JP7253110B2 - 骨誘導性骨再生材料およびその製造方法 - Google Patents
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Description
QAKQRKQRKHKRKQRKHKSKRFVDFVDWNDVAPPGYHAFPGYHAFCHGECPLADHLNSTNHAVNSVNSKIPCCVPTELSAISMLYLDENEKVLKNYQDMVGCGCR(配列番号:32)を含む。いくつかの実施形態では、ターゲット型BMP-2は配列番号33~38のいずれか1つを含む。いくつかの実施形態ではターゲット型BMP-2は、配列番号33を含む。いくつかの実施形態では、カルシウム含有化合物は、リン酸カルシウム、バテライト、またはリン酸カルシウムおよびバテライトを含む。いくつかの実施形態では、カルシウム含有化合物はβ-リン酸三カルシウム(β-TCP)を含む。いくつかの実施形態において、β-TCPは足場中に足場材の約60重量%~約80重量%存在する。いくつかの実施形態において、β-TCPは、約70重量%足場中に存在する。いくつかの実施形態において、β-TCPは、足場材の約30重量%~約50重量%で足場中に存在する。いくつかの実施形態において、β-TCPは、足場材の約40重量%で足場中に存在する。いくつかの実施形態において、カルシウム含有化合物は、バテライトを含む。いくつかの実施態様において、バテライトは、足場材の約20重量%~40重量%で足場中に存在する。いくつかの実施態様において、バテライトは、約30重量%足場中に存在する。いくつかの実施形態において、バテライトはSiV(ケイ素ドープバテライト)を含む。いくつかの実施態様において、足場材は、生分解性ポリマーを含む。いくつかの実施形態において、足場材は、ポリ(乳酸-コグリコール酸)(PLGA)を含む。いくつかの実施形態では、足場材は、約20重量%~約40重量%のPLGAを含む。いくつかの実施態様において、足場材は、約30重量%のPLGAを含む。さらに、本明細書に提供される組成物および/または構造で被験体を治療する方法が提供される。例えば、対象の骨欠損を治療するため。
非限定的な例として、β-TCP結合ペプチドは、LLATHWTHVISIHGHPGTHGLGHTHWGHGHGHGHGHGILESHKPWTHPWT(配列番号:27)、LLADTTHHRPWTVIGESTHHRPWS(配列番号28)、LLADTTHHRPWTVIGESTHHRPWS(配列番号29)、LLADTTHHRPWTVIGESTHHRPWS(配列番号30)、およびVIGESTHHWSIHPKLGDLGDHGITHKPWT(配列番号31)を含む。さらなる例として、β-TCP結合ペプチドは、第1のペプチドが配列番号:1を含み、第2のペプチドが配列番号:23、24、25または26のうちの1つまたは複数を含み、第2のペプチドが配列番号:1、25または26のうちの1つまたは複数を含み、第1のペプチドが配列番号:25を含み、第2のペプチドが配列番号:23、24、1または26のうちの1つまたは複数を含み、第1のペプチドが配列番号:26を含み、第2のペプチドが配列番号:23、24、25のうちの1つまたは複数を含む。第1のペプチドは配列番号1を含み、第2のペプチドは配列番号23、24、25又は26の2以上を含み、第1のペプチドは配列番号を含む:第1のペプチドは配列番号1、24、25または26のうちの2つ以上を含み、第2のペプチドは配列番号23、25または26のうちの2つ以上を含み、第2のペプチドは配列番号23、24、1または26のうちの2つ以上を含み、第2のペプチドは配列番号23、24、25または1のうちの2つ以上を含み、第2のペプチドは配列番号23、25または26のうちの3つ以上を含み、第1のペプチドは配列番号23、24、25のうちの3つ以上を含む。第1のペプチドは配列番号24を含み、第2のペプチドは配列番号23、1、25または26のうちの3つ以上を含み、第1のペプチドは配列番号25番目のペプチドは配列番号23、24、1または26の3つ以上を含み、2番目のペプチドは配列番号26を含み、2番目のペプチドは配列番号23、24、25または1の3つ以上を含む。
ReBOSSIS
一部のβ-TCP粒子が繊維上に露出していることの確認
方法
・PLGA 30重量%、β-TCP 70重量% 又は
・PLGA 50重量%、β-TCP 50重量%
tBMP-2
MPIGSLLADTTHHRPWTVIGESTHHRPWSIIGESSHHKPFTGLGDTTHHRPWGILAESTHHKPWTASGAGGSEGGGSEGGTSGATGAGTSTSGGGASTGGGTGQAKHKQRKRLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR(配列番号33),LLADTTHHRPWTVIGESTHHRPWSIIGESSHHKPFTGLGDTTHHRPWGILAESTHHKPWTASGAGGSEGGGSEGGTSGATGAGTSTSGGGASTGGGTGQAKHKQRKRLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR(配列番号34),VIGESTHHRPWSIIGESSHHKPFTGLGDTTHHRPWGILAESTHHKPWTASGAGGSEGGGSEGGTSGATGAGTSTSGGGASTGGGTGQAKHKQRKRLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR(配列番号35),IIGESSHHKPFTGLGDTTHHRPWGILAESTHHKPWTASGAGGSEGGGSEGGTSGATGAGTSTSGGGASTGGGTGQAKHKQRKRLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR(配列番号36),GLGDTTHHRPWGILAESTHHKPWTASGAGGSEGGGSEGGTSGATGAGTSTSGGGASTGGGTGQAKHKQRKRLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR(配列番号37),and ILAESTHHKPWTASGAGGSEGGGSEGGTSGATGAGTSTSGGGASTGGGTGQAKHKQRKRLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR(配列番号38)を含む。
BMP-2のReBOSSISへの結合
巨視的に見ると、粒子の一部が繊維の表面の外部に露出している。
準備
1.ReBOSSIS10mgをスピンチューブに秤量;
2.BSAを調製する:BSAストック29μlを採取し、酢酸緩衝液971μlを加えて、pH4.75で1.22mg/mlのBSA希釈溶液を得る。
3.各チューブに500μlの酢酸塩洗浄緩衝液を添加することにより、酢酸塩洗浄緩衝液中でReBOSSISを予備洗浄する。ウェルを回転させて混合し、5分間インキュベートする。マイクロフュージの中で遠心沈殿させる。緩衝液を取り除くために、先端を管の底部に置いて。ReBOSSISはチューブ内に残る。
4.Gelサンプル:後のSDS-PAGE分析のために、一部のBSAロードとtBMP-2ロードを除外する。
評価
5.予め洗浄したReBOSSIS10mgにtBMP-2 200μgを加え、総容量は164μlとする;
6.10mgの予め洗浄したReBOSSISに200μgのBSAを総量164μlで添加する。
結合されていない材料を回収
8.マイクロフュージで最高速度で4-5分間管をスピンする。
9.ピペットをチューブの上部の上清に挿入し、結合していないものをチューブにピペットで取り出す。(注:ピペットチップにReBOSSISが入っていないことを確認してください。余分な量を取り出してゲルを流し、管の底部にチップを入れ、残りを廃棄します。);
洗浄
10.PBS又はアセテート洗浄緩衝剤のいずれかの500マイクロルを加える;
11.ジェネリー・ボルテックス。終了後に5分間混合し、その後再度緩やかに離婚する;
12.マイクロフュージで最高速度で4-5分間スピニング管を抜き出す。洗浄を継続する;
溶出
13.164μlの非還元性1X SDS PAGEゲル色素(BMP2ダイマーを破壊するようなβ-メルカプトエタノールを含まない)を添加することにより溶出する;
14.ボルテックス、5分間インキュベート、リピートボルテックス;
15.溶出物をマイクロフュージで最高速度で4-5分間スピニング管で回収する;
16.ReBOSSIS Load:10μl、Non-Bound 10μl、Wash 10μl、Elution 11μlのようにゲルをロードします。
Ld:既知量のtBMP-2またはBSAを含む試料溶液(Loading)。
FT:LdをReBOSSISに供した後、ReBOSSISに保持されずに通過した画分を回収することにより得られたサンプル(Flow Through)
W:たん白質を保持しているReBOSSISを通過させた洗浄用緩衝液を回収することによって得られたサンプル(Wash)。
ReBOSSISに結合したタンパク質が洗浄緩衝液によって解離する場合、洗浄後に流出した画分は解離したタンパク質を含有する。
埋植部位のpH環境が酸性または中性であるとし、2種類の洗浄用緩衝液(pBS pH7.0及び酢酸緩衝液pH4.5)を調製し、試験を行った。
EL:洗浄用緩衝液によって洗浄した後のReBOSSISに、さらに溶出用緩衝液を供し、ReBOSSISを通過させた溶出用緩衝液を回収することにより得られるサンプル(Elution)
タンパク質の結合能の評価(SDS-PAGE)
tBMP-2とrhBMP(INFUSE)との保持比較
慢性ヤギ脛骨欠損(CCTD)モデルにおけるReBOSSIS/tBMP-2の評価
スタディデザイン
動物の選択
グループ1 TCP+ReBOSSIS+BMAのみ
グループ2 TCP+ReBOSSIS+BMA+tBMP-2 @0.15g/cc欠陥
グループ3 TCP+ReBOSSIS+BMA+tBMP-2 @1.5g/cc欠陥
TCP、リン酸三カルシウム顆粒; BMA、骨髄吸引液
CCTDモデル
1.欠損部位の各端から2cmの骨膜を切除し、9cmの骨膜セグメント(5cmの欠損+両側2cm)を作成し、
2.欠損部位の周囲に10gの骨格筋を配置し、
3.髄内管をリーミングして欠損部位に隣接する骨髄と骨内膜を除去し、
4.移植前に4週間、PMMAスペーサーを欠損部に配置します。これにより繊維状の“誘導膜”(IM)または“マスカレット膜”によってスペーサーを包み込むことができる。
5.各動物は、これらの生物学的条件を作成するための「前処置」と、臨床的に関連する処置シナリオを実施することができる「処置手順」としてここで定義されている2つの手術を受ける。
1.頭尾方向に皮膚切開を作成し、脛骨骨幹部および骨膜にたいして5cmのセグメントを切除
2.近位および遠位の骨セグメント上のさらに2cmの骨膜を切除。
3.前脛骨筋と腓腹筋を10cm3切除。
4.5cmの欠損を維持するために、カスタムスペーサークランプを用いたインターロッキング髄内釘を配置。
5.欠損部の爪の周りに、あらかじめ成形した長さ5cm×直径2cmのPMMAスペーサーを配置。
6.創部に一般的な生理食塩水(0.9%)を注入し、創部を閉鎖。
1.脛骨の頭蓋側面で前回の皮膚切開を開く。
2.PMMAスペーサーの周囲に“誘導膜”を“ボムベイ・ドア・オープニング(bomb bay door opening)”を使用して開く。
3.メンブレンや爪を傷つけずにスペーサーを除去する。
4.以下に定める適切な組織サンプルの収集。
5.欠損部に適切な治療法を配置。
6.誘導された膜を3-0ナイロンで閉鎖し、内在性マーカーと創傷閉鎖を提供。
放射線分析:
サンプルの準備
tBMP-2のReBOSSISへの結合
1.無菌環境下で、50ccのReBOSSISをシャーレに入れて、均一な層になるように広げる。;
2.露出した表面の上で静かにピペッティングすることによりReBOSSISに30mLの結合バッファーを追加し、溶液中にReBOSSISを浸漬し、20分間結合させる。
3.10mLピペットを垂直に持ち、チップの先を表面に押し当てることによって、30mLの結合バッファーを除去する。表面を押さえながら注意深く液を吸い取る。ピペットを別の場所に移動させ、できるだけ多くの液体を回収するようにする。回収量を記録する。
4.40mlの滅菌されたPBSをReBOSSISに加え、10分間洗浄する。手順2と同様に加える;
5.手順3に記載されているように10mlのピペットを用いて40mlのPBSを取り除き、50mlのコニカルチューブにPBSを保管する;
6.手順4-5をもう1回繰り返す;
7.シャーレに蓋をし、端をパラフィルムで覆い、tBMP-2/ReBOSSISを密閉する。
tBMP-2のTCPへの結合
1.TCPの所望の量を測定し、滅菌チューブに入れる。
2.チューブに70%エタノールを充填し、2~4時間または一晩インキュベートすることによって、TCPを滅菌する。
3.アルコールを除去するために、滅菌された二段蒸留水で繰り返し3回洗浄。
4.TCPをTCP結合バッファー(10mM 酢酸ナトリウム pH4.75,100mM NaCl)で5分間、穏やかに攪拌しながら洗浄。
5.TCPを滅菌PBSで洗浄し、TCP結合バッファーを除去。
6.チューブ内のTCPに適量のtBMP-2を添加。
7.TCPを覆うのに十分なTCP結合バッファーを追加。
8.2時間、穏やかに混合。
9.TCP結合バッファーを除去するためにPBS繰り返し2回洗浄。
10.tBMP-2/TCPを無菌容器に4℃で保管。
術時
1.tBMP-2/ReBOSSISを入れたディッシュを1枚開く。
2.同じディッシュの隅に、tBMP-2でコーティングされたTCP 5ccを静かに移す。その後、骨髄吸引駅6ccをTCPに加え、均等に分散させる。
3.滅菌済みのスパーテルを用いてtBMP-2/TCP/BMAをReBOSSIS上に移し、それらがReBOSSIS上で全体にわたって均等に広がっていることを確認する。
4.上述のtBMP-2/TCP/BMAが均等に細かい小石の層のようにReBOSSIS上に分布しているので、滅菌済みの手袋を用いて穏やかに押し固める。
5.ReBOSSISをブリトーのようにそっとロールアップし、必要に応じて混ぜて形を整える。
結果
Claims (9)
- 複数の電界紡糸された生分解性繊維から形成された骨誘導性骨再生用材料を製造する方法であって、
前記複数の電界紡糸された生分解性繊維から形成される繊維状足場材料を作製し、前記複数の電界紡糸された生分解性繊維は、直径40~320μm、長さ5~20mmであり、
前記複数の電界紡糸された生分解性繊維は互いに絡み合って繊維間空間を有する綿形状構造を形成して、細胞成長のための微小環境をその中に形成しており、
前記電界紡糸された生分解性繊維は43~60vol%のβ-TCP粒子が前記生分解性繊維中に分散して含有されており、前記β-TCP粒子の一部がポリマー層によって被覆されることなく前記電界紡糸された生分解性繊維の表面に部分的に露出されており、
前記繊維状足場材料をBMP-2を含む溶液中に浸漬して、前記BMP-2が前記綿形状構造全体に微小環境を形成している前記繊維の表面に露出している前記β-TCP粒子に結合して、前記骨誘導性骨再生用材料を作製し、
前記電界紡糸された生分解性繊維の表面に露出したβ-TCP粒子上のBMP-2の結合サイトの面積は、前記電界紡糸された生分解性繊維に含まれるβ-TCP粒子の量によって調節されている、
前記複数の電界紡糸された生分解性繊維から形成された骨誘導性骨再生用材料を製造する方法。
- 前記複数の電界紡糸された生分解性繊維の直径が70~250μmである、請求項1に記載の方法。
- 前記複数の電界紡糸された生分解性繊維がPLGAを含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記β-TCP粒子の直径が2~5μmである、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 複数の電界紡糸された生分解性繊維を含む骨誘導性骨再生材料であって、
前記複数の電界紡糸された生分解性繊維は、直径40~320μm、長さ5~20mmであり、
前記複数の電界紡糸された生分解性繊維は互いに絡み合って繊維間空間を有する綿形状構造を形成して、細胞成長のための微小環境をその中に形成しており、
前記電界紡糸された生分解性繊維は45~60vol%のβ-TCP粒子が前記生分解性繊維中に分散して含有されており、前記β-TCP粒子の一部がポリマー層によって被覆されることなく前記電界紡糸された生分解性繊維の表面に部分的に露出されており、
前記電界紡糸された生分解性繊維の表面に部分的に露出した前記β-TCP粒子にBMP-2が結合しており、
前記電界紡糸された生分解性繊維の表面に露出された前記β-TCP粒子上の前記BMP-2の結合サイトの面積は、前記複数の電界紡糸された生分解性繊維に含まれるβ-TCP粒子の量によって調節されている、
前記複数の電界紡糸された生分解性繊維を含む、骨誘導性骨再生材料。
- 前記複数の電界紡糸された生分解性繊維の直径が70~250μmである、請求項5に記載の骨誘導性骨再生材料。
- 前記電界紡糸された生分解性繊維はPLGAを含む、請求項5又は6に記載の骨誘導性骨再生材料。
- 前記β-TCP粒子の直径が2~5μmである、請求項5~7のいずれか一項に記載の骨誘導性骨再生材料。
- 前記BMP-2が、配列番号1-38のいずれか1つ、または配列番号1-38からの2以上の配列の組み合わせを含む、請求項5~8のいずれか1項に記載の骨誘導性骨再生材料。
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