリウムもしくはヨウ化ナトリウムからなる群から選択される、請求項１または２に記載の組成物。
4. 前記還元剤が、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２－メルカプトエタノールおよびＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン）からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
5. 前記洗浄剤が、非イオン性洗浄剤である、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
6. 前記緩衝剤が、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、シトレート、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸、１，３－ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ビカーボネート、ホスフェートまたはそれらのあらゆる組み合わせからなる群から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
7. 以下の構成要素：
   －チモール ０．７５％～５％
   －イソプロパノール ４５～６０％（ｖ／ｖ）
   －ＧｕＳＣＮ １．２Ｍ～２Ｍ
   －ＴＣＥＰ ５ｍＭ～７５ｍＭ
   －洗浄剤 ０．４％
   －トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス） ３７５ｍＭ～６２５ｍＭ
   を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
8. マイコバクテリアを含有することが疑われる痰試料を処理するための方法であって、該方法が、以下の工程：
   ａ）痰試料を請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物と接触させ、
   ｂ）結果として得られた流体を混合し、
   ｃ）該混合物を、該試料を液化し、該試料中に存在する場合にマイコバクテリアを不活性化するために十分な期間の間および条件の下でインキュベートする；
   を含む前記方法。
9. 前記痰試料が生の痰である、請求項８に記載の方法。
10. 工程ａ）および工程ｂ）が同時に実施される、請求項８または９に記載の方法。
11. 工程ｃ）における該インキュベートの温度が室温である、請求項８～１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 工程ｃ）における該期間が少なくとも３０分間である、請求項８～１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 請求項８～１２のいずれか１項に記載の方法であって、工程ｃ）の後に以下の工程：
    ｄ）生物学的標的物質を、該試料中に存在する場合に該不活性化されたマイコバクテリアから単離し、
    ｅ）該生物学的標的物質を分析する；
    の１以上をさらに含む前記方法。
14. 請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物の、マイコバクテリアを含有することが疑われる痰試料を処理するための使用。