JP7237387B2 - 抗ｈｅｒ２アフィボディ及びこれをスイッチ分子として用いるスウィチャブルキメラ抗原受容体 - Google Patents

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本発明は、大韓民国産業通商資源部の支援下で課題番号２０００２８９３によってなされたものであり、この課題の研究管理専門機関は韓国産業技術評価管理院、研究事業名は“バイオ産業核心技術開発事業”、研究課題名は“革新スウィチャブルＣＡＲＴ技術を用いたＨＥＲ２標的卵巣癌治療剤開発”、主管機関はアブクロン（株）、研究期間は２０１８．１０．０１～２０２１．０６．３０である。
本特許出願は、２０２０年４月１７日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０－２０２０－００４７０２５号に対して優先権を主張し、この特許出願の開示事項は、本明細書に参照によって組み込まれる。
本発明は、“抗ＨＥＲ２アフィボディ及びこれをスイッチ分子として用いるスウィチャブルキメラ抗原受容体”に関する。
初期段階の臨床試験で印象的な成功を収めたにもかかわらず、既存のＣＡＲ－Ｔ細胞は、生体内での活性化及び拡張に対する制御が不可能な点で限界があった。例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、患者の抗原陽性細胞に出会うと１０４倍数まで急速に増殖し、腫瘍溶解症候群（ｔｕｍｏｒ ｌｙｓｉｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＴＬＳ）と致命的なサイトカイン放出症候群（ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＣＲＳ）による深刻な症状を招く。追加の合併症が、ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗原に対する持続的な活性化（ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ）によって引起こされることがある。例えば、ＣＡＲＴ－１９の場合、操作されたＴ細胞が悪性Ｂ細胞の他に正常Ｂ細胞も無差別的に殺し、長期間のＢ細胞無形性（Ｂ ｃｅｌｌ ａｐｌａｓｉａ）を引き起こす。最後に、既存ＣＡＲ－Ｔ細胞の固定した抗原特異性は、ＣＡＲＴ－１９治療を受ける全患者の１０％にもおいて再発の根源として明らかにされた抗原損失脱出突然変異体（ａｎｔｉｇｅｎ－ｌｏｓｓ ｅｓｃａｐｅ ｍｕｔａｎｔ）に対する標的化が排除される。したがって、ＣＡＲ－Ｔ細胞の安全性を向上させるために、深刻な毒性を示す場合にＣＡＲ－Ｔ細胞の活性を調節でき、抗原の突然変異が起きる場合にＣＡＲ－Ｔ細胞と標的細胞との相互作用を仲裁できるスイッチ分子の開発に対する要求が漸次増加している。
ヒト表皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２、或いは、“ＨＥＲ２／ｎｅｕ”又は“ＥｒｂＢ－２”とも呼ばれる。）は、表皮成長因子受容体ファミリーに属する１８５ｋＤａの膜横断受容体である。ＨＥＲ２遺伝子の増幅及びタンパク質の過剰発現は、多数類型の癌の発病と進行において中枢的な役割を担う。ＨＥＲ２は、乳癌の２５～３０％、胃癌の１５～３５％、及び卵巣癌の７～３８％で過剰発現し、不良な生存率と相関関係がある。ＨＥＲ２タンパク質は、近年、癌療法の重要な予測性バイオマーカー及び標的として台頭した。そのファミリーの他の構成員との同種二量体化又は異種二量体化は、細胞内チロシンキナーゼドメインの活性化を促し、ＭＡＰＫ及びＡｋｔ信号伝達経路を通じて媒介される細胞生存と増殖を触発する。臨床で利用可能なＨＥＲ２標的化療法は、受容体二量体化を防ぐ抗体、例えば、トラスツズマブ（ハーゼプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）社）及びペルツズマブ（パージェタ（Ｐｅｒｊｅｔａ）、ジェネンテック社）、抗体－薬物接合体、例えばＴ－ＤＭ１（カドサイラ（Ｋａｄｃｙｌａ）、ジェネンテック社）又はチロシン－キナーゼドメインを標的化する小分子抑制剤（例えば、ラパチニブ、タイバーブ（Ｔｙｖｅｒｂ）、グラクソスミスクライン（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；二重ＨＥＲ２及びＥＧＦＲ抑制剤）を含む。
本明細書全体を通じて多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照によって組み込まれ、本発明の属する技術分野のレベル及び本発明の内容がより明確に説明される。
ＰＣＴ国際公開公報ＷＯ２０１２－０９６７６０Ａ１（２０１２．０７．１９．公開）
本発明者らは、従来ＣＡＲ－Ｔで知られた合併症無しでＨＥＲ２を発現させる癌を治療できるキメラ抗原受容体を開発しようと鋭意研究努力した。その結果、コチニンと結合した抗ＨＥＲ２アフィボディをスイッチ分子として用いてコチニンを標的化するキメラ抗原受容体と共に処理する場合、ＨＥＲ２を発現させる癌細胞株に反応して免疫細胞活性を誘導することを究明し、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明の目的は、新規な抗ＨＥＲ２アフィボディを提供することである。
本発明の他の目的は、コチニンが結合した抗ＨＥＲ２アフィボディを含むスイッチ分子を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記スイッチ分子及び前記スイッチ分子を標的化するキメラ抗原受容体を含むスウィチャブルキメラ抗原受容体を提供することである。
本発明の一態様によれば、本発明は、下記一般式で表示されるアミノ酸配列を含む抗ＨＥＲ２アフィボディを提供する：
一般式
ＶＤＮＫＦＮＫＥＸ９Ｘ１０Ｘ１１ＡＹＷＥＩＸ１７Ｘ１８ＬＰＮＬＮＸ２４Ｘ２５ＱＸ２７Ｘ２８ＡＦＩＸ３２Ｘ３３ＬＸ３５ＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ
本明細書の一般式で定義したＸｙの形式で表現されたアミノ酸残基は、本一般式のアミノ酸配列からなるポリペプチドのターゲット抗原に対する特異的な結合特性を提供するアミノ酸残基の位置であり、前記Ｘｙは、２０種の全天然アミノ酸残基から選択されてよく、前記ｙは、一般式のアミノ酸配列においてｙ番目に該当することを意味する。
本明細書においてＸｙの形式で定義されていない位置のアミノ酸残基は、スキャフォールドアミノ酸又はスキャフォールドと呼ぶ。前記スキャフォールドアミノ酸は、本発明のポリペプチドのターゲット抗原との結合親和性を付与する前記Ｘｙ形態の無作為的アミノ酸とは区別されるアミノ酸配列であり、本発明のポリペプチド又はポリペプチド複合体としての構造的安定性を付与する。
前記一般式において、
（ｉ）前記Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１はＬＲＶで、前記Ｘ１７Ｘ１８はＶＫで、前記Ｘ２４Ｘ２５はＰＹ、ＰＰ又はＰＫで、前記Ｘ２７Ｘ２８はＳＲ又はＩＴで、前記Ｘ３２Ｘ３３はＲＳ又はＫＱで、前記Ｘ３５はＹである；
（ｉｉ）前記Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１はＬＲＧで、前記Ｘ１７Ｘ１８はＴＳで、前記Ｘ２４Ｘ２５はＨＳで、前記Ｘ２７Ｘ２８はＩＴで、前記Ｘ３２Ｘ３３はＶＳで、前記Ｘ３５はＹである；
（ｉｉｉ）前記Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１はＭＲＤで、前記Ｘ１７Ｘ１８はＶＲで、前記Ｘ２４Ｘ２５はＲＩ又はＰＰで、前記Ｘ２７Ｘ２８はＳＴ又はＳＶで、前記Ｘ３２Ｘ３３はＲＳ又はＲＱで、Ｘ３５はＹである；
（ｉｖ）前記Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１はＹＭＬで、前記Ｘ１７Ｘ１８はＶＫで、前記Ｘ２４Ｘ２５はＹＰで、前記Ｘ２７Ｘ２８はＱＨで、前記Ｘ３２Ｘ３３はＲＳで、Ｘ３５はＦである；又は
（ｖ）前記Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１はＩＮＫで、前記Ｘ１７Ｘ１８はＩＳで、前記Ｘ２４Ｘ２５はＫＥで、前記Ｘ２７Ｘ２８はＨＨで、前記Ｘ３２Ｘ３３はＨＳで、Ｘ３５はＹである。
本発明の一具現例において、前記Ｘ３５はＹである。
本発明の一具現例において、Ｘ１０はＲである。
本発明の一具現例において、Ｘ１７はＶである。
本発明の一具現例において、Ｘ２４はＰである。
本発明の一具現例において、前記抗ＨＥＲ２アフィボディは、配列番号１～８のいずれか一つのアミノ酸配列を含む。
本明細書において、“アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標））”分子は、黄色ブドウ状球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のタンパク質Ａ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）のうち、ＩｇＧに親和性がある部位であるＺ－ドメイン（Ｚ ｄｏｍａｉｎ）である。本明細書において“アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）”は、“Ｚ ｂｏｄｙ”又は“Ｚｂ”とも表現される。アフィボディは、５８個のアミノ酸残基からなる小さいタンパク質である。このようなアフィボディ分子のタンパク質配列においてＩｇＧと結合面を形成する１３個のアミノ酸は、アミノ酸配列によって様々なターゲット抗原に対する結合が可能であり、無作為的な配列が可能なので、ライブラリー（ｌｉｂｒａｒｙ）が構築できる。アフィボディ分子は、抗体と類似に、ライブラリーからファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ）、酵母タンパク質雑種法（ｙｅａｓｔ ｔｗｏ ｈｙｂｒｉｄ，Ｙ２Ｈ）などのスクリーニング方法を用いて、様々なターゲット抗原に対して結合できるアフィボディ分子を選別することができる。また、アフィボディは、分子量が６ｋＤａと非常に小さいため、一般に、１５０ｋＤａの分子量を持つＩｇＧ形態の抗体と比較して、人体投与時に全身的に広がり、腎臓濾過によって速く除去される特徴がある。したがって、アフィボディは、主に、診断試料研究開発に応用されている（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ Ｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．）。アフィボディは、一般ＩｇＧと結合した二重抗体の形態としても開発されている（Ｙｕ Ｆ ｅｔ ａｌ．，２０１４，ＭＡｂｓ）。第１世代Ｚ変異体（Ｚドメインの変異体）に基づくポリペプチドスキャフォールドに関する発明が、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９５／１９３７４に開示されたことがあり、第２世代Ｚ変異体に基づくポリペプチドスキャフォールドに関する発明が、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２００９／０８０８１１に開示されたことがある。
本発明の他の態様によれば、本発明は、上記の抗ＨＥＲ２アフィボディをエンコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。
本発明の一具現例において、本発明の前記抗ＨＥＲ２アフィボディをエンコードするヌクレオチド配列は、前記抗ＨＥＲ２アフィボディを構成するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であればよく、いかなる特定ヌクレオチド配列にも限定されないということは当業者に明らかである。これは、ヌクレオチド配列の変異が発生しても、変異されたヌクレオチド配列をタンパク質として発現させるとタンパク質配列において変化をもたらさない場合もあるためである。これをコドンの縮退性という。したがって、前記ヌクレオチド配列は、機能的に均等なコドン又は同一のアミノ酸をコードするコドン（例えば、コドンの縮退性によって、アルギニン又はセリンに対するコドンは６個である）、又は生物学的に均等なアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列を含む。
本明細書において、用語“核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）”は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）並びにＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸分子において基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドの他に、糖又は塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む（Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｕｈｌｍａｎ ａｎｄ Ｐｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０：５４３－５８４（１９９０））。
上述した生物学的均等活性を有する変異を考慮すれは、前記抗ＨＥＲ２アフィボディを構成するアミノ酸配列をコードする本発明の核酸分子は、これと実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す配列も含むものと解釈される。前記の実質的な同一性は、上述した本発明の配列と任意の他の配列を、極力対応するようにアライン（ａｌｉｇｎ）し、当業界で一般に用いられるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合に、少なくとも６０％以上の相同性、具体的には７０％以上の相同性、より具体的には８０％以上の相同性、さらに具体的には９０％以上の相同性、最も具体的には９５％以上の相同性を示す配列を意味する。配列比較のためのアラインメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）方法は当業界に公知されている。アラインメントに対する様々な方法及びアルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．４８：４４３（１９７０）；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３１（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ７３：２３７－４４（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１－３（１９８９）；Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１０８８１－９０（１９８８）；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．ＢｉｏＳｃｉ．８：１５５－６５（１９９２）ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３１（１９９４）に開示されているが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、上述した抗ＨＥＲ２アフィボディをコードする核酸分子を含む組換えベクターを提供する。
本明細書において、用語“ベクター”は、宿主細胞において目的遺伝子を発現させるための手段であり、プラスミドベクター；コスミドベクター；そしてバクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノ関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターなどを含む。
本発明の具体的な具現例によれば、本発明のベクターにおいて前記アフィボディをエンコードする核酸分子は、前記ベクターのプロモーターと作動的に結合（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）している。
本明細書において、用語“作動的に結合した”とは、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、又は転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列間の機能的な結合を意味し、これによって、前記調節配列は前記他の核酸配列の転写及び／又は解読を調節するようになる。
本発明の組換えベクターシステムは、当業界に公知の様々な方法を用いて構築でき、これに関する具体的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）に開示されており、この文献は、本明細書に参照によって組み込まれる。
本発明のベクターは、典型的に、遺伝子クローニングのためのベクター又はタンパク質の発現のためのベクターとして構築されてよい。また、本発明のベクターは、原核細胞又は真核細胞を宿主として構築されてよい。
例えば、本発明のベクターが発現ベクターであり、真核細胞を宿主とする場合には、哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター（例えば、メタロチオニンプロモーター、β－アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター及びヒト筋肉クレアチンプロモーター）又は哺乳動物ウイルスから由来したプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）のプロモーター及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）が用いられてよく、これらは一般に、転写終結配列としてポリアデニル化配列を有する。
本発明のベクターはそれから発現するポリペプチド又はタンパク質の精製を容易にするために、他の配列と融合されてもよい。融合される配列は、例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ，ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ，ＵＳＡ）及び６ｘ Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｕｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）などがある。
一方、本発明の発現ベクターは、選択標識として、当業界で通常用いられる抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲネチシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。
本発明の他の態様によれば、本発明は、前記組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
本発明のベクターを安定且つ連続してクローニング及び発現させ得る宿主細胞は、当業界に公知のいかなる宿主細胞も利用可能である。例えば、前記ベクターの好適な真核細胞宿主細胞は、サル腎臓細胞７（ＣＯＳ７：ｍｏｎｋｅｙ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ）、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）細胞、Ｗ１３８、仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ：ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ）細胞、ＭＤＣＫ、骨髄腫細胞株、ＨｕＴ７８細胞及びＨＥＫ－２９３細胞を含むが、これに限定されない。
本明細書において、用語“形質転換された”、“形質導入された”又は“形質感染された”とは、外因性核酸が宿主細胞内に伝達又は導入される過程のことを指す。“形質転換された”、“形質導入された”又は“形質感染された”細胞は、外因性核酸で形質転換、形質導入又は形質感染された細胞であり、前記細胞は、当該細胞及びその継代培養による子孫細胞を含む。
本発明の他の態様によれば、本発明は、コチニンと結合した、下記一般式で表示される抗ＨＥＲ２アフィボディを含むキメラ抗原受容体効果器細胞（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）を活性化するためのスイッチ分子（ｓｗｉｔｃｈ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を提供する：
一般式
ＶＤＮＫＦＮＫＥＸ９Ｘ１０Ｘ１１ＡＹＷＥＩＸ１７Ｘ１８ＬＰＮＬＮＸ２４Ｘ２５ＱＸ２７Ｘ２８ＡＦＩＸ３２Ｘ３３ＬＸ３５ＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ
前記一般式において、
（ｉ）前記Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１はＬＲＶで、前記Ｘ１７Ｘ１８はＶＫで、前記Ｘ２４Ｘ２５はＰＹ、ＰＰ又はＰＫで、前記Ｘ２７Ｘ２８はＳＲ又はＩＴで、前記Ｘ３２Ｘ３３はＲＳ又はＫＱで、前記Ｘ３５はＹである；
（ｉｉ）前記Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１はＬＲＧで、前記Ｘ１７Ｘ１８はＴＳで、前記Ｘ２４Ｘ２５はＨＳで、前記Ｘ２７Ｘ２８はＩＴで、前記Ｘ３２Ｘ３３はＶＳで、前記Ｘ３５はＹである；
（ｉｉｉ）前記Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１はＭＲＤで、前記Ｘ１７Ｘ１８はＶＲで、前記Ｘ２４Ｘ２５はＲＩ又はＰＰで、前記Ｘ２７Ｘ２８はＳＴ又はＳＶで、前記Ｘ３２Ｘ３３はＲＳ又はＲＱで、Ｘ３５はＹである；
（ｉｖ）前記Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１はＹＭＬで、前記Ｘ１７Ｘ１８はＶＫで、前記Ｘ２４Ｘ２５はＹＰで、前記Ｘ２７Ｘ２８はＱＨで、前記Ｘ３２Ｘ３３はＲＳで、Ｘ３５はＦである；又は
（ｖ）前記Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１はＩＮＫで、前記Ｘ１７Ｘ１８はＩＳで、前記Ｘ２４Ｘ２５はＫＥで、前記Ｘ２７Ｘ２８はＨＨで、前記Ｘ３２Ｘ３３はＨＳで、Ｘ３５はＹである。
本発明の一具現例において、前記Ｘ３５はＹである。
本発明の一具現例において、Ｘ１０はＲである。
本発明の一具現例において、Ｘ１７はＶである。
本発明の一具現例において、Ｘ２４はＰである。
本発明の一具現例において、前記抗ＨＥＲ２アフィボディは、配列番号１～８のいずれか一つのアミノ酸配列を含む。
前記コチニンは、ニコチン代謝の主要産物であり、下記化学式１の構造を有する物質のことを指す。
Figure 0007237387000001
本明細書において“スイッチ分子（ｓｗｉｔｃｈ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）”とは、前記キメラ抗原受容体を用いたＴ細胞治療剤、すなわち、ＣＡＲ－Ｔと呼ばれる細胞治療剤において、ＣＡＲのターゲット認識ドメインとＣＡＲの細胞シグナリングドメインを分離し、これを媒介するアダプター分子（ａｄａｐｔｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を意味する。スイッチ分子は、異種標的（Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ ｔａｒｇｅｔ）、又は耐性腫瘍（ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｕｍｏｒ）に対してＣＡＲのターゲットを交替したり、或いはＣＡＲを発現させる細胞の過度な活性化によって副作用が発生するとき、スイッチ分子の投与によるたＣＡＲ細胞の活性減少を可能にする（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．２０１６ Ｊｕｎｅ ２０；５５（２６）：７５２０－７５２４．）。
本発明の一具現例において、前記効果器細胞の活性化は、標的細胞に対する細胞毒性、サイトカイン分泌、及びこれらの組合せである。
本発明の一具現例において、前記効果器細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、肥満細胞、自然殺害細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、大食細胞及びこれらの前駆細胞からなる群から選ばれるが、これに限定されない。
本発明において、前記スイッチ分子を構成する抗ＨＥＲ２アフィボディとコチニン（ｃｏｔｉｎｉｎｅ）は、化学的コンジュゲーションによって結合する。
前記化学的コンジュゲーションは、化学的架橋剤によってなされてよい。前記化学的架橋剤には、ＥＤＣ（１－ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＤＣＣ（ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）、ＮＨＳ（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）、Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）、イミドエステル系架橋剤、Ｓｕｌｆｏ－ＳＭＣＣ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４－（Ｎ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）などがあるが、これに限定されるものではなく、本発明の属する分野において通常用いられる如何なる化学的架橋剤も使用可能である。
本発明の一具現例において、前記スイッチ分子を構成する抗ＨＥＲ２アフィボディには、コチニンが１個分子以上、２個分子、又は３個分子以上結合してよい。
本発明の具体的な具現例において、前記抗ＨＥＲ２アフィボディを構成するポリペプチドのＮ末端又はＣ末端にコチニンが結合してよい。
本発明の他の具体的な具現例において、前記抗ＨＥＲ２アフィボディを構成するポリペプチドのＮ末端及びＣ末端の両方にコチニンが結合してもよい。
本発明の一具現例において、前記スイッチ分子を構成する抗ＨＥＲ２アフィボディとコチニンが直接に連結されてもよく、又はリンカーを介して間接に連結されてもよい。
通常の技術者であれば、融合タンパク質の作製時に、一般に、融合しようとする機能的一部分（ｍｏｉｅｔｙ）の間にリンカーを使用することを含むことができ、異なる特性を有する他の種類のリンカー、例えば、柔軟性アミノ酸リンカー、非柔軟性リンカー及び切断可能なアミノ酸リンカーがあることを知っているだろう。リンカーは、融合タンパク質の発現量増加、生物学的活性向上、ターゲッティングを可能にしたり或いは薬動学を変更させるための目的で、又は融合タンパク質の安定性を増加させ、フォールディング（ｆｏｌｄｉｎｇ）を向上させる目的で使用されてきた。
したがって、本発明の具体的な具現例によれば、前記スイッチ分子は、少なくとも一つのリンカー、例えば、柔軟性アミノ酸リンカー、非柔軟性リンカー及び切断可能なアミノ酸リンカーから選ばれる少なくとも一つのリンカーを含むことができる。本発明の具体的な一具現例において、前記リンカーは、前記抗ＨＥＲ２アフィボディとコチニンとの間に配列される。
この場合、前記リンカーは、一般式（ＧｎＳｍ）ｐ又は（ＳｍＧｎ）ｐと表示されるアミノ酸配列からなり得る：
ここで、前記ｎ、ｍ及びｐは独立に、
ｎは、１～７範囲の整数であり；
ｍは、０～７範囲の整数であり；
ｎとｍの和は、８以下の整数であり；及び
ｐは、１～７範囲の整数である。
本発明の他の具体的な具現例によれば、前記リンカーは、ｎ＝１～５で、ｍ＝０～５である。より具体的な具現例において、ｎ＝４で、ｍ＝１である。さらに具体的な具現例において、前記リンカーは（Ｇ４Ｓ）３又は（Ｓ４Ｇ）３である。さらに他の具現例において、前記リンカーはＧＧＧＧＳである。
さらに他の具体的な具現例において、前記リンカーはＶＤＧＳである。さらに他の具体的な具現例において、前記リンカーはＡＳＧＳである。
本明細書において、前記スイッチ分子を構成する抗ＨＥＲ２アフィボディをはじめとする本明細書で発現するポリペプチド又は融合タンパク質は、ポリペプチド／融合タンパク質のＣ末端及び／又はＮ末端に少なくとも一つの追加アミノ酸を含むことができる。前記の追加アミノ酸残基は、例えば、生産性、精製（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、生体内又は生体外における安定化、複合体のカップリング又は検出を向上させるための目的で個別的又は集合的に追加されてよい。例えば、前記ポリペプチド又は融合タンパク質は、前記ポリペプチド又は融合タンパク質のＣ末端及び／又はＮ末端にシステイン残基を追加に含むことができる。追加のアミノ酸残基は、精製又はポリペプチドの検出のための“タグ（ｔａｇ）”を提供してもよく、例えば、そのタグは、そのタグと特異的な抗体との相互作用のためのものである。Ｈｉｓ６タグの場合、固定化した金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）のために、Ｈｉｓ６タグ、（ＨｉｓＧｌｕ）３タグ（“ＨＥＨＥＨＥ”タグ）、“ｍｙｃ”（ｃ－ｍｙｃ）タグ又は“ＦＬＡＧ”タグ）のようなタグを提供することができる。
本発明の他の態様によれば、本発明は、上述したスイッチ分子；及び薬剤学的に許容される担体を含む免疫治療用薬剤学的組成物を提供する。
本明細書において“免疫治療（ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）”とは、兔疫体系が癌を除去するように手伝う癌の治療方法である。免疫治療は、能動的免疫治療と受動的免疫治療とに区分される。能動的免疫治療は、ｉ）癌細胞又は癌細胞によって生成された物質を人体に注入して兔疫体系を活性化させる癌ワクチン治療（ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）、ｉｉ）サイトカイン（インターフェロン、インターロイキンなど）、成長因子などの免疫調節剤（ｉｍｍｕｎｅ－ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）を投与して特定の白血球を活性化させる免疫調節治療を含む。受動的免疫治療は、特定の癌細胞に結合する治療的抗体（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）と免疫細胞治療（ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ）を含む。免疫細胞治療は、具体的に、樹状細胞ワクチン治療（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｖａｃｃｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）とＣＡＲ－Ｔ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ）治療、ＮＫ細胞治療（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ）、ＣＴＬ治療（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｔｈｅｒａｐｙ）、養子細胞転移（ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ）などを含むが、これに限定されない。本発明において、免疫治療は主に、上述の免疫細胞治療を意味する。
本発明のスイッチ分子は、ＨＥＲ２抗原に特異的に結合するアフィボディを含むところ、本発明のスイッチ分子を有効成分として含む薬剤学的組成物を使用して治療できる疾患は、ＨＥＲ２を発現させる細胞と関連したヒト及び哺乳動物の疾患である。具体的に、前記疾患は、乳癌、胃癌、卵巣癌、直結腸癌、子宮内膜癌であるが、これに限定されない。
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に一般に用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されない。
本発明の薬剤学的組成物は、これらの成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などもさらに含むことができる。適切な薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。
本発明の薬剤学的組成物は、経口又は非経口で投与でき、例えば、静脈内注入、皮下注入、血内注入、筋肉内注入、腹腔内注入、胸骨内注入、腫瘍内注入、局所投与、鼻内投与、脳内投与、頭蓋骨内投与、肺内投与及び直腸内投与などで投与できるが、これに限定されない。
本発明の薬剤学的組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって様々であり、熟練した通常の医師は、所望する治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方できる。本発明の好ましい具現例によれば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は、０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇである。本明細書において、用語“薬剤学的有効量”とは、上述した疾患を予防又は治療するのに十分な量を意味する。
本明細書において、用語“予防”は、疾患又は疾患状態の防止又は保護的な治療を意味する。本明細書において、用語“治療”は、疾患状態の減少、抑制、鎮静又は根絶を意味する。
本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって単位容量の形態で製造されてもよく、又は多回容量容器内に内入させて製造されてよい。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、或いはエキス剤、散剤、坐剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。
本発明の薬剤学的組成物は、また、上述したスイッチ分子に加えて、他の薬剤学的活性薬剤又は薬物、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチンなどの化学治療剤を含むことができる。
本発明の他の態様によれば、本発明は、次を含むスウィチャブルキメラ抗原受容体を提供する：
（ａ）上述したコチニンが結合した抗ＨＥＲ２アフィボディを含むスイッチ分子；及び
（ｂ）次を含むキメラ抗原受容体：
ｉ）前記スイッチ分子を標的化する抗体又はその抗原結合断片を含む細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）；
ｉｉ）膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）；及び
ｉｉｉ）細胞内信号伝達ドメイン。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、上述した本発明のスイッチ分子、及び前記本発明のスイッチ分子を標的化するキメラ抗原受容体を含むＣＡＲ－効果器細胞治療的システムを提供する。
本発明に係るＣＡＲ－効果器細胞治療的システムを用いると、特定癌細胞の表面抗原（例えば、ＨＥＲ２）に特異的に結合するスイッチ分子、及び前記スイッチ分子を標的化するキメラ抗原受容体を発現させる効果器細胞（例えば、Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞）を、投与が必要な患者に投与して癌（例えば、ＨＥＲ２発現に関連した細胞の癌）を治療することができる。
本明細書において、用語“キメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＡＲ）”とは、効果器細胞信号伝達又は効果器細胞活性化ドメイン（例えば、Ｔ細胞信号伝達又はＴ細胞活性化ドメイン）に連結されたターゲット結合ドメイン（例えば、単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ））を含む人工的に作製されたハイブリッドタンパク質（融合タンパク質）又はポリペプチドである。キメラ抗原受容体は、一般に、単一クローン抗体の抗原結合性質を用いて非ＭＨＣ制限方式により、選択された標的に対するＴ細胞特異性及び反応性を再誘導する能力を有する。非ＭＨＣ制限された抗原認識は、ＣＡＲを発現させるＴ細胞に、抗原処理に関係なく抗原を認識する能力を提供し、腫瘍逃避の主要メカニズムを回避させる。また、ＣＡＲは、Ｔ細胞で発現するとき、有利には内在性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及びベータ鎖と二量体化しない。
本発明のキメラ抗原受容体は、スウィチャブルキメラ抗原受容体（ｓｗｉｔｃｈａｂｌｅ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｓＣＡＲ）である。一般的な従来のクラシックキメラ抗原受容体（ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の細胞外ドメインは、特定抗原（例えば、ＨＥＲ２抗原、ＣＤ１９抗原などの腫瘍関連抗原（ｔｕｍｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ，ＴＡＡ））を標的化する抗体又は抗原結合断片を含む。しかし、本発明のキメラ抗原受容体の細胞外ドメインは、上述したスイッチ分子（具体的には、スイッチ分子のコチニン）を標的化する。
本発明の一具現例において、前記ｉ）の抗体又はその抗原結合断片は、抗コチニン抗体又はその抗原結合断片である。
本発明の具体的な具現例において、前記抗コチニン抗体又はその抗原結合断片は、配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、配列番号１１のＨＣＤＲ３、配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、配列番号１４のＬＣＤＲ３を含むが、これに限定されない。
本発明の一具現例において、前記膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３、エプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８（ＣＤ８α）、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４のアルファ、ベータ又はゼータ鎖からなる群から選ばれるタンパク質の膜貫通ドメインである。
本発明の一具現例において、前記細胞内信号伝達ドメインは、刺激分子、補助刺激分子の細胞内信号伝達ドメインであり、前記ＣＡＲが発現する細胞の活性化を担当する。
前記細胞内信号伝達ドメインは、非制限的に、ＴＣＲ、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３エプシロン、ＣＤ８６、一般のＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ（ＦｃエプシロンＲ１ｂ）、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１２７、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、本明細書に記載の他の共同刺激分子、これらの任意の誘導体、変異体又は断片、同じ機能上の能力を有する共同刺激分子の任意の合成配列、及びこれらの任意の組合せを含む。
本発明の具体的な具現例において、前記細胞内信号伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖から由来したドメインである。
本発明の具体的な具現例において、前記ＣＤ３ゼータ鎖から由来した細胞内信号伝達ドメインは、配列番号２３の塩基配列によってエンコードされるアミノ酸配列を含むものである。
本発明の具体的な具現例において、前記細胞内信号伝達ドメインは、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）及び４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群から選ばれる共同刺激分子（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）をさらに含むものである。前記細胞内信号伝達ドメインは、上述したドメインの他にも、当該分野に公知された別の細胞内信号伝達分子から収得又は由来してもよく、細胞内信号伝達ドメインが由来する分子の全体又はその断片を含むことができる。
本発明のキメラ抗原受容体の膜貫通ドメイン及び細胞内信号伝達ドメインは、上述した具体的な膜貫通ドメイン及び細胞内信号伝達ドメインから選ばれる１以上の組合せで含まれてよい。例えば、本発明のキメラ抗原受容体は、ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通領域、ＣＤ１３７細胞質領域及びＣＤ３ζの細胞内信号伝達ドメインを含むことができる。さらに他の例として、本発明のキメラ抗原受容体は、ＣＤ８α膜貫通ドメイン及びＣＤ２８及びＣＤ３ζの細胞内信号伝達ドメインを含むことができる。
本発明の一具現例において、前記キメラ抗原受容体は、先行配列（ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＬＳ）を選択的にさらに含む。前記先行配列は、キメラ抗原受容体を構成する組換えポリペプチドのアミノ末端（Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ）に位置する。前記先行配列は、キメラ抗原受容体の細胞内プロセス及び細胞膜に局在化（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）しながら抗原結合ドメインから任意に切断される。
本発明の具体的な具現例において、前記先行配列は、配列番号２０の塩基配列でエンコードされるアミノ酸配列を含む先行配列である。
本発明のキメラ抗原受容体の前記ＨＥＲ２結合ドメインは、ヒンジドメイン（又は、スぺーサ）によって前記膜貫通ドメインに連結される。
本発明の他の具現例によれば、前記ヒンジドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、又はＩｇＤに由来したヒンジ、ＣＤ８又はＣＤ２８に由来したヒンジ、ＣＤ２８に由来した細胞外ドメイン（ＥＣＤ）又はこれらの組合せである。
本発明の具体的な具現例において、前記ヒンジドメイン及び膜貫通ドメインは、配列番号２１の塩基配列でエンコードされるアミノ酸配列を含む。
本明細書において、用語“抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）”は、特定抗原に特異的に結合する抗体であり、完全な抗体の形態の他に、抗体分子の抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）も含む。完全な抗体は、２本の全長の軽鎖及び２本の全長の重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は重鎖とジスルフィド結合で連結されている。重鎖定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びエプシロン（ε）のタイプを有し、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）を有する。軽鎖の定常領域は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）のタイプを有する（Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｏｎｓｉｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｊ．，Ｅｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ４５，ｐｐ．４１－５０，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（１９９１）；Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，Ａ．，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ４，ｐｐ．４５－６５，ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８４））。
本明細書において、前記抗体は、単一クローン抗体、多クローン抗体、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単一ドメイン抗体、及び単鎖可変断片からなる群から選ばれる抗体を含む。
本明細書において、用語“抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）”は、抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどを含む。抗体断片のうち、Ｆａｂ（ｆｒａｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）は、軽鎖及び重鎖の可変領域、軽鎖の定常領域及び重鎖の最初の定常領域（ＣＨ１）を有する構造であり、１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしながら生成される。Ｆｖは、重鎖可変部位及び軽鎖可変部位だけを有する最小の抗体断片であり、Ｆｖ断片を生成する組換え技術は、ＰＣＴ国際公開特許出願ＷＯ８８／１０６４９、ＷＯ８８／１０６６３０、ＷＯ８８／０７０８５、ＷＯ８８／０７０８６及びＷＯ８８／０９３４４に開示されている。二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位とが連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ，ｓｃＦｖ）は一般に、ペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と単鎖の可変領域とが共有結合で連結されたり或いはＣ末端で直接連結されており、二重鎖Ｆｖと同様にダイマーのような構造を有することができる。このような抗体断片はタンパク質加水分解酵素によって得られたり（例えば、全抗体をパパインで制限切断すればＦａｂが得られ、ペプシンで切断すればＦ（ａｂ’）２断片が得られる。）、或いは遺伝子組換え技術によって作製可能である。
本明細書において、用語“重鎖”は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む抗体の可変領域ドメインＶＨ及び３個の定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む全長重鎖及びその断片を全て意味する。また、本明細書において、用語“軽鎖”は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む抗体の可変領域ドメインＶＬ及び定常領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖及びその断片を全て意味する。
本明細書において、用語“ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）”は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の高可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を意味する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（１９８７））。重鎖（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）及び軽鎖（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）にはそれぞれ３個のＣＤＲが含まれている。ＣＤＲは、抗体が抗原又はエピトープに結合する上で主要な接触残基を提供する。
本明細書において、用語“ヒト化抗体”とは、非ヒト（例えば、ネズミ）抗体の非ヒト免疫グロブリンから由来した最小配列を含有するキメラ免疫グロブリン、その免疫グロブリン鎖又は断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は抗体の他の抗原結合下位配列）である。大部分の場合、ヒト化した抗体は、受容者の相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、目的とする特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（供与者抗体）、例えば、マウス、ラット又はウサギのＣＤＲの残基に置き換えられたヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。一部の場合に、前記ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、相応する非ヒト残基に置き換えられる。また、ヒト化した抗体は、受容者抗体からも或いは取り込まれたＣＤＲ又はフレームワーク配列からも発見されない残基を含むことができる。このような変形は、抗体性能をさらに改善及び最適化するためになされる。一般に、前記ヒト化された抗体は、少なくとも１つ、及び典型的に２つの実質的に全ての可変ドメインを含むはずであり、前記ドメインにおいて前記ＣＤＲ領域の全部又は実質的に全部は、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に相応し、前記ＦＲ領域の全部又は実質的に全部は、ヒト免疫グロブリンのＦＲ領域の配列を有する。前記ヒト化した抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ ｒｅｇｉｏｎ）の少なくとも一部又は実質的なヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ ｒｅｇｉｏｎ）配列を含む。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記キメラ抗原受容体ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記キメラ抗原受容体ポリペプチドをエンコードする核酸分子を含む組換えベクターを提供する。
本明細書において、用語“ベクター”は、伝達ベクターと発現ベクターを含む。
本明細書において、用語“伝達ベクター”は、単離した核酸を含み、単離した核酸を細胞内部に伝達するために利用可能な物質の組成を指す。線形ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物と連結されたポリヌクレオチド、プラスミド及びウイルスを含むが、これに限定されない。より具体的に、前記伝達ベクターは、自己複製性プラスミド又はウイルスを含む。前記用語は、細胞内への核酸の転移を促進させる非プラスミド及び非ウイルス性化合物、例えば、ポリリシン化合物、リポソームなどをさらに含み得るものと解釈される必要がある。ウイルス性伝達ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ連関ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターを含むが、これに限定されるものではない。
本発明の一具現例において、前記ベクターはレンチウイルスベクターである。本発明の具体的な一具現例において、前記ベクターはプロモーターをさらに含む。前記プロモーターは、例えば、ＥＦ－１ａｌｐｈａプロモーターであり得るが、これに限定されない。
本発明の具体的な具現例において、前記ＥＦ－１ａｌｐｈａプロモーターは、配列番号１９の塩基配列を含む。
本発明の他の具現例において、前記ベクターは、レトロウイルスベクターでよい。レトロウイルスは、遺伝子伝達システムのための便利なプラットホームを提供する。遺伝子伝達のために選択された遺伝子は、レトロウイルスベクター内に挿入され、レトロウイルス粒子内にパッケージングされてよい。次いで、組み換えられたレトロウイルスは、インビボ又はインビトロで目的とする宿主細胞に伝達されてよい。多くのレトロウイルスベクターが関連技術分野に知られている。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記キメラ抗原受容体を発現させる効果器細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）を提供する。前記キメラ抗原受容体は、上述したスイッチ分子を標的化する。
本発明の一具現例によれば、前記効果器細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、肥満細胞、自然殺害細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、大食細胞及びこれらの前駆細胞からなる群から選ばれる。
本発明の具体的な具現例によれば、前記Ｔリンパ球は、炎症性Ｔリンパ球、細胞毒性Ｔリンパ球、調節Ｔリンパ球又はヘルパーＴリンパ球からなる群から選ばれてよい。
本発明において、前記効果器細胞は、自己細胞又は同種異型細胞の集団を含む。すなわち、前記効果器細胞は、本発明のキメラ抗原受容体を発現させる自己細胞又は同種異型細胞の集団を含む。
本明細書において、用語“自己”とは、個体に再導入される予定である、同じ個体から由来した任意の物質のことを指す。本明細書において、用語“同種”とは、物質が導入される個体と同じ種の異なる動物から由来した任意の物質のことを指す。
また、本発明の一具現例によれば、前記効果器細胞は、本発明のキメラ抗原受容体をエンコードする核酸分子を含むベクターで形質感染又は形質導入された細胞の集団を含む。前記形質感染又は形質導入は、上述したように、当業界に知られた様々な手段によって制限なく行われてよい。
したがって、本発明の具体的な具現例によれば、本発明の効果器細胞、例えば、Ｔリンパ球、又は自然殺害細胞に伝達され、本発明のキメラ抗原受容体をエンコードする核酸分子はｍＲＮＡに転写され、前記ｍＲＮＡからキメラ抗原受容体が翻訳されて効果器細胞の表面に発現する。
本発明の実施例から立証される通り、本発明のコチニンと結合した抗ＨＥＲ２アフィボディを含むスイッチ分子及び前記スイッチ分子のコチニンを標的化するキメラ抗原受容体を発現させる効果器細胞は、表面にＨＥＲ２を発現させる癌細胞株であるＳＫＯＶ３（卵巣癌細胞株）を効果的に死滅させる。したがって、本発明の抗ＨＥＲ２スイッチ分子及び前記スイッチ分子を標的化するキメラ抗原受容体を発現させる効果器細胞は、ＨＥＲ２を発現させる癌腫に対する治療用薬剤学的組成物の有効成分として有用に用いることができる。
本発明の薬剤学的組成物は、上述したＣＡＲ発現効果器細胞、例えば、複数のＣＡＲ発現効果器細胞を一つ以上の製薬的又は生理学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と組み合わせて含むことができる。前記薬剤学的組成物は、緩衝剤、例えば、中性緩衝塩水、ホスフェート緩衝塩水など；炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチド又はアミノ酸、例えば、グリシン；抗酸化剤；キレーティング剤、例えば、ＥＤＴＡ又はグルタチオン；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；及び防腐剤を含むことができる。本発明の一具現例において、前記薬剤学的組成物は静脈内投与のために製剤化される。
本発明の薬剤学的組成物は、経口又は非経口で投与でき、例えば、静脈内投与、皮下投与、血内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、腫瘍内投与、脳内投与、頭蓋骨内投与、肺内投与及び直腸内投与などで投与できるが、これに限定されるものではない。
本発明の効果器細胞を含む薬剤学的組成物は、皮膚内又は皮下注射によって患者に投与される。一具現例において、本発明の薬剤学的組成物は、静脈内注射によって投与される。他の具現例において、本発明の薬剤学的組成物は、腫瘍、リンパ節、又は感染部位内に直接投与されてもよい。
本発明を必要とする対象体は、高容量化学療法を用いた標準治療を受けることができる。本発明の一具現例において、本発明を必要とする対象体には、化学療法後に又は化学療法と同時に、本発明の増殖されたＣＡＲ－Ｔ細胞が投与されてよい。他の具現例において、増殖されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、手術前又は手術後に投与される。
本発明の薬剤学的組成物の“免疫学的有効量”、“抗腫瘍有効量”、“腫瘍抑制有効量”、又は“治療量”に適合した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって決定され、熟練した通常の医者は所望の治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方でき、適切な投与量は臨床試験によって決定されるだろう。本明細書において用語“治療”は、疾患状態の減少、抑制、鎮静又は根絶を意味する。本明細書において用語“抗腫瘍”は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、期待寿命の増加、腫瘍細胞増殖の減少、腫瘍細胞生存の減少、又は癌的病態と関連した様々な生理学的症状の改善を含むが、これに制限されない。
本願に記載されたＴ細胞を含む薬剤学的組成物は、通常、１０４～１０９細胞／ｋｇ体重、いくつかの場合に１０５～１０６細胞／ｋｇ体重（前記範囲内の全ての整数値を含む。）の投与量で投与できるといえよう。Ｔ細胞組成物は、また、これらの投与量で多回投与されてもよい。細胞は、免疫療法において通常知られた注入技術を用いて投与できる（例えば、［Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８］参照）。
本発明の薬剤学的組成物は、また、上述した有効成分に加えて、他の薬剤学的活性薬剤及び療法と組み合わせて用いられてもよい。前記“組合せ”は、同時又は併用投与と表現されてもよい。本願に記載のＣＡＲ発現効果器細胞及び少なくとも一つの追加の治療剤は同時に、同一の組成物内に又は別個の組成物内に、又は順次に投与されてよい。順次投与のために、本願に記載のＣＡＲ発現効果器細胞が最初に投与され、追加の作用剤はその次に投与されてもよく、その逆の順序で投与されてもよい。
上記本発明の薬剤学的組成物と組み合わせて使用可能な治療剤には、当業界に公知の１以上の化学治療剤（例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチンなど）、１以上の標的治療剤（例えば、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、オラパリブ（ｏｌａｐａｒｉｂ）など）、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１特異的な免疫関門抑制剤（例えば、オプジーボ、キイトルーダ）があるが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記のキメラ抗原受容体を発現させる効果器細胞；及び、前記キメラ抗原受容体と結合するスイッチ分子を、治療が必要な対象体に投与する段階を含む、ＨＥＲ２発現に関連した疾患の治療方法を提供する。
ＣＡＲ－Ｔを用いた腫瘍又は癌と関連した疾患の治療途中に、癌細胞の細胞表面分子に突然変異が起こる場合（例えば、ＨＥＲ２抗原の変異）には、既存のＣＡＲが突然変異の発生した癌細胞を認識できず、治療効果が減少したり或いは治療が不可能である。この場合、突然変異の発生した細胞の表面分子を標的化する新規なスイッチ分子を対象体にさらに投与すれば、先に投与されたスイッチ分子に代えて持続した癌の治療効果が期待できよう。
また、本発明の他の態様によれば、本発明は、（ａ）上述したキメラ抗原受容体を発現させる効果器細胞（ＣＡＲ－ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）及び前記キメラ抗原受容体と結合する本発明のスイッチ分子を、治療が必要な対象体に投与する段階；及び、（ｂ）対象体に先に投与されたスイッチ分子と異なる標的細胞の細胞表面分子と結合する１つ以上のスイッチ分子（例えば、ｃｏｔｉｎｉｎｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ＥＧＦＲ）、又は標的化モイエティがないスイッチ分子（例えば、ｃｏｔｉｎｉｎｅ ｏｎｌｙ）を対象体にさらに投与する段階を含む、対象体内ＣＡＲ－効果器細胞の活性を抑制する方法を提供する。
ＣＡＲ－Ｔを用いた腫瘍又は癌と関連した疾病又は状態の治療途中に、ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化が過度になる場合、腫瘍溶解症候群（ｔｕｍｏｒ ｌｙｓｉｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＴＬＳ）、サイトカイン放出症候群（ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＣＲＳ）などの合併症が発生することがあり、これは患者に致命的である。本発明のスイッチ分子を用いるＣＡＲ－効果器細胞治療システムを用いれば、ＣＡＲを発現させる効果器細胞が癌細胞の細胞表面分子を直接に認識せず、ＣＡＲが標的化するスイッチ分子を介して間接に認識する。したがって、対象体に先に投与されたスイッチ分子と異なる標的細胞の細胞表面分子と結合する１つ以上のスイッチ分子、又は標的化モイエティがないキメラ抗原受容体に結合するスイッチ分子を対象体にさらに投与すれば、ＣＡＲがそれ以上既存の癌細胞を標的化できず、これによってＣＡＲ－Ｔ細胞の過度な活性を抑制することができる。
本発明は、抗ＨＥＲ２アフィボディ及びコチニンが結合した抗ＨＥＲ２アフィボディを含むスイッチ分子を提供する。本発明の抗ＨＥＲ２アフィボディは、コチニンが結合したとき、Ｃｏｔ－ｓＣＡＲＴと共に処理される場合にＨＥＲ２を発現させる陽性細胞株に反応して免疫細胞活性を誘導するので、ｓＣＡＲＴ治療剤のスイッチ分子として有用に用いることができる。
ＨＥＲ２に特異的に結合するアフィボディをペリプラズム抽出物（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｅｘｔｒａｃｔ）の形態で確認した図である。 ３種のＨＥＲ２発現細胞を対象にＨＥＲ２に結合するアフィボディの細胞結合能力を確認し、ＭＦＩ値をグラフ化した図である（Ａ．ＮＣＩ－Ｎ８７、Ｂ．ＳＫ－ＯＶ－３、Ｃ．ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）。 ３種のＨＥＲ２発現細胞を対象にＨＥＲ２に結合するアフィボディの細胞結合能力を確認し、ＭＦＩ値をグラフ化した図である（Ａ．ＮＣＩ－Ｎ８７、Ｂ．ＳＫ－ＯＶ－３、Ｃ．ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）。 ３種のＨＥＲ２発現細胞を対象にＨＥＲ２に結合するアフィボディの細胞結合能力を確認し、ＭＦＩ値をグラフ化した図である（Ａ．ＮＣＩ－Ｎ８７、Ｂ．ＳＫ－ＯＶ－３、Ｃ．ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）。 ＨＥＲ２に結合する５種のアフィボディをＦｃ結合形態で生産し、ＨＥＲ２タンパク質の結合程度を定量的に比較確認した図である。 ＨＥＲ２に結合する５種のアフィボディをＦｃ結合形態で生産し、ＨＥＲ２発現細胞４種の細胞に対する結合程度を定量的に分析した図である（Ａ．ＮＣＩ－Ｎ８７、Ｂ．ＳＫ－ＯＶ－３、Ｃ．ＭＤＡ－ＭＢ－４５３、Ｄ．ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）。 ＨＥＲ２に結合する５種のアフィボディをＦｃ結合形態で生産し、ＨＥＲ２発現細胞４種の細胞に対する結合程度を定量的に分析した図である（Ａ．ＮＣＩ－Ｎ８７、Ｂ．ＳＫ－ＯＶ－３、Ｃ．ＭＤＡ－ＭＢ－４５３、Ｄ．ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）。 ＨＥＲ２に結合する５種のアフィボディをＦｃ結合形態で生産し、ＨＥＲ２発現細胞４種の細胞に対する結合程度を定量的に分析した図である（Ａ．ＮＣＩ－Ｎ８７、Ｂ．ＳＫ－ＯＶ－３、Ｃ．ＭＤＡ－ＭＢ－４５３、Ｄ．ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）。 ＨＥＲ２に結合する５種のアフィボディをＦｃ結合形態で生産し、ＨＥＲ２発現細胞４種の細胞に対する結合程度を定量的に分析した図である（Ａ．ＮＣＩ－Ｎ８７、Ｂ．ＳＫ－ＯＶ－３、Ｃ．ＭＤＡ－ＭＢ－４５３、Ｄ．ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）。 コチニンが結合したアフィボディ５種のＨＥＲ２タンパク質結合程度を定量的に確認した図である。 ＨＥＲ２陽性細胞であるＳＫ－ＯＶ－３とＨＥＲ２陰性細胞であるＲａｊｉ細胞に対してコチニンが結合したアフィボディと抗コチニン抗体を用いたキメラ抗原受容体Ｔ細胞（Ｃｏｔ－ｓＣＡＲＴ）の細胞毒性効果を測定した図である。 免疫欠乏マウス（ＮＳＧ）にＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ細胞株で疾患モデルを形成した後、当該モデルに対するコチニンが結合したアフィボディとＣｏｔ－ｓＣＡＲＴの効能を測定した図である（Ａ．発光（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）測定イメージ、Ｂ．発光信号（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｓｉｇｎａｌ）定量資料）。 免疫欠乏マウス（ＮＳＧ）にＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ細胞株で疾患モデルを形成した後、当該モデルに対するコチニンが結合したアフィボディとＣｏｔ－ｓＣＡＲＴの効能を測定した図である（Ａ．発光（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）測定イメージ、Ｂ．発光信号（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｓｉｇｎａｌ）定量資料）。 ＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ細胞株で形成された疾患モデルに対するコチニンが結合したアフィボディとＣｏｔ－ｓＣＡＲＴの効能評価において、コチニンが結合したアフィボディの濃度による効能を確認した図である（Ａ．発光測定イメージ、Ｂ．発光信号定量資料）。 ＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ細胞株で形成された疾患モデルに対するコチニンが結合したアフィボディとＣｏｔ－ｓＣＡＲＴの効能評価において、コチニンが結合したアフィボディの濃度による効能を確認した図である（Ａ．発光測定イメージ、Ｂ．発光信号定量資料）。 親和性が向上したクローンをＦｃ結合形態で生産し、ＨＥＲ２タンパク質の結合程度を定量的に比較確認した図である。 親和性が向上したクローンをＦｃ結合形態で生産し、ＨＥＲ２タンパク質の結合程度を定量的に比較確認した図である。 コチニンが結合した最適化されたアフィボディのＨＥＲ２タンパク質結合程度を定量的に確認した図である。 コチニンが結合した最適化されたアフィボディのＨＥＲ２発現細胞であるＳＫ－ＯＶ－３に対する結合能を測定した図である。 ＨＥＲ２陽性細胞であるＳＫ－ＯＶ－３に対してコチニンが結合した最適化されたアフィボディとＣｏｔ－ｓＣＡＲＴの細胞毒性効果を測定した図である。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
実施例
本明細書全体を通じて、特定物質の濃度を示すために使われる“％”は、別に断りのない限り、固体／固体は（重量／重量）％、固体／液体は（重量／体積）％、そして液体／液体は（体積／体積）％である。
実施例１．ＨＥＲ２に対するアフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）開発
実施例１－１．パンニングを用いたアフィボディの選別
ＨＥＲ２－ＥＣＤ－Ｆｃタンパク質を使用し、アフィボディライブラリーからパンニングを用いて、ＨＥＲ２に特異的に結合するクローンを選別した。また、ＨＥＲ２を発現させる細胞に結合するクローンを確認して５種のアフィボディを選別した。
アフィボディライブラリーは、ＶＳＣＭ１３ヘルパーファージを用いてファージ形態に レスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）してパンニングに使用した。初めて抗原に結合させるライブラリーファージの数は１０１３個以上を使用し、４回のパンニングラウンドを経て進行した。親和性（Ａｆｆｉｎｉｔｙ）の高いファージを選択的に選別する戦略により、パンニングラウンドが増えるにつれて抗原量は減らし（１０μｇ、５μｇ、２μｇ、１μｇ）、洗浄回数は伸ばす（３回、５回、７回、１０回）方法を適用した。
パンニングの各ラウンドで得たバインダーファージは、ＥＲ２５３７に感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）させて得たコロニーをＥＬＩＳＡ方法で抗原に対する結合の有無を確認した。バインダーファージを感染させて得たコロニーをＳＢ培地（ＭＯＰＳ １０ｇ／Ｌ、バクト酵母エキス２０ｇ／Ｌ、トリプトン３０ｇ／Ｌ）に接種した後、ＯＤ６００で０．８になるまで培養した後、１ｍＭ ＩＰＴＧ（エルピーエスソリューション、ＩＰＴＧ０２５）を入れて３０℃で振盪培養してアフィボディを過発現させた。ＢＢＳバッファー（２００ｍＭホウ酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いてペリプラズム抽出を行い、これを用いてＥＬＩＳＡ方法でバインダーをスクリーニングした。ＥＬＩＳＡは、２μｇ／ｍＬの濃度でＨＥＲ１－ＥＣＤ－Ｆｃ、ＨＥＲ２－ＥＣＤ－Ｆｃ、ＨＥＲ３－ＥＣＤ－Ｆｃ、ＨＥＲ４－ＥＣＤ－Ｆｃタンパク質がコートされたプレートにアフィボディペリプラズム抽出物を処理し、２次抗体（ａｎｔｉ－ＨＡ－ＨＲＰ（Ｒｏｃｈｅ，１２０１３８１９００１））を処理した後、ＴＭＢ（ｂｉｏｆｘ，ＴＭＢＣ－１０００－０１）で発色反応を発生させ、ＥＬＩＳＡリーダ器（Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ，Ｖｉｃｔｏｒ３）を用いてＯＤ４５０値を測定した（図１）。ＥＬＩＳＡの結果、ＨＥＲ２タンパク質に特異的に結合するアフィボディを確認し、配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を確認した結果、２３種のユニーククローン（ｕｎｉｑｕｅ ｃｌｏｎｅ）を確認した。
ユニーククローンのペリプラズム抽出物を用いて、ＨＥＲ２発現細胞３種－ＮＣＩ－Ｎ８７（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ－５８２２）、ＳＫ－ＯＶ－３（韓国細胞株銀行、３００７７）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（韓国細胞株銀行、３００２６）を用いて細胞バインダーを確認した。３種のＨＥＲ２発現細胞を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｔｕｂｅで準備した後、１２００ｒｐｍで３分遠心分離して細胞を集め、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで洗浄した後、アフィボディが含まれたペリプラズム抽出物を２００ｕＬ処理し、４℃で１時間培養した。２００ｕＬの５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳを用いて１２００ｒｐｍで３分間遠心分離する方法で細胞を３回洗浄した。その後、ａｎｔｉ－ＨＡ－ＦＩＴＣ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａ１１０１３）を１μｇ／ｍＬで細胞に処理し、光を遮断したまま４℃で４５分間培養した。２００ｕＬの５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳを用いて１２００ｒｐｍで３分間遠心分離する方法で細胞を３回洗浄した後、ＦＡＣＳ機器（Ｂｅｃｋｍａｎｎ ｃｏｕｌｔｅｒ，ＦＣ５００）を用いて蛍光の強度を測定した（図２Ａ～図２Ｃ）。ＥＬＩＳＡ及び細胞結合テストにより、結合能に優れた５種のアフィボディ（ＺＱＡＡ１、７、８、１１、２２）を選別した（表１）。
Figure 0007237387000002
実施例１－２．選別されたアフィボディの結合能確認
選別された５種のアフィボディをＦｃ結合形態（Ｚｂ－Ｆｃ）でクローニングし、ＨＥＲ２タンパク質の結合とＨＥＲ２発現細胞の結合程度を確認した。ＥＬＩＳＡは、２μｇ／ｍＬの濃度でｈＨＥＲ２－ＥＣＤ－Ｈｉｓタンパク質がコートされたプレートに、精製されたＺｂ－Ｆｃ ５種を６０ｎＭから始めて１／５希釈（ｄｉｌｕｔｉｏｎ）して７ポイントで処理し、２次抗体（ａｎｔｉ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ－ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｈ１０００７））を処理した後にＴＭＢで発色反応を発生させ、ＥＬＩＳＡリーダ器を用いてＯＤ４５０値を測定し、グラフプリズム（Ｇｒａｐｈ ｐｒｉｓｍ）を用いてＥＣ５０値を求めた（図３、表２）。
Figure 0007237387000003
アフィボディのＨＥＲ２発現細胞において結合程度を確認するために、ＨＥＲ２発現が高い順にＮＣＩ－Ｎ８７、ＳＫ－ＯＶ－３、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３（韓国細胞株銀行、３０１３１）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ４種の細胞を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｔｕｂｅで準備した後、１２００ｒｐｍで３分遠心分離して細胞を集め、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで洗浄した後、Ｚｂ－Ｆｃ ５種を６０ｎＭから始めて１／５希釈して７ポイントで処理し、４℃で１時間培養した。２００μＬの５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳを用いて１２００ｒｐｍで３分間遠心分離する方法で細胞を３回洗浄した。その後、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ－Ｆｃ－ＦＩＴＣ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａ１１０１３）を１μｇ／ｍＬで細胞に処理し、光を遮断したまま４℃で４５分間培養した。２００μＬの５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳを用いて１２００ｒｐｍで３分間遠心分離する方法で細胞を３回洗浄した後、ＦＡＣＳ機器を用いて蛍光の強度を測定した。測定されたＭＦＩ値をグラフプリズムを用いてＥＣ５０値を求めた（図４Ａ～図４Ｄ、表３）。
Figure 0007237387000004
実施例２．コチニンが結合したアフィボディ開発及びその活性確認
実施例２－１．コチニンが結合したアフィボディの製造
本発明の抗ＨＥＲ２アフィボディを抗スウィチャブルＣＡＲシステムのスイッチ分子として使用するために、コチニンが結合したアフィボディ－コチニン複合体（Ｓｗｉｔｃｈ ｍｏｌｅｃｕｌｅ、スイッチ分子）を合成した（表４）。
Figure 0007237387000005
実施例２－２．コチニンが結合したアフィボディのＨＥＲ２結合能確認
本発明者らは、前記実施例２－１で作製したコチニンが結合したアフィボディ５種のＨＥＲ２タンパク質に対する結合の有無を確認した。まず、ＨＥＲ２－ＥＣＤ－Ｈｉｓタンパク質を抗原として用いたＥＬＩＳＡを行った。ＨＥＲ２－ＥＣＤ－Ｈｉｓタンパク質がコートされたプレートに、コチニンが結合したアフィボディを２μｇ／ｍＬ処理した。２次抗体（Ａｎｔｉ－Ｃｏｔｉｎｉｎｅ ＩｇＧ）を、ＨＥＲ－ＥＣＤ－Ｈｉｓタンパク質とコチニンが結合したアフィボディの複合体に処理した後、３次抗体（ａｎｔｉ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ－ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｈ１０００７））に結合した２次抗体を標識した。標識された複合体の定量は、ＴＭＢで発色反応を発生させてＥＬＩＳＡリーダ器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｖｉｃｔｏｒ３）を用いてＯＤ４５０値を測定した（図５）。
実施例２－３．抗コチニン抗体断片が連結されたキメラ抗原受容体を含むレンチウイルスの作製
抗コチニン抗体断片を用いてキメラ抗原受容体を開発した。キメラ抗原受容体は、ＣＤ８リーダ、ｓｃＦｖ形態の抗コチニン、ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通領域、ＣＤ１３７細胞質領域、及びＣＤ３ゼータの細胞質領域をコドン最適化した後、ｐＬｅｎｔｉ６－Ｖ５／ＤＥＳＴレンチウイルスベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｖ５３３０６）にＳｐｅＩ／ＸｈｏＩで切断及び結紮させた。製造されたコンストラクトは塩基配列分析によって確認した。前記抗コチニン抗体及びその抗原結合断片のアミノ酸及び塩基配列は、配列番号９～１８に示した。
製造されたレンチウイルスコンストラクトを、ウイルス外皮タンパク質であるＶＳＶ－Ｇ（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｉｎｄｉａｎａ ｖｉｒｕｓ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする核酸と、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｒｅｖ遺伝子を含むプラスミドであるｐＣＭＶ－ｄＲ８．９１と共に、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．，６３２１８０）細胞株に形質導入させた。形質導入は、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１１６６８０１９）を使用してメーカーのプロトコル通りに行った。７２時間後、レンチウイルス含有培養液を遠心分離型フィルター装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＦＣ９１００２４）を用いて１０倍濃縮して保管した。
実施例２－４．抗コチニン抗体断片を含むキメラ抗原受容体が表面に提示された細胞毒性Ｔ細胞（Ｃｏｔ－ｓＣＡＲＴ）の製造
実施例２－３で製造されたレンチウイルスを用いて、抗コチニン抗体断片を含むキメラ抗原受容体が表面に提示された細胞毒性Ｔ細胞を製造した。
まず、ヒトのナイーブＴ細胞を分離してＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１１１３１Ｄ）で２４時間刺激し、ポリブレン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｈ９２６８）及び前記レンチウイルスを前記細胞に添加して２４時間培養しながら形質導入させた。その後、ＩＬ－２（Ｇｉｂｃｏ，ＣＴＰ００２１）が含まれた培地に入れ換えて５％ ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。製造された抗コチニン抗体断片を含むキメラ抗原受容体が表面に提示されたＴ細胞（Ａｎｔｉ－Ｃｏｔｉｎｉｎｅ ＣＡＲ－Ｔ ｃｅｌｌ，Ｃｏｔ－ｓＣＡＲＴ）は、製造後２４時間以内に次の実験に使用した。
実施例２－５．コチニンが結合したアフィボディとＣｏｔ－ｓＣＡＲＴを用いた細胞毒性効果確認
実施例２－４で製造したＣｏｔ－ｓＣＡＲＴとコチニンが結合したアフィボディを用いて、前記Ｔ細胞とコチニンが結合したアフィボディ複合体が細胞表面のＨＥＲ２を認識することによって、キメラ抗原受容体細胞の活性化を誘導するか否かを確認した。
具体的に、ＨＥＲ２陽性細胞株であるＳＫＯＶ－３とＨＥＲ２陰性細胞株であるＲａｊｉに、ＧＦＰ－ルシフェラーゼが発現するレンチウイルス（Ｂｉｏｓｅｔｔｉａ，ＧｌｏｗＣｅｌｌ－１６ｐ－１）を導入して、遺伝子導入細胞株であるＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ及びＲａｊｉ－Ｌｕｃ細胞株を構築して実験に使用した。まず、ＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ細胞株及びＲａｊｉ－Ｌｕｃ細胞株を９６ウェルプレートにウェル当たり１×１０４個となるように分注した。Ｌｕｃ細胞株が分注されたプレートに、ウェル当たり処理比率に合わせて製造した細胞毒性Ｔ細胞を添加した。Ｌｕｃ細胞株と細胞毒性Ｔ細胞が処理された試験群に、コチニンが結合したアフィボディを濃度に合わせて添加（０．１、１、１０ｎＭ）し、５％ ＣＯ２及び３７℃の条件で２４時間培養した。培養後、細胞毒性Ｔ細胞の毒性効果をルシフェラーゼ測定（Ｂｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼ分析システム、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ７９４１）によって確認した。細胞毒性効果は、細胞毒性Ｔ細胞、コチニンと結合したアフィボディとＬｕｃ細胞株の培養後、残っているＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ或いはＲａＪｉ－Ｌｕｃ細胞株を３Ｘ溶解バッファー（Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）（７５ｍＭトリス（ｐＨ ８．０）、３０％グリコール、３％トリトンＸ１００）で破砕して溶出するルシフェラーゼを基質と反応させて確認した。Ｌｕｃ細胞株だけを培養したウェルから出るシグナルを１００％にして溶解（ｌｙｓｉｓ）比率を決定した。図６に示すように、処理されたコチニンが結合したアフィボディの濃度にしたがって細胞毒性効果が現れることが確認でき、３種（Ｃｏｔ－ＺＱＡＡ１－Ｃｏｔ、Ｃｏｔ－ＺＱＡＡ８－Ｃｏｔ、Ｃｏｔ－ＺＱＡＡ１１－Ｃｏｔ）のコチニンが結合したアフィボディの細胞毒性が相対的に優れていることを確認した。
実施例２－６．コチニンが結合したアフィボディとＣｏｔ－ｓＣＡＲＴを用いた疾患動物モデル効能評価
実施例２－４で製造したＣｏｔ－ｓＣＡＲＴとコチニンが結合したアフィボディを用いて、前記Ｔ細胞とコチニンが結合したアフィボディ複合体を用いたキメラ抗原受容体細胞の活性を疾患動物モデルから確認した。
具体的に、実施例２－５で構築したＨＥＲ２陽性細胞株であるＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ細胞株を、免疫欠乏しているＮＳＧマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，００５５５７）に腹腔投与した。投与後５日目にルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｐ１０４３）を腹腔注射し、発光測定機器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＩＶＩＳ１００）を用いて、腹部に形成されたＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ細胞株を測定し、無作為にグループを分けた。７日目にＣｏｔ－ｓＣＡＲＴ（２．０Ｅ＋６ＣＡＲＴセル）を腹腔投与した後、２日間隔で、コチニンが結合したアフィボディ（Ｃｏｔ－ｚＨＥＲ２；０．２５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔投与した。コチニンが結合したアフィボディを腹腔投与後にＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ細胞の変化を発光測定機器で測定した。図７Ａ及び図７Ｂから確認できるように、Ｃｏｔ－ｓＣＡＲＴにコチニンが結合したアフィボディが投与されたＮＳＧマウスのみから、ＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ細胞が減少することが確認できた。
コチニンが結合したアフィボディの濃度によるキメラ抗原受容体細胞の活性変化も疾患動物モデルから確認した。前記実験と同一に腹腔投与によって腹部にＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ細胞株が位置しているＮＳＧマウスにＣｏｔ－ｓＣＡＲＴを腹腔投与した。Ｃｏｔ－ｓＣＡＲＴを腹腔投与したＮＳＧマウスに、コチニンが結合したアフィボディを２５μｇ／ｋｇ、２．５μｇ／ｋｇに分けて処理した。処理した結果、図８Ａ及び図８Ｂから確認できるように、濃度にしたがって、コチニンが結合したアフィボディが多く投与されたＮＳＧマウスでＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ細胞がより速く減少することが確認できた。
実施例３．ＺＱＡＡ１とＺＱＡＡ８に対する親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）
実施例３－１．パンニングを用いた親和性が向上したアフィボディの選別
アフィボディＺＱＡＡ１とＺＱＡＡ８の親和性成熟サブライブラリー（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｓｕｂ ｌｉｂｒａｒｙ）を作製し、ＨＥＲ２に対する親和性が向上するアフィボディを選別した。
アフィボディは、３個のｈｅｌｉｘを有する構造であるが、そのうち、Ｈｅｌｉｘ１とＨｅｌｉｘ２はターゲットの結合に関与しており、総１３個のアミノ酸の変異（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有している。ＺＱＡＡ１とＺＱＡＡ８に基づいて、各Ｈｅｌｉｘ１の７個アミノ酸に無作為変異を与えるサブライブラリーとＨｅｌｉｘ２の６個アミノ酸に無作為変異を与えるサブライブラリーを作製した。各サブライブラリーは、ＶＳＣＭ１３ヘルパーファージを用いてファージ形態にレスキューしてパンニングに使用した。最初に抗原に結合させるライブラリーファージの数は１０１３個以上とした。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１１２０５Ｄ）を用いてｂｉｏｔｉｎ－ＨＥＲ２－ＥＣＤ－Ｆｃを結合させ、レスキューしたファージを結合する方式で５ラウンドのパンニングを経て行った。親和性の高いファージを選択的に選別する戦略として、パンニングラウンドが増加するにつれて抗原量は減らし（１００ｎｍ、１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０１ｎＭ）、洗浄回数（１０回、１５回、２０回、２５回、３０回）は増やす方法を用いた。パンニングの各ラウンドで得たバインダーファージをＥＲ２５３７に感染させて得たコロニーに対してＥＬＩＳＡ方法で抗原への結合の有無を確認し、配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）分析の結果、ＺＱＡＡ１のｈｅｌｉｘ１サブライブラリーは１０種、ＺＱＡＡ１のｈｅｌｉｘ２サブライブラリーは２３種、ＺＱＡＡ８のｈｅｌｉｘ１サブライブラリーは０種、ＺＱＡＡ８のｈｅｌｉｘ２サブライブラリーは３５種のユニーククローンを確認した。
ユニーククローンのペリプラズム抽出物を用いて、拡張された洗浄（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｗａｓｈ）方法と、発現対比結合の程度を比較する方法の２つの方法を行って親クローン（ｐａｒｅｎｔａｌ ｃｌｏｎｅ）と対比して選択した。バインダーファージを感染させて得たコロニーを、ＳＢ培地（ＭＯＰＳ １０ｇ／Ｌ、バクト酵母エキス２０ｇ／Ｌ、トリプトン３０ｇ／Ｌ）に接種した後、ＯＤ６００で０．８になるまで培養した後、１ｍＭ ＩＰＴＧ（エルピーエスソリューション、ＩＰＴＧ０２５）を入れて３０℃で振盪培養し、アフィボディを過発現させた。ＢＢＳバッファー（２００ｍＭホウ酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いてアフィボディのペリプラズム抽出を行った。
拡張された洗浄方法は、２μｇ／ｍＬの濃度でＨＥＲ２－ＥＣＤ－Ｆｃタンパク質がコートされたプレートにアフィボディペリプラズム抽出物を処理し、２次抗体（ａｎｔｉ－ＨＡ－ＨＲＰ（Ｒｏｃｈｅ，１２０１３８１９００１））を処理した後にＴＭＢ（ｂｉｏｆｘ，ＴＭＢＣ－１０００－０１）で発色反応を発生させ、ＥＬＩＳＡリーダ器（Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ，Ｖｉｃｔｏｒ３）を用いてＯＤ４５０値を測定した。これと同時に、ＨＥＲ２－ＥＣＤ－Ｆｃタンパク質がコートされたプレートにアフィボディペリプラズム抽出物を処理した後、洗浄バッファー（０．０５％ ｔｗｅｅｎ ｉｎ ＰＢＳ）で２時間放置した後、２次抗体（ａｎｔｉ－ＨＡ－ＨＲＰ（Ｒｏｃｈｅ，１２０１３８１９００１））を処理しＴＭＢ（ｂｉｏｆｘ，ＴＭＢＣ－１０００－０１）で発色反応を発生させ、ＥＬＩＳＡリーダ器（Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ，Ｖｉｃｔｏｒ３）を用いてＯＤ４５０値を測定した。洗浄バッファーに放置しなかったプレートのＯ．Ｄ値対比洗浄バッファーに放置したプレートのＯ．Ｄ値を、親クローンと比較して、向上したクローンを選定する作業を行った。
発現対比結合の程度を比較する方法は、２μｇ／ｍＬの濃度でＨＥＲ２－ＥＣＤ－Ｆｃタンパク質がコートされたプレートに、アフィボディペリプラズム抽出物を原液から階段希釈（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）して処理し、２次抗体（ａｎｔｉ－ＨＡ－ＨＲＰ（Ｒｏｃｈｅ，１２０１３８１９００１））を処理した後にＴＭＢ（ｂｉｏｆｘ，ＴＭＢＣ－１０００－０１）で発色反応を発生させ、ＥＬＩＳＡリーダ器（Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ，Ｖｉｃｔｏｒ３）を用いてＯＤ４５０値を測定した。同時に、ＮＣメンブレンにペリプラズム抽出物を原液から階段希釈してドッティング（ｄｏｔｔｉｎｇ）を行った。メンブレンに抽出物が吸着して乾燥したことを確認した後、ＮＣメンブレンを５％ ＢＳＡ ｉｎ ＴＢＳＴが入っているボトルで１時間培養した。その後、ａｎｔｉ－ＨＡ－ＨＲＰ（Ｒｏｃｈｅ，１２０１３８１９００１）を処理した後、ＥＤＣ溶液（ＡｂＣｌｏｎ，Ａｂｃ－３００１）で発色反応を発生させ、イメージングシステム（Ｂｉｏ－ｒａｄ，ＣｅｍｉＤｏｃ ｔｏｕｃｈ）を用いて発現程度を確認した。発現程度が見られない希釈濃度でＥＬＩＳＡ ＯＤ４５０値を親クローンと比較し、優れたクローンを選定した。ＺＱＡＡ１ベースでは５クローン、ＺＱＡＡ８ベースでは１クローンを選択し、Ｚｂ－Ｆｃ形態でクローニングを行った。
動物細胞で生産されたＺｂ－Ｆｃを用いて各ＨＥＲ２タンパク質の結合をＥＬＩＳＡ法とＢＬＩ法でＫＤ測定によって親クローンと比較確認した。ＥＬＩＳＡは、２μｇ／ｍＬの濃度でｈＨＥＲ２－ＥＣＤ－ｈｉｓタンパク質がコートされたプレートに、精製されたＺｂ－Ｆｃを６０ｎＭから始めて１／５希釈して７ポイントで処理し、２次抗体（ａｎｔｉ－ｈＩｇＧ－Ｆｃ－ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｈ１０００７））を処理した後にＴＭＢ（ｂｉｏｆｘ，ＴＭＢＣ－１０００－０１）で発色反応を発生させ、ＥＬＩＳＡリーダ器（Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ，Ｖｉｃｔｏｒ３）を用いてＯＤ４５０値を測定した（図９Ａ及び図９Ｂ）。
ＥＬＩＳＡ法によって選別された一部のクローンに対してＢＬＩ法を用いてＫＤ値を測定した。ＡＲ２Ｇセンサーチップ（ＰＡＬＬ，１８－５０９２）にＺｂ－Ｆｃタンパク質を２～５μｇ／ｍＬの各クローンに合う濃度でＥＤＣ／ＮＨＳを用いたアミンカップリング方法で固定させた。Ｚｂ－Ｆｃが固定されたセンサーチップに、ｈＨＥＲ２－ＥＣＤ－ｈｉｓタンパク質を、８００ｎＭから１２．５ｎＭまでの範囲における各クローンに合う濃度で１０分間結合させ、１５分間解離させる方法でＫＤ値を測定した。測定の結果、親クローン対比約１１倍以上のＫＤ値を有するクローンを確保した（表５）。測定された結果値に基づき、最適化されたＨＥＲ２に対するアフィボディとしてＺＱＡＡ１２３４、ＺＱＡＡ１２３９、ＺＱＡＡ８２９３を選別した。
Figure 0007237387000006
実施例４．最適化されたＨＥＲ２に対するアフィボディを用いたスイッチ生産及び活性分析
実施例４－１．コチニンが結合したアフィボディの製造
本発明によって最適化された抗ＨＥＲ２アフィボディを抗スウィチャブルＣＡＲシステムのスイッチ分子として使用するために、コチニン結合によるアフィボディ－コチニン複合体（Ｓｗｉｔｃｈ ｍｏｌｅｃｕｌｅ、スイッチ分子）を合成した（表６）。
Figure 0007237387000007
実施例４－２．コチニンが結合した最適化されたアフィボディのＨＥＲ２結合能確認
本発明者らは、前記実施例４－１で作製したコチニンが結合した最適化されたアフィボディ３種のＨＥＲ２．ＥＣＤ結合の有無を確認した。実施例２－２で用いられた方法と同様に、コチニンが結合した最適化されたアフィボディに対するＨＥＲ２．ＥＣＤの結合能力をＥＬＩＳＡ分析法で確認した（図１０）。
また、ＨＥＲ２陽性細胞株であるＳＫＯＶ－３細胞株に対する結合能を確認した。実施例２－３と同じ方法でコチニンが結合した最適化されたアフィボディを標識し、細胞株に結合した抗体断片に対する分析を流細胞分析機で測定した（図１１）。
図１０及び図１１に示すように、本発明のコチニンが結合した最適化されたアフィボディ３種（Ｃｏｔ－ＺＱＡＡ１２３４、Ｃｏｔ－ＺＱＡＡ１２３９、Ｃｏｔ－ＺＱＡＡ８２９３）の結合能が測定できた。
実施例４－３．コチニンが結合した最適化されたアフィボディとＣｏｔ－ｓＣＡＲＴを用いた細胞毒性効果確認
実施例２－４で製造したＣｏｔ－ｓＣＡＲＴとコチニンが結合した最適化されたアフィボディを用いて、前記Ｔ細胞とコチニンが結合したアフィボディ複合体が細胞表面のＨＥＲ２を認識することによって、キメラ抗原受容体細胞の活性化を誘導するか否かを確認した。実施例２－５と同一の方法でＳＫＯＶ３－Ｌｕｃ及びＲａｊｉ－Ｌｕｃ細胞株、コチニンが結合した最適化されたアフィボディとＣｏｔ－ｓＣＡＲＴを培養後、細胞毒性Ｔ細胞の毒性効果をルシフェラーゼ測定（Ｂｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼ分析システム、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ７９４１）によって確認した。図１２に示すように、処理されたコチニンが結合した最適化されたアフィボディの濃度にしたがって細胞毒性効果が現れることが確認できた。３種（Ｃｏｔ－ＺＱＡＡ１２３４、Ｃｏｔ－ＺＱＡＡ１２３９、Ｃｏｔ－ＺＱＡＡ８２９３）のコチニンが結合した最適化されたアフィボディのうち、Ｃｏｔ－ＺＱＡＡ１２３４、Ｃｏｔ－ＺＱＡＡ１２３９の細胞毒性活性が相対的に優れることを確認した。

Claims (16)

  1. 下記一般式で表示されるアミノ酸配列を含む抗ＨＥＲ２アフィボディ：
    一般式
    ＶＤＮＫＦＮＫＥＸ９Ｘ１０Ｘ１１ＡＹＷＥＩＸ１７Ｘ１８ＬＰＮＬＮＸ２４Ｘ２５ＱＸ２７Ｘ２８ＡＦＩＸ３２Ｘ３３ＬＸ３５ＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ
    前記一般式において、
    （ｉ）前記Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１はＬＲＶで、前記Ｘ１７Ｘ１８はＶＫで、前記Ｘ２４Ｘ２５はＰＹ、ＰＰ又はＰＫで、前記Ｘ２７Ｘ２８はＳＲ又はＩＴで、前記Ｘ３２Ｘ３３はＲＳ又はＫＱで、前記Ｘ３５はＹである；
    （ｉｉ）前記Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１はＬＲＧで、前記Ｘ１７Ｘ１８はＴＳで、前記Ｘ２４Ｘ２５はＨＳで、前記Ｘ２７Ｘ２８はＩＴで、前記Ｘ３２Ｘ３３はＶＳで、前記Ｘ３５はＹである；
    （ｉｉｉ）前記Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１はＭＲＤで、前記Ｘ１７Ｘ１８はＶＲで、前記Ｘ２４Ｘ２５はＲＩ又はＰＰで、前記Ｘ２７Ｘ２８はＳＴ又はＳＶで、前記Ｘ３２Ｘ３３はＲＳ又はＲＱで、Ｘ３５はＹである；
    （ｉｖ）前記Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１はＹＭＬで、前記Ｘ１７Ｘ１８はＶＫで、前記Ｘ２４Ｘ２５はＹＰで、前記Ｘ２７Ｘ２８はＱＨで、前記Ｘ３２Ｘ３３はＲＳで、Ｘ３５はＦである；又は
    （ｖ）前記Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１はＩＮＫで、前記Ｘ１７Ｘ１８はＩＳで、前記Ｘ２４Ｘ２５はＫＥで、前記Ｘ２７Ｘ２８はＨＨで、前記Ｘ３２Ｘ３３はＨＳで、Ｘ３５はＹである。
  2. 前記Ｘ３５はＹである、請求項１に記載のアフィボディ。
  3. Ｘ１０はＲである、請求項１に記載のアフィボディ。
  4. Ｘ１７はＶである、請求項１に記載のアフィボディ。
  5. Ｘ２４はＰである、請求項１に記載のアフィボディ。
  6. 前記抗ＨＥＲ２アフィボディは、配列番号１～８のいずれか一つのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗ＨＥＲ２アフィボディ。
  7. コチニンと結合した、下記一般式で表示される抗ＨＥＲ２アフィボディを含む、キメラ抗原受容体効果器細胞（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）を活性化させるためのスイッチ分子（ｓｗｉｔｃｈ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）：
    一般式
    ＶＤＮＫＦＮＫＥＸ９Ｘ１０Ｘ１１ＡＹＷＥＩＸ１７Ｘ１８ＬＰＮＬＮＸ２４Ｘ２５ＱＸ２７Ｘ２８ＡＦＩＸ３２Ｘ３３ＬＸ３５ＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ
    前記一般式において、
    （ｉ）前記Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１はＬＲＶで、前記Ｘ１７Ｘ１８はＶＫで、前記Ｘ２４Ｘ２５はＰＹ、ＰＰ又はＰＫで、前記Ｘ２７Ｘ２８はＳＲ又はＩＴで、前記Ｘ３２Ｘ３３はＲＳ又はＫＱで、前記Ｘ３５はＹである；
    （ｉｉ）前記Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１はＬＲＧで、前記Ｘ１７Ｘ１８はＴＳで、前記Ｘ２４Ｘ２５はＨＳで、前記Ｘ２７Ｘ２８はＩＴで、前記Ｘ３２Ｘ３３はＶＳで、前記Ｘ３５はＹである；
    （ｉｉｉ）前記Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１はＭＲＤで、前記Ｘ１７Ｘ１８はＶＲで、前記Ｘ２４Ｘ２５はＲＩ又はＰＰで、前記Ｘ２７Ｘ２８はＳＴ又はＳＶで、前記Ｘ３２Ｘ３３はＲＳ又はＲＱで、Ｘ３５はＹである；
    （ｉｖ）前記Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１はＹＭＬで、前記Ｘ１７Ｘ１８はＶＫで、前記Ｘ２４Ｘ２５はＹＰで、前記Ｘ２７Ｘ２８はＱＨで、前記Ｘ３２Ｘ３３はＲＳで、Ｘ３５はＦである；又は
    （ｖ）前記Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１はＩＮＫで、前記Ｘ１７Ｘ１８はＩＳで、前記Ｘ２４Ｘ２５はＫＥで、前記Ｘ２７Ｘ２８はＨＨで、前記Ｘ３２Ｘ３３はＨＳで、Ｘ３５はＹである。
  8. 前記効果器細胞の活性化は、標的細胞に対する細胞毒性、サイトカイン分泌、及びこれらの組合せであることを特徴とする、請求項７に記載のスイッチ分子。
  9. 前記効果器細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、肥満細胞、自然殺害細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、大食細胞及びこれらの前駆細胞からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項７に記載のスイッチ分子。
  10. 請求項７～９のいずれか一項のスイッチ分子；及び、薬剤学的に許容される担体を含む、免疫治療用薬剤学的組成物。
  11. 次を含むスウィチャブルキメラ抗原受容体：
    （ａ）請求項７～９のいずれか一項のスイッチ分子；及び
    （ｂ）次を含むキメラ抗原受容体：
    ｉ）請求項７～９のいずれか一項のスイッチ分子の前記コチニンを標的化する抗体又はその抗原結合断片を含む細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）；
    ｉｉ）膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）；及び
    ｉｉｉ）細胞内信号伝達ドメイン。
  12. 前記膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３エプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８（ＣＤ８α）、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４のアルファ、ベータ又はゼータ鎖からなる群から選ばれるタンパク質の膜貫通ドメインである、請求項１１に記載のスウィチャブルキメラ抗原受容体。
  13. 前記細胞内信号伝達ドメインは、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）鎖から由来したドメインである、請求項１１に記載のスウィチャブルキメラ抗原受容体。
  14. 前記細胞内信号伝達ドメインは、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）及び４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群から選ばれる共同刺激分子（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を含む、請求項１１又は１３に記載のスウィチャブルキメラ抗原受容体。
  15. 前記ｉ）の抗体又はその抗原結合断片は、抗コチニン抗体である、請求項１１に記載のスウィチャブルキメラ抗原受容体。
  16. 前記ｉ）の前記スイッチ分子の前記コチニンを標的化する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、配列番号１１のＨＣＤＲ３、配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２、及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含む、請求項１１に記載のスウィチャブルキメラ抗原受容体。
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