JP2019030231A - 抗体及びその製造方法、並びに抗体の熱安定性を向上させる方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本実施形態の抗体は、カバット法に基づく可変領域の80番目のアミノ酸残基と、カバット法に基づく定常領域の171番目のアミノ酸残基とがシステインではない抗体における、該可変領域の80番目のアミノ酸残基と、該定常領域の171番目のアミノ酸残基とがシステインに置換されたことを特徴とする。このようなアミノ酸残基の置換の結果、抗体の熱安定性は、置換が行われる前の元の抗体と比較して向上する。すなわち、本実施形態の抗体は、熱安定性が向上するよう人工的に改変した抗体である(以下、「改変抗体」ともいう)。
本実施形態の抗体の製造方法(以下、単に「製造方法」ともいう)によれば、上述の本実施形態の改変抗体を得ることができる。本実施形態の製造方法では、まず、カバット法に基づく可変領域の80番目のアミノ酸残基と、カバット法に基づく定常領域の171番目のアミノ酸残基とがシステインではない抗体に対して、該可変領域の80番目のアミノ酸残基と、該定常領域の171番目のアミノ酸残基とをシステインに置換する。
本実施形態の抗体の熱安定性を向上させる方法(以下、単に「方法」ともいう)によれば、カバット法に基づく可変領域の80番目のアミノ酸残基と、カバット法に基づく定常領域の171番目のアミノ酸残基とがシステインではない抗体の熱安定性を向上させることができる。本実施形態の方法が対象とする抗体は、上述の「元の抗体」と同じである。本実施形態の方法では、元の抗体に対して、カバット法に基づく可変領域の80番目のアミノ酸残基と、カバット法に基づく定常領域の171番目のアミノ酸残基とをシステインに置換することによって、熱安定性を向上させる。
上述のとおり、非特許文献1には、ウサギ抗体に特有のジスルフィド結合(軽鎖の80番目及び171番目のシステイン残基間に形成される)は、安定性に寄与しないことが示唆されている。しかし、タンパク質分子内のジスルフィド結合は熱安定性に関与する可能性があることから、本発明者らは、ウサギ抗体のFabの熱安定性を実際に測定した。
AFPで免疫したウサギの末梢血からリンパ球を取得し、該リンパ球からmRNAを抽出してcDNAを合成した。得られたcDNAを、抗体遺伝子をクローニングするための公知のプライマーを用いて増幅し、Fabファージライブラリを作製した。得られたライブラリを用いて、公知のFabファージディスプレイ法及びバイオパニング(Lang IM, Barbas CF 3rd, Schleef RR., Recombinant rabbit Fab with binding activity to type-1 plasminogen activator inhibitor derived from a phage-display library against human alpha-granules, (1996) Gene 172(2):295-8及びPhilippa M. O'Brien, Robert Aitken, Antibody Phage Display, (2002) Methods in Molecular Biology Volume No. 178参照)により、ウサギ抗AFP抗体のFabクローンを3つ得た。これらのクローンを以下、「A1」、「2-2-37」及び「C3」と呼ぶ。
得られた各Fabクローンを含む溶液の溶媒を、ゲルろ過により、示差走査熱量計(DSC)での測定に用いるバッファー(リン酸緩生理食塩水:PBS)に置換した。ゲルろ過の条件は下記のとおりである。
バッファー:PBS (pH 7.4)
使用したカラム:Superdex 200 Increase 10/300 (GEヘルスケア社)
カラム体積(CV):24 mL
サンプル体積:500μL
流速:1.0 mL/min
溶出量:1.5 CV
フラクション体積:500μL
サンプル量:400μL
測定範囲:30℃〜100℃
昇温速度:1℃/分
DSC測定により取得した各FabクローンのTm値を、表1に示す。
ウサギ抗体(SS6本型)、ヒト抗体及びマウス抗体のそれぞれに、SS7本型のウサギ抗体に特有のジスルフィド結合が形成されるよう変異を導入することにより、各抗体の熱安定性が改善されるか否かを検討した。
(1.1) ウサギ抗体の遺伝子の取得
上記の参考例で取得したウサギ抗AFP抗体のFabクローンA1の遺伝子を、ウサギ抗体のFc領域をコードする遺伝子を含むプラスミドDNAに組み込んで、ウサギ抗AFP抗体の遺伝子を含むプラスミドDNAを取得した。
ジェンスクリプトジャパン株式会社にヒト抗HER2モノクローナル抗体(トラスツズマブ)の遺伝子の合成を委託して、ヒト抗HER2抗体の遺伝子を含むプラスミドDNAを取得した。
以下のようにして、マウス抗インスリン抗体の遺伝子を取得した。
[試薬]
ISOGEN(株式会社ニッポンジーン)
SMARTer(登録商標)RACE 5'/3'キット(clontech社)
10x A-attachment mix(東洋紡株式会社)
pcDNA(商標)3.4 TOPO(登録商標)TAクローニングキット(Thermo Fisher社)
Competent high DH5α(東洋紡株式会社)
QIAprep Spin Miniprepキット(QIAGEN社)
KOD plus neo(東洋紡株式会社)
Ligation high ver.2(東洋紡株式会社)
ヒトインスリンを抗原に用いて、Kohler及びMilstein, Nature, vol.256, p.495-497, 1975に記載される方法により、マウス抗ヒトインスリン抗体を産生するハイブリドーマを作製した。このハイブリドーマの培養物(10 mL)を1000 rpmで5分間遠心処理した後、上清を除去した。得られた細胞をISOGEN(1mL)で溶解し、室温で5分静置した。ここに、クロロホルム(200μL)を添加し、15秒間撹拌した後、室温で3分間静置した。そして、これを12000×Gで10分間、4℃にて遠心処理して、RNAを含む水相(500μL)を回収した。回収した水相にイソプロパノール(500μL)を添加して混合した。得られた混合物を室温で5分間静置した後、12000×Gで10分間、4℃にて遠心処理した。上清を除去して、得られた沈殿物(トータルRNA)に70%エタノール(1mL)を添加し、7500×Gで10分間、4℃にて遠心処理した。上清を除去し、RNAを風乾させ、RNaseフリーの水(20μL)に溶解した。
上記(i)で得られた各トータルRNAを用いて、以下の組成のRNAサンプルを調製した。
[RNAサンプル]
トータルRNA (500 ng/μL) 1μL
RTプライマー 1μL
脱イオン水 1.75μL
合計 3.75μL
[逆転写反応液]
5x First-Strandバッファー 2μL
20 mM DTT 1μL
10 mM dNTP mix 1μL
RNAaseインヒビター 0.25μL
SMARTScribe RT(100 U/μL) 1μL
cDNA合成用サンプル 4.75μL
合計 10μL
[5'RACE反応液]
10x PCRバッファー 5μL
dNTP mix 5μL
25 mM Mg2SO4 3.5μL
cDNAサンプル 2.5μL
10x Universal Primer Mix 5μL
3'-プライマー 1μL
KOD plus neo (1 U/μL) 1μL
精製水 27μL
合計 50μL
[反応条件]
94℃で2分、
98℃で10秒、50℃で30秒、及び68℃でY秒を30サイクル、及び
68℃で3分。
5’RACE産物 9μL
10x A-attachment mix 1μL
合計 10μL
[TAクローニング反応液]
アデニン付加産物 4μL
salt solution 1μL
pCDNA3.4 1μL
合計 6μL
上記(ii)で得られたTAクローニングサンプル(3μL)をDH5α(30μL)に添加して、氷上で30分静置した後、混合物を42℃にて45秒間加熱してヒートショックを行った。再度、氷上で2分静置した後、全量をアンピシリン含有LBプレートに塗布した。該プレートを37℃にて16時間インキュベートした。プレート上のシングルコロニーをアンピシリン含有LB液体培地中に取り、37℃にて16時間振とう培養(250 rpm)した。培養物を5000×Gで5分間遠心処理して、大腸菌の形質転換体を回収した。回収した大腸菌からQIAprep Spin Miniprepキットを用いてプラスミドを抽出した。具体的な操作は、該キットに添付のマニュアルに従って行った。得られたプラスミドの塩基配列を、pCDNA3.4ベクタープライマーを用いて確認した。以上より、マウス抗インスリン抗体の遺伝子を含むプラスミドDNAを取得した。
(2.1) プライマーの設計及びPCR
各抗体の遺伝子の塩基配列に基づいて、軽鎖における可変領域の80番目のアミノ酸残基及び定常領域の171番目のアミノ酸残基をシステインに変異させるためのプライマーを設計した。また、比較のため、マウス抗インスリン抗体の軽鎖における可変領域の108番目のアミノ酸残基及び定常領域の171番目のアミノ酸残基をシステインに変異させるためのプライマーを設計した。抗体分子の構造上、軽鎖の108番目及び171番目のアミノ酸残基間の距離は、ジスルフィド結合が形成されうる軽鎖の80番目及び171番目のアミノ酸残基間の距離と近い。各プライマーの塩基配列を以下に示す。
可変領域
FOR: 5’- TGTGAAGATGCTGCCACTTATTAC -3’ (配列番号1)
REV: 5’- CGTCACGCCACTGATGGTGA -3’ (配列番号2)
定常領域
FOR: 5’- TGTACCTACAGCCTGAGCAGCAC -3’ (配列番号3)
REV: 5’- GTCTTCGGGGCTCTGCGGTG -3’ (配列番号4)
可変領域
FOR: 5’- TGTGAAGACTTCGCCACGTATTAC -3’ (配列番号5)
REV: 5’- CTGCAGAGAGCTGATCGTCAGG -3’ (配列番号6)
定常領域
FOR: 5’- TGTACGTACAGCCTGAGTTCCACC -3’ (配列番号7)
REV: 5’- GTCTTTTGAATCTTGTTCGGTCACGG -3’ (配列番号8)
可変領域(80番目)
FOR: 5’- TGTGAAGATGCTGCCACTTATTAC -3’ (配列番号9)
REV: 5’- CTCCATGCTGCTGATTGTGAG -3’ (配列番号10)
可変領域(108番目)
FOR: 5’- TGTGCTGATGCTGCACCAACTGTATC -3’ (配列番号11)
REV: 5’- TCTGATTTCCAGCTTGGTGCC -3’ (配列番号12)
定常領域
FOR: 5’- TGTACCTACAGCATGAGCAGCAC -3’ (配列番号13)
REV: 5’- GTCTTTGCTGTCCTGATCAG -3’ (配列番号14)
[PCR反応液]
10x PCRバッファー 5μL
25 mM Mg2SO4 3μL
2mM dNTP mix 5μL
フォワードプライマー 1μL
リバースプライマー 1μL
プラスミドDNA (40 ng/μL) 0.5μL
KOD plus neo (1U/μL) 1μL
精製水 33.5μL
合計 50μL
[反応条件]
98℃で2分、
98℃で10秒、54℃で30秒、及び68℃で4分を30サイクル、及び
68℃で3分。
[ライゲーション反応液]
DpnI処理済みPCR産物 2μL
Ligation high ver.2 5μL
T4ポリヌクレオチドキナーゼ 1μL
精製水 7μL
合計 15μL
ライゲーション反応後の溶液(3μL)をDH5α(30μL)に添加して、上記(1.3)と同様にして、大腸菌の形質転換体を得た。得られた大腸菌からQIAprep Spin Miniprepキットを用いてプラスミドDNAを抽出した。得られた各プラスミドDNAの塩基配列を、pCDNA3.4ベクタープライマーを用いて確認した。以下、これらのプラスミドDNAを、哺乳動物細胞発現用プラスミドとして用いた。
[試薬]
Expi293(商標)細胞(Invitrogen社)
Expi293(商標) Expression培地(Invitrogen社)
ExpiFectamine(商標)293トランスフェクションキット(Invitrogen社)
Expi293細胞は、5%CO2雰囲気下、37℃にて振とう培養(150 rpm)して増殖させた。サンプル数に応じた数の30 mLの細胞培養物(3.0 x 106 cells/mL)を準備した。各抗体の野生型及び変異型をコードするプラスミドDNAを用いて、以下の組成のDNA溶液を調製し、5分間静置した。
[DNA溶液]
軽鎖プラスミド溶液 15μgに相当する量(μL)
重鎖プラスミド溶液 15μgに相当する量(μL)
Opti-MEM(商標) 適量(mL)
合計 1.5 mL
ExpiFectamine試薬 80μL
プラスミド溶液 1420μL
合計 1.5 mL
各細胞培養物を3000 rpmで5分間遠心処理して、培養上清を回収した。培養上清には、トランスフェクションされたExpi293(商標)細胞から分泌された各抗体が含まれる。得られた培養上清を再度、15000×Gで10分間遠心処理して、上清を回収した。得られた上清をHiTrap Protein A HPカラム(GEヘルスケア社)を用いて精製した。得られた溶液を、Superdex 200 Increase 10/300 GLカラム(GEヘルスケア社)を用いてさらに精製して、抗体溶液を取得した。精製についての具体的な操作は、各カラムの添付文書に従って行った。
ウサギ抗AFP抗体及びヒト抗HER2抗体の野生型と、それらの改変抗体である変異型(cys80-171)を得た。また、マウス抗インスリン抗体の野生型とその改変抗体である変異型(cys80-171)及び変異型(cys108-171)を得た。各抗体の変異型の詳細を、以下に示す。
実施例1で作製した各抗体の野生型及びそれらの変異型の熱安定性を検討した。
実施例1で得られた各抗体を含む溶液の溶媒を、ゲルろ過によりPBS(pH 7.4)に置換した。各抗体を含むフラクションをPBSで希釈して、サンプル(終濃度5μM)を調製した。MicroCal PEAQ-DSC (Malvern Instruments Ltd社)を用いて、各抗体のTm値を測定した。ゲルろ過及びDSC測定の条件は、参考例で述べた条件と同じである。
DSC測定により取得した各抗体のTm値を、以下の表4〜7に示す。また、各抗体の解析ピークを図1、図2及び図3A〜3Cに示す。
実施例1で作製した各抗体の野生型及びそれらの変異型の抗原に対する親和性を、ELISA法により検討した。
(1.1) 抗原及び検出用抗体
ウサギ抗AFP抗体の抗原として、AFPタンパク質(Lee biosolutions社、カタログ番号:105-11)を用いた。ヒト抗HER2抗体の抗原として、HER2タンパク質(R&D Systems社、カタログ番号:1129-ER)を用いた。マウス抗インスリン抗体の抗原として、ヒューマリンR注100単位(イーライリリー社)を用いた。実施例1で作製した各抗体を1% BSA含有PBSで段階的に希釈して、濃度の異なる複数の抗体溶液を得た。
各抗原をPBS(pH 7.4)で希釈して、各抗原の溶液を調製した。各抗原の溶液をMaxiSorp(商標)平底プレート(Thermo Fisher社)のウェルに添加し、4℃にて一晩静置した。抗原溶液を除去し、ブロッキング溶液(1% BSA含有PBS)を各ウェルに添加してブロッキングした。ブロッキング溶液を除去した後、各抗体溶液を各ウェルに100μLずつ添加して、抗原抗体反応を室温で1時間行った。抗体溶液を除去し、各ウェルに洗浄液(1% BSA含有PBS)を添加してウェルを洗浄した。洗浄後、検出用抗体の種類に応じて、HRP標識抗ウサギFc抗体、HRP標識抗ヒトFc抗体又はHRP標識抗マウスFc抗体の溶液を添加して、抗原抗体反応を室温で行った。抗体溶液を除去し、各ウェルに洗浄液(1% BSA含有PBS)を添加してウェルを洗浄した。洗浄後、ABST基質(Thermo Fisher社)の溶液を各ウェルに添加し、450 nmでの吸光度を測定した。
図4〜6に示されるように、ウサギ抗体、ヒト抗体及びマウス抗体のいずれの変異体においても、抗原に対する親和性は、各抗体の野生型とほぼ同じであった。したがって、カバット法に基づく可変領域の80番目及び定常領域の171番目のアミノ酸残基のシステインへの置換は、抗原に対する親和性にはほとんど影響を与えないことが示された。よって、カバット法に基づく可変領域の80番目及び定常領域の171番目のアミノ酸残基をシステインに置換することにより、抗原に対する親和性に影響を与えることなく、抗体の熱安定性を向上できることが示唆された。
野生型の抗体における、カバット法に基づく可変領域の80番目及び定常領域の171番目のアミノ酸残基の近傍のアミノ酸残基をシステインに置換した場合も、抗体の熱安定性が向上するかを検討した。
実施例1と同様にして、マウス抗インスリン抗体の野生型における、カバット法に基づく可変領域の79〜81番目から選択される1つのアミノ酸残基と、カバット法に基づく定常領域の169〜171番目から選択される1つのアミノ酸残基とをシステインに置換して、マウス抗インスリン抗体の変異型を作製した。また、ヒトHER2抗体の野生型における、カバット法に基づく可変領域の80番目のアミノ酸残基と、カバット法に基づく定常領域の170又は171番目のアミノ酸残基とをシステインに置換して、ヒトHER2抗体の変異型を作製した。
実施例2と同様にして、各抗体の野生型及びそれらの変異型の熱安定性を測定した。結果を表8及び9に示す。
Claims (14)
- カバット法に基づく可変領域の80番目のアミノ酸残基と、カバット法に基づく定常領域の171番目のアミノ酸残基とがシステインではない抗体における、前記可変領域の80番目のアミノ酸残基と、前記定常領域の171番目のアミノ酸残基とがシステインに置換されたことを特徴とする、抗体。
- 前記抗体が、ヒト、マウス、ウサギ、ラット、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ウシ又はウマに由来する請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体が、IgG又はFabの形態にある請求項1又は2に記載の抗体。
- 前記可変領域が、軽鎖の可変領域であり、前記定常領域が、軽鎖の定常領域である請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記抗体の軽鎖が、カッパ鎖である請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗体。
- カバット法に基づく可変領域の80番目のアミノ酸残基と、カバット法に基づく定常領域の171番目のアミノ酸残基とがシステインではない抗体に対して、前記可変領域の80番目のアミノ酸残基と、前記定常領域の171番目のアミノ酸残基とをシステインに置換する工程と、
前記置換工程で得られた抗体を回収する工程と
を含む、抗体の製造方法。 - カバット法に基づく可変領域の80番目のアミノ酸残基と、カバット法に基づく定常領域の171番目のアミノ酸残基とがシステインではない抗体において、前記可変領域の80番目のアミノ酸残基と、前記定常領域の171番目のアミノ酸残基とをシステインに置換することを特徴とする、抗体の熱安定性を向上させる方法。
- 前記抗体が、ヒト、マウス、ウサギ、ラット、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ウシ又はウマに由来する請求項6又は7に記載の方法。
- 前記抗体が、IgG又はFabの形態にある請求項6〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記可変領域が、軽鎖の可変領域であり、前記定常領域が、前記軽鎖の定常領域である請求項6〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗体の軽鎖が、カッパ鎖である請求項6〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項12に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項13に記載のベクターを含む宿主細胞。
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