JP7239575B2 - サンプル中の自律的に活性なｂ細胞受容体または自律的に活性化されたｂ細胞受容体を認識する方法 - Google Patents

Description

本発明は、抗体またはその断片の産生、同定および選別の分野、ならびに特に悪性Ｂ細胞新生物などの癌疾患の診断の範囲におけるそれらの使用に関する。

悪性Ｂ細胞新生物は、一般的に造血系またはリンパ系の悪性疾患を示す。それらは、たとえば白血病などの臨床像を含み、広義では癌疾患に属している。白血病は、白血病細胞とも呼ばれる機能不全の白血球細胞前駆体の形成が大幅に増加することを特徴としている。これらの細胞は骨髄に広がり、そこで通常の血液形成を置換し、通常であれば末梢血に増殖して蓄積する。それらは、肝臓、脾臓、リンパ節および別の器官に浸潤し、それによってそれらの機能を損なう可能性がある。血液形成の障害は、正常な血液成分の減少につながり、その結果、酸素輸送赤血球の不足、止血作用のある血小板の不足、および成熟した機能的白血球の不足による貧血が生じる可能性がある。

病気の経過に応じて、急性白血病と慢性白血病とに区別される。急性白血病は生命を脅かす疾患であり、これは治療せずに放置すると数週間～数ヶ月で死に至る。これに対して、慢性白血病はたいてい数年にわたって進行し、しばしば初期段階で症状は低下する。

白血病の最も重要な形態は次のとおりである：
・急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）
・慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）
・急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）
・慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）

通常、白血病は化学療法の範囲で治療される。これに関して、より最近の治療では、リツキシマブおよびオファツムマブと同様にＣＤ２０抗体として作用し、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の治療に使用される、たとえばＧＡ１０１（オビヌツズマブ）などのモノクローナル抗体の使用がますます増えている。これらの抗体を使用することによって、無寛解期間を約１０ヶ月延ばすことができる。

造血系またはリンパ系の別の悪性疾患（悪性Ｂ細胞新生物）は、たとえばホジキンリンパ腫や非ホジキンリンパ腫のＢ細胞バリアントなどのリンパ腫に影響を与える。

受容体に対する抗体が作り出されると、通常であれば、動物は受容体（精製、クローン化、またはペプチド断片として）で免疫化され、ハイブリドーマ細胞が作製される。これらのハイブリドーマ細胞は抗体を産生し、ＥＬＩＳＡまたは発現受容体を使用して細胞系で試験される。従来、確立された細胞株がこのために使用される。なぜなら、これらだけが簡単に培養され得るからである。この場合、特定の受容体型（たとえばＡｎｔｉ－ＩｇＧ１、Ａｎｔｉ－ＩｇＥ）に比較的特異的に結合する抗体を作製することができる。しかしながら、これは、しばしば他の受容体または他のエピトープとの交差反応につながる。

ＢＣＲ抗体の診断用途において、一般的にＢＣＲに対する抗体を１つだけ使用するのでは、たいていの場合十分ではない。なぜなら、そのような広いスペクトルの使用は、偽陽性の結果につながる可能性があるからである。むしろ、（病態生理学的）活性化、たとえば、特に自律的な活性化を示す受容体に選択的に結合する抗体を提供することが望ましいだろう。そのような抗体は、先行技術では知られておらず、その産生または選別による取得のための方法は存在していない。

白血病の治療のための先行技術の治療は、患者にとって非常に負担が大きい。概して、治療の望ましくない副作用と、薬物の多くの場合に不十分な効果とが、この疾患の高い死亡率につながると約言することができる。というのも、腫瘍細胞だけでなく、免疫系の健康な細胞も損傷されるからである。そのうえ、多くの場合、治癒に至らず、疾患が無寛解で進行する特定の期間が生じるだけである。それゆえ、治療すべき患者の特定および選択ならびに個々の治療計画の作成には、特定の形態の悪性Ｂ細胞新生物を区別して検出することができる診断手段および診断方法を使用することが重要である。

それゆえ、本発明の課題は、特に診断用途のための代替的な抗体などの代替的な構想および手段を提供して、先行技術の既存の問題を克服することである。

本発明の個々の態様を詳細に議論する前に、本明細書の範囲で使用される関連用語の意味を明らかにする。

本明細書で使用される「新生物」という用語は、一般的に、新しい身体組織の形成を指す。これが病理学的または悪性の症状である場合、悪性新生物についてのものである。つまり、悪性Ｂ細胞新生物は、Ｂ細胞の悪性で制御されない新しい組織の形成であり、この用語は、たとえば白血病やＢ細胞リンパ腫などのすべてのＢ細胞関連癌疾患に等しく適用される。

「生物学的結合分子」とは、本明細書では、たとえば、融合タンパク質を含む抗体を指すがこれに限られない。有利には、それゆえ好ましくは、そのような抗体は、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、ヒト化ＩｇＧ抗体、およびエピトープの認識配列が挿入されるヒト抗体からなる群から選択される。このような結合分子は、抗体全体の機能的断片の形態、たとえばＦａｂ断片で提供されてもよい。結合分子は、さらに別の領域または追加のエンティティも含む場合があり、その使用は診断用途の範囲で有利である。これらは、フローサイトメトリーを使用する蛍光色素（たとえば：ＦＩＴＣ、Ｒ－フィコエリトリン（Ｒ－ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ））あるいはまたビオチンや、当業者に知られている他の物質である。結合分子はさらに、免疫組織化学プロセスの範囲で基質変換酵素（たとえばＨＲＰ）と一緒に使用することもできる。さらに、診断目的で融合タンパク質を提供することもでき、この場合、たとえば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質が検出のために抗体のＦＣ部分に結合して存在する。

Ｂ細胞の表面のＢ細胞受容体またはＢ細胞受容体複合体（ＢＣＲ）の機能は、病原体を認識して結合することであるため、それをいわば膜結合抗体とみなすことができる。この結合は、ＢＣＲの構造変化をもたらし、それによって最終的にＢ細胞の活性化をもたらすシグナル伝達カスケードを引き起こす。ＢＣＲは、成熟中のＢ細胞で非常に多様に形成される。

Ｂ細胞の発生は、ヒトや他のいくつかの哺乳類でも、骨髄または胎児肝臓において起こる。発生プログラムに必要なシグナルは、いわゆる間質細胞から発生するリンパ球が受け取る。Ｂ細胞の発生では、機能するＢ細胞受容体（「抗体」の膜結合型）の形成が非常に重要である。成熟Ｂ細胞は、この抗原受容体によってのみ、後に外来抗原を認識し、対応する抗体を形成することにより敵性の構造に結合することができる。受容体の抗原特異性は、特定の遺伝子セグメントを連結することによって決定される。セグメントはＶ－、Ｄ－およびＪ－セグメントと呼ばれることから、プロセスはＶ（Ｄ）Ｊ再結合と呼ばれる。Ｂ細胞受容体の抗原結合部分を形成するこれらのセグメントは再編成される。受容体全体は、２つの同一の軽タンパク質鎖と２つの同一の重タンパク質鎖とで構成され、重鎖と軽鎖とはそれぞれジスルフィド架橋で連結されている。ＶＤＪ再結合では、Ｂ細胞受容体の重鎖のＶ－、Ｄ－およびＪ－セグメントが最初に連結され、その後に受容体軽鎖のＶ－およびＪ－セグメントが連結される。これに関して、産生的な遺伝子再編成と呼ばれる遺伝子の再編成に成功した場合のみ、細胞はそれぞれ次の発生期に進むことができる。

骨髄でのその成熟中に身体自身の抗原に反応するＢ細胞は、たいていの場合、アポトーシスによって死滅する。健康なヒトの血液では、特にサイログロブリンあるいはまたコラーゲンに対する少量の自己反応性細胞を検出することができる（Ａｂｕｌ Ｋ．Ａｂｂａｓ：Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ Ｖｉｎａｙ Ｋｕｍａｒ，Ａｂｕｌ Ｋ．Ａｂｂａｓ，Ｎｅｌｓｏｎ Ｆａｕｓｔｏ：Ｒｏｂｂｉｎｓ ａｎｄ Ｃｏｔｒａｎ－Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ；７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ ２００５，ｐ．２２４ｆ）。

そのようなＢＣＲを作り出すプロセスは遺伝子セグメントのランダムな集合に基づいていることから、新しく形成されたＢＣＲは不必要に生体構造を認識し、したがって「恒久的に活性化される」ことが起こり得る。そのような「恒久的に活性なまたは活性化された」ＢＣＲの形成を妨げるために、さまざまな生体保護メカニズムが存在する。しかしながら、発生中のＢ細胞の病理学的変化に基づきこれらが克服されると、それにより悪性あるいはまた自己免疫表現型疾患が発生する可能性がある。

対照的に、「自律的に活性な」または「自律的に活性化された」ＢＣＲは、恒久的に活性なＢＣＲの特別な種類である。従来の活性化は外部抗原から出発するが（上記を参照）、自律的に活性なＢＣＲは、同じ細胞の表面の膜構造との相互作用から生じる。ＣＬＬの臨床像については、同じ細胞の表面で互いに隣接して存在するＢＣＲ間の自律的な活性化を引き起こす相互作用を示すことができていた（Ｍ．Ｄｕｅｈｒｅｎ－ｖｏｎ Ｍｉｎｄｅｎ ｅｔ．ａｌ；Ｎａｔｕｒｅ ２０１２）。自律的に活性なＢＣＲのもう１つの例はプレＢＣＲであり、これはＢ細胞の発生を通じて発生チェックとして発現される。一方で、隣接する受容体（ＢＣＲ：ＢＣＲ）の相互作用に加えて、受容体と膜タンパク質（ＢＣＲ：膜タンパク質）との相互作用も、自律的に活性なＢＣＲまたは活性化されたＢＣＲをもたらす。

本発明によるこれらの問題の解決は、ＣＬＬを持つ患者の腫瘍細胞上に自律的に活性なＢ細胞受容体または自律的に活性化されたＢ細胞受容体があること、およびこれらの自律的に活性な受容体または活性化された受容体が、同じ患者の健康な細胞の対応する受容体では検出することができない共通のエピトープの存在を特徴としていることの驚くべき知見に基づいている。したがって、これらの細胞は、上記エピトープの存在を特徴とする自律的に活性なＢ細胞受容体の存在に基づき、抗体によって特異的に認識され、必要に応じて治療されるため、この特性を有しない健康なＢ細胞は巻き添えにされず、それによって治療をより明らかに特異的に、望ましくない副作用を少なくして実施することができる。

しかしながら、本発明のために実施された多数の実験の範囲で、驚くべきことに、これらの変性された受容体領域（エピトープ）に対して特別な特異性を有する抗体は、通常の標準的な方法を用いて産生および選別することができないことが判明した。結合研究の範囲で遺伝子改変された細胞が使用されるように実験条件が適応され、この細胞の変性されたＢ細胞受容体がｎａｔｉｖｅかつ活性化された状態になった後にのみ、所望の必要な特異性を有する適切な抗体を得ることができた。言い換えると、本発明により提案された解決策にとって、適切な診断抗体の選別のために結合研究で使用される細胞は、それらの変性された領域（エピトープ）を、大部分がｎａｔｉｖｅかつ活性化された形態で提示することが不可欠である。これに関して、いわゆるプロ／プレＢ細胞が生理学的構成に基づき特に適していることがわかった。したがって、このような特異的抗体および同様にこの特異的結合挙動も有するその機能的断片の提供により、腫瘍特異的診断と、必要に応じて、治療の成功が大幅に改善され、望ましくない全身効果が減少したおかげで、治療の成功が大幅に向上したことを特徴とする後続の治療とが可能になる。

既述のとおり、本発明によって、抗体またはその機能的断片の形態の生物学的結合分子を使用する診断方法および自律的に活性な膜結合Ｂ細胞新生物の免疫グロブリンの変性されたエピトープに選択的に結合するそのような結合分子を産生（同定および選別）する方法が提供される。本発明の好ましい実施形態によれば、生物学的結合タンパク質は、免疫学的（たとえば自己免疫）疾患で発生し、これらと因果関係がある（たとえば、アレルギー、潰瘍性大腸炎、１型糖尿病、多発性硬化症、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、セリアック病）Ｂ細胞上の自律的に活性なそのようなＢ細胞受容体に選択的に結合する。

膜結合免疫グロブリンは、標的化された、すなわち特定の免疫療法によく適した標的である。骨髄でのＢ細胞の発生中、一つ一つのＢ細胞前駆体は、個々の遺伝子セグメントを再配列することによって、その固有のほぼ独自のＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を作り出す。

自律的に活性なＢＣＲの２つのバリアント（サブセット２；サブセット４）が知られており、そのそれぞれ特徴的な分子モチーフ（エピトープ）に関して互いに異なる（Ｍｉｎｉｃｉ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｈｏｍｏｔｙｐｉｃ Ｂ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｓｈａｐｅ ｔｈｅ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋａｅｍｉａ，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍ．（２０１７））。しかしながら、当業者は、ＣＬＬサブセット２およびサブセット４のＢＣＲに加えて、自律的に活性な特性を有する更なるＢＣＲもあることを認識している。両方のバリアントは、これらのバリアントにそれぞれ特異的な異なる短いアミノ酸配列を有する。当業者は、上掲のサブセットに加えて、他のＣＬＬ－Ｂ細胞受容体も自律的に活性であることを認識している。これに関して、受容体の自律的に活性な機能に重要なサブセット２の領域は、軽鎖のアミノ酸配列ＫＬＴＶＬＲＱＰＫＡ（配列番号１）およびＶＡＰＧＫＴＡＲ（配列番号２）を特徴とし、受容体の自律的に活性な機能に重要なサブセット４の領域は、重鎖の可変部分のアミノ酸配列ＰＴＩＲＲＹＹＹＹＧ（配列番号３）およびＮＨＫＰＳＮＴＫＶ（配列番号４）によって定義される。免疫化の範囲でマウス抗体を作製するために使用されるサブセット２および４の配列は、配列番号５および６（ｖＨＣ；ＬＣ）と７および８（ｖＨＣ；ＬＣ）とのそれぞれに示される。完全を期すため、配列番号１７（ＶＳＳＡＳＴＫＧ）には、サブセット４のＢＣＲの重鎖の可変部分に特異性を有する更なる標的配列または更なるエピトープが示される。したがって、配列番号３および４によるＢＣＲ（サブセット４）の自律的に活性な状態の形成に関与する標的配列（エピトープ）に加えて、配列番号１７による配列は、このサブセットの更なる特徴的な特性を表す。

重大な疾患の進行を伴う患者におけるＢ細胞受容体の２つのバリアントとしてのサブセット２および４の発見および特徴付けは、多数の個々の症例研究の調査に基づいており、それゆえ、可能な限り多数のＢＣＲの他のサブタイプでは、２つの既知のサブタイプを特徴付ける同じ標的配列（エピトープ）が存在せず、重篤な疾患の進行と相関していることを意味しない点に留意されたい。

これらのサブセットの両方に対する抗体は、原則として標準的な方法によって、たとえばマウスで作り出すことが望ましいが、驚くべきことに、ペプチドを使用した免疫化により、所望の特異的抗体が形成されないことが観察された。たとえば、変性された配列領域を含むＢＣＲの軽鎖の使用など、受容体の個々の鎖を使用した免疫化も望ましい成功を遂げなかったことから、組換え産生された可溶型のＢＣＲ（配列番号５および６を参照）でマウスが最終的に免疫化された。続いて、これらのマウスから所望の特異性を有する免疫細胞を取得し、細胞融合によってハイブリドーマ細胞にトランスフェクションすることができた。これに関して、驚くべきことに、活性抗体はＥＬＩＳＡ試験または他の標準的な方法では同定することができなかった。しかしながら、ＥＬＩＳＡによる最初のステップで潜在的な結合パートナーとして同定されたクローンは、選別後に非特異的に結合するか、または自律的に活性な受容体（配列番号１および２を含む）に結合しないことが判明し、それゆえ廃棄しなければならなかった。

この認識に至るまで使用されてきた方法には、ＥＬＩＳＡやＳＰＲなどの標準的な方法だけでなく、結合対照として細胞内ＦＡＣＳ染色を用いた線維芽細胞での細胞内発現も含まれていた。

更なる試験シリーズを精緻化した後、本発明による適切な結合分子の選別は、遊離受容体またはそれらの断片でも、膜結合または細胞内受容体断片でも首尾良く実施することができないことがわかった。代わりに、完全かつ機能的なＢ細胞受容体が膜結合でその範囲に提示された細胞系を使用してのみ選別が可能であることが観察された。これに関して、変性された領域（エピトープ）を持つＢＣＲが、これらの細胞中または細胞上に自律的に活性で存在するか、または提示されることが非常に重要である。その条件が主に生理学的－ｎａｔｉｖｅなｉｎ ｓｉｔｕシナリオを反映しているこの手順でのみ、腫瘍細胞、すなわち細胞膜上にこの細胞型のサブセット２またはサブセット４に特徴的なエピトープを持つＢＣＲを発現するＢ細胞にのみ高度に特異的かつ選択的に結合し、定義によりサブセット２または４のＢ細胞を表さない他のＢ細胞またはそれらの受容体（ＢＣＲ）には結合しない抗体を同定することができた。言い換えると、本発明により提案された結合分子は、自律的に活性なＢ細胞受容体または自律的に活性化されたＢ細胞受容体に選択的に結合し、これらのＢ細胞受容体は、構造ドメインまたはエピトープ（標的配列）の存在を特徴とし、かつＢ細胞受容体の自律的に活性な状態または活性化された状態の原因となる。本発明により診断用途に提案された結合分子の選択的結合挙動は、Ｂ細胞の自律的に活性な状態または活性化された状態の原因となる構造ドメインまたはエピトープを持たないＢ細胞の受容体または他の膜構造に結合しないことを意味する。したがって、本発明により提案された結合分子は、サブセット２またはサブセット４に特徴的ではないＢ細胞受容体の標的配列に選択的に結合せず、特に、配列番号１、２、３および／または４のいずれも持たないＢ細胞受容体には結合しない。

さらに、「トリプルノックアウト」マウス（ＴＫＯ）から取得したプロ／プレＢ停止細胞の使用は、取扱いが困難で取得に手間がかかるにもかかわらず、これらの受容体を発現し、試験系の範囲でこれらの受容体の同定に使用されるのによく適していることがわかった。プロ／プレＢ細胞期は、ＢＣＲの成熟および選別を実施するように自然に設計されており、この細胞期は、それらの酵素特性（シャペロンなど）に基づき「困難な」ＢＣＲ成分も正確に折り畳み、それらの表面に十分に生理学的にｎａｔｉｖｅな形態で提示するのに特に適している。以下に説明する欠失（ノックアウト）は、組換えまたはサロゲート軽鎖（「ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ」）の使用によって所望のＢＣＲの変化が起きることを妨げる。自律的に活性なＢ細胞受容体または活性化されたＢ細胞受容体に対する選別的－特異的結合挙動を有する抗体の選別の範囲でＢＣＲの発現および提示のためにプロ／プレＢ停止細胞のこれらの細胞またはこの細胞型を使用することによって、先行技術での選別に従来使用されてきた系と比較して、一次ＴＫＯ細胞の使用と、数回の継代にわたるそれらの培養とのそれぞれの高い出費を正当化するはるかに高い品質を特徴とする選別プラットフォームが提供される。

上記の適切なハイブリドーマ細胞の選別後、モノクローナル抗体の形態で診断目的に適した抗体を大量に取得することができた。抗体の結合部位は、これらの細胞のＤＮＡを配列決定することによって確かめることができた（配列番号９および１０を参照）。対応する方法が当業者に知られており、市販もされている。これに関して、より多くの数のハイブリドーマ細胞を取得し、最良の結合活性（特異性および結合強度／親和性）を有する細胞を選別することが有利である。

このようにして得られた結合部位に関する遺伝情報によって、通常の組換え経路で所望の特異性を有するモノクローナル抗体を作製するために、コード配列を発現プラスミドに導入した。これらの抗体は、それらの独自の特異性に基づき、従来の診断手段と比較してより優れた診断特異性を示した。当業者は、これらの組換え抗体が生物工学的手法で大量に産生することができることを理解している。合成された抗体の精製には、標準化された方法、たとえば、沈殿、ろ過およびクロマトグラフィーの組合せを適用することができ、それは当業者に周知であるが、ここで留意すべき点は、抗体を変性させず、たとえばタンパク質、発熱物質および毒素などの考えられる異物を定量的に除去することである。

所望の抗体は、抗体がグリコシル化、たとえば、特にヒトのグリコシル化を受ける系で発現されることが好ましい。そのような系は当業者に周知であり、昆虫細胞（Ｓ２細胞）、哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞）、および特に好ましくは、たとえばＨＥＫ２９３Ｔ細胞などのヒト細胞の使用を含む。

十分に精製された抗体は、それが、特定の免疫応答を引き起こすアイソタイプ、たとえば、Ｆｃ受容体を介して腫瘍に対する免疫応答をもたらすＩｇＧサブタイプなどを有している場合には、それ自体でも治療効果があり得る。

一方で、抗体は断片として存在する場合もある。完全な抗体の場合と同様に、使用される断片は、診断用に、たとえば、蛍光色素、ビオチンおよび／または酵素サブユニットに通常の手法でカップリングすることによって変性される。

診断用には、フローサイトメトリーまたは免疫組織化学の範囲などの標準化された方法で抗体を使用することが好ましい。有利には、診断目的のために提案された抗体、生物学的結合分子またはその機能的断片はマウス骨格を有する。フローサイトメーターでの検出は、有利には二次抗体を使用して、または代替的に、好ましくは抗体、蛍光色素、生物学的結合分子もしくはその機能的断片に直接結合した蛍光色素を使用して行われる。

安定した貯蔵のために、抗体またはその断片を安定化された形態で提供することが有利でありえ、それはしたがって好ましくもある。このために、たとえば、安定化された塩緩衝液で乾燥を行ってよい。そのような緩衝液は、たとえば、当業者に知られているリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）であってよい。乾燥の適切な形態は、たとえば凍結乾燥または冷凍乾燥である。

本発明の個々の態様を、例を用いて以下により詳細に説明する。

実験手順の詳細な説明を行う前に、以下の説明を参照されたい。

変性されたＢ細胞受容体に選択的に結合する抗体の産生および同定は、主要な予期しない問題によって特徴付けられていた。ハイブリドーマの作製は、標準的な方法を使用して行った。ハイブリドーマグループからの上清をプールし、ＥＬＩＳＡ（ＥＬＩＳＡプレート上の可溶性Ｂ細胞受容体）を使用して陽性結合事象について調べた。陽性プールを分離し、個々のクローンをテストした。これに関して、驚くべきことに、ＥＬＩＳＡで陽性クローンはもはや同定されなかった。プールの陽性ＥＬＩＳＡシグナルは、その後に非特異的結合であることが判明した。

抗体の認識のためにより優れたエピトープを作り出すために、ＢＣＲの軽鎖を線維芽細胞で発現させた。これにより、自律的なシグナルに関与するモチーフ（エピトープ）を運ぶタンパク質の正確な折り畳みが保証されることになる。これらの細胞を用いて、細胞内ＦＡＣＳ解析を実施した。陽性クローン（抗体）を同定することはできなかった。

こうした理由から、ＲＡＭＯＳ細胞（ヒトバーキットリンパ腫細胞株）を別の実験で変性し、それらは機能的に変性されたＢＣＲを示した。これにより、完全に正確な生合成、折り畳み、およびＢＣＲの変性が保証されることになる。このために、ＣＲＩＳＰＲを使用して細胞自体のＢＣＲを欠失させ、次いで「ＣＬＬ受容体」を分子生物学的に再構成した（ＣＭＶベクターのエレクトロポレーション）。これらの細胞を使用して陽性結合事象をテストした。この場合も、ＦＡＣＳを使用して陽性クローンを検出することはできなかった。

驚くべきことに、対照的に、ＣＬＬ受容体が遺伝子シャトルによって導入されたマウスＴＫＯ（「トリプルノックアウト」）細胞（プロ／プレＢ停止細胞）を使用すると、陽性クローンが生まれた。そしてこれは、ヒト細胞系がこれを保証することができなかったという事実にもかかわらずである。これらの細胞は、特徴としてそれらのゲノムに以下のノックアウトを有する：
－ ＲＡＧ２のノックアウトは、免疫グロブリンの固有の重鎖と軽鎖の体細胞組換えを妨げることから、ＢＣＲの内因性形成は排除される。これは、この発生期で、対応して処理されたＢ細胞の停止、遮断または「凍結」につながる。ＲＡＧ１とＲＡＧ２は、最初に通常のＶＤＪ再編成を可能にする複合体を形成することが知られていることから、ＲＡＧ１のノックアウトが同じ効果を持つ手段であり、ひいてはＲＡＧ２のノックアウトに代わるものであり、本発明による教示に含まれる。
－ サロゲート軽鎖の一部であるＬａｍｂｄａ５を欠失させると、プレＢＣＲの形成が妨げられる。プレＢＣＲは自律的に活性であるため、これは自律的に活性な受容体の検出に干渉することになる。ここで新しいＢＣＲが細胞にクローンニングされるため、プレＢＣＲは、これが望ましくないサロゲート軽鎖と組み合わせて望ましい重鎖（ＨＣ）とともに表面に現れ、選別を妨げることになるという理由で望ましくない。
－ ＢＣＲシグナル経路で最も重要なアダプタータンパク質であるＳＬＰ６５のノックアウトは、場合によっては再構成されたＢＣＲによるＴＫＯ細胞の活性化を妨げる。

ＲＡＧ２またはＲＡＧ１とＬａｍｂｄａ５のノックアウトの組合せにより、重鎖（ＨＣ）のＶＤＪセグメントの初期の再配置によって古典的に特徴付けられるプロＢ細胞期からプレＢ細胞期への移行が遮断される。それゆえ、それらはプロ／プロＢ細胞である。

ＲＡＧ２またはＲＡＧ１とＬａｍｂｄａ５のノックアウトは、ＢＣＲの発現および適切な抗体の選別にとって十分である。ＢＣＲの活性は、誘導性ＳＬＰ６５で再構成することによって測定することができる。

ここでの選別方法は、ＦＡＣＳ解析を使用したＳＬＰ６５の誘導後のＣａフラックスの測定およびＩｎｄｏ－１などのＣａ^２＋依存性色素の使用である。これらの方法は当業者に知られている（Ｍ．Ｄｕｅｈｒｅｎ－ｖｏｎ Ｍｉｎｄｅｎ ｅｔ．ａｌ；Ｎａｔｕｒｅ ２０１２を参照）。

最初の２つのノックアウトによって、「目的のＢＣＲ」のみが表面に発現される。誘導性ＳＬＰ－６５を使用して細胞を再構成することによって、さらに、発現されたＢＣＲの機能を特徴付けることができ、ひいては表面のＢＣＲの自律的に活性な状態を選別前に検証することができる。

これらの細胞を「標的」として、ＦＡＣＳを使用して、ＢＣＲの自律的な活性化を基礎付けて特徴付ける変性領域に特異的に結合する抗体を同定することに成功した。そしてこれは、ＲＡＭＯＳ細胞の同じ受容体型への結合は成功しなかったにもかかわらずである！

このために、表面に「目的のＢＣＲ」を担持する細胞を、まずプールされた上清とともにインキュベートし、数回の洗浄ステップの後、二次抗体を使用して結合抗体を検出した。特異的選別のために、「目的のＢＣＲ」の異なるバージョンを発現するＴＫＯ細胞（ＴＫＯ）を使用した。図１に示される選別マトリックスは、ＣＬＬサブセット２ＢＣＲの選別の典型例であり、陽性クローンの同定および選別に用いた。同定をより容易にするために、ハイブリドーマの上清をプールして測定した。結合を示したグループを分離し、それぞれのハイブリドーマの上清の結合をテストした。

選別された抗体が他のＢＣＲバリアントではなく、変性されたＢＣＲに特異的に結合することの確認は、２つのブランクサンプル、すなわちＢＣＲを持たない細胞（図１Ａを参照）と非ＣＬＬ－ＢＣＲを持つ細胞（図１Ｅを参照）を使用して行った。白血病患者の血液からの一次Ｂ細胞は、ＦＡＣＳを使用して結合について調べた。選別された抗体は、標的構造を示すＢＣＲを特異的に同定することができた。これは遺伝子レベルで確認した。この標的構造を持たないサンプルは、結合を示さなかった。

本発明を、図１を考慮しながら、例を用いて以下により詳細に説明する。

ＣＬＬサブセット２ＢＣＲの選別の典型例である選別マトリックスを示す図。 サブセット２に特異的な抗体の使用例を用いた解析の例を示す図。

例１
トリプルノックアウト細胞（ＴＫＯ）の産生の出発点は、遺伝子Ｌａｍｂｄａ５、ＲＡＧ２およびＳＬＰ－６５のそれぞれのノックアウトを有するトランスジェニックマウスによって形成される（Ｄｕｅｈｒｅｎ ｖｏｎ Ｍｉｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｎａｔｕｒｅ ４８９，ｐ．３０９－３１３）。そのようなマウスの作成は当業者に知られており、先行技術に含まれる。細胞を取得するために、マウスの犠牲後に大腿骨の骨髄を抽出した。このようにして取得した細胞を、続いてプロ／プレＢ細胞の生存を促進する条件下で培養した（３７℃、７．５％ＣＯ_２、イスコベス培地、１０％ＦＣＳ、Ｐ／Ｓ、マウスＩＬ７）。数回継代した後、対照のためにＦＡＣＳソーティングを実施し、プロ／プレＢ細胞をソーティングし、続いて培養に戻した。このために使用したマーカーは当業者に知られている。

「目的のＢＣＲ」で再構成するために、重鎖（ＨＣ）と軽鎖（ＬＣ）をコードする対応する配列を合成し、次いでＣＭＶプロモーターを持つそれぞれの発現ベクターにクローニングした。これらをリポフェクションによってパッケージング細胞株（フェニックス細胞株）に導入した。３６時間のインキュベーション後、ウイルス上清を除去し、ＴＫＯ細胞のスピンフェクションに使用した。上清を取得するための作業とＴＫＯのスピンフェクションのどちらも広く知られた方法であり、当業者に知られている。

サブセット２Ｂ細胞受容体の構造的特徴は、対応する文献から取った（上記を参照）。例示的なＣＬＬサブセット２ＶＨおよび完全なＬＣ ＤＮＡセグメントを、標準的な方法で委託メーカーにより合成させた。次いで、ＰＣＲを使用して、これらをマウスＩｇＧ１定常セグメントと融合させ、ＣＭＶベクターにクローニングした。完成したベクターの配列は、サンガー配列決定によって確認した。

ＣＬＬサブセット２ＶＨ（配列番号５）：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＲＳＹＳＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＩＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＬＹＹＣＡＲＤＱＮＡＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＣＬＬサブセット２ＬＣ（配列番号６）：
ＳＹＥＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＫＴＡＲＩＴＣＡＧＮＮＩＧＳＫＳＶＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＩＹＹＤＳＤＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＲＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＳＧＳＤＨＰＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＲＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ

ＣＬＬサブセット２ＩｇＧ１の発現には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞ベースのヒト細胞発現系を使用した。トランスフェクションには、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ベースのプロトコルを使用した。数回継代した後、上清をプールし、プロテインＧカラムを使用して、結合した細胞上清に含まれる培地を精製した。可溶性サブセット２ＩｇＧ１の純度および品質は、ウエスタンブロッティング法によって決定した。

モノクローナル抗体の産生は、マウスでの標準的な方法と、続いてハイブリドーマ細胞を作り出すことによって行った。陽性クローンのスクリーニングは、従来のようにＥＬＩＳＡを使用して行わなかった。標的構造は膜結合受容体であるため、潜在的な抗体の結合を、細胞系でも、すなわち、この細胞型に本来備わっている細胞生理学的状態を大部分保持しながら実証することが最も重要である。まず、ＦＡＣＳ解析を使用して、プールした上清のグループの結合事象について調べた。このために、さまざまなＣＬＬサブセット２ＢＣＲバリアントを、それ自体ではＢＣＲを発現することができない細胞株（ＴＫＯ）の表面に発現させた。このようにしてまず、抗体が結合を示した上清を同定することができた。続いて、個々のハイブリドーマクローンの上清を、それらの結合に関してより詳細に調べて、高い親和性を有する高度に特異的なクローンを同定した。

スクリーニング方法では、対応するＣＬＬ－ＢＣＲの重鎖（ＨＣ）と軽鎖（ＬＣ）との以下の組合せについて、先行するトランスフェクションの範囲で異なるベクターを使用し、これらの組合せをＢＣＲ再構成系の表面で使用した：
・対照（ＢＣＲを持たないトランスフェクションベクター）（図１Ａを参照）
・ＣＬＬサブセット２に典型的なＨＣ／ＬＣを持つベクター（図１Ｂを参照）
・非ＣＬＬサブセット２ＨＣ／ＣＬＬサブセット２に典型的なＬＣを持つベクター（標的モチーフ；エピトープを持たない）（図１Ｃを参照）
・ＣＬＬサブセット２に典型的なＨＣ／非ＣＬＬサブセット２ＬＣを持つベクター（図１Ｄを参照）
・１つの非ＣＬＬサブセット２ＨＣ／１つの非ＣＬＬサブセット２ＬＣを持つベクター（図１Ｅを参照）
・ＣＬＬサブセット２に典型的なＨＣ／ＬＣを持つベクター（突然変異Ｒ１１０Ｇ（標的モチーフ）を含む）（図１Ｆを参照）。

この選別の手順は、図１にＣＬＬサブセット２ＢＣＲの例を使用して概略的に示されており、「ＴＫＯ」という用語はＴＫＯ細胞（上記を参照）を指す。

１回目の選別ラウンドでは、いくつかのクローンの上清を結合して、選別マトリックスへの結合プロファイルについて調べた。「目的のＢＣＲ」への特異的結合が示されている場合、陽性結合プロファイルが提供される。そのようなプロファイルを示すグループを分離し、個々のクローンの結合プロファイルを、２回目の選別ラウンドの範囲で選別マトリックスにより再度特性評価した。モノクローナル抗体の結合は、蛍光標識されたＡｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ－ＩｇＧ抗体を使用したＦＡＣＳ結合アッセイを使用して検証した。表記：Ａ）ＢＣＲを持たない（対照）；Ｂ）ＣＬＬサブセット２に典型的なＢＣＲ；Ｃ）ランダムな重鎖およびＣＬＬサブセット２に典型的な軽鎖を持つＢＣＲ；Ｄ）ＣＬＬサブセット２に典型的な重鎖およびランダムな軽鎖を持つＢＣＲ；Ｅ）ランダムな重鎖および軽鎖を持つＢＣＲ（対照；非ＣＬＬサブセット２に典型的なＢＣＲ）；Ｆ）標的モチーフ（Ｒ１１０Ｇ）（対照）に突然変異を持つＣＬＬサブセット２に典型的なＢＣＲ。

抗体は標的構造を持つ細胞にのみ結合するという知見に基づき（ＣＬＬサブセット２ＢＣＲ；図１Ｂ）、自律的に活性な受容体を持つ細胞に特異的に結合する抗体がここに存在すると結論付けることができる。

これに関して、検出に必要なＢＣＲの正確な発現には、プロ／プレＢ細胞発生期にある細胞の使用が必要であることがわかった。これらの細胞は、正確な折り畳みとそれらの表面での発現とによって新しいＢＣＲを表すために発生遺伝学的に整えられている。ＲＡＧ２とＬａｍｂｄａ５の不活性化（ノックアウト）によって、内因性ＢＣＲまたはプレＢＣＲの発現が妨げられる。ＳＬＰ６５の欠失とそれに続く誘導性ＳＬＰ６５の再構成とにより、「目的のＢＣＲ」の活性レベルを特性評価することが可能である。

選別により選択されたモノクローナル抗体のアミノ酸配列を決定するために、個々のハイブリドーマクローンからｍＲＮＡを単離し、それらからｃＤＮＡを作り出し、アンカーＰＣＲを使用して増幅した（Ｒａｐｉｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｂ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ ａｎｄ ａｎｔｉ－ｉｄｉｏｔｙｐｅ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ；Ｏｓｔｅｒｒｏｔｈ Ｆ，Ａｌｋａｎ Ｏ，Ｍａｃｋｅｎｓｅｎ Ａ，Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ Ａ， Ｆｉｓｃｈ Ｐ，Ｓｋｅｒｒａ Ａ，Ｖｅｅｌｋｅｎ Ｈ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９９ Ｏｃｔ ２９；２２９（１－２）：１４１－５３）。

モノクローナル抗体を作り出すために、完全な免疫グロブリンに加えて、自律シグナルの能力の領域を提示する合成ペプチドも使用した。

サブセット２に対する特異的モノクローナル抗体を配列決定した。以下のアミノ酸配列を決定し、配列番号９は重鎖の可変部分（ＨＣ）に該当し、配列番号１０は軽鎖の可変部分（ＬＣ）に該当し、印を付けた領域は、示した順序でＣＤＲ１、２および３を表す。

配列番号９（ＡＶＡ－ｍＡｂ０１ ＨＣ）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＳＹＧＩＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＲＧＧＧＴＤＳＮＡＡＦＭＳＲＬＳＩＴＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＱＡＤＤＴＡＩＹＹＣＡＲＳＲＹＤＥＥＥＳＭＮＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
配列番号１０（ＡＶＡ－ｍＡｂ０１ ＬＣ）
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＳＡＳＶＧＥＴＶＴＩＴＣＲＡＳＧＮＩＨＳＹＬＡＷＹＱＱＫＱＧＫＳＰＱＬＬＶＹＮＡＫＴＬＡＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＹＳＬＫＩＮＳＬＱＰＥＤＦＧＳＹＹＣＱＨＦＷＮＴＰＰＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ

配列番号９によるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に対応する重鎖の部分配列は、配列番号１１～１３に示され、配列番号１０によるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に対応する軽鎖の部分配列は、配列番号１４～１６に表される。

配列番号１１（ＡＶＡ－ｍＡＢ０１ ＣＤＲ１ ＨＣ）
ＧＦＳＬＴＳＹＧ
配列番号１２（ＡＶＡ ｍＡＢ０１ ＣＤＲ２ ＨＣ）
ＩＷＲＧＧＧＴ
配列番号１３（ＡＶＡ ｍＡＢ０１ ＣＤＲ３ ＨＣ）
ＡＲＳＲＹＤＥＥＥＳＭＮＹ
配列番号１４（ＡＶＡ ｍＡＢ０１ ＣＤＲ１ ＬＣ）
ＧＮＩＨＳＹ
配列番号１５（ＡＶＡ ｍＡＢ０１ ＣＤＲ２ ＬＣ）
ＮＡＫＴ
配列番号１６（ＡＶＡ ｍＡＢ０１ ＣＤＲ３ ＬＣ）
ＱＨＦＷＮＴＰＰＴ

上記の手順は、ＣＬＬサブセット２に特異的な抗体を作り出すための例である。サブセット４の特定の配列およびアイソタイプを使用して同じプロセスを実施した。

例示的なＣＬＬサブセット４ＶＨおよび完全なＬＣ ＤＮＡセグメントを、標準的な方法で委託メーカーにより合成させた。次いで、ＰＣＲを使用して、これらをマウスＩｇＧ１定常セグメントと融合させ、ＣＭＶベクターにクローニングした。完成したベクターの配列は、サンガー配列決定によって確認した。

ＣＬＬサブセット４ＨＣ（配列番号７）：
ＱＶＱＬＱＱＷＧＡＧＬＬＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＡＶＹＧＧＳＦＳＧＹＹＷＴＷＩＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥＩＮＨＳＧＳＴＴＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＮＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＧＤＴＰＴＩＲＲＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＣＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＣ

太字の領域は、その自律的に活性な状態に関与するサブセット４のＢＣＲの重鎖の可変部分の標的配列（エピトープ）を示している（配列番号３および４を参照）。

ＣＬＬサブセット４ＬＣ（配列番号８）：
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＤＧＮＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲＲＬＩＹＫＶＳＤＲＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＬＹＹＣＭＱＧＴＨＷＰＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ．

例２
本発明による教示を用いて、患者から少量の末梢血を採取した。解析のために、１００μｌの血液を反応容器に移し、２ｍｌのＰＢＳ－ＢＳＡ緩衝液を入れた。続いてサンプルをエッペンドルフ５８０４遠心機で１５００ｒｐｍにて５分間遠心分離した。上清を廃棄し、沈殿物をよく混ぜた。続いて抗体を加えた。暗所で室温にて１５分間インキュベートする前に、以下の表面パラメーターに対して染色を行った：１）ＣＤ１９－ＦＩＴＣ、２）ＣＤ５－ＰＥ、および３）ＣＬＬサブセット２に特異的な抗体（ＡＰＣ）。その後、溶解を開始し、赤血球を溶解した。既述のとおり、細胞をＰＢＳ－ＢＳＡ緩衝液で２回洗浄し、５００μｌの０．１％ＰＢＳ－ＢＳＡ緩衝液に取り込んで再懸濁した。フローサイトメーターで測定するまで、細胞を２～８℃の暗所で保管した。

ＦＡＣＳによる解析は、ＢＤＣａｌｉｂｕｒで行った。個々のレーザーと検出パラメーターの設定は、デバイスメーカーの指示に従って行い、当業者には周知である。続いて、ＦｌｏｗＪｏ解析ソフトウェアを使用して、解析の生データを評価した。最初にリンパ球集団をＦＳＣ／ＳＳＣブロット中で選択して標識を行った。次いで、この選択のために、ＣＤ１９陽性Ｂ細胞に焦点を合わせ、サブセット２に特異的な抗体の結合を解析した。図２は、サブセット２に特異的な抗体の使用例を用いたそのような解析の例を示している。最初の工程で、ＣＤ１９陽性Ｂ細胞をさらに解析するために選択した（左パネル）。次いで、これらを特異的な抗体の結合について調べた（右パネル）。

Claims (5)

1. サンプル中の自律的に活性なＢ細胞受容体または自律的に活性化されたＢ細胞受容体を、自律的に活性なＢ細胞受容体または自律的に活性化されたＢ細胞受容体に選択的に結合する生物学的結合分子を使用して認識する方法であって、前記生物学的結合分子は、抗体または当該抗体と同様の特異的結合挙動を有するその断片であり、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３によって示される重鎖の可変部分のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に対応する部分配列と、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６によって示される軽鎖の可変部分のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に対応する部分配列を含み、かつ、前記自律的に活性なＢ細胞受容体または自律的に活性化されたＢ細胞受容体は、前記結合分子が選択的に結合し、かつ前記Ｂ細胞受容体の自律的に活性な状態または自律的に活性化された状態の原因となる構造ドメインまたはエピトープの存在を特徴とする、方法。
2. 前記結合分子が、サブセット２に特徴的な前記Ｂ細胞受容体の標的配列に選択的に結合することを特徴とする、請求項１記載の方法。
3. 前記結合分子が、少なくとも１種の蛍光染料を含むことを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
4. 前記結合分子が、前記Ｂ細胞受容体の自律的に活性な状態または自律的に活性化された状態の原因となる構造ドメインまたはエピトープを持たないＢ細胞の受容体または他の膜構造に結合しないことを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
5. 前記結合分子が、サブセット２に特徴的ではないＢ細胞受容体の標的配列に結合しないことを特徴とする、請求項４記載の方法。

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