TW202207951A - 骨誘導性的骨再生材料及其製備方法 - Google Patents

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Abstract

公開一種製造由多根電紡可生物分解纖維所組成的骨誘導性骨移植物的方法。該方法包括製備由多根電紡可生物分解纖維組成的一纖維支架材料，其中該多根電紡可生物分解纖維相互纏結以形成一具有纖維間空間的棉絮狀結構，在其中形成供細胞生長的微環境，然後將該纖維支架浸沒於包含BMP-2的溶液中，使BMP-2與暴露在纖維表面的鈣粒子結合。該電紡可生物分解纖維表面上暴露的鈣粒子，其上之BMP-2結合位點的面積係通過電紡可生物分解纖維中的鈣粒子含量來調節。

Description

骨誘導性的骨再生材料及其製備方法
本發明是關於骨誘導性(osteoinductive)的骨再生材料及製備所述骨誘導性骨再生材料的方法。
申請人之一一直在生產和銷售一種由包含β-TCP的可生物分解纖維組成的骨傳導性(osteoconductive)骨再生材料，商品名為ReBOSSIS®。該骨再生材料是利用電紡方法生產，其中一紡絲溶液從噴嘴成一細纖維噴出後，於電場中受靜電引力的拉扯沉積在一收集器上。利用一種新穎的電紡絲設置，申請人已成功的將該可生物分解纖維製成一棉絮狀(cotton wool-like)結構，該結構包含β-TCP和一可生物分解聚合物。該棉絮狀結構是獨一無二的且具有許多優點：(1)它包含大的間隙空間，使生物體液能輕易地滲透到骨移植物結構中，(2)它提供了大的表面積，使鈣和磷能隨時從β-TCP被釋放進入生物體液；(3)它具有彈性的結構，可以製成符合骨修復部位的形狀；同時(4)它提供了一大的表面積讓細胞附著。該棉絮狀複合材料作為骨替代材料的體內和體外評估已證明了它在修復複雜骨缺損方面的優勢。
骨成形蛋白-2(Bone morphogenetic protein-2，BMP-2)是骨誘 導性的並且可以促進骨形成/再生。例如，InfuseTM Bone Graft(Medtronic)包含有一種含有重組人類BMP-2(rhBMP-2)的人造骨移植物材料，已獲得食品和藥物管理局(FDA)的批准，可作為骨移植物於鼻竇增高術(sinus augmentation)和局部牙槽脊增加術(localized alveolar ridge augmentation)中使用。將BMP-2包含在骨植入物(INFUSE)中並遞送到骨折部位。BMP-2在該部位逐漸釋放進而刺激骨形成；BMPs刺激的生長是局部性的且會持續數週。如果BMP-2洩漏到遠處，將會產生不良影響。事實上，由rhBMP-2所引起的數種副作用曾被報導。這些副作用包含手術後的炎症和與其相關的不良反應、異位骨生成(ectopic bone formation)、破骨細胞(osteoclast)介導的骨吸收(osteoclast-mediated bone resorption)和不適當的脂肪生成(adipogenesis)。
因此，需要一種骨移植材料，其包含BMP-2之方式可使BMP-2逐漸釋放，以在預定的部位實現骨形成，但不會使所述生長因子在非預定的部位洩出。
為了解決現有技術中骨誘導性骨移植物的問題，本發明的發明人進行了深入研究進而發現暴露在ReBOSSIS®的可生物分解纖維表面上的β-TCP粒子並沒有覆蓋著一層薄聚合物。基於該發現，本發明的發明人的推斷β-TCP粒子暴露的部分可用於將BMP-2結合到粒子上。通過將BMP-2結合到β-TCP粒子，人們可以將ReBOSSIS®作為一種骨誘導性的骨再生材料的支架使用，該材料能讓BMP-2在骨缺損部位逐漸釋放，但不允許這種生長因子洩漏到非預定的部位。
本發明的實施例是關於骨誘導性的骨再生材料，其包含ReBOSSIS®纖維和骨成形蛋白-2(BMP-2)。本發明的實施例所使用的BMP可為BMP-2或BMP-2的衍生物。BMP-2可為一人類BMP-2或動物(例如寵物或家畜)的BMP-2。BMP-2的衍生物包含一BMP-2與一種或多種β-TCP結合肽融合所形成的一融合蛋白，其在本說明書中將稱為“可靶向的(targetable)BMP-2(targetable BMP-2)”或“tBMP-2”。這些所有不同形式的BMP-2，例如人類BMP-2(包含重組人類BMP-2，rhBMP-2和野生型的人類BMP-2，wtBMP-2)、動物的BMP-2、和tBMP-2，可統稱為“BMP-2”。即，“BMP-2”一詞包括rhBMP-2、wtBMP-2、動物的BMP-2和tBMP-2。
ReBOSSIS®具有由多根電紡可生物分解纖維所組成的棉絮狀結構，該可生物分解纖維的直徑為40-320μm、長度為5-20mm並包含鈣化合物粒子(例如β-TCP粒子)和可生物分解的聚合物如聚乳酸(poly(lactic acid)，PLLA)或聚乳酸-甘醇酸(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)。該可生物分解纖維可包含其他鈣化合物粒子，例如釋放矽的碳酸鈣六方方解石(vaterite)(即摻雜矽的六方方解石(silicon-doped vaterite)，SiV)。因此，ReBOSSIS®纖維可包含可生物分解的聚合物(例如PLLA和/或PLGA)和鈣化合物粒子(例如β-TCP粒子和/或SiV粒子)。本文所用的術語“鈣化合物粒子”可為β-TCP粒子、SiV粒子或β-TCP粒子和SiV粒子的組合。
ReBOSSIS®的電紡可生物分解纖維包含大量的鈣化合物粒子，分佈在纖維上或纖維內。一部分的β-TCP粒子暴露在纖維的表面， 形成不均勻的纖維表面形貌，而剩餘部分的β-TCP粒子則埋在纖維內。暴露在纖維表面的β-TCP粒子沒有覆蓋著一層薄聚合物。通過將ReBOSSIS®浸沒於一包含骨成形蛋白2(BMP-2，包括tBMP-2)的溶液中，BMP-2與暴露在纖維表面的β-TCP粒子和/或SiV粒子結合，從而使BMP-2被捕獲在暴露於ReBOSSIS®的纖維表面的β-TCP粒子和/或SiV粒子上，充斥於整個棉絮狀結構。
ReBOSSIS的可生物分解纖維的不均勻表面形貌有助於幹細胞附著於纖維上。通過增加或減少包含在電紡可生物分解纖維中β-TCP粒子的量，可以增加或減少暴露於電紡可生物分解纖維表面的β-TCP粒子上BMP-2的結合位點面積。
該可生物分解纖維的直徑約為40-320μm，較佳者約為70-250μm，更佳者為90-200μm，使得直徑約為2-5μm的鈣化合物粒子(例如，β-TCP和/或SiV粒子)可分佈在纖維中，同時該棉絮狀結構的機械強度在ReBOSSIS®植入骨缺損部位後仍可維持。
在本發明的一實施例中，可生物分解纖維的長度約為4至10mn。因為ReBOSSIS是由這種短的纖維相互纏結所形成的，所以可以輕易地用手將該棉絮狀結構分離成較小的片段。因此，外科醫生可以不使用刀具或剪刀，依據患者骨缺損的尺寸由ReBOSSIS中分離出所需的較小尺寸，製作棉絮狀材料。
較佳者，電紡可生物分解纖維的直徑係經調節，使得該纖維支架維持足夠的機械強度，且該纖維支架植入骨缺損部位後，該纖維支架的通道的平均尺寸在10-300μm的範圍內。本文所用的纖維支架的通道是 指纖維支架中由纖維之間的空間所形成的通道。
在骨缺損部位植入ReBOSSIS®後，包含間充質幹細胞(mesenchymal stem cells)的體液可能會進入與捕獲在β-TCP粒子上的BMP-2(例如，rhBMP-2或t-BMP-2)接觸。然後，BMP-2(例如，rhBMP-2或tBMP-2)促進骨前驅細胞(osteoprogenitor cells)分化為造骨細胞(osteoblast cells)。結合了BMP-2的β-TCP粒子可能會被破骨細胞(osteoclast cells)逐漸溶解。然後，造骨細胞在β-TCP粒子上作用以生成骨(即骨重塑(bone remodeling))。
在骨缺損部位植入ReBOSSIS®後，電紡纖維中的可生物分解聚合物(例如，PLLA和/或PLGA)逐漸降解，使得埋在纖維中的β-TCP粒子逐漸暴露，新暴露的β-TCP粒子可能會重新捕獲黏附在纖維表面的BMP-2(例如rhBMP-2或tBMP-2)。隨著聚合物降解的進行，由於新暴露的β-TCP粒子重新捕獲BMP-2(例如rhBMP-2或tBMP-2)，使得骨重塑在整個可生物分解纖維支架的網絡中不斷發生，致使骨缺損部位的有效骨形成。
由於BMP-2(例如rhBMP-2或tBMP-2)與固定在可生物分解纖維表面的β-TCP粒子結合，因而防止BMP-2洩漏到骨缺損區域外。因此，確保了使用BMP-2/ReBOSSIS®的安全性。
一方面，此發明提供了一種組合物包含：包含了約60wt%至約80wt%含鈣化合物的支架，和一可靶向的BMP-2，該可靶向的BMP-2包含(i)VIGESTHHRPWS(SEQ ID NO：23)、(ii)IIGESSHHKPFT(SEQ ID NO：24)、(iii)GLGDTTHHRPWG(SEQ ID NO：25)、(iv) ILAESTHHKPWT(SEQ ID NO：26)或(v)(i)-(iv)中的兩個或兩個以上的組合。在一些實施例中，可靶向的BMP-2包含VIGESTHHRPWS(SEQ ID NO：23)。在一些實施例中，可靶向的BMP-2包含IIGESSHHKPFT(SEQ ID NO：24)。在一些實施例中，可靶向的BMP-2包含GLGDTTHHRPWG(SEQ ID NO：25)。在一些實施例中，可靶向的BMP-2包含ILAESTHHKPWT(SEQ ID NO：26)。在一些實施例中，可靶向的BMP-2還包含LLADTTHHRPWT(SEQ ID NO：1)。在一些實施例中，可靶向的BMP-2包含
Figure 110122386-A0101-12-0006-55
Figure 110122386-A0101-12-0006-56
(SEQ ID NO：32)。在一些實施例中，可靶向的BMP-2包含SEQ ID NOS：33-38中的任何一個。在一些實施例中，可靶向的BMP-2包含SEQ ID NO：33。在一些實施例中，含鈣化合物包含磷酸鈣、六方方解石或磷酸鈣和六方方解石。在一些實施例中，含鈣化合物包含β-磷酸三鈣(β-TCP)。在一些實施例中，β-TCP以支架的約60wt%至約80wt%存在於支架中。在一些實施例中，β-TCP以約70wt%存在於支架中。在一些實施例中，β-TCP以支架的約30wt%至約50wt%存在於支架中。在一些實施例中，β-TCP以約40wt%存在於支架中。在一些實施例中，含鈣化合物包含六方方解石。在一些實施例中，六方方解石以支架的約20wt%至40wt%存在於支架中。在一些實施例中，六方方解石以約30wt%存在於支架中。在一些實施例中，六方方解石包含SiV(摻雜矽的六方方解石)。在一些實施例中，支架包含可生物分解的聚合物。在 一些實施例中，支架包含聚乳酸-甘醇酸(PLGA)。在一些實施例中，支架包含約20wt%至約40wt%的PLGA。在一些實施例中，支架包含約30wt%的PLGA。本發明還提供了使用本發明提供的組合物和/或結構治療個體的方法。例如，治療個體的骨缺損。
圖1A-1F展示ReBOSSIS®纖維的電子顯微鏡影像。圖1A展示數根ReBOSSIS(85)纖維(PLGA 30wt%、SiV 30wt%、β-TCP 40wt%)於200倍放大的影像，顯示了棉絮狀結構中纖維之間的間隙空間。圖1B展示了一根ReBOSSIS(85)纖維於2000倍放大的影像。可以輕易地辨識出纖維表面的鈣粒子。圖1C展示同一根纖維於5000倍的放大，其中白色箭頭指示β-TCP粒子，而黑色箭頭指示SiV粒子。圖1D展示數根纖維(PLGA 30wt%、β-TCP 70wt%)於200倍放大的影像。圖1E展示一根纖維(PLGA 30wt%，β-TCP 70wt%)於2000倍放大的影像。圖1F展示同一根纖維(PLGA 30wt%，β-TCP 70wt%)於5000倍的放大，其中白色箭頭指示β-TCP粒子。
圖2展示一張SDS-PAGE凝膠圖像，其說明了與對照組(牛血清蛋白，BSA)相比，具有SEQ ID NO：33序列的tBMP-2與ReBOSSIS(85)的結合。分圖A展示使用酸性緩衝液(醋酸鹽緩衝液)作為洗滌緩衝液獲得的凝膠圖像，分圖B展示使用中性緩衝液(磷酸鹽緩衝液，PBS)作為洗滌緩衝液獲得的凝膠圖像。在每張凝膠圖像中，右側的四個泳道顯示tBMP-2的分析結果，左側的四個泳道顯示BSA的分析結果。
圖3展示由具有SEQ ID NO：33的tBMP-2與數種含鈣材料結合的凝膠圖像。tBMP2與包含β-TCP和/或SiV的材料(SiV70、 ReBOSSIS(85)和ORB-03)結合良好。泳道1是標準品，泳道2是空的，泳道3-6顯示在低pH的醋酸鹽溶液洗滌後，與PLGA(泳道3)、SiV70(泳道4)、ReBOSSIS(85)(泳道5)或ORB-03(泳道6)結合的BSA的量，泳道7是空的，泳道8-11顯示在低pH的醋酸鹽洗滌後，與PLGA(泳道8)、SiV70(泳道9)、ReBOSSIS(85)(泳道10)或ORB-03(泳道11)結合的tBMP2的量，泳道12是空的。圖10描述此結合實驗的程序。
圖4展示rhBMP-2(重組人類B MP-2，沒有連接β-TCP結合肽)與數種含鈣材料結合的凝膠圖像。rhBMP-2主要保留在包含β-TCP的材料上(ReBOSSIS(85)和ORB-03)，但不保留在僅包含SiV的材料上。泳道1是標準品，泳道2是空的，泳道3-6顯示在低pH的醋酸鹽溶液洗滌後，與PLGA(泳道3)、SiV70(泳道4)、ReBOSSIS(85)(泳道5)或ORB-03(泳道6)結合的BSA的量，泳道7為空的，第8-11列顯示在低pH的醋酸鹽溶液洗滌後，與PLGA(泳道8)、SiV70(泳道9)、ReBOSSIS(85)(泳道10)或ORB-03(泳道11)結合的rhBMP-2的量，泳道12是空的。圖10描述此結合實驗的程序。
圖5展示慢性山羊臨界性缺損(Chronic Caprine Critical Defect，CCTD)模型的示意圖。預手術時，在骨骼成熟的雌性山羊身上製造一段5公分的臨界性缺損。將一長5公分x直徑2公分的聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate，PMMA)間隔物(spacer)放置在缺損處以誘導生成生物膜。四個星期後，將PMMA間隔物輕輕地移除並替換成移植材料。每4週拍攝一次正交放射線照片(orthogonal radiograph)以評估缺損癒合的情況。圖中，AP代表頭尾位，而ML代表內外位。白色箭頭指出放置於PMMA間隔物 處的移植材料。
圖6A-6B展示於移植手術8週(圖6A)和12週(圖6B)後所拍攝的放射線照片(內外位(ML)和頭尾位(AP)的投影)。每個治療組6隻山羊。與第1組(不含tBMP-2)相比，包含具有SEQ IS NO：33序列tBMP-2的組(第2組(0.15mg/cc tBMP2)和第3組(1.5mg/cc tBMP2))顯示出較高百分比的新骨形成。第1組的放射線照片顯示於第一個兩行，第2組的放射線照片顯示於第二個兩行，第3組的射線照片則顯示於圖中的最後兩行。
圖7展示用固定式x光機拍攝的12根移植過的脛骨的射線照片(內外位(ML)和頭尾位(AP)的投影)。在較高劑量的tBMP-2組(1.5mg/cc，第3組)中獲得了大量的新骨。在TCP和ReBOSSIS®中添加tBMP-2增強了CCTD模型中的骨癒合。第1組的放射線照片顯示於第一個兩行，第2組的放射線照片顯示於第二個兩行，第3組的射線照片則顯示於圖中的最後兩行。
圖8是滲流(percolation)現象的概念圖，說明當β-TCP粒子的量超過滲流閾值時，β-TCP粒子團簇的形成。
圖9A展示包含50wt%(24.3vol%)β-TCP粒子的電紡PLGA纖維的表面。圖9B展示包含70wt%(42.9vol%)β-TCP、粒子的電紡PLGA纖維的表面。圖9C展示包含80wt%(56.3vol%)β-TCP粒子的電紡PLGA纖維的表面。圖9D展示包含85wt%(64.6vol%)β-TCP粒子的電紡PLGA纖維的表面。
圖10展示解釋收集SDS-PAGE分析用樣品的方法的圖。
圖11展示根據本發明一實施例解釋骨再生機理的概念圖。
圖12展出根據本發明一實施例解釋骨再生機理的概念圖。
圖13A-13D展示之實驗結果，證明在含有70wt% β-TCP粒子的電紡可生物分解纖維表面上所暴露的β-TCP粒子，沒有覆蓋著聚合物。
圖14A-14E展示之實驗結果，證明在含有50wt% β-TCP粒子的電紡可生物分解纖維表面上所暴露的β-TCP粒子，沒有覆蓋著聚合物。
本發明的實施例是關於骨誘導性的骨再生材料，其包含鈣粒子(β-TCP和/或SiV)和骨成形蛋白-2(BMP-2，例如rhBMP-2或tBMP-2)。除此之外，本發明的骨再生材料具有一棉絮狀結構，使得結合於棉絮狀結構上大表面積的BMP-2可以在骨修復部位與生物體液相互作用，從而促進骨誘導的過程。
骨誘導涉及刺激骨前驅細胞分化成造骨細胞，然後造骨細胞開始新骨生成。相比之下，骨傳導則發生在骨移植物材料作為新骨生長的支架時，由缺損部位周圍天然骨邊緣的現有成骨細胞使新骨持續生長。
本發明的實施例可使用重組BMP-2(例如rhBMP-2)或可靶向的BMP-2。可靶向的BMP-2是一種融合了β-TCP結合肽的BMP蛋白(即融合蛋白)，使得BMP-2可在骨再生材料中與β-TCP緊密結合。β-TCP結合肽可以融合在BMP-2的N端或C端。
BMP-2具有很強的骨生成活性，應用於骨科，例如脊柱融合。然而，如果從治療部位洩出，BMP-2可能會在非預期的部位誘導骨形成。這些BMP-2相關的併發症發生頻率相對較高，從20%到70%的病例不 等，同時這些不良反應可能會危及生命。(Aaron W.James et al.,“A review of the Clinical Side Effects of Bone Morphogenetic Protein-2,”Tissue Eng.Part B Rev.,2016,22(4)：284-297)。因此，必須將BMP限制在治療部位，例如，通過將BMP-2牢固地結合到骨再生/修復材料上，且不允許BMP-2自治療部位擴散開。
本發明的實施例可使用各自含有一種或多種β-TCP結合肽的rhBMP-2或BMP-2融合蛋白。這些BMP-2融合蛋白稱為可靶向的BMP-2或tBMP-2。tBMP-2設計為與包含β-TCP和/或包含SiV的骨再生/修復材料一起使用，其中tBMP-2與β-TCP和/或SiV緊密結合，且不會從治療部位擴散開，從而消除或減少副作用。
本發明的骨再生/修復材料具有由可生物分解的纖維組成的棉絮狀結構，該纖維包含β-TCP和生物可分解的聚合物(例如，聚乳酸-甘醇酸；PLGA))。tBMP-2融合蛋白可以與這些棉絮狀結構上的β-TCP和/或SiV粒子緊密結合，且不會從治療部位擴散開。
該棉絮狀結構具有許多優點：(1)它包含大的間隙空間，使生物體液能輕易地滲透到骨移植物結構中，(2)它提供大的表面積，使β-TCP能隨時釋放鈣和磷到生物體液；(3)它提供大的表面積以支持/攜帶其他生物活性的因子或骨成形因子，如rhBMP-2或tBMP-2；且(4)它具有彈性的結構，可製成符合骨修復部位的形狀。
該棉絮狀結構由電紡一種包含一可生物分解的聚合物和β-TCP的溶液所製造。該棉絮狀結構的製成細節描述於美國專利第8,853,298號和第10,092,650號、美國專利申請公開案第2016/0121024號和第 2018/0280569號中，該描述將藉由援引以其全文併入本文中。這些棉絮狀材料可以商品名ReBOSSIS®從Orthorebirth Co.,Ltd.(Yokohama,Japan)取得。
ReBOSSIS®具有棉絮狀結構，該結構由多根包含β-TCP和/或SiV粒子和可生物分解聚合物(例如聚乳酸-甘醇酸(PLGA)或聚乳酸(PLLA))的電紡可生物分解纖維所組成。該可生物分解纖維可包含β-TCP或其他鈣化合物粒子，例如釋放矽的碳酸鈣(六方方解石)(SiV)。目前已發現摻雜矽的六方方解石(SiV)粒子能夠增強可生物分解複合材料中的細胞活性。(Obata et al.,“Enhanced in vitro cell activity on silicon-doped vaterite/poly(lactic acid)composites,”Acta Biomater.,2009,5(1)：57-62；doi：10.1016/j.actbio.2008.08.004)。
在ReBOSSIS®中，電紡可生物分解纖維包含大量的鈣化合物粒子(β-TCP和/或SiV粒子)分布在纖維中。在一般的ReBOSSIS®纖維中，鈣化合物粒子(例如，β-TCP粒子或β-TCP+SiV粒子)可佔約30-85wt%，較佳者約50-80wt%，更佳者約70-80wt%。通過使用捏合(kneading)工藝，實現讓可生物分解纖維中包含如此大量的鈣粒子。如果鈣化合物粒子的量超過85wt%，就很難透過捏合PLGA和鈣化合物粒子的混合物，將粒子分散在聚合物中。
鈣化合物粒子的密度比PLGA大。例如，PLGA的密度為1.01g/cm3，而β-TCP的密度為3.14g/cm3。因此，重量百分比(wt%)和體積百分比(vol%)可能具有如下的相關性：
表1. β-TCP含量的相關性
Figure 110122386-A0101-12-0013-2
在一些實施例中，所提供的支架或纖維包含了約60wt%至約80wt%的包含鈣化合物的化合物。非限制性的實例包括磷酸鈣(例如，β-磷酸三鈣(β-TCP))和六方方解石(例如，摻雜矽的六方方解石(SiV))。在一些例子中，支架或纖維包含約70wt%的包含鈣化合物的化合物。作為一個例子，支架或纖維包含約70wt%的β-TCP。作為另一個例子，支架或纖維包含約40wt%的β-TCP。作為又一實例，支架或纖維包含約40%的β-TCP和約30%的SiV。根據本發明的實施例，ReBOSSIS®(85)纖維的內容物含量可以用重量百分比(wt%)或體積百分比(vol%)表示。例如，一些ReBOSSIS®(85)纖維可能包含約25-65vol%量的β-TCP和約75-35vol%量的PLGA，更佳者40-60vol%的β-TCP粒子和60-40vol%的PLGA。
根據本發明的實施例，本文中的支架和纖維具有一部分鈣化合物粒子(例如，β-TCP粒子，或SiV粒子，或β-TCP+SiV粒子)暴露在纖維的表面上，而剩餘部分的鈣化合物粒子埋在纖維內部。例如，圖1A-1F顯示兩個ReBOSSIS樣品的掃描式電子顯微照片：ReBOSSIS(85)包含PLGA(30wt%或50.8vol%)、SiV(30wt%或27.4vol%)和β-TCP(40wt%或21.8vol%)，和ORB-03包含PLGA(30wt%或57.1vol%)和β-TCP(70wt%或42.9vol%)。
圖1A展示數根ReBOSSIS(85)纖維(PLGA 30wt%、SiV 30wt%、β-TCP 40wt%)於200倍放大的圖像，顯示了棉絮狀結構中纖維之間 的間隙空間。大的纖維間間隙體積能促進生物體液的灌注。圖1B展示一根ReBOSSIS(85)纖維於2000倍放大的圖像。能輕易地辨識纖維表面的鈣粒子。圖1C展示同一根纖維於5000倍的放大，其中白色箭頭指示β-TCP粒子，黑色箭頭指示SiV粒子。暴露在纖維表面的大量鈣粒子為BMP-2或tBMP-2提供了結合位點。此外，暴露的鈣粒子還促進了在重塑和新骨形成時與破骨細胞和造骨細胞的相互作用。
圖1D展示數根ORB-03纖維(PLGA 30wt%/β-TCP 70wt%)於200倍放大的圖像，顯示了棉絮狀結構中纖維之間的間隙空間。大的纖維間間隙體積促進生物體液的灌注。圖1E展示一根ORB-03纖維於2000倍放大的圖像。可以輕易地辨識纖維表面的鈣粒子。圖1F展示同一根纖維於5000倍的放大，其中白色箭頭指示β-TCP粒子。暴露在纖維表面的大量鈣粒子為BMP-2或tBMP-2提供了結合位點。此外，暴露的鈣粒子還促進了在重塑和新骨形成時與破骨細胞和造骨細胞的相互作用。
根據本發明的實施例，本文中的支架和纖維(例如，ReBOSSIS(85)、ORB-03)較佳者具有從約40μm至約320μm的直徑(包括範圍內的任何數字)，較佳者從約70μm至約250μm，更佳者從約90μm至約200μm，使得直徑為1-5μm的鈣化合物粒子可以分佈在纖維內和纖維上，同時在將支架或纖維植入骨缺損部位後，該棉絮狀結構的機械強度足以維持所需的形狀。該支架或纖維的棉絮狀結構的堆積密度約為0.01至0.2g/cm3，較佳者約0.01至0.1g/cm3，同時棉絮狀結構內纖維間的間隙約為1-1000μm，較佳者約1-100μm，使得體液可以滲透整個纖維間的間隙，並確保整個棉絮狀結構內骨生成的空間。
根據本發明的一個實施例，可生物分解纖維的長度較佳者為約5-20mm，更佳者為約4-10mm。根據本發明的一個實施例，通過使用捏合工藝生產出的紡絲溶液包含大量的鈣粒子，例如70wt%或43vol%。當紡絲溶液從噴嘴噴出時，鈣粒子通過聚合物相互結合，形成一長的縱向纖維。然而，當噴射出的纖維軌跡在飛行過程中由於電場中的排斥力而劇烈擺動時，由鈣粒子和結合聚合物所形成的纖維不能再保持其縱向形狀，被撕裂從而產生較短的纖維。
在骨缺損部位植入支架或纖維後，包含間充質幹細胞的體液可能會進入與捕獲在β-TCP粒子上的BMP-2(例如，rhBMP-2或tBMP-2)接觸。然後BMP-2促進骨前驅細胞分化為造骨細胞。結合了BMP-2的β-TCP粒子被破骨細胞或其他生物活性成分逐漸溶解。接著，如同於骨重塑過程，造骨細胞在β-TCP粒子上作用以生成新骨。
在骨缺損部位植入支架或纖維後，電紡纖維中的PLGA聚合物逐漸降解，使得埋在纖維中的β-TCP粒子暴露出來，而新暴露的β-TCP粒子將重新捕獲黏附在纖維表面的BMP-2。隨著PLGA降解的進行，由於新暴露的β-TCP粒子重新捕獲BMP-2，骨重塑在整個可生物分解纖維支架的網絡中不斷發生，致使骨在骨缺損部位有效的生成。
根據本發明的實施例，BMP-2(例如，rhBMP-2或tBMP-2)與暴露在纖維表面上的β-TCP和/或SiV粒子結合，使得BMP-2被捕獲於整個棉絮狀結構的纖維。β-TCP結合肽的融合可於BMP-2的N端或C端。
tBMP-2可以用慣用的分子生物學技術或本領域已知的其 他技術(例如將β-TCP結合肽化學的或酵素催化的耦合到BMPs上)生成。例如，使用聚合酶連鎖反應(PCR)將β-TCP結合肽的核酸序列連接至BMP的核酸序列。或者，可化學合成融合蛋白的核酸構建體。接著將融合蛋白的構建體置入合適的表達載體的限制位點處。然後將表達載體轉染到蛋白質表達系統(例如，大腸桿菌、酵母細胞或CHO細胞)中。然後純化表達的蛋白質。為了促進蛋白質純化，可以將特定標籤(例如組氨酸標籤)構建到表達構建體中。所有這些過程和技術都是慣用的和常規的。本領域技術人員無需過多實驗即可執行這些操作。
根據本發明的實施例，β-TCP結合肽可包含氨基酸序列LLADTTHHRPWT(SEQ ID NO：1)、GQVLPTTTPSSP(SEQ ID NO：2)、VPQHPYPVPSHK(SEQ ID NO：3)、HNMAPATLHPLP(SEQ ID NO：4)、QSFASLTNPRVL(SEQ ID NO：5)、HTTPTTTYAAPP(SEQ ID NO：6)、QYGVVSHLTHTP(SEQ ID NO：7)、TMSNPITSLISV(SEQ ID NO：8)、IGRISTHAPLHP(SEQ ID NO：9)、MNDPSPWLRSPR(SEQ ID NO：10)、QSLGSMFQEGHR(SEQ ID NO：11)、KPLFTRYGDVAI(SEQ ID NO：12)、MPFGARILSLPN(SEQ ID NO：13)、QLQLSNSMSSLS(SEQ ID NO：14)、TMNMPAKIFAAM(SEQ ID NO：15)、EPTKEYTTSYHR(SEQ ID NO：16)、DLNELYLRSLRA(SEQ ID NO：17)、DYDSTHGAVFRL(SEQ ID NO：18)、SKHERYPQSPEM(SEQ ID NO：19)、HTHSSDGSLLGN(SEQ ID NO：20)、NYDSMSEPRSHG(SEQ ID NO：21)或ANPIISVQTAMD(SEQ ID NO：22)，或它們的組合，其公開於美國專利第10,329,327 B2號中，其公開的內容將藉由援引以其全文併入本文。在一些實施例中，β-TCP結合肽包含 VIGESTHHRPWS(SEQ ID NO：23)、IIGESSHHKPFT(SEQ ID NO：24)、GLDGDTTHHRPWG(SEQ ID NO：25)或ILAESTHHKPWT(SEQ ID NO：26)，或其組合。在一些實施例中，β-TCP結合肽包含LLADTTHHRPWT(SEQ ID NO：1)、VIGESTHHRPWS(SEQ ID NO：23)、IIGESSHHKPFT(SEQ ID NO：24)、GLDGDTTHHRPWG(SEQ ID NO：25)和ILAESTHHKPWT(SEQ ID NO：26)。
根據本發明的一些實施例，β-TCP結合肽可包含兩個或兩個以上選自上述序列的序列。該兩個或兩個以上的序列可以直接彼此相互連接，或有一短肽穿插於其間，以形成更長的β-TCP結合肽。非限制性的例子，β-TCP結合肽包括LLADTTHHRPWTVIGESTHHRPWSIIGESSHHKPFTGLGDTTHHRPWGILAESTHHKPWT(SEQ ID NO：27)、LLADTTHHRPWTVIGESTHHRPWSIIGESSHHKPFTGLGDTTHHRPWG(SEQ ID NO：28)、LLADTTHHRPWTVIGESTHHRPWSIIGESSHHKPFT(SEQ ID NO：29)、LLADTTHHRPWTVIGESTHHRPWS(SEQ ID NO：30)和VIGESTHHRPWSIIGESSHHKPFTGLGDTTHHRPWGILAESTHHKPWT(SEQ ID NO：31)。進一步的例子，β-TCP結合肽包括一第一肽和一第二肽，其中：該第一肽包含SEQ ID NO：1而該第二肽包含SEQ ID NOS：23、24、25或26中的一個或多個；該第一肽包含SEQ ID NO：23而該第二肽包含SEQ ID NOS：1、24、25或26中的一個或多個；該第一肽包含SEQ ID NO：24而該第二肽包含SEQ ID NOS：23、1、25或26中的 一個或多個；該第一肽包含SEQ ID NO：25而該第二肽包含SEQ ID NO：23、24、1或26中的一個或多個；該第一肽包含SEQ ID NO：26而該第二肽包含SEQ ID NOS：23、24、25或1中的一個或多個；該第一肽包含SEQ ID NO：1而該第二肽包含SEQ ID NOS：23、24、25或26中的兩個或兩個以上；該第一肽包含SEQ ID NO：23而該第二肽包含SEQ ID NO：1、24、25或26中的兩個或兩個以上；該第一肽包含SEQ ID NO：24而該第二肽包含SEQ ID NOS：23、1、25或26中的兩個或兩個以上；該第一肽包含SEQ ID NO：25而該第二肽包含SEQ ID NOS：23、24、1或26中的兩個或兩個以上；該第一肽包含SEQ ID NO：26而該第二肽包含SEQ ID NOS：23、24、25或1中的兩個或兩個以上；該第一肽包含SEQ ID NO：1而該第二肽包含SEQ ID NOS：23、24、25或26中的三個或三個以上；該第一肽包含SEQ ID NO：23而該第二肽包含SEQ ID NOS：1、24、25或26中的三個或三個以上；該第一肽包含SEQ ID NO：24而該第二肽包含SEQ ID NOS：23、1、25或26中的三個或三個以上；該第一肽包含SEQ ID NO：25而該第二肽包含SEQ ID NO：23、24、1或26中的三個或三個以上；或者該第一肽包含SEQ ID NO：26而該第二肽包含SEQ ID NOS：23、24、25或1中的三個或三個以上。
由於β-TCP結合肽的存在，tBMP-2與β-TCP粒子的結合非常緊密，從而進一步防止tBMP-2洩漏到骨缺損區域之外。因此，進一步確保了本文中tBMP-2/纖維的使用安全性。
ReBOSSIS®
ReBOSSIS®是一種骨空隙填充材料，具有由可生物分解纖 維所組成的棉絮狀結構。ReBOSSIS®的詳細資訊在美國專利第8,853,298號、美國專利第10,092,650號、美國專利申請公開案第2016/0121024號和美國專利申請公開案第2018/0280569號中進行了解釋。這些參考文獻的公開內容將藉由援引以其全文併入本文。
ReBOSSIS®的電紡可生物分解纖維的直徑範圍可為約40-320μm，較佳地約80-250μm，更佳地約90-200μm。相比之下，傳統電紡纖維的直徑通常為數十或數百奈米(nm)。Orthorebirth通過將電紡(ES)溶液以高速發送到大口徑的噴嘴，和將纖維從ES裝置的頂部滴落到底部來紡絲纖維，以取得較粗的電紡纖維。電紡纖維的直徑，隨著鈣化合物粒子量的增加，而變得更粗，最終使直徑超過60μm。因為電紡是以生產非常細的奈米纖維而聞名，所以Orthorebirth用來生產較粗纖維的方法是獨一無二的。Orthorebirth的方法細節描述於2019年9月13日提交的PCT/JP2019/036052。藉由生成這種粗電紡可生物分解纖維，使發明人可能在纖維中包含大量的鈣化合物粒子，使得粒子暴露在纖維上。此外，較粗的纖維具有在植入於骨修復部位後維持纖維形狀的機械強度。
ReBOSSIS®的可生物分解纖維含有大量的鈣粒子(例如，β-TCP、或SiV或β-TCP+SiV)。通過使用捏合過程來實現包含如此大量的鈣粒子。簡而言之，將可生物分解纖維和鈣粒子的混合物在捏合機中以強力捏合以產生一複合物。然後將該複合物溶解在溶劑(例如氯仿)中以生成一紡絲溶液。捏合過程的細節描述於2017年4月28日提交的WO2017/188435中。
通過在捏合機中將鈣粒子加入聚合物，來捏合可生物分解聚 合物和鈣粒子的混合物，鈣粒子均勻地分散在基質聚合物中。然而，如果鈣粒子的體積比超過閾值的量，由於滲流現象的發生，粒子不能再保持均勻的分散狀態，團簇相(cluster phase)開始出現(見圖8)。粒子團簇相生成的結果為，一些鈣粒子暴露在可生物分解纖維的表面上(見圖1A-1F)。這使得BMP-2可以與可生物分解纖維上的β-TCP粒子結合。根據發明人的經驗，當無機粒子的體積百分比超過約25vol%時，這種滲流現象開始出現。鈣粒子的相對體積百分比是根據可生物分解纖維中所有成分(即，可生物分解聚合物和鈣化合物)的總體積(100wt%)計算的。在本發明的一個實施例中，BMP-2與暴露在電紡可生物分解纖維表面上的β-TCP粒子的結合位點面積，係藉由電紡可生物分解纖維中的β-TCP粒子含量來調節。
圖9A-9D展示本發明的ReBOSSIS®纖維的EM圖像，說明了可生物分解纖維上β-TCP粒子的暴露量隨著可生物分解纖維中所包含的β-TCP粒子的體積百分比增加而增加。圖9A展示具有β-TCP(50wt%，24.3vol%)的纖維；沒有很多β-TCP粒子暴露在纖維表面。圖9B展示具有β-TCP(70wt%，42.9vol%)的纖維；有許多β-TCP粒子暴露在纖維表面。圖9C展示具有β-TCP(80wt%，56.3vol%)的纖維；有更多的β-TCP粒子暴露在纖維表面。圖9D展示具有β-TCP(85wt%，64.6vol%)的纖維；有更加多的β-TCP粒子暴露在纖維表面。
確認一些β-TCP粒子暴露在纖維上
方法
將具有下列成份的纖維片浸沒到1mol/L的鹽酸中10秒、1 分鐘、5分鐘。
˙PLGA 30wt%，β-TCP 70wt%，或
˙PLGA 50wt%，β-TCP 50wt%
如果β-TCP粒子被聚合物包覆，則該β-TCP粒子不會被鹽酸溶解。因此，不會有任何變化。反之，如果β-TCP粒子被鹽酸溶解，則假定β-TCP粒子暴露在外，沒有被聚合物所包覆。
如圖13A-13D所示，證實了β-TCP粒子被鹽酸溶解。PLGA則未被鹽酸溶解。β-TCP的比例越高，暴露在纖維表面的β-TCP粒子越多。如這些實驗所揭示的，纖維中一部分的β-TCP粒子沒有被聚合物完全覆蓋。因此，鹽酸能溶解這些β-TCP粒子。如圖13A-13D和圖14A-14E所示，通過改變β-TCP粒子與聚合物的比例，可以控制β-TCP粒子的暴露程度。因此，可以通過增加或減少β-TCP粒子在纖維上的暴露量來控制BMP-2與纖維支架的結合位點。
tBMP-2
本發明的一些實施例使用可靶向的BMP-2(tBMP-2)，其中β-TCP結合肽與BMP2融合。作為一個非限制性的例子，BMP包含
Figure 110122386-A0101-12-0021-57
Figure 110122386-A0101-12-0021-58
(SEQ ID NO：32)。tBMP-2與由本發明的一位發明者開發的β-TCP結合肽融合。某些β-TCP結合肽的詳細資訊解釋於美國專利第10,329,327B2號和“Tethering of Epidermal Growth Factor(EGF)to Beta Tricalcium Phosphate(βTCP)via Fusion to a High Affinity,Multimeric β-TCP binding Peptide：Effects on Human Multipotent Stromal Cells/Connective Tissue Progenitors”，Alvarez等人，PLoS ONE DOI：10.1371/journal.pone.0129600，2015年6月29日。這些參考文獻的公開內容將藉由援引全文併入本文中。
根據本發明的實施例，β-TCP結合肽可包含氨基酸序列LLADTTHHRPWT(SEQ ID NO：1)、GQVLPTTTPSSP(SEQ ID NO：2)、VPQHPYPVPSHK(SEQ ID NO：3)、HNMAPATLHPLP(SEQ ID NO：4)、QSFASLTNPRVL(SEQ ID NO：5)、HTTPTTTYAAPP(SEQ ID NO：6)、QYGVVSHLTHTP(SEQ ID NO：7)、TMSNPITSLISV(SEQ ID NO：8)、IGRISTHAPLHP(SEQ ID NO：9)、MNDPSPWLRSPR(SEQ ID NO：10)、QSLGSMFQEGHR(SEQ ID NO：11)、KPLFTRYGDVAI(SEQ ID NO：12)、MPFGARILSLPN(SEQ ID NO：13)、QLQLSNSMSSLS(SEQ ID NO：14)、TMNMPAKIFAAM(SEQ ID NO：15)、EPTKEYTTSYHR(SEQ ID NO：16)、DLNELYLRSLRA(SEQ ID NO：17)、DYDSTHGAVFRL(SEQ ID NO：18)、SKHERYPQSPEM(SEQ ID NO：19)、HTHSSDGSLLGN(SEQ ID NO：20)、NYDSMSEPRSHG(SEQ ID NO：21)、ANPIISVQTAMD(SEQ ID NO：22)、VIGESTHHRPWS(SEQ ID NO：23)、IIGESSHHKPFT(SEQ ID NO：24)、GLGDTTHHRPWG(SEQ ID NO：25)或ILAESTHHKPWT(SEQ ID NO：26)NO：26)，或其組合。根據本發明的一些實施例，β-TCP結合肽可包含兩個或兩個以上選自上述序列的序列。β-TCP結合肽可包含LLADTTHHRPWT(SEQ ID NO：1)、VIGESTHHRPWS(SEQ ID NO：23)、IIGESSHHKPFT(SEQ ID NO：24)、GLGDTTHHRPWG(SEQ ID NO：25)和ILAESTHHKPWT(SEQ ID NO：26)。該兩個或兩個以上的序列可以直接彼此相互連接，或有一短肽穿插於期間，以形成一較長的β-TCP結合肽。
根據本發明的實施例，tBMP中使用的BMP可包括可靶向的BMP-2和重組人類BMP-2(rhBMP-2)。在一些實施例中，提供的是包含β-TCP結合肽(例如，本文中公開的一種或多種β-TCP結合肽)和
Figure 110122386-A0101-12-0023-3
Figure 110122386-A0101-12-0023-4
的tBMP。β-TCP結合肽可以通過連接子(linker)例如肽連接子與BMP序列連接。tBMP肽的非限制性例子包括
Figure 110122386-A0101-12-0023-5
Figure 110122386-A0101-12-0023-6
(SEQ ID NO：33)、
Figure 110122386-A0101-12-0023-7
Figure 110122386-A0101-12-0023-8
(SEQ ID NO：34)、
Figure 110122386-A0101-12-0023-9
Figure 110122386-A0101-12-0024-10
(SEQ ID NO：35)
Figure 110122386-A0101-12-0024-11
Figure 110122386-A0101-12-0024-13
(SEQ ID NO：36)、
Figure 110122386-A0101-12-0024-14
Figure 110122386-A0101-12-0024-15
(SEQ ID NO：37)和
Figure 110122386-A0101-12-0024-16
Figure 110122386-A0101-12-0024-18
(SEQ ID NO：38)。
將BMP-2結合到ReBOSSIS®
根據本發明的實施例，BMP-2可以與ReBOSSIS®纖維結合。為了評估BMP-2與ReBOSSIS®纖維結合的特性，進行了以下實驗(以tBMP2和rhBMP-2為例)。在本實驗中，ReBOSSIS®的可生物分解纖維含有PLGA(30wt%)和β-TCP粒子(40wt%)和SiV(六方方解石相的摻雜矽的碳酸鈣)粒子(30wt%)。β-TCP粒子和SiV粒子分佈在纖維內和纖維上。巨觀上，部分粒子暴露在外，於纖維的表面上。
製備四種樣品溶液。使用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)比較以下四種樣品溶液中tBMP-2或rhBMP-2與對照樣品的濃度。牛血 清白蛋白(BSA)作為對照樣品。
具體而言，製備了以下試劑：(a)tBMP-2(SEQ ID NO：33，在10mM醋酸鈉、0.1M氯化鈉添加或不添加0.1M尿素，pH 4.75的溶液中)；(b)BSA原液溶液：42mg/ml溶解在醋酸鹽洗滌緩衝液中(儲存於-20℃)；(c)醋酸鹽洗滌緩衝液：5mM醋酸鈉pH 4.75、100mM氯化鈉；(d)ReBOSSIS®(OrthoRebirth)；和(e)PBS(Rocbe，目錄號11666789001，1倍濃度的溶液=137mM氯化鈉、2.7mM氯化鉀、10mM磷酸氫鈉、1.8mM磷酸二氫鉀，pH 7.0)。
方法：使20μg tBMP-2或BSA與每mg的ReBOSSIS®結合(總共200μg tBMP-2和10mg ReBOSSIS®)、洗滌(wash)、洗脫(elute)並加載(load)到非還原性的SDS-PAGE。具體程序如下：
製備
1.在離心管中秤取10mg的ReBOSSIS®；
2.製備BSA：取29μl BSA原液，加入971μl醋酸鹽緩衝液，以獲得稀釋的BSA溶液，1.22mg/ml，pH 4.75。
3.透過在每個離心管中加入500μl醋酸鹽洗滌緩衝液，在醋酸洗滌緩衝液中預洗ReBOSSIS®。顛倒混合均勻後，使其反應5分鐘。在微量離心機中離心。將移液管管頭置於離心管底部後移液，以移除緩衝液。ReBOSSIS®將保留在離心管中。
4.凝膠樣品：留出一些BSA加載樣品和tBMP2加載樣品以供稍後的SDS-PAGE分析。
分析
5.將200μg tBMP2加到10mg預洗過的ReBOSSIS®中，總體積為164μl；
6.將200μg BSA加到到10mg預洗過的ReBOSSIS®中，總體積為164μl範例設置
Figure 110122386-A0101-12-0026-20
7.結合30分鐘(結合在20分鐘時接近完成)；
收集未結合的材料
8.在微量離心機中以最高速離心離心管4-5分鐘。
9.將移液管插入位於離心管頂部的上清液中，然後將未結合物移液到另一管子內。(注意：確保不要讓ReBOSSIS®進入您的移液管管頭內。我們取出過多的量來跑我們的凝膠。然後我們將一移液管管頭置於離心管的底部並丟棄剩餘的部分)；
洗滌
10.加入500μl的PBS或醋酸鹽洗滌緩衝液；
11.輕輕地渦漩。顛倒混合5分鐘，然後再次輕輕地渦漩；
12.在微量離心機中將離心管以最高速離心4-5分鐘以萃取洗滌液。保留洗滌液；
洗脫
13.加入164μl非還原性1倍濃度的SDS PAGE凝膠染料(不加β-巰基乙 醇，因為它會破壞BMP2二聚體)來洗脫；
14.輕輕地渦漩，反應5分鐘，重複渦漩；
15.在微量離心機中以將離心管以最高速離心4-5分鐘後收集洗脫的材料；
16.如下加載樣品至凝膠：ReBOSSIS®加載樣品：10μl，未結合10μl，洗滌10μl，洗脫11μl。
SDS PAGE分析用的樣品標記如下(如圖2和圖10所示)：
Ld：包含已知量的tBMP-2或BSA的加載樣品溶液。
FT：將Ld提供給ReBOSSIS®後，藉由收集流經ReBOSSIS®的部分而取得的流經(flow-through)樣品溶液。
W：在提供洗滌緩衝液後，藉由收集經過包含蛋白質的ReBOSSIS®的部分而取得的洗滌樣品溶液。
‧如果與ReBOSSIS®結合的蛋白質因洗滌緩衝液而分離，洗滌後流出的部分將包含分離的蛋白質。
‧假設移植部位的pH條件為酸性或中性，製備兩種類型的洗滌緩衝液(PBS pH 7.0和醋酸鹽緩衝液pH 4.5)並用於進行實驗。
EL：藉由收集提供洗脫緩衝液給用洗滌緩衝液洗滌過後的ReBOSSIS®後的部分，以取得的洗脫樣品溶液。
評估蛋白質的結合(SDS-PAGE)
用SDS-PAGE來評估tBMP-2(或BSA)與ReBOSSIS®的結合，使用染色溶液來檢測蛋白質條帶。檢測到的蛋白質在泳道中顯示為條帶。通過比較蛋白質含量已知的樣品的電泳條帶的信號強度和蛋白質含量未知的樣品的電泳條帶信號強度，可以定量估計未知的蛋白質含量。 通過使用軟件分析圖像，可以定量分析信號的強度。
在本實驗中，通過肉眼觀察來比較凝膠圖像。泳道中顯示的藍色條帶是通過用藍色染料染色蛋白質(tBMP2或BSA)產生的。條帶越深表示蛋白質的量越大。
在130V的恆定電壓下進行SDS-PAGE。使用NuPAGE 4-12% Bis-Tris蛋白凝膠，1.0mm,12-well(Life Technologies，目錄號NP0322BOX)，以及使用NuPAGE MOPS SDS Running Buffer(20倍)(Life Technologies目錄號NP0001)作為電泳緩衝液。為了在電泳完成後染色蛋白質，使用Gelcode Blue Sage Protein Stain(Thermos Scientific，目錄號24596)。
如圖2所示，分圖A顯示使用酸性緩衝液(醋酸鹽緩衝液)作為洗滌緩衝液所獲得的凝膠圖像，B部分顯示了使用中性緩衝液(PBS)作為洗滌緩衝液所獲得的凝膠圖像。在每張凝膠圖像中，右側的四道顯示tBMP2的分析結果，左側的四道顯示BSA的分析結果。
在Ld泳道(加載樣品)中，可以識別tBMP-2和BSA的主要條帶位置。如果FT、W或EL道中包含tBMP-2或BSA，預期它的條帶會出現在跟它在Ld道中相同的位置。
在圖2中，虛線包圍的區域為在條件A下使用BSA製備的樣品的凝膠圖像。矩形實線框指出BSA的主要條帶位置，註記為BSA主條帶。通過比較每條泳道中BSA主條帶的強度，清楚表明了FT和Ld泳道顯示相似量的蛋白質，意味著大多數的BSA不結合ReBOSSIS®，直接流過。亦即，BSA作為陰性對照，不結合ReBOSSIS®纖維。雖然W和 EL泳道也顯示了微量的BSA條帶，但與Ld泳道的量相比，W和EL泳道的BSA條帶量要低得多，意味著很少BSA與ReBOSSIS®結合。
在pH值中性的緩衝液中(分圖B)，BSA顯示與ReBOSSIS®纖維的一些非特異性結合，然而，大多數的BSA出現在流經部分(FL)，意味著大多數的BSA不與ReBOSSIS®纖維結合。在洗滌部分(W)，也有一些BSA接續出現，但量少於流經部分。洗脫(EL)部分中的量更少。這些結果表明BSA對ReBOSSIS®纖維為非特異性黏附。
反之，tBMP-2與ReBOSSIS®結合良好，無論使用酸性緩衝液或pH值中性的緩衝液，極少量的tBMP-2出現在流經(FT)部分或洗滌(W)部分。結合的tBMP-2僅在洗脫(EL)後出現。(圖2，分圖A和分圖B)，意味著tBMP-2特異性地結合ReBOSSIS®纖維。
由此實驗證實了，tBMP-2可以與ReBOSSIS®纖維緊密結合，並且，與ReBOSSIS®纖維結合的tBMP-2不會因為酸性或中性洗滌緩衝液而與ReBOSSIS®纖維分離。
由此實驗證實了，在中性和酸性的條件下，超過98%的tBMP2結合並滯留在ReBOSSIS上。這代表著即使在破骨細胞吸收的影響下，tBMP-2與ReBOSSIS仍維持結合。
比較tBMP-2和rhBMP(Infuse)的滯留情形
本實驗旨在比較tBMP-2和rhBMP-2(INFUSE)與ReBOSSIS纖維的結合特性。對如下表所示的幾種組成比例進行測試：
Figure 110122386-A0101-12-0029-21
Figure 110122386-A0101-12-0030-22
PLGA：聚乳酸-甘醇酸PLA：PGA=85：15分子量=31000-380000
SiV：含矽氧烷的六方方解石(一種碳酸鈣，CaCO3)
β-TCP：β-磷酸三鈣
結合的流程如上所述。圖3顯示tBMP-2與各種材料結合的結果。在包含β-TCP和/或SiV(含矽氧烷的六方方解石)的材料(SiV70、ReBOSSIS(85)和ORB-03)上，tBMP-2滯留的很好。tBMP-2的滯留與BSA的滯留明顯的不同。
圖4顯示重組人類BMP2(rhBMP2)的結果。rhBMP-2僅滯留在包含β-TCP的材料(ReBOSSIS(85)和ORB-03)上，但不滯留在包含SiV的材料上。rhBMP-2的結合比tBMP2的結合弱。因為ReBOSSIS®對rhBMP-2的滯留少於其對tBMP-2的滯留，所以我們可以預測tBMP2從治療部位洩漏的可能性較低。因此，本發明的較佳實施例可使用tBMP-2，與rhBMP-2(例如，INFUSE®骨移植物)相比，預期tBMP-2有較少(如果有的話)的副作用。
在慢性山羊脛骨缺損(CCTD)模型中評估ReBOSSIS/tBMP2
為了評估tBMP-2/ReBOSSIS®在骨修復中的利用，評估了可靶向BMP-2(tBMP-2具有SEQ ID NO：33)在ReBOSSIS(85)上在CCTD模型中的功效，該模型是一個具有挑戰性的長骨節段性缺損山羊模型。與目前的治療法相比，預期當在植入部位中結合於表面的tBMP2的較長局部滯留可提高為了恢復長骨節段性缺損的矯形手術的安全性和有效性。
實驗設計
動物的選擇
本研究使用了12隻體重在40-60公斤之間的母西班牙波爾山羊(Spanish Boer goats)。將其分成以下三個實驗組：
‧第1組-TCP+ReBOSSIS+BMA
‧第2組-TCP+ReBOSSIS+BMA+tBMP-2@0.15mg/cc缺損
‧第3組-TCP+ReBOSSIS+BMA+tBMP-2@1.5mg/cc缺損
TCP：磷酸三鈣顆粒；BMA：骨髓穿刺
CCTD模型
CCTD模型旨在為大型動物模型“提高標準”，以更好地匹配具有挑戰性的臨床生物學情況，在這些情況下，當前對大型骨缺損的治療以不可接受的頻率持續失敗。
CCTD模型涉及骨的臨界尺寸(5cm)節段性脛骨缺損。幾個特徵可區別CCTD模型與急性缺陷模型：
1.由缺損部位的每側移除2cm的骨膜，產生了一段9cm的骨膜(5cm的缺損+於每側的2cm)，
2. 10克的骨骼肌於缺損部位的周圍，
3.擴大骨髓內管，去除缺損部位附近的骨髓和骨內膜骨，
4.移植前將PMMA間隔物放置於缺損處4週。這可使纖維“誘導膜”(IM)或“Masquelet膜”包裹間隔物。
5.每隻動物都經過兩次手術，這裡將其定義為製造這些生物學狀態的“預手術”和於手術中實施臨床相關的治療方案的“治療手術”。
圖5顯示慢性山羊臨界性缺損(CCTD)模型的示意圖。於預手術時在骨骼成熟的雌性山羊上製造5公分節段的臨界性缺損。將一長5cm x直徑2cm的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)間隔物放置於缺損處以誘導生成生物膜。四個星期後，輕輕地移除PMMA間隔物並替換成移植物材料。每4週拍攝一次正交攝像照片以評估缺損的癒合情形。圖中，AP代表頭尾位，ML代表內外位。白色箭頭指示放置於PMMA間隔物處的移植物材料。
預手術包含以下基本特徵：
1.創建一個前內側(craniomedial)皮膚切口並切除一段5cm的脛骨骨幹和骨膜。
2.在近端骨節和遠端骨節上再切除2cm的骨膜。
3.於脛前肌和腓腸肌的10cm3清創。
4.放置具有定制的間隔物夾的互鎖髓內釘以維持5cm的缺損。
5.在缺損處髓內釘的周圍放置一個長5cm x直徑2cm的預成型PMMA間隔物。
6.以正常(0.9%)生理食鹽水沖洗傷口後閉合傷口。
在預手術的4週後進行的治療程序包含：
1.打開先前在脛骨前內側的皮膚切口。
2.使用“炸彈艙門打開”方式打開PMMA間隔物周圍的“誘導膜”。
3.在不損壞膜或釘子的情況下移除間隔物。
4.收集如下定義的適當組織樣本。
5.在缺損處施予適當的治療。
6.用3-0尼龍閉合誘導膜以提供內在標記和傷口閉合。
射線照相分析：
在間隔物手術後(第0週)、移植物手術後(第4週)和追蹤(第8週和第12週)時，對脛骨的頭尾位(AP)和內外位(ML)投影進行透視成像。在移植手術的12週後，實施安樂死後(解剖軟組織後)取得射線照片。
樣品製備
樣品組成：5cc TCP+50cc ReBOSSIS+6cc BMA(包含或不包含tBMP-2)。
將tBMP2與ReBOSSIS結合
1.在無菌環境下，於培養皿中分離出50cc ReBOSSIS，並確保其分佈成大致均勻的一層；
2.在ReBOSSIS上加入30mL結合緩衝液(包含或不包含tBMP-2)，藉由輕輕地對暴露的表面移液，浸沒ReBOSSIS於溶液中，結合20分鐘；
3.藉由垂直握住移液管並將其管頭推到該位置的表面，使用10mL移液管取出30mL的結合緩衝液。當管頭維持在表面時，小心地吸取液體。將移液管移動到其他區域以確保收集盡可能多的液體。監控回收量；
4.在ReBOSSIS上加40mL的無菌PBS，洗滌10分鐘。按照步驟2中描述的方法添加；
5.如步驟3所述，用10mL移液管取出40mL PBS，將PBS保存在50mL錐形管中；
6.重複1次步驟4-5；
7.蓋上培養皿的蓋子，在邊緣封上封口膜(Parafilm)使tBMP2/ReBOSSIS保持密封。
將tBMP2與TCP結合
1.量測所需的TCP並放入無菌管中。
2.藉由在管中注入70%的乙醇並反應2-4小時或過夜來對TCP進行滅菌。
3.用無菌的二次去離子水清洗TCP 3次以去除酒精。
4.在TCP結合緩衝液(10mM醋酸鈉pH 4.75，100mM氯化鈉)中輕輕地攪拌，洗滌TCP 5分鐘。
5.用無菌的PBS清洗TCP以去除TCP結合緩衝液。
6.對管中的TCP加入適量的tBMP2。
7.添加足以覆蓋TCP的TCP結合緩衝液。
8.輕輕地混合2小時。
9.用PBS清洗2次以去除TCP結合緩衝液。
10.將tBMP-2/TCP置於無菌容器中儲存在4℃。
手術時
1.打開一個含有tBMP2/ReBOSSIS的培養皿。
2.在同一培養皿找一角落，倒出5cc tBMP-2所覆蓋的TCP。然後將6cc的骨髓抽吸物塗在TCP上，使其均勻分佈。
3.用無菌刮刀將tBMP-2/TCP/BMA轉移到ReBOSSIS的頂部，確保它均勻散佈在整個ReBOSSIS堆上。
4.用戴著無菌手套的手輕拍上述的tBMP-2/TCP/BMA，使其像一層細 鵝卵石一樣均勻地分佈在ReBOSSIS上。
5.將ReBOSSIS像捲餅一樣輕輕捲起，並依照需要混合和塑形
結果
加入ReBOSSIS大大地提高了移植物材料的手術處理性能。與第1組相比，包含tBMP-2的實驗組(第2組和第3組)顯示較高的新骨形成百分比。圖6A展示移植手術8週後拍攝的射線照片(內外位(ML)和頭尾位(AP)投影)，圖6B展示移植手術12週後拍攝的射線照片(內外位(ML)和頭尾位(AP)投影)。每個治療組使用了六(6)隻山羊。
移植後的x射線圖顯示，第1組(TCP+ReBOSSIS®+BMA)的所有4隻山羊的任何缺損部位均未獲得新骨。在第2組(低劑量tBMP2)中，4隻山羊中的一隻在缺損部位填充了約75%的新骨生長，其他3隻山羊在缺損部位填充了少於25%的新骨。在第3組(較高劑量的tBMP-2)中，2隻山羊顯示骨癒合，而2隻山羊顯示少於50%的新骨。這些數據表明在支架添加tBMP2確實增加了新骨的形成。
圖7展示用固定式x射線機拍攝的12根移植後的脛骨射線照片(內外位(ML)和頭尾位(AP)投影)。在較高劑量的tBMP-2組(1.5mg/cc)中獲得了大量的新骨。
如這些結果所示，ReBOSSIS®大大地增強了植入材料的手術處理性能。將tBMP2添加到TCP和ReBOSSIS®增強了CCTD模型中的骨癒合。這些結果表明本發明的實施例將優於目前用於骨修復的材料。雖然這些特定的例子使用tBMP-2，但rhBMP-2將會產生如先前已證明的相同結果。
圖11和圖12展示說明使用本發明的實施例增強骨修復的可能過程的示意圖。簡而言之，在骨缺損部位移植了浸過tBMP-2溶液的ReBOSSIS®後，纖維表面可能會被體液中存在的細胞外基質(ECM)蛋白或黏附蛋白所覆蓋。然後，骨微環境中的間充質幹細胞(MSC)黏附到被黏附蛋白包覆的纖維表面。MSC也可能產生蛋白質，形成其自身ECM。TBMP-2誘導MSC分化為造骨細胞，然後造骨細胞在富含鈣的環境中形成骨骼。
雖然已經用有限數量的示例說明了本發明的實施例。本領域技術人員將理解，在不脫離本發明範圍的情況下，其他修改和變化是可能的。因此，保護範圍僅以所附權利要求為準。 
				                         SEQUENCE LISTING
				<110>  日商奧梭瑞貝斯股份有限公司 (ORTHOREBIRTH CO., LTD.)
				       美商賽瑞達普提孚股份有限公司 (THERADAPTIVE, INC.)
				<120>  骨誘導性的骨再生材料及其製備方法
				<130>  ORP21001WO
				<140>  110122386
				<141>  2021-6-18
				<150>  63/042,006
				<151>  2020-06-21
				<160>  38    
				<170>  PatentIn version 3.5
				<210>  1
				<211>  12
				<212>  PRT
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  合成的
				<400>  1
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				<210>  2
				<211>  12
				<212>  PRT
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  合成的
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				<213>  人工序列
				<220>
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				<223>  合成的
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				<223>  合成的
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				<220>
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				<220>
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				<220>
				<223>  合成的
				<400>  18
				Asp Tyr Asp Ser Thr His Gly Ala Val Phe Arg Leu 
				1               5                   10          
				<210>  19
				<211>  12
				<212>  PRT
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  合成的
				<400>  19
				Ser Lys His Glu Arg Tyr Pro Gln Ser Pro Glu Met 
				1               5                   10          
				<210>  20
				<211>  12
				<212>  PRT
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  合成的
				<400>  20
				His Thr His Ser Ser Asp Gly Ser Leu Leu Gly Asn 
				1               5                   10          
				<210>  21
				<211>  12
				<212>  PRT
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  合成的
				<400>  21
				Asn Tyr Asp Ser Met Ser Glu Pro Arg Ser His Gly 
				1               5                   10          
				<210>  22
				<211>  12
				<212>  PRT
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  合成的
				<400>  22
				Ala Asn Pro Ile Ile Ser Val Gln Thr Ala Met Asp 
				1               5                   10          
				<210> 23
				<211> 12
				<212> PRT
				<213> 人工序列
				<220>
				<223> 人工序列描述：合成胜肽
				<400> 23
				Val Ile Gly Glu Ser Thr His His Arg Pro Trp Ser 
				1               5                   10          
				<210> 24
				<211> 12
				<212> PRT
				<213> 人工序列
				<220>
				<223> 人工序列描述：合成胜肽
				<400> 24
				Ile Ile Gly Glu Ser Ser His His Lys Pro Phe Thr 
				1               5                   10          
				<210> 25
				<211> 12
				<212> PRT
				<213> 人工序列
				<220>
				<223> 人工序列描述：合成胜肽
				<400> 25
				Gly Leu Gly Asp Thr Thr His His Arg Pro Trp Gly 
				1               5                   10          
				<210> 26
				<211> 12
				<212> PRT
				<213> 人工序列
				<220>
				<223> 人工序列描述：合成胜肽
				<400> 26
				Ile Leu Ala Glu Ser Thr His His Lys Pro Trp Thr 
				1               5                   10          
				<210> 27
				<211> 60
				<212> PRT
				<213> 人工序列
				<220>
				<223> 人工序列描述：合成多胜肽
				<400> 27
				Leu Leu Ala Asp Thr Thr His His Arg Pro Trp Thr Val Ile Gly Glu 
				1               5                   10                  15      
				Ser Thr His His Arg Pro Trp Ser Ile Ile Gly Glu Ser Ser His His 
				            20                  25                  30          
				Lys Pro Phe Thr Gly Leu Gly Asp Thr Thr His His Arg Pro Trp Gly 
				        35                  40                  45              
				Ile Leu Ala Glu Ser Thr His His Lys Pro Trp Thr 
				    50                  55                  60  
				<210> 28
				<211> 48
				<212> PRT
				<213> 人工序列
				<220>
				<223> 人工序列描述：合成多胜肽
				<400> 28
				Leu Leu Ala Asp Thr Thr His His Arg Pro Trp Thr Val Ile Gly Glu 
				1               5                   10                  15      
				Ser Thr His His Arg Pro Trp Ser Ile Ile Gly Glu Ser Ser His His 
				            20                  25                  30          
				Lys Pro Phe Thr Gly Leu Gly Asp Thr Thr His His Arg Pro Trp Gly 
				        35                  40                  45              
				<210> 29
				<211> 36
				<212> PRT
				<213> 人工序列
				<220>
				<223> 人工序列描述：合成多胜肽
				<400> 29
				Leu Leu Ala Asp Thr Thr His His Arg Pro Trp Thr Val Ile Gly Glu 
				1               5                   10                  15      
				Ser Thr His His Arg Pro Trp Ser Ile Ile Gly Glu Ser Ser His His 
				            20                  25                  30          
				Lys Pro Phe Thr 
				        35      
				<210> 30
				<211> 24
				<212> PRT
				<213> 人工序列
				<220>
				<223> 人工序列描述：合成胜肽
				<400> 30
				Leu Leu Ala Asp Thr Thr His His Arg Pro Trp Thr Val Ile Gly Glu 
				1               5                   10                  15      
				Ser Thr His His Arg Pro Trp Ser 
				            20                  
				<210> 31
				<211> 48
				<212> PRT
				<213> 人工序列
				<220>
				<223> 人工序列描述：合成多胜肽
				<400> 31
				Val Ile Gly Glu Ser Thr His His Arg Pro Trp Ser Ile Ile Gly Glu 
				1               5                   10                  15      
				Ser Ser His His Lys Pro Phe Thr Gly Leu Gly Asp Thr Thr His His 
				            20                  25                  30          
				Arg Pro Trp Gly Ile Leu Ala Glu Ser Thr His His Lys Pro Trp Thr 
				        35                  40                  45              
				<210> 32
				<211> 114
				<212> PRT
				<213> 現代人種
				<400> 32
				Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg 
				1               5                   10                  15      
				His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile 
				            20                  25                  30          
				Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro 
				        35                  40                  45              
				Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln 
				    50                  55                  60                  
				Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val 
				65                  70                  75                  80  
				Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu 
				                85                  90                  95      
				Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly 
				            100                 105                 110         
				Cys Arg 
				<210> 33
				<211> 217
				<212> PRT
				<213> 人工序列
				<220>
				<223> 人工序列描述：合成多胜肽
				<400> 33
				Met Pro Ile Gly Ser Leu Leu Ala Asp Thr Thr His His Arg Pro Trp 
				1               5                   10                  15      
				Thr Val Ile Gly Glu Ser Thr His His Arg Pro Trp Ser Ile Ile Gly 
				            20                  25                  30          
				Glu Ser Ser His His Lys Pro Phe Thr Gly Leu Gly Asp Thr Thr His 
				        35                  40                  45              
				His Arg Pro Trp Gly Ile Leu Ala Glu Ser Thr His His Lys Pro Trp 
				    50                  55                  60                  
				Thr Ala Ser Gly Ala Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly 
				65                  70                  75                  80  
				Thr Ser Gly Ala Thr Gly Ala Gly Thr Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ala 
				                85                  90                  95      
				Ser Thr Gly Gly Gly Thr Gly Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg 
				            100                 105                 110         
				Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp 
				        115                 120                 125             
				Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe 
				    130                 135                 140                 
				Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser 
				145                 150                 155                 160 
				Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys 
				                165                 170                 175     
				Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met 
				            180                 185                 190         
				Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp 
				        195                 200                 205             
				Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg 
				    210                 215         
				<210> 34
				<211> 212
				<212> PRT
				<213> 人工序列
				<220>
				<223> 人工序列描述：合成多胜肽
				<400> 34
				Leu Leu Ala Asp Thr Thr His His Arg Pro Trp Thr Val Ile Gly Glu 
				1               5                   10                  15      
				Ser Thr His His Arg Pro Trp Ser Ile Ile Gly Glu Ser Ser His His 
				            20                  25                  30          
				Lys Pro Phe Thr Gly Leu Gly Asp Thr Thr His His Arg Pro Trp Gly 
				        35                  40                  45              
				Ile Leu Ala Glu Ser Thr His His Lys Pro Trp Thr Ala Ser Gly Ala 
				    50                  55                  60                  
				Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Thr Ser Gly Ala Thr 
				65                  70                  75                  80  
				Gly Ala Gly Thr Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ala Ser Thr Gly Gly Gly 
				                85                  90                  95      
				Thr Gly Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys 
				            100                 105                 110         
				Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp 
				        115                 120                 125             
				Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu 
				    130                 135                 140                 
				Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile 
				145                 150                 155                 160 
				Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys 
				                165                 170                 175     
				Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu 
				            180                 185                 190         
				Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly 
				        195                 200                 205             
				Cys Gly Cys Arg 
				    210         
				<210> 35
				<211> 200
				<212> PRT
				<213> 人工序列
				<220>
				<223> 人工序列描述：合成多胜肽
				<400> 35
				Val Ile Gly Glu Ser Thr His His Arg Pro Trp Ser Ile Ile Gly Glu 
				1               5                   10                  15      
				Ser Ser His His Lys Pro Phe Thr Gly Leu Gly Asp Thr Thr His His 
				            20                  25                  30          
				Arg Pro Trp Gly Ile Leu Ala Glu Ser Thr His His Lys Pro Trp Thr 
				        35                  40                  45              
				Ala Ser Gly Ala Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Thr 
				    50                  55                  60                  
				Ser Gly Ala Thr Gly Ala Gly Thr Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ala Ser 
				65                  70                  75                  80  
				Thr Gly Gly Gly Thr Gly Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu 
				                85                  90                  95      
				Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val 
				            100                 105                 110         
				Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr 
				        115                 120                 125             
				Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr 
				    130                 135                 140                 
				Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile 
				145                 150                 155                 160 
				Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu 
				                165                 170                 175     
				Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met 
				            180                 185                 190         
				Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg 
				        195                 200 
				<210> 36
				<211> 188
				<212> PRT
				<213> 人工序列
				<220>
				<223> 人工序列描述：合成多胜肽
				<400> 36
				Ile Ile Gly Glu Ser Ser His His Lys Pro Phe Thr Gly Leu Gly Asp 
				1               5                   10                  15      
				Thr Thr His His Arg Pro Trp Gly Ile Leu Ala Glu Ser Thr His His 
				            20                  25                  30          
				Lys Pro Trp Thr Ala Ser Gly Ala Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser 
				        35                  40                  45              
				Glu Gly Gly Thr Ser Gly Ala Thr Gly Ala Gly Thr Ser Thr Ser Gly 
				    50                  55                  60                  
				Gly Gly Ala Ser Thr Gly Gly Gly Thr Gly Gln Ala Lys His Lys Gln 
				65                  70                  75                  80  
				Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp 
				                85                  90                  95      
				Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr 
				            100                 105                 110         
				His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His 
				        115                 120                 125             
				Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val 
				    130                 135                 140                 
				Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala 
				145                 150                 155                 160 
				Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn 
				                165                 170                 175     
				Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg 
				            180                 185             
				<210> 37
				<211> 176
				<212> PRT
				<213> 人工序列
				<220>
				<223> 人工序列描述：合成多胜肽
				<400> 37
				Gly Leu Gly Asp Thr Thr His His Arg Pro Trp Gly Ile Leu Ala Glu 
				1               5                   10                  15      
				Ser Thr His His Lys Pro Trp Thr Ala Ser Gly Ala Gly Gly Ser Glu 
				            20                  25                  30          
				Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Thr Ser Gly Ala Thr Gly Ala Gly Thr 
				        35                  40                  45              
				Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ala Ser Thr Gly Gly Gly Thr Gly Gln Ala 
				    50                  55                  60                  
				Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro 
				65                  70                  75                  80  
				Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala 
				                85                  90                  95      
				Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro 
				            100                 105                 110         
				Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu 
				        115                 120                 125             
				Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr 
				    130                 135                 140                 
				Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val 
				145                 150                 155                 160 
				Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg 
				                165                 170                 175     
				<210> 38
				<211> 164
				<212> PRT
				<213> 人工序列
				<220>
				<223> 人工序列描述：合成多胜肽
				<400> 38
				Ile Leu Ala Glu Ser Thr His His Lys Pro Trp Thr Ala Ser Gly Ala 
				1               5                   10                  15      
				Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Thr Ser Gly Ala Thr 
				            20                  25                  30          
				Gly Ala Gly Thr Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ala Ser Thr Gly Gly Gly 
				        35                  40                  45              
				Thr Gly Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys 
				    50                  55                  60                  
				Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp 
				65                  70                  75                  80  
				Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu 
				                85                  90                  95      
				Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile 
				            100                 105                 110         
				Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys 
				        115                 120                 125             
				Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu 
				    130                 135                 140                 
				Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly 
				145                 150                 155                 160 
				Cys Gly Cys Arg

Claims (40)

  1. 一種製造由多根電紡可生物分解纖維所組成的一骨誘導性骨再生材料的方法，包含：
    製備一由所述多根電紡可生物分解纖維所組成的纖維支架材料，其中所述多根電紡可生物分解纖維的直徑為40-320μm、長度為5-20mm，其中
    所述多根電紡可生物分解纖維彼此纏結，形成具有纖維間空間的一棉絮狀結構，在其中形成供細胞生長的微環境，
    所述電紡可生物分解纖維包含43-60vol%的β-TCP粒子分佈於所述電紡絲可生物分解纖維中，使得一部分的β-TCP粒子部分暴露在所述電紡絲可生物分解纖維的表面，沒有被一層聚合物覆蓋，同時
    將所述纖維支架浸沒於一包含BMP-2的溶液中，使BMP-2與暴露在纖維表面的β-TCP粒子結合，於整個棉絮狀結構形成微環境，以製造骨誘導性的骨移植物，
    其中暴露於所述電紡可生物分解纖維表面的β-TCP粒子上BMP-2結合位點之面積，係藉由所述電紡可生物分解纖維中β-TCP粒子的含量來調節。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中所述多根電紡可生物分解纖維的直徑為70-250μm。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中所述多根電紡可生物分解纖維的長度為5-20μm。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中所述多根電紡可生物分解纖維包含PLGA。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中所述β-TCP粒子的直徑為2-5μm。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中所述BMP-2為可靶向的BMP-2。
  7. 一種由如申請專利範圍第1-6項所述之方法所製造的骨誘導性骨再生材料。
  8. 一種用於骨誘導性骨再生材料的纖維支架材料，包含多根電紡可生物分 解纖維，
    其中所述的多根電紡可生物分解纖維的直徑為40-320μm、長度為5-20mm，
    其中多根電紡可生物分解纖維束彼此纏結，形成具有纖維間空間的一棉絮狀結構，在其中形成供細胞生長的微環境，
    其中所述電紡可生物分解纖維包含45-60vol%的β-TCP粒子分佈於所述電紡可生物分解纖維中，使得部分的β-TCP粒子部分暴露在所述電紡可生物分解纖維的表面，沒有被一層聚合物覆蓋，
    其中暴露於所述電紡可生物分解纖維表面的β-TCP粒子上BMP-2結合位點之面積，係藉由所述電紡可生物分解纖維的β-TCP粒子含量來調節。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之纖維支架材料，其中所述多根電紡可生物分解纖維的直徑為70-250μm。
  10. 如申請專利範圍第8項所述之纖維支架材料，其中所述多根電紡可生物分解纖維的長度為4-10μm。
  11. 如申請專利範圍第8項所述之纖維支架材料，其中所述多根電紡可生物分解纖維包含PLGA。
  12. 如申請專利範圍第8項所述之纖維支架材料，其中所述β-TCP粒子的直徑為2-5μm。
  13. 如申請專利範圍第8項所述之纖維支架材料，其中所述β-TCP粒子結合於BMP-2。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之纖維支架材料，其中所述BMP-2為可靶向的BMP-2。
  15. 如上述申請專利範圍中任一項所述之纖維支架材料，其中BMP-2包含SEQ ID NOS：1-38中的任一個，或來自SEQ ID NOS：1-38的組合或兩個以上序列。
  16. 一種組合物，包含：
    一包含約60wt%至約80wt%含鈣化合物的支架，和
    一種可靶向的BMP-2，包含(i)VIGESTHHRPWS(SEQ ID NO：23)、(ii)IIGESSHHKPFT(SEQ ID NO：24)、(iii)GLGDTTHHRPWG(SEQ ID NO： 25)、(iv)ILAESTHHKPWT(SEQ ID NO：26)、或(v)(i)-(iv)中兩個或兩個以上的組合。
  17. 如申請專利範圍第16項所述之組合物，其中所述可靶向的BMP-2包含VIGESTHHRPWS(SEQ ID NO：23)。
  18. 如申請專利範圍第16項或申請專利範圍第17項所述之組合物，其中所述可靶向的BMP-2包含IIGESSHHKPFT(SEQ ID NO：24)。
  19. 如申請專利範圍第16-18項中任一項所述之組合物，其中所述可靶向的BMP-2包含GLGDTTHHRPWG(SEQ ID NO：25)。
  20. 如申請專利範圍第16-19項中任一項所述之組合物，其中所述可靶向的BMP-2包含ILAESTHHKPWT(SEQ ID NO：26)。
  21. 如申請專利範圍第16-20項中任一項所述之組合物，其中所述可靶向的BMP-2還包含LLADTTHHRPWT(SEQ ID NO：1)。
  22. 如申請專利範圍第16-21項中任一項所述之組合物，其中所述可靶向的BMP-2包含
    Figure 110122386-A0101-13-0003-61
    Figure 110122386-A0101-13-0003-60
    (SEQ ID NO：32)。
  23. 如申請專利範圍第16-22項中任一項所述之組合物，其中所述可靶向的BMP-2包含SEQ ID NOS：33-38中的任一項。
  24. 如申請專利範圍第16-22項中任一項所述之組合物，其中所述可靶向的BMP-2包含SEQ ID NOS：33。
  25. 如申請專利範圍第16-24項任一項所述之組合物，其中所述含鈣化合物包含磷酸鈣、六方方解石或磷酸鈣和六方方解石。
  26. 如申請專利範圍第16-24項中任一項所述之組合物，其中所述含鈣化合物包含β-磷酸三鈣(β-TCP)。
  27. 如申請專利範圍第26項所述之組合物，其中所述β-TCP以所述支架的約60wt%至約80wt%存在於所述支架中。
  28. 如申請專利範圍第27項所述之組合物，其中所述β-TCP以約70wt%的量存在於所述支架中。
  29. 如申請專利範圍第26項所述之組合物，其中所述β-TCP以所述支架約 30wt%至約50wt%存在於所述支架中。
  30. 如申請專利範圍第29項所述之組合物，其中所述β-TCP以約40wt%的量存在於所述支架中。
  31. 如申請專利範圍第16-26項或申請專利範圍第29-30項中任一項所述之組合物，其中所述含鈣化合物包含六方方解石。
  32. 如申請專利範圍第31項所述之組合物，其中所述六方方解石以所述支架的約20wt%至40wt%存在於所述支架中。
  33. 如申請專利範圍第32項所述之組合物，其中所述六方方解石以約30wt%的量存在於所述支架中。
  34. 如申請專利範圍第25或申請專利範圍第31-33項任一項所述之組合物，其中所述六方方解石包含摻矽的六方方解石(SiV)。
  35. 如申請專利範圍第16-34項中任一項所述之組合物，其中所述支架包含一可生物分解的聚合物。
  36. 如申請專利範圍第16-34項中任一項所述之組合物，其中所述支架包含聚乳酸-甘醇酸(PLGA)。
  37. 如申請專利範圍第36項所述之組合物，其中所述支架包含約20wt%至約40wt%的PLGA。
  38. 如申請專利範圍第37項所述之組合物，其中所述支架包含約30wt%的PLGA。
  39. 一種治療有需要的個體的方法，包括對所述受試者施用任一項前述申請專利範圍中所述之組合物。
  40. 如申請專利範圍第38項所述之方法，其中所述個體具有骨缺損。
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