JP7268103B2 - CRISPR-Cas9を用いた組織特異的ゲノム操作 - Google Patents
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Description
本出願は、2015年11月12日に出願された米国仮特許出願第62/254,652号及び2016年9月7日に出願された米国仮特許出願第62/384,660号の利益ならびに優先権を主張する。当該仮特許出願の各々は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、ASCIIフォーマットにて電子的に提出した、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。2016年10月7日に作成された当該ASCIIコピーは、名称がPCFC-989-WO1_SL.txtであり、サイズは8,036,161バイトである。
本発明は、化合物、組成物、及びその遺伝子標的化剤としての使用に関する。
バリアであることが知られている。生物活性分子は、多くの場合、エンドソーム小胞に捕捉され、リソソーム区画にて分解される。各種試薬、例えば、クロロキン、ポリエチレンイミン[PEI]、ある特定の多価カチオン化合物、膜融合ペプチド、及び不活化アデノウィルスは、エンドソームを迅速に破壊し、送達される生物活性剤がエンドソーム様環境にて費やす時間を最小限にすることを目的として開発されている。しかしながら、これらの薬剤は、しばしば普遍性を欠き、当該カーゴのエンドソーム脱出を促進する能力が最適以下であり、毒性問題を含む様々な不利益と関連する。
式中、
Rxxは、-H、-アルキル、-シクロアルキル、-アルケニル、-アルキニル、-アリール、-ヘテロアリール、-OR5、-N(R4)-R5、-SR5であり、該Rxxの-CH2
-基は、各々独立して、-O-、-S-、-N(R4)-から選択されるヘテロ原子基と
交換されてもよく、該Rxxの-CH3は、-N(R4)2、-OR4、及び-S(R4)から
選択されるヘテロ原子基と交換されてもよく、該ヘテロ原子基は、少なくとも2つの炭素原子で離間されており、該アルキル、シクロアルキル、アルケニル、及びアルキニルは、各々独立して、1つ以上のハロ原子で置換されてもよく、
Ryyは、-CN、-CH2-CN、-C≡CH、-CH2-N3、-CH2-NH2、-CH2-N(R4)-S(O)2-R5、-CH2-CO2H、-CO2H、-CH2-OH、-CH2-SH、-CH=CH-R5、-CH2-R5、-CH2-S-R5、-CH2-N(R4)-
R5、-CH2-N(R4)-C(O)-R5、-CH2-N(R4)-C(O)-O-R5、
-CH2-N(R4)-C(O)-N(R4)-R5、-CH2-O-R5、-CH2-O-C
(O)-R5、-CH2-O-C(O)-N(R4)-R5、-CH2-O-C(O)-O-
R5、-CH2-S(O)-R5、-CH2-S(O)2-R5、-CH2-S(O)2-N(R4)-R5、-C(O)-NH2、-C(O)-O-R5、-C(O)-N(R4)-R5、またはアリールもしくはヘテロアリールであり、該アリールもしくはヘテロアリールは、任意にR5で置換され、
各R1は、独立して、-CN、-CH2-CN、-C≡CH、-CH2-N3、-CH2-N
H2、-CH2-N(R4)-S(O)2-R5、-CH2-CO2H、-CO2H、-CH2-
OH、-CH2-SH、-CH=CH-R5、-CH2-R5、-CH2-S-R5、-CH2
-N(R4)-R5、-CH2-N(R4)-C(O)-R5、-CH2-N(R4)-C(O
)-O-R5、-CH2-N(R4)-C(O)-N(R4)-R5、-CH2-O-R5、-
CH2-O-C(O)-R5、-CH2-O-C(O)-N(R4)-R5、-CH2-O-C(O)-O-R5、-CH2-S(O)-R5、-CH2-S(O)2-R5、-CH2-S(
O)2-N(R4)-R5、-C(O)-NH2、-C(O)-O-R5、-C(O)-N(
R4)-R5、またはアリールもしくはヘテロアリールであり、該アリールもしくはヘテロアリールは、任意にR5で置換されるか、
または、R1は、-Z-X-Y、-Z-Y、-X-Y、-Z-X+Y-、-X+Y-、-Z-
X-Y+、-X-Y+、もしくは-Yであり、
Xは、リンカーであり、
X+は、正に荷電したリンカーであり、
X-は、負に荷電したリンカーであり、
Yは、部位特異的修飾ポリペプチドを含むリボ核タンパク質もしくはエンドヌクレアーゼであるか、Yは、部位特異的修飾ポリペプチドであるか、Yは、Cas9リボ核タンパク質であるか、Yは、Cas9タンパク質であるか、Yは、シングルガイドRNA配列(sgRNA)であるか、Yは、CRISPR RNA(crRNA)及びトランス活性型crRNA(tracrRNA)を含むデュアルガイドRNA配列であり、
Y+は、部位特異的修飾ポリペプチドを含む正に荷電したリボ核タンパク質もしくはエン
ドヌクレアーゼであるか、Y+は、正に荷電した部位特異的修飾ポリペプチドであるか、
Y+は、正に荷電したCas9タンパク質であり、
Y-は、部位特異的修飾ポリペプチドを含む負に荷電したリボ核タンパク質もしくはエン
ドヌクレアーゼであるか、Y-は、負に荷電した部位特異的修飾ポリペプチドであるか、
Y-は、負に荷電したCas9リボ核タンパク質であるか、Y-は、負に荷電したsgRNAであるか、Y-は、CRISPR RNA(crRNA)及びトランス活性型crRN
A(tracrRNA)を含む負に荷電したデュアルガイドRNA配列であり、
Zは、存在しないか、または、-C≡C-、-CH=CH-、-CH2-、-CH2-O-、-C(O)-N(R4)-、-CH2-S-、-CH2-S(O)-、-CH2-S(O)2-、-CH2-S(O)2-N(R4)-、-C(O)-O-、-CH2-N(R4)-、-CH2-N(R4)-C(O)-、-CH2-N(R4)-S(O)2-、-CH2-N(R4)-C(O)-O-、-CH2-N(R4)-C(O)-N(R4)-、-CH2-O-C(O)-、-CH2-O-C(O)-N(R4)-、-CH2-O-C(O)-O-、またはア
リールもしくはヘテロアリールであり、該アリールもしくはヘテロアリールは、任意にR5で置換され、
R2は、-OH、-N3、-N(R3)2、-N(R3)-C(O)-R3、-N(R3)-C
(O)-N(R3)2、-N(R3)-C(O)-OR3、-N(R3)-S(O)2-R3、
テトラゾール、またはトリアゾールであり、該テトラゾール及びトリアゾールは、任意にR3で置換され、
各R3は、独立して、-H、-(C1-C5)アルキル、ハロ置換(C1-C5)アルキル、
ハロ置換(C3-C6)シクロアルキル、(C3-C6)シクロアルキル、-(C1-C5)アルケニル、-(C1-C5)アルキニル、ハロ置換-(C1-C5)アルケニル、またはハロ置換-(C1-C5)アルキニルであり、該アルキルまたはシクロアルキルの-CH2-基
は、各々独立して、-O-、-S-、及び-N(R4)-から選択されるヘテロ原子基と
交換されてもよく、該アルキルの-CH3は、各々独立して、-N(R4)2、-OR4、及び-S(R4)から選択されるヘテロ原子基と交換されてもよく、該ヘテロ原子基は、少
なくとも2つの炭素原子で離間されており、
各R4は、独立して、-H、-(C1-C20)アルキル、-(C1-C20)アルケニル、-
(C1-C20)アルキニル、または(C3-C6)シクロアルキルであり、少なくとも2つ
の炭素原子で離間された該アルキルまたはシクロアルキルの1~6個の-CH2-基は、
各々独立して、-O-、-S-、または-N(R4)-から独立して選択されるヘテロ原
子と交換されてもよく、該アルキルの-CH3は、各々独立して、-N(R4)2、-OR4、及び-S(R4)から選択されるヘテロ原子基と交換されてもよく、該ヘテロ原子基は
、少なくとも2つの炭素原子で離間されており、該アルキル、アルケニル、アルキニル、及びシクロアルキルは、ハロ原子で置換されてもよく、
各R5は、独立して、-H、(C3-C20)シクロアルキル、-(C1-C60)アルケニル
、-(C1-C60)アルキニル、または(C1-C60)アルキルであり、該シクロアルキルの1~6個の-CH2-基または該アルキルの1~20個の-CH2-基は、各々独立して、-O-、-S-、及び-N(R4)-から独立して選択されるヘテロ原子と交換されて
もよく、該ヘテロ原子は、少なくとも2つの炭素原子で離間されており、該アルキルの-CH3は、各々独立して、-N(R4)2、-OR4、及び-S(R4)から選択されるヘテ
ロ原子基と交換されてもよく、該ヘテロ原子基は、少なくとも2つの炭素原子で離間されており、該アルキル、アルケニル、アルキニル、及びシクロアルキルは、ハロ原子で置換されてもよい。
式中、
R1は、-Z-X-Y、-Z-Y、-X-Y、-Z-X+Y-、-X+Y-、-Z-X-Y+、
-X-Y+、または-Yであり、
Xは、リンカーであり、
X+は、正に荷電したリンカーであり、
X-は、負に荷電したリンカーであり、
Yは、部位特異的修飾ポリペプチドを含むリボ核タンパク質もしくはエンドヌクレアーゼであるか、Yは、部位特異的修飾ポリペプチドであるか、Yは、Cas9リボ核タンパク質であるか、Yは、Cas9タンパク質であるか、Yは、シングルガイドRNA配列(sgRNA)であるか、Yは、CRISPR RNA(crRNA)及びトランス活性型crRNA(tracrRNA)を含むデュアルガイドRNA配列であり、
Y+は、部位特異的修飾ポリペプチドを含む正に荷電したリボ核タンパク質もしくはエン
ドヌクレアーゼであるか、Y+は、正に荷電した部位特異的修飾ポリペプチドであるか、
Y+は、正に荷電したCas9タンパク質であり、
Y-は、部位特異的修飾ポリペプチドを含む負に荷電したリボ核タンパク質もしくはエン
ドヌクレアーゼであるか、Y-は、負に荷電した部位特異的修飾ポリペプチドであるか、
Y-は、負に荷電したCas9リボ核タンパク質であるか、Y-は、負に荷電したsgRNAであるか、Y-は、CRISPR RNA(crRNA)及びトランス活性型crRN
A(tracrRNA)を含む負に荷電したデュアルガイドRNA配列であり、
Zは、存在しないか、または、-C≡C-、-CH=CH-、-CH2-、-CH2-O-、-C(O)-N(R4)-、-CH2-S-、-CH2-S(O)-、-CH2-S(O)2-、-CH2-S(O)2-N(R4)-、-C(O)-O-、-CH2-N(R4)-、-CH2-N(R4)-C(O)-、-CH2-N(R4)-S(O)2-、-CH2-N(R4)-C(O)-O-、-CH2-N(R4)-C(O)-N(R4)-、-CH2-O-C(O)-、-CH2-O-C(O)-N(R4)-、-CH2-O-C(O)-O-、またはア
リールもしくはヘテロアリールであり、該アリールもしくはヘテロアリールは、任意にR5で置換され、
R2は、-OH、-N3、-N(R3)2、-N(R3)-C(O)-R3、-N(R3)-C
(O)-N(R3)2、-N(R3)-C(O)-OR3、-N(R3)-S(O)2-R3、
テトラゾール、またはトリアゾールであり、該テトラゾール及びトリアゾールは、任意に
R3で置換され、
各R3は、独立して、-H、-(C1-C5)アルキル、ハロ置換(C1-C5)アルキル、
ハロ置換(C3-C6)シクロアルキル、-(C1-C5)アルケニル、-(C1-C5)アルキニル、ハロ置換-(C1-C5)アルケニル、ハロ置換-(C1-C5)アルキニル、または(C3-C6)シクロアルキルであり、該アルキルまたはシクロアルキルの-CH2-基
は、各々独立して、-O-、-S-、及び-N(R4)-から選択されるヘテロ原子基と
交換されてもよく、該アルキルの-CH3は、各々独立して、-N(R4)2、-OR4、及び-S(R4)から選択されるヘテロ原子基と交換されてもよく、該ヘテロ原子基は、少
なくとも2つの炭素原子で離間されており、
各R4は、独立して、-H、-(C1-C20)アルキル、-(C1-C20)アルケニル、-
(C1-C20)アルキニル、または(C3-C6)シクロアルキルであり、少なくとも2つ
の炭素原子で離間された該アルキルまたはシクロアルキルの1~6個の-CH2-基は、
各々独立して、-O-、-S-、または-N(R4)-から独立して選択されるヘテロ原
子と交換されてもよく、該アルキルの-CH3は、各々独立して、-N(R4)2、-OR4、及び-S(R4)から選択されるヘテロ原子基と交換されてもよく、該ヘテロ原子基は
、少なくとも2つの炭素原子で離間されており、該アルキル、アルケニル、アルキニル、及びシクロアルキルは、ハロ原子で置換されてもよく、
各R5は、独立して、-H、(C3-C20)シクロアルキル、-(C1-C60)アルケニル
、-(C1-C60)アルキニル、または(C1-C60)アルキルであり、該シクロアルキルの1~6個の-CH2-基または該アルキルの1~20個の-CH2-基は、各々独立して、-O-、-S-、及び-N(R4)-から独立して選択されるヘテロ原子と交換されて
もよく、該ヘテロ原子は、少なくとも2つの炭素原子で離間されており、該アルキルの-CH3は、各々独立して、-N(R4)2、-OR4、及び-S(R4)から選択されるヘテ
ロ原子基と交換されてもよく、該ヘテロ原子基は、少なくとも2つの炭素原子で離間されており、該アルキル、アルケニル、アルキニル、及びシクロアルキルは、ハロ原子で置換されてもよい。
組成物の有効量を投与することを含む方法を提供する。
Cpf1リボ核タンパク質は、形質導入または転座ドメインを含むように修飾される。
かる本発明を限定するものではないことを理解されたい。
定義
本発明は、以下の本発明の例示的な実施形態の詳細な説明及びそこに含まれる実施例を参照することによりさらにいっそう容易に理解され得る。
Biology,6th ed.,”Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA(2000)を参照されたい。
は無機化合物(例えば、本発明の化合物等)、化合物の混合物)、生体高分子(例えば、核酸、抗体、その一部、ヒト化、キメラ、及びヒト抗体ならびにモノクローナル抗体、タンパク質もしくはその一部、例えば、ペプチド、脂質、炭水化物)、または、細菌、植物、真菌、もしくは動物(特に哺乳類)細胞もしくは組織等の生物材料からなる抽出物を意味するために使用される。剤には、例えば、構造に関して既知の剤、及び構造に関して未知の剤が含まれる。
カルを指す。該アルカンラジカルは、直鎖でも分岐でもよい。例えば、「(C1-C6)アルキル」という用語は、1~6個の炭素原子を含む一価の直鎖、または分岐脂肪族基(例えば、メチル、エチル、n-プロピル、i-プロピル、n-ブチル、i-ブチル、s-ブチル、t-ブチル、n-ペンチル、1-メチルブチル、2-メチルブチル、3-メチルブチル、ネオペンチル、3,3-ジメチルプロピル、ヘキシル、2-メチルペンチル等)を指す。同様に、アルコキシ、アシル(例えば、アルカノイル)、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルスルホニル、及びアルキルチオ基のアルキル部(すなわち、アルキル部分)も、上記と同じ定義を有する。「任意に置換される」ものとして示される場合、該アルカンラジカルまたはアルキル部分は、未置換でもよいし、「置換される」に対する定義において以下に記載する置換基の群から独立して選択される1つ以上の置換基(一般に、パークロロまたはパーフルオロアルキル等のハロゲン置換基の場合以外は1~3個の置換基)で置換されてもよい。「ハロ置換アルキル」とは、1つ以上のハロゲン原子で置換されたアルキル基(例えば、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、パーフルオロエチル、1,1-ジフルオロエチル等)を指す。
カルを指す。
、かかる環は縮合していてもよい。該環が縮合している場合、該環の1つは完全に不飽和でなければならず、縮合された環(複数可)は、完全に飽和でも、部分的に不飽和でも、完全に不飽和でもよい。「縮合された」という用語は、第二の環が、第一の環と共通に2つの隣接する原子を有する(すなわち、共有する)ことで存在する(すなわち、結合または形成される)ことを意味する。「fused(縮合された)」という用語は、「condensed(縮合された)」という用語と同意義である。「アリール」という用語は、ベンジル、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、ビフェニル、ベンゾ[b][1,4]オキサジン-3(4H)-オニル、2,3-ジヒドロ-1Hインデニル、及び1,2,3,4-テトラヒドロナフタレニル等の芳香族ラジカルを包含する。
障害を治療する、(ii)特定の疾患、状態、もしくは障害の1つ以上の症状を軽減、改善、もしくは除去する、または(iii)特定の疾患、状態、もしくは障害の1つ以上の症状の発現を予防もしくは遅延する本発明の化合物の量を意味する。
edition,A.Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990、及びRemington,The Science and Practice of Pharmacy,20th Ed.,Mack
Publishing,2000参照)。
Letters,20,2200(2010)及びA.A.Kislukhin et
al.,”Degradable Conjugates from Oxanorbornadiene Reagents”,Journal of the American Chemical Society,134, 6491(2012)参照。これらの条件としては、pH、温度、塩濃度、触媒、または酵素が挙げられる(G.M.Dubowchik et al.,”Cathepsin B-Labile Dipeptide Linkers for Lysosomal Release of Doxorubicin from Internalizing Immunoconjugates:Model Studies of Enzymatic Drug Release and Antigen-Specific In Vitro Anticancer Activity”,Bioconjugate Chemistry,13, 855(2002),G.Leriche et al.,”Cleavable Linkers in Chemical Biology”,Bioorganic and Medicinal Chemistry,20, 571(2012),C.P.R. Hackenberger et al.,”Chemoselective Ligation and Modification Strategies
for Peptides and Proteins”,Angewandte Chemie International Edition,47, 10030(2008)、D.M.Patterson et al.,”Finding the Right(Bioorthogonal) Chemistry”,ACS Chemical Biology,9, 592(2014)、C.A.Blencowe et al.,”Self-immolative Linkers in Polymeric Delivery Systems”,Polymer Chemistry,2,
773(2011)。上記刊行物の開示は、すべての目的のため、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
の化合物から分解によって放出される。この過程は、しばしば自壊性脱離と呼ばれ、エントロピー及び熱力学によって行われる環化または電子カスケード反応によって作用する。開裂可能でないリンカーの一例は、ベンジル位で脱離基にコンジュゲートするアミノ基もしくはヒドロキシル基または他の電子供与基を備えた多置換の電子豊富な芳香族種である(Blencowe,Christopher A.et al.,Self-immolative Linkers in Polymeric Delivery Systems,Polymer Chemistry,2011, 2, 773-790参照)。自壊性脱離リンカーとしては、アニリン系リンカー、N-ヒドロキシアニリン系リンカー、フェノール系リンカー、1,8-脱離系リンカー、環化系リンカー(すなわち、ヒドロキシル系リンカー、アミノ系リンカー、及びチオール系リンカー)、ポリマー-デンドロンコンジュゲート、ならびにポリマーコンジュゲート(すなわち、N-(2-ヒドロキシプロピル)-メタクリルアミド(HPMA)ポリマーコンジュゲート、ポリエチレングリコール(PEG)ポリマーコンジュゲート)が挙げられるがこれに限定されない(I.Tranoy-Opalinski,et al.,Design of Self-immolative Linkers for Turn our-Activated Prodrug Therapy,Anti-Cancer Agents in
Medicinal Chemistry,2008, 8, 618-637、Blencowe,Christopher A.et al.,Self-immolative Linkers in Polymeric Delivery Systems,Polymer Chemistry,2011, 2, 773-790参照)。
各Qは、独立して、存在しないか、またはC(O)、C(O)-NR4、NR4-C(O)、O-C(O)-NR4、NR4-C(O)-O、-CH2-、ヘテロアリール、もしくは
O、S、S-S、S(O)、S(O)2、及びNR4から選択されるヘテロ原子基であり、少なくとも2つの炭素原子が該ヘテロ原子基O、S、S-S、S(O)、S(O)2、及
びNR4を任意の他のヘテロ原子基から離間し、
各R4は、独立して、-H、-(C1-C20)アルキル、または(C3-C6)シクロアルキルであり、少なくとも2つの炭素原子で離間された該アルキルまたはシクロアルキルの1~6個の-CH2-基は、-O-、-S-、または-N(R4)-と交換されてもよく、該アルキルの-CH3は、-N(R4)2、-OR4、及び-S(R4)から選択されるヘテロ
原子基と交換されてもよく、該ヘテロ原子基は、少なくとも2つの炭素原子で離間されており、該アルキル及びシクロアルキルは、ハロ原子で置換されてもよく、
各mは、独立して、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13
、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40である。各(T-Q-T-Q)の各T及び各Qは、独立して選択される。
1-15を参照されたい。
質は、本明細書に記載の部位特異的修飾ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、該リボ核タンパク質は、Cas9タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、該リボ核タンパク質は、Cpf1タンパク質を含む。
10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、または少なくとも30のヌクレオチドを含み、該ガイド配列とその対応する標的配列の間の相補性度は、適切なアラインメントアルゴリズムを用いて最適に並べた場合、約50%、60%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれ以上であるか、または、約50%、60%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくはそれ以上を超える。最適アラインメントは、配列を並べるために任意の適切なアルゴリズムを用いて決定され得る。その非限定的な例としては、Smith-Watermanアルゴリズム、Needleman-Wunschアルゴリズム、Burrows-Wheeler Transformに基づくアルゴリズム(例えば、Burrows Wheeler Aligner)、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novoalign(Novocraft Technologies、ELAND(Illumina、カリフォルニア州サンディエゴ)、SOAP(soap.genomics.org.cnで入手可能)、及びMaq(maq.sourceforge.netで入手可能)が挙げられる。
3)、Acidovorax ebreus Cas9(配列番号854)、酸性鉱山排水細菌Ga0052161_JGI Cas9(配列番号855)、S.pyogenes Cas9ヌル変異体D10A及びH840A(配列番号1027)、ならびにウラン鉱山細菌FW106_JGI Cas9(配列番号856)から選択される。
標識した(化合物53を反応物として使用、さらなる詳細は実験部分を参照のこと)S.pyogenes Cas9変異体M1C及びC80S(アミノ酸配列)-3NLSならびにmCherry(配列番号1015)を指す:
9タンパク質であり、Y-は、負に荷電したCas9リボ核タンパク質、負に荷電したs
gRNA、またはCRISPR RNA(crRNA)及びトランス活性型crRNA(tracrRNA)を含む負に荷電したデュアルガイドRNA配列である。
電したCas9タンパク質であり、Y-は、負に荷電したCas9リボ核タンパク質、負
に荷電したsgRNA、またはCRISPR RNA(crRNA)及びトランス活性型crRNA(tracrRNA)を含む負に荷電したデュアルガイドRNA配列である。
では、R2は、-NH-C(O)-CH3である。
R1は、-Z-X-Yであり、L1~L10からなる群から選択される:
基は、各々独立して、-O-、-S-、及び-N(R4)-から独立して選択されるヘテ
ロ原子基と交換されてもよく、該ヘテロ原子基は、少なくとも2つの炭素原子で離間されており、該アルキレン、アルケニレン、及びアルキニレンは、各々独立して、1つ以上のハロ原子で置換されてもよく、
各Qは、独立して、存在しないか、またはC(O)、C(O)-NR4、NR4-C(O)、O-C(O)-NR4、NR4-C(O)-O、-CH2-、ヘテロアリール、もしくは
O、S、S-S、S(O)、S(O)2、及びNR4から選択されるヘテロ原子基であり、少なくとも2つの炭素原子が該ヘテロ原子基O、S、S-S、S(O)、S(O)2、及
びNR4を任意の他のヘテロ原子基から離間し、
各R4は、独立して、-H、-(C1-C20)アルキル、-(C1-C20)アルケニル、-
(C1-C20)アルキニル、または(C3-C6)シクロアルキルであり、少なくとも2つ
の炭素原子で離間された該アルキルまたはシクロアルキルの1~6個の-CH2-基は、
-O-、-S-、または-N(R4)-と交換されてもよく、該アルキルの-CH3は、-N(R4)2、-OR4、及び-S(R4)から選択されるヘテロ原子基と交換されてもよく、該ヘテロ原子基は、少なくとも2つの炭素原子で離間されており、該アルキル、アルケ
ニル、アルキニル、及びシクロアルキルは、ハロ原子で置換されてもよく、
各mは、独立して、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40である。いくつかの実施形態では、Qは、独立して、1H-1,2,3-トリアゾリル、ピリジニル、及び1,2,3,4-テトラゾリルから選択されるヘテロアリールである。
式中、
nは1、2、または3であり、
Wは、存在しないか、またはペプチドであり、
Lは、-(T-Q-T-Q)m-であり、
各Tは、独立して、存在しないか、または(C1-C10)アルキレン、(C2-C10)アルケニレン、もしくは(C2-C10)アルキニレンであり、該Tの1つ以上の炭素基は、各
々独立して、-O-、-S-、及び-N(R4)-から独立して選択されるヘテロ原子基
と交換されてもよく、該ヘテロ原子基は、少なくとも2つの炭素原子で離間されており、該アルキレン、アルケニレン、及びアルキニレンは、各々独立して、1つ以上のハロ原子で置換されてもよく、
各Qは、独立して、存在しないか、またはC(O)、C(O)-NR4、NR4-C(O)、O-C(O)-NR4、NR4-C(O)-O、-CH2-、ヘテロアリール、もしくは
O、S、S-S、S(O)、S(O)2、及びNR4から選択されるヘテロ原子基であり、少なくとも2つの炭素原子が該ヘテロ原子基O、S、S-S、S(O)、S(O)2、及
びNR4を任意の他のヘテロ原子基から離間し、
各R4は、独立して、-H、-(C1-C20)アルキル、-(C1-C20)アルケニル、-
(C1-C20)アルキニル、または(C3-C6)シクロアルキルであり、少なくとも2つ
の炭素原子で離間された該アルキルまたはシクロアルキルの1~6個の-CH2-基は、
-O-、-S-、または-N(R4)-と交換されてもよく、該アルキルの-CH3は、-N(R4)2、-OR4、及び-S(R4)から選択されるヘテロ原子基と交換されてもよ
く、該ヘテロ原子基は、少なくとも2つの炭素原子で離間されており、該アルキル、アルケニル、アルキニル、及びシクロアルキルは、ハロ原子で置換されてもよく、
各mは、独立して、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40であり、
その他の部分は、式(A-1)、(A-2)、または(A-3)で定義される通りである。
式中、
nは1、2、または3であり、
Wは、存在しないか、またはペプチドであり、
Lは、-(T-Q-T-Q)mであり、
各Tは、独立して、存在しないか、または(C1-C10)アルキレン、(C2-C10)アルケニレン、もしくは(C2-C10)アルキニレンであり、該Tの1つ以上の炭素基は、各
々独立して、-O-、-S-、及び-N(R4)-から独立して選択されるヘテロ原子基
と交換されてもよく、該ヘテロ原子基は、少なくとも2つの炭素原子で離間されており、該アルキレン、アルケニレン、アルキニレンは、各々独立して、1つ以上のハロ原子で置換されてもよく、
各Qは、独立して、存在しないか、またはC(O)、C(O)-NR4、NR4-C(O)、O-C(O)-NR4、NR4-C(O)-O、-CH2-、ヘテロアリール、もしくは
O、S、S-S、S(O)、S(O)2、及びNR4から選択されるヘテロ原子基であり、少なくとも2つの炭素原子が該ヘテロ原子基O、S、S-S、S(O)、S(O)2、及
びNR4を任意の他のヘテロ原子基から離間し、
各R4は、独立して、-H、-(C1-C20)アルキル、-(C1-C20)アルケニル、-
(C1-C20)アルキニル、または(C3-C6)シクロアルキルであり、少なくとも2つ
の炭素原子で離間された該アルキルまたはシクロアルキルの1~6個の-CH2-基は、
-O-、-S-、または-N(R4)-と交換されてもよく、該アルキルの-CH3は、-N(R4)2、-OR4、及び-S(R4)から選択されるヘテロ原子基と交換されてもよく、該ヘテロ原子基は、少なくとも2つの炭素原子で離間されており、該アルキル、アルケニル、アルキニル、及びシクロアルキルは、ハロ原子で置換されてもよく、
各mは、独立して、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40であり、
その他の部分は、式(B)で定義される通りである。
番号1029)、GLFHAIAHFIHGGWHGLIHGWYG(配列番号862)、及びそれらの誘導体から選択されるがこれに限定されないエンドソーム溶解ヒスチジンリッチペプチドを含むペプチドである。
配列番号869)、JST-1、GLFEALLELLESLWELLLEA(配列番号870)、ppTG1、GLFKALLKLLKSLWKLLLKA(配列番号871)、ppTG20、GLFRALLRLLRSLWRLLLRA(配列番号872)、及びそれらの誘導体から選択されるがこれに限定されない膜融合ペプチドを含むペプチドである。
4’炭素間にメチレン架橋を含むロックド核酸(LNA)ヌクレオチドの使用、リボース糖の2’位での化学修飾(例えば、RNA類似体の使用は、2’-O-メチルRNA、2’-O-メトキシエチル(2’-MOE)RNA、及び2’-フルオロRNAを含む)、リボース環の4’炭素に結合した酸素の代わりにイオウ原子を導入することによる4’-チオ位の修飾、リボジフルオロトルイル(rF)ヌクレオチドの導入、及びPNAまたはモルホリノモノマーの導入が挙げられるがこれらに限定されない。
PCSK9 crRNA配列1:
GGUGCUAGCCUUGCGUUCCGGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号885)、任意に、最後の4塩基の最初の3つ(GCU)の任意の1つ以上に2’-O-メチルまたは2’-Fの修飾を含む、
PCSK9 crRNA配列2:
CGUGCUCGGGUGCUUCGGCCGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号886)、任意に、最後の4塩基の最初の3つ(GCU)の任意の1つ以上に2’-O-メチルまたは2’-Fの修飾を含む、
PCSK9 crRNA配列3:
GCCGUCCUCCUCGGAACGCAGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列
番号887)、任意に、最後の4塩基の最初の3つ(GCU)の任意の1つ以上に2’-O-メチルまたは2’-Fの修飾を含む、
PCSK9 crRNA配列4:
GGACGAGGACGGCGACUACGGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号888)、任意に、最後の4塩基の最初の3つ(GCU)の任意の1つ以上に2’-O-メチルまたは2’-Fの修飾を含む、
PCSK9 crRNA配列5:
ACCACCGGGAAAUCGAGGGCGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号889)、任意に、最後の4塩基の最初の3つ(GCU)の任意の1つ以上に2’-O-メチルまたは2’-Fの修飾を含む、
PCSK9 crRNA配列6:
CGACUUCGAGAAUGUGCCCGGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号890)、任意に、最後の4塩基の最初の3つ(GCU)の任意の1つ以上に2’-O-メチルまたは2’-Fの修飾を含む、
PCSK9 crRNA配列7:
GAGUGACCACCGGGAAAUCGGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号891)、任意に、最後の4塩基の最初の3つ(GCU)の任意の1つ以上に2’-O-メチルまたは2’-Fの修飾を含む、
PCSK9 crRNA配列8:
CUCGGGCACAUUCUCGAAGUGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号892)、任意に、最後の4塩基の最初の3つ(GCU)の任意の1つ以上に2’-O-メチルまたは2’-Fの修飾を含む、
PCSK9 crRNA配列9:
GGAAGCCAGGAAGAAGGCCAGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号893)、任意に、最後の4塩基の最初の3つ(GCU)の任意の1つ以上に2’-O-メチルまたは2’-Fの修飾を含む、
PCSK9 crRNA配列10:
UCUUUGCCCAGAGCAUCCCGGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号894)、任意に、最後の4塩基の最初の3つ(GCU)の任意の1つ以上に2’-O-メチルまたは2’-Fの修飾を含む、及び
PCSK9 crRNA配列11:
CUAGGAGAUACACCUCCACCGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号895)、任意に、最後の4塩基の最初の3つ(GCU)の任意の1つ以上に2’-O-メチルまたは2’-Fの修飾を含むものであって、該crRNAは、任意にさらに化学的に修飾されてもよいものから選択される配列に対して、少なくとも約75パーセント、少なくとも約80パーセント、少なくとも約85パーセント、少なくとも約90パーセント、少なくとも約95パーセント、少なくとも約96パーセント、少なくとも約97パーセント、少なくとも約98パーセント、少なくとも約99パーセント、または100パーセントのヌクレオチド配列同一性である配列を含む。
PCSK9 crRNA配列1:
GGUGCUAGCCUUGCGUUCCGGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号885)、任意に、最後の4塩基の最初の3つ(GCU)に2’-O-メチルまたは2’-Fの修飾を含む、
PCSK9 crRNA配列2:
CGUGCUCGGGUGCUUCGGCCGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号886)、任意に、最後の4塩基の最初の3つ(GCU)に2’-O-メチルまたは2’-Fの修飾を含む、
PCSK9 crRNA配列3:
GCCGUCCUCCUCGGAACGCAGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号887)、任意に、最後の4塩基の最初の3つ(GCU)に2’-O-メチルまたは2’-Fの修飾を含む、
PCSK9 crRNA配列4:
GGACGAGGACGGCGACUACGGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号888)、任意に、最後の4塩基の最初の3つ(GCU)に2’-O-メチルまたは2’-Fの修飾を含む、
PCSK9 crRNA配列5:
ACCACCGGGAAAUCGAGGGCGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号889)、任意に、最後の4塩基の最初の3つ(GCU)に2’-O-メチルまたは2’-Fの修飾を含む、
PCSK9 crRNA配列6:
CGACUUCGAGAAUGUGCCCGGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号890)、任意に、最後の4塩基の最初の3つ(GCU)に2’-O-メチルまたは2’-Fの修飾を含む、
PCSK9 crRNA配列7:
GAGUGACCACCGGGAAAUCGGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号891)、任意に、最後の4塩基の最初の3つ(GCU)に2’-O-メチルまたは2’-Fの修飾を含む、
PCSK9 crRNA配列8:
CUCGGGCACAUUCUCGAAGUGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号892)、任意に、最後の4塩基の最初の3つ(GCU)に2’-O-メチルまたは2’-Fの修飾を含む、
PCSK9 crRNA配列9:
GGAAGCCAGGAAGAAGGCCAGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号893)、任意に、最後の4塩基の最初の3つ(GCU)に2’-O-メチルまたは2’-Fの修飾を含む、
PCSK9 crRNA配列10:
UCUUUGCCCAGAGCAUCCCGGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号894)、任意に、最後の4塩基の最初の3つ(GCU)に2’-O-メチルまたは2’-Fの修飾を含む、及び
PCSK9 crRNA配列11:
CUAGGAGAUACACCUCCACCGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号895)、任意に、最後の4塩基の最初の3つ(GCU)に2’-O-メチルまたは2’-Fの修飾を含むものであって、該crRNAは、任意にさらに化学的に修飾されてもよいものから選択される配列に対して、少なくとも約75パーセント、少なくとも約80パーセント、少なくとも約85パーセント、少なくとも約90パーセント、少なくとも約95パーセント、少なくとも約96パーセント、少なくとも約97パーセント、少なくとも約98パーセント、少なくとも約99パーセント、または100パーセントのヌクレオチド配列同一性である配列を含む。
%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%である。
PCSK9シングルガイドRNA配列1:
GGUGCUAGCCUUGCGUUCCGGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号896)、
PCSK9シングルガイドRNA配列2:
CGUGCUCGGGUGCUUCGGCCGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号897)、
PCSK9シングルガイドRNA配列3:
GCCGUCCUCCUCGGAACGCAGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号898)、
PCSK9ガイドRNA配列4:
GGACGAGGACGGCGACUACGGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号899)、
PCSK9シングルガイドRNA配列5:
ACCACCGGGAAAUCGAGGGCGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号900)、
PCSK9シングルガイドRNA配列6:
CGACUUCGAGAAUGUGCCCGGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号901)、
PCSK9シングルガイドRNA配列7:
GAGUGACCACCGGGAAAUCGGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号902)、
PCSK9シングルガイドRNA配列8:
CUCGGGCACAUUCUCGAAGUGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号903)、
PCSK9シングルガイドRNA配列9:
GGAAGCCAGGAAGAAGGCCAGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号904)、
PCSK9シングルガイドRNA配列10:
UCUUUGCCCAGAGCAUCCCGGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号905)、
PCSK9シングルガイドRNA配列11:
CUAGGAGAUACACCUCCACCGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号906)、
EMX1シングルガイドRNA配列:
GUCACCUCCAAUGACUAGGGGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号907)、
ROSA26シングルガイドRNA配列:
CGAACCCUACACAUUCAACGGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号908)からなる群から選択される配列であって、任意に化学的に修飾される配列に対して、少なくとも約75パーセント、少なくとも約80パーセント、少なくとも約85パーセント、少なくとも約90パーセント、少なくとも約95パーセント、少なくとも約96パーセント、少なくとも約97パーセント、少なくとも約98パーセント、少なくとも約99パーセント、または100パーセントのヌクレオチド配列同一性を有する。
EMX1 crRNA配列(Asp Cpf1):
UAAUUUCUACUCUUGUAGAUUCAUCUGUGCCCCUCCCUCCCUG(配列番号909)、
EMX1 crRNA配列(Lba Cpf1):
UAAUUUCUACUCUAAGUAGAUUCAUCUGUGCCCCUCCCUCCCUG(配列番号910)、
PCSK9 crRNA配列12(Asp Cpf1):
UAAUUUCUACUCUUGUAGAUCCCAGAGCAUCCCGUGGAACCUG(配列番号911)、
PCSK9 crRNA配列12(Lba Cpf1):
UAAUUUCUACUCUAAGUAGAUCCCAGAGCAUCCCGUGGAACCUG(配列番号912)、
PCSK9 crRNA配列13(Asp Cpf1):
UAAUUUCUACUCUUGUAGAUCCGGUGGUCACUCUGUAUGCUGG(配列番号913)、及び
PCSK9 crRNA配列13(Lba Cpf1):
UAAUUUCUACUCUAAGUAGAUCCGGUGGUCACUCUGUAUGCUGG(配列番号914)から選択される配列であって、任意に化学的に修飾される配列に対して、少なくとも約75パーセント、少なくとも約80パーセント、少なくとも約85パーセント、少なくとも約90パーセント、少なくとも約95パーセント、少なくとも約96パーセント、少なくとも約97パーセント、少なくとも約98パーセント、少なくとも約99パーセント、または100パーセントのヌクレオチド配列同一性である配列を含む。
RRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV、筋腫Tタンパク質の配列VSRKRPRP(配列番号836)及びPPKKARED(配列番号837)、ヒトp53の配列PQPKKKPL(配列番号838)、マウスc-abl IVの配列SALIKKKKKMAP(配列番号839)、インフルエンザウイルスNS1の配列DRLRR(配列番号840)及びPKQKKRK(配列番号841)、デルタ型肝炎ウイルス抗原の配列RKLKKKIKKL(配列番号842)、マウスMx1タンパク質の配列REKKKFLKRR(配列番号843)、ヒトポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼの配列KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(配列番号844)、ステロイドホルモン受容体(ヒト)グルココルチコイドの配列RKCLQAGMNLEARKTKK(配列番号845)、配列MAPKKKRKVGIHRGVP(配列番号1035)、ならびに配列PKKKRKVEDPKKKRKVD(配列番号1036)由来のNLS配列から選択されるがこれに限定されない。Yが2つ以上のNLSを含む実施形態では、2つのNLSの各々の間には任意に介在アミノ酸配列が存在してもよい。かかる介在配列は、1つ以上のアミノ酸残基を含んでよい。いくつかの実施形態では、Yは2つのNLSを含み、各々がアミノ酸配列PKKKRKV(配列番号830)を含む。Yは3つのNLSを含み、各々がアミノ酸配列PKKKRKV(配列番号830)を含む。
かの実施形態では、Yは、S.pyogenes Cas9(野生型)(配列番号848)、S.pyogenes Cas9変異体M1C(配列番号849)、S.pyogenes Cas9変異体M1C及びC80S(配列番号850)、S.pyogenes
Cas9ニッカーゼ変異体D10A(配列番号851)、S.pyogenes Cas9ニッカーゼ変異体H840A(配列番号852)、S.pyogenes Cas9ニッカーゼ変異体E923P及びT924P(配列番号853)、Acidovorax
ebreus Cas9(配列番号854)、酸性鉱山排水細菌Ga0052161_JGI Cas9(配列番号855)、S.pyogenes Cas9ヌル変異体D10A及びH840A(配列番号1027)、ならびにウラン鉱山細菌FW106_JGI
Cas9(配列番号856)から選択される配列に対して、少なくとも約75パーセント、少なくとも約80パーセント、少なくとも約85パーセント、少なくとも約90パーセント、少なくとも約95パーセント、少なくとも約96パーセント、少なくとも約97パーセント、少なくとも約98パーセント、少なくとも約99パーセント、または100パーセントのアミノ酸配列同一性であるCas9タンパク質を含む。
スラミン、チオリダジン、チロロン、トリブチルアミン、フマル酸ケトチフェン、グリセロール、及びスクロースが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、リソソーム作用剤は、クロロキン、グリセロール、またはスクロースである。
LAEHLAEALAEALEALAA(配列番号868)、KALAペプチド、WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA(配列番号869)、JST-1、GLFEALLELLESLWELLLEA(配列番号870)、ppTG1、GLFKALLKLLKSLWKLLLKA(配列番号871)、ppTG20、GLFRALLRLLRSLWRLLLRA(配列番号872)、及びそれらの誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、該エンドソーム脱出剤は、KALAペプチド、WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA(配列番号869)を含む。
、H5WYG(配列番号1029)、GLFHAIAHFIHGGWHGLIHGWYG(配列番号862)、及びそれらの誘導体から選択されるがこれに限定されないエンドソーム溶解ヒスチジンリッチペプチドを含む。いくつかの実施形態では、該エンドソーム脱出剤は、H5WYG(配列番号1029)、またはGLFHAIAHFIHGGWHGLIHGWYG(配列番号862)のペプチドを含む。
本発明の化合物は、化学分野で周知のものと類似の過程を含む合成経路によって、とりわけ、本明細書に含まれる説明に照らして合成され得る。出発物質は、概して、Aldrich Chemicals(ウィスコンシン州ミルウォーキー)等の商業的供給源から入手可能であるか、または、当業者に周知の方法を用いて容易に調製される(例えば、Louis F.Fieser and Mary Fieser,Reagents for Organic Synthesis,v.1-19,Wiley, New York(1967-1999 ed.)、または付録を含めたBeilsteins Handbuch der organischen Chemie,4,Aufl.ed.Springer-Verlag,Berlin(バイルシュタインのオンラインデータベースでも入手可能)に一般的に記載の方法によって調製される)。
、ベンジル(Bn)、パラ-メトキシベンジル(PMB)、トリチル(Tr)、パラ-ブロモベンゾイル、パラ-ニトロベンゾイル、及び同類のもの(1,2-または1,3-ジオールを保護するためのベンジリデン、環状ケタール、オルソエステル、オルソアミド)が挙げられる。かかる保護の必要性は、当業者によって容易に判断される。保護基及びそれらの使用の概要については、T.W.Greene,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley&Sons,New York,1991を参照されたい。
William v. E.Doering in Journal of the American Chemical Society,89, 5505-5507(1967)に記載のParikh-Doering酸化と、それに続いて、水中またはアルコール溶媒中、ほぼ室温~約60℃に及ぶ温度で、アルカリ金属水酸化物(例えば、水酸化ナトリウム、ナトリウムアルコキシド)の存在下、ホルムアルデヒド源(例えば、ホルムアルデヒド水溶液、固体パラホルムアルデヒド)との反応によって、このグリコシドに導入することができる。これは、アルドール・カニッツァーロ反応と呼ばれる。当業者に知られる本過程の改変形態を同様に使用してもよい。例えば、他の酸化剤、例えば、Ozanne,A.et al.in Organic Letters,5, 2903(2003)に記載の安定化された2-ヨードキシ安息香酸、Kanji Omura and Daniel Swern in Tetrahedron,34, 1651(1978)に記載のスワーン酸化、ならびに当業者に知られる他の酸化剤も同様に使用することができる。アルドール・カニッツァーロシーケンスは、Robert Schafferによりthe Journal of The American Chemical Society,81, 5452(1959)にて、及びAmigues,E.J.によりTetrahedron,63, 10042(2007)にて記載されている。スキーム1のステップ2の実験条件はまた、二級アルコールを保護するトリメチルシリル基の開裂も促進する。スキーム1のステップ3では、中間体(I-c)を、水等の溶媒中、ほぼ室温から約100℃に及ぶ温度で、有機もしくは無機酸(例えば、硫酸)または酸性樹脂と反応させ、化合物(1)を得る。スキーム1のステップ4では、化合物(1)を、アジド基を対応するアミンに還元することが既知の還元剤と反応させることができる(例えば、遷移金属媒介接触水素化、当業者に周知の古典的実験条件下、水中でトリフェニルホスフィン使用)。その後、アシル化剤の存在下での反応(例えば、無水酢酸または塩化アセチル、0~80℃に及ぶ温度で、ジクロロメタンもしくはテトラヒドロフラン等の溶媒中、ピリジンもしくはトリエチルアミンの存在下)で化合物(2)を得る。
スキーム1のステップ5では、約0~室温に及ぶ温度で、アルコール溶媒もしくはテトラヒドロフラン等の溶媒または溶媒混合物中、アルコキシド(例えば、ナトリウムメトキシド)の存在下での化合物(2)の反応で化合物(3)を得る。さらに、このようにして得られた化合物は、その後、当業者に知られる周知の保護及び官能基の操作順序を用いて、本発明の他の請求項にかかる化合物に容易に官能化することができる。従って、スキーム1のステップ6及び7では、それぞれ化合物(1)及び(3)の二級ヒドロキシル基をさらに適切な保護基で保護し(例えば、ほぼ室温~約90℃に及ぶ温度で、N,N-ジメチルホルムアミド等の溶媒中、酸性条件下での2,2-ジメトキシプロパンとの反応による
環状ケタールとして)、(I-d)及び(I-e)等の中間体を得ることができる。次に、当業者に周知の合成変換ならびに官能基及び保護基の操作を用いて、(I-d)及び(I-e)をさらなる官能化及び一級ヒドロキシル基の誘導体化のために準備し、目的の所望のリンカーX及びリガンドYを連結し、本発明の請求項にかかるXY含有化合物を製造する。二級ヒドロキシル基を現すために当技術分野で周知の試薬及び条件を用いた保護基(例えば、Pg)の除去(例えば、2つのPgがアセトニド等の環状ケタールを形成する場合、酢酸、アルコール溶媒、水、テトラヒドロフラン等の溶媒または溶媒混合物中、酢酸等の酸を用いた酸性条件下、室温~約80℃に及ぶ温度で、それを除去することができる)で、本発明の請求項にかかるXY含有化合物に至る。例えば、保護基の操作及び除去の後、(I-e)の一級ヒドロキシル基のアルキル化で、本発明の請求項にかかる対応するエーテル結合のXY含有化合物をもたらすことができる。本発明の請求項にかかるエステル結合、カーボネート結合、及びカルバメート結合のXY含有化合物も同様に、(3)または中間体(I-e)から、当業者に周知の適切な反応物及び試薬を用いて簡便に得ることができる。(I-e)の一級ヒドロキシル基の対応するトリフレート(III-e-1)への転換、それに続く適切な求核剤での求核置換により、保護基の操作及び除去の後に、本発明の請求項にかかる対応するエーテル及びチオエーテル結合のXY含有化合物をもたらすことができる。また、このチオエーテル中間体の酸化で、本発明の請求項にかかる対応するスルホキシド及びスルホン結合のXY含有化合物をもたらすことができる。さらに、(III-e-1)の一級トリフレートのチオ酢酸カリウムによる置換と、それに続くチオエステルの加水分解で、対応するチオール(III-e-2)を与えることができ、これは、保護基の操作及び除去の後、化合物(IV-e-1)を与え、チオール(III-e-2)のさらなるアルキル化ならびに保護基の操作及び除去で、本発明の請求項にかかるチオエーテル結合のXY含有化合物を製造することができる。(III-e-2)はまた、対応するスルホニルクロリドに転換し、適切なアミンと反応させ、保護基の操作及び除去の後に本発明のスルホンアミド結合のXY含有化合物を製造することができる。この一級トリフレート(III-e-1)はまた、アジ化ナトリウムで置換することで、対応するアジド含有化合物(III-e-3)を製造することができ、これは保護基の操作及び除去の後、化合物(IV-e-2)を与える。化合物(III-e-3)の還元で、保護基の操作及び除去の後に、XY置換基を連結し、本発明の請求項にかかる化合物を製造するためのさらなる官能化(例えば、アミド結合形成、還元的アミノ化、スルホンアミド形成、尿素形成、カルバメート形成等)のための対応する一級アミン(III-e-4)を製造することができる。(III-e-4)はまた、保護基の操作及び除去の後、本発明の化合物(IV-e-3)を製造することができる。上記アジド中間体(III-e-3)とアルキンまたはニトリル含有試薬もしくは合成中間体との反応と、それに続く、当業者に周知の条件下での保護基の操作及び除去で、それぞれ、本発明の請求項にかかるトリアゾールまたはテトラゾール結合のXY含有化合物を製造することができる。
(I-e)の一級ヒドロキシル基の、対応するアルデヒド(III-e-d)への酸化と、それに続く当業者に既知の古典的条件下での適切なアミンでの還元的アミノ化、またはオレフィン化(例えば、ウィッティヒ、ホーナー・ワズワース・エモンズ、ピーターソン、ジュリア型及びそれらの改良されたもの)、それに続く形成されたオレフィンの還元(例えば、当業者に周知の金属媒介接触水素化またはジイミド介在還元を用いて)で、それぞれ、官能基の操作及び保護基の操作ならびに除去の後、本発明の請求項にかかる所望の窒素または炭素結合のXY含有化合物をもたらすことができる。このアルデヒド(III-e-5)の対応するアルキン(III-e-6)への転換(コーリー・フックス型反応を用いて、またはセイファース・ギルバート型試薬を用いて)と、それに続く保護基の操作及び除去で、化合物(IV-e-4)をもたらすことができる。次に、アルキン(III-e-6)または(IV-e-4)とアジド含有試薬または合成中間体との反応と、それに続く当業者に周知の条件下での保護基の操作及び除去で、同様に、本発明の請求項にかかるトリアゾール結合のXY含有化合物を製造することができる。アルキン(III-e-6)はまた、有用な合成中間体としても機能し、当業者に知られる金属媒介クロスカ
ップリング(例えば、薗頭型反応)下、適切な試薬との反応により、本発明の請求項にかかる他の化合物を得ることができる。当業者に周知の合成変換を用いた、(I-e)の一級ヒドロキシル基の対応する酸(III-e-7)への酸化は、保護基の除去の後、本発明の請求項にかかるエステル及びアミド結合のXY含有化合物の入手法を与える。(III-e-7)の保護基の操作及び除去はまた、容易に化合物(IV-e-5)への入手法を与える。当業者に周知の条件下、(IV-e-5)または(III-e-7)の対応する一級アミドへの転換は、直接化合物(IV-e-6)を、または、保護基の操作及び除去の後に(IV-e-6)を与える化合物(III-e-8)を与える。さらに、(III-e-8)のアミド官能基の脱水で、対応するニトリル(III-e-9)を与えることができ、これは、官能基の操作及び除去の後、化合物(IV-e-7)を与える。一級トリフレート(III-e-1)のシアン化物アニオンでの置換で同様に、対応するニトリル含有化合物(III-e-10)を製造することができ、これは保護基の操作及び除去の後、化合物(IV-e-8)を与える。次に、(IV-e-8)または(III-e-10)のニトリルの加水分解で、直接酸(IV-e-9)への、または、保護基の操作及び除去の後、(IV-e-9)を与える(III-e-11)の入手法を与えることができる。
(III-e-6)/(IV-e-4)等のアルキン含有化合物、(III-e-8)/(IV-e-6)等の一級アミド含有化合物、(III-e-9)/(IV-e-7)/(III-e-10)/(IV-e-8)等のニトリル含有化合物、(III-e-7)/(IV-e-5)/(III-e-11)/(IV-e-9)等の酸含有化合物、(III-e-5)等のアルデヒド含有化合物もまた、さらに官能化し、適切な試薬及び合成中間体と当業者に周知の(及び、J.A.Joule and K.Mills,Heterocyclic Chemistry,5thedition,Wiley Ed.,(2010)、J.J.Li,Name Reactions in heterocyclic chemistry,Wiley,(2005)、M.R.Grimmett
Advances in Heterocyclic Chemistry,27, 241,(1981)、I.G.Turchi et al.,Chemical Reviews,75, 389,(1975)、K.T.Potts,Chemical Reviews,61, 87,(1961)、R.H.Wiley,Organic Reactions,6, 367,(1951)、L.B.Clapp,Advances in Heterocyclic Chemistry,20, 65,(1976)、A.Hetzheim et al.,Advances in Heterocyclic Chemistry,7, 183,(1967)、J.Sandstrom,Advances in Heterocyclic Chemistry,9, 165,(1968)、S.J.Wittenberger,Organic Preparations and Procedures International,26, 499,(1994)、M.G.Finn et al.,Angewandte Chemie International Edition,48, 9879,(2009)に要約された)条件下で反応させ、本発明の請求項にかかるさらなる5員環及び6員環(例えば、イソオキサゾール、イソチアゾール、ピラゾール、オキサゾール、チアゾール、イミダゾール、1,2,4-オキサジアゾール、1,2,4-チアジアゾール、1,2,4-トリアゾール、1,3,4-オキサジアゾール、1,3,4-チアジアゾール、テトラゾール、1,2,3-トリアゾール)結合のXY含有化合物を製造することができる。本発明の請求項にかかるアリール環結合のXY含有化合物も同様に、(III-e-6)及び(IV-e-4)等のアルキンから、または、これらアルキンのヘテロ置換類似体(すなわち、(III-e-6)/(IV-e-4)のアルキン水素をOR4、N
(R4)2、SR4で置換することによる。これらの化合物は、当業者に知られる条件及び
試薬を用いて得ることができる)から、当業者に知られるベンズアヌレーション反応(例えば、ダンハイザー型またはデッツ型ベンズアヌレーション)を介して得ることができる。
合、本発明の化合物を、当業者に知られる条件下、さらに官能化、反応、及び配合させ、本発明の請求項にかかるさらなる化合物を得ることができ、これらを、肝選択的薬物送達システム、例えば、生分解性PLGA-b-PEGポリマーナノ粒子(Erica Locatelli et al.,Journal of Nanoparticle Research,14, 1316,(2012)参照)及び脂質ベースのプラットフォーム、例えば、リポソーム、脂質ナノ粒子、安定な核酸脂質ナノ粒子(SaraFalsini et al.,Journal of Medicinal Chemistry,57, 1138(2014)参照)の処方に用い、組み込むことができる。
的相違に基づいて、当業者に周知の方法により、例えば、クロマトグラフィー及び/または分別結晶、蒸留、昇華により分割することができる。エナンチオマーは、エナンチオマー混合物を、適切な光学活性化合物(例えば、キラルアルコールやモッシャー酸クロリド等の不斉補助剤)との反応でジアステレオマー混合物に転換し、これらのジアステレオマーを分割し、個々のジアステレオマーを対応する純粋なエナンチオマーに転換することによって分割することができる。また、本発明の化合物のいくつかは、アトロプ異性体(例えば、置換ビアリール)である場合があり、これらは本発明の一部と見なされる。エナンチオマーはまた、キラルHPLC(高圧液体クロマトグラフィー)カラムの使用によっても分割することができる。
「ASGPRL」または「ASGPrL」は、アシアロ糖タンパク質受容体のためのリガンドまたはそのデンドリマー、例えば、本発明に記載の化合物として指す。
化合物及び/または基質の組織分布アッセイに有用である。トリチウム(すなわち、3H
)及び炭素14(すなわち、14C)同位体は、それらの調製の容易さ及び検出能のために特に好ましい。さらに、重水素(すなわち、2H)等の重同位体での置換は、代謝安定性
がより高いことに起因するある特定の治療上の利点(例えば、インビボ半減期の延長または必要用量の減少)をもたらし、それ故、いくつかの状況で好ましい場合がある。陽電子放出同位体、例えば、15O、13N、11C、及び18Fは、基質占有率を調べる陽電子放出断層撮影(PET)研究に有用である。本発明の同位体標識化合物は、通常、非同位体標識試薬を同位体標識試薬に置き換えることにより、本明細書で以下のスキーム及び/または実施例に開示するものと類似の以下の手順によって調製することができる。
本発明の別の態様は、本明細書に記載の化合物及び本明細書に記載のエンドソーム脱出剤を含む組成物を提供する。かかる組成物のいくつかの実施形態では、該化合物は、該エンドソーム脱出剤と共インキュベートされ、該組成物を形成する。
本発明の化合物及び組成物は、疾患、状態、及び/または障害の治療に有用である。従って、本発明の別の実施形態は、本発明の治療有効量の化合物、もしくはエンドソーム脱出剤含有組成物、及び医薬的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を含む医薬組成物である。本発明の化合物(本明細書で使用される組成物及び過程を含む)は、本明細書に記載の治療用途のための薬剤の製造にも使用される場合がある。
kg~約100mg/kg、約1.0mg/kg~約50mg/kg、約5.0mg/kg~約20mg/kg、または約15mg/kgである。本発明の目的では、平均的なヒト対象は、体重約70kgである。本明細書で言及する投与量のいずれかの中間にある範囲、例えば、約0.02mg/kg~199mg/kgもまた、本発明の一部であることが意図される。例えば、上限及び/または下限として列挙された値のいずれかの組合せを用いた値の範囲が含まれることが意図される。
本出願の化合物及び組成物は、様々な疾患または状態の治療に有用である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物及び組成物は、遺伝性血管浮腫、家族性チロシン血症I型、アラジール症候群、アルファ-1アンチトリプシン欠損症、胆汁酸合成及び代謝異常、胆道閉鎖症、嚢胞性線維症肝疾患、特発性新生児肝炎、ミトコンドリア性肝障害、進行性家族性肝内胆汁うっ滞、原発性硬化性胆管炎、トランスサイレチンアミロイドーシス、血友病、ホモ接合性家族性高コレステロール血症、家族性カイロミクロン血症、高脂血症、脂肪性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)、II型糖尿病のような高血糖、ならびにII型糖尿病に類似した異常に高い肝臓グルコース産生を伴う疾患が挙げられるがこれらに限定されない、対象における肝臓疾患もしくは状態、または肝臓変調疾患もしくは状態の治療に有用である。
ることを含む、遺伝性血管浮腫、家族性チロシン血症I型、アラジール症候群、アルファ-1アンチトリプシン欠損症、胆汁酸合成及び代謝異常、胆道閉鎖症、嚢胞性線維症肝疾患、特発性新生児肝炎、ミトコンドリア性肝障害、進行性家族性肝内胆汁うっ滞、原発性硬化性胆管炎、トランスサイレチンアミロイドーシス、血友病、ホモ接合性家族性高コレステロール血症、家族性カイロミクロン血症、高脂血症、脂肪性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)、II型糖尿病のような高血糖、ならびにII型糖尿病に類似した異常に高い肝臓グルコース産生を伴う疾患等であるがこれらに限定されない、対象における肝臓疾患もしくは状態、または肝臓変調疾患もしくは状態と関連するタンパク質をコードする核酸分子の編集に有用である。
リ・ドレフュス型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、筋ジストロフィー、大理石骨病、筋萎縮から選択されるがこれに限定されない。いくつかの実施形態では、該神経学的及び神経疾患または障害は、ALS、アルツハイマー病、自閉症、脆弱性X症候群、ハンチントン病及び病様障害、パーキンソン病、レット症候群、統合失調症、セクレターゼ関連疾患、ならびにトリヌクレオチド反復障害から選択されるがこれに限定されない。いくつかの実施形態では、該眼疾患または障害は、加齢黄斑変性、白内障、角膜薄濁及びジストロフィー、先天性扁平角膜、緑内障、レーバー先天黒内障、ならびに黄斑ジストロフィーから選択されるがこれに限定されない。
代謝、シトクロムP450による生体異物の代謝、メタン代謝、フェニルアラニン代謝、プロパン酸代謝、セレノアミノ酸代謝、スフィンゴ脂質代謝、アミノホスホン酸代謝、アンドロゲン及びエストロゲン代謝、アスコルビン酸及びアルダル酸代謝、胆汁酸生合成、システイン代謝、脂肪酸生合成、グルタミン酸受容体シグナル伝達、NRF2媒介酸化ストレス応答、ペントースリン酸経路、ペントースとグルクロン酸の相互変換、レチノール代謝、リボフラビン代謝、チロシン代謝、ユビキノン生合成、バリン、ロイシン、及びイソロイシンの分解、グリシン、セリン、及びスレオニンの代謝、リジン分解、痛み/味覚、痛み、ミトコンドリア機能、ならびに発達神経学から選択されるがこれに限定されない。
RNP等の部位特異的修飾ポリペプチドを含むRNP)及びエンドソーム脱出剤を含む組成物は、対象における標的DNAの転写の選択的調節に有用であり、該DNAは、本明細書に記載の通り、疾患または障害と関連している。いくつかの実施形態では、該標的DNAは、新形成と関連しており、該DNAは、PTEN、ATM、ATR、EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4、Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、AKT、AKT2、AKT3、HIF、HIFla、HIF3a、Met、HRG、Bcl2、PPARアルファ、PPARガンマ、WT1(ウイルムス腫瘍)、FGF受容体ファミリーメンバー(5メンバー:1、2、3、4、5)、CDKN2a、APC、RB(網膜芽細胞腫)、MEN1、VHL、BRCA1、BRCA2、AR(アンドロゲン受容体)、TSG101、IGF、IGF受容体、Igf1(4変異体)、Igf2(3変異体)、Igf1受容体、Igf2受容体、Bax、Bcl2、カスパーゼファミリー(9メンバー:1、2、3、4、6、7、8、9、12)、Kras、Apcから選択される。
キシン1(Cplx1)、Tph1トリプトファンヒドロキシラーゼ、Tph2トリプトファンヒドロキシラーゼ2、ニューレキシン1、GSK3、GSK3a、GSK3b、5-HTT(Slc6a4)、COMT、DRD(Drd1a)、SLC6A3、DAOA、DTNBP1、Dao(Dao1)、Mecp2、BZRAP1、MDGA2、Sema5A、ニューレキシン1、Fragile X(FMR2(AFF2)、FXR1、FXR2、Mglur5)、E1、CHIP、UCH、UBB、Tau、LRP、PICALM、クラステリン、PS1、SORL1、CR1、Vldlr、Uba1、Uba3、CHIP28(Aqp1、アクアポリン1)、Uchl1、Uchl3、APP、x-シヌクレイン、DJ-1、LRRK2、Parkin、PINK1から選択される。
、FMR2、FXR1、FXR2、mGLUR5から選択される。
、AML1、WHSC1L1、NSD3、FLT3、AF1Q、NPM1、NUMA1、ZNF145、PLZF、PML、MYL、STAT5B、AF10、CALM、CLTH、ARL11、ARLTS1、P2RX7、P2X7、BCR、CML、PHL、ALL、GRAF、NF1、VRNF、WSS、NFNS、PTPN11、PTP2C、SHP2、NS1、BCL2、CCND1、PRAD1、BCL1、TCRA、GATA1、GF1、ERYF1、NFE1、ABL1、NQO1、DIA4、NMOR1、NUP214、D9S46E、CAN、CAINから選択される。
、EBS1、LRP5、BMND1、LRP7、LR3、OPPG、VBCH2、CLCN7、CLC7、OPTA2、OSTM1、GL、TCIRG1、TIRC7、OC116、OPTB1、VAPB、VAPC、ALS8、SMN1、SMA1、SMA2、SMA3、SMA4、BSCL2、SPG17、GARS、SMAD1、CMT2D、HEXB、IGHMBP2、SMUBP2、CATF1、SMARD1から選択される。
、RPE65、RP20、AIPL1、LCA4、GUCY2D、GUC2D、LCA1、CORD6、RDH12、LCA3、ELOVL4、ADMD、STGD2、STGD3、RDS、RP7、PRPH2、PRPH、AVMD、AOFMD、VMD2から選択される。
RNP等の部位特異的修飾ポリペプチドを含むRNP)及びエンドソーム脱出剤を含む組成物は、対象における標的DNAの転写の選択的調節に有用であり、該DNAは、本明細書に記載の通り、細胞機能と関連している。
、該DNAは、PRKCE、ROCK1、BID、IRAK1、PRKAA2、EIF2AK2、BAK1、BIRC4、GRK6、MAPK1、CAPNS1、PLK1、AKT2、IKBKB、CAPN2、CDK8、FAS、NFKB2、BCL2、MAP3K14、MAPK8、BCL2L1、CAPN1、MAPK3、CASP8、KRAS、RELA、PRKCD、PRKAA1、MAPK9、CDK2、PIM1、TP53、TNF、RAF1、IKBKG、RELB、CASP9、DYRK1A、MAP2K2、CHUK、APAF1、MAP2K1、NFKB1、PAK3、LMNA、CASP2、BIRC2、TTK、CSNK1A1、BRAF、BAX、PRKCA、SGK、CASP3、BIRC3、PARP1から選択される。
、MAPK9、ABCB1、TRAF2、MAPK14、TNF、RAF1、IKBKG、RELB、MAP3K7、MAP2K2、IL8、JAK2、CHUK、STAT3、MAP2K1、NFKB1、CEBPB、JUN、IL1R1、SRF、IL6から選択される。
3、PRKCD、MAPK9、PIK3C2A、BTK、MAPK14、TNF、RAF1、FYN、MAP2K2、AKT1、PIK3R1、PDPK1、MAP2K1、AKT3、VAV3、PRKCAから選択される。
FOS、NFKB2、PIK3CB、PIK3C3、MAPK8、MAPK3、KRAS、RELA、PIK3C2A、BTK、LCK、RAF1、IKBKG、RELB、FYN、MAP2K2、PIK3R1、CHUK、MAP2K1、NFKB1、ITK、BCL10、JUN、VAV3から選択される。
、RHOA、CCR3、SRC、PPP1CC、MAPK14、NOX1、RAF1、MAP2K2、MAP2K1、JUN、CCL2、PRKCAから選択される。
UK、NFKB1、TLR2、JUNから選択される。
elnから選択される。
NMRスペクトルは、プロトンについて、Varian Unity(商標)400(Varian Inc.、カリフォルニア州パロアルトから入手可能)で室温にて400MHzで記録した。化学シフトは、内部標準としての残留溶媒に対する百万分率(デルタ)で表される。ピーク形状は、次のように示す:s、一重項;d、二重項;dd、二重項の二重項;t、三重項;q、四重項;m、多重項;bsまたはbr.s.、ブロード一重項;2s、2つの一重項;br.d.、ブロード二重項。いくつかの場合では、代表的な1H NMRピークのみ示す。カラムクロマトグラフィーは、ガラスカラムもしくはFl
ash 40 Biotage(商標)カラム(ISC,Inc.、コネチカット州シェルトン)内で、Baker(商標)シリカゲル(40ミクロン、J.T.Baker、ニュージャージー州フィリップスバーグ)またはシリカゲル50(EM Sciences(商標)、ニュージャージー州ギブスタウン)のいずれかで行った。MPLC(中圧液体クロマトグラフィー)は、Teledyne(商標)Isco(商標)からのBiotage(商標)SP精製システムまたはCombiflash(登録商標)Companion(登録商標)を用いて行った。低窒素圧下、Biotage(商標)SNAPカート
リッジKPsilまたはRedisep Rfシリカ(Teledyne(商標)Isco(商標)から)を用いた。特に指定のある場合を除き、すべての反応は、無水溶媒を用い、窒素ガスの不活性雰囲気下で行った。同様に、特に指定のある場合を除き、すべての反応は室温(約23℃)で行った。TLC(薄層クロマトグラフィー)を行う場合、Rf
は、化合物の移動距離を溶離液の移動距離で除した比として定義される。Rt(保持時間
)。H-Cube(登録商標)連続フロー式水素化反応器:連続フローの微量化学と内生的なオンデマンド水素生成及び使い捨て触媒カートリッジシステムとを組み合わせた卓上独立型水素化反応器。
HSS T3、2.1mm×50mm、C18、1.7μm、移動相:A:0.1%ギ酸水溶液(v/v)、移動相B:0.1%ギ酸アセトニトリル溶液(v/v)、流量-1.25ml/分、初期条件:A-95%:B-5%、0.0~0.1分は初期に保持する、0.1~2.6分にかけてA-5%:B-95%まで直線傾斜をかける、2.6~2.95分はA-5%:B-95%で保持する、2.95~3.0分は初期条件に戻す。
(c 1, クロロホルム); 1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d)デル
タ ppm 0.14 (s, 9H), 0.20 (s, 9H), 1.80 (br. s., 1H), 3.36 - 3.42 (m, 1H), 3.45 (dd, J= 7.3, 4.6 Hz, 1H), 3.54 (dd, J=10.0, 8.0 Hz, 1H)
, 3.59 (s, 3H), 3.65 (dd, J=11.3, 4.7 Hz, 1H
), 3.77 (d, J= 2.7 Hz, 1H), 3.87(dd, J=11.2,
7.3 Hz, 1H), 4.14 (d, J= 8.0 Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz, クロロホルム-d)デルタ ppm 0.27 (3C), 0.6 (
3C), 57.3, 62.6, 64.0, 71.1, 73.7, 75.2, 10
3.4; HRMS (ESI) C13H29N3O5Si2 (m/z) [M + Na]+に対
する計算値386.1538,実測値386.1539.
、ジクロロメタンで希釈した。水相をジクロロメタンで3回抽出し、合わせた有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、濃縮して、対応するアルデヒドを得た。このアルデヒドを無水エタノール(106mL)に溶解し、パラホルムアルデヒド粉末(40.3g、425mmol)、続いてナトリウムエトキシドの21重量%エタノール溶液(16mL、42.5mmol)を添加した。この反応混合物を室温で12時間撹拌し、その後エタノールを蒸発させた。この粗混合物にメタノールを添加し、この固体を濾過し、メタノールで十分にすすいだ。所望の生成物を含むこの濾液にシリカゲルを添加し、メタノールを蒸発させた。得られた乾燥ロードを高真空下で乾燥し、カラムにロードした。この粗物質をフラッシュクロマトグラフィー(10%メタノール/ジクロロメタン)によりシリカゲルを通して精製し、3.03gの(I-c)を無色油として得た(2ステップを通して57%)。[α]D -20 (c 1.25,メタノール); 1H NMR (400 MHz,メタノール-d4) デルタ ppm 3.46 (dd, J=10.2, 8.1 Hz, 1H), 3.51 (s, 3H), 3.64 - 3.80 (m, 5H), 3.80 - 3.83 (m, 1H), 4.54 (d, J= 8.0 Hz, 1 H); 13C NMR (100 MHz,メタノール-d4) デルタ
ppm 57.2, 61.2, 63.6, 65.9, 69.9, 71.2, 80.9, 101.2; HRMS (ESI) C8H15N3O6 (m/z) [M + Na]+に対する計算値272.0853,実測値272.0856.
メタノール); 1H NMR (400 MHz,メタノール-d4) デルタ ppm 1.
34 (s, 3H), 1.48 (s, 3H), 1.98 (s, 3H), 3.77 (d, J=7.8 Hz, 1H), 3.83 (d,J=7.8Hz, 1H), 3.
86 (d, .J=11.6 Hz, 1H), 3.90 (d, .J=11.3 Hz,
1H), 3.91 - 3.94 (m, 1H), 4.14 - 4.19 (m, 1H
), 4.29 (d, J= 6.0 Hz, 1H), 5.23 (d, J= 2.0 H
z, 1H); 13C NMR (100 MHz,メタノール-d4) デルタ ppm 22
.7, 26.9, 28.5, 56.8, 61.9, 70.2, 76.1, 76.
6, 83.0, 102.6, 112.5, 173.6; HRMS (ESI) C12
H19NO6 (m/z) [M + H]+に対する計算値274.1285,実測値274.1274.
400 MHz, メタノール-d4) デルタ ppm 3.35 (dd, J=9.2,
1.6 Hz, 1H), 3.70 (d, J=8.2 Hz, 1H), 3.76 (d
, J=8.0 Hz, 1H), 3.80 (d, .J=11.3 Hz, 1H), 3
.83 - 3.89 (m, 2H), 3.90 (d, J=11.5 Hz, 1H), 5.32 (d, J=1.4 Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz,メタノール-d4) デルタ ppm 61.9, 66.1, 69.5, 69.6, 71.0,
85.3, 102.7; HRMS (ESI) C7H11N3O5 (m/z) [M + N
a]+に対する計算値240.0591,実測値240.0596.
MR (400 MHz, メタノール-d4) デルタ ppm 1.95 (s, 3H), 1.95 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 2.15 (s, 3H), 3.
75 (d, J= 8.6 Hz, 1H), 4.06 (d, J= 8.6 Hz, 1H
), 4.13 (d, J=11.6 Hz, 1H), 4.20 (d, J=10.6
Hz, 1H), 4.46 (d, J=11.3 Hz, 1H), 5.13 (dd,
J=10.4, 4.4 Hz, 1H), 5.35 (d, J=1.0 Hz, 1H),
5.38 (d, J=4.3 Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz,メタノ
ール-d4) デルタ ppm 20.6, 20.7 (2C), 22.6, 53.3,
63.0, 68.9, 69.1, 70.3, 82.6, 103.0, 171.8,
171.9, 172.1, 173.8; HRMS (ESI) C15H21NO9 (m/z) [M + H]+に対する計算値360.1289,実測値360.1290.
e(商標)IR-120樹脂の添加により中和した。この樹脂を濾過し、溶媒を蒸発させ、1.71gの(3)を白色固体として得た(83%)。m.p.: 175.7-17
6.1 ℃;[α]D 164 (c 1, メタノール); 1H NMR (400 MHz, メタノール-d4) デルタ ppm 1.99 (s, 3H), 3.68 (d, J=8
.1 Hz, 1H), 3.70- 3.73 (m, 1H), 3.75 (d, J=7
.8Hz, 1H), 3.81 (d, J=11.3 Hz, 1H), 3.87 (d,
J=4.3 Hz, 1H), 3.92 (d, J=11.3 Hz, 1H), 3.9
5 (dd, J= 9.9, 1.1 Hz, 1H), 5.22 (d, J=1.3 Hz, 1 H); 13C NMR (100 MHz,メタノール-d4) デルタ ppm 22.7, 56.4, 62.1, 69.2, 69.3, 70.6, 85.1, 102.
8, 174.1; HRMS (ESI) C9H15NO6 (m/z) [M + H]+に対
する計算値234.0972,実測値234.0974.
,8,11-テトラオキサトリデカン-13-イル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ)-2-(((1-(1-((1S,2R,3R,4R,5S)-4-アセトアミド-2,3-ジヒドロキシ-6,8-ジオキサビシクロ[3.2.1]オクタン-1-イル)-2,5,8,11-テトラオキサトリデカン-13-イル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ)メチル)プロパン-2-イル)アミノ)-4-オキソブチル)カルバメート(6)
ロロホルム); 1H NMR (400 MHz, メタノール-d4) デルタ ppm 1.34 (s, 3H), 1.49 (s, 3H),1.98 (s, 3H), 3.37
(t, J=4.9 Hz, 2H), 3.62 - 3.71 (m, 14H), 3.7
5 - 3.80 (m, 2H), 3.86 (d, J=8.1 Hz, 1H) 3.90- 3.97 (m, 2H), 4.12-4.19 (m, 1H), 4.31 (d,
J=5.8Hz, 1H), 5.23 (d, J=2.0Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz,メタノール-d4) デルタ ppm 22.7, 26.9, 28.5
, 51.9, 56.7, 70.9, 71.1, 71.3, 71.6, 71.7, 71.8, 71.81, 71.82, 72.7, 76.1, 76.5, 82.1,
102.4, 112.4, 173.6; HRMS (ESI) C20H34N4O9 (m
/z) [M + H]+に対する計算値475.2399,実測値475.2386.
中間体(I-f-2)は次のように合成することができる:Boc-セリノール(1000mg、5.1mmol)のテトラヒドロフラン(21mL)溶液に、室温で、ヨウ化テトラブチルアンモニウム(287mg、0.76mmol)、ヨウ化ナトリウム(153mg、1.02mmol)、及び臭化プロパルギル(1.8mL、16mmol、80%トルエン溶液)を添加した。水酸化カリウム(569mg、10.1mmol)を30分間かけて少量ずつ添加し、その後この混合物を室温で16時間撹拌した。この反応混合物を酢酸エチル及び水で希釈した。水相を酢酸エチルで1回抽出した。合わせた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。この粗物質をフラッシュクロマトグラフィー(30%酢酸エチル/ヘキサン)により、シリカゲルを通して精製し、化合物(I-f-2)を油として得た(530mg、収率39%)。1H NMR (400 MHz,
クロロホルム-d/TMS) デルタ ppm 1.44 (s, 9H), 2.44 (t
, J=2.4 Hz, 2H), 3.53 - 3.67 (m, 4H), 3.92 (br. s., 1H), 4.16 (d, J= 2.5 Hz, 4H), 4.90 (br. s., 1H); 13C NMR (100 MHz, クロロホルム-d/ TMS) デ
ルタ ppm 28.4 (3C), 49.5, 58.5 (2C), 68.6 (2C), 74.6 (2C), 77.2, 79.5 (2C), 155.4; HRMS (ESI) C14H21NO4 (m/z) [M + H]+に対する計算値268.1543,実
測値268.1536.
メタン及び水を添加し、水相をジクロロメタンで2回抽出した。合わせた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。この粗物質を最少量のトルエンに溶解し、カラムにロードし、フラッシュクロマトグラフィーによりシリカゲルを通しして精製した。
400 MHz, クロロホルム-d/TMS) デルタ ppm 1.80 - 1.91 (m, 2H), 2.24 (t, J=7.1 Hz, 2H), 2.46 (t, J=2
.3 Hz, 1H), 3.22 - 3.31 (m, 2H), 3.43 - 3.51
(m, 2H), 3.56 - 3.64 (m, 2H), 4.16 (d, J=2.3 Hz, 2H), 5.07 (br. s., 1H), 5.10 (s, 2H), 6.
09 (br. s., 1H), 7.28 - 7.42 (m, 5H); 13C NMR
(100 MHz,クロロホルム-d/TMS) デルタ ppm 25.9, 33.7, 39.1, 40.5, 58.3, 66.7, 68.7, 74.8, 79.4, 1
28.1, 128.5 (4C), 136.6, 156.7, 172.5; HRMS
(ESI) C17H22N2O4 (m/z) [M + H]+に対する計算値319.165
2,実測値319.1646.
pm 1.79 - 1.91 (m, 2H), 2.24 (t, J=7.1 Hz, 2H), 2.44 (t, J=2.4 Hz, 2H), 3.20 - 3.29 (m, 2H), 3.54 - 3.69 (m, 4H), 4.16 (d, J=1.5 Hz, 4H), 4.22 - 4.33 (m, 1H), 5.10 (br. s, 3H), 6.04 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.28 - 7.42 (m, 5H); 13C
NMR (100 MHz, クロロホルム-d/TMS) デルタ ppm 25.8, 3
3.7, 40.4, 48.2, 58.4 (2C), 66.6, 68.3 (2C)
, 74.7 (2C), 79.4 (2C), 128.1, 128.5 (4C), 136.6, 156.6, 172.2; HRMS (ESI) C21H26N2O5 (m/z) [M + H]+に対する計算値387.1914,実測値387.1904.
), 5.12 (br. s., 1H), 5.89 (br. s., 1H), 7.2
8 - 7.40 (m, 5H); 13C NMR (100 MHz, クロロホルム-d/
TMS) デルタ ppm 25.7, 34.3, 40.3, 58.6 (3C), 59.2, 66.6, 68.5 (3C), 74.6 (3C), 79.5 (3C), 128.1, 128.5 (4C), 136.6, 156.6, 172.6; HRMS
(ESI) C25H30N2O6 (m/z) [M + H]+に対する計算値455.217
7,実測値455.2167.
トリス(3-ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル)アミン(THPTA;M.G.Finn et al.in Angewandte Chemie International Edition 48, 9879(2009)参照)(2mg、0.005mmol)及び硫酸銅(1mg、0.004mmol)を水(50マイクロL)に溶解し、その後(I-e-2)(42mg、0.089mmol)及びアルキン(I-g-1)(40mg、0.125mmol)のメタノール(0.9mL)溶液に添加した。次に、水(30マイクロL)に溶解したアスコルビン酸ナトリウム(1.8mg、0.009mmol)を添加し、この反応混合物を室温で24時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、この粗物質をフラッシュクロマトグラフィー(5%~10%メタノールのジクロロメタン溶液)によりシリカゲルを通して精製し、所望の化合物(I-h-1)を油として得た(54mg、収率76%)。[α]D 48.2 (c 0.54, メタノール); 1H NMR
(400 MHz, メタノール-d4) デルタ ppm 1.33 (s, 3H), 1.
48 (s, 3H), 1.70 - 1.83 (m, 2H), 1.98 (s, 3H), 2.21 (t, J= 7.4 Hz, 2H), 3.13 (t, J= 6.9 Hz
, 2H), 3.37 (t, J=5.4 Hz, 2H), 3.51 - 3.70 (m, 14H), 3.71 - 3.95 (m, 7H), 4.15 (t, J= 6.5
Hz, 1H), 4.29 (d, J=5.8 Hz, 1H), 4.56 (t, J=
5.0 Hz, 2H), 4.60 (s, 2H), 5.06 (s, 2H), 5.2
2 (d, J=1.8 Hz, 1H), 7.25 - 7.38 (m, 5H), 8.01 (s, 1 H); 13C NMR (100 MHz,メタノール-d4) デルタ ppm
22.7, 27.0, 27.4, 28.5, 34.4, 40.5, 41.4, 51.6, 56.7, 62.4, 64.9, 67.5, 70.0, 70.5, 70
.8, 71.1, 71.5, 71.6, 71.65, 71.7, 71.73, 7
2.6, 73.8, 76.2, 76.5, 82.1, 102.4, 112.4,
126.1, 129.0, 129.1, 129.6, 138.6, 146.1, 159.0, 173.6, 175.7; HRMS (ESI) C37H56N6O13 (m/
z) [M + H]+に対する計算値793.3978,実測値793.3959.
THPTA(22mg、0.051mmol)及び硫酸銅(2.5mg、0.01mmol)を水(70マイクロL)に溶解し、その後(I-e-2)(48mg、0.1mmol)及びアルキン(I-g-2)(20mg、0.051mmol)のメタノール(1mL)溶液に添加した。次に、水(30マイクロL)に溶解したアスコルビン酸ナトリウム(4mg、0.02mmol)を添加し、この反応混合物を室温で72時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をジクロロメタン及び飽和塩化アンモニウム水溶液に溶解した。この水相をジクロロメタンで3回抽出した。合わせた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、
濾過し、濃縮した。この粗物質をさらに精製することなく次のステップに使用した。
THPTA(34mg、0.079mmol)及び硫酸銅(4mg、0.016mmol)を水(200マイクロL)に溶解し、その後(I-e-2)(50mg、0.1mmol)及びアルキン(I-g-3)(24mg、0.053mmol)のメタノール(1mL)溶液に添加した。次に、水(30マイクロL)に溶解したアスコルビン酸ナトリウム(6.5mg、0.032mmol)を添加し、この反応混合物を室温で72時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をジクロロメタン及び飽和塩化アンモニウム水溶液に溶解した。水相をジクロロメタンで3回抽出した。合わせた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。この粗物質をさらに精製することなく次のステップに使用した。
化合物(I-h-1)、(I-h-2)、または(I-h-3)(0.030~0.068mmol)を、酢酸、メタノール、及び水の混合物(それぞれ1.6~1.8mL、0.5mL、0.5mL)に溶解し、70℃で24時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、この残渣をトルエンとともに2回共蒸発させた。この粗物質をフラッシュクロマトグラフィーによりシリカゲルを通して精製した。
精製条件:10%メタノールのジクロロメタン溶液、43.3mg、油(収率85%)。[α]D 45 (c 1, メタノール); 1H NMR (400 MHz, メタノール
-d4) デルタ ppm 1.72 - 1.83 (m, 2H), 1.99 (s, 3H
), 2.22 (t, J=7.4 Hz, 2H), 3.13 (t, J= 6.8 Hz, 2H), 3.37 (t, J=5.4 Hz, 2H), 3.52 - 3.79 (m, 20H), 3.85 - 4.00 (m, 3H), 4.57 (t, J=5.0 Hz, 2H), 4.61 (s, 2H), 5.07 (s, 2H), 5.21 (s, 1H), 7.24 - 7.41 (m, 5H), 8.02 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, メタノール-d4) デルタ ppm 22.8, 27.4, 34
.4, 40.4, 41.4, 51.6, 56.4, 64.9, 67.5, 69.
0, 70.0, 70.1, 70.4, 70.5, 71.4, 71.5 (2C), 71.6, 71.65, 71.7, 72.5, 84.3, 102.6, 126.0, 129.0 (2C), 129.1, 129.6 (2C), 138.6, 145
.8, 159.0, 174.0, 175.8; HRMS (ESI) C34H52N6O13 (m/z) [M + H]+に対する計算値753.3665,実測値753.3679.
精製条件:20%メタノールのジクロロメタン溶液、25mg、油(2つのステップを通して収率20%)。[α]D 56 (c 1.25, メタノール); 1H NMR (4
00 MHz, メタノール-d4) デルタ ppm 1.72 - 1.81 (m, 2H), 1.99 (s, 6H), 2.23 (t, J= 7.5 Hz, 2H), 3.13
(t, J= 6.9 Hz, 2H), 3.50 - 3.80 (m, 36H), 3.
85 - 3.91 (m, 6H), 3.92 - 4.00 (m, 4H), 4.13
- 4.25 (m, 1H), 4.52 - 4.63 (m, 8H), 5.07 (s,
2H), 5.21 (d, J=1.3 Hz, 2H), 7.23 - 7.40 (m,
5H), 8.01 (s, 2H); 13C NMR (100 MHz, メタノール-d4) デルタ ppm 22.6 (2C), 27.2, 34.2, 41.2, 50.2,
51.4 (2C), 56.2 (2C), 65.0 (2C), 67.3, 68.8
(2C), 69.9 (2C), 70.0 (2C), 70.2 (2C), 70.3
(2C), 71.2 (2C), 71.3 (4C), 71.4 (2C), 71.5
(2C), 71.52 (2C), 72.3 (2C), 84.1 (2C), 102.4 (2C), 125.8 (2C), 128.8 (2C), 128.9, 129
.4 (2C), 138.4, 145.6 (2C), 158.8, 173.8 (2
C), 175.3; HRMS (ESI) C55H86N10O23 (m/z) [M + H]+に対する計算値1255.5940,実測値1255.5925.
精製条件:20%メタノールのジクロロメタン溶液、31mg、油(2つのステップを通して収率18%)。[α]D 53 (c 1, メタノール);1H NMR (400 M
Hz, メタノール-d4) デルタ ppm 1.65 - 1.78 (m, 2H), 1.98 (s, 9H), 2.19 (t, J=7.3 Hz, 2H), 3.11 (t, J= 6.8 Hz, 2H), 3.51 - 3.80 (m, 54H), 3.86 -
3.91 (m, 9H), 3.91 - 3.99 (m, 6H), 4.51 - 4.63 (m, 12H), 5.06 (s, 2H), 5.21 (d, J=1.3 Hz, 3H), 7.24 - 7.40 (m, 5H), 7.98 (s, 3H); HRMS (ESI) C76H120N14O33 (m/z) [M + 2H]+/2に対する計算値879
.4144,実測値879.4148.
解し(0.01M)、このフラスコを窒素でフラッシュした。パラジウム炭素(10%、0.7当量)を添加し、このフラスコを窒素、その後水素でフラッシュした。この反応混合物を室温で12~24時間水素雰囲気下(水素充填バルーン使用)で攪拌した。パラジウムを0.45マイクロmのPTFEアクロディスクCrを用いて濾過し、メタノールで1回すすいだ。溶媒を蒸発させた。
25.5mg、油、収率76%;[α]D 57.6 (c 1.25, メタノール); 1H NMR (400 MHz, メタノール- d4) デルタ ppm 1.70 - 1.81 (m, 2H), 1.99 (s, 3H), 2.24 (t, J=7.4 Hz, 2H), 2.67 (t, J= 6.8 Hz, 2H), 3.36 - 3.41 (m,
2H), 3.51 - 3.80 (m, 19H), 3.84 - 4.01 (m, 4H), 4.59 (t, J= 5.2 Hz, 2H), 4.61 (s, 2H), 5.21 (s, 1H), 8.03 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, メタノール-d4) デルタ ppm 22.8, 29.6, 34.5, 40.4, 42.0,
51.6, 56.4, 64.9, 69.0, 70.0, 70.1, 70.5, 70.6, 71.4, 71.5 (2C), 71.6, 71.66, 71.7, 72
.5, 84.3, 102.6, 126.0, 145.8, 174.1, 175.9; HRMS (ESI) C26H46N6O11 (m/z) [M + H]+に対する計算値6
19.3297,実測値619.3278.
この粗物質を0.5mLのメタノール/水(50:50)に溶解し、HPLCカラムに注入した。分取高速液体クロマトグラフィー(HPLC)は、Waters XBridge BEH C18 OBD分取カラム、130Å、5マイクロm、19mmX100mm(Waters、部品番号186002978)を使用し、流速17mL/分にて直線傾斜勾配で溶出して行った。溶媒勾配:40分間でアセトニトリル/水/トリフルオロ酢酸(2:98:0.1)から(22:58:0.1)。収集した画分を分析LCMSにより分析し、十分な純度を有すると判定された25.7~27.3分の画分をプールし、蒸発させて、10.7mgの(8)を油として得た。収率49%;[α]D 56 (c 1, メタノール); 1H NMR (500 MHz, メタノール-d4) デルタ ppm
1.86 - 1.95 (m, 2H), 1.99 (s, 6H), 2.37 (t, J=7.0 Hz, 2H), 2.96 (t, J=7.4 Hz, 2H), 3.50 - 3.80 (m, 36H), 3.84 - 4.00 (m, 10H), 4.17 - 4.26 (m, 1H), 4.57 - 4.62 (m, 8H), 5.21 (s, 2H), 8.03 (s, 2 H); 13C NMR (100 MHz, メタノール-d4)
デルタ ppm 22.8 (2C), 29.2, 34.5, 41.8, 50.4, 51.6 (2C), 56.4 (2C), 65.1 (2C), 69.0 (2C), 70.1 (2C), 70.3 (2C), 70.5 (2C), 70.6 (2C), 71.4 (2C), 71.5 (4C), 71.6 (2C), 7.67, (2C), 71.7 (2C), 72.5 (2C), 84.3 (2C), 102.6 (2C)
, 126.1 (2C), 145.8 (2C), 174.1 (2C), 175.6
; HRMS (ESI) C47H80N10O21 (m/z) [M + H]+に対する計算値1121.5572,実測値1121.5558.
粗物質を0.5mLのメタノール/水(50:50)に溶解し、HPLCカラムに注入した。分取高速液体クロマトグラフィー(HPLC)は、Waters XBridge
BEH C18 OBD分取カラム、130Å、5マイクロm、19mmX100mm(Waters、部品番号186002978)を使用し、流速17mL/分にて直線傾
斜勾配で溶出して行った。溶媒勾配:40分間でアセトニトリル/水/トリフルオロ酢酸(2:98:0.1)から(22:58:0.1)。収集した画分を分析LCMSにより分析し、十分な純度を有すると判定された30.3~32.0分の画分をプールし、蒸発させて、15mgの(9)を油として得た。収率63%;[α]D 59.1 (c 1.1, メタノール); 1H NMR (500 MHz, メタノール-d4) デルタ ppm
1.84 - 1.92 (m, 2H), 2.00 (s, 9H), 2.31 -2.3
8 (m, 2H), 2.97 (t, J=7.3 Hz, 2H), 3.54 - 3.80 (m, 54H), 3.86 - 3.93 (m, 9H), 3.93 -4.00 (m, 6H), 4.57 (s, 6H), 4.60 (t, J=4.9 Hz, 6H)
, 5.22 (s, 3H), 8.02 (s, 3H); HRMS (ESI) C68H114N14O31 (m/z) [M + H]+に対する計算値1623.7847,実測値16
23.7803.
分取高速液体クロマトグラフィー(HPLC)は、Waters XBridge BEH C18 OBD分取カラム、130Å、5マイクロm、19mmX100mm(Waters、部品番号186002978)を使用し、流速17mL/分にて直線傾斜勾配で溶出して行った。溶媒勾配:40分間でアセトニトリル/水/トリフルオロ酢酸(2:98:0.1)から(22:78:0.1)。収集した画分を分析LCMSにより分析し、十分な純度を有すると判定されたものをプールし、蒸発させた。
化合物(7)(3.0mg、4.8マイクロmol)のジメチルスルホキシド(200マイクロL)溶液に、Alexa Fluor(登録商標)647カルボン酸スクシンイミジルエステル(5.0mg、4マイクロmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(10マイクロL、10当量)を添加した。この反応混合物を室温で1時間振とうし、その後分取HPLCにより直接精製した。収集した画分を分析LCMSにより分析し、十分な純度を有すると判定されたものをプールした(Rt=22.7~24分)。3.2
mgの(10)を得た(収率55%)。この溶液を等分し、真空遠心分離器で蒸発させ、この生成物を4℃で保存した。MS (ESI) [M + H]+に対する計算値(m/z
)約1456,実測値1456.82.
化合物(8)(6.0mg、5マイクロmol)のジメチルスルホキシド(200マイクロL)溶液に、Alexa Fluor(登録商標)647カルボン酸スクシンイミジ
ルエステル(5.0mg、4マイクロmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(10マイクロL、10当量)を添加した。この反応混合物を室温で1時間振とうし、その後分取HPLCにより直接精製した。収集した画分を分析LCMSにより分析し、十分な純度を有すると判定されたものをプールした(Rt=25.3~26.7分)。4.8
mgの(11)を得た(収率62%)。この溶液を等分し、真空遠心分離器で蒸発させ、この生成物を4℃で保存した。MS (ESI) [M + H]+に対する計算値(m/z
)約1958,実測値1958.74.
化合物(9)(9.8mg、6マイクロmol)のジメチルスルホキシド(200マイクロL)溶液に、Alexa Fluor(登録商標)647カルボン酸スクシンイミジルエステル(5.0mg、4.8マイクロmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(10マイクロL、10当量)を添加した。この反応混合物を室温で1時間振とうし、その後分取HPLCにより直接精製した。収集した画分を分析LCMSにより分析し、十分な純度を有すると判定されたものをプールした(Rt=27.7分)。5.2mgの
(12)を得た(収率52%)。この溶液を等分し、真空遠心分離器で蒸発させ、この生成物を4℃で保存した。MS (ESI) [M + H]+に対する計算値(m/z)約2
460,実測値2461.18.
トリフレートのジメチルホルムアミド(4.1mL)溶液に添加した。この反応混合物を60℃で16時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、この粗物質をフラッシュクロマトグラフィー(15/1酢酸エチル/メタノール)によりシリカゲルを通して精製し、所望の化合物(I-e-3)を黄色油として得た(227mg、収率92%)。[α]D 127 (c 1, メタノール); 1H NMR (500 MHz, クロロホルム-d) デルタ pp
m 1.34 (s, 3H), 1.53 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 3.67 (d, J=12.7 Hz, 1H), 3.72 (d, J= 7.8 Hz, 1H), 3.74 (d, J= 7.8 Hz, 1H), 3.75 (d, J=12.7 Hz, 1H), 4.02 - 4.10 (m, 2H), 4.11 (d, J= 5.9
Hz, 1H), 5.35 (d, J=2.4 Hz, 1H), 5.95 (d, J=8.8 Hz, 1H); 13C NMR (125 MHz, クロロホルム-d) デルタ
ppm 23.2, 26.2, 27.7, 51.0, 54.2, 69.3, 74.
8, 76.1, 80.6, 101.2, 111.6, 170.1; HRMS (E
SI) C12H18N4O5 (m/z) [M + H]+に対する計算値299.1350,実測値299.1344.
2.43 (t, J=2.3 Hz, 2H), 3.20 - 3.29 (m, 2H),
3.39 - 3.55 (m, 24H), 3.60 (t, J=6.3 Hz, 4H), 4.13 (d, J= 2.5 Hz, 4H), 4.15 - 4.24 (m, 1H
), 5.09 (s, 2H), 5.16 (br. s., 1H), 6.05 (d, J=8.1 Hz, 1H), 7.28 - 7.41 (m, 5H); 13C NMR (100 MHz, クロロホルム-d/TMS) デルタ ppm 25.8, 29.8 (2
C), 29.9 (2C), 30.0 (2C), 33.7, 40.4, 48.5, 58.1 (2C), 66.6, 67.2 (2C), 67.6 (2C), 67.7 (2C), 67.8 (2C), 67.9 (2C), 68.3 (2C), 69.0 (2C), 74.2 (2C), 79.9 (2C), 128.1, 128.5 (4
C), 136.6, 156.6, 172.1; HRMS (ESI) C39H62N2O11 (m/z) [M + H]+に対する計算値735.4426,実測値735.4424.
ppm 1.75 - 1.90 (m, 20H), 2.18 (t, J= 6.9 Hz,
2H), 2.43 (t, J=2.4 Hz, 3H), 3.23 (q, J=6.3
Hz, 2H), 3.40 - 3.53 (m, 30H), 3.59 (t, J=6.
3 Hz, 6H), 3.67 (s, 6H), 4.13 (d, J= 2.3 Hz,
6H), 5.08 (s, 2H), 5.27 (br. s., 1H), 5.85 (
s, 1H), 7.27 - 7.40 (m, 5H); 13C NMR (100 MHz,
クロロホルム-d/TMS) デルタ ppm 25.7, 29.7 (3C), 29.
9 (3C), 30.0 (3C), 34.4, 40.4, 58.1 (3C), 59.8, 66.5, 67.1 (3C), 67.6 (3C), 67.7 (3C), 67.8 (3C), 67.82 (3C), 68.4 (3C), 69.1 (3C), 74.2 (3C), 79.9 (3C), 128.0, 128.4 (4C), 13
6.6, 156.6, 172.3; HRMS (ESI) C52H84N2O15 (m/z
) [M + H]+に対する計算値977.5944,実測値977.5943.
THPTA(22.6mg、0.052mmol)及び硫酸銅(2.5mg、0.01mmol)を水(200マイクロL)に溶解し、その後(I-e-3)(45mg、0.152mmol)及び(I-j-2)(51mg、0.069mmol)のメタノール(1.1mL)溶液に添加した。次に、水(100マイクロL)に溶解したアスコルビン酸ナトリウム(4.2mg、0.021mmol)を添加し、この反応混合物を50℃で24時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、この粗物質をフラッシュクロマトグラフィー(5%メタノールのジクロロメタン溶液)によりシリカゲルを通して精製し、所望の化合物(I-k-2)を油として得た(72mg、収率78%)。1H NMR (400 MHz, メ
タノール-d4) デルタ ppm 1.34 (s, 6H), 1.52 (s, 6H), 1.73 - 1.86 (m, 12H), 1.97 (s, 6H), 2.24 (t, J=7.4 Hz, 2H), 3.15 (t, J= 6.8 Hz, 2H), 3.43 - 3.54 (m, 22H), 3.58 (t, J=6.3 Hz, 4H), 3.8
6 (d, J=8.1 Hz, 2H), 3.97 (dd, J= 6.2, 1.9 Hz, 2H), 4.11 - 4.23 (m, 5H), 4.58 (s, 4H), 4.78 (s, 6H), 4.91 (d, J=14.1 Hz, 2H), 4.98 (d, J=14.4 Hz, 2H), 5.07 (s, 2H), 5.24 (d, J=1.8
Hz, 2H), 7.25 - 7.40 (m, 5H), 7.99 (s, 2H); 13C NMR (100 MHz, メタノール-d4) デルタ ppm 22.7 (2C),
26.8 (2C), 27.5, 28.4 (2C), 31.1 (4C), 31.2
(2C), 34.5, 41.4, 50.6, 51.0 (2C), 56.3 (2C), 64.8 (2C), 67.5 (2C), 68.7 (2C), 68.8 (2C), 68.9 (3C), 69.0 (2C), 69.4 (2C), 69.7 (2C), 70.9 (2C), 76.3 (2C), 76.6 (2C), 81.5 (2C), 102.5 (2C), 112.8 (2C), 127.2 (2C), 129.
0 (2C), 129.1, 129.6 (2C), 138.6, 146.3 (2C
), 159.0, 173.5 (2C), 175.5; HRMS (ESI) C63H98N10O21 (m/z) [M + H]+に対する計算値1331.6981,実測値1331.6971.
THPTA(16mg、0.037mmol)及び硫酸銅(1.7mg、0.007mmol)を水(100マイクロL)に溶解し、その後(I-e-3)(32.5mg、0.109mmol)及び(I-j-3)(32mg、0.033mmol)のメタノール(1.1mL)溶液に添加した。次に、水(100マイクロL)に溶解したアスコルビン酸ナトリウム(3mg、0.015mmol)を添加し、この反応混合物を50℃で24時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、この粗物質をフラッシュクロマトグラフィー(10%メタノールのジクロロメタン溶液)によりシリカゲルを通して精製し、所望の化合物(I-k-3)を油として得た(43.5mg、収率70%)。1H NMR (400 MHz,
メタノール-d4) デルタ ppm 1.33 (s, 9H), 1.52 (s, 9H), 1.71 - 1.87 (m, 18H), 1.97 (s, 9H), 2.20 (t, J=7.3 Hz, 2H), 3.15 (t, J= 6.8 Hz, 2H), 3.43 - 3.52 (m, 28H), 3.58 (t, J=6.3 Hz, 6H), 3.67 (s, 6H), 3.86 (d, J=8.3 Hz, 3H), 3.97 (dd
, J= 6.0, 1.8 Hz, 3H), 4.14 - 4.22 (m, 5H), 4
.58 (s, 6H), 4.78 (s, 8H), 4.91 (d, J=14.6 H
z, 3H), 4.97 (d, J=14.6 Hz, 3H), 5.07 (s, 2H
), 5.24 (d, J= 2.0 Hz, 3H), 7.26 - 7.38 (m, 5
H), 7.98 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, メタノール-d4) デルタ ppm 22.7 (3C), 26.9 (3C), 27.7, 28.4 (3C), 31.1 (3C), 31.2 (3C), 31.3 (3C), 35.2, 41.3, 51.0 (3C), 56.3 (3C), 61.8, 64.9 (3C), 67.5 (3C), 68.7 (3C), 68.8 (3C), 68.9 (3C), 69.0 (4C), 69.6 (3C), 69.7 (3C), 70.0 (3C), 76.3 (3C), 76.6 (3C), 81.5 (3C), 102.5 (3C), 112.8 (3C), 127.2 (3C), 129.0 (2C), 129.1,
129.7 (2C), 138.6, 146.4 (3C), 159.0, 173.5
(3C), 175.6; HRMS (ESI) C88H138N14O30 (m/z) [M
+ H]+に対する計算値1871.9776,実測値1871.9713.
ルに溶解し(0.01M)、このフラスコを窒素でフラッシュした。パラジウム炭素(10%、0.7当量)を添加し、このフラスコを窒素、その後水素でフラッシュした。この反応混合物を水素雰囲気下(水素を充填したバルーンを使用)室温で24時間撹拌した。パラジウムを、0.45マイクロmのPTFE Acrodisc Crを使用して濾過し、メタノールで1回すすいだ。溶媒を蒸発させた。
この粗物質を0.5mLのメタノール/水(50:50)に溶解し、HPLCカラムに注入した。分取高速液体クロマトグラフィー(HPLC)は、Waters XBridge BEH C18 OBD分取カラム、130Å、5マイクロm、19mmX100mm(Waters、部品番号186002978)を使用し、流速17mL/分にて直線傾斜勾配で溶出して行った。溶媒勾配:40分間でアセトニトリル/水/トリフルオロ酢酸(2:98:0.1)から(22:58:0.1)。収集した画分を分析LCMSにより分析し、十分な純度を有すると判定された34.7~35.6分の画分をプールし、蒸発させて、12.8mgの(13)を油として得た(2ステップを通して収率17%)。1H NMR (500 MHz, メタノール-d4) デルタ ppm 1.73 - 1.
87 (m, 12H), 1.88 - 1.96 (m, 2H), 1.98 (s, 6H), 2.39 (t, J=7.0 Hz, 2H), 2.98 (t, J=7.4 Hz
, 2H), 3.42 (d, J= 8.5 Hz, 2H), 3.45 - 3.55 (
m, 24H), 3.59 (t, J=6.3 Hz, 4H), 3.71 - 3.75 (m, 4H), 3.77 (d, J=8.3 Hz, 2H), 3.96 - 4.02 (m, 2H), 4.13 - 4.20 (m, 1H), 4.58 (s, 4H), 4.91 - 4.95 (m, 4H), 5.20 (d, J=1.5 Hz, 2H), 7.98 (s, 2H); HRMS (ESI) C49H84N10O19 (m/z) [M +
H]+に対する計算値1117.5987,実測値1117.5977.
粗物質を0.5mLのメタノール/水(50:50)に溶解し、HPLCカラムに注入した。分取高速液体クロマトグラフィー(HPLC)は、Waters XBridge
BEH C18 OBD分取カラム、130Å、5マイクロm、19mmX100mm(Waters、部品番号186002978)を使用し、流速17mL/分にて直線傾斜勾配で溶出して行った。溶媒勾配:40分間でアセトニトリル/水/トリフルオロ酢酸(2:98:0.1)から(42:58:0.1)。収集した画分を分析LCMSにより分析し、十分な純度を有すると判定された24.7~25.6分の画分をプールし、蒸発させて、5.5mgの(14)を油として得た(2ステップを通して収率10%);1H NMR (500 MHz, メタノール-d4) デルタ ppm 1.75 - 1.86 (m, 18H), 1.87 - 1.94 (m, 2H), 1.98 (s, 9H), 2.37 (t, J= 6.8 Hz, 2H), 2.98 (t, J=7.4 Hz, 2H), 3.43 (d, J= 8.5 Hz, 3H), 3.46 - 3.53 (m, 3
1H), 3.59 (t, J=6.3 Hz, 6H), 3.68 (s, 6H), 3
.72 - 3.76 (m, 5H), 3.77 (d, J=8.3 Hz, 3H), 3.97 - 4.02 (m, 3H), 4.59 (s, 6H), 4.90 - 4.96
(m, 6H), 5.20 (d, J=1.2 Hz, 3H) 7.98 (s, 3H); HRMS (ESI) C71H120N14O28 (m/z) [M + H]+に対する計算値
1617.8469,実測値1617.8415.
分取高速液体クロマトグラフィー(HPLC)は、Waters XBridge BEH C18 OBD分取カラム、130Å、5マイクロm、19mmX100mm(Waters、部品番号186002978)を使用し、流速17mL/分にて直線傾斜勾配で溶出して行った。溶媒勾配:40分間でアセトニトリル/水/トリフルオロ酢酸(2:98:0.1)から(22:78:0.1)。収集した画分を分析LCMSにより分析し、十分な純度を有すると判定されたものをプールし、蒸発させた。
化合物(13)(4.5mg、4マイクロmol)のジメチルスルホキシド(200マイクロL)溶液に、Alexa Fluor(登録商標)647カルボン酸スクシンイミジルエステル(5.0mg、4マイクロmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(10マイクロL、10当量)を添加した。この反応混合物を室温で1時間振とうし、その後分取HPLCにより直接精製した。収集した画分を分析LCMSにより分析し、十分な純度を有すると判定されたものをプールした(Rt=37.3~39分)。4.0m
gの(15)を得た(収率50%)。この溶液を等分し、真空遠心分離器で蒸発させ、この生成物を4℃で保存した。MS (ESI) [M + H]+に対する計算値(m/z)
約1955,実測値1955.32.
化合物(14)(5.2mg、3.2マイクロmol)のジメチルスルホキシド(200マイクロL)溶液に、Alexa Fluor(登録商標)647カルボン酸スクシンイミジルエステル(5.0mg、4マイクロmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(10マイクロL、10当量)を添加した。この反応混合物を室温で1時間振とうし、その後分取HPLCにより直接精製した。収集した画分を分析LCMSにより分析し、十分な純度を有すると判定されたものをプールした(Rt=24.3~25.3分)。
4.0mgの(16)を得た(収率51%)。この溶液を等分し、真空遠心分離器で蒸発させ、この生成物を4℃で保存した。MS (ESI) [M + H]+に対する計算値(
m/z)約2455,実測値2456.90.
(I-e-1)のジクロロメタン溶液に、所望のヨードアルキル、硫酸水素テトラブチルアンモニウム、及び12.5Mの水酸化ナトリウム水溶液を添加した。この反応混合物を室温で一夜撹拌し、水及びジクロロメタンで希釈し、水相をジクロロメタンでさらに2回抽出した。合わせた有機層を1Mの塩酸水溶液、水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。得られた物質は、粗製のまま次の反応を引き続き行って
もよいし、フラッシュクロマトグラフィーを用いてシリカゲルを通して精製してもよい。得られた物質を酢酸/メタノール/水の混合物(3:1:1v/v)に溶解し、この溶液を60~70℃に一夜加熱した。この反応混合物を減圧下で濃縮し、トルエンとともに2回共蒸発させ、この粗物質をフラッシュクロマトグラフィーによりシリカゲルを通して、または逆相クロマトグラフィーにより精製した。
デルタ ppm 5.23 (d, J=1.5 Hz, 1 H), 3.97 (dd, J=9.7, 1.4 Hz, 1 H), 3.94 (d, J= 9.3 Hz, 1 H), 3.88 (d, J=4.3 Hz, 1 H), 3.79 (d, J=8.1 Hz, 1
H), 3.73 (dd, J= 9.8, 4.3 Hz, 1 H),3.66 (d, J=8.1 Hz, 1 H), 3.60 (d, J= 9.6 Hz, 1 H), 3.59 (dq, J= 9.6, 7.1 Hz, 1 H), 3.55 (dq, J= 9.6,
7.1 Hz, 1 H), 2.00 (s, 3 H), 1.19 (t, J= 6.9 Hz, 3 H). LCMS (APCI) m/z: 262.1 [M+H] (100 %
).
タ ppm 5.23 (d, J= 1.5 Hz, 1 H), 3.97 (dd, J= 9
.7, 1.4 Hz, 1 H), 3.95 (d, J= 9.6 Hz, 1 H), 3.89 (d, J=4.3 Hz, 1 H), 3.79 (d, J= 7.8 Hz, 1 H), 3.73 (dd, J=9.8, 4.3 Hz, 1 H), 3.66 (d, J=8.1 Hz, 1 H), 3.59 (d, J= 9.3 Hz, 1 H), 3.49 (dt, J= 9.3, 6.5 Hz, 1 H), 3.46 (dt, J= 9.3, 6
.5 Hz, 1 H), 2.01 (s, 3 H), 1.60 (qt, J= 7.4, 6.5 Hz, 2 H), 0.94 (t, J=7.4 Hz, 3 H). LCMS (
APCI) m/z: 276.2 [M+H] (100 %).
6, 1.3 Hz, 1 H), 3.94 (d, J= 9.6 Hz, 1 H), 3.88 (d, J=4.3 Hz, 1 H), 3.79 (d, J= 7.8 Hz, 1 H), 3.73 (dd, J= 9.8, 4.3 Hz, 1 H), 3.66 (d, J= 7.8 Hz, 1 H), 3.59 (d, J= 9.3 Hz, 1 H), 3.54 (dt, J= 9.3, 6.5 Hz, 1 H), 3.50 (dt, J= 9.3, 6
.5 Hz, 1 H), 2.00 (s, 3 H), 1.52 - 1.61 (m, 2
H), 1.34 - 1.45 (m, 2 H), 0.95 (t, J=7.3 Hz,
3 H). LCMS (APCI) m/z: 290.2 [M+H] (100 %).
(d, J=4.3 Hz, 1 H), 3.79 (d, J=8.1 Hz, 1 H),
3.73 (dd, J= 9.8, 4.3 Hz, 1 H), 3.66 (d, J= 8
.1 Hz, 1 H), 3.59 (d, J= 9.6 Hz, 1 H), 3.53 (dt, J=9.3, 6.5 Hz, 1 H), 3.49 (dt, J=9.3, 6.5 Hz, 1 H), 2.01 (s, 3 H), 1.53 - 1.63 (m, 2 H),
1.29 - 1.41 (m, 4 H), 0.89 - 0.97 (m, 3 H). L
CMS (APCI) m/z: 304.1 [M+H] (100 %).
デルタ ppm 5.23 (d, J=1.5 Hz, 1 H), 3.96 (dd, J
=10.1, 1.3 Hz, 1 H), 3.94 (d, J= 9.6 Hz, 1 H)
, 3.88 (d, J=4.3 Hz, 1 H), 3.79 (d, J= 7.8 Hz
, 1 H), 3.73 (dd, J= 9.8, 4.3 Hz, 1 H), 3.66 (d, J=8.1 Hz, 1 H), 3.59 (d, J= 9.6 Hz, 1 H), 3.53 (dt, J= 9.3, 6.5 Hz, 1 H), 3.49 (dt, J= 9
.3, 6.5 Hz, 1 H), 2.00 (s, 3 H), 1.53 - 1.62 (m, 2 H), 1.27 - 1.50 (m, 6 H), 0.89 - 0.97 (m,
3 H). LCMS (APCI) m/z: 318.1 [M+H] (100 %).
13-オール(207mg、0.994mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液に、水素化ナトリウム(39.9mg、1.0mmol)を添加し、この反応混合物を10分間撹拌した。上記の粗製((3aR,4R,7S,8R,8aR)-8-アセトアミド-2,2-ジメチルテトラヒドロ-4,7-エポキシ[1,3]ジオキソロ[4,5-d]オキセピン-4(5H)-イル)メチルトリフルオロメタンスルホネートのN,N-ジメチルホルムアミド(0.5mL)溶液を滴下し、この反応混合物を0℃で25分間撹拌した。この反応物をメタノールでクエンチし、この反応混合物を5分間撹拌した。次に、得られた混合物を減圧下で濃縮し、得られた残渣をジクロロメタンに溶解し、水で洗浄した。水層をジクロロメタンでさらに2回抽出した。合わせた有機層を水で洗浄し、減圧下で濃縮した。この粗物質を、フラッシュクロマトグラフィーにより、シリカゲルを通して、酢酸エチル/メタノール(15:2)で溶出して精製し、85mg(100%)の所望の生成物を得た。N-((3aR,4S,7S,8R,8aR)-2,2-ジメチル-4-(2,5,8,11,14-ペンタオキサペンタデシル)ヘキサヒドロ-4,7-エポキシ[1,3]ジオキソロ[4,5-d]オキセピン-8-イル)アセトアミド(85mg、0.18mmol)の酢酸/メタノール/水の混合物(3.9:1.3:1.3v/v)溶液を、70℃に一夜加熱した。この反応混合物を減圧下で濃縮し、得られた粗物質をトルエンとともに2回蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィーにより、シリカゲルを通して、10%メタノール/ジクロロメタンで溶出して精製し、15mgの所望の生成物(22)を油として得た。1H NMR (400 MHz, メタノール-d4) デルタ ppm 5.22 (d, J=1.3 Hz, 1 H), 3.96 (d, J= 9.6
Hz, 1 H), 3.95 (dd, J= 9.9, 1.3 Hz, 1 H), 3.8
9 (d, J=4.3 Hz, 1 H), 3.78 (d, J=8.1 Hz, 1 H)
, 3.59 - 3.74 (m, 17 H), 3.53 - 3.56 (m, 2 H),
3.36 (s, 3 H), 1.99 (s, 3 H). LCMS (APCI) m/
z: 424.2 [M+H] (13 %), 441.3 [M+NH4] (100 %)
.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): デルタ (ppm) 7.89 - 7.
95 (m, 2 H), 7.78 - 7.84 (m, 2 H), 7.54 - 7.66
(m, 6 H), 7.41 - 7.46 (m, 2 H), 5.87 (d, J=8.8 Hz, 1 H), 5.80 (d, J=4.3 Hz, 1 H), 5.60 (d, J=l.l Hz, 1 H), 5.44 (dd, J=10.2, 4.5 Hz, 1 H), 4.54 - 4.64 (m, 3 H), 4.15 (d, J= 8.6 Hz, 1
H), 3.93 (d, J=8.6 Hz, 1 H), 1.95 (s, 3 H). 13C NMR(101 MHz, CDCl3) デルタ ppm 170.6, 165.6, 165.0, 164.9, 132.1, 131.9, 131.8, 131.4, 131.2, 131.2, 129.3, 129.0, 128.9, 127.7, 127.5, 127.4, 101.8, 81.6, 69.5, 68.8, 68.4,
62.5, 52.7, 23.2。メタノール及びヘプタンを溶媒として用いた蒸気拡散技術により、単結晶を得た。単結晶X線解析:データ収集は室温にてBruker APEX回折計で行った。データ収集は、それぞれ0.5ステップで低角度での3回及び高角度での3回のオメガスキャンからなるものであった。加えて、2回のファイスキャンを収集して、吸収補正の質を改善した。構造は非欠面性双晶であり、第二のドメインを無視することにより精密化した。空間群P2(1)においてSHELXソフトウェアスイート(SHELXTL,Version 5.1、Bruker AXS,1997参照)を使用する直接法により、構造を解明した。その後、構造を完全行列最小二乗法により精密化した。異方性変位パラメーターを使用して、すべての非水素原子を見出し、精密化した。窒素上にある水素原子はこの位置に置き、合理的な位置に拘束した。残りの水素原子は算出された位置に置き、それらの担体原子に乗せた。最終精密化は、すべての水素原子についての等方性変位パラメーターを含んでいた。尤度法(R.W.W.Hooft et al.J.Appl.Cryst.,41,96-103(2008))を用いる絶対構造の解析を、PLATON(A.L.Spek,J.Appl.Cryst.,36,7-13(2003))を用いて行った。結果は、絶対構造が正確に割り当てられたことを示す。この方法は、構造が正確である確率が100.0であると算出する。Hooftパラメーターは、0.036でesd0.013として報告される。加えて、Flackパラメーターは、0.03でesd0.04である。最終R指数は5.6%であった。最終差フーリエは、欠落したまたは間違って配置された電子密度がないことを明らかにした。関連する結晶、データ収集及び精密化を、表1及び図1に要約する。
表1.(23)に関する結晶データ及び構造精密化。
実験式 C15H12Br1.50N0.50O4.50
式量 391.12
温度 296(2)K
波長 1.54178Å
結晶系 単斜晶系
空間群 P2(1)
単位格子の寸法 a=12.5748(9)Å α=90°
b=5.6465(4)Å β=97.453(4)°
c=21.2806(16)Å γ=90°
体積 1498.23(19)Å3
Z 4
密度(計算値) 1734Mg/m3
吸収計数 5.476mm-1
F(000) 776
結晶サイズ 0.37×0.22×0.15mm3
データ収集様のシータ範囲 2.09~68.30°
指数範囲 -13≦h≦5、-5≦k≦6、-24≦1≦24
収集した反射 8050
独立した反射 4408[R(int)=0.0247]
シータ=68.30°に対する完全性 93.9%
吸収補正 経験的
精密化方法 F2の完全行列最小二乗法
データ/抑制/パラメーター 4408/32/389
F2の適合度 1.031
最終R指数[I>2シグマ(I)] R1=0.0563、wR2=0.1658
R指数(全データ) R1=0.0589、wR2=0.1701
絶対構造パラメーター 0.04(3)
最大差ピーク及びホール 0.949及び-0.685e.Å-3
ル-d4) δ: 7.07-7.52 (m, 15H), 5.31 (s, 1H), 4
.81 (d, J=5.1 Hz, 1H), 4.78 (d, J=5.5 Hz, 1H
), 4.68-4.74 (m, 1H), 4.47-4.51 (m, 1H), 4.
46 (d, J=6.6 Hz, 1H), 4.35-4.42 (m, 1H), 4.12 (d, J=3.9 Hz, 1H), 3.87-3.91 (m, 2H), 3.86
(d, J=8.2 Hz, 1H), 3.62 (d, J=8.2 Hz, 1H), 3.58 (d, J=9.4 Hz, 1H), 3.46 (d, J=8.6 Hz, 1H
)
15H), 5.29 (d, J=1.2 Hz, 1H), 4.90 (d, 11.5
Hz, 1H), 4.79 (d, J=11.5Hz, 1H), 4.57 (d, J=11.7 Hz, 1H), 4.56 (d, J=12.1 Hz, 1H), 4.43
(d, J=12.1Hz, 1H), 4.39 (d, J=11.7 Hz, 1H), 3.97 (d, J=3.9 Hz, 1H), 3.90 (d, J=9.0 Hz, 1
H), 3.69 (d, J=8.2 Hz, 1H), 3.59 (d, J=8.2 H
z, 1H), 3.42 (d, J=8.6 Hz, 1H), 3.37 (dd, J=
9.4, 3.5 Hz, 1H), 3.07 (dd, J=9.4, 1.2 Hz, 1
H); 13C NMR (クロロホルム-d) δ: 131.8, 131.6, 131.
5, 128.2, 128.2, 128.1, 128.1, 128.0, 127.7, 127.6, 127.6, 127.4, 103.5, 82.6, 80.3, 7
4.5, 73.3, 73.1, 72.2, 69.9, 69.3, 55.1; LC
MS (ES+): 1.18分, 484.2 (M+Na)+.
%から60%への酢酸エチルのヘプタン溶液勾配で溶出して精製し、表題生成物を白色固体として得た(20mg、73%)。1H NMR (クロロホルム-d) δ: 7.24
-7.43 (m, 15H), 5.35 (d, J=1.2 Hz, 1H), 5.06
(d, J=8.6 Hz, 1H), 4.96 (d, J=11.3 Hz, 1H), 4.74 (d, J=12.5 Hz, 1H), 4.58 (d, J=11.3 Hz,
1H), 4.42 (d, J=12.5 Hz, 1H), 4.40 (s, 2H), 4.30-4.36 (m, 1H), 4.04 (d, J=3.9 Hz, 1H), 3.96 (d, J=8.6 Hz, 1H), 3.67-3.70 (m, 1H), 3.58-3.61 (m, 1H), 3.41-3.47 (m, 2H), 1.87 (s
, 3H); 13C NMR (クロロホルム-d) δ: 170.0, 138.2, 137.8, 137.4, 128.7, 128.5, 128.4, 128.3, 128.2, 128.1, 128.0, 127.8, 101.6, 82.8, 75.7,
75.0, 73.8, 73.2, 71.5, 70.1, 69.5, 53.5, 23.3; LCMS (ES+): 1.87分, 526.3 (M+Na)+.
7.25-7.42 (m, 15H), 5.91 (d, J=8.6 Hz, 1H),
5.35 (d, J=1.2 Hz, 1H), 4.95 (d, J=11.3Hz,
1H), 4.72 (d, J=12.5 Hz, 1H), 4.58 (d, J=11.3 Hz, 1H), 4.41 (s, 2H), 4.40 (d, J=12.5 Hz, 1H), 4.36 (t, J=9.8 Hz, 1H), 4.08 (d, J=3.9
Hz, 1H), 3.96 (d, J=9.0 Hz, 1H), 3.68-3.72 (m, 1H), 3.60-3.63 (m, 1H), 3.50 (dd, J=10.0
, 3.7 Hz, 1H), 3.45 (d, J=8.6 Hz, 1H); 13C NMR
(クロロホルム-d) δ: 137.9, 137.1, 136.1, 128.9,
128.5, 128.5, 128.4, 128.4, 128.1, 128.1, 128.1, 127.9, 100.6, 83.0, 75.0, 74.9, 73.8,
72.7, 71.4, 70.3, 69.2, 54.1; 19F NMR (クロロホルム-d) δ: -75.7 (s); LCMS (ES-): 2.11分, 556.2 (M-H)-.
5.43 (d, J=1.2 Hz, 1H), 4.93 (d, J=11.3 Hz,
1H), 4.79 (d, J=11.7Hz, 1H), 4.62 (br.s., 1
H), 4.56 (d, J=11.7Hz, 1H), 4.54 (d, J=11.3
Hz, 1H), 4.41 (d, J=12.1 Hz, 1H), 4.37 (d, J
=12.1 Hz, 1H), 4.05 (d, J=3.9 Hz, 1H), 3.92
(d, J=8.6 Hz, 1H), 3.74 (d, J=8.6 Hz, 1H), 3
.68-3.72 (m, 1H), 3.62 (d, J=8.6 Hz, 1H), 3.54 (dd, J=10.0, 3.7 Hz, 1H), 3.44 (d, J=9.0
Hz, 1H), 2.90 (s, 3H); 13C NMR (クロロホルム-d) δ:
138.0, 137.3, 137.2, 128.7(2), 128.5(2), 1
28.4(2), 128.3, 128.1(2), 128.1, 127.9(2),
127.8(2), 102.7, 82.9, 77.2, 77.1, 75.0, 7
3.7, 73.5, 72.8, 70.2, 69.3, 57.7, 41.2;; L
CMS (ES-): 1.97分, 538.3 (M-H)-.
δ:7.03-7.58(m, 15H), 5.35(s, 1H), 5.09(d,
J=8.2Hz, 1H), 4.95(d, J=11.3Hz, 1H), 4.72(
d, J=12.1Hz, 1H), 4.57(d, J=11.3Hz, 1H), 4.43(d, J=12.1Hz, 1H), 4.39(s, 2H), 4.31-4.3
8(m, 1H), 4.04(d, J=3.9Hz, 1H), 3.95(d, J=9.0Hz, 1H), 3.68(d, J=8.2Hz, 1H), 3.59(d, J=8.2Hz, 1H), 3.44-3.49(m, 1H), 3.44(d, J=8.
6Hz, 1H), 2.08(q, J=7.4Hz, 2H), 1.11(t, J=7.6Hz, 3H). 13C-NMR(クロロホルム-d)δ:173.5, 138.1
, 137.8, 137.4, 128.6, 128.5, 128.3, 128.3,
128.2, 128.1, 128.0, 128.0, 127.7, 101.6,
82.7, 75.7, 74.9, 73.7, 73.2, 71.5, 70.1, 6
9.4, 53.3, 29.6, 9.5. LCMS(ES-):1.94分, 516
.4(M-H)-. LCMS(AP+):1.94分, 518.5(M+H)+.
クロロホルム-d)δ:7.24-7.42(m, 15H), 5.37(d, J=8
.6Hz, 1H), 5.35(d, J=1.6Hz, 1H), 4.95(d, J=11.3Hz, 1H)4.71(d, J=12.1Hz, 1H), 4.56(d,
J=11.3Hz, 1H), 4.45(d, J=12.1Hz, 1H), 4.40
(s, 2H), 4.35-4.40(m, 1H), 4.05(d, J=3.5Hz
, 1H), 3.95(d, J=8.6Hz, 1H), 3.71(d, J=8.2Hz, 1H), 3.61(d, J=8.2Hz, 1H), 3.50(dd, J=10.0, 3.7Hz, 1H), 3.45(d, J=8.6Hz, 1H), 2.92(q, J=10.5Hz, 2H). 13C-NMR(クロロホルム-d)δ:162.3, 138.0, 137.6, 137.3, 128.7, 128.5, 128.4,
128.3, 128.3, 128.2, 128.0, 128.0, 127.8,
101.1, 82.8, 75.8, 75.0, 73.7, 73.2, 71.9,
70.2, 69.3,54.0,41.7. 19F-NMR(クロロホルム-d)δ:
-62.8(s). LCMS(ES-):2.05分, 570.3(MH)-.
ム-d)δ:7.14-7.47(m, 15H), 6.02(d, J=8.6Hz, 1H), 5.83(t, J=54.2Hz, 1H), 5.35(s, 1H), 4.96(d, J=11.3Hz, 1H), 4.73(d, J=12.5Hz, 1H)
, 4.58(d, J=11.3Hz, 1H), 4.45(d, J=12.1Hz, 1H), 4.41 2H), 4.34-4.40(m, 1H), 4.08(d, J
=3.9Hz, 1H), 3.96(d, J=9.0Hz, 1H), 3.67-3.
75(m, 1H), 3.59-3.65(m, 1H), 3.53(dd, J=9.
8,3.9Hz, 1H), 3.46(d, J=8.6Hz, 1H). 13C-NMR
(クロロホルム-d)δ:162.6, 138.0, 137.3, 128.8, 128.5, 128.4, 128.3, 128.1, 128.0, 127.8, 108.3(t, J=253.1Hz), 72.9, 71.6, 70.2, 69.3, 53.5. 19F-NMR(クロロホルム-d)δ:-126.1(d, J=53.1Hz). LCMS(ES-):2.05分, 538.2(M-H)-.
この残渣を、中における10%から40%への酢酸エチルヘプタン溶液の勾配で溶離させるシリカゲルカラムで精製して、表題の生成物を白色固体として得た(104mg、71%)。1H-NMR(クロロホルム-d)δ:7.17-7.45(m, 15H), 5
.35(s, 1H), 4.97(d, J=11.3Hz, 1H), 4.74(d, J=12.1Hz, 1H), 4.57(d, J=11.3Hz, 2H), 4.47
(d, J=7.0Hz, 1H), 4.39(s, 2H), 4.09(br.s, 1H), 4.01(d, J=3.9Hz, 1H), 3.93(d, J=9.0Hz, 1H), 3.63-3.71(m, 1H),3.54-3.62(m, 1H),3.
38-3.48(m, 2H),1.47(s, 9H)。13C-NMR(クロロホルム-d)δ:155.2, 138.2, 137.8, 137.4, 128.5, 128
.4, 128.3, 128.3, 128.0, 127.9, 127.8, 127.8, 127.7, 102.2, 82.8, 79.4, 74.8, 73.7, 73
.4, 72.0, 70.0, 69.4, 54.6, 31.9, 28.4. LCM
S(AP+):2.25分, 462.2(M-Boc+H)+.
ポレーターで乾燥させた。この物質を、4%から15%へのメタノールのジクロロメタン溶液勾配で溶離させるシリカゲルカラムで精製して、表題化合物を無色ゴム状物として得た(12mg、60%)。1H-NMR(メタノール-d4)δ:5.21(d, J=1
.6Hz, 1H), 3.95(dd, J=10.1,1.2Hz, 1H), 3.9
2(d, J=11.3Hz, 1H), 3.87(d, J=1H), 3.81(d, J=11.3Hz, 1H), 3.75(d, J=8.2Hz, 1H), 3.71-
3.76(m, 2H), 3.68(d, J=8.2Hz, 1H), 3.35(s, 1H), 2.26(q, J=7.4Hz, 2H), 1.13(t, J=7.4Hz
, 3H)。13C-NMR(メタノール-d4)δ:177.7, 102.6, 84.9, 70.4, 69.1, 69.0, 61.9, 56.0, 30.0, 10.3。
LCMS(AP+):0.25分, 248.2(M+H)+.
1H), 3.90(d, J=7.0Hz, 1H), 3.88-3.95(m, 2H
), 3.82(d, J=11.7Hz, 1H), 3.78(d, J=7.8Hz, 1H), 3.71(d, J=7.8Hz, 1H), 3.35(s, 1H). 13C-NMR(メタノール-d4)δ:159.8,102.3,85.5,70.8,69.
7,68.4,62.2,57.4. 19F-NMR(クロロホルム-d)δ:-77.
0(s). LCMS(AP+):0.42分, 288.2(M+H)+.
(ベンジルオキシ)メチル)-6,8-ジオキサビシクロ[3.2.1]オクタン-4-イル)メタンスルホンアミド(1-n-4)(19mg、0.035mmol)、1-メチル-1,4-シクロヘキサジエン(0.093mL、0.81mmol)、活性炭上の10%Pd(20mg)及び2-プロパノール(2.5mL)の混合物を、80℃で3時間攪拌した。水(0.2ml)を加え、この混合物全体をシリカゲルにロードし、ロータリーエバポレーターで乾燥させた。この物質を、4%から15%へのメタノールのジクロロメタン溶液勾配で溶離するシリカゲルカラムで精製して、表題化合物を無色ゴム状物(6.4mg、68%)として得た。1H-NMR(メタノール-d4)δ:5.26(d,
J=1.6Hz, 1H), 3.91(d, J=11.3Hz, 1H), 3.87(d, J=4.3Hz, 1H), 3.80(d, J=11.3Hz, 1H), 3.73(d, J=7.8Hz, 1H), 3.68(d, J=7.8Hz, 1H), 3.66-3.71(m, 1H), 3.37(dd, J=9.8,1.6Hz, 1H),
3.35(s, 1H), 3.04(s, 3H). 13C-NMR(メタノール-d4)δ:104.6, 85.1, 70.9, 69.8, 69.3, 62.0, 60.2, 41.7. LCMS(ES-):0.15分, 268.0(M-H)-.
a=292]。1H-NMR(メタノール-d4)δ:6.06(t, J=54.2Hz
, 1H), 5.25(s, 1H), 4.02(d, J=9.4Hz, 1H), 3
.92(d, J=11.7Hz, 1H), 3.84-3.90(m, 2H), 3.
81(d, J=11.7Hz, 1H), 3.78(d, J=8.2Hz, 1H), 3.70(d, J=8.2Hz, 1H).
トリフルオロプロパンアミド(28)
9(d, J=9.8Hz, 1H), 3.92(d, J=11Hz, 1H), 3.87(d, J=4.3Hz, 1H), 3.81(d, J=11.3Hz, 1H), 3.76(d, J=8.2Hz, 1H), 3.71-3.74(m, 1H), 3.6
9(d, J=8.2Hz, 1H), 3.22(qd, J=10.7,2.5Hz,
2H)
合物(3:1). 回転異性体l:1H-NMR(クロロホルム-d)d:7.21-7.43(m, 15H), 5.37(s, 1H), 4.93(d, J=10.9Hz, 1H), 4.65(d, J=11.7Hz, 1H), 4.54(d, J=11.3
Hz, 1H), 4.50(d, J=11.7Hz, 1H), 4.37-4.45(
m, 2H), 4.15(d, J=9.8Hz, 1H), 4.09(d, J=3.5Hz, 1H), 3.93(d, J=8.6Hz, 1H), 3.85(dd, J=10.1,3.5Hz, 1H), 3.78(d, J=8.2Hz, 1H), 3.64
(d, J=8.2Hz, 1H), 3.45(d, J=8.6Hz, 1H), 2.80(s, 3H), 2.19(s, 3H). 回転異性体2:1H-NMR(クロロホル
ム-d)d:7.21-7.43(m, 15H), 5.27(s, 1H), 5.12(d, J=10.9Hz, 1H), 4.94-4.98(m, 1H), 4.74(
d, J=12.1Hz, 1H), 4.56(d, J=11.7Hz, 1H), 4.46(d, J=11.3Hz, 1H), 4.37-4.46(m, 2H), 4.1
4-4.17(m, 1H), 3.97(d, J=8.6Hz, 1H), 3.82-
3.89(m, 2H), 3.79(d, J=8.2Hz, 1H), 3.60-3.
63(m, 1H), 2.71(s, 3H), 2.08(s, 3H). 13C-NMR(クロロホルム-d)d:172.2, 138.0, 137.3, 137.2, 128.6, 128.5, 128.5, 128.4, 128.1, 128.0, 127.9, 127.9, 127.9, 127.8, 103.2, 83.2, 75.2,
74.1, 73.8, 73.7, 73.0, 72.4, 70.1, 69.2, 61.2, 28.0, 22.2. LCMS(AP+):1.99分, 518.0(M+H)+.
NMR(クロロホルム-d)δ:7.25-7.39(m, 15H), 5.39(d,
J=0.8Hz, 1H), 4.93(d, J=11.7Hz, 1H), 4.80(d, J=11.3Hz, 1H), 4.58(d, J=11.3Hz, 1H), 4.45(d, J=11.7Hz, 1H), 4.43(d, J=11.7Hz, 1H)
, 4.41(d, J=11.7Hz, 1H), 4.21(d, J=3.5Hz, 1H), 4.18(d, J=10.5Hz, 1H), 3.98(d, J=8.6Hz
, 1H), 3.87(dd, J=10.5, 3.9Hz, 1H), 3.82(d,
J=8.6Hz, 1H), 3.62(d, J=8.2Hz, 1H), 3.45(d, J=9.0Hz, 1H), 2.83(s, 3H), 2.68(s, 3H). 13
C-NMR(クロロホルム-d)δ:138.1, 137.3, 136.8, 128
.7, 128.5, 128.4, 128.4, 128.1, 128.1, 128.0, 127.8, 128.1, 104.6, 82.9, 74.9, 73.8, 7
3.5, 73.3, 71.6, 70.3, 69.4, 59.7, 37.5, 29
.5. LCMS(AP+):2.08分, 575.8(M+Na)+.
ある)。
回転異性体1:1H-NMR(メタノール-d4)δ:7.08-7.48(m, 15
H), 5.26(s, 1H), 4.83-4.90(m, 1H), 4.73(d, J=11.7Hz, 1H), 4.47-4.58(m, 3H), 4.36-4.47(m, 2H), 4.21(d, J=3.5Hz, 1H), 3.98(dd, J=10.7, 3.3Hz, 1H), 3.92(dd, J=8.2Hz, 2H), 3.61(d, J=7.8Hz, 1H), 3.47(dd, J=8.6, 3.9Hz, 1H), 2.75(s, 3H), 1.42(s, 9H)
回転異性体2:1H-NMR(メタノール-d4)δ:7.08-7.48(m, 15
H), 5.21(s, 1H), 4.83-4.90(m, 1H), 4.73(d, J=11.7Hz, 1H), 4.47-4.58(m, 3H), 4.36-4.47
(m, 2H), 4.21(d, J=3.5Hz, 1H), 3.98(dd, J=10.7, 3.3Hz, 1H), 3.92(d, J=8.2Hz, 1H), 3.61(d, J=7.8Hz, 1H), 3.47(dd, J=8.6, 3.9Hz, 1H), 2.70(s, 3H), 1.44-1.52(m, 9H)
回転異性体1:1H-NMR(メタノール-d4)δ:5.20(s, 1H), 4.65(d, J=10.5Hz, 1H), 4.02-4.09(m, 1H), 3.89
-3.98(m, 2H), 3.84(s, 1H), 3.78-3.82(m, 1H
), 3.68(s, 1H), 3.11(s, 3H), 2.15(s, 3H)
回転異性体2:1H-NMR(メタノール-d4)δ:5.37(s, 1H), 4.02-4.09(m, 1H), 3.89-3.98(m, 3H), 3.84-3.87(m, 1H), 3.79-3.83(m, 1H), 3.71(d, J=8.2Hz
, 1H), 2.98(s, 3H), 2.15(s, 3H)
13C-NMR(メタノール-d4)δ:175.4,104.85.8, 71.3,
69.7, 66.2, 62.3, 59.1, 28.8, 22.7. LCMS(ES-):0.41分, 246.2(M-H)―
80℃で3時間撹拌した。水(0.2ml)を加え、この混合物全体をシリカゲルにロードし、ロータリーエバポレーターで乾燥させた。4%から15%へのメタノールのジクロロメタン溶液勾配で溶離させるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、表題化合物を無色ゴム状物として得た(2.9mg、51%)。1H-NMR(メタノール-d4)δ:5.26(d, J=1.2Hz, 1H), 4.00-4.05(m, 1H), 3
.92-3.96(m, 1H), 3.89-3.91(m, 1H), 3.84(d,
J=1.2Hz, 1H), 3.77-3.83(m, 2H), 3.68(d, J=7.8Hz, 1H), 3.35(s, 3H), 2.93(s, 3H). 13C-NMR(メタノール-d4)δ:106.1, 85.5, 71.5, 69.7, 65.9
, 62.6, 62.2, 37.8, 30.4. LCMS(ES-):0.42分, 282.0(M-H)-
回転異性体1:1H-NMR(メタノール-d4)δ::5.22(br.s., 1H
), 4.19(d, J=10.6Hz, 1H), 4.00(d, J=10.6Hz
, 1H), 3.90-3.95(m, 2H), 3.77-3.82(m, 2H), 3.67(d, J=7.6Hz, 1H), 2.94(s, 3H), 1.47(s, 9H)
回転異性体2:1H-NMR(メタノール-d4)δ:5.21(br.s., 1H)
, 4.05-4.10(m, 1H), 4.00(d, J=10.6Hz, 1H), 3.90-3.95(m, 2H), 3.77~3.82(m, 2H), 3.67(d, J=7.6Hz, 1H), 2.94(s, 3H), 1.47(s, 9H)
)-6,8-ジオキサビシクロ[3.2.1]オクタン-2,3-ジオール塩酸塩(32)
H-NMR(メタノール-d4)δ:5.63(s, 1H), 3.90-3.97(m
, 3H), 3.84(s, 2H), 3.78(d, J=8.2Hz, 1H), 3
.10-3.20(m, 1H), 2.84(s, 3H)
乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。得られた粗製物質に酢酸エチル(50mL)を加え、30分間撹拌した。得られた沈殿物を濾過した。濾液を減圧下で濃縮した。この粗製物質を、CombiFlash・Rf(ISCO・RediSep・Gold・80gシリカゲルカラム)を用い、0%から100%への酢酸エチル/ヘプタン勾配で溶離した後に、直ちに0%から20%へのメタノール/ジクロロメタン勾配で溶離して表題化合物を得た(1267mg、53.5%)。方法C:1.5分間の運転LRMS[M+Na=562]。1H-NMR(メタノール-d4)δ:7.13-7.45(m, 5H), 5.22(d, J=1.6Hz, 1H), 4.55(s, 2H), 4.30(d, J=5.9Hz, 1H), 4.15(t, J=6.4Hz, 1H), 3.89-3.9
7(m, 2H), 3.85(d, J=7.8Hz, 1H), 3.73-3.79(
m, 2H), 3.58-3.71(m, 16H), 1.98(s, 3H), 1.48(s, 3H), 1.33(s, 3H)
5H), 5.21(s, 1H), 4.55(s, 2H), 3.92-4.01(m, 2H), 3.88(d, J=4.3Hz, 1H), 3.77(d, J=7.8Hz, 1H), 3.70(dd, J=9.8,3.9Hz, 1H), 3.58-3.
68(m, 18H), 1.98(s, 3H)
), 4.16(t, J=6.6Hz, 1H), 3.93-3.97(m, 1H), 3.90-3.93(m, J=2.0Hz, 1H), 3.86(d, J=7.8Hz, 1H), 3.78(d, J=3.9Hz, 1H), 3.75(d, J=1.6Hz, 1H), 3.61-3.71(m, 14H), 3.37(t, J=4.9Hz
, 2H), 1.98(s, 3H), 1.49(s, 3H), 1.34(s, 3H
)
化合物を油状物として得た(43.3mg、58%)。方法C:3分間運転LRMS[M-1=433]。1H-NMR(メタノール-d4)δ:5.21(d, J=0.8, 1H), 3.98(d, J=9.8Hz, 1H), 3.94(d, J=9.8Hz, 1H), 3.89(d, J=4.3Hz, 1H), 3.78(d, J=7.8Hz
, 1H), 3.72(dd, J=10.1,4.3Hz, 1H), 3.61-3.
69(m, 16H), 3.38(t, J=4.9Hz, 2H), 1.99(s, 3H)
5.7Hz, 1H), 5.28(dd, J=17.4, 1.4Hz, 1H), 5.23(d, J=1.6Hz, 1H), 5.16(dd, J=10.3, 1.0Hz
, 1H), 4.31(d, J=5.9Hz, 1H), 4.15(t, J=6.4Hz, 1H), 4.02(d, J=5.5Hz, 2H), 3.89-3.97(m, 2H), 3.86(d, J=7.8Hz, 1H), 3.73-3.80(m, 2H
), 3.56-3.72(m, 12H), 1.98(s, 3H), 1.49(s,
3H), 1.34(s, 3H).
), 5.28(dd, J=17.2,1.6Hz, 1H), 5.21(d, J=0
.8Hz, 1H), 5.16(dd, J=10.5, 1.2Hz, 1H), 4.02(d, J=5.5Hz, 2H), 3.98(d, J=9.8Hz, 1H), 3.95(d, J=10.1Hz, 1H), 3.89(d, J=3.9Hz, 1H), 3.78(d, J=8.2Hz, 1H), 3.71(dd, J=10.0,4.5Hz, 1H), 3.57-3.68(m, 14H), 1.99(s, 3H).
-NMR(メタノール-d4)δ:5.23(d, J=1.6Hz, 1H), 4.31(d, J=5.9Hz, 1H), 4.19(d, J=2.3Hz, 2H), 4.16(t, J=6.4Hz, 1H), 3.90-3.97(m, 2H), 3.86(
d, J=7.8Hz, 1H), 3.74-3.79(m, 2H), 3.60-3.
72(m, 12H), 2.85(t, J=2.3Hz, 1H), 1.98(s, 3H), 1.49(s, 3H), 1.34(s, 3H)
, 3.78(d, J=8.2Hz, 1H), 3.71(dd, J=10.0, 4.1Hz, 1H), 3.60-3.69(m, 14H), 2.86(s, 1H), 1
.99(s, 3H)
)。Hキューブに通した後にこの溶液を収集し、減圧下に濃縮し、ゴム状物として表題化合物を得た(17.2mg、46%)。方法C:3分間運転LRMS[M+1=409]。1H-NMR(メタノール-d4)δ:5.21(s, 1H), 3.92-4.00(m, 2H), 3.89(d, J=3.9Hz, 1H), 3.78(d, J=8.2Hz, 1H), 3.69-3.748m, 1H), 3.61-3.69(m, 14
H), 3.56(t, J=5.1Hz, 2H), 2.85(t, J=5.1Hz, 2H), 1.99(s, 3H)
86mmol)をメタノール(2mL)に溶解し、Hキューブに通した(条件:触媒(炭素上の20%水酸化パラジウム(30×4mm)、流速:1mL/分、温度:60℃、圧力=全H2)。H-キューブに通過させた後、溶液を収集し、減圧下で濃縮して、表題化
合物を得た(32.2mg、91%)。1H-NMR(メタノール-d4)δ:5.21(s, 1H), 3.98(d, J=9.4Hz, 1H), 3.95(d, J=10.1Hz, 1H), 3.89(d, J=4.3Hz, 1H), 3.78(d, J=8.2Hz, 1H), 3.71(dd, J=9.8,4.3Hz, 1H), 3.61
-3.69(m, 16H), 3.54-3.59(m, 2H), 1.99(s, 3
H). 13C-NMR(メタノールd4)δ:174.1, 102.6, 84.3, 7
3.8, 72.5, 71.7, 71.7(2), 71.6, 71.5, 71.4,
70.5, 70.2, 69.0, 62.4, 56.4, 22.7
を収集し、減圧下で濃縮して、表題化合物をゴム状物として得た(2.5g、100%)。方法C:1.5分間運転LRMS[M+1=450]。1H-NMR(メタノール-d4)δ:5.23(d, J=1.6Hz, 1H), 4.31(d, J=5.9Hz,
1H), 4.16(t, J=6.4Hz, 1H), 3.89-3.97(m, 2H
), 3.86(d, J=7.8Hz, 1H), 3.74-3.80(m, 2H), 3.60-3.71(m, 14H), 3.53-3.59(m, 2H), 1.98(s, 3H), 1.49(s, 3H), 1.34(s, 3H)
チルエーテル(8mL)で希釈し、2回目にデカントした。デカントした溶液を、0.45μmのナイロン膜を備えたLife・Science・Acrodisc・25mmシリンジフィルターに通した。収集した溶液を減圧下で濃縮して、表題化合物をゴム状物(65.0mg、37%)として得た。方法C:3分間運転LRMS[M+1=448]。1H-NMR(クロロホルム-d)δ:9.74(s, 1H), 5.63(d, J=9.0Hz, 1H), 5.34(d, J=1.6Hz, 1H), 4.23(d, J=5.9Hz, 1H), 4.17(s, 2H), 4.09-4.15(m, 1H), 4.01(t, J=6.2Hz, 1H), 3.97(d, J=10.1Hz, 1H
), 3.77-3.85(m, 3H), 3.68-3.76(m, 5H), 3.6
1-3.68(m, 7H), 2.03(s, 3H), 1.56(s, 3H), 1.36(s, 3H).
MR(メタノール-d4)δ:5.24(s, 1H)4.14(2H)3.97(d,
J=10.1Hz, 2H)3.90(d, J=3.9Hz, 1H)3.81(d, J=7.8Hz, 1H), 3.63-3.77(m, 15H), 2.01(s, 3H
)
ール-d4)δ:5.23(d, J=2.0Hz, 1H), 4.34-4.40(m,
2H), 4.31(d, J=5.9Hz, 1H), 4.15(t, J=6.4,
1H), 3.89-3.97(m, 2H), 3.86(d, J=7.8Hz, 1H
), 3.72-3.81(m, 4H), 3.59-3.71(m, 12H), 3.
11(s, 3H), 1.98(s, 3H), 1.48(s, 3H), 1.34(s, 3H)
-d4)δ:5.23(d, J=1.6Hz, 1H), 4.31(d, J=5.9H
z, 1H), 4.16(t, J=6.4Hz, 1H), 3.90~3.97(m, 2H), 3.86(d, J=7.8Hz, 1H), 3.74-3.79(m, 2H
), 3.55-3.72(m, 14H), 3.08(t, J=6.6Hz, 2H)
, 2.32(s, 3H), 1.98(s, 3H),1.49(s, 3H), 1.34(s, 3H)
ノール-d4)δ:5.23(s, 1H), 4.00(d, J=9.8Hz, 1H)
, 3.97(d, J=9.8ヘルツ, 1H), 3.91(d, J=4.3Hz, 1H), 3.80(d, J=7.8Hz, 1H), 3.73(dd, J=10.1,
4.3Hz, 1H), 3.63-3.70(m, 14H), 3.60(t, J=6
.6Hz, 2H), 3.10(t, J=2H), 2.34(s, 3H), 2.01(s, 3H)
0mL)を加え、10分間撹拌した。このメタノール溶液を、メタノール(2mL)及び酢酸(1mL)の混合物中の2,2’-ジスルファンジイルジピリジン(35.3mg、0.160mmol)の撹拌溶液に滴下して加えた。この反応物を室温で2時間攪拌した。2時間後、この反応物を減圧下で濃縮した。CombiFlash・Rf(RediSep・gold・4gシリカゲルカラム)を用い、この粗製物質を0%から20%へのメタノール/ジクロロメタン勾配で溶離して精製し、表題化合物を得た(31.4mg、55%)。方法C:3分間運転LRMS[M+Na=557]。1H-NMR(メタノール
-d4)δ:8.39(d, J=4.3Hz, 1H), 7.94(d, J=8.2H
z, 1H), 7.83(td, J=7.8,1.6Hz, 1H), 7.22(d, J=6.8,5.3Hz, 1H), 5.21(s, 1H), 3.92-4.00(m, 2H), 3.88(d, J=4.3Hz, 1H), 3.77(d, J=7.8Hz, 1H), 3.71(t, J=6.0Hz, 3H), 3.59-3.67(m, 12H), 3.52-3.58(m, 2H), 3.02(t, J=6.0Hz, 2
H), 1.99(s, 3H)
ヘキシル]カルバメート(1-q―1)
2.0Hz, 6H), 3.79(s, 6H), 3.03-3.20(m, 2H), 2.83(t, J=2.1Hz, 3H), 2.18(t, J=7.2Hz, 2H)
, 1.59(quin, J=7.3Hz, 2H), 1.44-1.54(m, 2H
), 1.28-1.40(m, 2H)
7.77-7.84(m, 1H), 7.21(dd, J=6.6,5.5Hz, 1
H), 2.77-2.90(m, 6H), 2.61(t, J=7.2Hz, 2H)
, 1.63-1.83(m, 4H), 1.46-1.59(m, 2H)
85-7.90(m, 1H), 7.78-7.84(m, 1H), 7.19-7.25(m, 1H), 4.06-4.23(m, 6H), 3.72-3.84(m, 6
H), 2.78-2.87(m, 5H), 2.12-2.20(m, 2H), 1.
71(quin, J=7.3Hz, 2H), 1.57(quin, J=7.3Hz,
2H), 1.36-1.50(m, 2H)
2.81(s, 4H), 2.73(t, J=7.2Hz, 2H), 1.99(quin, J=6.6Hz, 2H)
3.78(s, 6H), 3.51(t, J=6.2Hz, 2H), 2.28(t, J=7.2Hz, 2H), 1.79-1.94(m, 2H)
J=1.6Hz, 3H), 4.51-4.63(m, 12H), 4.29(d, J=5.9Hz, 3H), 4.16(t, J=6.4Hz, 3H), 3.87-3.
96(m, 12H), 3.84(d, J=7.8Hz, 3H), 3.73-3.8
0(m, 6H), 3.64-3.72(m, 12H), 3.54-3.63(m,
30H), 1.98(s, 9H), 1.48(s, 9H), 1.40(s, 9H), 1.33(s, 9H)
.1.0~2,6~]ウンデカ-1-イル]-2,5,8,11-テトラオキサトリデカン-13-イル}-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ]-2-{[(1-{1-[(1S,2R,6R,7R,8S)-7-(アセチルアミノ)-4,4-ジメチル-3,5,9,11-テトラオキサトリシクロ[6.2.1.0~2,6~]ウンデカ-1-イル]-2,5,8,11-テトラオキサトリデカン-13-イル}-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ]メチル}プロパン-2-イル)-6-(ピリジン-2-イルジスルファニル)ヘキサンアミド(1-x-1)
:8.38(d, J=4.7Hz, 1H), 7.97(s, 3H), 7.82-7
.88(m, 1H), 7.78-7.81(m, 1H), 7.20(t, J=5.
9Hz, 1H), 5.23(s, 3H), 4.52-4.62(m, 12H), 4.29(d, J=5.9Hz, 3H), 4.15(t, J=6.4Hz, 3H), 3.86-3.96(m, 12H), 3.81-3.85(m, 3H), 3.72-3.80(m, 12H), 3.54-3.71(m, 36H), 2.79(t, J
=7.2Hz, 2H), 2.16(t, J=7.2Hz, 2H), 1.98(s, 9H), 1.64-1.73(m, 2H), 1.50-1.57(m, 2H), 1
.48(s, 9H), 1.42(d, J=6.6Hz, 2H), 1.32(s, 9H)
.0mg、6.8mmol)を加え、続いて水(12mL)を添加し、続いてアスコルビン酸ナトリウム(3690mg、18.2mmol)を無希釈で加え、この反応物を窒素で10分間パージした。硫酸銅(II)(294mg、1.82mmol)を水1mLに
て加え、室温で24時間撹拌した。24時間後、この反応混合物を飽和塩化アンモニウム(50mL)及び水酸化アンモニウム(5mL)に加えて反応を停止させ、ジクロロメタン(45mL)で3回抽出した。合わせた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。この粗製物質を、CombiFlash・Rf(RediSep・80g・ゴールド・シリカゲルカラム)を使用し、0%から20%へのメタノール/ジクロロメタン勾配で溶離することにより精製して、表題化合物を固体の純粋でない表題化合物として得た(1890.0mg、54.4%)。この粗製物(1270.0mg、36.5%)を、CombiFlash・Rf(RediSep・80g・ゴールド・シリカゲルカラム)を用い、0%から20%へのメタノール/ジクロロメタン勾配で溶離して表題化合物(607.0mg、17.5%)を得た。表題化合物の全収量2.497g(72%)。方法C:3分間運転LRMS[M+1=1907]。1H-NMR(メタノール
-d4)δ:7.99(s, 3H), 7.21-7.47(m, 5H), 5.25(
d, J=1.6Hz, 3H), 5.07(s, 2H), 4.53-4.62(m, 12H), 4.31(d, J=5.9Hz, 3H), 4.18(t, J=6.4H
z, 3H), 3.88-3.98(m, 12H), 3.85(d, J=7.8Hz
, 3H), 3.74-3.81(m, 12H), 3.53-3.71(m, 36H
), 3.10(q, J=6.2Hz, 2H), 2.18(t, J=7.2Hz, 2H), 2.00(s, 9H), 1.53-1.65(m, 2H), 1.50(s, 11H), 1.34(s, 11H)
残渣をジメチルスルホキシド(1mL)に溶解し、逆相HPLCで精製した。カラム:Waters Sunfire C18 19×100、5u。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。勾配:8.5分で80%H2O/20.0%アセトニトリルから直線で65%H2O/35%アセトニトリルへ、9.0分まで0%H2O/100%MeCNへ、9.0から10.0
分まで0%H2O/100%アセトニトリルを維持。流量:25mL/分。47.6mg
の表題化合物をゴム状物として得た(保持時間2.87、観測された質量=890.4376)。
カラム:Waters Atlantis dC18 4.6×50、5u。移動相A
:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。3.75分で95.0%H2O/50%アセトニトリルから直線で50%H2O/50%アセトニトリルへ、4.0分まで5%H2O/95%アセトニトリルへ、4.
0から5.0分まで5%H2O/95%アセトニトリルを維持。流量:2mL/分。保持
時間2.87、観測された質量=890.4376。方法C:3分間運転LRMS[1/2M=889]。1H-NMR(メタノール-d4)δ:8.41(d, J=4.7Hz
, 1H), 7.99(s, 3H), 7.84-7.91(m, 2H), 7.26(t, J=5.9Hz, 1H), 5.21(s, 3H), 4.58(t, J=5.0Hz, 6H), 4.56(s, 6H), 3.95(t, J=8.8Hz, 6H),
3.89(t, J=5.0Hz, 6H), 3.86-3.88(m, 3H), 3.74-3.78(m, 9H), 3.71(dd, J=9.4,4.1Hz, 3H),
3.54-3.67(m, 42H), 2.80(t, J=7.0Hz, 2H), 2.16(t, J=7.3Hz, 2H), 1.99(s, 9H), 1.68(qui
n, J=7.3Hz, 2H), 1.50-1.57(m, 2H), 1.35-1.
44(m, 2H)
-ブチル(1,3-ビス[(1-{1-[(1S,2R,6R,7R,8S)-7-(アセチルアミノ)-4,4-ジメチル-3,5,9,11-テトラオキサトリシクロ[6.2.1.0~2,6~]ウンデカ-1-イル]-2,5,8,11-テトラオキサトリデカン-13-イル}-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ]-2-{[(1-{1-[(1S,2R,6R,7R,8S)-7-(アセチルアミノ)-4,4-ジメチル-3,5,9,11-テトラオキサトリシクロ[6.2.1.0~2,6~]ウンデカ-1-イル]-2,5,8,11-テトラオキサトリデカン-13-イル}-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ]メチル}プロパン-2-イル)カルバメート(1-w-1)(210mg、0.119mmol)の溶液を、一晩70℃に加熱した。18時間後、この反応物を室温に冷却し、減圧下で濃縮した。この粗製物質をトルエン及びメタノールで希釈し、減圧下で濃縮した。この粗製物質をトルエンで2回目に希釈し、減圧下で濃縮した。この粗製物質をジクロロメタン(10mL)及びメタノール(4mL)で希釈し、これにジオキサン(2.0mL、8mmol)中の4.0M塩化水素を加えた。この反応混合物を室温で一晩撹拌した。18時間後、この反応物を減圧下で濃縮した。この粗製物質を酢酸エチル(1mL)で希釈し、これにヘプタン(10mL)を加え、減圧下で濃縮した。次いで、この物質を高真空下に18時間置き、表題化合物を固体として得た(198.8mg、106%)。方法C:3分間運転LRMS[M+Na=1561]。1H-NMR(メタノール-d4)δ:8.13-8.21(m, 3H
), 5.22(s, 3H), 4.71(s, 9H), 4.65(d, J=4.7Hz, 6H), 3.92-4.00(m, 12H), 3.90(d, J=4.3Hz
, 3H), 3.58-3.80(m, 51H), 2.02(s, 9H)
残渣をジメチルスルホキシド(1mL)に溶解し、逆相HPLCで精製した。カラム:Waters Sunfire C18 19×100,5u。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。勾配:10.5分で90.0%H2O/10.0%アセトニトリルから直線で70%H2O/30%アセトニトリルへ、0.5分で70%H2O/30%アセトニトリルから直線で0
%H2O/100%MeCNへ、11.0から12.0分まで0%H2O/100%アセトニトリルを維持。流量:25mL/分。
カラム:Waters Atlantis dC18 4.6×50、5u。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。MobCe相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。4.0分で95.0%H2O/5.0%アセトニトリルから直線で5
%H2O/95%アセトニトリルへ、4.0から5.0分まで5%H2O/95%アセトニトリルを維持。流量:2mL/分。保持時間1.77、観測された質量=839.7097。方法C:3分間運転LRMS[M+1=1678]。1H-NMR(メタノール-d4)δ:8.00(s, 3H), 5.21(s, 3H), 4.58(t, J=4.7
Hz, 6H), 4.57(s, 6H), 3.95(m, 9H), 3.85~3.92(m, 9H), 3.74~3.80(m, 9H), 3.71(dd, J=10.
0,4.1Hz, 3H), 3.55~3.68(m, 42H), 3.25(t, J
=6.5Hz, 2H), 2.19(t, J=7.3Hz, 2H), 1.99(s, 9H), 1.52-1.62(m, 4H), 1.33-1.41(m, 2H)
残渣をジメチルスルホキシド(1mL)に溶解し、逆相HPLCで精製した。カラム:Waters Sunfire C18、19×100、5u。移動相A:0.05%TFA/水(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。10.5分で55%H2O/95%アセトニトリルから直線で55%H2O/45%アセトニトリルへ、0.5分で55%H2O/45%アセトニトリルから直線で0%H2O/100%MeCNへ、11.0分から12.0分まで0%H2O/100%アセトニトリルを維持
。流量:25mL/分。
カラム:Waters Atlantis dC18、4.6×50、5u。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。4.0分で95.0%H2O/5.0%アセトニトリルから直線で5%H2O/95%アセトニトリルへ、4.0分から5.0分まで5%H2O/95%アセトニトリ
ルを維持。流量:2mL/分。保持時間=1.81。観測された質量=825.2381。方法C:3分間運転LRMS[M-1=1647]。1H-NMR(メタノール-d4)δ:7.99(s, 3H), 5.69-5.88(m, 1H), 5.21(s, 3
H), 4.95(m, 2H), 4.51-4.63(m, 12H), 3.95(t
, J=9.7Hz, 6H), 3.85-3.91(m, 9H), 3.74-3.8
1(m, 9H), 3.71(dd, J=9.4,4.1Hz, 3H), 3.54-
3.68(m, 42H), 2.17(t, J=7.3Hz, 2H), 2.01-2
.09(m, 2H), 1.99(s, 9H), 1.52-1.61(m, 2H), 1.39(quin, J=7.5Hz, 2H)
残渣をジメチルスルホキシド(1mL)に溶解し、逆相HPLC(カラム:Waters Sunfire C18、19×100、5u)で精製した。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。10.5分で95%H2O/5.0%アセトニトリルから直線で55%H2O/45%アセトニトリルへ、0.5分で55%H2O/45%アセトニトリルから直線で0%H2O/100%MeCNへ、11.0分から12.0分まで0%H2O/100%アセトニトリル
を維持。流量:25mL/分。
カラム:Waters Atlantis dC18、4.6×50、5u。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。4.0分で95.0%H2O/5.0%アセトニトリルから5%H2O/95%アセトニトリルへ、4.0分から5.0分まで5%H2O/95%アセトニトリルを維
持。流量:2mL/分。保持時間=1.68。観測された質量=824.2237。方法C:3分間運転LRMS[1/2M=823]。1H-NMR(メタノール-d4)δ:7.99(s, 3H), 5.21(s, 3H), 4.59(t, J=5.0Hz, 6H), 4.56(s, 6H), 3.95(t, J=10.0Hz, 6H), 3.85-3.92(m, 9H), 3.74-3.79(m, 9H), 3.71(dd,
J=10.0, 4.1Hz, 3H), 3.54-3.67(m, 41H), 2.1
3-2.24(m, 6H), 1.99(s, 9H), 1.66(quin, J=7
.5Hz, 2H), 1.50(quin, J=7.3Hz, 2H)
-d4)δ:4.12(q, J=7.0Hz, 2H), 2.83(s, 4H), 2.64(t, J=7.2Hz, 2H), 2.33(t, J=7.2Hz, 2H), 1.74(quin, J=7.4Hz, 2H), 1.58-1.68(m, 2H),
1.40-1.53(m, 2H), 1.24(t, J=7.0Hz, 3H).
5mL、0.190mmol)を添加した。この反応物を室温で3時間攪拌した。3時間後、この反応物を減圧下で濃縮した。この粗製物質をジメチルスルホキシド(1mL)で希釈し、シリンジフィルターで濾過した。この溶液を、以下の条件を用いて逆相クロマトグラフィーで精製し、表題化合物をゴム状物として得た(3.7mg、11%)。
残渣をジメチルスルホキシド(1mL)に溶解し、逆相HPLC(カラム:Waters Sunfire C18、19×100、5u)で精製した。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v))。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。10.5分で90.0%H2O/10.0%アセトニトリルから直線で70%H2O/30%アセトニトリルへ、0.5分で70%H2O/30%アセトニトリルから直線で0%
H2O/100%MeCNへ、11.0分から12.0分まで0%H2O/100%アセトニトリルを維持。流量:25mL/分。
カラム:Waters Atlantis dC18、4.6×50、5u。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。4.0分で95.0%H2O/5.0%アセトニトリルから直線で5%H2O/95%アセトニトリルへ、4.0分から5.0分まで5%H2O/95%アセトニトリ
ルを維持。流量:2mL/分。保持時間=1.58分。観察された質量=839.7097)。方法C:MassLynx\Acid_3.0Min.olp-LRMS[M+1=1681]。1H-NMR(メタノール-d4)δ:7.99(s, 3H), 5.21(s, 3H), 4.58(t, J=4.7Hz, 6H), 4.56(s, 6H),
3.95(t, J=9.7Hz, 6H), 3.89(dt, J=9.8,4.8H
z, 9H), 3.74-3.79(m, 9H), 3.71(dd, J=10.0,
4.1Hz, 3H), 3.53-3.67(m, 42H), 2.25(t, J=7
.3Hz, 2H), 2.17(t, J=7.3Hz, 2H), 1.99(s, 9H), 1.58(dquin, J=14.3,7.3Hz, 4H), 1.31~1.39(m, 1H),
ノール-d4)δ:7.98(s、3H)、7.19-7.43(m、5H)、5.21
(s、3H)、5.06(s、2H)、4.50-4.66(m, 12H), 3.95(dd, J=9.6,5.7Hz, 6H), 3.86-3.91(m, 9H), 3
.74-3.78(m, 9H), 3.71(dd, J=10.0, 4.1Hz, 3
H), 3.54-3.67(m, 42H), 3.03-3.12(m, 2H), 2
.11-2.24(m, 2H), 1.98(s, 9H), 1.51-1.63(m,
2H), 1.43-1.51(m, 2H), 1.33(d, J=6.6Hz, 2H).
上の10%パラジウム(小カートリッジ)を用いたHキューブに通した。この溶液を集め、減圧下で濃縮して、表題化合物を白色泡状物として得た(572mg、93%)。方法C:3分間運転LRMS[M+1=1652]。1H-NMR(メタノール-d4)δ:8.00(s, 3H), 5.21(s, 3H), 4.59(t, J=4.9Hz, 6H), 4.56(s, 6H), 3.95(d, J=9.8Hz, 6H), 3.85-3.92(m, 9H), 3.74-3.79(m, 9H), 3.69-3.74(m, 3H), 3.55-3.69(m, 42H), 2.91(t, J=7.6Hz
, 2H), 2.20(t, J=7.2Hz, 2H), 1.99(s, 9H), 1
.90(s, 3H), 1.52-1.68(m, 4H), 1.34-1.43(m,
2H)
ソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサンアミド(49)
残渣をジメチルスルホキシド(1mL)に溶解し、逆相HPLCにより精製した。カラム:Waters Sunfire C18、19×100、5u。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。勾配:10.5分で80%H20/20.0%アセトニトリルから直線で75%H2O/25%アセトニトリルへ、11.0分まで0%H2O/100%MeCNへ、11.0分
から12.0分まで0%H2O/100%アセトニトリルを維持。流量:25mL/分。
カラム:Waters Atlantis dC18、4.6×50、5u。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。勾配:4.0分で95%H2O/5.0%アセトニトリルから直線で5%H2O/95%アセトニトリルへ、4.0分から5.0分まで5%H2O/95%アセトニト
リルを維持。流量:2mL/分。保持時間=1.69分。観察された質量観察=923.4907。方法C:3分間運転LRMS[M-1=1843]。1H-NMR(メタノー
ル-d4)δ:8.00(s, 3H), 6.80(s, 2H), 5.21(s, 3H), 4.59(t, J=5.0Hz, 6H), 4.56(s, 6H), 3.95(t, J=9.7Hz, 6H), 3.90(t, J=5.0Hz, 6H), 3.88(d, J=4.1Hz, 3H), 3.74-3.79(m, 9H), 3.71(d
d, J=10.0, 4.1Hz, 3H), 3.55-3.68(m, 42H), 3.48(t, J=7.0Hz, 2H), 3.12(t, J=7.0Hz, 2H), 2.11-2.23(m, 4H), 1.99(s, 9H), 1.53-1.66(m, 6H), 1.48(quin, J=7.2Hz, 2H), 1.24-1.36(
m, 4H)
-6,8-ジオキサビシクロ[3.2.1]オクタ-1-イル]-2,5,8,11-テトラオキサトリデカン-13-イル}-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ]メチル}プロパン-2-イル)ヘキサンアミド(48)(60mg、0.036mmol)の溶液に、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.0253mL、0.145mmol)及び6-[(ブロモアセチル)アミノ]ヘキサン酸ペンタフルオロフェニル
残渣をジメチルスルホキシド(1mL)に溶解し、逆相HPLCにより精製した。カラム:Waters Sunfire C18、19×100、5u。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中0.05%TFA(v/v)。勾配:10.5分で80%H2O/20.0%アセトニトリルから直線で75%H2O/25%アセトニトリルへ、11.0分まで0%H2O/100%MeCNへ、11.0分か
ら12.0分まで0%H2O/100%アセトニトリルを維持。流量:25mL/分。
カラム:Waters Atlantis dC18、4.6×50、5u。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。勾配:4.0分で95%H2O/5.0%アセトニトリルから直線で5%H2O/95%アセトニトリルへ、4.0分から5.0分まで5%H2O/95%アセトニト
リルを維持。流量:2mL/分。保持時間=1.64分。観測された質量=944.1543。方法C:3分間運転LRMS[M+1=1886]。1H-NMR(メタノール-
d4)δ:7.99(s, 3H), 5.21(s, 3H), 4.57-4.62(m
, 6H), 4.56(s, 6H), 3.92-3.98(m, 6H), 3.83-3.91(m, 10H), 3.80(s, 2H), 3.69-3.79(m, 12
H), 3.54-3.68(m, 43H), 3.13(t, J=6.7Hz, 2H
), 2.18(d, J=6.5Hz, 4H), 1.98(s, 9H), 1.59-1.67(m, 2H), 1.51-1.59(m, 4H), 1.48(br.s.,
2H), 1.27-1.41(m, 4H)
(2S)-シクロペンチル{[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]アミノ}エタン酸
ロピルアルコール(4:1)(50mL)を用いて6回抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、乾固するまで濃縮して、表題化合物を白色固体として得た(403mg、93.7%)。
H-NMR(400MHz, DMSO)δ:9.95(s, 1H), 8.09(d, 1H), 7.90-7.88(d, 2H), 7.73-7.71(t, 2H), 7
.55-7.53(t, 2H), 7.41(t, 2H), 7.34-7.30(t,
2H), 7.24-7.22(d, 2H), 5.96(t, 1H), 5.39(s, 2H), 5.11-5.08(t, 1H), 4.44-4.42(d, 3H), 4.32-4.23(m, 3H), 3.96-3.92(t, 1H), 3.01-3.00(m, 3H), 2.15-2.13(m, 1H), 1.66-1.24(m,
12H)、C35H41N5O6についてのm/z:628.4(M+H)+、保持時間:4.213分
カラム:DIKMA・Diamonsil(2)C18、200*20mm*5um。移動相:水中の30%アセトニトリル(0.1%TFA)から水中の50%アセトニトリル(0.1%TFA)。波長=220nm。ワークアップ:濃縮し、凍結乾燥する。
カラム:Ultimate・XB-C18、3*50mm、3um。保持時間:4.33分。移動相:A、水(4Lの水中の2.7mLのTFA)。B:アセトニトリル(4Lのアセトニトリル中の2.5mLのTFA)、溶離勾配1%から100%。波長:220nm。ee値:100%。カラム:Chiralcel・OD-3、50*4.6mm、I.D.3um。保持時間:1.923分。移動相:5%から40%のCO2中エタノー
ル(0.05%DEA)。流速:2.5mL/分。波長:254nm。ee値=100%
。カラム:AD-3、50*4.6mm、I.D.3μm。保持時間:1.981分。移動相:5%から40%のCO2中エタノール(0.05%DEA)。流速:2.5mL/
分。波長:220nm
、濾過し、濾過ケーキを濃縮乾固して、表題化合物(300mg、67.8%)を固体として得、これを精製することなく次のステップに使用した。
2H), 5.25(s, 2H), 4.39(m, 1H), 4.23-4.19(m, 1H), 3.37(m, 1H), 3.03-2.96(m, 2H), 2.14-2.11(m, 3H), 1.70-1.19(m, 19H)。LC-MS:C37H45
N7O11についてのm/z:764.3(M+H)+。保持時間:0.823分。
残渣をジメチルスルホキシド(1mL)に溶解し、逆相HPLCにより精製した。カラム:Waters Sunfire C18、19×100、5u。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。勾配:10.5分で75.0%H2O/25.0%アセトニトリルから直線で65%H2O/35%アセトニトリルへ、11.0分まで0%H2O/100%MeCNへ、11.
0分から12.0分まで0%H2O/100%アセトニトリルを維持。流量:25mL/
分。
カラム:Waters Atlantis dC18、4.6×50、5u。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。4.0分で95.0%H2O/5.0%アセトニトリルから直線で5%H2O/95%アセトニトリルへ、4.0分から5.0分まで5%H2O/95%アセトニトリ
ルを維持。流量:2mL/分。保持時間=1.99分。観測された質量=1139.1254。方法C:1.5分間運転LRMS[1/2M=1138]。1H-NMR(メタノ
ール-d4)δ:7.99(s, 3H), 7.57(d, J=8.2Hz, 2H), 7.30(d, J=8.2Hz, 2H), 6.79(s, 2H), 5.21(s, 3H), 5.01(s, 2H), 4.55-4.64(m, 12H), 4.51(
dd, J=9.0,5.1Hz, 1H), 4.43(q, J=7.2Hz, 1H)
, 4.16(d, J=9.4Hz, 1H), 3.95(d, J=9.8Hz, 6H), 3.85-3.91(m, 9H), 3.74-3.79(m, 9H), 3.7
1(dd, J=9.8,4.3Hz, 3H), 3.54-3.67(m, 41H),
3.47(t, J=7.0Hz, 2H), 3.16-3.26(m, 1H), 3.10-3.16(m, 1H), 3.07(t, J=6.8Hz, 2H), 2.24
(q, J=7.7Hz, 3H), 2.16(t, J=7.4Hz, 2H), 1.99(s, 9H), 1.85-1.95(m, 1H), 1.42-1.84(m, 1
6H), 1.37(t, J=7.0Hz, 2H), 1.23-1.34(m, 5H
)
(メタノール-d4)δ:8.47(d, J=4.7Hz, 1H), 8.01(s,
3H), 7.93(d, J=3.5Hz, 2H), 7.30-7.38(s, 1H
), 5.21(s, 3H), 4.57-4.62(m, 6H), 4.57(s, 6H), 3.92-3.99(m, 6H), 3.89(dd, J=10.7,4.9Hz, 9H), 3.74-3.80(m, 9H), 3,72(d, J=9.8,4.
7Hz, 6H), 3.51-3.68(m, 55H), 3.35-3.41(m,
2H), 3.14(t, J=7.0Hz, 2H), 3.10(t, J=6.8Hz
, 2H), 2.64(t, J=7.0Hz, 2H), 2.43(t, J=6.0Hz, 2H), 2.17(t, J=7.4Hz, 2H), 1.99(s, 9H),
1.52-1.61(m, 2H), 1.43-1.51(m, 2H), 1.27-1.38(m, 2H)
残渣をジメチルスルホキシド(1mL)に溶解し、逆相HPLCにより精製した。カラム:Waters Sunfire C18、19×100、5u。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。勾配:8.5分で80.0%H2O/20.0%アセトニトリルから直線で70%H2O/30%アセトニトリルへ、9.0分まで0%H2O/100%MeCNへ、9.0から
10.0分まで0%H2O/100%アセトニトリルを維持。流量:25mL/分。
カラム:Waters Atlantis dC18、4.6×50、5u。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。勾配:4.0分で95.0%H2O/5.0%アセトニトリルから直線で5
%H2O/95%アセトニトリルへ、4.0分から5.0分まで5%H2O/95%アセトニトリルを維持。流量:2mL/分。保持時間=1.78分。観察された質量=699.6404
ノール-d4)δ:8.47(d, J=5.1Hz, 1H), 8.01(s, 3H)
, 7.92(d, J=3.5Hz, 2H), 7.30-7.39(m, 6H), 5.21(s, 3H),4.57(s, 6H), 3.92-3.99(m, 6H), 3.86-3.92(m, H), 3.74(m, 6H), 3.77(m, 9H), 3.69-3.74(m, 6H), 3.50-3.68(m, 73H), 3.14(t, J=7.0Hz, 2H), 3.10(t, J=7.0Hz, 2H), 2.64(t, J=6.8Hz, 2H), 2.43(t, J=6.0Hz, 2H), 2.17(t, J=7.4Hz, 2H), 1.99(s, 9H), 1.53-1.63(m
, 2H), 1.42-1.52(m, 2H), 1.32(dt, J=15.1, 7.5Hz, 2H)
残渣をジメチルスルホキシド(1mL)に溶解し、逆相HPLCにより精製した。カラム:Waters Sunfire C18、19×100、5u。移動相A:水中の0
.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。勾配:8.5分で80.0%H2O/20.0%アセトニトリルから直線で70%H2O/30%アセトニトリルへ、9.0分まで0%H2O/100%MeCNへ、9.0から
10.0分までは0%H2O/100%アセトニトリルを維持。流量:25mL/分。
カラム:Waters Atlantis dC18、4.6×50、5u。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。勾配:4.0分で95%H2O/5.0%アセトニトリルから直線で5%H2O/95%アセトニトリルへ、4.0分から5.0分まで5%H2O/95%アセトニト
リルを維持。流量:2mL/分。保持時間=1.85分。観測された質量=758.405
ノ)-4,4-ジメチル-3,5,9,11-テトラオキサトリシクロ[6.2.1.0~2,6~]ウンデカ-1-イル]-2,5,8,11-テトラオキサトリデカン-13-イル}-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ]メチル}プロパン-2-イル)アミノ]-6-オキソヘキシル}カルバメート(1-y-1)(1200mg、0.63mmol)を、メタノール(30mL)に溶解した。次いで、この溶液を、以下のパラメーター(温度=50℃、流速=1.0mL/分、圧力=全H2(1bar))
を使用して、炭素上の10%パラジウム(小カートリッジ)を使用したH-キューブに通した。この溶液を収集した。試料を取り出したところ、UPLCは出発物質が残っていることを示した。上記のパラメーターを用いて、この反応物を2回目にH-キューブに通した。収集した溶液を減圧下で濃縮して、表題化合物を白色泡状物として得た(1039mg、93%)。方法C:1.5分間運転LRMS[1/2M=886]。1H-NMR(
メタノール-d4)δ:7.99(s, 3H), 5.23(d, J=1.6Hz, 3
H), 4.45-4.62(m, 12H), 4.29(d, J=5.9Hz, 3H
), 4.16(t, J=6.4Hz, 3H), 3.87-3.98(m, 12H)
, 3.73-3.85(m, 15H), 3.54-3.70(m, 36H), 2.
87(t, J=7.6Hz, 2H), 2.20(t, J=7.2Hz, 2H), 1.98(s, 9H), 1.53-1.69(m, 4H), 1.48(s, 9H), 1.34-1.41(m, 2H), 1.33(s, 9H)
リシクロ[6.2.1.0~2,6~]ウンデカ-1-イル]-2,5,8,11-テトラオキサトリデカン-13-イル}-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ]-2-{[(1-{1-[(1S、2R、6R、7R、8S)-7-(アセチルアミノ)-4,4-ジメチル-3,5,9,11-テトラオキサトリシクロ[6.2.1.0~2,6~]ウンデカ-1-イル]-2,5,8,11-テトラオキサトリデカン-13-イル}-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ]メチル}プロパン-2-イル)ヘキサンアミド(1-ag-1)(105.0mg、0.0593mmol)の溶液に、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.031mL、0.178mmol)を添加し、10分間攪拌した後、1-{[6-(ピリジン-2-イルジスルファニル)ヘキサノイル]オキシ}ピロリジン-2,5-ジオン(1-s-1)(25.2mg、0.0711mmol)を加え、この反応物を16時間室温に加熱した。16時間後、この反応物を水(15mL)及びブライン(5mL)で希釈し、ジクロロメタン(20mL)で3回抽出した。合わせた有機層を水(20mL)、ブライン(20mL)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。この粗製物質をCombiFlash・Rf(RediSep・12g・シリカゲルカラム)を用い、0から20%へのメタノール/ジクロロメタン勾配で溶離して精製し、表題化合物を得た(56.6mg、50%)。方法C:MassLynx\Acid_3.0Min.olp-LRMS[1/2M+1=1006]。1H-NMR(メタノール-d4)δ:8.39(d, J=
4.7Hz, 1H), 7.98(s, 3H), 7.83-7.87(m, 1H), 7.77-7.83(m, 1H), 7.21(t, J=5.9Hz, 1H), 5.
23(d, J=1.6Hz, 3H), 4.50-4.64(m, 12H), 4.2
9(d, J=5.9Hz, 3H), 4.16(t, J=6.4Hz , 3H), 3.87-3.96(m, 12H), 3.84(d, J=7.8Hz, 3H), 3.
71-3.79(m, 15H), 3.54-3.70(m, 31H), 3.18-3.28(m, 2H), 3.13(q, J=6.5Hz, 2H), 2.82(t, J=7.2Hz, 2H), 2.12-2.23(m, 4H), 1.98(s, 9H)
, 1.71(quin, J=7.3Hz, 2H), 1.51-1.64(m, 6H
), 1.44-1.51(m, 11H), 1.28-1.34(m, 11H)
残渣をジメチルスルホキシド(1mL)に溶解し、逆相HPLCにより精製した。カラム:Waters Sunfire C18、19×100、5u。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。勾配:10.5分で80.0%H2O/20.0%アセトニトリルから直線で70%H2O/30%アセトニトリルへ、11.0分まで0%H2O/100%MeCNへ、11.
0分から12.0分まで0%H2O/100%アセトニトリルを維持。流量:25mL/
分。
カラム:Waters Atlantis dC18、4.6×50、5u。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。4.0分で95.0%H2O/5.0%アセトニトリルから直線で5%H2O/95%アセトニトリルへ、4.0分から5.0分まで5%H2O/95%アセトニトリ
ルを維持。流量:2mL/分。保持時間=1.96分。観測された質量=946.5137。
方法C:MassLynx\Acid_3.0Min.olp-LRMS[1/2M+
1=946]。1H-NMR(メタノール-d4)δ:8.45(d, J=5.1Hz, 1H), 8.01(s, 3H), 7.94(d, J=3.1Hz, 2H), 7.29-7.36(m, 1H), 5.21(s, 3H), 4.57-4.62(m, 6
H), 4.57(s, 6H), 3.92-4.00(m, 6H), 3.89(dd
, J=10.7,4.9Hz, 9H), 3.74-3.80(m, 9H), 3.7
1(dd, J=10.1,4.3Hz, 3H), 3.53-3.68(m, 42H), 3.13(t, J=6.8Hz, 2H), 2.85(t, J=7.2Hz, 2H), 2.17(t, J=7.2Hz, H), 1.99(s, 9H), 1.71(quin, J=7.4Hz, 2H), 1.52-1.64(m, 4H), 1.45(
td, J=15.0, 7.8Hz, 4H), 1.26-1.37(m, 2H)
ート
タノール-d4)δ:8.40(d, J=4.3Hz, 1H), 7.98(s, 3H
), 7.83-7.89(m, 1H), 7.75-7.83(m, 1H), 7.1
5-7.25(m, 1H), 5.22(d, J=1.2Hz, 3H), 4.51-
4.64(m, 12H), 4.29(d, J=5.9Hz, 3H), 4.23(t
, J=6.2Hz, 2H), 4.15(t, J=6.4Hz, 3H)3.86-3
.97(m, 12H), 3.83(d, J=7.8Hz, 3H), 3.72-3.
79(m, 12H), 3.53-3.69(m, 36H), 3.05(t, J=5
.7Hz, 4H), 2.17(t, J=7.0Hz, 2H), 1.98(s, 9H), 1.51-1.61(m, 2H), 1.48(s, 11H), 1.33(s, 11H)
残渣をジメチルスルホキシド(1mL)に溶解し、逆相HPLCにより精製した。カラム:Waters Sunfire C18、19×100、5u。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。勾配:10.5分で80.0%H2O/20.0%アセトニトリルから直線で70%H2O/30%アセトニトリルへ、11.0分まで0%H2O/100%MeCNへ、11.
0分から12.0分まで0%H2O/100%アセトニトリルを維持。流量:25mL/
分。
カラム:Waters Atlantis dC18、4.6×50、5u。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。4.0分で95.0%H2O/5.0%アセトニトリルから直線で5%H2O/95%アセトニトリルへ、4.0分から5.0分まで5%H2O/95%アセトニトリ
ルを維持。流量:2mL/分。保持時間=1.91分。観測された質量=933.4313。方法C:MassLynx\Acid_3.0Min.olp-LRMS[1/2M+1=933]。1H-NMR(メタノール-d4)δ:8.46(d, J=4.7Hz
, 1H), 8.01(s, 3H), 7.86-7.97(m, 2H), 7.32(
t, J=5.3Hz, 1H), 5.21(s, 3H), 4.55-4.62(m, 12H), 4.24(t, J=6.0Hz, 2H), 3.92-3.99(m, 6
H), 3.85-3.92(m, 9H), 3.74-3.79(s, 3H), 3.
71(dd, J=9.8,4.3Hz, 3H), 3.52-3.68(m, 42H), 2.99-3.15(m, 4H), 2.17(t, J=7.2Hz, 2H), 1.99(s, 9H), 1.56(quin, J=7.4Hz, 2H), 1.42-
1.50(m, 2H), 1.24-1.38(m, 2H)
H), 1.38-1.50(m, 4H), 1.24(s, 12H), 0.75(t
, J=6.8Hz, 2H).
4,4-ジメチル-3,5,9,11-テトラオキサトリシクロ[6.2.1.0~2,6~]ウンデカ-1-イル]-2,5,8,11-テトラオキサトリデカン-13-イル}-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ]メチル}プロパン-2-イル)アミノ]-6-オキソヘキシル-6-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)ヘキサンアミド(1-ag-4)
(d, J=5.9Hz, 3H), 4.16(t, J=6.4Hz, 3H), 3.87-3.97(m, 12H), 3.84(d, J=8.2Hz, 3H), 3.72
-3.79(m, 12H), 3.54-3.69(m, 36H), 3.13(q,
J=6.6Hz, 2H), 2.16(q, J=7.3Hz, 4H), 1.98(s
, 9H), 1.52-1.66(m, 4H), 1.44-1.51(m, 11H)
, 1.35-1.43(m, 2H), 1.27-1.35(m, 13H), 1.1
8-1.25(m, 12H), 0.73(t, J=7.6Hz, 2H)
残渣をジメチルスルホキシド(1mL)に溶解し、逆相HPLCにより精製した。カラム:Waters Sunfire C18 19×100・5u。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。勾配:8.5分で80.0%H2O/20.0%アセトニトリルから直線で65%H2O/35%アセトニトリルへ、9、0分まで0%H2O/100%MeCN、9.0分から
10.0分まで0%H2O/100%アセトニトリルを維持。流量:25mL/分。
カラム:Waters Atlantis dC18、4.6×50、5u。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。勾配:4.0分で95.0%H2O/5.0%アセトニトリルから直線で5
%H2O/95%アセトニトリルへ、4.0分から5.0分まで5%H2O/95%アセトニトリルを維持。流量:2mL/分。保持時間=2分。観察された質量=938.9628。1H-NMR(メタノール-d4)δ:8.01(s, 3H), 5.21(s, 3
H), 4.51-4.66(m, 12H), 3.95(dd, J=9.4,5.9Hz, 6H), 3.89(dd, J=11.7, 4.7Hz, 9H), 3.74-3.81(m, 9H), 3.71(dd, J=9.8,4.3Hz, 3H), 3.5
2-3.68(m, 42H), 3.13(t, J=2H), 2.17(q, J=7
.0Hz, 4H), 1.99(s, 9H), 1.53-1.66(m, 4H), 1.45-1.52(m, 2H), 1.36-1.44(m, 2H), 1.27-1.35(m, 4H), 1.23(s, 12H), 0.73(t, J=7.6Hz, 2H)
(d, J=5.5Hz, 4H), 2.31(t, J=7.2Hz, 2H), 2.23(t, J=7.4Hz, 2H), 1.63(quin, J=7.5Hz, 4H)
, 1.30-1.45(m, 2H), 1.24(t, J=7.0Hz, 3H)
残渣をジメチルスルホキシド(1mL)に溶解し、逆相HPLCにより精製した。カラム:Waters Sunfire C18、19×100、5u。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。勾配:8.5分で85.0%H2O/15.0%アセトニトリルから直線で75%H2O/25%アセトニトリルへ、9.0分まで0%H2O/100%MeCNへ、9.0分か
ら10.0分まで0%H2O/100%アセトニトリルを維持。流量:25mL/分。
カラム:Waters Atlantis dC18、4.6×50、5u。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA
(v/v)。4.0分で95.0%H2O/5.0%アセトニトリルから直線で5%H2O/95%アセトニトリルへ、4.0分から5.0分まで5%H2O/95%アセトニトリ
ルを維持。流量:2mL/分。保持時間=1.53分。観測された質量=934.548。方法C:3分間運転LRMS[M+Na=1889]。1H-NMR(メタノール-d4)δ:8.00(s, 3H), 5.21(s, 3H), 4.52-4.62(m,
12H), 3.95(t, J=9.4Hz, 6H), 3.85-3.91(m, 9
H), 3.74-3.79(m, 9H), 3.71(dd, J=10.0,4.1Hz, 3H), 3.55-3.67(m, 47H), 3.12(t, J=6.7Hz
, 2H), 2.22(t, J=7.3Hz, 2H), 2.17(t, J=7.3Hz, 4H), 1.98(s, 9H), 1.58-1.69(m, 4H), 1.51-1.57(m, 2H), 1.48(quin, J=7.2Hz, 2H), 1.2
6-1.40(m, 4H)
3-イル}-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ]メチル}プロパン-2-イル)ヘキサンアミド(1-ag-1)(300mg、0.169mmol)の溶液に、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.118mL、0.677mmol)及び1-[(6-アジドヘキサノイル)オキシ]ピロリジン-2,5-ジオン(56.0mg、0.220mmol)を加えた。この反応物を室温で24時間攪拌した。24時間後、この反応物を減圧下で濃縮した。この粗製反応混合物を、CombiFlash・Rf(RediSep・24g・ゴールド・シリカゲルカラム)を用い、0%から20%へのメタノール/ジクロロメタン勾配で溶離して精製し、表題化合物をゴム状物として得た(269mg、83%)。方法C:3分間運転LRMS[1/2M+1=956]。1H-NMR(メタノール-d4)δ:7.98(s, 3H), 5.22(s, 3H), 4.
50-4.65(m, 12H), 4.29(d, J=5.9Hz, 3H), 4.1
6(t, J=6.5Hz, 3H), 3.83-3.95(m, 12H), 3.83
(d, J=7.6Hz, 3H), 3.73-3.79(m, 12H), 3.55-
3.71(m, 36H), 3.26-3.30(m, 2H), 3.14(q, J=
6.5Hz, 2H), 2.18(q, J=7.6Hz, 4H), 1.98(s, 9H), 1.53-1.68(m, 6H), 1.45-1.51(m, 11H), 1
.36-1.43(m, 2H), 1.29-1.36(m, 11H)
2-{[(1-{1-[(1S,2R,6R,7R,8S)-7-(アセチルアミノ)-4,4-ジメチル-3,5,9,11-テトラオキサトリシクロ[6.2.1.0~2,6~]ウンデカ-1-イル]-2,5,8,11-テトラオキサトリデカン-13-イル}-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ]メチル}プロパン-2-イル)-6-オキソヘキシル}ヘキサンアミド(1-ag-5)(25.0mg、0.013mmol)の溶液を、70℃に24時間加熱した。24時間後、この反応物を室温に冷却し、減圧下で濃縮した。この粗製物質をトルエンで希釈し、減圧下で濃縮して、表題化合物をゴム状物として得た(22.7mg、97%)。方法C:3分間運転LRMS[M+1=1791]。1H-NMR(メタノール-d4)δ:7.99(s, 3H), 5.21(s, 3H), 4.51-4.66(m, 12H), 3.92-4.01(m,
6H), 3.89(dd, J=4.7Hz, 9H), 3.74-3.81(m, 9H), 3.71(dd, J=10.0,4.1Hz, 3H), 3.52-3.68(m, 42H), 3.25-3.30(m, 2H), 3.08-3.19(m, 2H
), 2.13-2.23(m, 4H), 1.99(s, 9H), 1.54-1.6
9(m, 6H), 1.49(dt, J=14.4,7.2Hz, 2H), 1.36
-1.44(m, 2H), 1.32(dd, J=14.8,6.2Hz, 2H)
-1.59(m, 2H)
,8,11-テトラオキサトリデカン-13-イル}-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ]-2-{[(1-{1-[(1S,2R,6R,7R,8S)-7-(アセチルアミノ)-4,4-ジメチル-3,5,9,11-テトラオキサトリシクロ[6.2.1.0~2,6~]ウンデカ-1-イル]-2,5,8,11-テトラオキサトリデカン-13-イル}1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ]メチル}プロパン-2-イル)アミノ]-6-オキソヘキシル}ヘキサンアミド(1-ag-6)
d4)δ:7.98(s, 3H), 7.19-7.38(m, 5H), 5.23(d
, J=1.2Hz, 3H), 4.52-4.64(m, 12H), 4.48(s, 2H), 4.29(d, J=5.9Hz, 3H), 4.15(t, J=6.4Hz
, 3H), 3.86~3.96(m, 12H), 3.83(d, J=7.8Hz, 3H), 3.72~3.80(m, 12H), 3.54-3.70(m, 36H),
3.49(t, J=6.4Hz, 2H), 3.08-3.15(m, 2H), 2.12-2.26(m, 4H), 1.98(s, 9H), 1.51-1.68(m,
6H), 1.48(s, 11H), 1.37-1.44(m, 2H), 1.33(
s, 11H)
=9.8,4.3Hz, 3H), 3.54-3.67(m, 42H), 3.49(t, J=6.4Hz, 2H), 3.08-3.17(m, 2H), 2.13-2.2
2(m, 4H), 1.99(s, 9H), 1.51-1.68(m, 6H), 1.48(t, J=7.4Hz, 2H), 1.39(dt, J=15.3, 7.8Hz
, 2H), 1.26-1.35(m, 2H)
.3Hz, 3H), 5.32(s, 3H), 5.10(dd, J=10.5, 4.3Hz, 3H), 4.52-4.60(m, 12H), 4.48(s, 2H)4.
18(d, J=10.5Hz, 3H), 3.99(d, J=8.2Hz, 3H), 3.89(t, J=5.1Hz, 6H), 3.70-3.81(m, 12H), 3
.52-3.67(m, 39H), 3.49(t, J=6.2Hz, 2H), 3.
13(q, J=6.6Hz, 2H), 2.13-2.21(m, 13H), 1.9
4(d, J=1.6Hz, 18H), 1.51-1.68(m, 6H), 1.45
-1.50(m, 2H), 1.37-1.43(m, 2H), 1.28-1.35(m, 2H)
トリッジ)を用いたHキューブに通した。この溶液を収集し、減圧下に濃縮し、ゴム状物として表題化合物を得た(91.6mg、87%)。方法C:3分間運転LRMS[1/2M=1009]。1H-NMR(メタノール-d4)δ:7.98(s, 3H), 5.44(d, J=4.3Hz, 3H), 5.32(s, 3H), 5.10(dd, J=10.5,4.3Hz, 3H), 4.50-4.64(m, 12H), 4.18(
d, J=10.5Hz, 3H), 3.99(d, J=8.2Hz, 3H), 3.90(t, J=4.9Hz, 6H), 3.71-3.82(m, 9H), 3.44-
3.66(m, 44H), 3.08-3.19(m, 2H), 2.16-2.22(m, 4H), 2.15(s, 9H), 1.94(d, J=1.2Hz, 18H),
1.44-1.68(m, 8H), 1.27-1.42(m, 4H)
}-2-({6[(6-ヒドロキシヘキサノイル)アミノ]ヘキサノイル}アミノ)プロポキシ}メチル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル]-2,5,8,11-テトラオキサトリデカ-1-イル}-3-(アセチルオキシ)-6,8-ジオキサビシクロ[3.2.1]オクタ-2-イルアセテート(60)
ートリッジ)を用いたHキューブに通した。この溶液を収集し、減圧下に濃縮し、ゴム状物として表題化合物を得た(7.9mg、27%)。方法C:3分間運転LRMS[M+
1=1766]。1H-NMR(メタノール-d4)δ:7.99(s, 3H), 5.21(s, 3H), 4.49-4.63(m, 12H), 3.92-4.00(m,
6H), 3.89(dd, J=3.5Hz, 9H), 3.74-3.79(m, 9
H), 3.71(dd, J=9.8,4.3Hz, 3H), 3.53-3.67(m, 44H), 3.02-3.16(m, 2H), 2.18(td, J=7.3, 3.3Hz, 4H), 1.99(s, 9H), 1.44-1.72(m, 8H), 1.25-1.42(m, 4H)
2Hz, 3H), 5.06(s, 2H), 4.51-4.61(m, 12H), 4.29(d, J=5.9Hz, 3H), 4.16(t, J=6.4Hz, 3H), 3.86~3.96(m, 12H), 3.83(d, J=7.8Hz, 3H), 3
.73-3.79(m, 12H), 3.53-3.70(m, 36H), 3.04-3.19(m, 4H), 2.17(t, J=7.4Hz, 4H), 1.98(s, 9H), 1.58(td, J=14.5, 7.6Hz, 4H), 1.48(s, 13H), 1.33(s, 13H)
ルアミノ)-4,4-ジメチル-3,5,9,11-テトラオキサトリシクロ[6.2.1.0~2,6~]ウンデカ-1-イル]-2,5,8,11-テトラオキサトリデカン-13-イル]-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ]2-{[(1-{1-[1S,2R,6R,7R,8S)-7-(アセチルアミノ)-4,4-ジメチル-3,5,9,11-テトラオキサトリシクロ[6.2.1.0~2,6~]ウンデカ-1-イル]-2,5,8,11-テトラオキサトリデカン-13-イル]-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル}メトキシ]メチル}プロパン-2-イル)アミノ]-6-オキソヘキシル}アミノ)-6-オキソヘキシル]カルバメート(1-ag-7)(250.0mg、0.124mmol)の溶液を36時間70℃に加熱した。36時間後、この反応物を室温に冷却し、減圧下で濃縮した。この粗製物質をトルエンで希釈し、減圧下で濃縮した。この粗製物質をトルエンで2回目に希釈し、減圧下で濃縮して、表題化合物をゴム状物として得た(225mg、96%)。方法C:3分間運転LRMS[1/2M+1=950]。1H-NMR(メタノール-d4)δ:7.98(s, 3H), 7.22-7.41(m, 5H), 5.21(s, 3H), 5.05(s, 2H), 4.57(t, J=5.0Hz, 6H), 4.55(s, 6H), 3.92-4.
00(m, 6H), 3.83-3.91(m, 9H), 3.73-3.78(m,
9H), 3.68-3.72(m, J=10.0,4.1Hz, 3H), 3.52-3.68(m, 42H), 3.05-3.17(m, 4H), 2.16(t, J=
7.3Hz, 4H), 1.98(s, 9H), 1.57-1.65(m, 2H), 1.53-1.57(m, 2H), 1.43-1.52(m, 4H), 1.24-1.39(m, 4H)
,5S)-4-(アセチルアミノ)-2,3-ジヒドロキシ-6,8-ジオキサビシクロ[3.2.1]オクタ-1-イル]-2,5,8,11-テトラオキサトリデカン-13-イル}-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ]-2-{[(1-{1-[(1S,2R,3R,4R,5S)-4-(アセチルアミノ)-2,3-ジヒドロキシ-6,8-ジオキサビシクロ[3.2.1]オクタ-1-イル]-2,5,8,11-テトラオキサトリデカン-13-イル}-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ]メチル}プロパン-2-イル)アミノ]-6-オキソヘキシル}アミノ)-6-オキソヘキシル]カルバメート(61)(200mg、0.105mmol)をメタノール(20mL)及び酢酸(0.024mL、0.421mmol)中に溶解し、次いでこの溶液を、次のパラメーター(温度=50℃、流速=1.0mL/分、圧力=全H2
(1bar))を使用し、炭素上の10%パラジウム(小カートリッジ)を使用するHキューブに通した。この溶液を集め、減圧下で濃縮して、表題化合物をゴム状物として得た(148mg、77%)。方法C:3分間運転LRMS[M+45(ギ酸)=1809]。1H-NMR(メタノール-d4)δ:8.02(s, 3H), 5.23(s, 3H
), 4.59-4.63(m, 6H), 4.58(s, 6H), 3.97(dd, J=9.6,5.3Hz, 6H), 3.91(d, J=11.3,4.7Hz, 9H), 3.76-3.82(m, 9H), 3.73(dd, J=10.1,4.3Hz, 3H), 3.56-3.70(m, 42H), 3.16(t, J=6.8Hz, 2H), 2.93(t, J=7.6Hz, 2H), 2.16-2.29(m, 4H
), 2.01(s, 9H), 1.92(s, 3H), 1.62-1.74(m, 4H), 1.54-1.61(m, 2H), 1.46-1.53(m, 2H), 1.
39-1.45(m, 2H), 1.29-1.38(m, 2H)
, 1H), 4.34-4.43(m, 2H), 3.88-3.98(m, 3H), 3.81-3.87(m, 1H), 3.37(dd, J=6.2,1.6Hz, 1H
), 1.54(s, 3H), 1.42(s, 3H)
方法C:1.5分間運転LRMS[M+Na=546]。1H-NMR(メタノール-
d4)δ:7.17-7.47(m, 5H), 5.35(d, J=1.6Hz, 1H
), 4.55(s, 2H), 4.32-4.37(m, 1H), 4.25-4.3
2(m, 1H), 3.92(d, J=10.1Hz, 1H), 3.88(d, J=8.2Hz, 1H), 3.73-3.80(m, 2H), 3.55-3.71(m,
17H), 1.49(s, 3H), 1.36(s, 3H)
ル(6mL)に溶解し、続いてジ-tert-ブチル-ジカルボネート(162mg、0.74mmol)及び炭素上10%パラジウム(50%湿重量/重量、100.0mg、0.940mmol)を添加した。この反応器を密封し、この反応物を窒素(50psi)で3回パージし、次いで水素(50psi)で2回パージし、水素を50psiまで充填し、一晩攪拌した。翌朝(24時間)、この反応物をセライトプラグで濾過し、メタノールで洗浄した。濾液を減圧下で濃縮した。この粗製物質をCombiFlash・Rf(RediSep・12gシリカゲルカラム)を用い、0%から20%へのメタノール/ジクロロメタン勾配で溶離することにより精製して、表題化合物をゴム状物として得た(304mg、100%)。方法C:3分間運転LRMS[M+Na=530]。1H-N
MR(メタノール-d4)δ:5.22(s, 1H), 4.28(d, J=5.9Hz, 1H), 4.11(t, J=6.4Hz, 1H), 3.93(d, J=10.1Hz, 1H), 3.80-3.85(m, 1H), 3.76(d, J=6.2Hz
, 1H), 3.74(d, J=3.9Hz, 1H), 3.60-3.71(m, 15H), 3.53-3.59(m,2H), 1.50(s, 3H), 1.45(s,
9H), 1.34(s, 3H)
, 1H), 3.80-3.86(m, 1H), 3.72-3.79(m, 4H), 3.61-3.70(m, 12H), 3.58(d, J=5.9Hz, 1H), 3
.11(s, 3H), 1.50(s, 3H), 1.45(s, 9H), 1.34(s, 3H)
m, 1H), 3.75-3.80(m, 2H), 3.53-3.74(m, 15H
), 3.39(t, J=4.9Hz, 2H), 1.52(s, 3H), 1.47(s, 9H), 1.36(s, 3H)
NMR(メタノール-d4)δ:7.97(s, 3H), 7.17-7.43(m, 5H), 5.21(s, 3H), 4.52-4.60(m, 12H), 4.45(s
, 2H), 4.25(d, J=5.9Hz, 3H), 4.10(t, J=6.2Hz, 3H), 3.85-3.93(m, 9H), 3.71-3.82(m, 15H
), 3.63-3.69(m, 6H), 3.53-3.62(m, 33H), 3.
48(t, J=6.2Hz, 2H), 2.27(t, J=7.2Hz, 2H), 1.74-1.96(m, 2H), 1.49(s, 9H), 1.45(s, 27H)
, 1.32(s, 9H)
4R,5S)-4-アミノ-2,3-ジヒドロキシ-6,8-ジオキサビシクロ[3.2.1]オクタ-1-イル]-2,5,8,11-テトラオキサトリデカン-13-イル}-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ]-2-{[(1-{1-[(1S,2R,3R,4R,5S)-4-アミノ-2,3-ジヒドロキシ-6,8-ジオキサビシクロ[3.2.1]オクタ-1-イル]-2,5,8,11-テトラオキサトリデカン-13-イル}-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ]メチル}プロパン-2-イル)ブタンアミド(63)
39(m, 5H), 5.48(s, 3H), 4.57-4.66(m, 12H), 4.47(s, 2H), 3.98(d, J=9.8Hz, 3H), 3.90-3.
95(m, 9H), 3.82-3.89(m, 6H), 3.79(s, 6H), 3.76(d, J=8.2Hz, 3H), 3.71(d, J=9.8Hz, 3H), 3.57-3.69(m, 36H), 3.50(t, J=6.2Hz, 2H), 3
.21(d, J=9.4Hz, 3H), 2.29(t, J=7.2Hz, 2H), 1.85(quin, J=6.8Hz, 2H)
ジン(無水)(1.5mL、19mmol)に溶解し、これに無水酢酸(0.125mL、1.33mmol)を室温で加えた。次いで、この反応物を50℃で一晩加熱した。翌朝、この反応物を減圧下で濃縮した。この粗製物質を、CombiFlash・Rf(RediSep・12g・ゴールド・シリカゲルカラム)を用い、0%から20%へのメタノール/ジクロロメタン勾配で溶離することにより精製して、粗製表題化合物を得た。この粗製表題化合物をCombiFlash・Rf(RediSep・4g・ゴールド・シリカゲルカラム)を用い、0%から20%へのメタノール/ジクロロメタン勾配で溶離することにより精製して、ゴム状物として表題化合物を得た(54.0mg、62%)。方法C:1.5分間運転LRMS[1/2M+1=984]。1H-NMR(メタノール-
d4)δ:7.97(s, 3H), 7.19-7.42(m, 5H), 5.44(d
, J=4.3Hz, 3H), 5.31(s, 3H), 5.10(dd, J=10.3,4.1Hz, 3H), 4.51-4.64(m, 12H), 4.45(s, 2
H), 4.18(d, J=10.1Hz, 3H), 3.99(d, J=8.6Hz
, 3H), 3.88(t, J=4.9Hz, 6H), 3.68-3.82(m, 12H), 3.52-3.64(m, 39H), 3.48(t, J=6.2Hz, 2
H), 2.26(t, J=7.4Hz, 2H), 2.15(s, 9H), 1.94(d, J=1.2Hz, 18H), 1.84(t, J=6.8Hz, 2H).
ラジウム(小カートリッジ)を使用するHキューブに通した。この溶液を収集し、減圧下で濃縮して、表題化合物をゴム状物として得た(51.0mg、99%)。方法C:3分間運転LRMS[M+Na=1899]。1H-NMR(メタノール-d4)δ:7.98(s, 3H), 5.44(d, J=4.3Hz, 3H), 5.32(s, 3H),
5.10(dd, J=10.5, 3.9Hz, 3H), 4.41-4.66(m, 12H), 4.18(d, J=10.5Hz, 3H), 3.99(d, J=8.6
Hz, 3H), 3.90(t, J=5.1Hz, 6H), 3.68-3.83(m
, 12H), 3.51-3.67(m, 41H), 2.24(t, J=7.6Hz
, 2H), 2.15(s, 9H), 1.94(s, 18H), 1.69-1.83(m, 2H)
-1-イル]-2,5,8,11-テトラオキサトリデカン-13-イル}-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ]-2-{[(1-{1-[(1S,2R,3R,4R,5S)-4-(アセチルアミノ)-2,3-ジヒドロキシ-6,8-ジオキサビシクロ[3.2.1]オクタ-1-イル]-2,5,8,11-テトラオキサトリデカン-13-イル}-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ]メチル}プロパン-2-イル)-4-ヒドロキシブタンアミド(64)
3H), 4.53-4.65(m, 12H), 3.92-4.00(m, 6H), 3.89(dd, J=11.1, 4.9Hz, 9H), 3.74-3.79(m,
9H), 3.71(dd, J=9.8, 4.3Hz, 3H), 3.52-3.69
(m, 44H), 2.24(t, J=7.4Hz, 2H), 1.99(s, 9H), 1.76(quin, J=6.9Hz, 2H).
チルカルボジイミド塩酸塩(463mg、2.42mmol)及び1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(326mg、2.42mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。1時間後、2-アミノプロパン-1,3-ジオール(183mg、2.01mmol)を加え、次いでN,N-ジイソプロピルエチルアミン(1.05mL、6.04mmol)を添加した。この反応物を室温で一晩撹拌した。18時間後、この反応物を水で希釈し、ジクロロメタンで3回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。この粗製物質をCombiFlash・Rf(RediSep・24gシリカゲルカラム)を用い、0%から20%へのメタノール/ジクロロメタン勾配で溶離することにより、表題化合物(368mg、55%)を得た。方法C:1.5分間運転LRMS[M+45(ギ酸)=375]。1H-NMR(メタノール-d4)δ:8.38(d, J=4.3Hz, 1H), 7.84-7.89(m, 1H),
7.77-7.83(m, 1H), 7.21(t, J=5.7Hz, 1H), 3.92(quin, J=5.5Hz, 1H), 3.51-3.70(m, 4H), 2
.82(t, J=7.2Hz, 2H), 2.21(t, J=7.4Hz, 2H), 1.71(quin, J=7.3Hz, 2H), 1.60(quin, J=7.5Hz, 2H), 1.37-1.51(m, 2H)
異性体1:1H-NMR(メタノール-d4)δ:8.41(d, J=4.7Hz, 1H), 7.86-7.92(m, 1H), 7.80-7.86(m, 1H), 7.
20-7.27(m, 1H), 5.31(s, 1H), 4.29(d, J=2.7
Hz, 1H), 3.92-3.96(m, 1H), 3.83(br.s, 1H), 3.63(d, J=5.1Hz, 1H), 3.59(dd, J=11.5, 3.7
Hz, 1H), 3.42(s, 3H), 2.85(t, J=7.2Hz, 2H),
2.21-2.30(m, 2H), 1.68-1.80(m, 2H), 1.56-
1.67(m, 2H), 1.39-1.53(m, 2H)
異性体2:1H-NMR(メタノール-d4)δ:8.41(d, J=4.7Hz, 1H), 7.86-7.92(m, 1H), 7.80-7.86(m, 1H), 7.
20-7.27(m, 1H), 5.27(s, 1H), 4.26(d, J=2.7
Hz, 1H), 3.92-3.96(m, 2H), 3.86-3.91(m, 1H
), 3.59(dd, J=11.5,3.7Hz, 1H), 3.38(s, 3H)
, 2.85(t, J=7.2Hz, 2H), 2.21-2.30(m, 2H), 1.68-1.80(m, 2H), 1.56-1.67(m, 2H), 1.39-1.53(m, 2H).
1172mg、62.8%)。
方法C:3分間運転LRMS[1/2M+1=1020]。1H-NMR(メタノール
-d4)δ:7.97(s, 3H), 7.22-7.40(m, 5H), 5.44(
d, J=3.9Hz, 3H), 5.32(s, 3H), 5.10(dd, J=10.5, 4.3Hz, 3H), 5.05(s, 2H), 4.56-4.60(m, 6H), 4.55(s, 6H), 4.18(d, J=10.5Hz, 3H), 3.99(d, J=8.6Hz, 3H), 3.89(t, J=5.1Hz, 6H), 3.71-3.80(m, 12H), 3.51-3.65(m, 39H), 3.09(q, J=6.2Hz, 2H), 2.16-2.19(m, 2H), 2.15(s, 9H), 1.94(d, J=1.6Hz, 18H), 1.52-1.61(m, 2H
), 1.42-1.52(m, 2H), 1.33(d, J=7.0Hz, 2H)
セチルオキシ)-6,8-ジオキサビシクロ[3.2.1]オクタ-1-イル]-2,5,8,11-テトラオキサトリデカン-13-イル}-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ]メチル}-3,10-ジオキソ-1-フェニル-2,14-ジオキサ-4,11-ジアザペンタデカン-15-イル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル]-2,5,8,11-テトラオキサトリデカ-1-イル}-6,8-ジオキサビシクロ[3.2.1]オクタ-3-イルアセテート(I-az-1)(930.0mg、0.456mmol)の溶液を、以下のパラメーター(温度=50℃、流速=1.0mL/分、圧力=全H2(1bar))を用いて、炭素上の10%パラジウム(小型カー
トリッジ)を使用するH-キューブに通した。この溶液を収集し、減圧下で濃縮して、表題化合物をゴム状物として得た(837mg、96%)。方法C:3分間運転LRMS[M+45(ギ酸)-1=1948]。1H-NMR(メタノール-d4)δ:7.99(s, 3H), 5.44(d, J=4.3Hz, 3H), 5.32(s, 3H), 5
.10(dd, J=10.5, 4.3Hz, 3H), 4.59(t, J=5.1H
z, 6H), 4.56(s, 6H), 4.18(d, J=10.1Hz, 3H),
3.99(d, J=8.2Hz, 3H), 3.90(t, J=5.1Hz, 6H), 3.71-3.82(m, 12H), 3.53-3.66(m, 39H), 2.
76(t, J=7.4Hz, 2H), 2.16-2.23(m, 2H), 2.15
(s, 9H), 1.94(s, 18H), 1.48-1.64(m, 4H), 1.29-1.43(m, 2H)
1S,2R,3R,4R,5S)-4-(アセチルアミノ)-1-{13-[4-({3-[(1-{1-[(1S,2R,3R,4R,5S)-4-(アセチルアミノ)-2,3-ビス(アセチルオキシ)-6,8-ジオキサビシクロ[3.2.1]オクタ-1-イル]-2,5,8,11-テトラオキサトリデカン-13-イル}-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ]-2-{[(1-{1-[(1S,2R,3R,4R,5S)-4-(アセチルアミノ)-2,3-ビス(アセチルオキシ)-6,8-ジオキサビシクロ[3.2.1]オクタ-1-イル]-2,5,8,11-テトラオキサトリデカン-13-イル}-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ]メチル}-2-[(6-アミノヘキサノイル)アミノ]プロポキシ}メチル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル]-2,5,8,11-テトラオキサトリデカ-1-イル}-3-(アセチルオキシ)-6,8-ジオキサビシクロ[3.2.1]オクタ-2-イルアセテート(1-ba-1)(200.0mg、0.105mmol)の溶液に、7-[(2,5-ジフルオロフェニル)ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ]-7-オキソヘプタン酸エチル
(s, 6H), 4.18(d, J=9.8Hz, 3H), 4.11(q, J=7.2Hz, 2H), 3.99(d, J=8.6Hz, 3H), 3.90(t, J=4.9Hz, 6H), 3.71-3.83(m, 12H), 3.53-3.65(m,
39H), 3.08-3.17(m, 2H), 2.31(t, J=7.4Hz, 2H), 2.16-2.22(m, 4H), 2.15(s, 9H), 1.94(d, J=1.6Hz, 18H), 1.53-1.66(m, 6H), 1.43-1.52(m, 2H), 1.28-1.40(m, 4H), 1.24(t, J=7.2Hz
, 3H)
6(s, 6H), 3.92-3.99(m, 6H), 3.89(dd, J=10.
7, 4.9Hz, 9H), 3.69-3.80(m, 12H), 3.54-3.6
8(m, 42H), 3.12(t, J=7.0Hz, 2H), 2.16(q, J=7.3Hz, 6H), 1.99(s, 9H), 1.53-1.67(m, 6H), 1.49(dt, J=14.7, 7.7Hz, 2H), 1.27-1.41(m,
4H)
ジオキソ-2,16,19,22,25-ペンタオキサ-5,12-ジアザヘプタコンサン-27-イル]エタンチオエート(68)
.68-3.73(m, 6H), 3.54-3.67(m, 55H), 3.14(t, J=7.0Hz, 2H), 3.06(t, J=6.5Hz, 2H), 2.43(t, J=6.2Hz, 2H), 2.31(s, 3H), 2.17(t, J=7.3Hz, 2H), 1.98(s, 9H), 1.56(quin, J=7.5Hz, 2H), 1.49(quin, J=7.3Hz, 2H), 1.28-1.40(m,
2H)
残渣をジメチルスルホキシド(1mL)に溶解し、逆相HPLCにより精製した。カラム:Waters Sunfire C18、19×100、5u。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:0.05%TFA中のアセトニトリル(v/v)。10.5分で80.0%H2O/20.0%アセトニトリルから直線で60.0%H2O/40.0%アセトニトリルへ、0.5分で60.0%H2O/40.0%アセトニトリ
ルから直線で0%H2O/100%アセトニトリルへ、11.0分から12.0分まで0
%H2O/100%アセトニトリルを維持。流量:25mL/分。
カラム:Waters Atlantis dC18、4.6×50、5u。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。4.0分で95.0%H2O/5.0%アセトニトリルから直線で5%H2O/95%アセトニトリルへ、5.0分まで5%H2O/95%アセトニトリルに維持。流
量:2mL/分。
,N-ジメチルホルムアミド(0.1mL)及び無水ピリジン(0.024mL、0.30mmol)中の、6-アミノ-N-(1,3-ビス[(1-{1-[(1S,2R,3R,4R,5S)-4-(アセチルアミノ)-2,3-ジヒドロキシ-6,8-ジオキサビシクロ[3.2.1]オクタ-1-イル]-2,5,8,11-テトラオキサトリデカン-13-イル}-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ]-2-{[(1-{1-[(1S,2R,3R,4R,5S)-4-(アセチルアミノ)-2,3-ジヒドロキシ-6,8-ジオキサビシクロ[3.2.1]オクタ-1-イル]-2,5,8,11-テトラオキサトリデカン-13-イル}-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ]メチル}プロパン-2-イル)ヘキサンアミド酢酸塩(48)(126.0mg、0.0736mmol)を加えた。この反応物を室温で一晩撹拌した。18時間後に、更に4当量のピリジン(0.024mL、0.30mmol)を添加し、続いて1.0当量の酸塩化物(I-bc-1)(15mg、0.074mmol)を加えた。この反応物を室温で一晩撹拌した。翌朝、更に2当量の酸塩化物(I-bc-1)を加え(30mg、0.148mmol)、この反応物を室温で4日間撹拌した。4日後、この反応物を減圧下で濃縮した。この粗製表題化合物を、以下の条件を使用して逆相クロマトグラフィーにより精製することにより、表題化合物をゴム状物として得た(16.1mg、12%)。方法C:3分間運転LRMS[1/2M+1=910]。1H-NMR(
メタノール-d4)δ:8.00(s, 3H), 5.21(s, 3H), 4.52-
4.62(m, 12H), 3.92-3.99(m, 6H), 3.89(dd, J
=11.3, 4.7Hz, 9H), 3.74-3.79(m, 9H), 3.71(
dd, J=10.1, 4.3Hz, 3H), 3.54-3.68(m, 42H), 3.11(t, J=7.0Hz, 2H), 2.75(t, J=7.2Hz, 2H)
, 2.46-2.53(m, 2H), 2.16(t, J=7.4Hz, 2H), 2.05(s, 3H), 1.99(s, 9H), 1.55(dt, J=14.9, 7.6Hz, 2H), 1.46(quin, J=7.2Hz, 2H), 1.24-1
.34(m, 2H)
残渣をジメチルスルホキシド(1mL)に溶解し、逆相HPLCにより精製した。カラム:Waters Sunfire C18、19×100、5u。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。10.5分で75.0%H2O/25.0%アセトニトリルから直線で65.0%H2O/35.0%アセトニトリルへ、0.5分で65.0%H2O/35.0%アセトニトリ
ルから直線で0%H20/100%アセトニトリルへ、11.0分から12.0分まで0
%H20/100%アセトニトリルを維持。流量:25mL/分。
カラム:Waters Atlantis dC18、4.6×50、5u。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。4.0分で95.0%H2O/5.0%アセトニトリルから直線で5%H20/95%アセトニトリルへ、5.0分まで5%H20/95%アセトニトリルを維持。流
量:2mL/分。保持時間=1.82分。観察された質量=909.8649。質量ターゲット=909.2。
-2,5,8,11-テトラオキサトリデカン-13-イル}-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ]メチル}プロパン-2-イル)アミノ]-6-オキソヘキシル}カルバモイル)-7,35-ジオキソ-37-(ピリジン-2-イルジスルファニル)-10,13,16,19,22,25,28,31-オクタオキサ-6,34-ジアザヘプタトリアコンタ-1-イル]カルバメート(I-bd-1)
、この反応物を室温で18時間撹拌した。18時間後、ピペリジン(900mg、10mmol、0.6mL)をこの反応物に加え、室温で3時間撹拌した。3時間後、この反応物を減圧下で濃縮して、粗製のゴム状物(450.0mg、158%)を得た。
残渣をジメチルスルホキシド(1mL)に溶解し、逆相HPLCにより精製した。カラム:Waters XBridge・C18 19×100、5u。移動相A:水中の0.03%NH4OH(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.03%NH4OH(v/v)。8.5分で75.0%H2O/25.0%アセトニトリルから直線で45%H2O/55%アセトニトリルへ、0.5分で45%H2O/55%アセトニトリルから直線で
0%H2O/100%MeCNへ、9.0分から10.0分まで0%H2O/100%アセトニトリルを維持。流速:25mL/分。
カラム:Waters Atlantis dC18、4.6×50、5u。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。4.0分で95.0%H2O/5.0%アセトニトリルから直線で5%H2O/95%アセトニトリルへ、5.0分まで5%H2O/95%アセトニトリルを維持。流
量:2mL/分。保持時間=2.06分。観測された質量=843.5669、質量ターゲット=833.4
残渣をジメチルスルホキシド(1mL)に溶解し、逆相HPLCにより精製した。カラム:Waters Sunfire C18、19×100、5u。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。8.5分で80.0%H2O/20.0%アセトニトリルから直線で45%H2O/55%アセトニトリルへ、0.5分で45%H2O/55%アセトニトリルから直線で0%H2O/100%MeCNへ、0%H2O/100%アセトニトリルを9.0から10.0分
まで維持。流速:25mL/分。
カラム:Waters Atlantis dC18、4.6×50、5u。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。4.0分で95.0%H2O/5.0%アセトニトリルから直線で5%H2O/95%アセトニトリルへ、5.0分まで5%H2O/95%アセトニトリルを維持。流
量:2mL/分。保持時間=1.7544分。観測された質量=601.159(1/4M+1)。質量ターゲット=600.3)
カラム:Acquity・BEH300・C41.7um
移動相:水中のA=0.1%ギ酸。B=ACN中の0.1%ギ酸
勾配:2分で97%Aから5%Aへ。5%Aで0.75分間維持する。その後、開始条件に戻る。
温度:70℃
MS検出=ESI 0~2000ダルトン、より高いMW種を解析するためにMaxEntを使用する。
3-トリアゾール-4-イル)メトキシ]メチル}プロパン-2-イル)ヘキサンアミド(1-ag-1)(210mg、0.119mmol)の溶液に滴下により加えた。LCMSにより反応が完了するまで、室温でこの反応物を撹拌する。Gene vacを用いて粗製油状物に濃縮し、0%から20%へのMeOH/DCM勾配を用いてシリカゲルカラム上で精製した。単離された画分を濃縮して、205mg(収率82%)の表題化合物を白色形態として得た。方法C:LRMS(1/2M+1=1045.7)。NMRスペクトルは、部分的水素として報告される回転異性体(1:4比)を示した。
1H-NMR(メタノール-d4)δ:7.96(s, 3H), 7.85(d, J=8
.2Hz, 0.4H), 7.79(d, J=7.6Hz, 1.6H), 7.73(
d, J=8.2Hz, 0.4H), 7.66(d, J=7.0Hz, 1.6H), 7.51(t, J=7.6Hz, 0.4H), 7.43-7.47(m, J=7.6Hz, 0.4H), 7.39(t, J=7.3Hz, 1.6H), 7.28-7.
32(m, 1.6H), 5.22(s, 3H), 4.50-4.62(m, 12H
), 4.38-4.45(m, 1H), 4.30-4.36(m, 1H), 4.2
8(d, J=5.9Hz, 3H), 4.19-4.25(m, 2H), 4.15(
t, J=6.2Hz, 3H), 3.88-3.94(m, 6H), 3.87(t, J=4.7Hz, 6H), 3.82(d, J=7.6Hz, 3H), 3.72-3
.78(m, 12H), 3.48-3.70(m, 36H), 3.12-3.20(m, 2H), 2.65(br.s., 1H), 2.54-2.61(m, 1H), 2.40(br.s., 1H), 2.15(t, J=6.7Hz, 2H), 1.9
7(s, 9H), 1.47(s, 9H), 1.43-1.59(m, 4H), 1.31(s, 9H), 1.36(s, 2H)
, 7.86(d, J=8.2Hz, 0.4H), 7.80(d, J=7.6Hz, 1.6H), 7.73(d, J=8.2Hz, 0.4H), 7.66(t, J=6
.5Hz, 1.6H), 7.51(t, J=7.6Hz, 0.4H),7.43-7.47(m, J=8.2Hz, 0.4H), 7.39(t, J=7.3Hz, 1.
6H), 7.28-7.33(m, 1.6H), 5.23(s, 3H), 4.50
-4.61(m, 12H), 4.38-4.46(m, 1H), 4.31-4.38(m, 1H), 4.28(d, J=5.9Hz, 3H), 4.22(t, J=6.7Hz, 1H), 4.15(t, J=6.2Hz, 3H), 4.04-4.11(
m, 1H), 3.85-3.96(m, 12H), 3.82(d, J=7.6Hz
, 3H), 3.71-3.78(m, 12H), 3.51-3.70(m, 36H
), 3.10-3.19(m, 2H), 2.29(t, J=7.3Hz, 2H), 2.15(t, J=7.0Hz, 2H), 2.01-2.10(m, 1H), 1.
98(s, 9H), 1.78-1.90(m, 1H), 1.51-1.59(m,
2H), 1.47(s, 11H), 1.44(s, 9H), 1.32(s, 11H)
ル-d4)δ:7.97(s, 3H), 7.85(d, J=8.2Hz, 0.4H)
, 7.80(d, J=7.0Hz, 1.6H), 7.73(d, J=8.2Hz, 0.4H), 7.67(d, J=7.0Hz, 1.6H), 7.50(d, J=7
.6Hz, 0.4H), 7.45(d, J=7.6Hz, 0.4H), 7.39(
t, J=7.3Hz, 1.6H), 7.29-7.33(m, 1.6H), 5.2
2(s, 3H), 4.52-4.62(m, 12H), 4.41-4.47(m,
1H), 4.34-4.40(m, 1H), 4.28(d, J=5.9Hz, 3H
), 4.21-4.26(m, 1H), 4.15(t, J=6.5Hz, 3H), 3.89-3.95(m, 6H), 3.87(t, J=5.0Hz, 6H), 3.
82(d, J=7.6Hz, 3H), 3.72-3.79(m, 12H), 3.4
9-3.69(m, 39H), 3.06-3.23(m, 2H), 2.13-2.23(m, 2H), 1.98(s, 9H), 1.50-1.63(m, 4H), 1.47(s, 9H), 1.32(s, 9H), 1.28-1.40(m, 2H)
,2,3-triazol-4-イル)メトキシ]-2-{[(1-{1-[(1S,2R,6R,7R,8S)-7-(アセチルアミノ)-4,4-ジメチル-3,5,9,11-テトラオキサトリシクロ[6.2.1.0~2,6~]ウンデカ―1-イル]-2,
5,8,11-テトラオキサトリデカン-13-イル}-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ]メチル}プロパン-2-イル)アミノ]-6-オキソヘキシル}アミノ)-3-(1-{15-[(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ]-15-オキソ-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカ-1-イル}-1H-1,
2,3-トリアゾール-4-イル)-1-オキソプロパン-2-イル]カルバメート(I-bh-1)
mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.28g、2.2ミリモル)の溶液を室温で5日間撹拌した。この反応混合物を水(10mL)で希釈し、酢酸エチル(3×5mL)で抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。この粗製残渣をカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン中の0%から7%へのメタノール)により精製して、表題化合物を無色油状物として得た(0.19g、62%)。
R(600MHz, メタノール-d4)δ:7.34-7.42(m, 2H), 7.23-7.32(m, 6H), 7.16-7.23(m, 1H), 6.81-6.90(m, 4H), 4.52-4.62(m, 0.66H), 4.48(dt, J=9
.7, 5.1Hz, 0.33H), 4.22-4.34(m, 1H), 3.67-
3.84(m, 8H), 3.40-3.64(m, 16H), 3.22(m, J=
5.6, 5.6Hz, 0.66H), 3.13(dd, J=9.4, 2.3Hz, 0.66H), 3.01-3.10(m, 1.66H), 2.54-2.68(m, 1.66H), 2.26-2.37(m, 3.33H), 2.17-2.25(m, 1H), 2.02-2.11(m, 0.33H), 1.91-2.00(m, 0.66H).
残渣をジメチルスルホキシド(1mL)に溶解し、逆相HPLCにより精製した。カラム:Waters XBridge・C18、19×100、5u。移動相A:水中の0.03%NH4OH(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.03%NH4OH(v/v)。
10.5分で60.0%H2O/40.0%アセトニトリルから直線で40%H20/60%アセトニトリルへ、12.0分まで0%H20/100%アセトニトリルを維持。流
量:25mL/分。
表題化合物を無色の残渣として得た(1mg、1%)。方法F:3分法LRMS[1/2M-1]=1097.2。1H-NMR(600MHz, メタノール-d4)δ:7.
99(s, 3H), 7.40(d, J=7.6Hz, 2H), 7.24-7.32
(m, 6H), 7.16-7.22(m, 1H), 6.85(d, J=8.8Hz
, 4H), 5.21(s, 3H), 4.52-4.64(m, 12H), 4.39-4.47(m, 1H), 4.21(br.s., 1H), 3.95(t, J=9
.7Hz, 6H), 3.85-3.92(m, 9H), 3.44-3.83(m,
65H), 3.09-3.17(m, 2H), 2.24-2.49(m, 2H),
2.12-2.23(m, 4H), 1.93-2.11(m, 10H), 1.53-1.70(m, 6H), 1.44-1.52(m, 2H), 1.22-1.42(m, 4H)
2,2’-ジメトキシプロパンでの処理時には環状ケタールとして)で更に保護されて、(I-bm)のような中間体となる。加えて、スキーム9のステップ6において、化合物(I-bo)は、アジド基を対応するアミンに還元することが知られた還元剤(例えば、遷移金属媒介接触水素化、当業者に周知の古典的な実験条件下での水中におけるトリフェニルホスフィンの使用)で処理することができる。続いて、アシル化剤(例えば、無水酢酸またはピリジンまたはトリエチルアミンの存在下の、ジクロロメタンまたはテトラヒドロフランのような溶媒中における0~80℃の温度での塩化アセチル)の存在下での処理。溶媒、またはアルコール溶媒もしくはテトラヒドロフランのような溶媒の混合物中において、約0℃~室温の範囲の温度でアルコキシド(例えば、ナトリウムメトキシド)を後で添加すると、(I-bp)のような化合物が得られる。スキーム9のステップ7において、化合物(I-bp)中の第2級ヒドロキシル基は、適切な保護基(例えば、約室温~約90℃の範囲の温度で、N,N-ジメチルホルムアミドのような溶媒中の酸性条件下での2,2-ジメトキシプロパンでの処理により環状ケタールとして)により更に保護して、(I-bq)のような中間体とすることができる。次いで、(Id)及び(Ie)について同様に記載された当業者に周知の合成変換ならびに官能基及び保護基の操作を用いることは、(I-bm)及び(I-bq)のために用いることができ、これは本発明で特許請求されるXY含有化合物を形成するように、目的の所望のリンカーX及びリガンドYを結合させて第1級ヒドロキシル基を更に官能化及び誘導体化するために用意される。当業者に周知の試薬及び条件を使用して、保護基(例えば、Pg)を除去することは(例えば、2つのPgがアセトニドなどの環状ケタールを形成する場合、それは酢酸、アルコール溶媒、水、テトラヒドロフランのような溶媒の混合物中で酢酸等酸を用いた酸性条件下に、室温~約80℃の温度で除去できる)、二級ヒドロキシル基を露出させて、本発明で請求されるXY含有化合物を導く。例えば、(I-bq)中の第一級ヒドロキシル基のアルキル化は、保護基の操作及び除去後に、本発明で権利請求される対応のエーテル結合型XY含有化合物をもたらすことができる。本発明で請求されるエステル結合型、カーボネート結合型及びカルバメート結合型のX-Y含有化合物もまた、当業者に周知の適切な反応体及び試薬を使用して、(I-bm)または(I-bq)のような中間体から便宜に得ることができる。(I-e)について先に述べたのと同様の(I-bq)に対する更なる操作は、中間体(III-e-1)~(III-e-11)及び(IV-e-1)~(IV-e-9)についての当業者に類似の方法で、(III-bo-1)~(III-bo-22)及び(IV-bo-1)~(IV-bo-1)のような中間体を得ることを可能にする(Ie)。
室温で添加した。次いで、この反応物を50℃で一晩加熱した。翌朝、この反応物を減圧下で濃縮した。CombiFlash・Rf(RediSep・40gシリカゲルカラム)を用い、0%から20%へのメタノール/ジクロロメタン勾配で溶離することによりこの粗製物質を精製して、表題化合物をゴム状物として得た(1800mg、87%)。3分間運転LRMS[M+1=549.3]
]エトキシ}エチル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル]メトキシ}-2-({[1-(2-{2-[2-(2-{[2-(アセチルアミノ)-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシル]オキシ}エトキシ)エトキシ]エトキシ}エチル)-1H-1,2,3-トリアゾール-4-9イル]メトキシ}メチル)プロパン-2-イル]ヘキサンアミド(I-bt-1)
下で濃縮して、表題化合物をゴム状物として得た(187mg、80%)。
残渣をジメチルスルホキシド(1mL)に溶解し、逆相HPLCにより精製した。カラム:Waters Sunfire C18。19×100、5μ。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。勾配:10.5分で80.0%H2O/20.0%アセトニトリルから直線で65.0
%H2O/35.0%アセトニトリルへ、0.5分で65.0%H2O/35.0%アセトニトリルから直線で0%H2O/100%アセトニトリルへ、11.0分から12.0分まで0%H2O/100%アセトニトリルを維持。流量:25mL/分。
カラム:Waters Atlantis dC18、4.6×50、5μ。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。勾配:4.0分で95.0%H2O/5.0%アセトニトリルから直線で5
%H2O/95%アセトニトリルへ、5.0分まで5%H2O/95%アセトニトリルを維持。流速:2mL/分、保持時間=1.6667分、観測された質量=746.5042
、質量ターゲット=745.3)。
ペプチドの純度チェック:特に明記しない限り、純粋なペプチドは、溶剤勾配A:Bで溶離する4.6×150mmのPhenomenox・C18(2)、5μm100Aカラムを有するHP1090システムを用いて分析した。ここで、溶媒A=水中の0.1%トリフルオロ酢酸水中の酸、及びB=0.09%トリフルオロ酢酸。アセトニトリル:水(4:1)の混合物を流速1.0mL/分で20分間かけて添加した。比保持時間、UV純度(220nm)、及び溶媒勾配が、最終ペプチドについて記載されている。水素原子は、見やすくするために以下のペプチド構造から省かれている。
質量スペクトル分析:Agilent6200シリーズTOF/6500シリーズQ-TOFまたはThermo-LCQ・Advantageシステムを使用して、ESIに基づく質量データを収集した。
ppTG21及びppTG21誘導体
ppTG21:GLFHALLHLLHSLWHLLLHA(配列番号:1012)(74)、
ペプチジル樹脂のFmoc脱保護の後、Fmoc-アミノ酸を、上記の標準的なアミドカップリング/FMOC切断方法を用いて樹脂結合ペプチドに連続的にカップリングさせ、H-Gly-Leu-Phe-His(Trt)-Ala-Leu-Leu-Leu-Leu-His(Trt)-Lau-Leu-His(Trt)-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-His(Trt)-Leu-Leu-Leu-His(Trt)-Ala-Wang樹脂(配列番号:1052)を供給した。このペプチジル樹脂をMeOH(2×150mL)、ジクロロメタン(2×150mL)及びMeOH(2×150mL)で洗浄した。この樹脂を真空下で一晩乾燥させた。TFA:チオアニソール:フェノール:EDT:H2Oの溶液0(87.5:5:2.5:2.5:2.5,650m
L)をこのペプチジル樹脂に添加し、得られた懸濁液を2.5時間振とうし、濾過した。濾液にエーテル(5L)を加え、固体を得た。この混合物を遠心分離し、エーテル層をデカントした。得られた固体をエーテル(3×)で洗浄し、真空中で一晩乾燥させた。次いで、得られた粗製物を、逆相HPLCによって精製し、類似の画分を合わせた後、凍結乾燥して5.18gの所望のペプチド(TFA塩)を白色固体として得た。UV純度(220nm)=95.4%(保持時間=9.22分、溶媒勾配A:B、24:76から14:
86)。ESI(m/z)2341.3430(M+H)+。
ル樹脂に添加し、この懸濁液を2.5時間振とうし、次いで濾過した。濾液にエーテル(5L)を加え、固体を得た 。この混合物を遠心分離し、エーテル層をデカントした。得
られた固体をエーテル(3×)で洗浄し、真空中で一晩乾燥させた。次いで、得られた粗製ペプチドを、逆相HPLCを介して精製し、同様の画分を合わせ、凍結乾燥して、800mg(UVにより90%)のAc-Cys-Gly-Leu-Phe-His-Ala-Leu-Leu-His-Leu-Leu-His-Ser-Leu-Trp-His-Leu-Leu-Leu-His-Ala-OH(配列番号1054)を得た。N,N-ジメチルホルムアミド(80mL)中のペプチドの溶液を、2,2’-ジチオジ(5-ニトロピリジン)(200mg、2当量)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.23mL、4当量)で処理した 。この混合物を1時間撹拌した。N,N-ジメチルホ
ルムアミドを減圧下に除去して、黄色油状物(1.05g)を得た。得られた粗製ペプチドを、逆相HPLCを介して精製し、同様の画分を合わせ、凍結乾燥して、520mg(66%)の所望のペプチド(TFA塩)を白色固体として得た。UV純度(220nm)=95.6%。保持時間=10.80分。溶媒勾配A:B=10:90から0:100。ESI(m/z)2640.3345(M+H)+。
(3mmol、1.89g)、HBTU(2.85mmol、1.08g)の溶液を、N-メチルモルホリン(6mmol、0.66mL)で、0℃で処理し、この混合物を0℃で15分間維持した。次いで、この溶液をH-Ala-wang樹脂に添加し、この混合物を25℃で1時間撹拌し、その時点でカイザーニンヒドリン試験は反応が完了したことを示した 。この混合物を濾過し、固体をN,N-ジメチルホルムアミド(5×30mL
)で洗浄した。得られたFmoc-His(Trt)-Ala-CTC樹脂生成物を、更に処理することなく次のステップで使用した。このペプチジル樹脂のFmoc脱保護の後、Fmocアミノ酸を、上記の標準的なアミドカップリング/FMOC切断方法を用いて、樹脂結合ペプチドに連続的にカップリングさせた。Ac-Cys(Trt)-PEG-Gly-Leu-Phe-His(Trt)-Ala-Leu-Leu-His(Trt)-Leu-Leu-His(Trt)-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-His(Trt)-Leu-Leu-Leu-His(Trt)-Ala-Wang樹脂(配列番号1055)を構築した後、このペプチジル樹脂をメタノール(2×50mL)、ジクロロメタン(2×50mL)及びメタノール(2×50mL)で洗浄した。この樹脂を真空下で一晩乾燥させた。TFA:チオアニソール:フェノール:EDT:H2O
=87.5:5:2.5:2.5:2.5,150mL)の溶液を加え、この懸濁液を2.5時間振とうし、濾過した。濾液にエーテル(1.2L)を加え、固体を得た 。この
混合物を遠心分離し、エーテル層をデカントした。得られた固体をエーテル(3×)で洗浄し、真空中で一晩乾燥させた。得られた粗製ペプチドを逆相HPLCで精製し、同様の画分を合わせ、凍結乾燥して、Ac-Cys-PEG-Gly-Leu-Phe-His-Ala-Leu-Leu-His-Leu-Leu-His-Ser-Leu-Trp-His-Leu-Leu-Leu-His-Ala-OH(配列番号1056)を得た。N,N-ジメチルホルムアミド(110mL)中の粗製ペプチド(1.10g、純度:HPLCで85%)を、2,2’-ジチオジ(5-ニトロピリジン)(275mg、2当量)及びDIPEA(0.32mL、4当量)で処理した 。この混合物を1時間撹拌し
、次いでDMFを減圧下で除去して、黄色油状物を得た。得られた粗製ペプチドを、逆相HPLCを用いて精製し、同様の画分を合わせ、凍結乾燥して、270mg(27%)の所望のペプチド(TFA塩)を白色固体として得た。UV純度(220nm)=95.4%。保持時間=9.18分。溶媒勾配A:B=14:86から4:96。ESI(m/z)2887.4972(M+H)+。
ジメチルホルムアミド(5×30mL)で洗浄した。このFmoc-Ala-Cys(Trt)-CTC樹脂を、更に処理することなく次のステップで使用した。
5:5:2.5:2.5:2.5,150mLの溶液を添加し、この懸濁液を2.5時間振とうし、次いで濾過した。エーテル(1.2L)を濾液に添加して固体を得た 。この
混合物を遠心分離し、エーテル層をデカントした。この粗製ペプチドをエーテル(3×)で洗浄し、真空中で一晩乾燥させた。得られた残渣を逆相HPLCにより精製し、同様の画分を合わせ、凍結乾燥して、H-Gly-Leu-Phe-His-Ala-Leu-Leu-His-Leu-Leu-His-Ser-Leu-Trp-His-Leu-Leu-Leu-His-Ala-Cys-OH(配列番号1058)を得た。このペプチド1.4g(HPLC純度75%)をN,N-ジメチルホルムアミド(140mL)に溶解し、2,2’-ジチオジ(5-ニトロピリジン)(217mg、2当量)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.25mL、4当量)を加えた 。この混合物を1時
間撹拌し、次いでN,N-ジメチルホルムアミドを減圧下で除去して黄色油状物を得た。得られた粗製ペプチドを、逆相HPLCにより精製し、同様の画分を合わせ、凍結乾燥して、280mg(25%)の所望のペプチド(TFA塩)を白色固体として得た。UV純度(220nm)=95.3%。保持時間=9.88分。溶媒勾配A:B=11:89から1:99。ESI(m/z)1299.9(M/2+H)+、866.7(M/3+H
)+。
てN,N-ジイソプロピルエチルアミン(7.0μM)を室温で添加した。この反応物を室温で18時間撹拌し、Genevacを用いて減圧下で濃縮した。この粗製物質を、以下の条件を用いる逆相クロマトグラフィーを使用して精製し、標題化合物をガラス状固体として得た(3.3mg、40%)。
残渣をジメチルスルホキシド(1mL)に溶解し、逆相HPLCにより精製した。カラム:Waters Sunfire C18、19×100、5u。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。勾配:10.5分で60.0%H2O/40.0%アセトニトリルから直線で30.0
%H2O/70.0%アセトニトリルへ、10.5分で30.0%H2O/70.0%アセトニトリルから直線で0%H2O/100%アセトニトリルへ、11.0分から12.0
分まで0%H2O/100%アセトニトリルへ。流量:25mL/分。
カラム:Waters Atlantis dC18、4.6×50、5u。移動相A:水中の0.05%TFA(v/v)。移動相B:アセトニトリル中の0.05%TFA(v/v)。勾配:4.0分で75.0%H2O/25.0%から直線で5%H2O/95%アセトニトリルへ、5.0分まで4.0%H2O/95%アセトニトリルを維持。流量
:2mL/分。保持時間=3.33分。観察された質量M/Z=741.65。方法E:ESIM/Z=2963.0
KALA:WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA(配列番号869)(83)
WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKASEA-Cys(NPys)-OH(配列番号1065)(85)
Cas9構築物及びガイドRNAの発現及び精製を、文献(Jinek et al.,A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.Science,337(6096):p.816-21(2012))に記載されたようにして実施した。簡単に説明すると、S.pyogenes Cas9 M1C/C80Sタンパク質(配列番号850)をコードする大腸菌コドン最適化遺伝子を、ヘキサ-ヒスチジン(配列番号1068)と、N末端におけるマルトース結合タンパク質タグと、C末端における2つの核酸局在化シグナル(NLS)(各NLSはPKKKRKV(配列番号830))または3つのNLS(各NLSはPKKKRKV(配列番号830)及びmCherry(配列番号915)との融合タンパク質として、細菌タンパク質発現プラスミドに挿入した。配列番号1013に記載のCas9構築物のアミノ酸配列は、Y1C80S-2Nと呼ばれる。配列番号1015に記載のCas9構築物のアミノ酸配列は、Cas9構築物Y1C80S-3N-mと呼ばれる。
0.05で接種し、37℃、170rpmで増殖させた。0.8μmのOD値で、0.2mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)の添加により発現を誘導し、16℃で16時間増殖させた。細菌を、600の光学密度(OD600nm)0.05
において、リソゲンブロス(LB)培地に接種し、37℃、170rpmで増殖させた。細菌をペレット化し、上清を捨て、次いで20mMの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、500mMの塩化カリウム(KCl)、5mMのトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、10mMのイミダゾール、pH7.5中における超音波処理により溶解させた。清澄化された溶解物をNi-NTAアガロース(Qiagen)上に捕捉し、20mMのHEPES、500mMのKCl、5mMのTCEP、10mMのイミダゾール、pH7.5で徹底的に洗浄し、20mMのHEPES、250mMのKCl、5mMのTCEP、300mMのイミダゾール、10%グリセロール、pH7.5。4℃で溶離させた。タバコエッチウイルス(TEV)プロテアーゼにより一晩、6×His-MBPタグ(配列番号1068として開示された「6×His」を)を除去する一方、20mMのHEPES、300mMのKCl、5mMのTCEP、10%グリセロール、pH7.5中で透析した。Cas9構築物を、ヘパリンSPカラム(GEヘルスケア)での捕捉及び300mMから1MのKClで、直線で溶離することによってタグから分離した。最後に、Cas9構築物を、20mMのHEPES、150mMのKCl、10%グリセロール、pH7.5中のSuperdex・S200・HiLoadカラム(GEヘルスケア)で更に精製した。この時点で、Cas9構築物は、UV吸光度により決定した濃度の約15~20mg/mLに濃縮され、純度はSDS-PAGEにより評価され、アリコートは液体窒素中で急速凍結された。アリコートを-80℃で保存した。
、50℃で5分間インキュベートし、最後に室温まで冷却した。濃度をUV吸光度により決定し、-80℃で保存した。
実施例Y53aASGPRL:ASGPRリガンド(化合物53、N-(1,3-ビス[(1-{1-[(1S,2R,3R,4R,5S)-4-(アセチルアミノ)-2,3-ジヒドロキシ-6,8-ジオキサビシクロ[3.2.1]オクタ-1-イル]-2,5
,8,11-テトラオキサトリデカン-13-イル}-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ]-2-{[(1-{1-[(1S,2R,3R,4R,5S)-4-(アセチルアミノ)-2,3-ジヒドロキシ-6,8-ジオキサビシクロ[3.2.1]オクタ-1-イル]-2,5,8,11-テトラオキサトリデカン-13-イル}-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ]メチル}プロパン-2-イル)-3,31-ジオキソ-1-(ピリジン-2-イルジスルファニル)-7,10,13,16,19,22,25,28-オクタオキサ-4,32-ジアザオクタトリアコンタン38-アミド)を、ジメチルスルホキシド(DMSO)中で8mMに再構成して、リガンド断片53aを得た(下記に示す)。その後、リガンド断片53aを、20:1のHEPES、150mMのKCl、10%グリセロール、pH7.5中で10倍に希釈し、リガンド対タンパク質のモル比15:1で、Cas9構築物(Y1C80S-3N-m)に直接添加し、室温で1~2時間インキュベートした。標識されたCas9構築物、Y53aASGPRLをZeba・Spinカラム(Thermo Fisher)を用いて脱塩した。
実施例Y53a-C574-ASGPRL-RNP-EMX1:(53)RNP(EMX1sgRNAガイド配列(配列番号907)に連結された、S.pyogenesCas9-突然変異C80S(アミノ酸配列)3NLS-mcherry(配列番号1026
)
1mMのMgCl2、20mMのHEPES、150mMのKCl、10%グリセロー
ル(pH7.5)中のEMXl・sgRNAガイド配列(配列番号907)の溶液(15.6μL、222μΜ、3463pmol)に、29.5μLの1mMのMgCl2、2
0mMのHEPES、150mMのKCl、10%グリセロール(pH7.5)バッファを加えて、EMXl・sgRNAガイド配列(配列番号907)を、45μl、76.8μMで得た。
MのKCl、10%グリセロール(pH7.5)緩衝液を加えて、1mMのMgCl2、
20mMのHEPES、150mMのKCl、10%グリセロール(pH7.5)緩衝液中のCas9構築物Y53a-C574-ASGPRL15μlを得た。
ペッティングして混合し、Y53a-C574-ASGPRL・RNP構築物(30μM、32μM)を得た。このRNP構築物を、ここでは、Y53a-C574-ASGPRL-RNP-EMX1と称する。この反応混合物を37℃(水浴)で10分間インキュベートし、次いで生物学的実験または蛍光顕微鏡実験において直接使用した。
1mMのMgCl2、20mMのHEPES、150mMのKCl、10%グリセロー
ル(pH7.5)バッファ中のPCSK9単一ガイドsgRNA配列(配列番号896)の溶液に、20mMのHEPES中の0.96μLの1mMのMgCl2、20mMのH
EPES、150mMのKCl、10%グリセロール(pH7.5)緩衝液を加えて、64μMで5μLのPCSK9単一ガイドsgRNA配列1(配列番号896)を得た。
同様の手順を用いて、以下のRNPを調製した:
実施例Y53aASGPRL-RNP-EMX1:Cas9構築物Y53aASGPRL及びEMX1ガイドRNA配列(配列番号907)を用いた。
実施例Y53aASGPRL-RNP-PCS4:Cas9構築物Y53aASGPRL及びPCSK9ガイドRNA配列(配列番号906)を用いた。
ヒト肝細胞における遺伝子編集は、T7エンドヌクレアーゼ1(T7E1)エンドヌクレアーゼアッセイによって行った。簡単に説明すると、80000のHepG2(ASGPR陽性-ATCCnb.HB-8065)またはSkHep(ASGRP陰性-ATCCnb.HTB-52)細胞を、24ウエルプレートに播種した。以下のCas9構築物:Y1C80S-3N-m及びY53aASGPRLを、1:1.2のモル比のガイドRNAと共に、37℃で10分間インキュベートすることにより、Cas9ガイドRNAリボヌクレオタンパク質(Cas9・RNP)を組立てた。
分解剤の存在下または非存在下において、50pmolのCas9・RNPで処理した。インキュベーションの48時間後、培養培地を除去し、細胞をQuickExtract緩衝液(Epibio)を用いて5分間室温で溶解した。チューブに上清を移し、この試料を65℃で20分間加熱し、続いて95℃で20分間加熱した。UV吸光度によりゲノムDNA濃度を測定した。特異的プライマー(以下の配列)を用いて対象の遺伝子座を増幅し、またポリメラーゼ連鎖反応(PCR)産物をアガロースゲル上で視覚化し、標準と比較することにより定量化した。200ngのPCR産物を融解及び再ハイブリダイズし、それを37℃で30分間、T7E1エンドヌクレアーゼを用いて消化した。切断されたPCR産物の定量により、編集効率を決定した。
順方向:5’-GCCATCCCCTTCTGTGAATGTTAGAC-3’(配列番号1017)
逆方向:5’-GGAGATTGGAGACACGGAGAGCAG-3’(配列番号:1018)
順方向:5’-CCAGCTCCCAGCCAGGATTC-3’(配列番号1019)
逆方向:5’-ATCGTGCCAAGCGAAGAGC-3’(配列番号1020)
順方向:5’-TGATGGCCTTGGACAGTTACC-3’(配列番号1021)
逆方向:5’-GGTCCAGATGGAGAGAGACCA-3’(配列番号1022)
RNP-PCS4で、濃度を増加させたppTG21エンドソーム溶解性ペプチド(250及び1000nM)の存在下で処理した。T7E1エンドヌクレアーゼアッセイにより編集を評価する前に、細胞を48時間処理した。編集効率を図5に注記する。
材料/試薬:
SKHep細胞(ATCC HTB-52)
HepG2細胞(ATCC HB-8065)
増殖培地:DMEM高グルコース(ThermoFisher 11965-092)
10%ウシ胎仔血清、熱不活性化型(ThermoFisher 16000-044)
1mMの非必須アミノ酸(ThermoFisher 11140-050)
2mMのL-グルタミン(ThermoFisher 25030-081)
100単位/mLのペニシリン/ストレプトマイシン(ThermoFisher 10378-016)
MatTekガラス底ウエル(MatTek・Corp・P35G-1.5-14-C)
デキストラン647-(Life Technologies D34682)
Hoechst3328-(Life Technologies 62249)-1μg/mLで使用
コラーゲン-(Life Technologies A10483-01)-5ug/cm2で使用
上記のY53aASGPRL-RNP-EMX1及びY1C80S-3N-m-RNP-EMX1・RNP構築物を使用した。図2に画像を示す。
プロトコル:
-コラーゲンでコーティングしたMatTekウエルに、増殖培地中40,000/ウエルで細胞をプレーティングする
-24時間後に新しい培地に変える
-Dextran647(500ng/mL)で4時間処理する。
-4時間後、培地にHoechstを5分間添加する。
-新鮮な培地に変える。
-培地を除去し、Y1・C80S-3N-m-RNP-EMX1・RNP構築物64μMで、またはY53・ASGPRL-RNP-EMX1・RNP構築物を64μMで添加する。
-生細胞条件で1時間、Zeiss回転ディスク顕微鏡で画像化し、5分ごとに画像を収集する。
・画像はZenソフトウェア(Carl Zeiss、Inc)で処理した。
本発明の化合物を用いてアシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)を標的とすることにより調節される疾患を治療するための本発明の実施は、以下に記載する1以上の機能アッセイにおける活性によって証明することができる。供給源は括弧内に記載する。
化合物を用いた全てのSPR測定は、Biacore 3000(GE Healthcare)を用いて25℃で行った。ビオチン化ASGPRは、SAセンサーチップ(GE Healthcare)またはCM5センサーチップ(GE Healthcare)への標準のアミンカップリングにより固定されたNeutravidin(Pierc
e Biochemical)を備えたカスタムセンサーチップを使用して、典型的には2000~3000共鳴単位(Ru)で固定化された。ランニング緩衝液はHBS(10mMのHEPES、150mMのNaCl)、20mMのCaCl2、0.01%のp2
0、3%のDMSO、または50mMのトリス、150mMのNaCl、50mMのCaCl2、0.01%のp20、3%のDMSO、pH7.5であった。化合物を、900
μMの濃度でランニング緩衝液の中に希釈し、3倍で、3.3μMまで段階的に希釈した。化合物溶液を50uL/分で1分間注入し、続いて各濃度について2回ずつ1分間解離させた。多量体コンジュゲート(二量体、三量体)については、コンジュゲートをランニング緩衝液中で100nMまたは10nMの濃度にまで段階的に希釈した。コンジュゲートを2分間注入し、オフ速度を300または600秒間検出した。オフ・フェーズ・データの完了後、900μMのGalNAcの注入を用いて化合物を置換し、受容体表面を遊離状態に戻した。スクラバー2(Biologic Software、Inc.)を使用して全てのデータを処理し、ゼロ調整し、排除体積効果について整列させ、参照し、修正した。KDSは、スクラバー2中での化合物及び単一接合分子の定常状態結合応答をフィ
ッティングすることによって決定した。動態応答を示す多量体コンジュゲートのKDをス
クラバー2で処理し、BiaEval(GE Healthcare)に適合させて、KDを計算するためにオン及びオフ速度パラメータを抽出した。その値は、複数の実験の標
準偏差を反映している。
SPR結合アッセイについては以下の結果が得られ、ここで各アッセイは別々に報告され、またはラン回数(n)及び標準偏差が記録される。
SPR:全ての実験は、市販のストレプトアビジンセンサー(Senor Chip SA、GE Healthcare)を25℃で用い、Biacore3000(GE Healthcare)で行った。
ASGPr・HI・CRDタンパク質の固定化レベルは実験に依存し、個々の実験プロトコルに記載されている。全ての実験は、50uL/分の流量で行った。全ての実験にお
いて、ストレプトアビジンセンサー表面を参照として使用した。得られた全てのデータは、Scrubber2ソフトウェア(BioLogic Software)を使用して処理し、ゼロ調整し、x-整列させ、参照及びベースラインについて修正した。曲線は、スクラバーにおける1:1動態結合モデルを使用して適合させた。
ASGPr HI CRD:ストレプトアビジン表面上への捕捉のために、先に述べたようにして、ASGPr HI CRDは、孤立した遊離システインと反応されたマレイミド-PEG2-ビオチン(Pierce)を用いて誘導体化された。タンパク質コンジュゲートについては、立体的な衝突を生じさせる表面上の混雑を減少させるために、表面密度を低く維持した。
RNP構築物は、20mMのHEPES・pH7.5、150mMのKCl、20mMのCaCl2、5mMのMgCl2、0.01%のp20の中の32μMのストックとして供給され、これはRNPと共にSPRのランニング緩衝液として役立った。Cas9-リボ核タンパク質については、このストックをランニング緩衝液で10倍に希釈し、次いで最大濃度として10nMに再度希釈した。ASGPrを、50及び200Ruでストレプトアビジンセンサー上に固定化した。10nM濃度の単回注入は、低分子複合体で観察されたのと同様に、過剰の(900μM)N-アセチル-ガラクトサミン(GalNAc)の注入によって主に競合され得る明確な結合を示した。ASGPrリガンド(Y1C80S-3N-m-RNP-EMX1)を含まない対照RNP構築物も最高濃度(10nM)で注入されたが、固定化された受容体への如何なる結合も示さなかった。タンパク質をランニング緩衝液中で10nMから2倍に連続希釈して、両方の密度で親和性を得た。各濃度の間で900μMのGalNAcを注入して、受容体からRNPを除去した。一連の濃度からの応答を前述のスクラバー2を用いて処理し、1:1結合モデルに適合させた。
1.式(A-1)、(A-2)、または(A-3)の化合物、またはその医薬的に許容される塩:
Rxxは、-H、-アルキル、-シクロアルキル、-アルケニル、アルキニル、-アリール、-ヘテロアリール、-OR5、-N(R4)-R5、-SR5であり、前記Rxxの-CH2-基は、各々独立して、-O-、-S-、-N(R4)-から選択されるるヘテロ原子基と交換されてもよく、前記Rxxの-CH3は、-N(R4)2、-OR4、及び-S(R4)
から選択されるヘテロ原子基と交換されてもよく、前記ヘテロ原子基は、少なくとも2つの炭素原子によって離間されており、前記アルキル、アルケニル、アルキニル、及びシクロアルキルは、各々1以上のハロ原子で置換されてもよく、
Ryyは、-CN、-CH2-CN、-C≡CH、-CH2-N3、-CH2-NH2、-C
H2-N(R4)-S(O)2-R5、-CH2-CO2H、-CO2H、-CH2-OH、-
CH2-SH、-CH-CH-R5、-CH2-R5、-CH2-S-R5、-CH2-N(R4)-R5、-CH2-N(R4)-C(O)-R5、-CH2-N(R4)-C(O)-O-R5、-CH2-N(R4)-C(O)-N(R4)-R5、-CH2-O-R5、-CH2-O-C(O)-R5、-CH2-O-C(O)-N(R4)-R5、-CH2-O-C(O)-O
-R5、-CH2-S(O)-R5、-CH2-S(O)2-R5、-CH2-S(O)2-N(R4)-R5、-C(O)-NH2、-C(O)-O-R5、-C(O)-N(R4)-R5、またはアリールもしくはヘテロアリールであり、前記アリールもしくはヘテロアリールは任意にR5で置換され、
各R1は、独立して、-CN、-CH2-CN、-C≡CH、-CH2-N3、-CH2-
NH2、-CH2-N(R4)-S(O)2-R5、-CH2-CO2H、-CO2H、-CH2
-OH、-CH2-SH、-CH-CH-R5、-CH2-R5、-CH2-S-R5、-CH2-N(R4)-R5、-CH2-N(R4)-C(O)-R5、-CH2-N(R4)-C(O)-O-R5、-CH2-N(R4)-C(O)-N(R4)-R5、-CH2-O-R5、-
CH2-O-C(O)-R5、-CH2-O-C(O)-N(R4)-R5、-CH2-O-C(O)-O-R5、-CH2-S(O)-R5、-CH2-S(O)2-R5、-CH2-S(
O)2-N(R4)-R5、-C(O)-NH2、-C(O)-O-R5、-C(O)-N(
R4)-R5、またはアリールもしくはヘテロアリールであり、前記アリールもしくはヘテロアリールは、任意にR5で置換されるか、
または、R1は、-Z-X-Y、-Z-Y、-X-Y、-Z-X+Y-、-X+Y-、-Z
-X-Y+、-X-Y+、または-Yであり、
Xは、リンカーであり、
X+は、正に荷電したリンカーであり、
X-は、負に荷電したリンカーであり、
Yは、部位特異的修飾ポリペプチドを含むリボ核タンパク質またはエンドヌクレアーゼであるか、Yは部位特異的修飾ポリペプチドであるか、YはCas9リボ核タンパク質で
あるか、YはCas9タンパク質であるか、YはシングルガイドRNA配列(sgRNA)であるか、YはCRISPR RNA(crRNA)及びトランス活性化crRNA(tracrRNA)を含むデュアルガイドRNA配列であり、
Y+は、部位特異的修飾ポリペプチドを含む正に荷電したリボ核タンパク質またはエン
ドヌクレアーゼであるか、Y+は正に荷電した部位特異的修飾ポリペプチドであるか、Y+は正に荷電したCas9タンパク質であり、
Y-は、部位特異的修飾ポリペプチドを含む負に荷電したリボ核タンパク質もしくはエ
ンドヌクレアーゼであるか、またはY-は負に荷電した部位特異的修飾ポリペプチドであ
るか、Y-は負に荷電したCas9リボ核タンパク質であるか、またはY-は負に荷電したsgRNAであるか、またはY-はCRISPR RNA(crRNA)及びトランス活
性化crRNA(tracrRNA)を含む負に荷電したデュアルガイドRNA配列であり、
Zは、存在しないか、または-C≡C-、-CH=CH-、-CH2-、-CH2-O-、-C(O)-N(R4)-、-CH2-S-、-CH2-S(O)-、-CH2-S(O)2-、-CH2-S(O)2-N(R4)-、-C(O)-O-、-CH2-N(R4)-、-CH2-N(R4)-C(O)-、-CH2-N(R4)-S(O)2-、-CH2-N(R4
)-C(O)-O-、-CH2-N(R4)-C(O)-N(R4)-、-CH2-O-C(O)-、-CH2-O-C(O)-N(R4)-、-CH2-O-C(O)-O-、または
アリールもしくはヘテロアリールであり、前記アリールもしくはヘテロアリールは任意にR5で置換され、
R2は、-OH、-N3、-N(R3)2、-N(R3)-C(O)-R3、-N(R3)-
C(O)-N(R3)2、-N(R3)-C(O)-OR3、-N(R3)-S(O)2-R3
、テトラゾール、またはトリアゾールであり、前記テトラゾール及びトリアゾールは任意にR3で置換され、
各R3は独立して、-H、-(C1-C5)アルキル、ハロ置換(C1-C5)アルキル、
ハロ置換(C3-C6)シクロアルキル、-(C1-C5)アルケニル、-(C1-C5)アルキニル、ハロ置換-(C1-C5)アルケニル、ハロ置換-(C1-C5)アルキニル、または(C3-C6)シクロアルキルであり、前記アルキルまたはシクロアルキルの-CH2-
基は各々独立して、-O-、-S-、及び-N(R4)-から選択されるヘテロ原子基と
交換されてもよく、前記アルキルの-CH3は各々が独立して、-N(R4)2、-OR4、及び-S(R4)から選択されるヘテロ原子基で置換されてもよく、前記ヘテロ原子基は
少なくとも2つの炭素原子で離間されており、
各R4は独立して、-H、-(C1-C20)アルキル、-(C1-C20)アルケニル、-
(C1-C20)アルキニル、または(C3-C6)シクロアルキルであり、前記少なくとも
2つの炭素原子で離間されたアルキルまたはシクロアルキルの1~6個の-CH2-基は
各々独立して、-O-、-S-、または-N(R4)-から独立して選択されるヘテロ原
子と交換されてもよく、前記アルキルの-CH3は各々独立して、-N(R4)2、-OR4、及び-S(R4)から選択されるヘテロ原子基と交換されてもよく、前記ヘテロ原子基
は、少なくとも2つの炭素原子で離間されており、前記アルキル、アルケニル、アルキニル、及びシクロアルキルはハロ原子で置換されてもよく、
各R5は独立して、-H、(C3-C20)シクロアルキル、-(C1-C60)アルケニル
、-(C1-C60)アルキニル、または(C1-C60)アルキルであり、前記シクロアルキルの1~6個の-CH2-基、または前記アルキルの1~20個の-CH2-基は、各々独立して、-O-、-S-、及び-N(R4)-から独立して選択されるヘテロ原子と交換
されてもよく、前記ヘテロ原子は少なくとも2つの炭素原子で離間されており、また前記アルキルの-CH3は各々独立して、-N(R4)2、-OR4、及び-S(R4)から選択
されるヘテロ原子で置換されてもよく、前記ヘテロ原子基は少なくとも2つの炭素原子で離間されており;また前記アルキル、アルケニル、アルキニル、及びシクロアルキルは、ハロ原子で置換されてもよい。
2.式(B)の化合物、またはその医薬的に許容される塩:
R1は、-Z-X-Y、-Z-Y、-X-Y、-Z-X+Y-、-X+Y-、-Z-X-Y+
、-X-Y+、または-Yであり、
Xはリンカーであり、
X+は、正に荷電したリンカーであり、
X-は、負に荷電したリンカーであり、
Yは、部位特異的修飾ポリペプチドを含むリボ核タンパク質またはエンドヌクレアーゼであるか、Yは部位特異的修飾ポリペプチドであるか、YはCas9リボ核タンパク質であるか、YはCas9タンパク質であるか、YはシングルガイドRNA配列(sgRNA)であるか、YはCRISPR RNA(crRNA)及びトランス活性化crRNA(tracrRNA)を含むデュアルガイドRNA配列であり、
Y+は、部位特異的修飾ポリペプチドを含む正に荷電したリボ核タンパク質またはエン
ドヌクレアーゼであるか、またはY+は正に荷電した部位特異的修飾ポリペプチドである
か、またはY+は正に荷電したCas9タンパク質であり、
Y-は、部位特異的修飾ポリペプチドを含む負に荷電したリボ核タンパク質またはエン
ドヌクレアーゼであるか、Y-は負に荷電した部位特異的修飾ポリペプチドであるか、Y-は負に荷電したCas9リボ核タンパク質であるか、Y-は負に荷電したsgRNAであ
るか、またはY-はCRISPR RNA(crRNA)及びトランス活性化crRNA
(tracrRNA)を含む負に荷電したデュアルガイドRNA配列であり、
Zは、存在しないか、または-C≡C-、-CH=CH-、-CH2-、-CH2-O-、-C(O)-N(R4)-、-CH2-S-、-CH2-S(O)-、-CH2-S(O)2-、-CH2-S(O)2-N(R4)-、-C(O)-O-、-CH2-N(R4)-、-CH2-N(R4)-C(O)-、-CH2-N(R4)-S(O)2-、-CH2-N(R4
)-C(O)-O-、-CH2-N(R4)-C(O)-N(R4)-、-CH2-O-C(O)-、-CH2-O-C(O)-N(R4)-、-CH2-O-C(O)-O-、または
アリールもしくはヘテロアリールであり、前記アリールもしくはヘテロアリールは任意にR5で置換され、
R2は、-OH、-N3、-N(R3)2、-N(R3)-C(O)-R3、-N(R3)-
C(O)-N(R3)2、-N(R3)-C(O)-OR3、-N(R3)-S(O)2-R3
、テトラゾール、またはトリアゾールであり、前記テトラゾール及びトリアゾールは任意にR3で置換され、
各R3は独立して、-H、-(C1-C5)アルキル、ハロ置換(C1-C5)アルキル、
ハロ置換(C3-C6)シクロアルキル、-(C1-C5)アルケニル、-(C1-C5)アルキニル、ハロ置換-(C1-C5)アルケニル、ハロ置換-(C1-C5)アルキニル、または(C3-C6)シクロアルキルであり、前記アルキルまたはシクロアルキルの-CH2-
基は、各々独立して、-O-、-S-、及び-N(R4)-から選択されるヘテロ原子基
と交換されてもよく、前記アルキルの-CH3は各々が独立して、-N(R4)2、-OR4
、及び-S(R4)から選択されるヘテロ原子基と交換されてもよく、前記ヘテロ原子基
は少なくとも2つの炭素原子で離間されており、
各R4は独立して、-H、-(C1-C20)アルキル、-(C1-C20)アルケニル、-
(C1-C20)アルキニル、または(C3-C6)シクロアルキルであり、前記少なくとも
2つの炭素原子で離間されたアルキルまたはシクロアルキルの1~6個の-CH2-基は
、各々独立して、-O-、-S-、または-N(R4)-から独立して選択されるヘテロ
原子で置換されてもよく、前記アルキルの-CH3は、各々独立して、-N(R4)2、-
OR4、及び-S(R4)から選択されるヘテロ原子基と交換されてもよく、前記ヘテロ原子基は、少なくとも2つの炭素原子で離間されており、前記アルキル、アルケニル、アルキニル、及びシクロアルキルはハロ原子で置換されてもよく、
各R5は独立して、-H、(C3-C20)シクロアルキル、-(C1-C60)アルケニル
、-(C1-C60)アルキニル、または(C1-C60)アルキルであり、前記シクロアルキルの1~6個の-CH2-基、または前記アルキルの1~20個の-CH2-基は、各々独立して、-O-、-S-、及び-N(R4)-から独立して選択されるヘテロ原子と交換
されてもよく、前記ヘテロ原子は、少なくとも2つの炭素原子で離間されており、前記アルキルの-CH3は各々独立して、-N(R4)2、-OR4、及び-S(R4)から選択さ
れるヘテロ原子と交換されてもよく、前記ヘテロ原子基は少なくとも2つの炭素原子で離間されており;また前記アルキル、アルケニル、アルキニル、及びシクロアルキルはハロ原子で置換されてもよい。
3.実施形態1または2に記載の化合物であって、R2が、-NH-C(O)-CH3である前記化合物。
4.実施形態1~3の何れかに記載の化合物であって、R1が、-Z-X+Y-である
前記化合物。
5.実施形態1~3の何れかに記載の化合物であって、R1が、-Z-X-Y+である
前記化合物。
6.実施形態1~3の何れかに記載の化合物であって、R1が、-Z-X-Yである前
記化合物。
7.実施形態6に記載の化合物であって、R1が、L1~L10からなる群から選択さ
れる-Z-X-Yである前記化合物:
各Tは独立して、存在しないか、または(C1-C10)アルキレン、(C2-C10)アルケニレン、または(C2-C10)アルキニレンであり、前記Tの1以上の炭素基は、各々
独立して、-O-、-S-、及び-N(R4)-から独立して選択されるヘテロ原子基と
交換されてもよく、前記ヘテロ原子基は、少なくとも2つの炭素原子によって離間されており、また前記アルキレン、アルケニレン、及びアルキニレンは各々独立して1以上のハロ原子で置換されてもよく、
各Qは独立して、存在しないか、またはC(O)、C(O)-NR4、NR4-C(O)、O-C(O)-NR4、NR4-C(O)-O、-CH2-、ヘテロアリール、またはO
、S、S-S、S(O)、S(O)2及びNR4から選択されるヘテロ原子基であり、ここでは少なくとも2つの炭素原子が前記ヘテロ原子基O、S、S-S、S(O)、S(O)2及びNR4を任意の他のヘテロ原子基から離間し、
各R4は独立して、-H、-(C1-C20)アルキル、または(C3-C6)シクロアルキルであり、少なくとも2つの炭素原子で離間された前記アルキルまたはシクロアルキルの1~6個の-CH2-基が、-O-、-S-、または-N(R4)-で置換されてもよく、また前記アルキルの-CH3は各々独立して-N(R4)2、-OR4、及び-S(R4)か
ら選択されるヘテロ原子基が交換されてもよく、前記ヘテロ原子基は、少なくとも2つの炭素原子によって離間されており、また前記アルキル及びシクロアルキルは、ハロ原子で置換されてもよく、
各mは独立して0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40である。
8.実施形態7に記載の化合物であって、前記Qの各出現が独立して、1H-1,2,
3-トリアゾリル、ピリジニル及び1,2,3,4-テトラゾリルから選択されるヘテロアリールである前記化合物。
9.実施形態7または8に記載の化合物であって、前記Xはジスルフィド結合を含んで
いる前記化合物。
10.実施形態1に記載の化合物であって、式(C-1)、(C-2)、(C-3)または(C4)の式を有する前記化合物、またはその医薬的に許容される塩:
nは、1、2、または3であり、
Wは、存在しないか、またはペプチドであり、
Lは、-(T-Q-T-Q)m-であり、
各Tは独立して、存在しないか、または(C1-C10)アルキレン、(C2-C10)アルケニレン、もしくは(C2-C10)アルキニレンであり、前記Tの1以上の炭素基は、各
々独立して、-O-、-S-、及び-N(R4)-から独立して選択されるヘテロ原子基
と交換されてもよく、前記ヘテロ原子基は少なくとも2つの炭素原子によって離間されており、アルキレン、アルケニレン、及びアルキニレンは各々独立して1以上のハロ原子で置換されてもよく、
各Qは独立して、存在しないか、またはC(O)、C(O)-NR4、NR4-C(O)、O-C(O)-NR4、NR4-C(O)-O、-CH2-、ヘテロアリール、またはO
、S、S-S、S(O)、S(O)2及びNR4から選択されるヘテロ原子基であり、少なくとも2つの炭素原子が前記ヘテロ原子基O、S、S-S、S(O)、S(O)2及びN
R4を任意の他のヘテロ原子基から離間し、
各R4は独立して、-H、-(C1-C20)アルキル、または(C3-C6)シクロアルキルであり、少なくとも2つの炭素原子によって離間された前記アルキルまたはシクロアルキルの1~6個の-CH2-基が、-O-、-S-、または-N(R4)-と交換されてもよく、前記アルキルの-CH3は、各々独立して-N(R4)2、-OR4、及び-S(R4
)から選択されるヘテロ原子基と交換されてもよく、前記ヘテロ原子基は、少なくとも2つの炭素原子によって離間されており、前記アルキル及びシクロアルキルはハロ原子で置換されてもよく、
各mは独立して0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40である。
11.実施形態1に記載の化合物であって、式(D-1)または(D-2)の式を有する前記化合物、またはその医薬的に許容される塩:
nは1、2または3である。
12.実施形態2に記載の化合物であって、式(E)を有する前記化合物、またはその医薬的に許容される塩:
nは1、2または3であり、
Wは存在しないか、またはペプチドであり、
Lは、-(T-Q-T-Q)m-であり、
式中、
各Tは独立して、存在しないか、または(C1-C10)アルキレン、(C2-C10)アルケニレン、もしくは(C2-C10)アルキニレンであり、前記Tの1以上の炭素基は、各
々独立して、-O-、-S-、及び-N(R4)-から独立して選択されるヘテロ原子基
で置換されてもよく、前記ヘテロ原子基は少なくとも2つの炭素原子によって離間されており、
各Qは独立して、存在しないか、またはC(O)、C(O)-NR4、NR4-C(O)、O-C(O)-NR4、NR4-C(O)-O、-CH2-、ヘテロアリール、またはO
、S、S-S、S(O)、S(O)2及びNR4から選択されるヘテロ原子基であり、ここでは少なくとも2つの炭素原子が前記ヘテロ原子基O、S、S-S、S(O)、S(O)2及びNR4を任意の他のヘテロ原子基から離間し、
各R4は独立して、-H、-(C1-C20)アルキル、または(C3-C6)シクロアルキルであり、少なくとも2つの炭素原子によって離間された前記アルキルまたはシクロアルキルの1~6個の-CH2-基が、各々独立して、-O-、-S-、または-N(R4)-と交換されてもよく、また前記アルキルの-CH3は、-N(R4)2、-OR4、及び-S(R4)から選択されるヘテロ原子基と交換されてもよく、前記ヘテロ原子基は少なくと
も2つの炭素原子によって離間されており、また前記アルキル及びシクロアルキルはハロ原子で置換されてもよく、また
各mは独立して0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40である。
13.実施形態2に記載の化合物であって、式(F-1)または(F-2)の式を有する前記化合物、またはその医薬的に許容される塩:
nは1、2及び3から選択される。
14.実施形態10~13の何れか1項に記載の化合物であって、nが3である前記化合物。
15.実施形態12に記載の化合物であって、式
16.実施形態10または12に記載の化合物であって、Wがエンドソーム溶解性ペプチドまたは核局在化ペプチドであるペプチドである前記化合物。
17.先行する実施形態の何れか1項に記載の化合物であって、Yは、
(1)CRISPR RNA(crRNA)及びトランス活性化crRNA(tracrRNA)を含むデュアルガイドRNA配列、またはシングルガイドRNA配列(sgRNA)の何れかを備えた認識要素を含む第一の要素であって、前記配列は、発現されたときにCas9リボ核タンパク質の標的配列への配列特異的結合を指示し、前記第一の要素は1以上のエンドソーム脱出剤を任意に含む前記第一の要素と、
(2)Cas9タンパク質及び場合により1つ以上の核局在配列(NLS)及び場合により1つ以上の蛍光タンパク質及び1以上のエンドソーム脱出剤を含む第二の要素を含んだCas9リボ核タンパク質であり、
前記第一の要素は前記第二の要素と会合している前記化合物。
18.実施形態17に記載の化合物であって、前記標的配列が真核細胞標的配列である前記化合物。
19.実施形態17に記載の化合物であって、前記第一の要素が、CRISPR RNA(crRNA)及びトランス活性化crRNA(tracrRNA)を含むデュアルガイドRNA配列を含み、前記化合物の残りは、それぞれ独立してtracrRNA配列またはcrRNAへの1以上の相互作用を介して前記Cas9リボ核タンパク質に連結され
る前記化合物。
20.実施形態19に記載の化合物であって、前記tracrRNAが任意に化学的に修飾される前記化合物。
21.実施形態19または20に記載の化合物であって、前記tracrRNAは、CAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(配列番号1028)の配列に対して少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または少なくとも約100%の核酸配列同一性を有する配列を含み、前記配列は任意で、最初の3個の塩基において2’-O-メチルまたは2’-F修飾を含む前記化合物。
22.実施形態19~21の何れか1項に記載の化合物であって、前記crRNAが任
意に化学的に修飾されている前記化合物。
23.実施形態19~21の何れか1項に記載の化合物であって、前記crRNAは、
下記から選択される配列に対して少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または少なくとも約100%のヌクレオチド配列同一性を有する配列を含む前記化合物:
PCSK9 crRNA配列1:
GGUGCUAGCCUUGCGUUCCGGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号885)、最後の4塩基の最初の3つ(GCU)に任意に2’-O-メチルまたは2’-F修飾を含む、
PCSK9 crRNA配列2:
CGUGCUCGGGUGCUUCGGCCGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号886)、最後の4塩基の最初の3つ(GCU)に任意に2’-O-メチルまたは2’-F修飾を含む、
PCSK9 crRNA配列3:
GCCGUCCUCCUCGGAACGCAGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号887)、最後の4塩基の最初の3つ(GCU)に任意に2’-O-メチルまたは2’-F修飾を含む、
PCSK9 crRNA配列4:
GGACGAGGACGGCGACUACGGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号888)、最後の4塩基の最初の3つ(GCU)に任意に2’-O-メチルまたは2’-F修飾を含む、
PCSK9 crRNA配列5:
ACCACCGGGAAAUCGAGGGCGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号889)、最後の4塩基の最初の3つ(GCU)に任意に2’-O-メチルまたは2’-F修飾を含む、
PCSK9 crRNA配列6:
CGACUUCGAGAAUGUGCCCGGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号890)、最後の4塩基の最初の3つ(GCU)に任意に2’-O-メチルまたは2’-F修飾を含む、
PCSK9 crRNA配列7:
GAGUGACCACCGGGAAAUCGGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号891)、最後の4塩基の最初の3つ(GCU)に任意に2’-O-メチルまたは2’-F修飾を含む、
PCSK9 crRNA配列8:
CUCGGGCACAUUCUCGAAGUGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号892)、最後の4塩基の最初の3つ(GCU)に任意に2’-O-メチルまたは2’-F修飾を含む、
PCSK9 crRNA配列9:
GGAAGCCAGGAAGAAGGCCAGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号893)、最後の4塩基の最初の3つ(GCU)に任意に2’-O-メチルまたは2’-F修飾を含む、
PCSK9 crRNA配列10:
UCUUUGCCCAGAGCAUCCCGGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号894)、最後の4塩基の最初の3つ(GCU)に任意に2’-O-メチルまたは2’-F修飾を含む、
PCSK9 crRNA配列11:
CUAGGAGAUACACCUCCACCGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号895)、最後の4塩基の最初の3つ(GCU)に任意に2’-O-メチルまたは2’-F修飾を含む。
24.実施形態17に記載の化合物であって、前記第一の要素がシングルガイドRNA配列(sgRNA)を含み、前記化合物の残りがsgRNAに対する1以上の相互作用を介して前記Cas9リボ核タンパク質に連結される前記化合物。
25.実施形態24に記載の化合物であって、前記sgRNAが少なくとも20ヌクレオチドを含む前記化合物。
26.実施形態24に記載の化合物であって、前記sgRNAが少なくとも8個のヌク
レオチドを含む前記化合物。
27.実施形態24に記載の化合物であって、前記sgRNAとその対応する標的配列との間の相補性の程度が、適切なアライメントアルゴリズムを使用して最適に整列されたときに、少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%である前記化合物。
28.実施形態24の何れか1項に記載の化合物であって、前記sgRNAは、下記か
らなる群から選択される配列に対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%少なくとも約97パーセント、少なくとも約98パーセント、少なくとも約99パーセントまたは100パーセントのヌクレオチド配列同一性を有する前記化合物:
PCSK9シングルガイドRNA配列1
GGUGCUAGCCUUGCGUUCCGGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号896)、
PCSK9シングルガイドRNA配列2
CGUGCUCGGGUGCUUCGGCCGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号897)、
PCSK9シングルガイドRNA配列3
GCCGUCCUCCUCGGAACGCAGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号898)、
PCSK9シングルガイドRNA配列4
GGACGAGGACGGCGACUACGGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号899)、
PCSK9シングルガイドRNA配列5
ACCACCGGGAAAUCGAGGGCGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号900)、
PCSK9シングルガイドRNA配列6
CGACUUCGAGAAUGUGCCCGGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号901)、
PCSK9シングルガイドRNA配列7
GAGUGACCACCGGGAAAUCGGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号902)、
PCSK9シングルガイドRNA配列8
CUCGGGCACAUUCUCGAAGUGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号
903)、
PCSK9シングルガイドRNA配列9
GGAAGCCAGGAAGAAGGCCAGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号904)、
PCSK9シングルガイドRNA配列10
UCUUUGCCCAGAGCAUCCCGGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号905)、
PCSK9シングルガイドRNA配列11
CUAGGAGAUACACCUCCACCGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号906)、
EMX1シングルガイドRNA配列
GUCACCUCCAAUGACUAGGGGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号907)、
ROSA26シングルガイドRNA配列
CGAACCCUACACAUUCAACGGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号908)、
ここで、前記配列は任意に化学的に修飾される。
29.実施形態24~28の何れか1項に記載の化合物であって、前記Yが任意に化学的に修飾されたsgRNAを含む前記化合物。
30.実施形態1~29の何れか1項に記載の化合物であって、前記Yが更に蛍光プローブを含む前記化合物。
31.実施形態30に記載の化合物であって、前記蛍光プローブがmCherry配列(配列番号915)である前記化合物。
32.先行する実施形態の何れか1項に記載の化合物であって、前記Yが1以上のNL
Sを含む前記化合物。
33.実施形態32に記載の化合物であって、前記NLSの各々が、下記からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む前記化合物:
PKKKRKV(配列番号830)、
KRPAATKKAGQAKKKK(配列番号831)、
PAAKRVKLD(配列番号832)、
RQRRNELKRSP(配列番号833)、
NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(配列番号834)、
RMRIXFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(配列番号835)、
VSRKRPRP(配列番号836)、
PPKKARED(配列番号837)、
PQPKKKPL(配列番号838)、
SALIKKKKKMAP(配列番号839)、
DRLRR(配列番号840)、
PKQKKRK(配列番号841)、
RKLKKKIKKL(配列番号842)、
REKKKFLKRR(配列番号843)、
KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(配列番号844)、
RKCLQAGMNLEARKTKK(配列番号845)、
MAPKKKRKVGIHRGVP(配列番号1035)、及び
PKKKRKVEDPKKKRKVD(配列番号1036)。
34.実施形態33に記載の化合物であって、前記NLSの各々がアミノ酸配列PKKKRKV(配列番号830)を含む前記化合物。
35.実施形態34に記載の化合物であって、各々がアミノ酸配列PKKKRKV(配列番号830)を含む2つのNLSを含む前記化合物。
36.先行する実施形態の何れか1項に記載の化合物であって、前記Yは、S.aureus、S.pneumoniae、S.pyogenes、S.thermophilus、N.meningitidisまたはA.ebreus由来のCas9タンパク質に対して少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98パーセント、少なくとも約99パーセント、または100パーセントのアミノ酸配列同一性であるCas9タンパク質を含む前記化合物。
37.先行する実施形態の何れか1項に記載の化合物であって、前記Yが、II型Cas9タンパク質に対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96パーセント、少なくとも約97パーセント、少なくとも約98パーセント、少なくとも約99パーセント、または100パーセントのアミノ酸配列同一性であるCas9タンパク質を含む前記化合物。
38.先行する実施形態の何れか1項に記載の化合物であって、前記Yが、配列番号8の7~166位または731~1003位のアミノ酸または配列番号1~7、9~829に記載のものの対応するアミノ酸に対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99パーセント、または100パーセントのアミノ酸配列同一性であるCas9タンパク質を含む前記化合物。
39.先行する実施形態の何れか1項に記載の化合物であって、前記Yが、配列番号8の7~166位、または731~1003位におけるアミノ酸に対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99パーセント、または100パーセントのアミノ酸配列同一性であるCas9タンパク質を含む前記化合物。
40.先行する実施形態の何れか1項に記載の化合物であって、前記Yが、配列番号260~263の何れかのCas9アミノ酸配列のモチーフ1,2,3及び4に対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99パーセント、または100パーセントのアミノ酸配列同一性を有する配列内の少なくとも4モチーフを有するCas9タンパク質を含む前記化合物。
41.先行する実施形態の何れか1項に記載の化合物であって、前記Yが、S.pyogenesCas9(野生型)(配列番号848)、S.pyogenesCas9-突然変異M1C(配列番号849)、S.pyogenesCas9-突然変異M1C&C80S(配列番号850)、S.pyogenesCas9ニッカーゼ変異体D10A(配列番号851)、S.pyogenesCas9ニッカーゼ変異体H840A(配列番号852)、S.pyogenesCas9ニッカーゼ変異体E923P&T924P(配列番号853)、Acidovorax ebreus(Acidovorax ebreus)Cas9(配列番号854)、酸性鉱山排水菌Ga0052161_JGI・
Cas9(配列番号855)、S.pyogenesCas9ヌル変異体D10A&H840A(配列番号1027)、及びウラン鉱山菌FW106_JGICas9(配列856)から選択される配列に対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99パーセント、または100パーセントのアミノ酸配列同一性を有するCas9タンパク質を含む前記化合物。
42.先行する実施形態の何れか1項に記載の化合物であって、肝細胞上に存在する受容体に結合できる前記化合物。
43.実施形態42に記載の化合物であって、前記肝細胞に存在する受容体がアシアロ糖タンパク質受容体である前記化合物。
44.先行する実施形態の何れか1項に記載の化合物であって、エンドソーム脱出剤を更に含む前記化合物。
45.先行する実施形態の何れか1項に記載の化合物であって、前記Yが更にエンドソーム脱出剤を含む前記化合物。
46.実施形態44または45に記載の化合物であって、前記エンドソーム脱出剤は、リソソーム作用剤、細胞浸透性ペプチド、融合性ペプチド、孔形成剤、及びプロトンスポンジ剤からなる群から選択される前記化合物。
47.実施形態46に記載の化合物であって、前記エンドソーム脱出剤がペプチドppTG21:GLFHALLHLLHSLWHLLLHA(配列番号1012)である前記化合物。
48.実施形態1~47の何れか1項に記載の化合物及びエンドソーム脱出剤を含有する組成物であって、前記組成物を形成するために前記化合物及び前記エンドソーム脱出剤が同時インキュベートされる前記組成物。
49.実施形態48に記載の組成物であって、前記エンドソーム脱出剤が、リソソーム作用剤、細胞浸透性ペプチド、融合性ペプチド、細孔形成剤、及びプロトンスポンジ剤からなる群より選択される前記組成物。
50.実施形態49に記載の組成物であって、前記エンドソーム脱出剤がペプチドppTG21:GLFHALLHLLHSLWHLLLHA(配列番号1012)である前記組成物。
51.先行する実施形態の何れか1項に記載の化合物と、医薬的に許容される担体、賦形剤または希釈剤とを含有する医薬組成物。
52.対象における肝疾患もしくは状態、または肝臓調節疾患もしくは状態を治療する方法であって、前記対象に対して、実施形態51に記載の医薬組成物の治療的有効量を投与することを含む前記方法。
53.実施形態52に記載の方法であって、前記疾患または状態が、遺伝性血管浮腫、家族性チロシン血症I型、アラジール症候群、アルファ-1-アンチトリプシン欠損症、胆汁酸合成及び代謝異常、胆道閉鎖症、嚢胞性線維症肝疾患、特発性新生児肝炎、ミトコンドリア肝障害、進行性家族性肝内胆汁うっ滞、原発性硬化性胆管炎、トランスサイレチンアミロイドーシス、血友病、ホモ接合性家族性高コレステロール血症、家族性キロミクロン血症、高脂血症、脂肪性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)、高血糖、及びII型糖尿病と同様に異常に高い肝臓グルコース産生を伴う疾患からなる群から選択される前記方法。
54.実施形態53に記載の方法であって、前記疾患または状態が、高脂血症、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、または非アルコール性脂肪性肝炎(NAFLD)である方法。
55.対象の肝臓細胞における標的DNAの転写を選択的に調節する方法であって、前記対象に対して、実施形態51による医薬組成物を投与することを含む方法。
56.実施形態55に記載の方法であって、前記標的DNAが、遺伝性血管浮腫、家族性チロシン血症I型、アラジール症候群、アルファ-1-アンチトリプシン欠損症、胆汁酸合成及び代謝異常、胆道閉鎖症、嚢胞性線維症肝疾患、特発性新生児肝炎、ミトコンド
リア肝障害、進行性家族性肝内胆汁うっ滞、原発性硬化性胆管炎、トランスサイレチンアミロイドーシス、血友病、ホモ接合性家族性高コレステロール血症、家族性キロミクロン血症、高脂血症、脂肪性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)、高血糖、及びII型糖尿病と同様の異常に高い肝臓グルコース産生を伴う疾患からなる群から選択される疾患または状態に関連する前記方法。
57.実施形態55に記載の方法であって、前記標的DNAがPCSK9遺伝子である前記方法。
58.対象において肝疾患または状態に関連するタンパク質をコードする核酸分子を編集する方法であって、実施態様48に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む前記方法。
59.実施形態57の方法であって、前記タンパク質は、遺伝性血管浮腫、家族性チロシン血症I型、アラジール症候群、アルファ-1-アンチトリプシン欠損症、胆汁酸合成及び代謝異常、胆道閉鎖症、嚢胞性線維症肝疾患、特発性新生児肝炎、ミトコンドリア肝障害、進行性家族性肝内胆汁うっ滞、原発性硬化性胆管炎、トランスサイレチンアミロイドーシス、血友病、ホモ接合性家族性高コレステロール血症、家族性キロミクロン血症、高脂血症、脂肪性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)、高血糖、及びII型糖尿病と同様の異常に高い肝臓グルコース産生を伴う疾患からなる群から選択される肝疾患または状態に関連する前記方法。
60.対象における肝疾患または状態に関連した少なくとも1つの遺伝子産物の発現レベルを調節する方法であって、前記対象に対して、実施形態51に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
61.実施形態60に記載の方法であって、前記遺伝子産物が、遺伝性血管浮腫、家族性チロシン血症I型、アラジール症候群、アルファ-1-アンチトリプシン欠損症、胆汁酸合成及び代謝異常、胆道閉鎖症、嚢胞性線維症肝疾患、特発性新生児肝炎、ミトコンドリア肝障害、進行性家族性肝内胆汁うっ滞、原発性硬化性胆管炎、トランスサイレチンアミロイドーシス、血友病、ホモ接合性家族性高コレステロール血症、家族性キロミクロン血症、高脂血症、脂肪性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)、高血糖、及びII型糖尿病と同様の異常に高い肝臓グルコース産生を伴う疾患からなる群から選択される肝臓疾患または状態に関連する前記方法。
62.実施形態61に記載の方法であって、低密度リポタンパク質(LDL)のレベルを調節する前記方法。
63.実施形態61に記載の方法であって、前記対象の血液中コレステロールのレベルを調節する前記方法。
64.実施形態63に記載の方法であって、前記対象の血中コレステロールのレベルを低下させる前記方法。
65.リボ核タンパク質及びエンドソーム脱出剤を含有する組成物。
66.実施形態65に記載の組成物であって、前記リボ核タンパク質がCas9リボ核タンパク質またはCpflリボ核タンパク質であるである前記組成物。
67.実施形態66に記載の組成物であって、前記リボ核タンパク質がCas9リボ核タンパク質である前記組成物。
68.実施形態67に記載の組成物であって、前記Cas9リボ核タンパク質及び前記エンドソーム脱出剤が共インキュベートされる前記組成物。
69.実施形態67または68に記載の組成物であって、前記Cas9リボ核タンパク質が、
(1)CRISPR RNA(crRNA)及びトランス活性化crRNA(tracrRNA)を含むデュアルガイドRNA配列、またはシングルガイドRNA配列(sgRNA)の何れかを備えた認識要素を含む第一の要素であって、前記ガイド配列は、発現されたときにCas9リボ核タンパク質の標的配列への配列特異的結合を指示し、前記第一の要素は任意に1以上のエンドソーム脱出剤を含む第一の要素と、
(2)Cas9タンパク質及び任意に1以上の核局在配列(NLS)及び任意に1以上
の蛍光タンパク質、ならびに1以上のエンドソーム脱出剤を含む第二の要素を含み、
前記第一の要素は前記第二の要素と会合している前記組成物。
70.請求項69に記載の組成物であって、前記標的配列が真核細胞標的配列である前記組成物。
71.実施形態69に記載の組成物であって、前記第一の要素が、CRISPR RNA(crRNA)及びトランス活性化crRNA(tracrRNA)を備えたデュアルガイドRNA配列を含む前記組成物。
72.実施形態71に記載の組成物であって、前記tracrRNAが任意に化学的に修飾される組成物。
73.実施形態71または72に記載の組成物であって、前記tracrRNAが、CAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(配列番号1028)の配列に対して少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約95%、少なくとも約96パーセント、少なくとも約97パーセント、少なくとも約98パーセント、少なくとも約99パーセント、または100パーセントのヌクレオチド配列同一性である配列を含み、前記配列は任意に、最初の3塩基において2’-O-メチルまたは2’-F修飾を含む前記組成物。
74.実施形態71~73の何れか1項に記載の組成物であって、前記crRNAが任
意に化学的に修飾される前記組成物。
75.実施形態71~73の何れか1項に記載の組成物であって、前記crRNAが、
下記から選択される配列に対して少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、約96パーセント、少なくとも約97パーセント、少なくとも約98パーセント、少なくとも約99パーセント、または100パーセントのヌクレオチド配列同一性を有する配列を含む前記組成物:
PCSK9 crRNA配列1:
GGUGCUAGCCUUGCGUUCCGGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号885)、最後の4塩基の最初の3塩基(GCU)において任意に2’-O-メチルまたは2’-F修飾を含む
PCSK9 crRNA配列2:
CGUGCUCGGGUGCUUCGGCCGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号886)、最後の4塩基の最初の3塩基(GCU)において任意に2’-O-メチルまたは2’-F修飾を含む
PCSK9 crRNA配列3:
GCCGUCCUCCUCGGAACGCAGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号887)、最後の4塩基の最初の3塩基(GCU)において任意に2’-O-メチルまたは2’-F修飾を含む
PCSK9 crRNA配列4:
GGACGAGGACGGCGACUACGGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号888)、最後の4塩基の最初の3塩基(GCU)において任意に2’-O-メチルまたは2’-F修飾を含む
PCSK9 crRNA配列5:
ACCACCGGGAAAUCGAGGGCGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号889)、最後の4塩基の最初の3塩基(GCU)において任意に2’-O-メチルまたは2’-F修飾を含む
PCSK9 crRNA配列6:
CGACUUCGAGAAUGUGCCCGGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号890)、最後の4塩基の最初の3塩基(GCU)において任意に2’-O-メチルまたは2’-F修飾を含む
PCSK9 crRNA配列7:
GAGUGACCACCGGGAAAUCGGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号891)、最後の4塩基の最初の3塩基(GCU)において任意に2’-O-メチルまたは2’-F修飾を含む
PCSK9 crRNA配列8:
CUCGGGCACAUUCUCGAAGUGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号892)、最後の4塩基の最初の3塩基(GCU)において任意に2’-O-メチルまたは2’-F修飾を含む
PCSK9 crRNA配列9:
GGAAGCCAGGAAGAAGGCCAGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号893)、最後の4塩基の最初の3塩基(GCU)において任意に2’-O-メチルまたは2’-F修飾を含む
PCSK9 crRNA配列10:
UCUUUGCCCAGAGCAUCCCGGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号894)、最後の4塩基の最初の3塩基(GCU)において任意に2’-O-メチルまたは2’-F修飾を含む
PCSK9 crRNA配列11:
CUAGGAGAUACACCUCCACCGUUUUAGAGCUAUGCUG(配列番号895)、最後の4塩基の最初の3塩基(GCU)において任意に2’-O-メチルまたは2’-F修飾を含む
76.実施形態69に記載の組成物であって、前記第一の要素がシングルガイドRNA配列(sgRNA)を含む前記組成物。
77.実施形態76に記載の組成物であって、前記sgRNAが少なくとも20ヌクレオチドを含む前記組成物。
78.実施形態76に記載の組成物であって、前記sgRNAが少なくとも8ヌクレオチドを含む前記組成物。
79.実施形態76に記載の組成物であって、前記sgRNAとその対応する標的配列との間の相補性の程度は、適切なアライメントアルゴリズムを使用して最適に整列されたときには、少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%である前記組成物。
80.実施形態76に記載の組成物であって、前記sgRNAは、下記からからなる群から選択される配列に対して、少なくとも約75パーセント、少なくとも約80パーセント、少なくとも約85パーセント、少なくとも約90パーセント、少なくとも約95パーセント、少なくとも約96パーセント、少なくとも約97パーセント、少なくとも約98パーセント、少なくとも約99パーセント、または100パーセントのヌクレオチド配列同一性を有する前記組成物:
PCSK9ガイドRNA配列1
GGUGCUAGCCUUGCGUUCCGGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号896)、
PCSK9ガイドRNA配列2
CGUGCUCGGGUGCUUCGGCCGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号897)、
PCSK9ガイドRNA配列3
GCCGUCCUCCUCGGAACGCAGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号
898)、
PCSK9ガイドRNA配列4
GGACGAGGACGGCGACUACGGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号899)、
PCSK9ガイドRNA配列5
ACCACCGGGAAAUCGAGGGCGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号900)、
PCSK9ガイドRNA配列6
CGACUUCGAGAAUGUGCCCGGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号901)、
PCSK9ガイドRNA配列7
GAGUGACCACCGGGAAAUCGGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号902)、
PCSK9ガイドRNA配列8
CUCGGGCACAUUCUCGAAGUGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号903)、
PCSK9ガイドRNA配列9
GGAAGCCAGGAAGAAGGCCAGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号904)、
PCSK9ガイドRNA配列10
UCUUUGCCCAGAGCAUCCCGGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号905)、
PCSK9ガイドRNA配列11
CUAGGAGAUACACCUCCACCGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号906)、
EMX1ガイドRNA配列
GUCACCUCCAAUGACUAGGGGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号907)、
ROSA26ガイドRNA配列
CGAACCCUACACAUUCAACGGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(配列番号
908)、
ここで、前記配列は任意に化学的に修飾される。
81.実施形態76~80の何れか1項に記載の組成物であって、前記sgRNAが任意に化学的に修飾される前記組成物。
82.実施形態67~81の何れか1項に記載の組成物であって、前記Cas9リボ核タンパク質が更に蛍光プローブを含む前記組成物。
83.実施形態82に記載の組成物であって、前記蛍光プローブがmCherry配列(配列番号915)である前記組成物。
84.実施形態67~83の何れか1項に記載の組成物であって、1以上のNLSを含む前記組成物。
85.実施形態67~83の何れか1項に記載の組成物であって、前記Cas9リボ核タンパク質が1以上のNLSを含む前記組成物。
86.実施形態84または85に記載の組成物であって、前記NLSの各々が、下記からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む前記組成物:
PKKKRKV(配列番号830)、
KRPAATKKAGQAKKKK(配列番号831)、
PAAKRVKLD(配列番号832)、
RQRRNELKRSP(配列番号833)、
NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(配列番号834)、
RMRIXFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(配列番号835)、
VSRKRPRP(配列番号836)、
PPKKARED(配列番号837)、
PQPKKKPL(配列番号838)、
SALIKKKKKMAP(配列番号839)、
DRLRR(配列番号840)、
PKQKKRK(配列番号841)、
RKLKKKIKKL(配列番号842)、
REKKKFLKRR(配列番号843)、
KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(配列番号844)、
RKCLQAGMNLEARKTKK(配列番号845)、
MAPKKKRKVGIHRGVP(配列番号1035)、及び
PKKKRKVEDPKKKRKVD(配列番号1036)。
87.実施形態86に記載の組成物であって、前記NLSの各々がアミノ酸配列PKKKRKV(配列番号830)を含む前記組成物。
88.実施形態87に記載の組成物であって、2つのNLSを含有し、その各々がアミノ酸配列PKKKRKV(配列番号830)を含む前記組成物。
89.実施形態67~88の何れか1項に記載の組成物であって、前記Cas9リボ核タンパク質は、S.aureus、S.pneumoniae、S.pyogenes、S.thermophilus、またはN.meningitidis由来のCas9タンパク質に対して少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98パーセント、少なくとも約99パーセント、または100パーセントのアミノ酸配列同一性であるCas9タンパク質を含む前記組成物。
90.実施形態67~89の何れか1項に記載の組成物であって、前記Cas9リボ核タンパク質が、II型Cas9タンパク質に対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96パーセント、少なくとも約97パーセント、少なくとも約98パーセント、少なくとも約99パーセント、または100パーセントのアミノ酸配列同一性であるCas9タン
パク質を含む前記組成物。
91.実施形態67~90の何れか1項に記載の組成物であって、前記Cas9リボ核タンパク質が、配列番号8の7~166位または731~1003位のアミノ酸または配列番号1~7、9~829に記載のものの対応するアミノ酸に対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96パーセント、少なくとも約97パーセント、少なくとも約98パーセント、少なくとも約99パーセント、または100パーセントのアミノ酸配列同一性であるCas9リボ核タンパク質を含む前記組成物。
92.実施形態91に記載の組成物であって、前記Cas9リボ核タンパク質が、配列番号8の7~166位、または731~1003位におけるアミノ酸に対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99パーセント、または100パーセントのアミノ酸配列同一性であるCas9タンパク質を含む前記組成物。
93.実施形態92に記載の組成物であって、前記Cas9リボ核タンパク質が、配列番号260~263何れかのCas9アミノ酸配列のモチーフ1,2,3及び4に対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99パーセント、または100パーセントのアミノ酸配列同一性を有する配列内の少なくとも4モチーフを有するCas9タンパク質を含む前記組成物。
94.実施形態67~93の何れか1項に記載の組成物であって、前記Cas9リボ核タンパク質が、S.pyogenesCas9(野生型)(配列番号848)、S.pyogenesCas9変異体M1C(配列番号849)、S.pyogenesCas9-突然変異M1C&C80S(配列番号850)、S.pyogenesCas9ニッカーゼ変異体D10A(配列番号851)、S.pyogenesCas9ニッカーゼ変異体H840A(配列番号852)、S.pyogenesCas9ニッカーゼ変異体E923P&T924P(配列番号853)、Acidovorax ebreus(Acidovorax ebreus)Cas9(配列番号854)、酸性鉱山排水菌Ga0052161_JGI・Cas9(配列番号855)、S.pyogenesCas9ヌル変異体D10A&H840A(配列番号1027)、及びウラン鉱山菌FW106_JGI・Cas9(配列856)から選択される配列に対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99パーセント、または100パーセントのアミノ酸配列同一性を有するCas9タンパク質を含む前記組成物。
95.実施形態67~94の何れか1項に記載の組成物であって、前記エンドソーム脱出剤が、リソソーム作用剤、細胞浸透性ペプチド、融合性ペプチド、細孔形成剤、及びプロトンスポンジ剤からなる群から選択される前記組成物。
96.実施形態95に記載の組成物であって、前記エンドソーム脱出剤がペプチドppTG21:GLFHALLHLLHSLWHLLLHA(配列番号1012)である前記組成物。
97.実施形態65~96の何れか1項に記載の組成物、及び薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含有する医薬組成物。
98.対象における疾患または状態を治療する方法であって、前記対象に対して、治療的有効量の実施形態97に記載の医薬組成物を投与することを含む前記方法。
99.実施形態98に記載の方法であって、前記疾患または状態が、血液障害、細胞の調節不全もしくは腫瘍疾患及び障害、炎症及び免疫関連疾患、代謝性、肝臓、腎臓、及びタンパク質の疾患ならびに障害、筋肉もしくは骨格疾患、神経学的及び神経疾患ならびに障害、ならびに眼疾患及び障害からなる群から選択される前記方法。
100.対象の細胞内標的DNAの転写を選択的に調節する方法であって、前記対象に
対して、実施態様97に記載の医薬組成物を投与することを含む前記方法。
101.実施形態100に記載の方法であって、前記標的DNAが、血液障害、細胞の調節不全もしくは腫瘍疾患及び障害、炎症及び免疫関連疾患、代謝性、肝臓、腎臓、及びタンパク質の疾患ならびに障害、筋肉もしくは骨格疾患、神経学的及び神経疾患ならびに障害、ならびに眼の疾患及び障害からなる群から選択される障害または状態と関連する前記方法。
102.対象における疾患または状態に関連するタンパク質をコードする核酸分子を編集する方法であって、前記対象に対して、請求項97に記載の医薬組成物を投与することを含む前記方法。
103.実施形態102に記載の方法であって、前記タンパク質が、血液障害、細胞の調節不全もしくは腫瘍疾患及び障害、炎症及び免疫関連疾患、代謝性、肝臓、腎臓、及びタンパク質の疾患ならびに障害、筋肉もしくは骨格疾患、神経学的及び神経疾患ならびに障害、ならびに眼の疾患及び障害からなる群から選択される疾患または状態と関連する前記方法。
104.対象の疾患または状態に関連する少なくとも1つの遺伝子産物の発現レベルを調節する方法であって、前記対象に対して、実施態様97に記載の医薬組成物を投与することを含む前記方法。
105.実施形態104に記載の方法であって、前記遺伝子産物が、血液障害、細胞の調節不全もしくは腫瘍疾患及び障害、炎症及び免疫関連疾患、代謝性、肝臓、腎臓、及びタンパク質の疾患ならびに障害、筋肉もしくは骨格疾患、神経学的及び神経の疾患障害、ならびに眼の疾患及び障害からなる群から選択される疾患または状態と関連する前記方法。
Claims (29)
- 式(B)の化合物:
式中、
R1は、-Z-X-Y、-Z-Y、-X-Y、-Z-X+Y-、-X+Y-、-Z-X-Y+、
-X-Y+、または-Yであり;
Xは、リンカーであり;
X+は、正に荷電したリンカーであり;
X-は、負に荷電したリンカーであり;
Yは、部位特異的修飾ポリペプチドを含むリボ核タンパク質、部位特異的修飾ポリペプチドを含むエンドヌクレアーゼ、部位特異的修飾ポリペプチド、シングルガイドRNA配列(sgRNA)、並びにCRISPR RNA(crRNA)及びトランス活性型crRNA(tracrRNA)を含むデュアルガイドRNA配列から成る群から選択され、前記Yは、任意にCas9リボ核タンパク質またはCas9タンパク質であり;
Y+は、部位特異的修飾ポリペプチドを含む正に荷電したリボ核タンパク質、部位特異的
修飾ポリペプチドを含む正に荷電したエンドヌクレアーゼ、及び正に荷電した部位特異的修飾ポリペプチドから成る群から選択され、前記Y+は、任意に正に荷電したCas9タ
ンパク質であり;
Y-は、部位特異的修飾ポリペプチドを含む負に荷電したリボ核タンパク質、部位特異的
修飾ポリペプチドを含む負に荷電したエンドヌクレアーゼ、負に荷電した部位特異的修飾ポリペプチド、負に荷電したsgRNA、並びにCRISPR RNA(crRNA)及びトランス活性型crRNA(tracrRNA)を含む負に荷電したデュアルガイドRNA配列から成る群から選択され、前記Y-は、任意に負に荷電したCas9リボ核タン
パク質であり;
Zは、共有結合、-C≡C-、-CH=CH-、-CH2-、-CH2O-、-C(O)N(R4)-、-CH2S-、-CH2S(O)-、-CH2SO2-、-CH2SO2N(R4)-、-CO2-、-CH2N(R4)-、-CH2N(R4)C(O)-、-CH2N(R4)
SO2-、-CH2N(R4)CO2-、-CH2N(R4)C(O)N(R4)-、-CH2OC(O)-、-CH2OC(O)N(R4)-、-CH2OCO2-、アリール、またはヘテロアリールであり、前記アリールまたはヘテロアリールは、任意にR5で置換されており
;
R2は、-OH、-N3、-N(R3)2、-N(R3)C(O)R3、-N(R3)C(O)
N(R3)2、-N(R3)CO2R3、-N(R3)SO2R3、テトラゾール、またはトリアゾールであり、前記テトラゾールまたトリアゾールは、任意にR3で置換されており;
各R3は、独立して、H、(C1-C5)アルキル、ハロ置換(C1-C5)アルキル、ハロ
置換(C3-C6)シクロアルキル、(C1-C5)アルケニル、(C1-C5)アルキニル、ハロ置換(C1-C5)アルケニル、ハロ置換(C1-C5)アルキニル、または(C3-C6)シクロアルキルであり、前記(C1-C5)アルキル、ハロ置換(C1-C5)アルキル、ハロ置換(C3-C6)シクロアルキル、及び(C3-C6)シクロアルキルの-CH2-基
のいずれか1つ以上は、各々任意に独立して、-O-、-S-、及び-N(R4)-から
なる群から選択される第1のヘテロ原子基と交換され、前記(C1-C5)アルキル及びハロ置換(C1-C5)アルキルの-CH3基のいずれか1つ以上は、各々任意に独立して、
-N(R4)2、-OR4、及び-SR4からなる群から選択される第2のヘテロ原子基と交換され、前記ヘテロ原子基のいずれか2つは、少なくとも2つの炭素原子で離間されており;
各R4は、独立して、H、(C1-C20)アルキル、(C1-C20)アルケニル、(C1-C20)アルキニル、または(C3-C6)シクロアルキルであり、前記(C1-C20)アルキ
ル及び(C3-C6)シクロアルキルの-CH2-基の1~6個は、各々任意に独立して、
-O-、または-S-であるヘテロ原子と交換され、前記ヘテロ原子基のいずれか2つは、少なくとも2つの炭素原子で離間されており、前記(C1-C20)アルキル、(C1-C20)アルケニル、(C1-C20)アルキニル、または(C3-C6)シクロアルキルは、任
意に、1つ以上のハロゲン原子で置換されており;
各R5は、独立して、H、(C3-C20)シクロアルキル、(C1-C60)アルケニル、(
C1-C60)アルキニル、または(C1-C60)アルキルであり、前記(C3-C20)シク
ロアルキルの1~6個の-CH2-基または前記(C1-C60)アルキルの1~20個の-CH2-基は、各々任意に独立して、-O-、-S-、及び-N(R4)-からなる群から選択される第1のヘテロ原子と交換され、前記第1のヘテロ原子基のいずれか2つは、少なくとも2つの炭素原子で離間されており、前記(C1-C60)アルキルの-CH3基のいずれか1つ以上は、各々任意に独立して、-N(R4)2、-OR4、及び-S(R4)からなる群から選択される第2のヘテロ原子基と交換され、前記第2のヘテロ原子基のいずれか2つは、少なくとも2つの炭素原子で離間されており、前記(C3-C20)シクロアル
キル、(C1-C60)アルケニル、(C1-C60)アルキニル、または(C1-C60)アル
キルは、任意に1つ以上のハロゲン原子で置換されている、
前記化合物またはその医薬的に許容される塩。 - R2が-NHC(O)CH3である、請求項1に記載の化合物。
- R1が-Z-X-Yである、請求項1に記載の化合物。
- R1が、L1~L10:
ここで、各Tは、独立して、共有結合、(C1-C10)アルキレン、(C2-C10)アルケニレン、または(C2-C10)アルキニレンであり、前記Tのいずれか1つ以上の-CH2-基は、各々任意に独立して、-O-、-S-、及び-N(R4)-からなる群から選択
されるヘテロ原子基と交換され、前記ヘテロ原子基のいずれか2つは、少なくとも2つの炭素原子で離間されており、前記(C1-C10)アルキレン、(C2-C10)アルケニレン、または(C2-C10)アルキニレンは、任意に、1つ以上のハロゲン原子で置換されて
おり;
各Qは、独立して、共有結合、-C(O)-、-C(O)N(R4)-、-N(R4)C(O)-、-OC(O)N(R4)-、-N(R4)-、-CO2-、-CH2-、ヘテロアリール、または-O-、-S-、-S-S-、-S(O)-、-S(O)2-、及び-N(
R4)-からなる群から選択されるヘテロ原子基であり、前記ヘテロ原子基のいずれか2
つは、少なくとも2つの炭素原子で離間されており;
各R4は、独立して、H、(C1-C20)アルキル、または(C3-C6)シクロアルキルで
あり、前記(C1-C20)アルキル及び(C3-C6)シクロアルキルの1~6個の-CH2-基は、各々任意に独立して、-O-、または-S-であるヘテロ原子基と交換され、前記ヘテロ原子基のいずれか2つは、少なくとも2つの炭素原子で離間されており、前記(C1-C20)アルキルまたは(C3-C6)シクロアルキルは、任意に、1つ以上のハロゲ
ン原子で置換されており;および
各mは、独立して、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40である、前記化合物。 - 前記Xがジスルフィド結合を含む、請求項4に記載の化合物。
- 式(E):
式中、
nは1、2、または3であり、
Wは、存在しないか、またはペプチドであり、
Lは、-(T-Q-T-Q)m-であり、
各Tは、独立して、共有結合、(C1-C10)アルキレン、(C2-C10)アルケニレン、もしくは(C2-C10)アルキニレンであり、前記Tの1つ以上の-CH2-基は、各々任意に独立して、-O-、-S-、及び-N(R4)-からなる群から選択されるヘテロ原
子基と交換され、前記ヘテロ原子基のいずれか2つは、少なくとも2つの炭素原子で離間されており;
各Qは、独立して、共有結合、-C(O)-、-C(O)N(R4)-、-N(R4)C(O)-、-OC(O)N(R4)-、-N(R4)CO2-、-CH2-、ヘテロアリール、または-O-、-S-、-S-S-、-S(O)-、-S(O)2-、及び-N(R4)-からなる群から選択されるヘテロ原子基であり、前記ヘテロ原子基のいずれか2つは、少なくとも2つの炭素原子で離間されており;
各R4は、独立して、H、(C1-C20)アルキル、または(C3-C6)シクロアルキルであり、前記(C1-C20)アルキル及び(C3-C6)シクロアルキルの1~6個の-CH2-基は、各々任意に独立して、-O-、または-S-であるヘテロ原子基と交換され、前記ヘテロ原子基のいずれか2つは、少なくとも2つの炭素原子で離間されており、前記(C1-C20)アルキル及び(C3-C6)シクロアルキルは、任意に、1つ以上のハロゲン
原子で置換されており;および
各mは、独立して、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40である、前記化合物またはその医薬的に許容される塩。 - Yが、Cas9リボ核タンパク質であり、これが、(1)CRISPR RNA(crRNA)及びトランス活性型crRNA(tracrRNA)を含むデュアルガイドRNA配列、またはシングルガイドRNA配列(sgRNA)のいずれかを含む認識要素を含む第一の要素であって、前記ガイド配列は、発現時、前記Cas9リボ核タンパク質の配列特異的結合を標的配列に向けるものであり、任意に1つ以上のエンドソーム脱出剤を含む前記第一の要素、ならびに(2)Cas9タンパク質ならびに任意に1つ以上の核局在配列(NLS)及び任意に1つ以上の蛍光タンパク質、ならびに1つ以上のエンドソーム脱出剤を含む第二の要素を含み、前記第一の要素が前記第二の要素に会合している、請求項1に記載の化合物。
- Yが、1つまたは2つのNLSを含み、前記NLSの各々が、アミノ酸配列PKKKRKV(配列番号830)を含む、請求項8に記載の化合物。
- 前記Yが、S.aureus、S.pneumoniae、S.pyogenes、S.thermophilus、N.meningitidis、またはA.ebreus由来のCas9タンパク質に対して、少なくとも75パーセントのアミノ酸配列同一性であるCas9タンパク質を含む、請求項1に記載の化合物。
- 前記Yが、S.pyogenes Cas9(野生型)(配列番号848)、S.pyogenes Cas9変異体M1C(配列番号849)、S.pyogenes Cas9変異体M1C及びC80S(配列番号850)、S.pyogenes Cas9ニッカーゼ変異体D10A(配列番号851)、S.pyogenes Cas9ニッカーゼ変異体H840A(配列番号852)、S.pyogenes Cas9ニッカーゼ変異体E923P及びT924P(配列番号853)、Acidovorax ebreus Cas9(配列番号854)、酸性鉱山排水細菌Ga0052161_JGI Cas9(配列番号855)、S.pyogenes Cas9ヌル変異体D10A及びH840A(配列番号1027)、ならびにウラン鉱山細菌FW106_JGI Cas9(配列番号856)から選択される配列に対して、少なくとも75パーセントのアミノ酸配列同一性であるCas9タンパク質を含む、請求項1に記載の化合物。
- 前記化合物が、さらにエンドソーム脱出剤を含む、請求項1に記載の化合物。
- 前記エンドソーム脱出剤が、ペプチドppTG21:GLFHALLHLLHSLWHLLLHA(配列番号1012)である、請求項12に記載の化合物。
- 前記エンドソーム脱出剤が、ペプチドKALA:WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA(配列番号869)である、請求項12に記載の化合物。
- 請求項1に記載の化合物及びエンドソーム脱出剤を含む医薬組成物であって、前記化合物及び前記エンドソーム脱出剤が、前記医薬組成物を形成するために共インキュベートされる、前記医薬組成物。
- 請求項1に記載の化合物、及び医薬的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含む、医薬組成物。
- YがCas9リボ核タンパク質またはCas9タンパク質である、請求項1に記載の化合物。
- Y+が正に荷電したCas9タンパク質である、請求項1に記載の化合物。
- Y-が負に荷電したCas9リボ核タンパク質である、請求項1に記載の化合物。
- Zが共有結合である、請求項1に記載の化合物。
- Qが1H-1,2,3-トリアゾリル、ピリジニル及び1,2,3,4-テトラゾリルからなる群から選択されるヘテロアリールである、請求項4に記載の化合物。
- Wがエンドソーム溶解ペプチドおよび核局在ペプチドからなる群から選択される、請求項6に記載の化合物。
- nが3である、請求項6に記載の化合物。
- 第一の要素が、crRNAおよびtracrRNAを含むデュアルガイドRNA配列を含む認識要素を含み、tracrRNAが配列CAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACC GAGUCGGUGCUUUU(配列番号1028)を含む、請求項8に記載の化合物
- tracrRNA配列の最初の3個のヌクレオチド塩基が2’-O-メチルまたは2’-フルオロ修飾された糖である、請求項24に記載の化合物。
- Yが1つまたは2つのNLSを含み、NLSの各々が、PKKKRKV(配列番号830)、KRPAATKKAGQAKKKK(配列番号831)、PAAKRVKLD(配列番号832)、RQRRNELKRSP(配列番号833)、NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(配列番号834)、RMRIXFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(配列番号835)、VSRKRPRP(配列番号836)、PPKKARED(配列番号837)、PQPKKKPL(配列番号838)、SALIKKKKKMAP(配列番号839)、DRLRR(配列番号840)、PKQKKRK(配列番号841)、RKLKKKIKKL(配列番号842)、REKKKFLKRR(配列番号843)、KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(配列番号844)、RKCLQAGMNLEARKTKK(配列番号845)、MAPKKKRKVGIHRGVP(配列番号1035)、及びPKKKRKVEDPKKKRKVD(配列番号1036)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の化合物。
- Yが、ペプチドppTG21:GLFHALLHLLHSLWHLLLHA(配列番号1012)およびペプチドKALA:WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA(配列番号869)から成る群から選択される1つ以上のエンドソーム脱出剤を含む、請求項8に記載の化合物。
- nが3である、請求項28に記載の化合物。
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