JP7253110B2 - 骨誘導性骨再生材料およびその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、骨誘導性骨再生材料および骨誘導性骨再生材料の製造方法に関する。

本願の出願人の一人は、β－ＴＣＰを含有する生分解性繊維からなる骨伝導性の骨再生材料をＲｅＢＯＳＳＩＳという商標の下で製造販売している。上記骨再生材料は、エレクトロスピニングプロセスを用いて製造され、そこにおいては、紡糸溶液はノズルから極細繊維として吐出され、電場の静電引力によって引っぱられてコレクターに堆積される。本願の出願人は、新規なエレクトロスピニング装置を用いて、このような生分解性繊維を、β－ＴＣＰ及び生分解性樹脂を含む綿形状の構造に調製することに成功した。上記綿形状の構造は独特のものであり、（１）体液が骨移植材料の構造に容易に浸透することができるように組織内に大きな空間を有していること、（２）β－ＴＣＰからカルシウム及びリンの体液への放出を可能にするための広い表面積を提供すること、（３）骨修復部の形状に適合させることができる柔軟な構造を有していること、（４）他の生体活性又は骨形成因子を支援するための広い表面積を提供すること、のいくつかの特長を与えている。綿形状の複合材料を骨再生材料としてｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した結果、複雑な骨欠損の修復において有利であることが実証された。

骨形成性タンパク質－２（ＢＭＰ－２）は、骨誘導を生じさせるタンパク質であり、骨の形成／再生を促進することが可能である。例えば、Ｉｎｆｕｓｅ Ｂｏｎｅ Ｇｒａｆｔ（メドトロニック）は、遺伝子組み換えヒトＢＭＰ－２（ｒｈＢＭＰ－２）を含む骨移植材料であり、上顎洞底挙上術および局所的歯槽堤造成術における骨移植材料としての使用が米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されている。ＢＭＰ－２は骨インプラント（ＩＮＦＵＳＥ）に組み込まれ、骨欠損部位に運ばれる。ＢＭＰ－２は骨欠損部位において徐々に放出され、骨形成を刺激する。ＢＭＰによる骨形成の刺激は局在化され、そこで数週間持続する。ＢＭＰ－２が遠隔部位に漏出すると、悪影響が生じる。実際、ｒｈＢＭＰ－２から生じるいくつかの副作用が報告されている。これらの副作用には、術後炎症とそれに伴う有害作用、異所性骨化、破骨細胞を介した骨吸収、不適切な脂肪生成などがある。

従って、ＢＭＰ－２をゆるやかに徐放することができるような態様でＢＭＰ－２を含有することが可能であり、他方で意図しない場所にこの骨形成因子が浸出することを許容しない骨移植材料が必要である。

先行技術における骨誘導性骨移植材料の問題を解決するために、本発明の発明者らは、集中的な研究を行い、ＲｅＢＯＳＳＩＳの生分解性繊維の表面に露出したβ－ＴＣＰ粒子が薄いポリマー層で覆われていないことを見出した。この知見に基づいて、本発明者の発明者らは、β－ＴＣＰ粒子の露出部分を使用して、ＢＭＰ－２を粒子に結合することができると結論した。ＢＭＰ－２をβ－ＴＣＰ粒子に結合させることにより、骨欠損部位でのＢＭＰ－２の徐々の放出を可能にするが、この成長因子の意図しない部位への浸出を許容しない骨誘導性骨再生材料のための足場としてＲｅＢＯＳＳＩＳを使用することができる。

本発明の実施の形態は、ＲｅＢＯＳＳＩＳ繊維及び骨形成性タンパク質－２（ＢＭＰ－２）を含む骨再生材料に関するものである。本発明の実施形態で使用するＢＭＰは、ＢＭＰ－２またはＢＭＰ－２の誘導体であり得る。ＢＭＰ－２は、ヒトＢＭＰ－２またはアニマル（ペットまたは家畜など）ＢＭＰ－２であり得る。ＢＭＰ－２の誘導体には、１つまたは複数のβ－ＴＣＰ結合ペプチドがと融合されたＢＭＰ－２を含み、それは「ターゲット型ＢＭＰ－２」または「ｔＢＭＰ－２」と呼ばれる。これらの全ての異なる形態のＢＭＰ－２（遺伝子組換えヒトＢＭＰ－２、ｒｈＢＭＰ－２および野生型ＢＭＰ－２、ｗｔＢＭＰ－２を含む）、アニマルＢＭＰ－２およびｔＢＭＰ－２のようなＢＭＰ－２を一般的に「ＢＭＰ－２」と呼ぶことができる。すなわち、「ＢＭＰ－２」という語は、ｒｈＢＭＰ－２、ｗｔＢＭＰ－２、動物ＢＭＰ－２およびｔＢＭＰ－２を含む。

ＲｅＢＯＳＳＩＳは、直径４０～３２０μｍ、長さ５～２０ｍｍの複数の生分解性電界紡糸繊維で構成され、カルシウム化合物粒子（例えばβ－ＴＣＰ粒子）及びポリ（乳酸）（ＰＬＬＡ）又は乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）等の生分解性樹脂を含む綿形状の構造を有する。生分解性繊維には、ケイ素を溶出するバテライト相炭酸カルシウム（ケイ素がドーピングされたバテライト相炭酸カルシウム、ＳｉＶ）のような、その他のカルシウム化合物粒子を含むことができる。従って、ＲｅＢＯＳＳＩＳ繊維は、生分解性ポリマー（例：ＰＬＬＡまたはＰＬＧＡ）およびカルシウム化合物粒子（例：β－ＴＣＰ粒子および／またはＳＩＶ粒子）を含むことができる。ここで使用される場合、「カルシウム化合物粒子」とは、β－ＴＣＰ粒子、ＳｉＶ粒子、又はβ－ＴＣＰ粒子とＳｉＶ粒子の組み合わせであってもよい。

ＲｅＢＯＳＳＩＳの生分解性電界紡糸繊維には、繊維上又は繊維中に多量のカルシウム化合物粒子が分散して含まれている。β－ＴＣＰ粒子の一部は繊維の表面に露出して平坦でない表面形状を形成しており、β－ＴＣＰ粒子の残りの部分は繊維の中に埋め込まれている。繊維の表面に露出したβ－ＴＣＰ粒子は薄い樹脂層によって覆われていない。ＲｅＢＯＳＳＩＳを骨形成タンパク質２（ｔＢＭＰ－２を含むＢＭＰ－２）を含む溶液中に浸漬することによって、ＢＭＰ－２は繊維の表面に露出したβ－ＴＣＰ粒子及び／又はＳｉＶ粒子と結合されて、レボシスの綿形状の全体にわたって、ＢＭＰ－２が繊維の表面に露出したβ－ＴＣＰ粒子及び／又はＳｉＶ粒子によって捕捉されている。

ＲｅＢＯＳＳＩＳの生分解性繊維の平坦でない表面形状は、幹細胞が繊維に付着するのを助ける。電界紡糸された生分解性繊維の表面に露出したβ－ＴＣＰ粒子上のＢＭＰ－２の結合サイトの面積は、電界紡糸された生分解性繊維に含まれるβ－ＴＣＰ粒子の量を増加または減少させることによって増加または減少させることができる。

生分解性繊維は、直径約４０～３２０μｍ、好ましくは約７０～２５０μｍ、より好ましくは９０～２００μｍの直径を有しており、直径約２～５μｍのカルシウム化合物粒子（例えば、β－ＴＣＰ及び／又はＳｉＶ粒子）を繊維中に分散させることができ、また、ＲｅＢＯＳＳＩＳを骨欠損部に埋植した後も綿形状構造物の機械的強度を維持することができる。

本発明の一実施形態では、生分解性繊維の長さは、約５～２０ｍｍ、より好ましくは４～１０ｍｍである。ＲｅＢＯＳＳＩＳはこのような短い繊維が絡み合って形成されているので、綿毛状の構造は手で簡単に細かく分けることができる。従って、外科医は、カッターまたははさみを使用することなく所望のより小さいサイズをＲｅＢＯＳＳＩＳから分離することにより、患者の骨欠損のサイズに応じて、綿形状材料を作製することができる。

好ましくは、電界紡糸生分解繊維の直径は繊維性足場が十分な機械的強度を維持し、繊維性足場が骨欠損部位に埋め込まれた後、繊維性足場のチャンネルの平均サイズが１０～３００μｍの範囲に収まるように適合されている。本明細書中で使用される場合、繊維性足場のチャネルは、繊維性足場材中の繊維間空間によって形成される通路を指す。

ＲｅＢＯＳＳＩＳを骨欠損部に埋植後、間葉系幹細胞を含む体液が、β－ＴＣＰ粒子上に捕捉されたＢＭＰ－２（ｒｈＢＭＰ－２又はｔ－ＢＭＰ－２等）に接触することができる。次いで、ＢＭＰ＆＃８７２２；２（例えば、ｒｈＢＭＰ＆＃８７２２；２またはｔＢＭＰ－２）は、骨前駆細胞が骨芽細胞に分化することを促進する。ＢＭＰ－２（ｒｈＢＭＰ－２またはｔ－ＢＭＰ－２など）を結合するβ－ＴＣＰ粒子は、破骨細胞によって徐々に溶解される。その上で、骨芽細胞はβ－ＴＣＰ粒子上に骨を形成する作用（すなわち骨リモデリング）を遂行する。

ＲｅＢＯＳＳＩＳを骨欠損部に埋め込んだ後、電界紡糸繊維中の生分解性ポリマー（例：ＰＬＬＡ及び／又はＰＬＧＡ）は、次第に繊維に埋め込まれたβ－ＴＣＰ粒子が露出するように分解され、その結果新たに露出されたβ－ＴＣＰ粒子が、繊維の表面に付着していたＢＭＰ－２（例：ｒｈＢＭＰ－２またはｔＢＭＰ－２）を再び捕捉することができる。ポリマーの分解が進むにつれて、新たに露出されたβ－ＴＣＰ粒子によるＢＭＰ－２（ｒｈＢＭＰ－２、ｔＢＭＰ－２等）を再び補足することにより、生分解性繊維の足場のネットワーク全体を通じて継続的に骨のリモデリングが行われ、その結果、骨欠損部において効率的な骨の形成が生じる。

ＢＭＰ－２（ｒｈＢＭＰ－２、ｔＢＭＰ－２など）が、生分解性繊維の表面に固定されたβ－ＴＣＰ粒子と結合するため、ＢＭＰ－２が骨欠損部外へ漏洩することが防止される。その結果、ＢＭＰ－２／ＲｅＢＯＳＳＩＳの使用の安全性が確保される。

１つの態様において、本明細書では、約６０重量％～約８０重量％のカルシウム含有化合物を含む足場と、（ｉ）ＶＩＧＥＳＴＨＨＲＰＷＳ（配列番号２３）、（ｉｉ）ＩＩＧＥＳＳＨＨＫＰＦＴ（配列番号２４）、（ｉｉｉ）ＧＬＧＤＴＴＨＨＲＰＷＧ（配列番号２５）、（ｉｖ）ＩＬＡＥＳＴＨＨＫＰＷＴ（配列番号２６）、または（ｖ）（ｉ）～（ｉｖ）の２つ以上の組み合わせを含むターゲット型ＢＭＰ－２を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、ターゲット型ＢＭＰ＆＃８７２２；２は、ＶＩＧＥＳＴＨＨＲＰＷＳ（配列番号２３）を含む。いくつかの実施形態にでは、ターゲット型ＢＭＰ－２は、ＩＩＧＥＳＳＨＨＫＰＦＴ（配列番号２４）を含む。いくつかの実施形態では、ターゲット型ＢＭＰ＆＃８７２２；２は、ＧＬＧＤＴＴＨＨＲＰＷＧ（配列番号２５）を含む。いくつかの実施形態では、ターゲット型ＢＭＰ－２は、ＩＬＡＥＳＴＨＨＫＰＷＴ（配列番号２６）を含む。いくつかの実施形態では、ターゲット型ＢＭＰ－２は、ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴ（配列番号１）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ターゲット型ＢＭＰ－２は、
ＱＡＫＱＲＫＱＲＫＨＫＲＫＱＲＫＨＫＳＫＲＦＶＤＦＶＤＷＮＤＶＡＰＰＧＹＨＡＦＰＧＹＨＡＦＣＨＧＥＣＰＬＡＤＨＬＮＳＴＮＨＡＶＮＳＶＮＳＫＩＰＣＣＶＰＴＥＬＳＡＩＳＭＬＹＬＤＥＮＥＫＶＬＫＮＹＱＤＭＶＧＣＧＣＲ（配列番号：３２）を含む。いくつかの実施形態では、ターゲット型ＢＭＰ－２は配列番号３３～３８のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態ではターゲット型ＢＭＰ－２は、配列番号３３を含む。いくつかの実施形態では、カルシウム含有化合物は、リン酸カルシウム、バテライト、またはリン酸カルシウムおよびバテライトを含む。いくつかの実施形態では、カルシウム含有化合物はβ－リン酸三カルシウム（β－ＴＣＰ）を含む。いくつかの実施形態において、β－ＴＣＰは足場中に足場材の約６０重量％～約８０重量％存在する。いくつかの実施形態において、β－ＴＣＰは、約７０重量％足場中に存在する。いくつかの実施形態において、β－ＴＣＰは、足場材の約３０重量％～約５０重量％で足場中に存在する。いくつかの実施形態において、β－ＴＣＰは、足場材の約４０重量％で足場中に存在する。いくつかの実施形態において、カルシウム含有化合物は、バテライトを含む。いくつかの実施態様において、バテライトは、足場材の約２０重量％～４０重量％で足場中に存在する。いくつかの実施態様において、バテライトは、約３０重量％足場中に存在する。いくつかの実施形態において、バテライトはＳｉＶ（ケイ素ドープバテライト）を含む。いくつかの実施態様において、足場材は、生分解性ポリマーを含む。いくつかの実施形態において、足場材は、ポリ（乳酸－コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）を含む。いくつかの実施形態では、足場材は、約２０重量％～約４０重量％のＰＬＧＡを含む。いくつかの実施態様において、足場材は、約３０重量％のＰＬＧＡを含む。さらに、本明細書に提供される組成物および／または構造で被験体を治療する方法が提供される。例えば、対象の骨欠損を治療するため。

図１Ａ～図１Ｆは、ＲｅＢＯＳＳＩＳ繊維の電子顕微鏡画像である。図１Ａは、２００ｘ倍率でのいくつかのＲｅＢＯＳＳＩＳ（８５）繊維（ＰＬＧＡ ３０重量％、ＳｉＶ ３０重量％、β－ＴＣＰ ４０重量％）の画像を示し、綿形状構造の繊維間の間隙空間を示す。図１Ｂは、一本のＲｅＢＯＳＳＩＳ（８５）繊維の２０００ｘ倍率での画像を示す。繊維の表面のカルシウム粒子は、容易に識別することができる。図１Ｃは、同じ繊維を５０００ｘ拡大で示しており、この中で、白色の矢印はβ－ＴＣＰ粒子を示し、暗い矢印はＳｉＶ粒子を示す。図１Ｄは、２００ｘ倍率でいくつかの繊維（ＰＬＧＡ３０ｗｔ％、β－ＴＣＰ７０ｗｔ％）の画像を示す。図１Ｅは、２０００倍の倍率で繊維（ＰＬＧＡ ３０重量％、β－ＴＣＰ ７０重量％）の画像を示す。図１Ｆは、５０００ｘ倍率で同じ繊維（ＰＬＧＡ３０ｗｔ％、β－ＴＣＰ７０ｗｔ％）を示し、白い矢印はβ－ＴＣＰ粒子を示す。 図２は、コントロール（ＢＳＡ）と比較した場合の、配列番号３３を有するｔＢＭＰ－２のＲｅＢＯＳＳＩＳ（８５）に対する結合を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルイメージを示す。パネルＡは、洗浄バッファーとして酸性バッファー（酢酸緩衝液）を使用して得られたゲル画像を示し、パネルＢは、洗浄バッファーとして中性バッファー（ＰＢＳ）を使用して得られたゲル画像を示す。各ゲル画像では、右の４レーンがｔＢＭＰ－２の分析結果を示し、左の４レーンがＢＳＡの分析結果を示している。 図３は、配列番号３３を有するｔＢＭＰ－２のいくつかのカルシウム含有材料への結合からのゲルイメージを示す。ｔＢＭＰ２はβ－ＴＣＰおよび／またはＳｉＶを含有する材料（ＳｉＶ７０、ＲｅＢＯＳＳＩＳ（８５）およびＯＲＢ－０３）によく結合する。レーン１はマーカーであり、レーン２は空であり、レーン３－６はＰＬＧＡ（レーン３）、ＳｉＶ７０（レーン４）、ＲｅＢＯＳＳＩＳ（８５）（レーン５）またはＯＲＢ－０３（レーン６）に結合したＢＳＡの量を示し、レーン７は空であり、レーン８－１１はＰＬＧＡ（レーン８）、ＳｉＶ７０（レーン９）、ＲｅＢＯＳＳＩＳ（８５）（レーン１０）またはＯＲＢ－０３（レーン１１）に結合したｔＢＭＰ－２の量を示し、レーン１２は空である。図１０は、結合アッセイのための手順を説明する。 図４は、ｒｈＢＭＰ－２（β－ＴＣＰ結合ペプチドに連結されていない組換えヒトＢＭＰ－２）のいくつかのカルシウム含有材料への結合からのゲルイメージを示す。ｒｈＢＭＰ－２は、主としてβ－ＴＣＰ（ＲｅＢＯＳＳＩＳ（８５）およびＯＲＢ－０３）を含有する材料上に保持されるが、ＳｉＶのみを含有する材料上には保持されていない。レーン１はマーカーであり、レーン２は空であり、レーン３－６はＰＬＧＡ（レーン３）、ＳｉＶ７０（レーン４）、ＲｅＢＯＳＳＩＳ（８５）（レーン５）、またはＯＲＢ－０３（レーン６）に結合したＢＳＡの量を示し、レーン７は空であり、レーン８－１１はＰＬＧＡ（レーン８）、ＳｉＶ７０（レーン９）、ＲｅＢＯＳＳＩＳ（８５）（レーン１０）、またはＯＲＢ－０３（レーン１１）に結合したｒｈＢＭＰ－２の量を示し、レーン１２は空である。図１０は、結合アッセイのための手順を説明する。 図５は、Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｃａｐｒｉｎｅ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｄｅｆｅｃｔ（ＣＣＴＤ）モデルの概略を示している。処置前において、骨格的に成熟した雌ヤギに５ｃｍセグメントの重大な欠損を形成する。欠損部には、５ｃｍ×直径２ｃｍのポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）スペーサーが設置されて、生体膜を生じさせる。４週間後、ＰＭＭＡスペーサーは緩やかに取り外され、移植材料と交換される。欠損部の治癒を評価するために、４週間ごとに正中Ｘ線写真を撮影する。図では、ＡＰは頭尾方向を表し、ＭＬは内外側方向を表す。白い矢印は、ＰＭＭＡスペーサーの配置における移植材料を示す。 図６Ａ～６Ｂは、移植手術の８週間後（図６Ａ）および１２週間後（図６Ｂ）に撮影したＸ線写真（内外側（ＭＬ）および頭蓋尾（ＡＰ）投影像）を示す。投与群あたり６頭のヤギ。配列番号３３を有するｔＢＭＰ－２含有群（第２群（０．１５ｍｇ／ｃｃ ｔＢＭＰ－２）および第３群（１．５ｍｇ／ｃｃ ｔＢＭＰ－２））は、第１群（ｔＢＭＰ－２なし）と比較して、より高い割合の新たな骨形成を示した。第１群のＸ線像を最初の二つの欄に、第２群のＸ線像を二番目の二つの欄に、第３群のＸ線像を図の最後の二つの欄にそれぞれ示す。 図７は、固定Ｘ線装置で撮影した１２の外植脛骨のＸ線写真（中外側（ＭＬ）および頭尾（ＡＰ）投影）を示す。高用量ｔＢＭＰ－２群（１．５ｍｇ／ｃｃ群、第３群）では、大量の新生骨が得られた。ＴＣＰおよびＲｅＢＯＳＳＩＳにｔＢＭＰ－２を加えると、ＣＣＴＤモデルにおける骨治癒が促進された。第１群のＸ線像を最初の二つの欄に、第２群のＸ線像を第二番目の二つの欄に、第３群のＸ線像を図の最後の二つの欄にそれぞれ示す。 図８は、パーコレーション現象の概念図であり、β－ＴＣＰ粒子の量がパーコレーションしきい値を超える場合のβ－ＴＣＰ粒子クラスターの形成を説明するものである。 図９（Ａ）は、β－ＴＣＰ粒子を５０ｗｔ％（２４．３ｖｏｌ％）含有する電界紡糸ＰＬＧＡ繊維の表面を示している。図９（Ｂ）は、７０ｗｔ％（４２．９ｖｏｌ％）のβ－ＴＣＰ粒子を含む電界紡糸ＰＬＧＡ繊維の表面を示したものである。図９（Ｃ）は、８０ｗｔ％（５６．３ｖｏｌ％）のβ－ＴＣＰ粒子を含む電界紡糸ＰＬＧＡ繊維の表面を示したものである。図９（Ｄ）は、８５ｗｔ％（６４．６ｖｏｌ％）のβ－ＴＣＰ粒子を含む電界紡糸ＰＬＧＡ繊維の表面を示している。 図１０は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析のためのサンプル回収方法を説明する図である。 図１１は、本発明の一実施形態による骨再生のメカニズムを説明する概念図を示す。 図１２は、本発明の一実施形態による骨再生のメカニズムを説明する概念図を示す。 図１３Ａ～１３Ｄは、７０重量％のβ－ＴＣＰ粒子を含有する電界紡糸された生分解性繊維の表面上に露出したβ－ＴＣＰ粒子がポリマーによって被覆されていないことを証明する実験結果を示す。 図１４Ａ～１４Ｅは、５０重量％のβ－ＴＣＰ粒子を含有する電界紡糸された生分解性繊維の表面上に露出したβ－ＴＣＰ粒子がポリマーによって被覆されないことを証明する実験結果を示す。

本発明の実施の形態は、β－ＴＣＰ及び骨形成性タンパク質－２（ｒｈＢＭＰ－２又はｔＢＭＰ－２ようなＢＭＰ－２）を含む骨再生材料に関するものである。また、本願発明の骨再生材料は、綿形状の構造体上の表面積が大きいＢＭＰ－２が、骨の修復部位において体液と相互に作用することにより、骨誘導プロセスが促進されるような綿形状の構造を有するものである。

骨誘導には、骨前駆細胞を刺激して骨芽細胞に分化させ、それから新たな骨形成を開始させることが含まれる。これに対し、骨伝導は骨移植材料が新生骨を成長させるための足場として機能する場合に生じるものであり、それは欠損部位を取り囲んでいる生体骨の周縁から既に生体内に存在している骨芽細胞によって継続される。

本発明の実施形態は、遺伝子組換えＢＭＰ－２（ｒｈＢＭＰ－２等）又はターゲット型ＢＭＰ－２を使用することができる。ターゲット型ＢＭＰ－２とは、ＢＭＰ－２が骨再生材料中のβ－ＴＣＰにタイトに結合できるようにβ－ＴＣＰ結合ペプチドとＢＭＰ－２を融合したタンパク質（すなわち融合タンパク質）である。β－ＴＣＰ結合ペプチドは、ＢＭＰ－２のＮ－ターミナルまたはＣ－ターミナルに融合されることができる。

ＢＭＰ－２は強力な骨形成活性を有し、脊椎固定術などの整形外科用途に用いられる。しかし、ＢＭＰ－２が治療部位から漏れ出てしまうと、意図しない部位で骨形成を誘導する可能性がある。これらのＢＭＰ－２関連合併症は症例の２０％～７０％に及ぶ比較的高い頻度で発生し、これらの有害作用は生命を脅かす可能性がある。（Ａａｒｏｎ Ｗ．Ｊａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｉｄｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ－２，”Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．Ｐａｒｔ Ｂ Ｒｅｖ．，２０１６，２２（４）：２８４－２９７）従って、ＢＭＰを治療部位に閉じ込めることが不可欠である。例えば、ＢＭＰ－２を骨再生／修復材料に確実に結合させ、ＢＭＰ－２を治療部位から離れて拡散させないようにすることが不可欠である。

本発明の実施の形態は、１つ又は複数のβ－ＴＣＰ結合ペプチドを含むｒｈＢＭＰ－２またはＢＭＰ－２融合タンパク質を使用することができる。これらのＢＭＰ－２融合タンパク質は、ターゲット型ＢＭＰ－２またはｔＢＭＰ－２と呼ばれる。ｔＢＭＰ－２は、ｔＢＭＰ－２がβ－ＴＣＰ及び／又はＳｉＶを含有する骨再生／修復材料と共に使用され、そこにおいて、ｔＢＭＰ－２はβ－ＴＣＰ及び／又はＳｉＶと密接に結合しており、治療部位から拡散せず、それによる悪影響を除去又は最小限に抑えるように設計されている。

本発明の骨再生・修復材料は、β－ＴＣＰ及び生分解性ポリマー（例えば、ポリ（乳酸－グリコール酸共重合体；ＰＬＧＡ））を含む生分解性繊維からなる綿形状の構造を有する。ｔＢＭＰ－２融合タンパク質は、これらの綿形状の構造物上で、β－ＴＣＰ及び／又はＳｉＶ粒子にタイトに結合することができ、かつ、治療部位から離れて拡散しない。

綿形状の構造は、（１）体液が骨移植材料の構造に容易に浸透することができる大きな間隙を有していること、（２）β－ＴＣＰからカルシウム及びリンが生体液に溶出されることを可能にする大きい表面積を提供すること、（３）ｒｈＢＭＰ－２又はｔＢＭＰ－２のような他の生理活性又は骨形成要因を支持／運搬するための広い表面積を提供すること、（４）骨修復部位の形状に適合させることができる柔軟な構造を有すること、といういくつかの利点を与える。

綿形状の構造物は、生分解性ポリマー及びβ－ＴＣＰを含有する溶液を電界紡糸することにより製造される。綿形状構造物の製造の詳細は、米国特許番号８，８５３，２９８， １０，０９２，６５０、米国特許出願公開番号２０１６／０１２１０２４， ２０１８／０２８０５６９に記載されている。それらの記載は、引用によって全て組み込まれている。これらの綿形状材料は、商標「ＲｅＢＯＳＳＩＳ」のもとでＯＲＴＨＯＲＥＢＩＲＴＨ株式会社（横浜）から入手可能である。

ＲｅＢＯＳＳＩＳは、β－ＴＣＰ及び／又はＳｉＶ粒子並びに乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）又はポリ乳酸（ＰＬＬＡ）のような生分解性ポリマーを含む電界紡糸された複数の生分解性繊維からなる綿形状の構造を有する。生分解性繊維はβ－ＴＣＰ又はケイ素含有炭酸カルシウム（ＳｉＶ）等のその他のカルシウム化合物粒子を含有することができる。ケイ素がドープされたバテライト相炭酸カルシウム粒子は、生分解性複合材料における細胞活性を高める能力を有することが判明している。（Ｏｂａｔａ等、「Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｎ ｓｉｌｉｃｏｎ－ｄｏｐｅｄ ｖａｔｅｒｉｔｅ／ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ」、Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒ．、２００９、５（１）：５７～６２；ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｃｔｂｉｏ．２００８．０８．００４）。

ＲｅＢＯＳＳＩＳでは、電界紡糸された生分解性繊維は当該繊維中に多量のカルシウム化合物粒子（β－ＴＣＰ及び／又はＳＩＶ粒子）を含有する。典型的なＲｅＢＯＳＳＩＳ繊維においては、カルシウム化合物粒子（例えば、β－ＴＣＰ粒子又はβ－ＴＣＰ＋ＳＩＶ粒子）の含有量は約３０～８５ｗｔ％、好ましくは約５０～８０ｗｔ％、さらに好ましくは約７０～８０ｗｔ％である。カルシウム化合物粒子の量が８５重量％を超えると、ＰＬＧＡとカルシウム化合物粒子との混合物を混練してポリマー中に分散させることが困難になる。

カルシウム化合物粒子はＰＬＧＡより密度が高い。例えば、ＰＬＧＡは１．０１ｇ／ｃｍ３の密度を有し、β‐ＴＣＰは３．１４ｇ／ｃｍ３の密度を有する。したがって、ｗｔ％とｖｏｌ％は、次のような相関関係がある：

いくつかの実施形態では、約６０重量％～約８０重量％のカルシウム化合物を含む足場材または繊維が提供される。非限定的な例として、リン酸カルシウム（例えば、β－リン酸三カルシウム（β－ＴＣＰ））およびバテライト（例えば、シリコンドープバテライト（ＳｉＶ））が挙げられる。いくつかの実施例では、足場材または繊維は、約７０重量％のカルシウム化合物を含む。一つの例では、足場材または繊維は、約７０重量％のβ－ＴＣＰを含む。別の例では、足場材または繊維は約４０重量％のβ－ＴＣＰを含む。さらに別の例では、足場材または繊維は約４０％のβ－ＴＣＰおよび約３０％のＳｉＶを含む。本発明の実施形態によれば、ＲｅＢＯＳＳＩＳ（８５）繊維の含有量は、重量％または容量％のいずれかで参照することができる。例えば、いくつかのＲｅＢＯＳＳＩＳ（８５）繊維は、β－ＴＣＰを約２５～６５ｖｏｌ％の量で含有し、ＰＬＧＡを約７５～３５ｖｏｌ％、より好ましくはβ－ＴＣＰ粒子を４０～６０ｖｏｌ％、ＰＬＧＡを６０～４０ｖｏｌ％の量で含有することができる。

本発明の実施の形態に従って、ＲｅＢＯＳＳＩＳ繊維は、カルシウム化合物粒子（例えば、β－ＴＣＰ粒子、又はＳｉＶ粒子、又はβ－ＴＣＰ＋ＳｉＶ粒子）の一部を繊維の表面に露出する一方、カルシウム化合物粒子の残存部分は繊維の内部に埋め込まれている。例えば、図１Ａ－１Ｆは、２つのＲｅＢＯＳＳＩＳサンプルの走査電子顕微鏡画像を示している。ＲｅＢＯＳＳＩＳ（８５）はＰＬＧＡ（３０ｗｔ％または５０．８ｖｏｌ％）、ＳＩＶ（３０ｗｔ％または２７．４ｖｏｌ％）、およびβ－ＴＣＰ（４０ｗｔ％または２１．８ｖｏｌ％）、ＯＲＢ－０３はＰＬＧＡ（３０ｗｔ％または５７．１ｖｏｌ％）およびβ－ＴＣＰ（７０ｗｔ％または４２．９ｖｏｌ％）からなる。

図１Ａは、２００倍の拡大倍率でのいくつかのＲｅＢＯＳＳＩＳ（８５）繊維（ＰＬＧＡ ３０重量％、ＳｉＶ ３０重量％、β－ＴＣＰ ４０重量％）の画像を示し、綿形状構造の繊維間の間隙空間を示す。繊維間の大きな間隙容量は、生体液の灌流を促進する。図１Ｂは、２０００倍の拡大倍率における一本のＲｅＢＯＳＳＩＳ（８５）繊維のイメージを示している。繊維の表面のカルシウム粒子は、容易に識別することができる。図１Ｃは、同じ繊維を５０００倍の拡大倍率で示しており、この中で、白色の矢印はβ－ＴＣＰ粒子を示し、暗い矢印はＳｉＶ粒子を示している。繊維の表面に露出した多数のカルシウム粒子は、ＢＭＰ－２またはｔＢＭＰ－２が結合する場所を提供する。加えて、露出したカルシウム粒子は、骨リモデリングや新骨形成の際に、破骨細胞や骨芽細胞との相互作用を容易にする。

図１Ｄは、２００倍の拡大倍率におけるいくつかのＯＲＢ－０３繊維（ＰＬＧＡ ３０ｗｔ％／β－ＴＣＰ ７０ｗｔ％）の画像を示しており、綿形状構造における繊維間の間隙空間を示している。繊維間の大きい間隙容量は、生体液の灌流を促進する。図１Ｅは、１本のＯＲＢ－０３ファイバーの画像を２０００倍の倍率で示している。繊維の表面のカルシウム粒子は、容易に識別することができる。図１Ｆは、同じ繊維を５０００倍の拡大倍率で示しており、白の矢印は、β－ＴＣＰ粒子を示す。繊維の表面に露出した多数のカルシウム粒子は、ＢＭＰ－２またはｔＢＭＰ－２が結合する場所を提供する。加えて、露出したカルシウム粒子は、リモデリングや新骨形成の際に、破骨細胞や骨芽細胞との相互作用を促進する。

本発明の実施形態によれば、足場材及び繊維（例えばＲｅＢＯＳＳＩＳ（８５）、ＯＲＢ－０３）は、好ましくは約４０μｍ～約３２０μｍ（範囲内の全ての数を含む）、好ましくは約７０μｍ～約２５０μｍ、より好ましくは約９０μｍ～約２００μｍの直径を有し、その結果、１～５μｍの直径を有するカルシウム化合物粒子を繊維中および繊維上に分布させることができ、綿形状構造の機械的強度は、骨欠損部位に足場材又は繊維を移植後に所望の形状を維持するのに十分である。前記足場材又は繊維の綿形状構造体の嵩密度は約０．０１～０．２ｇ／ｃｍ３、好ましくは約０．０１～０．１ｇ／ｃｍ３であり、綿形状構造体内の繊維間のギャップは、約１～１０００μｍ、より好ましくは約１～１００μｍであり、これにより、体液が繊維間のギャップを通して透過することができ、骨形成のためのスペースが綿形状構造体全体にわたって確保される。

本発明の一実施形態によれば、生分解性繊維の長さは、好ましくは約５～２０ｍｍ、より好ましくは約４～１０ｍｍである。本発明の一実施形態によれば、混練工程を用いて製造された紡糸溶液は、７０ｗｔ％または４３ｖｏｌ％などの多量のカルシウム粒子を含有する。紡糸溶液をノズルから噴射すると、カルシウム粒子は、ポリマーによって互いに結合されて、長手方向に長い繊維を形成する。しかし、電場の反発力により飛行中に放出されたファイバーの軌跡が激しく揺れると、カルシウム粒子とバインダーポリマーから形成されたファイバーは、もはやその長手方向の形状を維持することができず、引きちぎられてより短いファイバーを形成する。

骨欠損部位に足場材又は繊維を埋植後、間葉系幹細胞を含む体液が、β－ＴＣＰ粒子上で捕獲されたＢＭＰ－２（ｒｈＢＭＰ－２、ｔＢＭＰ－２など）に接触する。そうするとＢＭＰ－２は骨前駆細胞を骨芽細胞に分化させるのを促進する。ＢＭＰ－２と結合するβ－ＴＣＰ粒子は、破骨細胞またはその他の生理活性物質によって徐々に溶解される。そして、骨芽細胞は、骨リモデリングプロセスにおけると同様にβ－ＴＣＰ粒子上に新しい骨を形成するように働く。

骨欠損部位に足場材又は繊維を埋植後、電界紡糸繊維のＰＬＧＡポリマーは、繊維に埋め込まれたβ－ＴＣＰ粒子が露出するように徐々に分解し、新たに露出されたβ－ＴＣＰ粒子は、繊維の表面に露出したＢＭＰ－２を再捕獲する。ＰＬＧＡの分解が進むにつれて、新たに露出したβ－ＴＣＰ粒子によってＢＭＰ－２が再捕獲されて、生分解性繊維の足場のネットワーク全体を通じて継続的に骨のリモデリングが発生し、その結果、骨の欠損部位で効率的な骨の形成が生じる。

本発明の実施の形態において、ＢＭＰ－２（例えば、ｒｈＢＭＰ－２又はｔＢＭＰ－２）は、ＢＭＰ－２が綿形状構造全体を通じて繊維に捕捉されるように、繊維の表面に露出したβ－ＴＣＰ及び／又はＳｉＶ粒子と結合する。β－ＴＣＰ結合ペプチドの融合は、ＢＭＰ－２のＮ－ターミナルまたはＣ－ターミナルに対してすることができる。

ｔＢＭＰ－２は、従来の分子生物学的手法又は当該技術分野において知られている他の技術（例えば、ＢＭＰへのβ－ＴＣＰ結合ペプチドの化学的又は酵素的結合）を用いて製造することができる。例えば、ＢＭＰの塩基配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、β－ＴＣＰ結合ペプチドの塩基配列につなげることができる。あるいは、融合タンパク質の塩基配列を化学的に合成することができる。その後、融合タンパク質のコンストラクトは、制限場所において適切な発現ベクターに組み込まれる。そして、発現ベクターを、タンパク質の発現系（例えば、大腸菌、酵母、又は、ＣＨＯ細胞）にトランスフェクションする。次に、発現させたタンパク質を精製する。タンパク質の精製を容易にするために、特定のタグ（例えば、ヒスチジンタグ）を、当該の発現に組み込むことができる。これらのプロセスと技術はすべて、既知の慣用的なものである。当業者であれば、過度の実験を行うことなくこれらを実施することができる。

本発明の実施形態に従って、β－ＴＣＰ結合ペプチドは、アミノ酸配列ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１），ＧＱＶＬＰＴＴＴＰＳＳＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２），ＶＰＱＨＰＹＰＶＰＳＨＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３），ＨＮＭＡＰＡＴＬＨＰＬＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４），ＱＳＦＡＳＬＴＮＰＲＶＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５），ＨＴＴＰＴＴＴＹＡＡＰＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６），ＱＹＧＶＶＳＨＬＴＨＴＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７），ＴＭＳＮＰＩＴＳＬＩＳＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８），ＩＧＲＩＳＴＨＡＰＬＨＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９），ＭＮＤＰＳＰＷＬＲＳＰＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０），ＱＳＬＧＳＭＦＱＥＧＨＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１），ＫＰＬＦＴＲＹＧＤＶＡＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２），ＭＰＦＧＡＲＩＬＳＬＰＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３），ＱＬＱＬＳＮＳＭＳＳＬＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４），ＴＭＮＭＰＡＫＩＦＡＡＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５），ＥＰＴＫＥＹＴＴＳＹＨＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６），ＤＬＮＥＬＹＬＲＳＬＲＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７），ＤＹＤＳＴＨＧＡＶＦＲＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８），ＳＫＨＥＲＹＰＱＳＰＥＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９），ＨＴＨＳＳＤＧＳＬＬＧＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０），ＮＹＤＳＭＳＥＰＲＳＨＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１），又はＡＮＰＩＩＳＶＱＴＡＭＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）を含むことができる。これらは米国特許法第１０，３２９，３２７号Ｂ２号に開示されており、その開示は、その全てを引用することにより本発明に組み込まれる。いくつかの実施形態では、β＆＃８７２２；ＴＣＰ結合ペプチドは、ＶＩＧＥＳＴＨＨＲＰＷＳ（配列番号２３）、ＩＩＧＥＳＳＨＨＫＰＦＴ（配列番号２４）、ＧＬＧＤＴＴＨＨＲＰＷＧ（配列番号２５）、またはＩＬＡＥＳＴＨＨＫＰＷＴ（配列番号２６）、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、β＆＃８７２２；ＴＣＰ結合ペプチドは、ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴ（配列番号１）、ＶＩＧＥＳＴＨＨＲＰＷＳ（配列番号２３）、ＩＩＧＥＳＳＨＨＫＰＦＴ（配列番号２４）、ＧＬＧＤＴＴＨＨＲＰＷＧ（配列番号２５）、およびＩＬＡＥＳＴＨＨＫＰＷＴ（配列番号２６）を含む。

本発明のいくつかの実施例に従い、β－ＴＣＰ結合ペプチドは、上記の配列から選択された２つ以上の配列を含むことができる。この２つ以上の配列は、互いに直接結びつけることができ、あるいは、その間に短いペプチド・リンク体を相互に綴じて、より長いβ－ＴＣＰ結合ペプチドを形成することができる。
非限定的な例として、β－ＴＣＰ結合ペプチドは、ＬＬＡＴＨＷＴＨＶＩＳＩＨＧＨＰＧＴＨＧＬＧＨＴＨＷＧＨＧＨＧＨＧＨＧＨＧＩＬＥＳＨＫＰＷＴＨＰＷＴ（配列番号：２７）、ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴＶＩＧＥＳＴＨＨＲＰＷＳ（配列番号２８）、ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴＶＩＧＥＳＴＨＨＲＰＷＳ（配列番号２９）、ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴＶＩＧＥＳＴＨＨＲＰＷＳ（配列番号３０）、およびＶＩＧＥＳＴＨＨＷＳＩＨＰＫＬＧＤＬＧＤＨＧＩＴＨＫＰＷＴ（配列番号３１）を含む。さらなる例として、β－ＴＣＰ結合ペプチドは、第１のペプチドが配列番号：１を含み、第２のペプチドが配列番号：２３、２４、２５または２６のうちの１つまたは複数を含み、第２のペプチドが配列番号：１、２５または２６のうちの１つまたは複数を含み、第１のペプチドが配列番号：２５を含み、第２のペプチドが配列番号：２３、２４、１または２６のうちの１つまたは複数を含み、第１のペプチドが配列番号：２６を含み、第２のペプチドが配列番号：２３、２４、２５のうちの１つまたは複数を含む。第１のペプチドは配列番号１を含み、第２のペプチドは配列番号２３、２４、２５又は２６の２以上を含み、第１のペプチドは配列番号を含む：第１のペプチドは配列番号１、２４、２５または２６のうちの２つ以上を含み、第２のペプチドは配列番号２３、２５または２６のうちの２つ以上を含み、第２のペプチドは配列番号２３、２４、１または２６のうちの２つ以上を含み、第２のペプチドは配列番号２３、２４、２５または１のうちの２つ以上を含み、第２のペプチドは配列番号２３、２５または２６のうちの３つ以上を含み、第１のペプチドは配列番号２３、２４、２５のうちの３つ以上を含む。第１のペプチドは配列番号２４を含み、第２のペプチドは配列番号２３、１、２５または２６のうちの３つ以上を含み、第１のペプチドは配列番号２５番目のペプチドは配列番号２３、２４、１または２６の３つ以上を含み、２番目のペプチドは配列番号２６を含み、２番目のペプチドは配列番号２３、２４、２５または１の３つ以上を含む。

β－ＴＣＰ－結合ペプチドが存在するために、ｔＢＭＰ－２のβ－ＴＣＰ粒子への結合は非常に密になっており、それによってｔＢＭＰ－２が骨欠部の外部に流出することがさらに防止される。その結果、本明細書においてｔＢＭＰ－２／繊維を使用することの安全性はさらに保証される。
ＲｅＢＯＳＳＩＳ

ＲｅＢＯＳＳＩＳは、生分解性繊維で形成された綿形状の構造を有する骨欠損部充填材料である。ＲｅＢＯＳＳＩＳの詳細は、米国特許第８，８５３，２９８号、米国特許第１０，０９２，６５０号、米国特許出願公開第２０１６／０１２１０２４号、および米国特許出願公開第２０１８／０２８０５６９号に説明されている。これらの文献の開示は、引用によってその全部が本出願に組み込まれている。

ＲｅＢＯＳＳＩＳの電界紡糸された生分解性繊維の直径は、約５～１００μｍ、好ましくはできれば約１０～１００μｍ、さらに好ましくは約１０～６０μｍの範囲である。これに対し、従来の電界紡糸繊維の直径は、通常数十ナノメートルないし数百ナノメートル（ｎｍ）である。Ｏｒｔｈｏｒｅｂｉｒｔｈ社は、電界紡糸（ＥＳ）溶液を高速で大径ノズルに送り、ＥＳ装置の上部から下部に繊維を落下させることによって紡糸することによって、より太く電界紡糸された繊維を得た。カルシウム化合物粒子の量が増加するにつれて、電界紡糸繊維の直径はさらに太くなり、最終的に直径は６０μｍを超えることになる。電界紡糸法は極めて細いナノファイバーを製造する方法として知られているので、Ｏｒｔｈｏｒｅｂｉｒｔｈ社が太い生分解生繊維を製造するために用いる方法は独特である。２０１９年９月１３日出願のＰＣＴ／ＪＰ２０１９／０３６０５２に、Ｏｒｔｈｏｒｅｂｉｒｔｈ社の方法の詳細が記載されている。この太い電界紡糸された生分解性繊維を製造することにより、本発明者らは、繊維上に粒子が露出するように、繊維中に多量のカルシウム化合物粒子を含有させることが可能となった。また、太い繊維は、骨修復部位に埋植した後に繊維の形状を維持する機械的強度を有する。

ＲｅＢＯＳＳＩＳの生分解性繊維には、カルシウム粒子（例えば、β－ＴＣＰ、ＳｉＶ、又はβ－ＴＣＰ＋ＳｉＶ）が多量に含まれている。このような多量のカルシウム粒子を混入することは、混練工程を用いることによって達成される。簡単に言えば、生分解性樹脂とカルシウム粒子の混合物を強い力で練ることによって複合体を製造する。次に、この複合体を溶剤（例えば、クロロホルム）に溶解して紡糸溶液を製造する。混練工程の詳細は、２０１７年４月２８日に出願されたＷＯ２０１７／１８８４３５に記載されている。

ニーダーの中でカルシウム粒子を樹脂に加えて生分解性樹脂とカルシウム粒子の混合物を混練することによって、カルシウム粒子はマトリックス樹脂中に均一に分散される。しかし、カルシウム粒子の容積比がしきい値を超えると、パーコレーシン現象の発生により、粒子はもはや均質分散状態を維持することができなくなり、クラスター相が現れ始める（図８参照）。粒子のクラスター相の形成の結果、一部のカルシウム粒子は生分解性繊維の表面に露出する（図１Ａ～１Ｆ参照）。これにより、ＢＭＰ－２が、生分解性繊維上のβ－ＴＣＰ粒子に結合することが可能となる。発明者等の経験によれば、このパーコレーション効果は、無機粒子の容積パーセントが約２５ｖｏｌ％を超える場合に現れる。カルシウム粒子の相対的ｖｏｌ％は、生分解性繊維中の全成分（すなわち、生分解性ポリマーおよびカルシウム化合物）の総体積（１００体積％）に基づいて計算される。本発明の一実施形態において、電界紡糸された生分解性繊維の表面上に露出されたβ－ＴＣＰ粒子とＢＭＰ－２との結合サイトの面積は、電界紡糸された生分解性繊維に含まれるβ－ＴＣＰ粒子の量によって調整される。

図９Ａ～９Ｄには、本発明のＲＥＢＯＳＳＩＳ繊維のＳＥＭ画像が示されており、生分解性繊維に含まれるβ－ＴＣＰ粒子のｖｏｌ％の割合が増加するにつれて、生分解性繊維へのβ－ＴＣＰ粒子の露出が増加していることが示されている。図９Ａは、β－ＴＣＰを有する繊維（５０ｗｔ％、２４．３ｖｏｌ％）を示しており、繊維の表面に露出したβ－ＴＣＰ粒子は多くない。図９Ｂは、β－ＴＣＰを有する繊維（７０ｗｔ％、４２．９ｖｏｌ％）を示しており、繊維の表面には多くのβ－ＴＣＰ粒子が露出している。図９Ｃは、β－ＴＣＰを有する繊維（８０ｗｔ％、５６．３ｖｏｌ％）を示しており、繊維の表面に露出したβ－ＴＣＰ粒子はさらに多い。図９Ｄは、β－ＴＣＰを有する繊維（８５ｗｔ％、６４．６ｖｏｌ％）を示しており、繊維の表面に露出したβ－ＴＣＰ粒子はさらに多い。
一部のβ－ＴＣＰ粒子が繊維上に露出していることの確認
方法

次の組成を有する繊維性シートを１ｍｏｌ／ＬのＨＣＬに１０秒間、１分間、５分間浸漬した。
・ＰＬＧＡ ３０重量％、β－ＴＣＰ ７０重量％ 又は
・ＰＬＧＡ ５０重量％、β－ＴＣＰ ５０重量％

β－ＴＣＰ粒子がポリマーによって被覆されていればβ－ＴＣＰ粒子はＨＣｌによって溶解されない。したがって、変化はないであろう。他方、β－ＴＣＰ粒子がＨＣｌによって溶解されれば、β－ＴＣＰ粒子は露出していて、ポリマーによって被覆されていないと考えられる。

図１３Ａ～１３Ｄに示されるように、β－ＴＣＰ粒子がＨＣＬによって溶解されることが確認された。ＰＬＧＡはＨＣｌによって溶解しなかった。β－ＴＣＰ率が高いほど、繊維表面のβ－ＴＣＰ粒子の曝露量が増加する。これらの実験から明らかなように、繊維中のβ－ＴＣＰ粒子の一部はポリマーによって完全には覆われていない。したがって、ＨＣｌはこれらのβ－ＴＣＰ粒子を溶解することができる。図１３Ａ～１３Ｄおよび図１４Ａ～１４Ｅに示されるように、β－ＴＣＰ粒子のポリマーに対する比率を変化させることによって、β－ＴＣＰ粒子の曝露の程度を制御することができる。従って、繊維状足場へのＢＭＰ－２の結合サイトは、繊維上のβ－ＴＣＰ粒子の曝露を増加または減少させることによって制御することができる。
ｔＢＭＰ－２

本発明のいくつかの実施形態は、β－ＴＣＰ結合ペプチドがＢＭＰ－２と融合されているターゲット型ＢＭＰ－２（ｔＢＭＰ－２）を使用する。非限定的な例として、ＢＭＰは、ＱＡＫＱＲＫＱＲＫＨＫＱＲＫＱＲＫＳＫＶＤＦＶＤＰＶＤＰＶＰＧＹＨＡＦＰＨＡＦＰＧＥＣＦＰＬＡＮＳＴＮＶＮＳＱＴＬＶＮＳＫＩＰＫＣＣＶＰＴＥＬＳＡＩＬＹＬＤＥＮＥＫＶＫＮＹＱＤＭＶＧＣＧＣＲ（配列番号３２）を含み、ｔＢＭＰ－２は、本発明の発明者の一人によって開発されたβ－ＴＣＰ結合ペプチドと融合されている。β－ＴＣＰ結合ペプチドの詳細は、米国特許第１０，３２９，３２７ Ｂ２号および「Ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）ｔｏ Ｂｅｔａ Ｔｒｉｃａｌｃｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（β ＴＣＰ）ｖｉａ Ｆｕｓｉｏｎ ｔｏ ａ Ｈｉｇｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ，Ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ β－ＴＣＰ ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ：Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌｓ／Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ，”Ａｌｖａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１２９６００，Ｊｕｎｅ ２９，２０１５」に説明されている。これらの文献の開示は、引用によってその全部が本出願に組み込まれている。

本発明の実施形態において、β＆＃８７２２；ＴＣＰ結合ペプチドは、アミノ酸配列ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴ（配列番号１）、ＧＱＶＬＰＴＴＴＰＳＳＰ（配列番号３）、ＨＮＭＡＰＡＴＬＨＰＬＰ（配列番号４）、ＱＳＦＡＳＬＴＮＰＲＶＬ（配列番号５）、ＨＴＴＰＴＴＴＹＡＡＰＰ（配列番号７）、ＱＹＧＶＶＳＨＬＴＨＴＰ（配列番号８）、ＩＧＲＩＳＴＨＡＰＬＨＰ（配列番号９）、ＭＮＤＰＳＰＷＬＲＳＰＲ（配列番号１０）、ＱＳＬＧＳＭＦＱＥＧＨＲ（配列番号１１）、ＫＰＬＦＴＲＹＧＤＶＡＩ（配列番号１２）、ＭＰＦＧＡＲＩＬＳＬＰＮ（配列番号１３）、ＱＬＱＬＳＮＳＭＳＳＬＳ（配列番号１４）、ＴＭＮＭＰＡＫＩＦＡＡＭ（配列番号１５）を含み得る。ＥＰＴＫＥＹＴＴＳＹＨＲ（配列番号１６）、ＤＬＮＥＬＹＬＲＳＬＲＡ（配列番号１７）、ＤＹＤＳＴＨＧＡＶＦＲＬ（配列番号１８）、ＳＫＨＥＲＹＰＱＳＰＥＭ（配列番号１９）、ＨＴＨＳＳＤＧＳＬＬＧＮ（配列番号２０）。ＮＹＤＳＭＳＥＰＲＳＨＧ（配列番号２１）、ＡＮＰＩＩＳＶＱＴＡＭＤ（配列番号２２）、ＶＩＧＥＳＴＨＨＲＰＷＳ（配列番号２３）、ＩＩＧＥＳＳＨＨＫＰＦＴ（配列番号２４）、ＧＬＧＤＴＴＨＨＲＰＷＧ（配列番号２５）、又はＩＬＡＥＳＴＨＨＫＰＷＴ（配列番号２６）、又はそれらの組み合わせを含み得る。本発明のいくつかの実施例において、β－ＴＣＰ結合ペプチドは、上記の配列から選択された二つ以上の配列を含むことができる。前記β＆＃８７２２；ＴＣＰ結合ペプチドは、ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴ（配列番号１）、ＶＩＧＥＳＴＨＨＲＰＷＳ（配列番号２３）、ＩＩＧＥＳＳＨＨＫＰＦＴ（配列番号２４）、ＧＬＧＤＴＴＨＨＲＰＷＧ（配列番号２５）、およびＩＬＡＥＳＴＨＨＫＰＷＴ（配列番号２６）を含むことができる。二つ以上の配列は、互いに直接結びつくことができ、あるいは、それらの間に短いペプチドを相互に綴じ合わせて、より長いβ－ＴＣＰ結合ペプチドを形成することができる。

本発明の実施形態において、ｔＢＭＰ－２で使用されるＢＭＰには、ターゲット型ＢＭＰ－２および組換えヒトＢＭＰ－２（ｒｈＢＭＰ－２）を含むことができる。いくつかの実施形態において、提供されるｔＢＭＰ－２は、β－ＴＣＰ結合ペプチド（例えば、本明細書に開示された一つ以上のβ－ＴＣＰ結合ペプチド）及びＱＡＫＨＫＱＲＫＲＬＫＳＳＣＫＲＨＰＬＹＶＤＦＳＤＶＧＷＮＤＷＩＶＡＰＰＧＹＨＡＦＹＣＨＧＥＣＰＦＰＬＡＤＨＬＮＳＴＮＨＡＩＶＱＴＬＶＮＳＶＮＳＫＩＰＫＡＣＣＶＰＴＥＬＳＡＩＳＭＬＹＬＤＥＮＥＫＶＶＬＫＮＹＱＤＭＶＶＥＧＣＧＣＲを含む。上記β－ＴＣＰ結合ペプチドは、リンカー、例えばペプチドリンカーを介してＢＭＰ配列に連結され得る。ｔＢＭＰ－２ペプチドの非限定的な例は、
ＭＰＩＧＳＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴＶＩＧＥＳＴＨＨＲＰＷＳＩＩＧＥＳＳＨＨＫＰＦＴＧＬＧＤＴＴＨＨＲＰＷＧＩＬＡＥＳＴＨＨＫＰＷＴＡＳＧＡＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＴＳＧＡＴＧＡＧＴＳＴＳＧＧＧＡＳＴＧＧＧＴＧＱＡＫＨＫＱＲＫＲＬＫＳＳＣＫＲＨＰＬＹＶＤＦＳＤＶＧＷＮＤＷＩＶＡＰＰＧＹＨＡＦＹＣＨＧＥＣＰＦＰＬＡＤＨＬＮＳＴＮＨＡＩＶＱＴＬＶＮＳＶＮＳＫＩＰＫＡＣＣＶＰＴＥＬＳＡＩＳＭＬＹＬＤＥＮＥＫＶＶＬＫＮＹＱＤＭＶＶＥＧＣＧＣＲ（配列番号３３），ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴＶＩＧＥＳＴＨＨＲＰＷＳＩＩＧＥＳＳＨＨＫＰＦＴＧＬＧＤＴＴＨＨＲＰＷＧＩＬＡＥＳＴＨＨＫＰＷＴＡＳＧＡＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＴＳＧＡＴＧＡＧＴＳＴＳＧＧＧＡＳＴＧＧＧＴＧＱＡＫＨＫＱＲＫＲＬＫＳＳＣＫＲＨＰＬＹＶＤＦＳＤＶＧＷＮＤＷＩＶＡＰＰＧＹＨＡＦＹＣＨＧＥＣＰＦＰＬＡＤＨＬＮＳＴＮＨＡＩＶＱＴＬＶＮＳＶＮＳＫＩＰＫＡＣＣＶＰＴＥＬＳＡＩＳＭＬＹＬＤＥＮＥＫＶＶＬＫＮＹＱＤＭＶＶＥＧＣＧＣＲ（配列番号３４），ＶＩＧＥＳＴＨＨＲＰＷＳＩＩＧＥＳＳＨＨＫＰＦＴＧＬＧＤＴＴＨＨＲＰＷＧＩＬＡＥＳＴＨＨＫＰＷＴＡＳＧＡＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＴＳＧＡＴＧＡＧＴＳＴＳＧＧＧＡＳＴＧＧＧＴＧＱＡＫＨＫＱＲＫＲＬＫＳＳＣＫＲＨＰＬＹＶＤＦＳＤＶＧＷＮＤＷＩＶＡＰＰＧＹＨＡＦＹＣＨＧＥＣＰＦＰＬＡＤＨＬＮＳＴＮＨＡＩＶＱＴＬＶＮＳＶＮＳＫＩＰＫＡＣＣＶＰＴＥＬＳＡＩＳＭＬＹＬＤＥＮＥＫＶＶＬＫＮＹＱＤＭＶＶＥＧＣＧＣＲ（配列番号３５），ＩＩＧＥＳＳＨＨＫＰＦＴＧＬＧＤＴＴＨＨＲＰＷＧＩＬＡＥＳＴＨＨＫＰＷＴＡＳＧＡＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＴＳＧＡＴＧＡＧＴＳＴＳＧＧＧＡＳＴＧＧＧＴＧＱＡＫＨＫＱＲＫＲＬＫＳＳＣＫＲＨＰＬＹＶＤＦＳＤＶＧＷＮＤＷＩＶＡＰＰＧＹＨＡＦＹＣＨＧＥＣＰＦＰＬＡＤＨＬＮＳＴＮＨＡＩＶＱＴＬＶＮＳＶＮＳＫＩＰＫＡＣＣＶＰＴＥＬＳＡＩＳＭＬＹＬＤＥＮＥＫＶＶＬＫＮＹＱＤＭＶＶＥＧＣＧＣＲ（配列番号３６），ＧＬＧＤＴＴＨＨＲＰＷＧＩＬＡＥＳＴＨＨＫＰＷＴＡＳＧＡＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＴＳＧＡＴＧＡＧＴＳＴＳＧＧＧＡＳＴＧＧＧＴＧＱＡＫＨＫＱＲＫＲＬＫＳＳＣＫＲＨＰＬＹＶＤＦＳＤＶＧＷＮＤＷＩＶＡＰＰＧＹＨＡＦＹＣＨＧＥＣＰＦＰＬＡＤＨＬＮＳＴＮＨＡＩＶＱＴＬＶＮＳＶＮＳＫＩＰＫＡＣＣＶＰＴＥＬＳＡＩＳＭＬＹＬＤＥＮＥＫＶＶＬＫＮＹＱＤＭＶＶＥＧＣＧＣＲ（配列番号３７），ａｎｄ ＩＬＡＥＳＴＨＨＫＰＷＴＡＳＧＡＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＴＳＧＡＴＧＡＧＴＳＴＳＧＧＧＡＳＴＧＧＧＴＧＱＡＫＨＫＱＲＫＲＬＫＳＳＣＫＲＨＰＬＹＶＤＦＳＤＶＧＷＮＤＷＩＶＡＰＰＧＹＨＡＦＹＣＨＧＥＣＰＦＰＬＡＤＨＬＮＳＴＮＨＡＩＶＱＴＬＶＮＳＶＮＳＫＩＰＫＡＣＣＶＰＴＥＬＳＡＩＳＭＬＹＬＤＥＮＥＫＶＶＬＫＮＹＱＤＭＶＶＥＧＣＧＣＲ（配列番号３８）を含む。
ＢＭＰ－２のＲｅＢＯＳＳＩＳへの結合

本発明の実施形態によれば、ＢＭＰ－２はＲｅＢＯＳＳＩＳ繊維に結合することができる。ＲｅＢＯＳＳＩＳ繊維へのＢＭＰ－２結合の特性を評価するために、以下の試験を実施した（例として、ｔＢＭＰ－２およびｒｈＢＭＰ－２を用いた）。この試験では、ＲｅＢＯＳＳＩＳの生分解性繊維は、ＰＬＧＡ（３０重量％）およびβ－ＴＣＰ粒子（４０重量％）およびＳｉＶ（バテライト相のケイ素ドープ炭酸カルシウム）粒子（３０重量％）を含有する。β－ＴＣＰ粒子及びＳＩＶ粒子は、繊維の内部及び繊維上に分散している。
巨視的に見ると、粒子の一部が繊維の表面の外部に露出している。

４つのサンプル溶液を調製した。以下の４つの試料溶液中のｔＢＭＰ－２またはｒｈＢＭＰ－２の濃度を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を用いて対照試料と比較した。コントロール試料として、牛のアルブミン（ＢＳＡ）を用いた。

具体的には、以下の試薬を調製した：（ａ）ｔＢＭＰ－２（配列番号３３、１０ｍＭ Ｎａ－酢酸塩中、０．１Ｍ Ｕｒｅａを含むまたは含まない０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ４．７５）；（ｂ）酢酸塩洗浄緩衝液（－２０℃で保存）に溶解したＢＳＡストック溶液：４２ｍｇ／ｍｌ；（ｃ）酢酸塩洗浄緩衝液：５ｍ Ｍ Ｎａ－酢酸塩ｐＨ４．７５、１００ｍＭ ＮａＣｌ；（ｄ）ＲｅＢＯＳＳＩＳ（ＯｒｔｈｏＲｅｂｉｒｔｈ）；及び（ｅ）ＰＢＳ（Ｒｏｃｈｅ、ｃａｔ＃ １１６６６７８９００１、１Ｘ 溶液＝１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ ＨＰ０４、１．８ｍＭ ＫＨ２ Ｐ０４、ｐＨ７．０）。

方法：２０μｇのｔＢＭＰ－２またはＢＳＡ／ｍｇのＲｅＢＯＳＳＩＳ（総量２００μｇのｔＢＭＰ－２およびＲｅＢＯＳＳＩＳ１０ｍｇ）を結合し、洗浄、溶出、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥに負荷する。具体的なプロトコルは以下の通りである：
準備
１．ＲｅＢＯＳＳＩＳ１０ｍｇをスピンチューブに秤量；
２．ＢＳＡを調製する：ＢＳＡストック２９μｌを採取し、酢酸緩衝液９７１μｌを加えて、ｐＨ４．７５で１．２２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ希釈溶液を得る。
３．各チューブに５００μｌの酢酸塩洗浄緩衝液を添加することにより、酢酸塩洗浄緩衝液中でＲｅＢＯＳＳＩＳを予備洗浄する。ウェルを回転させて混合し、５分間インキュベートする。マイクロフュージの中で遠心沈殿させる。緩衝液を取り除くために、先端を管の底部に置いて。ＲｅＢＯＳＳＩＳはチューブ内に残る。
４．Ｇｅｌサンプル：後のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析のために、一部のＢＳＡロードとｔＢＭＰ－２ロードを除外する。
評価
５．予め洗浄したＲｅＢＯＳＳＩＳ１０ｍｇにｔＢＭＰ－２ ２００μｇを加え、総容量は１６４μｌとする；
６．１０ｍｇの予め洗浄したＲｅＢＯＳＳＩＳに２００μｇのＢＳＡを総量１６４μｌで添加する。

７．３０分結合（結合は２０分近くで終了する）；
結合されていない材料を回収
８．マイクロフュージで最高速度で４－５分間管をスピンする。
９．ピペットをチューブの上部の上清に挿入し、結合していないものをチューブにピペットで取り出す。（注：ピペットチップにＲｅＢＯＳＳＩＳが入っていないことを確認してください。余分な量を取り出してゲルを流し、管の底部にチップを入れ、残りを廃棄します。）；
洗浄
１０．ＰＢＳ又はアセテート洗浄緩衝剤のいずれかの５００マイクロルを加える；
１１．ジェネリー・ボルテックス。終了後に５分間混合し、その後再度緩やかに離婚する；
１２．マイクロフュージで最高速度で４－５分間スピニング管を抜き出す。洗浄を継続する；
溶出
１３．１６４μｌの非還元性１Ｘ ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル色素（ＢＭＰ２ダイマーを破壊するようなβ－メルカプトエタノールを含まない）を添加することにより溶出する；
１４．ボルテックス、５分間インキュベート、リピートボルテックス；
１５．溶出物をマイクロフュージで最高速度で４－５分間スピニング管で回収する；
１６．ＲｅＢＯＳＳＩＳ Ｌｏａｄ：１０μｌ、Ｎｏｎ－Ｂｏｕｎｄ １０μｌ、Ｗａｓｈ １０μｌ、Ｅｌｕｔｉｏｎ １１μｌのようにゲルをロードします。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析用サンプルには、以下のようなラベルが付される（図２及び図１０に示す）。
Ｌｄ：既知量のｔＢＭＰ－２またはＢＳＡを含む試料溶液（Ｌｏａｄｉｎｇ）。
ＦＴ：ＬｄをＲｅＢＯＳＳＩＳに供した後、ＲｅＢＯＳＳＩＳに保持されずに通過した画分を回収することにより得られたサンプル（Ｆｌｏｗ Ｔｈｒｏｕｇｈ）
Ｗ：たん白質を保持しているＲｅＢＯＳＳＩＳを通過させた洗浄用緩衝液を回収することによって得られたサンプル（Ｗａｓｈ）。
ＲｅＢＯＳＳＩＳに結合したタンパク質が洗浄緩衝液によって解離する場合、洗浄後に流出した画分は解離したタンパク質を含有する。
埋植部位のｐＨ環境が酸性または中性であるとし、２種類の洗浄用緩衝液（ｐＢＳ ｐＨ７．０及び酢酸緩衝液ｐＨ４．５）を調製し、試験を行った。
ＥＬ：洗浄用緩衝液によって洗浄した後のＲｅＢＯＳＳＩＳに、さらに溶出用緩衝液を供し、ＲｅＢＯＳＳＩＳを通過させた溶出用緩衝液を回収することにより得られるサンプル（Ｅｌｕｔｉｏｎ）
タンパク質の結合能の評価（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）

ｔＢＭＰ－２（またはＢＳＡ）のＲｅＢＯＳＳＩＳへの結合をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより評価し、染色溶液を用いてタンパク質バンドを検出した。検出されたタンパク質は、レーンにバンドとして現れる。タンパク質の量が既知の試料と、タンパク質の量が分かっていない試料の電気泳動のバンドのシグナル強度を比較することにより、タンパク質の量を定量的に推定することができる。画像解析用のソフトを使用することにより、シグナルの強度を定量的に評価することができる。

この実験では、目視観察によってゲル画像を比較した。タンパク（ｔＢＭＰ－２又はＢＳＡ）を青色で染色することにより、レーンに表示された青色のバンドが得られた。バンドが濃いことは、タンパク質の量が多いことを示す。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥの泳動条件は、１３０Ｖの定電圧とした。泳動用ゲルにはＮｕＰＡＧＥ ４－１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓタンパク質ゲル、１．０ｍｍ、１２ウェル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｃａｔ＃ＮＰ０３２２ＢＯＸ）、泳動用緩衝液にはＮｕＰＡＧＥ ＭＯＰＳ ＳＤＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（２０Ｘ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｃａｔ＃ＮＰ０００１）を使用した。電気泳動が終了後、タンパク質を染色するための染色液として、Ｇｅｌｃｏｄｅ Ｂｌｕｅ Ｓａｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｃａｔ ＃ ２４５９６）を使用した。

図２に示すように、パネルＡは、洗浄緩衝液に酸性緩衝液（酢酸緩衝液）を用いた場合のサンプルについて電気泳動を行うことにより得られたゲル画像を示し、パネルＢは、洗浄緩衝液に中性緩衝液（ＰＢＳ）を用いた場合のサンプルについて電気泳動を行うことにより得られたゲル画像を示す。各ゲルイメージでは、右の４レーンはｔＢＭＰ－２の分析結果を示し、左の４レーンはＢＳＡの分析結果を示している。

Ｌｄレーン（ローディングサンプル）では、ｔＢＭＰ－２およびＢＳＡのメインバンドの位置を特定することができる。ｔＢＭＰ－２またはＢＳＡがＦＴ、Ｗ、またはＥＬレーンに含まれる場合、そのバンドはＬｄレーンのバンドの位置と同じ位置に表示されることが予想される。

図２において、点線で囲まれた部分は、条件ＡでＢＳＡを用いて調製したサンプルのゲルイメージを示しており、ＢＳＡのメインバンドの位置は、ＢＳＡメインバンドと表記された長方形の実線ボックスによって示されている。各レーンにおけるＢＳＡのメインバンドの強度の比較から、ＦＴ及びＬｄレーンは同等程度のタンパク質量を示しており、ほとんどのＢＳＡはＲｅＢＯＳＳＩＳに結合せずに通過していることを示している。すなわち、ＢＳＡはネガティブコントロールとして振舞い、ＲｅＢＯＳＳＩＳ繊維には結合しない。ＷレーンとＥＬレーンは、ＢＳＡバンドがやや確認できるものの、ＷレーンとＥＬレーンのＢＳＡバンドのレベルはＬｄレーンのレベルと比べてかなり低く、ＢＳＡはＲｅＢＯＳＳＩＳにほとんど結合しないことを示している。

中性ｐＨの緩衝液を洗浄バッファーとして用いた場合（パネルＢ）、ＢＳＡはＲｅＢＯＳＳＩＳに非特異的に結合することを示している。ほとんどのＢＳＡはフロースルー画分（ＦＬ）において回収されており、このことは、ほとんどのＢＳＡがＲｅＢＯＳＳＩＳファイバーに結合しないことを示す。洗浄バッファーによる画分（Ｗ）では、一部のＢＳＡが引き続き回収されているが、その量はフロースルー画分（ＦＬ）で回収された量より少ない。溶出バッファーによる画分（ＥＬ）で回収される量はさらに少ない。これらの結果は、ＢＳＡはＲｅＢＯＳＳＩＳ繊維に対して非特異的に結合していることを示している。

これに対し、ｔＢＭＰ－２はＲｅＢＯＳＳＩＳによく結合しており、酸性又は中性緩衝液のいずれを洗浄バッファーとして用いた場合でも、フロースルー（ＦＴ）又は洗浄（Ｗ）の画分からはｔＢＭＰ－２はほぼ含まれておらず、溶出後（Ｅ）にのみ結合していたｔＢＭＰ－２が回収された。（図２、パネルＡ及びパネルＢ）。このことは、ｔＢＭＰ－２がＲｅＢＯＳＳＩＳに特異的に結合していることを示している。

この実験から、ｔＢＭＰ‐２はＲｅＢＯＳＳＩＳ繊維にタイトに結合すること、およびＲｅＢＯＳＳＩＳ繊維に結合したｔＢＭＰ－２は酸性または中性の洗浄バッファーによってＲｅＢＯＳＳＩＳ繊維から分離されないことが確認された。

この実験から、中性および酸性のいずれの条件においても、ｔＢＭＰ－２の９８％以上がＲｅＢＯＳＳＩＳに結合され、保持されていることが確認された。このことは、破骨細胞によるカルシウム成分の吸収の影響下においても、ｔＢＭＰ－２のＲｅＢＯＳＳＩＳへの結合が持続することを意味する。
ｔＢＭＰ－２とｒｈＢＭＰ（ＩＮＦＵＳＥ）との保持比較

この実験は、ｔＢＭＰ－２およびｒｈＢＭＰ－２（ＩＮＦＵＳＥ）の結合能を各ＲｅＢＯＳＳＩＳ繊維について比較するためのものである。下表のとおり、いくつかの組成比率の綿状物について比較試験を行った。

結合性能を確認するための試験のプロトコルは上記の通り。図３は、ｔＢＭＰ－２を様々な材料に結合させた結果を示す。β－ＴＣＰ及び／又はＳｉＶ（シロキサンを含有するバテライト）を含有する材料（ＳＩＶ７０、ＲｅＢＯＳＳＩＳ（８５）及びＯＲＢ－０３）には、ｔＢＭＰ－２が十分に保持されている。ｔＢＭＰ－２の保持は、ＢＳＡとは明らかに異なる。

図４は、組換えヒトＢＭＰ－２（ｒｈＢＭＰ－２）の結果を示している。ｒｈＢＭＰ－２は、β－ＴＣＰ（ＲｅＢＯＳＳＩＳ（８５）およびＯＲＢ－０３）を含む材料には保持されるが、ＳｉＶを含む材料には保持されない。ｒｈＢＭＰ－２の結合能はｔＢＭＰ－２の結合能より弱い。それにもかかわらず、ｒｈＢＭＰ－２は、ＲｅＢＯＳＳＩＳで使用するのに依然として良好である。その理由は、ＲｅＢＯＳＳＩＳによるｒｈＢＭＰ－２の保持はｔＢＭＰ－２の保持よりも少ないため、ｔＢＭＰ－２が治療部位から漏れる可能性は低いと予測することができるためである。したがって、本発明の好ましい実施形態は、ｒｈＢＭＰ－２（例えば、ＩＮＦＵＳＥ Ｂｏｎｅ Ｇｒａｆｔ）と比較して、副作用が（もしあれば）より少ない副作用を有するｔＢＭＰ－２を使用することができる。
慢性ヤギ脛骨欠損（ＣＣＴＤ）モデルにおけるＲｅＢＯＳＳＩＳ／ｔＢＭＰ－２の評価

骨修復におけるｔＢＭＰ－２／ＲｅＢＯＳＳＳの有用性を評価するために、ＲｅＢＯＳＳＩＳ上のターゲット型ＢＭＰ－２（ｔＢＭＰ－２）の有効性をＣＣＴＤモデルで評価した。これは、挑戦的な長骨部分欠損ヤギモデルである。埋植部位での表面に結合されたｔＢＭＰ－２の局所保持の長期化は、長骨部分欠損を是正する整形外科手術の安全性と有効性を、現行の慣行に比べて改善することが期待される。
スタディデザイン
動物の選択

試験には４０～６０ｋｇのヤギ（Ｓｐａｎｉｓｈ Ｂｏｅｒ種）１２頭を使用した。以下の３つの試験群に分けられた：
グループ１ ＴＣＰ＋ＲｅＢＯＳＳＩＳ＋ＢＭＡのみ
グループ２ ＴＣＰ＋ＲｅＢＯＳＳＩＳ＋ＢＭＡ＋ｔＢＭＰ－２ ＠０．１５ｇ／ｃｃ欠陥
グループ３ ＴＣＰ＋ＲｅＢＯＳＳＩＳ＋ＢＭＡ＋ｔＢＭＰ－２ ＠１．５ｇ／ｃｃ欠陥
ＴＣＰ、リン酸三カルシウム顆粒； ＢＭＡ、骨髄吸引液
ＣＣＴＤモデル

ＣＣＴＤモデルは、大動物モデルのハードルを「上げる」ことを目的としており、現在の大きな骨欠損に対する治療法が容認できない頻度で失敗し続けている厳しい臨床生物学的環境に、よりよくマッチするように設計されている。

ＣＣＴＤモデルには、骨の臨界サイズ（５ｃｍ）の脛骨部位の欠損が含まれている。ＣＣＴＤモデルには急性欠損モデルとは異なるいくつかの特徴がある。
１．欠損部位の各端から２ｃｍの骨膜を切除し、９ｃｍの骨膜セグメント（５ｃｍの欠損＋両側２ｃｍ）を作成し、
２．欠損部位の周囲に１０ｇの骨格筋を配置し、
３．髄内管をリーミングして欠損部位に隣接する骨髄と骨内膜を除去し、
４．移植前に４週間、ＰＭＭＡスペーサーを欠損部に配置します。これにより繊維状の“誘導膜”（ＩＭ）または“マスカレット膜”によってスペーサーを包み込むことができる。
５．各動物は、これらの生物学的条件を作成するための「前処置」と、臨床的に関連する処置シナリオを実施することができる「処置手順」としてここで定義されている２つの手術を受ける。

図５は、Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｃａｐｒｉｎｅ臨界欠陥（ＣＣＴＤ）モデルの概略を示している。前処置の間に骨格が成熟した雌ヤギに５ｃｍの大欠損セグメントを作製する。欠陥には、長さ５ｃｍ×直径２ｃｍのポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）スペーサーが生体膜を誘導するために配置されている。４週間後、ＰＭＭＡスペーサーを緩やかに取り外し、骨充填剤と交換する。欠損部の治癒を評価するために、４週間ごとに直行Ｘ線写真を撮影する。図では、ＡＰは頭尾方向を表し、ＭＬは中外測方向を表す。白い矢印は、ＰＭＭＡスペーサーを配置する際の骨充填剤を示す。

前処理は、以下の本質的な特徴からなる。
１．頭尾方向に皮膚切開を作成し、脛骨骨幹部および骨膜にたいして５ｃｍのセグメントを切除
２．近位および遠位の骨セグメント上のさらに２ｃｍの骨膜を切除。
３．前脛骨筋と腓腹筋を１０ｃｍ３切除。
４．５ｃｍの欠損を維持するために、カスタムスペーサークランプを用いたインターロッキング髄内釘を配置。
５．欠損部の爪の周りに、あらかじめ成形した長さ５ｃｍ×直径２ｃｍのＰＭＭＡスペーサーを配置。
６．創部に一般的な生理食塩水（０．９％）を注入し、創部を閉鎖。

前処置の４週間後に実施される処置手順は、次の通りである：
１．脛骨の頭蓋側面で前回の皮膚切開を開く。
２．ＰＭＭＡスペーサーの周囲に“誘導膜”を“ボムベイ・ドア・オープニング（ｂｏｍｂ ｂａｙ ｄｏｏｒ ｏｐｅｎｉｎｇ）”を使用して開く。
３．メンブレンや爪を傷つけずにスペーサーを除去する。
４．以下に定める適切な組織サンプルの収集。
５．欠損部に適切な治療法を配置。
６．誘導された膜を３－０ナイロンで閉鎖し、内在性マーカーと創傷閉鎖を提供。
放射線分析：

脛骨、頭尾方向（ＡＰ）および内外側（ＭＬ）投影の透視画像撮影を、スペーサー処置（０週）、埋植処置（４週）、および経過観察（８週および１２週）後に実施した。Ｘ線写真は、術後１２週安楽死させた後（軟部組織の解剖後）に取得した。
サンプルの準備

サンプル構成：５ｃｃ ＴＣＰ＋５０ｃｃ ＲｅＢＯＳＳＩＳ＋６ｃｃ ＢＭＡ（ｔＢＭＰ－２の有無に依らない）。
ｔＢＭＰ－２のＲｅＢＯＳＳＩＳへの結合
１．無菌環境下で、５０ｃｃのＲｅＢＯＳＳＩＳをシャーレに入れて、均一な層になるように広げる。；
２．露出した表面の上で静かにピペッティングすることによりＲｅＢＯＳＳＩＳに３０ｍＬの結合バッファーを追加し、溶液中にＲｅＢＯＳＳＩＳを浸漬し、２０分間結合させる。
３．１０ｍＬピペットを垂直に持ち、チップの先を表面に押し当てることによって、３０ｍＬの結合バッファーを除去する。表面を押さえながら注意深く液を吸い取る。ピペットを別の場所に移動させ、できるだけ多くの液体を回収するようにする。回収量を記録する。
４．４０ｍｌの滅菌されたＰＢＳをＲｅＢＯＳＳＩＳに加え、１０分間洗浄する。手順２と同様に加える；
５．手順３に記載されているように１０ｍｌのピペットを用いて４０ｍｌのＰＢＳを取り除き、５０ｍｌのコニカルチューブにＰＢＳを保管する；
６．手順４－５をもう１回繰り返す；
７．シャーレに蓋をし、端をパラフィルムで覆い、ｔＢＭＰ－２／ＲｅＢＯＳＳＩＳを密閉する。
ｔＢＭＰ－２のＴＣＰへの結合
１．ＴＣＰの所望の量を測定し、滅菌チューブに入れる。
２．チューブに７０％エタノールを充填し、２～４時間または一晩インキュベートすることによって、ＴＣＰを滅菌する。
３．アルコールを除去するために、滅菌された二段蒸留水で繰り返し３回洗浄。
４．ＴＣＰをＴＣＰ結合バッファー（１０ｍＭ 酢酸ナトリウム ｐＨ４．７５，１００ｍＭ ＮａＣｌ）で５分間、穏やかに攪拌しながら洗浄。
５．ＴＣＰを滅菌ＰＢＳで洗浄し、ＴＣＰ結合バッファーを除去。
６．チューブ内のＴＣＰに適量のｔＢＭＰ－２を添加。
７．ＴＣＰを覆うのに十分なＴＣＰ結合バッファーを追加。
８．２時間、穏やかに混合。
９．ＴＣＰ結合バッファーを除去するためにＰＢＳ繰り返し２回洗浄。
１０．ｔＢＭＰ－２／ＴＣＰを無菌容器に４℃で保管。
術時
１．ｔＢＭＰ－２／ＲｅＢＯＳＳＩＳを入れたディッシュを１枚開く。
２．同じディッシュの隅に、ｔＢＭＰ－２でコーティングされたＴＣＰ ５ｃｃを静かに移す。その後、骨髄吸引駅６ｃｃをＴＣＰに加え、均等に分散させる。
３．滅菌済みのスパーテルを用いてｔＢＭＰ－２／ＴＣＰ／ＢＭＡをＲｅＢＯＳＳＩＳ上に移し、それらがＲｅＢＯＳＳＩＳ上で全体にわたって均等に広がっていることを確認する。
４．上述のｔＢＭＰ－２／ＴＣＰ／ＢＭＡが均等に細かい小石の層のようにＲｅＢＯＳＳＩＳ上に分布しているので、滅菌済みの手袋を用いて穏やかに押し固める。
５．ＲｅＢＯＳＳＩＳをブリトーのようにそっとロールアップし、必要に応じて混ぜて形を整える。
結果

ＲｅＢＯＳＳＩＳを添加することにより、埋植材料の外科的取扱い性が大幅に向上した。ｔＢＭＰ－２を含むグループ（グループ２及び３）はグループ１と比較してより高いパーセンテージの新生骨形成を示した。図６Ａは埋植から８週間後、図６Ｂは埋植後１２週で撮影されたに撮影されたＸ線写真（内側（ＭＬ）および頭尾方向（ＡＰ））を示す。各群につき、６頭のヤギを使用した。

埋植後のＸ線写真では、グループ１（ＴＣＰ＋ＲｅＢＯＳＳＩＳ＋ＢＭＡ）の４頭のヤギ全てで欠損部位に新しい骨は得られなかった。グループ２（低用量ｔＢＭＰ－２）では、４頭のヤギのうち１頭は欠損部位での新生骨の形成が約７５％であり、残り３頭では２５％以下であった。グループ３（高用量ｔＢＭＰ－２）では、２頭のヤギが骨癒合を呈し、残り２頭のヤギが５０％未満の新生骨を呈した。これらのデータは、スキャフォールドへのｔＢＭＰ－２の添加が新生骨の形成を増加させたことを示している。

図７は、固定Ｘ線装置で撮影した１２本の摘出脛骨のＸ線写真（内側（ＭＬ）および頭尾方向（ＡＰ））を示している。高用量のｔＢＭＰ－２群（１．５ｍｇ／ｃｃ）では、大量の新しい骨が得られた。

これらの結果に示されるように、ＲｅＢＯＳＳＩＳは埋植材料の外科的な操作性を大幅に向上させた。ＴＣＰおよびＲｅＢＯＳＳＩＳへのｔＢＭＰ－２の添加は、ＣＣＴＤモデルにおける骨治癒を向上させた。これらの結果は、本発明の実施形態が、骨修復のために現在使用されている材料よりも優れているであろうことを示している。これらの特定の実施例はｔＢＭＰ－２を使用しているが、ｒｈＢＭＰ－２は、以前に実証されたのと同じ結果をもたらすであろう。

図１１および図１２は、本発明の実施形態を使用して、向上された骨修復のための可能なプロセスを示す概略図である。簡単に述べれば、骨欠損部位にｔＢＭＰ－２溶液中に浸漬されたＲｅＢＯＳＳＩＳを入れた後、繊維の表面は、体溶液中に存在する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質または接着タンパク質によって被覆されていると考えられる。骨微小環境中の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、接着タンパク質によって被覆された繊維の表面に接着する。ＭＳＣはまた、それ自身のＥＣＭを形成するタンパク質を産生するかもしれない。ｔＢＭＰ－２はＭＳＣが骨芽細胞に分化するように誘導し、その後、骨芽細胞はカルシウムが豊富な環境下で骨を形成する。

本発明の実施形態は、限られた実施例を用いて例示されているが、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、他の修正及び変形が可能であることを理解する。したがって、保護の範囲は、添付の請求項によってのみ限定されるべきである。

Claims (9)

1. 複数の電界紡糸された生分解性繊維から形成された骨誘導性骨再生用材料を製造する方法であって、
   
   前記複数の電界紡糸された生分解性繊維から形成される繊維状足場材料を作製し、前記複数の電界紡糸された生分解性繊維は、直径40～320μm、長さ5～20mmであり、
   
   前記複数の電界紡糸された生分解性繊維は互いに絡み合って繊維間空間を有する綿形状構造を形成して、細胞成長のための微小環境をその中に形成しており、
   
   前記電界紡糸された生分解性繊維は43～60vol%のβ-TCP粒子が前記生分解性繊維中に分散して含有されており、前記β-TCP粒子の一部がポリマー層によって被覆されることなく前記電界紡糸された生分解性繊維の表面に部分的に露出されており、
   
   前記繊維状足場材料をBMP-2を含む溶液中に浸漬して、前記BMP-2が前記綿形状構造全体に微小環境を形成している前記繊維の表面に露出している前記β-TCP粒子に結合して、前記骨誘導性骨再生用材料を作製し、
   
   前記電界紡糸された生分解性繊維の表面に露出したβ-TCP粒子上のBMP-2の結合サイトの面積は、前記電界紡糸された生分解性繊維に含まれるβ-TCP粒子の量によって調節されている、
   
   前記複数の電界紡糸された生分解性繊維から形成された骨誘導性骨再生用材料を製造する方法。
   
2. 前記複数の電界紡糸された生分解性繊維の直径が70～250μmである、請求項1に記載の方法。
   
3. 前記複数の電界紡糸された生分解性繊維がPLGAを含む、請求項1又は２に記載の方法。
   
4. 前記β-TCP粒子の直径が2～5μmである、請求項1～３のいずれか一項に記載の方法。
   
5. 複数の電界紡糸された生分解性繊維を含む骨誘導性骨再生材料であって、
   
   前記複数の電界紡糸された生分解性繊維は、直径40～320μm、長さ5～20mmであり、
   
   前記複数の電界紡糸された生分解性繊維は互いに絡み合って繊維間空間を有する綿形状構造を形成して、細胞成長のための微小環境をその中に形成しており、
   
   前記電界紡糸された生分解性繊維は45～60vol%のβ-TCP粒子が前記生分解性繊維中に分散して含有されており、前記β-TCP粒子の一部がポリマー層によって被覆されることなく前記電界紡糸された生分解性繊維の表面に部分的に露出されており、
   
   前記電界紡糸された生分解性繊維の表面に部分的に露出した前記β-TCP粒子にBMP-2が結合しており、
   
   前記電界紡糸された生分解性繊維の表面に露出された前記β-TCP粒子上の前記BMP-2の結合サイトの面積は、前記複数の電界紡糸された生分解性繊維に含まれるβ-TCP粒子の量によって調節されている、
   
   前記複数の電界紡糸された生分解性繊維を含む、骨誘導性骨再生材料。
   
6. 前記複数の電界紡糸された生分解性繊維の直径が70～250μmである、請求項５に記載の骨誘導性骨再生材料。
   
7. 前記電界紡糸された生分解性繊維はPLGAを含む、請求項５又は６に記載の骨誘導性骨再生材料。
   
8. 前記β-TCP粒子の直径が2～5μmである、請求項５～７のいずれか一項に記載の骨誘導性骨再生材料。
   
9. 前記BMP-2が、配列番号1-38のいずれか1つ、または配列番号1-38からの2以上の配列の組み合わせを含む、請求項５～８のいずれか1項に記載の骨誘導性骨再生材料。
   

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