JP7269648B2 - セレノシステインを含む組換えポリペプチド及びその製造方法 - Google Patents
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Description
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される:
(項目1)
精製組換えポリペプチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドは、前記ポリペプチドの野生型には存在しない選択位置に少なくとも1つのセレノシステイン残基を含み、前記組成物中における前記組換えポリペプチドの少なくとも80%は、前記選択位置に前記セレノシステイン残基を含む、前記組成物。
(項目2)
前記組成物中における前記組換えポリペプチドの80%~99.9%は、前記選択位置に前記セレノシステイン残基を含む、項目1に記載の組成物。
(項目3)
前記組成物中における前記組換えポリペプチドの90%~99%は、前記選択位置に前記セレノシステイン残基を含む、項目1に記載の組成物。
(項目4)
前記組成物中における前記組換えポリペプチドの少なくとも95%は、前記選択位置に前記セレノシステイン残基を含む、項目1に記載の組成物。
(項目5)
前記組成物中における前記組換えポリペプチドの少なくとも99%は、前記選択位置に前記セレノシステイン残基を含む、項目1に記載の組成物。
(項目6)
前記組換えポリペプチドは、ヒトポリペプチドに対して少なくとも90%同一である、項目1から項目5のいずれか1項に記載の組成物。
(項目7)
前記ヒトポリペプチドは疾患に関与するポリペプチドである、項目6に記載の組成物。
(項目8)
前記組換えポリペプチドは抗体または酵素を含む、項目1から項目5のいずれか1項に記載の組成物。
(項目9)
前記ポリペプチドは選択位置に少なくとも2つのセレノシステイン残基を含む、項目1から項目5のいずれか1項に記載の組成物。
(項目10)
前記選択位置の前記2つのセレノシステイン残基はジセレニド結合を形成する、項目9に記載の組成物。
(項目11)
前記ポリペプチドは酵素または抗体を含む、項目10に記載の組成物。
(項目12)
前記抗体はアグリコシル化抗体である、項目11に記載の組成物。
(項目13)
少なくとも50μgの前記精製組換えポリペプチドを含む、項目1から項目5のいずれか1項に記載の組成物。
(項目14)
精製組換えポリペプチドは97%~99.9%の純度である、項目1から項目5のいずれか1項に記載の組成物。
(項目15)
前記ポリペプチドは、選択位置に2、3、4、5、6、7、8、9または10のセレノシステイン残基を含む、項目1から項目11のいずれか1項に記載の組成物。
(項目16)
項目1から項目11のいずれか1項に記載の組成物を含む医薬組成物。
(項目17)
項目16に記載の有効量の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、対象を治療するための方法。
(項目18)
(a)配列番号:1であり、配列番号:1の344位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
(b)配列番号:2であり、配列番号:2の702位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
(c)配列番号:3であり、配列番号:3の655位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
(d)配列番号:4であり、配列番号:4の73位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
(e)配列番号:5であり、配列番号:5の781位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
(f)配列番号:6であり、配列番号:6の136位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
(g)配列番号:7であり、配列番号:7の183位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
(h)配列番号:8であり、配列番号:8の1位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
(i)配列番号:9であり、配列番号:9の102位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
(j)配列番号:10であり、配列番号:10の105位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
(k)配列番号:11であり、配列番号:11の673位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
(l)配列番号:12であり、配列番号:12の69位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
(m)配列番号:13であり、配列番号:13の107位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
(n)配列番号:17であり、配列番号:17の246位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
(o)配列番号:18であり、配列番号:18の545位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、及び/または、
(p)配列番号:19であり、配列番号:19の124位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子。
(項目19)
(a)配列番号:1であり、配列番号:1の344位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
(b)配列番号:2であり、配列番号:2の702位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
(c)配列番号:3であり、配列番号:3の655位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
(d)配列番号:4であり、配列番号:4の73位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
(e)配列番号:5であり、配列番号:5の781位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
(f)配列番号:6であり、配列番号:6の136位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
(g)配列番号:7であり、配列番号:7の183位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
(h)配列番号:8であり、配列番号:8の1位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
(i)配列番号:9であり、配列番号:9の102位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
(j)配列番号:10であり、配列番号:10の105位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
(k)配列番号:11であり、配列番号:11の673位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
(l)配列番号:12であり、配列番号:12の69位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
(m)配列番号:13であり、配列番号:13の107位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
(n)配列番号:17であり、配列番号:17の246位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
(o)配列番号:18であり、配列番号:18の545位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、または、
(p)配列番号:19であり、配列番号:19の124位に相当する位置にアミノ酸置換または欠失を有する、
に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド。
(項目20)
前記ポリペプチドは、配列番号:1の344位に相当する位置にPro置換を含む、項目19に記載の組換えポリペプチド。
(項目21)
前記ポリペプチドは、配列番号:2の702位に相当する位置にHis置換を含む、項目19に記載の組換えポリペプチド。
(項目22)
前記ポリペプチドは、配列番号:3の655位に相当する位置にAla置換を含む、項目19に記載の組換えポリペプチド。
(項目23)
前記ポリペプチドは、配列番号:4の73位に相当する位置にAla置換を含む、項目19に記載の組換えポリペプチド。
(項目24)
前記ポリペプチドは、配列番号:5の781位に相当する位置にGly置換を含む、項目19に記載の組換えポリペプチド。
(項目25)
前記ポリペプチドは、配列番号:6の136位に相当する位置にVal置換を含む、項目19に記載の組換えポリペプチド。
(項目26)
前記ポリペプチドは、配列番号:7の183位に相当する位置にAla置換を含む、項目19に記載の組換えポリペプチド。
(項目27)
前記ポリペプチドは、配列番号:8の1位に相当する位置にArg置換を含む、項目19に記載の組換えポリペプチド。
(項目28)
前記ポリペプチドは、配列番号:9の102位に相当する位置にCys置換を含む、項目19に記載の組換えポリペプチド。
(項目29)
前記ポリペプチドは、配列番号:10の105位に相当する位置にCys置換を含む、項目19に記載の組換えポリペプチド。
(項目30)
前記ポリペプチドは、配列番号:11の673位に相当する位置にLeu置換を含む、項目19に記載の組換えポリペプチド。
(項目31)
前記ポリペプチドは、配列番号:12の69位に相当する位置にGly置換を含む、項目19に記載の組換えポリペプチド。
(項目32)
前記ポリペプチドは、配列番号:13の107位に相当する位置にSer置換を含む、項目19に記載の組換えポリペプチド。
(項目33)
前記ポリペプチドは、配列番号:17の246位に相当する位置にAla置換を含む、項目19に記載の組換えポリペプチド。
(項目34)
前記ポリペプチドは、配列番号:18の545位に相当する位置にIle置換を含む、項目19に記載の組換えポリペプチド。
(項目35)
前記ポリペプチドは、配列番号:19の124位に相当する位置にPro置換を含む、項目19に記載の組換えポリペプチド。
(項目36)
前記ポリペプチドは、配列番号:1の999位に相当する位置にThr置換、457位に相当する位置にThr置換、591位に相当する位置にPro置換、183位に相当する位置にThr置換、358位に相当する位置にLeu置換、23位に相当する位置にArg置換、902位に相当する位置にIle置換、889位に相当する位置にVal置換、620位に相当する位置にCys置換、及び/または、174位に相当する位置にGly置換、を更に含む、項目19に記載の組換えポリペプチド。
(項目37)
前記ポリペプチドは、配列番号:3の398位に相当する位置にCys置換、652位に相当する位置にAla置換、264位に相当する位置にCys置換、及び/または、21位に相当する位置にAla置換、を更に含む、項目19に記載の組換えポリペプチド。
(項目38)
前記ポリペプチドは、配列番号:4の45位に相当する位置にAsn置換、290位に相当する位置にLeu置換、271位に相当する位置にAsp置換、153位に相当する位置にTyr置換、45位に相当する位置にVal置換、284位に相当する位置にPro置換、73位に相当する位置にIle置換、68位に相当する位置にLeu置換、69位に相当する位置にIle置換、305位に相当する位置にCys置換、144位に相当する位置にSer置換、及び/または、281位に相当する位置にVal置換、を更に含む、項目19に記載の組換えポリペプチド。
(項目39)
前記ポリペプチドは、配列番号:5の916位に相当する位置にGly置換、938位に相当する位置にHis置換、860位に相当する位置にHis置換、925位に相当する位置にAsp置換、及び/または、470位に相当する位置にMet置換、を更に含む、項目19に記載の組換えポリペプチド。
(項目40)
前記ポリペプチドは、配列番号:6の115位に相当する位置にAla置換、386位に相当する位置にArg置換、155位に相当する位置にArg置換、98位に相当する位置にSer置換、201位に相当する位置にAla置換、294位に相当する位置にThr置換、159位に相当する位置にTyr置換、及び/または、112位に相当する位置にIle置換、を更に含む、項目19に記載の組換えポリペプチド。
(項目41)
前記ポリペプチドは、配列番号:18の76位に相当する位置にGly置換、293位に相当する位置にVal置換、637位に相当する位置にThr置換、3位に相当する位置にVal置換、311位に相当する位置にSer置換、471位に相当する位置にThr置換、228位に相当する位置にVal置換、311位に相当する位置にSer置換、及び/または、257位に相当する位置にThr置換、を更に含む、項目19に記載の組換えポリペプチド。
(項目42)
前記ポリペプチドは、配列番号:7の173位に相当する位置にVal置換、196位に相当する位置にLeu置換、180位に相当する位置にPhe置換、249位に相当する位置にAla置換、5位に相当する位置にVal置換、273位に相当する位置にLeu置換、及び/または、176位に相当する位置にAsn置換、を更に含む、項目19に記載の組換えポリペプチド。
(項目43)
前記ポリペプチドは、配列番号:9の15位に相当する位置にCys置換、及び/または、30位に相当する位置に置換、を更に含む、項目19に記載の組換えポリペプチド。
(項目44)
前記ポリペプチドは、配列番号:19の193位に相当する位置にIle置換、233位に相当する位置にThr置換、300位に相当する位置にAla置換、及び/または、199位に相当する位置にArg置換、を更に含む、項目19に記載の組換えポリペプチド。
(項目45)
前記ポリペプチドは、配列番号:17の246位に相当する位置にAla置換を更に含む、項目19に記載の組換えポリペプチド。
(項目46)
前記ポリペプチドは、配列番号:11の119位に相当する位置にVal置換、535位に相当する位置にPro置換、373位に相当する位置にArg置換、535位に相当する位置にSer置換、119位に相当する位置にThr置換、601位に相当する位置にAla置換、103位に相当する位置にLys置換、31位に相当する位置にAsp置換、662位に相当する位置にIle置換、359位に相当する位置にLys置換、及び/または、519位に相当する位置にAsp置換、を更に含む、項目19に記載の組換えポリペプチド。
(項目47)
(i)配列番号:14に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列、ならびに、(ii)212位に相当する位置にIle置換、162位に相当する位置にAsn置換、299位に相当する位置にAla置換、及び/または、220位に相当する位置にArg置換、を含む、ポリペプチドをコードする核酸分子。
(項目48)
(i)配列番号:14に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列、ならびに、(ii)212位に相当する位置にIle置換、162位に相当する位置にAsn置換、299位に相当する位置にAla置換、及び/または、220位に相当する位置にArg置換、を含む、組換えポリペプチド。
(項目49)
(i)配列番号:15に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列、ならびに、(ii)184位に相当する位置にAla置換、1730位に相当する位置にAsn置換、1888位に相当する位置にAsp置換、352位に相当する位置にThr置換、374位に相当する位置にSer置換、1423位に相当する位置にArg置換、1502位に相当する位置にGlu置換、285位に相当する位置にGln置換、470位に相当する位置にLys置換、939位に相当する位置にThr置換、1669位に相当する位置にPhe置換、2034位に相当する位置にIle置換、1713位に相当する位置にAsn置換、704位に相当する位置にThr置換、及び/または、1084位に相当する位置にIle置換、を含むポリペプチドをコードする核酸分子。
(項目50)
(i)配列番号:15に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列、ならびに、(ii)184位に相当する位置にAla置換、1730位に相当する位置にAsn置換、1888位に相当する位置にAsp置換、352位に相当する位置にThr置換、374位に相当する位置にSer置換、1423位に相当する位置にArg置換、1502位に相当する位置にGlu置換、285位に相当する位置にGln置換、470位に相当する位置にLys置換、939位に相当する位置にThr置換、1669位に相当する位置にPhe置換、2034位に相当する位置にIle置換、1713位に相当する位置にAsn置換、704位に相当する位置にThr置換、及び/または、1084位に相当する位置にIle置換、を含む、組換えポリペプチド。
(項目51)
(i)配列番号:16に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列、ならびに、(ii)112位に相当する位置にPhe置換、126位に相当する位置にAla置換、978位に相当する位置にLeu置換、199位に相当する位置にGly置換、476位に相当する位置にThr置換、及び/または、735位に相当する位置にVal置換、を含むポリペプチドをコードする核酸分子。
(項目52)
(i)配列番号:16に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列、ならびに、(ii)112位に相当する位置にPhe置換、126位に相当する位置にAla置換、978位に相当する位置にLeu置換、199位に相当する位置にGly置換、476位に相当する位置にThr置換、及び/または、735位に相当する位置にVal置換、を含む、組換えポリペプチド。
(項目53)
項目18、項目47、項目49または項目51に記載の核酸分子から選択される少なくとも1つの核酸分子を含む菌株。
(項目54)
前記菌株は、項目18、項目47、項目49または項目51に記載の核酸分子から選択される少なくとも1つの核酸分子によりコードされる前記ポリペプチドを発現する、項目53に記載の菌株。
(項目55)
少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9または10の前記核酸分子を含む、項目53に記載の菌株。
(項目56)
前記菌株は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9または10の前記核酸分子によりコードされる前記ポリペプチドを発現する、項目55に記載の菌株。
(項目57)
前記菌株はE.coli株である、項目55に記載の菌株。
(項目58)
配列番号:20、配列番号:21または配列番号:22に対して少なくとも90%同一なtRNAをコードする核酸を含み、以下の特徴、
(i)7位に相当する位置にGまたはC、
(ii)49位に相当する位置にT、
(iii)50位に相当する位置にAまたはC、
(iv)64位に相当する位置にT、
(v)65位に相当する位置にGまたはA、及び/または、
(vi)66位に相当する位置にG、TまたはC、
のうちの1つまたは複数を含む、項目53に記載の菌株。
(項目59)
前記分子は、配列番号:20に対して少なくとも約90%同一な前記配列を含むtRNAをコードし、以下の特徴、
(i)7位に相当する位置にG、
(ii)49位に相当する位置にT、
(iii)50位に相当する位置にC、
(iv)64位に相当する位置にT、
(v)65位に相当する位置にG、及び/または、
(vi)66位に相当する位置にC、
のうちの1つまたは複数を含む、項目58に記載の菌株。
(項目60)
前記分子は、前記特徴(i)~(vi)のうちの2、3、4、5または6つを含む、項目59に記載の菌株。
(項目61)
前記分子は、配列番号:20に対して少なくとも95%同一な配列を含むtRNAをコードする、項目58に記載の菌株。
(項目62)
前記分子は、配列番号:20の前記配列を含むtRNAをコードする、項目61に記載の菌株。
(項目63)
前記分子は、配列番号:21に対して少なくとも約90%同一な前記配列を含むtRNAをコードする、項目58に記載の菌株。
(項目64)
前記分子は、配列番号:21の前記配列を含むtRNAをコードする、項目63に記載の菌株。
(項目65)
前記分子は、配列番号:22に対して少なくとも約90%同一な前記配列を含むtRNAをコードする、項目58に記載の菌株。
(項目66)
前記分子は、配列番号:22の前記配列を含むtRNAをコードする、項目65に記載の菌株。
(項目67)
セレノシステイン組み込み用のTAGコドンを有するコード配列中に少なくとも1つの位置を有する目的のポリペプチドをコードする発現可能な核配列を更に含む、項目53に記載の菌株。
(項目68)
前記発現可能な核配列はヒトポリペプチドをコードする、項目67に記載の菌株。
(項目69)
前記発現可能な核配列は酵素または抗体をコードする、項目67に記載の菌株。
(項目70)
前記発現可能な核配列はT7 RNAポリメラーゼプロモーターを含む、項目67に記載の菌株。
(項目71)
T7 RNAポリメラーゼをコードする核酸配列を更に含む、項目53に記載の菌株。
(項目72)
寄託受入番号42595でNCIMBに寄託されたE.coli菌株。
(項目73)
項目53から項目72のいずれか1項に記載の菌株を含む細菌の培養物。
(項目74)
1~100mg/Lの前記培養物の量で発現組換えポリペプチドを含む前記培養物を含み、前記発現組換えポリペプチドは少なくとも1つのセレノシステイン残基を含む、細菌の培養物。
(項目75)
10~40mg/Lの前記培養物の量で発現組換えポリペプチドを含み、前記発現組換えポリペプチドは少なくとも1つのセレノシステイン残基を含む、項目74に記載の培養物。
(項目76)
前記発現組換えポリペプチドは項目のいずれか1項に記載のポリペプチドである、項目74または項目75に記載の培養物。
(項目77)
前記発現組換えポリペプチドは、前記ポリペプチドの野生型には存在しない選択位置に少なくとも1つのセレノシステイン残基を含む、項目74または項目75に記載の培養物。
(項目78)
前記培養物中における前記発現組換えポリペプチドの少なくとも80%は、前記選択位置に前記セレノシステイン残基を含む、項目77に記載の培養物。
(項目79)
前記培養物中における前記組換えポリペプチドの80%~99.9%は、前記選択位置に前記セレノシステイン残基を含む、項目77に記載の培養物。
(項目80)
前記培養物中における前記発現組換えポリペプチドの90%~99%は、前記選択位置に前記セレノシステイン残基を含む、項目77に記載の培養物。
(項目81)
前記培養物中における前記発現組換えポリペプチドの少なくとも95%は、前記選択位置に前記セレノシステイン残基を含む、項目77に記載の培養物。
(項目82)
前記培養物中における前記発現組換えポリペプチドの少なくとも99%は、前記選択位置に前記セレノシステイン残基を含む、項目77に記載の培養物。
(項目83)
前記発現組換えポリペプチドはヒトポリペプチドに対して少なくとも90%同一である、項目74または項目75に記載の培養物。
(項目84)
前記ヒトポリペプチドは疾患に関与するポリペプチドである、項目83に記載の培養物。
(項目85)
前記発現組換えポリペプチドは抗体または酵素を含む、項目74または項目75に記載の培養物。
(項目86)
前記ポリペプチドは選択位置に少なくとも2つのセレノシステイン残基を含む、項目74または項目75に記載の培養物。
(項目87)
前記選択位置の前記2つのセレノシステイン残基はジセレニド結合を形成する、項目86に記載の培養物。
(項目88)
前記ポリペプチドは、選択位置に2、3、4、5、6、7、8、9または10のセレノシステイン残基を含む、項目86に記載の培養物。
(項目89)
項目74から項目88のいずれか1項に記載の培養物から精製した少なくとも第1のセレノシステイン残基を含むポリペプチド。
(項目90)
少なくとも1つのセレノシステイン残基を含むポリペプチドを発現させるための方法であって、
(a)セレン供給源の存在下、項目53から項目72のいずれか1項に記載の菌株内で前記ポリペプチドをコードする核酸を発現させることと、
(b)前記細菌から前記組換えポリペプチドを精製することと、
を含む、前記方法。
(項目91)
(a)セレン供給源の存在下、項目53から項目72のいずれか1項に記載の菌株内で前記ポリペプチドをコードする核酸を発現させることと、
(b)前記細菌から前記組換えポリペプチドを精製することと、
を含む方法により製造した、選択位置に少なくとも1つのセレノシステイン残基を含む組換えポリペプチド。
本開示の実施形態では、セレノシステインを組み込むための機構、例えば、セレノプロテインを産生するための機構などを提供する。一態様では、機構は菌株、例えば、E.coli株などであり、細胞増殖またはセレノシステイン組み込みを高める遺伝子のうちの1つまたは複数内に1つまたは複数のアミノ酸置換または欠失を含む。菌株は、E.coli株K012 MG1655(GenBank受入番号U00096.3)、E.coli株C321ΔA(US2016/0060301)またはE.coli株RTΔAであってもよい。特定の実施形態では、菌株はRTΔA 2X310K株である。
セレノシステインを含むポリペプチド、例えば、抗体またはジスルフィド結合タンパク質などを産生するために、本明細書で提供するセレノシステイン組み込み機構を使用してもよい。一部の例においては、セレノシステイン残基で天然システインを置換してもよく、または、セレノシステイン残基の置換がポリペプチドの構造及び機能を変化させない任意の部位、例えば、セリン残基において置換してもよい。なおも更なる態様では、実施形態に記載の方法を使用して、通常は1つまたは複数のセレノシステイン残基、例えば、ヒトセレノプロテイン(例えば、ヒトTrxR)などを含むポリペプチドを製造してもよい。
A.セレノシステインを含む抗体
E.coli株RTΔA 2X310Kの代表的な凍結寄託が、2016年6月22日、National Collections of Industrial,Food and Marine Bacteria(NCIMB),23 St.Machar Drive,Aberdeen AB2 1RY,Scotland,United Kingdomで行われている。これら寄託細胞には、受入番号NCIMB 42595が付与されている。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を説明するために含まれる。以下に続く実施例に開示されている技術は本発明の実施において良好に機能する本発明者が発見した技術を表し、その結果、それらの実施に好ましい方法を構成するとみなすことができることを、当業者は理解するべきである。しかしながら、当業者は、本開示に鑑み、開示される特定の実施形態において多くの変更が実施可能であること、及び、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく同様または類似の結果をなおも得られることを理解するべきである。
セレノシステイン組み込み用のいくつかの菌株を作製してから進化させた。より効率的なセレノシステイン組み込み株の誘導用に、上記のE.coli RTΔA株(Thyer et al.,2015;(参照として本明細書に組み込まれる))を使用した。要約すると、RTΔA株は、株C321.ΔA(Lajole et al.,2013)内にselA、selB及びselC遺伝子(それぞれselA、selB及びtRNASecをコードする)の欠失を含み、一連の非天然アミノ酸の効率的な組み込みを可能とする解離因子1(RF1)をコードするprfA遺伝子を欠く。これら遺伝子を欠失させることにより、新しいtRNASecライブラリと内在性セレノシステイン組み込み機構の間におけるすべてのクロストークが排除された。
以下の参照文献は、それらが本明細書中に記載する詳細の補助となる例示的な手続き上またはその他の詳細を提供する限りにおいて、参照として明示的に本明細書に組み込まれる。
米国特許番号4,554,101号
米国特許番号5,091,513号
米国特許番号6,946,546号
米国特許番号6,881,557号
米国特許出願公開番号2005/0214860号
米国特許出願公開番号2017/0166945号
Ausubel et al.(eds.)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons,New York,1994)
Barbas et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,91:3809-13,1994
Cloning Vectors:A Laboratory Manual(P.H.Pouwels et al.,1985,Suppl.1987)
Gram et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,89:3576-80,1992
Hu et al.,Cancer Res.,56:3055-61,1996
Kyte and Doolittle,J.Mol.Biol.,157(1):105-32,1982
Liu et al.,Cell Mol.Biol.,49(2):209-16,2003
Marks et al.,J.Biol.Chem.,267:16007-10 1992
Schier et al.,J.Mol.Biol.,263:551-67,1996
Stemmer,Nature,370:389-91,1994
Thyer et al.,J.Am.Chem.Soc.,137(1):46-49,2015
Claims (10)
- 配列番号:4に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含み、配列番号:4の73位に相当する位置にAlaを有するポリペプチドをコードする核酸分子を含む、E.coli菌株であって、前記E.coli菌株は、セレノシステイン組み込みを示し、
(a)配列番号:1に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号:1の344位に相当する位置にProを有する配列、
(b)配列番号:2に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号:2の702位に相当する位置にHisを有する配列、
(c)配列番号:3に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号:3の655位に相当する位置にAlaを有する配列、
(d)配列番号:5に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号:5の781位に相当する位置にGlyを有する配列、
(e)配列番号:6に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号:6の136位に相当する位置にValを有する配列、
(f)配列番号:7に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号:7の183位に相当する位置にAlaを有する配列、
(g)配列番号:8に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号:8の1位に相当する位置にArgを有する配列、
(h)配列番号:9に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号:9の102位に相当する位置にCysを有する配列、
(i)配列番号:10に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号:10の105位に相当する位置にCysを有する配列、
(j)配列番号:11に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号:11の673位に相当する位置にLeuを有する配列、
(k)配列番号:12に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号:12の69位に相当する位置にGlyを有する配列、
(l)配列番号:13に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号:13の107位に相当する位置にSerを有する配列、
(m)配列番号:17に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号:17の246位に相当する位置にAlaを有する配列、
(n)配列番号:18に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号:18の545位に相当する位置にIleを有する配列、及び
(o)配列番号:19に対して少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号:19の124位に相当する位置にProを有する配列、
を含むポリペプチドをコードする核酸分子を含む、E.coli菌株。 - (a)配列番号:1と同一のアミノ酸配列において、配列番号:1の344位に相当する位置にProを有する配列、
(b)配列番号:2と同一のアミノ酸配列において、配列番号:2の702位に相当する位置にHisを有する配列、
(c)配列番号:3と同一のアミノ酸配列において、配列番号:3の655位に相当する位置にAlaを有する配列、
(d)配列番号:5と同一のアミノ酸配列において、配列番号:5の781位に相当する位置にGlyを有する配列、
(e)配列番号:6と同一のアミノ酸配列において、配列番号:6の136位に相当する位置にValを有する配列、
(f)配列番号:7と同一のアミノ酸配列において、配列番号:7の183位に相当する位置にAlaを有する配列、
(g)配列番号:8と同一のアミノ酸配列において、配列番号:8の1位に相当する位置にArgを有する配列、
(h)配列番号:9と同一のアミノ酸配列において、配列番号:9の102位に相当する位置にCysを有する配列、
(i)配列番号:10と同一のアミノ酸配列において、配列番号:10の105位に相当する位置にCysを有する配列、
(j)配列番号:11と同一のアミノ酸配列において、配列番号:11の673位に相当する位置にLeuを有する配列、
(k)配列番号:12と同一のアミノ酸配列において、配列番号:12の69位に相当する位置にGlyを有する配列、
(l)配列番号:13と同一のアミノ酸配列において、配列番号:13の107位に相当する位置にSerを有する配列、
(m)配列番号:17と同一のアミノ酸配列において、配列番号:17の246位に相当する位置にAlaを有する配列、
(n)配列番号:18と同一のアミノ酸配列において、配列番号:18の545位に相当する位置にIleを有する配列、及び
(o)配列番号:19と同一のアミノ酸配列において、配列番号:19の124位に相当する位置にProを有する配列
を含むポリペプチドをコードする核酸分子を含む、請求項1に記載のE.coli菌株。 - 請求項1に記載のE.coli菌株であって、セレノシステインの組み込みのためのtRNAおよびアミノアシルtRNA合成酵素をコードする核酸をさらに含む、E.coli菌株。
- 配列番号:20、配列番号:21または配列番号:22に対して少なくとも90%同一なtRNAをコードする核酸を含み、以下の特徴、
(i)7位に相当する位置にGまたはC、
(ii)49位に相当する位置にT、
(iii)50位に相当する位置にAまたはC、
(iv)64位に相当する位置にT、
(v)65位に相当する位置にGまたはA、及び/または、
(vi)66位に相当する位置にG、TまたはC、
のうちの1つまたは複数を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載のE.coli菌株。 - 寄託受入番号42595でNCIMBに寄託されたE.coli菌株である、請求項1~4のいずれか一項に記載のE.coli菌株。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載のE.coli菌株を含む、細菌の培養物。
- 少なくとも1mg/Lの量で発現組換えポリペプチドをさらに含む、請求項6に記載の培養物。
- 前記培養物中の前記発現組換えポリペプチドは、少なくとも1つのセレノシステイン残基を含む、請求項7に記載の培養物。
- 請求項5~7のいずれか一項に記載の培養物であって、前記培養物の量に対して1~100mg/Lで発現組換えポリペプチドを含み、前記培養物中の前記発現組換えポリペプチドは少なくとも1つのセレノシステイン残基を含む、培養物。
- 少なくとも1つのセレノシステイン残基を含むポリペプチドを発現させるための方法であって、
(a)セレン供給源の存在下、請求項1~5のいずれか一項に記載のE.coli菌株内で前記ポリペプチドをコードする核酸を発現させることと、
(b)前記細菌から前記組換えポリペプチドを精製することと、
を含む、前記方法。
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