JP7305158B2

JP7305158B2 - 修飾ポリエチレンイミン及びその製造方法

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Publication number: JP7305158B2
Application number: JP2019090841A
Authority: JP
Inventors: 義雄古荘; 秀人小島; 智也寺島; 大貴相馬; 由希中江
Original assignee: Shiga University of Medical Science NUC
Current assignee: Shiga University of Medical Science NUC
Priority date: 2019-05-13
Filing date: 2019-05-13
Publication date: 2023-07-10
Anticipated expiration: 2039-05-13
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Description

特許法第３０条第２項適用（その１）２０１９年３月１日「日本化学会第９９春季年会（２０１９）Ｗｅｂ予稿集」にて公開（その２）２０１９年３月１日「日本化学会第９９春季年会（２０１９）講演予稿集（ＤＶＤ・ＵＳＢ）」にて公開（その３）２０１９年３月１１日「日本化学会第９９春季年会アプリ」にて公開（その４）２０１９年３月１７日甲南大学において開催された「日本化学会第９９春季年会（２０１９）」にて発表

本発明は、修飾ポリエチレンイミン、該修飾ポリエチレンイミンを含む薬物送達用キャリア及び複合体、並びに該複合体を含む医薬組成物に関する。さらに、本発明は、修飾ポリエチレンイミンの製造方法に関する。

核酸の細胞内への導入は、遺伝子治療のような医療応用だけではなく、分子細胞生物学の基礎研究にも必要な技術である。遺伝子の細胞内への導入方法としては、例えば、ウイルスベクターを利用したトランスフェクション方法や、非ウイルス性のトランスフェクション方法が知られている。

ウイルスベクターを利用したトランスフェクション方法は遺伝子導入効率は高いが、それらの使用は、免疫応答の誘発及びウイルス関連の病原性のために制限がある。

非ウイルス性のトランスフェクション方法は、ウイルスベクターを利用したトランスフェクション方法が有する問題がなく、例えば、カチオン性脂質及び／又はカチオン性ポリマーを使用する方法が知られている。

そして、ポリエチレンイミン(polyethyleneimine: PEI)はカチオン性ポリマーであり、DNAとの静電相互作用を通して、ポリプレックスを容易に形成することから、DNAキャリアとして利用されている。これまでに、PEIのキャリア機能を向上させるための様々な試みがなされてきたが、その中でもグアニジノ基が特に有効であることが報告されている。報告されているのは無置換グアニジノ基による修飾PEIがほとんどであり、置換グアニジノ基による修飾の例はほとんどない。

そのような置換グアニジノ基による修飾として、非特許文献１では、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)-グアニジニル-ポリエチレンイミンを合成したことが報告されている。

ポリエチレンイミンは25 kDaの高分子量である場合に、高いトランスフェクション効率を発揮するが、同時に細胞毒性も高くなる。反対に低分子量の場合には、PEIの毒性は無くなるが、トランスフェクション効率は低くなる(非特許文献２参照)。非特許文献１でも25 kDaの分子量のPEIが使用されている。

また、特許文献１では、PEIなどのカチオン性送達物質と、治療有効量の疎水性生理活性物質と、薬学的に許容される水性担体とを含む、疎水性生理活性物質を局所投与するための送達組成物が報告されている。しかしながら、特許文献１には、分子量25 kDa未満のPEIを使用することや、置換グアニジノ基により修飾することは記載されていない。

特表2015-535292号公報

Colloids and Sufaces B: Biointerfaces, 109, 197-203(2013) Biomacromolecules, 18, 2231-2246(2017)

本発明は、核酸の導入効率が高く且つ細胞毒性が低い修飾ポリエチレンイミン、該修飾ポリエチレンイミンを含む薬物送達用キャリア及び複合体、並びに該複合体を含む医薬組成物を提供することを目的とする。さらに、本発明は、生成物の精製を簡便に行うことができる修飾ポリエチレンイミンの製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ポリエチレンイミンをカルボジイミドと反応させて、置換グアニジノ基により修飾することで、細胞毒性が低い分子量が25,000 Da未満のポリエチレンイミンを使用したとしても高い導入効率で核酸導入することができるという知見を得た。また、無溶媒及び無触媒下でカルボジイミドとポリエチレンイミンとを反応させても、反応が進行し、高い収率でグアニジノ基により修飾されたポリエチレンイミンが得られることも見出した。当該反応は溶媒も触媒も必要としないので、生成物の精製を容易に行うことができる。

本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、次の修飾ポリエチレンイミン、該修飾ポリエチレンイミンを含む薬物送達用キャリア及び複合体、該複合体を含む医薬組成物、並びに修飾ポリエチレンイミンの製造方法を提供するものである。

項１．以下の基を有する修飾ポリエチレンイミン。

〔式中、R¹及びR²は、同一又は異なって、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、モノ若しくはジ置換アミノ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、又はヘテロアラルキルを示し、
該R¹及びR²を構成するアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールは、アルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、モノ若しくはジ置換アミノ、ニトロ、及びシアノから選択される少なくとも1種で置換されていてもよく、
ただし、該R¹及びR²が共に水素である場合を除き、R¹及びR²の一方がエチルであり他方がジメチルアミノプロピルである場合はポリエチレンイミンの分子量は25,000 Da未満である。〕
項２．前記ポリエチレンイミンが、分岐状ポリエチレンイミンである、項１に記載の修飾ポリエチレンイミン。
項３．前記ポリエチレンイミンの分子量が、25,000 Da未満である、項１又は２に記載の修飾ポリエチレンイミン。
項４．前記ポリエチレンイミンの分子量が、600～3,000 Daである、項１～３のいずれか一項に記載の修飾ポリエチレンイミン。
項５．更にペプチドが結合している、項１～４のいずれか一項に記載の修飾ポリエチレンイミン。
項６．項１～５のいずれか一項に記載の修飾ポリエチレンイミンを含む、薬物送達用キャリア。
項７．項１～５のいずれか一項に記載の修飾ポリエチレンイミン、及び薬物を含む複合体。
項８．項７に記載の複合体を含む医薬組成物。
項９．以下の基を有する修飾ポリエチレンイミンの製造方法であって、

〔式中、R³及びR⁴は、同一又は異なって、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、モノ若しくはジ置換アミノ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、又はヘテロアラルキルを示し、
該R³及びR⁴を構成するアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールは、アルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、モノ若しくはジ置換アミノ、ニトロ、及びシアノから選択される少なくとも1種で置換されていてもよい。〕工程１：無溶媒及び無触媒下で、一般式（１）で表されるカルボジイミドとポリエチレンイミンとを反応させて、前記修飾ポリエチレンイミンを製造する工程

〔式中、R³及びR⁴は前記と同じである。〕
を含む、方法。
項１０．前記ポリエチレンイミンが、分岐状ポリエチレンイミンである、項９に記載の製造方法。

本発明の修飾ポリエチレンイミンによれば、細胞毒性が低い低分子量のポリエチレンイミンであっても、高い導入効率で核酸導入することができる。また、核酸以外の薬物を送達するためのドラッグデリバリーシステム(DDS)としての応用も期待される。

さらに、本発明の修飾ポリエチレンイミンの製造方法によれば、溶媒も触媒も必要としないため、生成物である修飾ポリエチレンイミンの精製を簡便に行うことができる。

実施例１における¹H NMRによる解析結果を示す図である。実施例２における¹H NMRによる解析結果を示す図である。実施例３における¹H NMRによる解析結果を示す図である。実施例４における¹H NMRによる解析結果を示す図である。実施例５における¹H NMRによる解析結果を示す図である。参考例１におけるPEI₁₈₀₀とpDNAの混合溶液を電気泳動した結果を示す写真である。実施例６における2a₁₈₀₀とpDNAの混合溶液を電気泳動した結果を示す写真である。

以下、本発明について詳細に説明する。

なお、本明細書において「含む(comprise)」とは、「本質的にからなる(essentially consist of)」という意味と、「のみからなる(consist of)」という意味をも包含する。

また、本発明において、「核酸」、「ヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は同義であって、これらはDNA及びRNAの両方を含み、2本鎖であっても1本鎖であってもよい。

本発明における「細胞」としては、インビトロ培養細胞、生体から抽出した細胞、生体内に存在する細胞等が挙げられる。当該細胞は、接着細胞又は浮遊細胞のいずれであってもよい。

本明細書において、「核酸導入」は「トランスフェクション」と互換可能に使用される。

本発明の修飾ポリエチレンイミンは、以下の基を有することを特徴とする。

〔式中、R¹及びR²は、同一又は異なって、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、モノ若しくはジ置換アミノ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、又はヘテロアラルキルを示し、
該R¹及びR²を構成するアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールは、アルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、モノ若しくはジ置換アミノ、ニトロ、及びシアノから選択される少なくとも1種で置換されていてもよく、
ただし、該R¹及びR²が共に水素である場合を除き、R¹及びR²の一方がエチルであり他方がジメチルアミノプロピルである場合はポリエチレンイミンの分子量は25,000 Da未満である。〕

上記基は、ポリエチレンイミン中の窒素原子上に存在することが望ましい。また、上記基のポリエチレンイミン中の導入率は、特に制限されず、例えば0.1～100%、好ましくは1～75%である。ここで導入率は、ポリエチレンイミン中の窒素原子上に上記基が導入されている割合を意味する。

アルキルは、直鎖状又は分枝鎖状のいずれでもよく、好ましくは炭素数が1～6のアルキル、より好ましくは炭素数が1～3のアルキルである。アルキルとしては、例えば、メチル、エチル、n-プロビル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、ヘキシル等が挙げられる。ここでのアルキルには、アルコキシ、アラルキル及びヘテロアラルキルのアルキル部分も含まれる。

アルケニルは、直鎖状又は分枝鎖状のいずれでもよく、好ましくは炭素数が2～6のアルケニル、より好ましくは炭素数が2～3のアルケニルである。

アルキニルは、直鎖状又は分枝鎖状のいずれでもよく、好ましくは炭素数が2～6のアルキニル、より好ましくは炭素数が2～3のアルキニルである。

ハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素が挙げられる。

シクロアルキル基は、好ましくは炭素数が3～8のシクロアルキルであり、より好ましくは炭素数が5又は6のシクロアルキルである。シクロアルキルとしては、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル等が挙げられる。

アリールは、5又は6員の芳香族炭化水素環からなる単環又は多環系の基を意味し、具体例としては、フェニル、ナフチル、フルオレニル、アントリル、ビフェニリル等が挙げられる。ここでのアリールには、アラルキルのアリール部分も含まれる。

ヘテロアリールは、N、O及びSから選択される1～3個のヘテロ原子を含む、5又は6員の芳香環からなる単環又は多環系の基を意味し、多環系の場合には少なくとも１つの環が芳香環であればよい。ここでのヘテロアリールには、ヘテロアラルキルのヘテロアリール部分も含まれる。

モノ若しくはジ置換アミノにおけるモノ置換とは、アミノ基の窒素原子に結合する水素原子の1個がアルキルで置換されていることを意味し、ジ置換とは、アミノ基の窒素原子に結合する水素原子の2個が同一又は異なるアルキルで置換されていることを意味する。

アラルキルとはアリールアルキルを意味し、ヘテロアラルキルとはヘテロアリールアルキルを意味する。

R¹及びR²を構成するアルキル、アルケニル、又はアルキニルは、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、モノ若しくはジ置換アミノ、ニトロ、及びシアノから選択される少なくとも1種で置換されていてもよい。このような置換基を有する場合の置換基の数は特に制限されず、例えば1～4個である。

R¹及びR²を構成するシクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールは、アルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、モノ若しくはジ置換アミノ、ニトロ、及びシアノから選択される少なくとも1種で置換されていてもよい。このような置換基を有する場合の置換基の数は特に制限されず、例えば1～4個である。

R¹及びR²の一方がエチルであり他方がジメチルアミノプロピルである場合、ポリエチレンイミンの分子量は25,000 Da未満、好ましくは10,000 Da以下、より好ましくは5,000 Da以下である。

PEIは、直鎖状PEI又は分岐状PEIのいずれでもよく、好ましくは分岐状PEIである。このような分岐状PEIとしては、例えば、第一級アミン、第二級アミン及び第三級アミンを含むものが挙げられる。

PEIの分子量(molecular mass)は、特に制限されず、好ましくは25,000 Da未満、より好ましくは600～10,000 Da、更に好ましくは600～3,000 Daである。このような分子量の範囲のPEIを使用することにより細胞毒性を低減させることができる。ここでの分子量は、数平均分子量である。PEIは市販されているので、各種市販品を使用することが可能である。

本発明の修飾ポリエチレンイミンには、更にペプチドが結合していてもよい。このようなペプチドとしては、例えば、特定の細胞(例えば、がん細胞)に選択的に結合するペプチド(標的化ペプチド)が挙げられる。このような標的化ペプチドを使用することにより、目的とする細胞に選択的に薬物を送達させることが可能となる。ペプチドのアミノ酸残基数は、特に制限されず、好ましくは3～20残基、より好ましくは5～10残基である。ペプチドの結合位置としては、R¹、R²、ポリエチレンイミン中の窒素原子などが挙げられる。また、ペプチドは、修飾ポリエチレンイミンに直接結合していてもよく、又はリンカーを介して修飾ポリエチレンイミンに結合していてもよい。

本発明の修飾ポリエチレンイミンは、細胞毒性が低い低分子量のポリエチレンイミンを使用したとしても、高い導入効率で核酸導入することができるので、核酸の導入効率が高い上に、細胞毒性が低いという特性を有している。本発明の修飾ポリエチレンイミンにおいてグアニジノ基に置換基を導入することで、修飾ポリエチレンイミンの脂溶性やカチオン性(ゼータ電位)を制御することが可能であるので、ベクターとしての性能を調整することができる。実施例で示されているように、本発明の修飾ポリエチレンイミンは、ポリエチレンイミンの分子量が25,000未満の場合であってもゼータ電位が高くなっていることから、高い細胞膜の透過性を有すること、すなわち高い核酸導入効率を発揮することが推測される。

本発明の薬物送達用キャリアは、上記修飾ポリエチレンイミンを含むことを特徴とする。

本発明において「薬物送達用キャリア」とは、薬物を細胞中に送達するためのキャリアを意味する。

本発明の修飾ポリエチレンイミンは、細胞への核酸の導入効率が高いため、核酸を細胞中に送達するためのキャリアとして利用することが可能である。例えば、本発明の修飾ポリエチレンイミンを使用して核酸とポリプレックスを形成させることにより、核酸を細胞内に移行させることが可能である。また、本発明の修飾ポリエチレンイミンは、核酸以外の薬物に関しても複合体を形成させることにより、そのような薬物を送達するためのドラッグデリバリーシステムとして利用することができる。

本発明の複合体は、上記修飾ポリエチレンイミン、及び薬物を含むことを特徴とする。

本発明の修飾ポリエチレンイミンは高い導入効率で細胞へ核酸を導入できることから、本発明の修飾ポリエチレンイミンを用いて核酸との複合体(ポリプレックス)を形成させることにより、核酸を効率的に細胞内に移行させることができる。また、核酸以外の薬物に関しても、本発明の修飾ポリエチレンイミンとの複合体を形成させることにより、得られた複合体は、そのような薬物を送達するためのドラッグデリバリーシステム(DDS)として利用することができる。

薬物としては、例えば、核酸、ペプチド、タンパク質(抗体、抗体断片、アンタゴニスト、アゴニストなどのタンパク質系薬剤など)、脂質、ペプチド脂質、糖、低分子化合物、その他の合成又は天然化合物などが挙げられる。中でも好ましくは核酸である。このような薬物は、1種単独又は2種以上を組み合わせて使用することができる。

核酸としては、プラスミドDNA、cDNA、アンチセンスDNAなどのDNA、siRNA、shRNA、miRNA、アンチセンスRNA、mRNA、tRNA、rRNAなどのRNAが挙げられる。核酸の大きさとしては、本発明の修飾ポリエチレンイミンを利用することで細胞へ導入することが可能な大きさである限り特に制限されない。

核酸は、cDNAライブラリーを鋳型としたPCR法、化学合成、生化学的切断／再結合などの常法で作製することができる。

本発明の複合体における修飾ポリエチレンイミンと核酸の配合比は、修飾ポリエチレンイミンのアミノ基と核酸のリン酸基とのモル比で、一般的には1 : 0.01～1 : 100、好ましくは1 : 0.1～1 : 50、より好ましくは1 : 1～1 : 10である。

本発明の複合体は、核酸とポリエチレンイミンとのポリプレックスを形成させる公知の方法を使用することで作製することができる。

本発明の複合体を利用した細胞への核酸導入方法は、当該複合体と細胞とを接触させることにより実施することができる。このような接触は、細胞を含む溶液(培地)に本発明の複合体を添加することにより行うことができる。本発明の複合体と細胞とを接触をさせる時間及び温度は、特に限定されず、効率的に核酸導入できる範囲から適宜設定できる。

本発明の医薬組成物は、上記の複合体を含むことを特徴とする。

医薬組成物として調製する場合、上記の複合体をそのまま使用するか、又は医薬品において許容される無毒性の担体、希釈剤若しくは賦形剤とともに、タブレット(素錠、糖衣錠、発泡錠、フィルムコート錠、チュアブル錠、トローチ剤などを含む)、カプセル剤、丸剤、粉末剤(散剤)、顆粒剤、細粒剤、液剤、懸濁液、乳濁液、ペースト、シロップ、注射剤(使用時に、蒸留水又はアミノ酸輸液や電解質輸液等の輸液に配合して液剤として調製する場合を含む)などの形態に調製して、医薬用の製剤にすることができる。

本発明の医薬組成物における上記の複合体の含量は、医薬組成物全量中0.001～100質量%、好ましくは0.01～99質量%、より好ましくは0.1～99質量%の範囲から適宜選択することができる。

本発明の医薬組成物の投与方法は特に限定されず、例えば、動脈内投与、静脈内投与、口腔内投与、直腸投与、経腸投与、経皮投与、経口投与などにより行うことができる。

本発明の医薬組成物は、ヒトを含む哺乳動物に対して投与される。

本発明の医薬組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、症状などの種々の条件に応じて適宜決定することができる。

本発明の修飾ポリエチレンイミンは高い導入効率で細胞へ薬物を導入できることから、疾患の治療に有効な薬物を効率的に細胞内に移行させることで、疾患の治療及び／又は予防効果が得られることが期待される。

本発明の以下の基を有する修飾ポリエチレンイミンの製造方法は、以下の工程を含むことを特徴とする。

〔式中、R³及びR⁴は、同一又は異なって、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、モノ若しくはジ置換アミノ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、又はヘテロアラルキルを示し、
該R³及びR⁴を構成するアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールは、アルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、シアノ、アミノ、モノ若しくはジ置換アミノ、ニトロ、及びシアノから選択される少なくとも1種で置換されていてもよい。〕
工程１：無溶媒及び無触媒下で、一般式（１）で表されるカルボジイミドとポリエチレンイミンとを反応させて、前記修飾ポリエチレンイミンを製造する工程

〔式中、R³及びR⁴は前記と同じである。〕

ここでの修飾ポリエチレンイミンに関する置換基、ポリエチレンイミンなどについては前述の通りである。

一般式（１）で表されるカルボジイミドとしては、特に限定されず、例えば、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド、ジメチルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、ジイソブチルカルボジイミド、ジオクチルカルボジイミド、t-ブチルイソプロピルカルボジイミド、ビス(2,6-ジイソプロピルフェニル)カルボジイミド、ジフェニルカルボジイミド、ジ-t-ブチルカルボジイミド、ジ-β-ナフチルカルボジイミド等が挙げられる。

一般式（１）で表されるカルボジイミドの使用量は、ポリエチレンイミンのアミノ基1モルに対して好ましくは0.001～1モル、より好ましくは0.01～0.75モルである。このように原料比を変更することで、上記基の導入率を調整することができる。

上記反応の温度条件は、通常0～200℃程度、好ましくは25～60℃程度であり、反応時間は通常1分～48時間程度、好ましくは1～6時間程度である。

上記反応は、減圧下、常圧下、又は加圧下で行うことができる。

上記反応により得られた反応生成物は、結晶化、再結晶、濃縮、減圧濃縮、溶媒抽出、クロマトグラフィー、蒸留、分留、転溶等の公知の手法により、単離及び精製することができる。

本発明の修飾ポリエチレンイミンの製造方法は、無溶媒及び無触媒下での反応であり、すなわち、溶媒も触媒も必要としないため、反応生成物である修飾ポリエチレンイミンの精製を簡便に行うことができる。

以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。しかし、本発明はこれら実施例等になんら限定されるものではない。

以下の実施例では、数平均分子量600、1800のポリエチレンイミン(PEI、富士フィルム和光純薬株式会社製)及び重量平均分子量25,000のPEI (Sigma-Aldrich製)(以下では、それぞれPEI₆₀₀、PEI₁₈₀₀、PEI₂₅₀₀₀として表記する)を用いた。

以下に実施例１～５における反応を示す。

実施例１：N,N'-ジイソプロピルグアニジノ基で修飾されたポリエチレンイミン(2a ₁₈₀₀ )の合成
PEI₁₈₀₀ 50.5 mg (1.17 mmol、PEIのアミノ基のモル数を示す。以下同様)にN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド1a (38 mg, 0.29 mmol)を加え、40℃で1時間加熱した。反応終了後、クロロホルム1.0 mLを加え、反応混合物を溶解させ、ゲル濾過クロマトグラフィー(BIO-RAD製：Bio-Beads S-X Beads、溶離液：クロロホルム)を用いて精製した。減圧濃縮にて溶媒を除去し、40℃で2時間減圧乾燥することで2a₁₈₀₀を得た。¹H NMR (重溶媒: 重クロロホルム)による解析から、グアニジノ基の導入率(r)は17%、PEI₁₈₀₀を基にした収率は100%であることがわかった(図１)。

実施例２：N,N'-ジシクロヘキシルグアニジノ基で修飾されたポリエチレンイミン(2b ₁₈₀₀ )の合成
PEI₁₈₀₀ 51.4 mg (1.19 mmol)にN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド1b (121 mg, 0.586 mmol)を加え、40℃で1時間加熱した。反応終了後、クロロホルム1 mLを加え、反応混合物を溶解させ、ゲル濾過クロマトグラフィー(BIO-RAD製：Bio-Beads S-X Beads、溶離液：クロロホルム)を用いて精製した。減圧濃縮にて溶媒を除去し、40℃で2時間減圧乾燥することで2b₁₈₀₀を得た。¹H NMR (重溶媒: 重クロロホルム)による解析から、グアニジノ基の導入率(r)は11%、PEI₁₈₀₀を基にした収率は96%であることがわかった(図２)。

実施例３：1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルグアニジノ基で修飾されたポリエチレンイミン(2c ₁₈₀₀ )の合成
PEI₁₈₀₀ 51.6 mg (1.19 mmol)に1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド1c (92.2 mg, 0.593 mmol)を加え、40℃で1時間加熱した。反応終了後、クロロホルム1 mLを加え、反応混合物を溶解させ、ゲル濾過クロマトグラフィー(BIO-RAD製：Bio-Beads S-X Beads、溶離液：クロロホルム)を用いて精製した。減圧濃縮にて溶媒を除去し、40℃で2時間減圧乾燥することで2c₁₈₀₀を得た。¹H NMR (重溶媒: 重クロロホルム)による解析から、グアニジノ基の導入率(r)は50%、PEI₁₈₀₀を基にした収率は97%であることがわかった(図３)。

実施例４：N,N'-ジイソプロピルグアニジノ基で修飾されたポリエチレンイミン(2a ₆₀₀ )の合成
PEI₆₀₀ 50.8 mg (1.18 mmol)にN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド1a (76.1 mg, 0.59 mmol)を加え、40℃で1時間加熱した。反応終了後、クロロホルム1.0 mLを加え、反応混合物を溶解させ、ゲル濾過クロマトグラフィー(BIO-RAD製: Bio-Beads S-X Beads、溶離液: クロロホルム)を用いて精製した。減圧濃縮にて溶媒を除去し、40℃で2時間減圧乾燥することで2a₆₀₀を得た。¹H NMR (重溶媒: 重クロロホルム)による解析から、グアニジノ基の導入率(r)は33%、PEI₆₀₀を基にした収率は100%であることがわかった(図４)。

実施例５：N,N'-ジイソプロピルグアニジノ基により修飾されたポリエチレンイミン(2a ₂₅₀₀₀ )の合成
PEI₂₅₀₀₀ 50.4 mg (1.17 mmol)にN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド1a (75.4 mg, 0.58 mmol)を加え、40℃で1時間加熱した。反応終了後、クロロホルム1.0 mLを加え、反応混合物を溶解させ、ゲル濾過クロマトグラフィー(BIO-RAD製: Bio-Beads S-X Beads、溶離液: クロロホルム)を用いて精製した。減圧濃縮にて溶媒を除去し、40℃で2時間減圧乾燥することで2a₂₅₀₀₀を得た。¹H NMR (重溶媒: 重クロロホルム)による解析から、グアニジノ基の導入率(r)は11%、PEI₂₅₀₀₀を基にした収率は93%であることがわかった(図５)。

参考例１：PEI ₁₈₀₀ /pDNA複合体(ポリプレックス)の作製とそれらのゲル電気泳動法による確認
リン酸緩衝液(0.1 mol/L, pH 7.4、ナカライテスク株式会社製)中で、プラスミドDNA (以下、pDNAと略記する)とPEI₁₈₀₀を混合し、室温で30分静置した。このとき、PEI₁₈₀₀のリン酸緩衝液(0.033 mg/mL)とpDNAの蒸留水溶液(0.5 mg/mL)を、それぞれストック溶液として使用して、PEI₁₈₀₀のアミノ基とpDNAのリン酸基とのモル比(以下、N/Pと略記)が、1:0.25、1:0.5、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:9.5になるように、それぞれ混合溶液を調製した。このようにして作製したPEI₁₈₀₀とpDNAの混合溶液10μLにローディングバッファー2μL (東洋紡株式会社製)を混合し、1%アガロースゲルにのせて、電気泳動を行った。この結果、図６に示すように、PEI₁₈₀₀はN/P比が5で、pDNAと完全にポリプレックスを形成することがわかった。

実施例６：2a ₁₈₀₀ /pDNA複合体(ポリプレックス)の作製とそれらのゲル電気泳動法による確認
リン酸緩衝液(0.1 mol/L, pH 7.4、ナカライテスク株式会社製)中で、pDNAと2a₁₈₀₀を混合し、室温で30分静置した。このとき、2a₁₈₀₀のリン酸緩衝液(0.033 mg/mL)とpDNAの蒸留水溶液(0.5 mg/mL)を、それぞれストック溶液として使用して、2a₁₈₀₀のアミノ基とpDNAのリン酸基とのモル比が、1:0.25、1:0.5、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:9.5になるように、それぞれ混合溶液を調製した。このようにして作製した2a₁₈₀₀とpDNAの混合溶液10μLにローディングバッファー2μL (東洋紡株式会社製)を混合し、1%アガロースゲルにのせて、電気泳動を行った。この結果、図７に示すように、2a₁₈₀₀はN/P比が5で、pDNAと完全にポリプレックスを形成することがわかった。

実施例７：ゼータ電位の測定
ゼータ電位測定液の調製は、実施例１～３で調製した測定サンプル5 mgにMilli-Q水(5 mL、メルクミリポア製、製品名:Milli-Q Integral MT5)を加え、室温で溶解させることにより行った。この測定液約1 mLをゼータ電位用ディスポーザブルセル(Malvern Panalytical製、型番:DTS1070)に入れて、ゼータ電位測定(Malvern Panalytical製、製品名:ZEN 3600、温度:25℃、繰り返し測定回数:3回)を行った(表１)。

この結果、ポリエチレンイミンをグアニジノ基で修飾することによってゼータ電位が大幅に上昇することがわかった。また、グアニジノ基上の置換基の構造によって、ある程度ゼータ電位が変化することもわかった。このことは、細胞膜の透過性、すなわち核酸導入効率をグアニジノ基上の置換基の構造を変えることで調節できる可能性を示唆している。

Claims

以下の基を有し、更にペプチドが結合している修飾ポリエチレンイミン。

〔式中、R¹及びR²は、同一又は異なって、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、モノ若しくはジ置換アミノ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、又はヘテロアラルキルを示し、
該R¹及びR²を構成するアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールは、アルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、モノ若しくはジ置換アミノ、ニトロ、及びシアノから選択される少なくとも1種で置換されていてもよく、ただし、該R¹及びR²が共に水素である場合を除き、R¹及びR²の一方がエチルであり他方がジメチルアミノプロピルである場合はポリエチレンイミンの重量平均分子量は25,000 Da未満である。〕
前記ポリエチレンイミンが、分岐状ポリエチレンイミンである、請求項１に記載の修飾ポリエチレンイミン。
修飾前のポリエチレンイミンの数平均分子量が、25,000 Da未満である、請求項１又は２に記載の修飾ポリエチレンイミン。
修飾前のポリエチレンイミンの数平均分子量が、600～3,000 Daである、請求項１～３のいずれか一項に記載の修飾ポリエチレンイミン。
以下の基を有する修飾ポリエチレンイミンを含む、薬物送達用キャリア。

〔式中、R ¹ 及びR ² は、同一又は異なって、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、モノ若しくはジ置換アミノ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、又はヘテロアラルキルを示し、
該R ¹ 及びR ² を構成するアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールは、アルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、モノ若しくはジ置換アミノ、ニトロ、及びシアノから選択される少なくとも1種で置換されていてもよく、ただし、該R ¹ 及びR ² が共に水素である場合を除き、R ¹ 及びR ² の一方がエチルであり他方がジメチルアミノプロピルである場合はポリエチレンイミンの重量平均分子量は25,000 Da未満である。〕
以下の基を有する修飾ポリエチレンイミン、及び薬物を含む複合体。

〔式中、R ¹ 及びR ² は、同一又は異なって、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、モノ若しくはジ置換アミノ、ニトロ、シアノ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、又はヘテロアラルキルを示し、
該R ¹ 及びR ² を構成するアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールは、アルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、モノ若しくはジ置換アミノ、ニトロ、及びシアノから選択される少なくとも1種で置換されていてもよく、ただし、該R ¹ 及びR ² が共に水素である場合を除き、R ¹ 及びR ² の一方がエチルであり他方がジメチルアミノプロピルである場合はポリエチレンイミンの重量平均分子量は25,000 Da未満である。〕
請求項６に記載の複合体を含む医薬組成物。