JP7284713B2 - 形質細胞関連疾患のためのアッセイ - Google Patents
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Description
トリス(ジメチルアミノ)ホスフィン(CAS番号1608-26-0)
トリス(ジエチルアミノ)ホスフィン(CAS番号2283-11-6)
トリメチルホスファイト(CAS番号121-45-9)
トリブチルホスフィン(CAS番号998-40-3)
が挙げられる。
参考資料:
参照により本明細書に援用される、
Bernardes et al. (2008) Angew. Chem. Int. Ed., vol 47, 2244-2247。
クロスリンクはまた、遊離チオールと反応して抗体分子の鎖にクロスリンクするマレイミドクロスリンカーなどのクロスリンカーを含んでいてもよい。これは、国際公開第WO00/44788号パンフレットに記載される通り、チオール基の一方の側と、追加的にリシンカルボキシル基などのもう一方の部分と、で結合するように作製することができる。
これは、炭化水素又は他のリンカーによりつなげられた2つのマレイミド基を含有する充分に特徴づけられたクラスのクロスリンカーである。該マレイミド基は、ジスルフィドの還元により露出した遊離スルフヒドリル基と自然に反応して、各スルフヒドリルで非還元性チオエーテル結合を形成し、それにより2つの残留するシステインを共有結合でクロスリンクする。
ビス(マレイミド)エタン(CAS番号5132-30-9)
1,4-ビス(マレイミド)ブタン(CAS番号28537-70-4)
が挙げられる。
参照により本明細書に援用される、
Auclair et al. (2010) Strategies for stabilizing superoxide dismutase (SODl), the protein destabilized in the most common form of familial amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A, vol 107(50) - pages 21394-9
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ジブロモ-m-キシレン(CAS番号626-15-3)は、ハロゲン化ジアルキルクラスの化合物のメンバーであり、遊離スルフヒドリル基と反応するホモ二官能性クロスリンカーとして作用する。
参照により本明細書に援用される、
Jo et al. (2012) Development of a-Helical Calpain Probes by Mimicking a Natural Protein-Protein Interaction J Am Chem Soc, col 134(42) - pages 17704-13。
遊離スルフヒドリルと反応して非還元性の共有結合でクロスリンクされた生成物をもたらすことが知られている試薬には少なくとも6つのクラスが存在する。スルフヒドリル基へのこれらの化合物の特異的反応性は様々であり、幾つかは、特定条件下で水、アミン及びカルボキシル基と反応するであろう。加えて、これらの化合物の多くは、嵩高のリンカー基を有し、制限された空間的環境でクロスリンクする能力を限定してもよい。以下の列挙は、各クラスからの2、3例を与えているが、より包括的列挙及び参考資料は、
ビス(マレイミド)ヘキサン;N-N’-メチレンビスマレイミド;ビス(N-マレイミドメチル)エーテル;N,N’-(1,3-フェニレン)-ビスマレイミド;ビス(N-マレイミド)-4,4’-ビベンジル;ナフタレン-1,5-ジマレイミド
1,3-ジブロモアセトン;N,N’-ビス(ヨードアセチル)ポリメチレンジアミン;Ν,Ν’-ジ(ブロモアセチル)フェニルヒドラジン;1,2-ジ(ブロモアセチル)アミノ-3-フェニルヒドラジン;γ-(2,4-ジニトロフェニル)-α-ブロモアセチル-L-ジアミノ酪酸ブロモアセチル-ヒドラジド
α,α’-ジブロモ-p-キシレンスルホン酸;α,α’-ジヨード-p-キシレンスルホン酸;ジ(2-クロロエチル)スルフィド;トリ(2-クロロエチル)アミン;N,N-ビス(p-ブロモエチル)ベンジルアミン
ジクロロ-6-メトキシ-s-トリアジン;2,4,6-トリクロロ-s-トリアジン(シアヌル酸);2,4-ジクロロ-6-(3’-メチル-4-アミノアニリノ)-s-トリアジン;2,4-ジクロロ-6-アミノ-s-トリアジン
2,4,6-トリ(エチレンイミド)-s-トリアジン;N,N’-エチレンイミノイル-1,6-ジアミノヘキサン;トリ[1-(2-メチルアジリデニル)]-ホスフィン オキシド
1,2:3,4-ジエポキシブタン;1,2:5,6-ジエポキシヘキサン;ビス(2,-エポキシプロピル)エーテル;1,4-ブタジオールジグリシドキシエーテル
該クロスリンクは、1つ又は複数の天然由来ジスルフィド結合を置き換えてもよく、或いはジスルフィド結合に加えて生成されてもよい。
(a)カルボジイミド活性化:N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N’-エチルカルボジイミドHCl(EDC;CAS Nr 25952-53-8
(b)カルボジイミド活性化:N-ヒドロキシスルホスクシンイミド(sNHS;CAS Nr 106627-54-7)で安定化されたEDC
(c)4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウム(DMTMM;CAS Nr 3945-69-5)
・上記のもののいずれかで活性化されたら、カルボキシラートが第一級アミン(リシン、N-末端)と反応して、アミド共有結合を形成するであろう。
・注:幾つかの条件下では、EDC/sNHS活性化は、活性化カルボキシル基(アスパラギン酸、グルタミン酸、C-末端の)とヒドロキシル基(即ち、セリン、トレオニン及びチロシン)の間のエステル共有結合を形成させ得る。
(a)カルボキシルをEDC、EDC/sNHS又はDMTMMで活性化し、その後、アミン誘導体化ポリエチレングリコール、例えばアミン-PEGn-アミン(ここでn=PEG単位の反復数)でクロスリンクする
(b)カルボキシルをDMTMMで活性化し、ホモ二官能性ヒドラジド、例えば、アジピン酸二塩酸塩(ADH;CAS Nr 1071-93-8)でクロスリンクする
ジスルフィドが存在する場合、還元剤、例えばトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP;CAS Nr 51805-45-9)で-SHに還元する。カルボキシルをカルボジイミド(EDC)で活性化して、
(a)3-(4-(4-(アミノメチル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)フェニル)プロピオロニトリル塩酸塩(APN;CAS Nr 1643841-88-6)
(b)アミン-(PEG)n-マレイミド(ここでn=PEG単位の反復数)(MAL-PEG-NH2)
でクロスリンクする。
(a)PEG化ビス(スルホスクシンイミジル)スベラート)、例えばBS(PEG)5(ここで5=PEG単位の反復数)
(b)ジメチルピメルイミダート(DMP;CAS Nr 58537-94-3)
(c)p-フェニレンジイソチオシアナート(PDITC;CAS Nr 4044-65-9)
(d)スベリン酸ビス(N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)(DSS;CAS Nr 68528-80-3)
(e)エチレングリコールビス(スルホスクシンイミジルスクシナート)(スルホ-EGS;CAS Nr 167410-92-6)
(a)マレイミド-PEG8-スクシンイミジルエステル(CAS Nr 756525-93-6)
(b)4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(SMCC;CAS Nr 64987-85-5)
(c)3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(SPDP;CAS Nr 68181-17-9)
(d)3-(4-ホルミルフェニル)プロピオロニトリル(APN-CHO)
(e)ヨード酢酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(IAA-NHS;CAS Nr 39028-27-8)
(a)4-(マレインイミド)フェニルイソシアナート(PMPI;CAS Nr 123457-83-0)
(a)p-アジドフェニルグリオキサール(APG;CAS Nr 1196151-49-1)
・アルギニンと、そしてより少ない程度にシスチン(ジスルフィド結合)及びヒスチジンと反応させる。光活性化により、二重結合、C-H及びN-Hで、又は環拡大機序を介して第一級アミンで、付加反応を開始する。
(b)1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル(BDDE;CAS Nr 2425-79-8)
・ヒドロキシル、アミン及びスルフヒドリル基と反応させる
(c)4-(4-ジアゾニオフェニル)ベンゼンジアゾニウム(CAS Nr 5957-03-9
・チロシン及びヒスチジンと反応させる
(d)ベンゾフェノン-4-ヨードアセトアミド(CAS Nr 76809-63-7)
・スルフヒドリルと反応させて、光活性化により、活性C-H及びN-H結合と反応させて、共有結合を形成させる
(e)スクシンイミジル 2-[(4,4’-アジペンタンアミド)エチル]-1,3’-ジチオプロピオナート)(SDAD;CAS Nr 1253202-38-8
・NHSエステル基は、第一級アミンと反応し;ジアジリン基は、光活性化により任意のアミノ酸側鎖又はペプチド骨格と効率的に反応する
血清血漿(Serum plasma)電気泳動又は免疫固定電気泳動を実施して、該病気をさらに特徴づけてもよい。
図14~15のヒト血清試料(図11~13(A~C)の3例のIPE陽性MGUS、及び2例の健常対照)を、PBS-T緩衝液(25mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、0.1%Tween20、pH7.0)で希釈して、抗体コーティング磁気ビーズと共にインキュベートして再懸濁させ、逐次PBS-Tで3回、そして脱イオン水で2回洗浄した。ビーズを酸性緩衝液により室温で15分間溶出した。溶離液の1つをマトリックス(a-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸、10mg/gl)と混合し、その後、Mosquito HTSスポッター(TTP)を用いて磨いたスチールMALDI標的プレートにスポットして、Bruker Biotyper MALDI-TOF質量分析計(Microflex LT/SH Smart)で分析した。マススペクトルを、一価(+1、m/z 22~25kDa)及び二価(=2、m/z 10~14kDa)イオンを含む10,000~30,000のm/z範囲に及ぶ陽イオンモードで獲得した。データをBruker Flex解析ソフトウエアで解析した。
Claims (10)
- 形質細胞関連疾患を同定又はモニタリングするため、対象の試料を分析するインビトロの方法であって、対象の試料から、免疫グロブリン遊離軽鎖(FLC)を、抗FLC特異性抗体又はその断片で精製すること、及び前記精製された試料を質量分析技術に供して、前記試料中の1種又は複数の単クローン性FLCに対応する1つ又は複数のピークの存在を同定すること、を含み、前記試料中の1種又は複数の単クローン性FLCに対応する1つ又は複数のピークは、バックグランドの正常なFLC生成と比較され、前記抗FLC特異性抗体が、抗カッパFLC特異性抗体又はその断片と、抗ラムダFLC特異性抗体又はその断片との混合物である、方法。
- 前記抗FLC特異性抗体又はその断片が、ポリクローナルである、請求項1に記載の方法。
- 前記抗体の断片が、F(ab’)2断片である、請求項1又は2のいずれかに記載の方法。
- 前記抗FLC特異性抗体又は断片が、前記抗体又はその断片の少なくとも1つの重鎖(又はその断片)と少なくとも1つの軽鎖(又はその断片)の間に1つ又は複数の非ジスルフィドクロスリンクを含む、請求項1~3の何れか一項に記載の方法。
- 前記質量分析技術が、オービトラップ型質量分析計、イオン捕捉型質量分析計、飛行時間型質量分析計、トリプル四重極質量分析計、又は四重極質量分析計である、請求項1~4の何れか一項に記載の方法。
- 前記質量分析技術が、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法-飛行時間型質量分析法(MALDI-TOF)である、請求項5に記載の方法。
- 総カッパ及び総ラムダ軽鎖を抗総カッパ及び抗総ラムダ抗体又はその断片で精製すること、及び前記精製された試料を質量分析法に供して、1つ又は複数の単クローン性免疫グロブリンに対応する1つ又は複数のピークを同定すること、をさらに含む、請求項1~6の何れか一項に記載の方法。
- 前記総ラムダ及び総カッパ軽鎖が、抗総カッパ抗体と抗総ラムダ抗体との混合物を用いて共精製される、請求項7に記載の方法。
- 前記形質細胞関連疾患が、インタクト免疫グロブリン、多発性骨髄腫、軽鎖多発性骨髄腫、非分泌性多発性骨髄腫、ALアミロイドーシス、軽鎖沈着症(LCDD)、くすぶり型多発性骨髄腫、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症(MGUS)、マクログロブリン血症、POEMS(多発神経障害、臓器腫大、内分泌疾患、単クローン性ガンマグロブリン血症及び皮膚変化)症候群及びLCDDから選択される、請求項1~8の何れか一項に記載の方法。
- 前記試料が、涙液、血漿、血清、唾液、尿、血液又は脳脊髄液である、請求項1~9の何れか一項に記載の方法。
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