JP7228901B2 - 分析物の検出を行うための予め製作された微粒子 - Google Patents
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Description
a)表面を有し、水溶液を受け取るための空隙容量を含む予め製作された微粒子を提供するステップであって、前記微粒子は、非水性媒体に分散性であり、非水性媒体に分散すると、このような非水性媒体において規定される反応空間を提供し、規定される反応空間において、分析物の存在を示す化学的または生化学的反応を実施でき、前記予め製作された微粒子は、前記微粒子を、前記予め製作された微粒子を取り囲み、分析物を含有する試料に対して曝露すると、検出されるべき前記分析物と選択的かつ特異的に結合し、前記分析物の捕捉剤との結合の際に、前記捕捉剤と前記分析物の間に複合体を形成する捕捉剤を含み、前記捕捉剤は、前記予め製作された微粒子を取り囲む試料に由来する分析物と結合し、前記予め製作された微粒子は、前記分析物または前記捕捉剤と前記分析物との間の前記複合体に特異的であり、前記分析物または前記捕捉剤と前記分析物との間の前記複合体と結合する検出剤をさらに含む、ステップと、
b)前記予め製作された微粒子を、検出されるべき分析物を含有すると疑われる水性試料に対して曝露し、したがって、存在する場合には、前記捕捉剤が、検出されるべき前記分析物と選択的かつ特異的に結合することを可能にするステップと、
c)前記予め製作された微粒子を非水相、例えば、油相に入れ、前記予め製作された微粒子の空隙容量を、分析物の存在を示す化学的または生化学的反応が、
d1)前記分析物または前記捕捉剤と前記分析物との間の前記複合体に結合した検出剤を検出すること、
あるいは
d2)存在する場合には、前記分析物を増幅反応によって増幅し、前記検出剤によってこのように増幅された産物を検出することであって、前記分析物が核酸であり、前記増幅反応が、例えば、PCR、TMA、NASBA、LAMP、3SR、SDA、RCA、LCR、RPA、NEARなどの核酸増幅であること
あるいは
d3)シグナル増幅反応、例えば、核酸が前記検出剤の一部である、もしくはそれを形成する場合には核酸増幅、または、例えば、酵素が前記検出剤の一部である、もしくはそれを形成する場合には、例えば、色素もしくはフルオロフォアなどの標識の形態のシグナルの酵素ベースの増幅を実施し、このように増幅されたシグナルを検出すること
のいずれかによって実施される、規定される反応空間として使用するステップと
を含む、方法に関する。
一実施形態では、前記予め製作された微粒子は、その場で作製された微粒子ではなく、好ましくは、分析物検出が行われるとき、またはその間に、その場所で、またはその反応中でその場で作製された微粒子ではない。
a)メチルアクリレートおよびアクリレート、アクリルアミドおよびメタクリルアミド、環状ラクタム、スチレンベースのモノマーなどのその対応するモノマーから調製された合成ポリマー、
b)シリコンベースのポリマー、例えば、ポリジメチルシロキサンおよびそのコポリマー、
c)多糖、例えば、アガロース、キチン、キトサン、アルギネート、カラゲナン、セルロース、フコイダン、ラミナラン;キサンタンガム、アラビアガム、ガッティガム(ghatti gum)、グアーガム、ローカストビーンガム、トラガカントガム、カラヤガムおよびイヌリンから選択されるガム;ポリペプチド、例えば、アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、ポリヌクレオチドならびにそれらの組合せから選択される天然に存在するポリマー
を含む群から選択される。
a)表面を有し、水溶液を受け取るための空隙容量を含む予め製作された微粒子を提供するステップであって、前記微粒子は、非水性媒体に分散性であり、非水性媒体に分散すると、このような非水性媒体において規定される反応空間を提供し、規定される反応空間において、分析物の存在を示す化学的または生化学的反応を実施でき、前記予め製作された微粒子は、好ましくは、前記微粒子を、前記予め製作された微粒子を取り囲み、分析物を含有する試料に対して曝露すると、前記微粒子の細孔において、前記細孔中に前記試料の一部を取り込むことによって前記予め製作された微粒子を取り囲む試料からの前記分析物と結合し、かつ/またはこれを固定化し、かつ/またはこれを受け取る多孔性微粒子であり、
前記捕捉剤は、前記予め製作された微粒子を取り囲む試料に由来する分析物と結合し、
前記予め製作された微粒子は、前記分析物に特異的であり、前記分析物と結合する検出剤をさらに含む、ステップと、
b)前記予め製作された微粒子を、検出されるべき分析物を含有すると疑われる水性試料に対して曝露し、したがって、存在する場合には、前記予め製作された微粒子が、検出されるべき前記分析物と結合し、かつ/またはこれを固定化し、かつ/またはこれを受け取ることを可能にするステップと、
c)前記予め製作された微粒子を非水相、例えば、油相に入れ、前記予め製作された微粒子の空隙容量を、分析物の存在を示す化学的または生化学的反応が、
d1)前記分析物に結合した検出剤を検出すること、
あるいは
d2)存在する場合には、前記分析物を増幅反応によって増幅し、前記検出剤によってこのように増幅された産物を検出することであって、前記分析物が核酸であり、前記増幅反応が、例えば、PCR、TMA、NASBA、LAMP、3SR、SDA、RCA、LCR、RPA、NEARなどの核酸増幅であること
あるいは
d3)シグナル増幅反応、例えば、核酸が前記検出剤の一部である、もしくはそれを形成する場合には核酸増幅、または、例えば、酵素が前記検出剤の一部である、もしくはそれを形成する場合には、例えば、色素もしくはフルオロフォアなどの標識の形態のシグナルの酵素ベースの増幅を実施し、このように増幅されたシグナルを検出すること
のいずれかによって実施される、規定される反応空間として使用するステップと
を含む、方法に関する。
a)メチルアクリレートおよびアクリレート、アクリルアミドおよびメタクリルアミド、環状ラクタム、スチレンベースのモノマーなどのその対応するモノマーから調製された合成ポリマー、
b)シリコンベースのポリマー、例えば、ポリジメチルシロキサンおよびそのコポリマー、
c)多糖、例えば、アガロース、キチン、キトサン、アルギネート、カラゲナン、セルロース、フコイダン、ラミナラン;キサンタンガム、アラビアガム、ガッティガム(ghatti gum)、グアーガム、ローカストビーンガム、トラガカントガム、カラヤガムおよびイヌリンから選択されるガム;ポリペプチド、例えば、アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、ポリヌクレオチドならびにそれらの組合せから選択される天然に存在するポリマー
を含む群から選択される。
a)本発明に従う予め製作された微粒子の集合体を提供するステップと、
b)前記集合体を、検出されるべき分析物を含有すると疑われる試料に対して曝露し、したがって、存在する場合には、前記捕捉剤が、検出されるべき前記分析物と選択的かつ特異的に結合することを可能にするステップであって、必要に応じて、再構成するステップおよび/または曝露するステップの後に、1つまたはいくつかの洗浄ステップがある、ステップと、
c)前記微粒子の集合体を非水相、例えば、油相に入れるステップと、
d1)前記分析物または前記捕捉剤と前記分析物との間の前記複合体に結合した検出剤を検出すること、
あるいは
d2)存在する場合には、前記分析物を増幅反応によって増幅し、前記検出剤によってこのように増幅された産物を検出することであって、前記分析物が核酸であり、前記増幅反応が、例えば、PCR、TMA、NASBA、LAMP、3SR、SDA、RCA、LCR、RPA、NEARなどの核酸増幅であること
あるいは
d3)シグナル増幅反応、例えば、核酸が前記検出剤の一部である、もしくはそれを形成する場合には核酸増幅、または、例えば、酵素が前記検出剤の一部である、もしくはそれを形成する場合には、例えば、色素もしくはフルオロフォアなどの標識の形態のシグナルの酵素ベースの増幅を実施し、このように増幅されたシグナルを検出すること
のいずれかのステップ
を含む、方法に関する。
a)任意の順序で、ゲル形成剤を含む水相と、前記水相とは別に、油相とを提供するステップと、
b)好ましくは、油相の流れを作製することによって、および規定容量の水相を、前記油相の前記流れの中に投入することによって、油相内に、ゲル形成剤を含む水相の水性液滴を形成するステップと、
c)前記油相内のこのように生成した水性液滴を集め、その後、遠心分離、篩分けまたは濾過などの機械的分離によって前記油相から前記水性液滴を分けるステップと
を含む。
ここで、図面を参照する。
DABミックスの作製
構成成分1:
脱イオン水、ヌクレアーゼ不含
超低ゲル化アガロース(Sigma-Aldrich、番号A5030)、ビオチン標識された2%(w/v)
5mLの、Novec7500油(Dolomite Microfluidics)中のエマルジョン試薬PicoSurf(商標)5%を、0.2μmのフィルターを通して濾過し、清潔な20mlのガラスチューブ(Fisher Scientific、番号12353317)に移し、油相のフローを制御するポンプ(油相ポンプ)のリザーバー中に入れる。アガロース相のフローを制御する2つのその他のポンプ(DABミックスポンプ)に不活性「駆動液体」HFE-7500(Dolomite Microfluidics、番号3200425)を用いて充填する。
篩構造を通して遠心分離によって油相からDABを抽出する。したがって、異常なサイズのビーズが除去される。この目的のために、DABエマルジョンをまず、SEFAR PETEX(登録商標)ファブリックw=44μm)を備えたチューブに付与し、300×gで遠心分離する。より大きなDABは、SEFARファブリック上に残りながら、油相および過小サイズDABを篩を通して移動させる。油相を完全に除去するために、DABを洗浄バッファーに再懸濁し、SEFAR篩を通して再度濾過する。使用される洗浄バッファーは、1×Taq DNAポリメラーゼPCRバッファー[20mM Tris HCl(pH8.4)、50mM KCl](Invitrogen、番号18067017)および1% TritonX100(Sigma-Aldrich、番号X100)からなる。この洗浄ステップを、油相が完全に除去されるまで5回反復する。界面活性剤を伴わない1×Taq DNAポリメラーゼバッファーを用いて2回のさらなる洗浄ステップを実施する。適した遠心チューブ中に反対の配向でフィルターユニットを適用することによってDABを回収する。洗浄バッファーをフィルターの裏側(粒子に背を向ける側)に頂部から付与する。濾過ユニットを1.000×gで1分間遠心分離する。すべての粒子を回収するために、このステップを数回反復する。全容量を、SEFAR PETEX(登録商標)ティシュー、メッシュ幅w=59μm(SEFAR AG、07-59/33)を備えたフィルター上にピペットでのせることによって、過大サイズのDABを濾過して除去する。ユニットを300×gで短時間遠心分離する。フィルターを通過した材料を集め、所望のサイズのDABを含有する。
ストレプトアビジンを用いるDABのコーティングを、以前に使用された洗浄バッファー中で達成する。ストレプトアビジンの濃度は、到達可能なビオチンがDABの表面に残らないように選択する。いずれの場合にも、DABの架橋結合を避けるために、ストレプトアビジンを過剰に付与する。最適ストレプトアビジン濃度は、プラトー表面被覆率を決定することによって標識されたストレプトアビジンを用いる予備試験において決定されている。ストレプトアビジンとのカップリング後、DABを、44μmのSEFAR PETEX遠心分離ユニット上で、ストレプトアビジンを伴わない洗浄バッファーを用いて数回洗浄する。その後、DHC-N01(Neubauer Improved)カウントチャンバー(INCYTO)中で顕微鏡下でカウントすることによって、またはCytoFlexフローサイトメーター(Beckman Coulter)でサイトメトリー的にDABの濃度を決定する。
DABでのHIV1(サブタイプO)標的の濃縮およびそれらのビーズの増幅ミックスとともに行うインキュベーション
逆転写によってビオチンを用いて標識された精製HIV-1 RNA(サブタイプO)を、ストレプトアビジン修飾デジタル増幅ビーズ上で濃縮する。逆転写反応の全容量を規定量の凍結乾燥DABに添加する。DABは、付与された液体の一部を吸収し、膨潤する。ビーズを注意深く再懸濁する。凝集を避けるために、超音波を使用してもよい。その後、懸濁液を、SEFAR PETEX(登録商標)ティシュー(w=44μm)を備えた遠心分離チューブに付与する。300×gでのカラムの遠心分離によって上清を除去する。洗浄のために、これまでに使用された洗浄バッファーを、界面活性剤は伴わずにカラムに添加し、同様に300×gで遠心分離する。洗浄を数回反復し、DABは、最終的に構成成分3に取り込まれる。この実施形態では、DABは、拡散によってPCRに必要なすべての構成成分を取り込む。
構成成分3は、以下の試薬からなる(最終濃度):
○1×Platinum(商標)Hot Start PCRマスターミックス(Invitrogen、番号13000012)
○0.2μMのセンスプライマー:GCAGTGGCGCCCGAACAGG(Metabion international AG)
○0.2μMのアンチセンスプライマー1:ACTGACGCTCTCGCACCCATCT(Metabion international AG)
○0.2μMのアンチセンスプライマー2:TGACGCTCTCGCACCCATCTCTC(Metabion international AG)
○1×SYBR(登録商標)Green I核酸ゲル染料(Sigma-Aldrich、番号S9430)または1×EvaGreen(登録商標)Fluorescent DNA染料(Jena Bioscience、番号PCR-352)
フルオロカーボン油、例えば、Novec7500油(Dolomite Microfluidics、番号3200214に分散されたPicoSurf(商標)5%中にDABを分散させることによって規定の容量を有する微小区画を作出する。重質フルオロカーボン油の代わりに、乳化剤を有する軽鉱油、例えば、5%(w/w)Span80(Sigma Aldrich、番号85548)を有する鉱油(Sigma-Aldrich、番号M5904 Sigma)を付与してもよい。
油中に懸濁されたDABを、PELTIERエレメント30×30×4.7mm、19.3W(Quick-Ohm、Kupper&Co.GmbH、番号QC-71-1.4-3.7M)で同一チャンバー中で温度サイクルに付す。捕捉されたcDNAは、アガロースの融解およびDABの液体液滴への変換の際に内在化される。個々のcDNA分子の増幅は、得られた微小反応区画中で起こる。
印加される熱条件は以下である:
ここで、本発明者らは、ヒトcTnIの検出のためにデジタルイムノアッセイを確立するプロセスを説明する。アッセイは、デジタル形式の免疫PCRを使用する:DNA標識された検出抗体およびストレプトアビジン標識された捕捉抗体は、溶液中の抗原とサンドイッチ複合体を形成する。この複合体は、PCR増幅を実施するための試薬が包埋された、ビオチンコーティングされたアガロース粒子上で捉えられる。適当な洗浄ステップによって、結合していない検出抗体、したがって、DNA標識を除去する。アガロース粒子を油中に懸濁し、その結果、別個の反応区画が形成される。その後の液滴PCRにおいて、結合したDNA標識が検出される。
cTnI検出抗体(クローン3H9、SDIX)を、Thunder-Link(登録商標)PLUSオリゴコンジュゲーションシステム(Innova Bioscience)を製造業者のプロトコールに従って使用して標識し、次いで、精製する。以下の配列が抗体にカップリングされる:
5’GCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCT3‘
クローンTPC-110(SDIX)を捕捉抗体として使用する。これに、製造業者のプロトコールに従ってLightning linkストレプトアビジン(Innova Bioscience)によって印を付けた。
DABの調製は、実施例1に記載される方法に従い、以下の修飾を用いて実施した。例示的実施形態においてビオチン標識アガロース粒子を水相に移し、適していない粒子サイズを排除した後、粒子を1×PCRバッファー中に集める。粒子の濃度を約4.000/μlに調整する。粒子を25μlの単位で等分する。
反応ミックス:
ヒト血漿 80μl
TBS(K)pH8.4(20mM Tris、50mM KCl pH8.4)、0.5% TritonX-100、10mg/ml BS 10μl
HBR-Plus(Scantibodies) 10μl
DNA標識された検出抗体 xμl
ストレプトアビジン標識された捕捉抗体 yμl
検出および捕捉抗体の最適濃度を、従来の免疫PCRによって決定する。2種の抗体の濃度を、系統的に変え、トロポニン不含血漿(陰性対照)および規定量の添加されたトロポニンIを含むトロポニン不含血漿を使用して免疫複合体を作製した。これらを粒子上に捕捉し、洗浄し、従来のPCRに付した。それぞれの抗体の最適濃度は、検出の下限および最も広いダイナミック測定レンジによって示されている。
2種の抗体のこれまでに決定された最適濃度を用いて、25μlの反応混合物(上記を参照のこと)を調製する。反応混合物を、エッペンドルフサーモミキサーで800rpm、37℃で10分間インキュベートする。その後、混合物を、DAB粒子のアリコート(25μlの1×Taqポリメラーゼバッファー中、100,000個粒子)と混合する。
500nM fw-プライマー(5’AGCTCTTGATCCGGCAAACA3’)
500nM rev-プライマー(5’GCGTCAGACCCCGTAGAAAA3’)
SYBR(登録商標)Green I核酸ゲル染料(Sigma-Aldrich、番号S9430)1:25000
12,5μl 2×PCR-マスターミックス
PCR等級水
実施形態2に記載されるように、DABを油相に移す。PCR増幅を以下のパラメーターを用いて40サイクルにわたって実施する:
サイクル1:
5分95℃
30秒65℃
30秒72℃
サイクル2~40:
30秒94℃
30秒65℃
30秒72℃
DNA標識された検出抗体の、DAB非特異的結合は、デジタル免疫PCRの適用性を制限する重大なパラメーターに相当する。非特異的に結合した標識は、増幅後に偽陽性DABをもたらす。したがって、デジタル免疫PCRでは、分析物の定量は、陽性試料と陰性対照間の差を決定することによって達成される。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
試料中の分析物の検出、好ましくは、デジタル検出を実施する方法であって、
a)表面を有し、水溶液を受け取るための空隙容量を含む予め製作された微粒子を提供するステップであって、前記微粒子は、非水性媒体に分散性であり、非水性媒体に分散すると、このような非水性媒体において規定される反応空間を提供し、規定される反応空間において、分析物の存在を示す化学的または生化学的反応を実施でき、前記予め製作された微粒子は、前記微粒子を、前記予め製作された微粒子を取り囲み、分析物を含有する試料に対して曝露すると、検出されるべき前記分析物と選択的かつ特異的に結合し、前記分析物の捕捉剤との結合の際に、前記捕捉剤と前記分析物の間に複合体を形成する捕捉剤を含み、前記捕捉剤は、前記予め製作された微粒子を取り囲む試料に由来する分析物と結合し、前記予め製作された微粒子は、前記分析物または前記捕捉剤と前記分析物との間の前記複合体に特異的であり、前記分析物または前記捕捉剤と前記分析物との間の前記複合体と結合する検出剤をさらに含む、ステップと、
b)前記予め製作された微粒子を、検出されるべき分析物を含有すると疑われる水性試料に対して曝露し、したがって、存在する場合には、前記捕捉剤が、検出されるべき前記分析物と選択的かつ特異的に結合することを可能にするステップと、
c)前記予め製作された微粒子を非水相、例えば、油相に入れ、前記予め製作された微粒子の空隙容量を、分析物の存在を示す化学的または生化学的反応が、
d1)前記分析物または前記捕捉剤と前記分析物との間の前記複合体に結合した検出剤を検出すること、
あるいは
d2)存在する場合には、前記分析物を増幅反応によって増幅し、前記検出剤によってこのように増幅された産物を検出することであって、前記分析物が核酸であり、前記増幅反応が、例えば、PCR、TMA、NASBA、LAMP、3SR、SDA、RCA、LCR、RPA、NEARなどの核酸増幅であること
あるいは
d3)シグナル増幅反応、例えば、核酸が前記検出剤の一部である、もしくはそれを形成する場合には核酸増幅、または、例えば、酵素が前記検出剤の一部である、もしくはそれを形成する場合には、例えば、色素もしくはフルオロフォアなどの標識の形態のシグナルの酵素ベースの増幅を実施し、このように増幅されたシグナルを検出すること
のいずれかによって実施される、規定される反応空間として使用するステップと
を含む、方法。
(項目2)
前記予め製作された微粒子が、乾燥した、好ましくは、凍結乾燥した予め製作された微粒子として提供される、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記予め製作された微粒子が、その場で作製された微粒子ではなく、好ましくは、分析物検出が行われるとき、またはその間に、その場所で、またはその反応中でその場で作製された微粒子ではない、項目1から2のいずれかに記載の方法。
(項目4)
前記捕捉剤が、前記予め製作された微粒子の前記表面上に主に位置し、その結果、前記予め製作された微粒子が、前記微粒子の外側に位置する分析物を濃縮し集中させることが可能である、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目5)
前記予め製作された微粒子が、好ましくは、ステップa)またはステップb)のいずれかの間に、水溶液中で再構成され、再構成の際に、その空隙容量中にこのような水溶液を受け取る、項目2から4のいずれかに記載の方法。
(項目6)
前記検出剤が、予め製作するプロセスの間に前記予め製作された微粒子中に含まれるか、または項目5に記載の前記水溶液中に含まれ、したがって、再構成の際に前記予め製作された微粒子の一部となる、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目7)
前記予め製作された微粒子が、ゲル形成剤でできており、このようなゲル形成剤が、好ましくは、熱もしくは光の印加の際に、またはpH、酸化還元電位、イオン強度、温度、磁場もしくは電磁放射の変化の際に、または酵素に対する、もしくは、前記ゲル形成剤自体が酵素を含む場合には、このような酵素の基質に対する曝露の際に、または前述の任意の組合せで液化可能である、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目8)
前記ゲル形成剤が、前記微粒子の前記表面および前記空隙容量を規定するマトリックスを形成する、項目7に記載の方法。
(項目9)
前記ゲル形成剤が、
a)メチルアクリレートおよびアクリレート、アクリルアミドおよびメタクリルアミド、環状ラクタム、スチレンベースのモノマーなどのその対応するモノマーから調製された合成ポリマー、
b)シリコンベースのポリマー、例えば、ポリジメチルシロキサンおよびそのコポリマー、
c)多糖、例えば、アガロース、キチン、キトサン、アルギネート、カラゲナン、セルロース、フコイダン、ラミナラン;キサンタンガム、アラビアガム、ガッティガム(ghatti gum)、グアーガム、ローカストビーンガム、トラガカントガム、カラヤガムおよびイヌリンから選択されるガム;ポリペプチド、例えば、アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、ポリヌクレオチドならびにそれらの組合せから選択される天然に存在するポリマー
を含む群から選択される、項目7から8のいずれかに記載の方法。
(項目10)
前記捕捉剤が、抗体または抗体断片、アプタマーを含む核酸、スピーゲルマー(Spiegelmer);受容体、受容体断片、親和性タンパク質、例えば、ストレプトアビジンなどの分析物または分析物複合体と特異的に結合可能な非抗体タンパク質から選択される、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目11)
前記検出剤が、抗体または抗体断片、アプタマーを含む核酸、スピーゲルマー;受容体、受容体断片、親和性タンパク質、例えば、ストレプトアビジンなどの非抗体タンパク質から選択され、その各々が、必要に応じて、適したレポーター分子、例えば、色素、酵素、化学触媒または検出されるべき前記分析物の存在を示す光学的にもしくは別の形で検出可能なシグナルをもたらす化学反応を開始可能である試薬の混合物を用いて標識される、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目12)
前記予め製作された微粒子が、特異的に標識される、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目13)
予め製作された微粒子の集合体を使用して実施され、前記予め製作された微粒子が、前記項目のいずれかに定義される通りである、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目14)
前記予め製作された微粒子の集合体において、前記予め製作された微粒子が、検出されるべき異なる分析物に特異的であるという点で互いに異なり、各予め製作された微粒子が、異なる予め製作された微粒子およびその対応する検出される分析物が、前記予め製作された微粒子の特異的標識によって区別され得るように特異的に標識される、項目13に記載の方法。
(項目15)
試料中の分析物もしくは複数の分析物のデジタル検出を実施するための、または複数の規定される容量中の複数の分析物を濃縮し集中させるための、好ましくは、前記複数の規定される容量中の前記規定される容量のすべてが同等である、前記項目のいずれかに記載の予め製作された微粒子の、または予め製作された微粒子の集合体の使用を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目16)
前記曝露するステップb)の後に、1つまたはいくつかの洗浄ステップがある、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目17)
ステップa)において、前記予め製作された微粒子が乾燥した形態で提供され、ステップb)において、前記予め製作された微粒子が水溶液中で再構成され、次いで、検出されるべき分析物を含有すると疑われる試料に対して曝露され、必要に応じて、前記再構成のステップ後に、1つまたはいくつかの洗浄ステップがある、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目18)
ステップb)において、予め製作された微粒子数および前記試料中の分析物分子数が、予め製作された微粒子あたりの単一分析物分子の結合が、ポワソン分布に従うように、好ましくは、平均して、微粒子あたり1つ以下の分析物分子が結合し、したがって、予め製作された微粒子あたり単一の分析物分子の検出が可能になるように、必要に応じて維持され、調整される、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目19)
ステップc)の間に、存在する場合には、前記予め製作された微粒子または前記予め製作された微粒子の集合体が、前記非水相に懸濁されるか、そして/または予め製作された微粒子をそれぞれその他の予め製作された微粒子から隔離する固体基材上に位置し、好ましくは、前記固体基材がフィルター、篩、ウェル、陥凹、溝、チャネル、塹壕、クレーター、孔、柱または前述の任意の組合せのパターンを有する基材である、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目20)
ステップc)の間またはステップc)の後に、前記ゲル形成剤が、好ましくは、熱もしくは光の印加を通じて、またはpH、酸化還元電位、イオン強度、温度、磁場もしくは電磁放射の変化によって、または酵素に対する、もしくは、前記ゲル形成剤自体が酵素を含む場合には、このような酵素の基質に対する曝露の際に、または前述の任意の組合せで液化され、非水相中の水性液滴をもたらす、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目21)
分析物の存在を示す前記化学的または生化学的反応が実施される前記反応空間が、前記予め製作された微粒子の前記空隙容量によって規定され、前記予め製作された微粒子の前記空隙容量よりも実質的に大きくない、前記項目のいずれかに記載の方法。
Claims (35)
- 試料中の分析物の検出を実施する方法であって、
a)表面を有し、水溶液を受け取るための空隙容量を含む予め製作された微粒子を提供するステップであって、前記微粒子は、非水性媒体に分散性であり、非水性媒体に分散すると、このような非水性媒体において規定される反応空間を提供し、規定される反応空間において、分析物の存在を示す化学的または生化学的反応を実施でき、前記予め製作された微粒子は、前記微粒子を、前記予め製作された微粒子を取り囲み、分析物を含有する試料に対して曝露すると、検出されるべき前記分析物と選択的かつ特異的に結合し、前記分析物の捕捉剤との結合の際に、前記捕捉剤と前記分析物の間に複合体を形成する捕捉剤を含み、前記捕捉剤は、前記予め製作された微粒子を取り囲む試料に由来する分析物と結合し、前記予め製作された微粒子は、前記分析物または前記捕捉剤と前記分析物との間の前記複合体に特異的であり、前記分析物または前記捕捉剤と前記分析物との間の前記複合体と結合する検出剤をさらに含む、ステップと、
b)前記予め製作された微粒子を、検出されるべき分析物を含有すると疑われる水性試料に対して曝露し、したがって、存在する場合には、前記捕捉剤が、検出されるべき前記分析物と選択的かつ特異的に結合することを可能にするステップと、
c)前記予め製作された微粒子を非水相に入れ、前記予め製作された微粒子の空隙容量を、分析物の存在を示す化学的または生化学的反応が、
d1)前記分析物または前記捕捉剤と前記分析物との間の前記複合体に結合した検出剤を検出すること、
あるいは
d2)存在する場合には、前記分析物を増幅反応によって増幅し、前記検出剤によってこのように増幅された産物を検出することであって、前記分析物が核酸であり、前記増幅反応が、核酸増幅であること
あるいは
d3)シグナル増幅反応を実施し、このように増幅されたシグナルを検出すること
のいずれかによって実施される、規定される反応空間として使用するステップと
を含み、
分析物の存在を示す前記化学的または生化学的反応が実施される前記反応空間が、前記予め製作された微粒子の前記空隙容量によって規定され、前記予め製作された微粒子の前記空隙容量よりも大きくなく、
前記予め製作された微粒子が、ゲル形成剤でできている、方法。 - ステップc)における前記非水相が油相である、請求項1に記載の方法。
- ステップd2)における前記核酸増幅が、PCR、TMA、NASBA、LAMP、3SR、SDA、RCA、LCR、RPA、およびNEARから選択され、ステップd3)における前記シグナル増幅反応が、核酸が前記検出剤の一部である、もしくはそれを形成する場合には核酸増幅であるか、またはステップd3)における前記シグナル増幅反応が、シグナルの酵素ベースの増幅である、請求項1または2に記載の方法。
- ステップd3)における前記シグナルは、酵素が前記検出剤であるか、またはその一部を形成する場合、色素またはフルオロフォアである標識の形態である、請求項3に記載の方法。
- 前記予め製作された微粒子が、乾燥した予め製作された微粒子として提供される、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 前記予め製作された微粒子が、凍結乾燥した予め製作された微粒子として提供される、請求項5に記載の方法。
- 前記予め製作された微粒子が、その場で作製された微粒子ではない、請求項1から6のいずれかに記載の方法。
- 前記予め製作された微粒子が、分析物検出が行われるとき、またはその間に、その場所で、またはその反応中でその場で作製された微粒子ではない、請求項7に記載の方法。
- 前記捕捉剤が、前記予め製作された微粒子の前記表面上に主に位置し、その結果、前記予め製作された微粒子が、前記微粒子の外側に位置する分析物を濃縮し集中させることが可能である、請求項1から8のいずれかに記載の方法。
- 前記予め製作された微粒子が、水溶液中で再構成され、再構成の際に、その空隙容量中にこのような水溶液を受け取る、請求項5から9のいずれかに記載の方法。
- 前記予め製作された微粒子が、ステップa)またはステップb)のいずれかの間に、水溶液中で再構成される、請求項10に記載の方法。
- 前記検出剤が、予め製作するプロセスの間に前記予め製作された微粒子中に含まれるか、または請求項10に記載の前記水溶液中に含まれ、したがって、再構成の際に前記予め製作された微粒子の一部となる、請求項1から11のいずれかに記載の方法。
- 前記ゲル形成剤が、熱もしくは光の印加の際に、またはpH、酸化還元電位、イオン強度、温度、磁場もしくは電磁放射の変化の際に、または酵素に対する、もしくは、前記ゲル形成剤自体が酵素を含む場合には、このような酵素の基質に対する曝露の際に、または前述の任意の組合せで液化可能である、請求項1から12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ゲル形成剤が、前記微粒子の前記表面および前記空隙容量を規定するマトリックスを形成する、請求項1から13のいずれかに記載の方法。
- 前記ゲル形成剤が、
a)その対応するモノマーから調製された合成ポリマー、
b)シリコンベースのポリマー、
c)多糖;ポリペプチド;ポリヌクレオチドならびにそれらの組合せから選択される天然に存在するポリマー
を含む群から選択される、請求項1から14のいずれかに記載の方法。 - a)の前記ポリマーが、メチルアクリレートおよびアクリレート、アクリルアミドおよびメタクリルアミド、環状ラクタム、ならびにスチレンベースのモノマーから選択され;前記シリコンベースのポリマーが、ポリジメチルシロキサンおよびそのコポリマーから選択され;前記天然に存在するポリマーが、アガロース、キチン、キトサン、アルギネート、カラゲナン、セルロース、フコイダン、ラミナラン;キサンタンガム、アラビアガム、ガッティガム(ghatti gum)、グアーガム、ローカストビーンガム、トラガカントガム、カラヤガムおよびイヌリンから選択されるガム;アルブミン、コラーゲン、ならびにゼラチン;ならびにそれらの組合せから選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記捕捉剤が、抗体または抗体断片、アプタマーを含む核酸、スピーゲルマー(Spiegelmer)、分析物または分析物複合体と特異的に結合可能な非抗体タンパク質から選択される、請求項1から16のいずれかに記載の方法。
- 前記非抗体タンパク質が、受容体、受容体断片、および親和性タンパク質から選択される、請求項17に記載の方法。
- 前記検出剤が、抗体または抗体断片、アプタマーを含む核酸、スピーゲルマー、非抗体タンパク質から選択され、その各々が、必要に応じて、適したレポーター分子を用いて標識される、請求項1から18のいずれかに記載の方法。
- 前記非抗体タンパク質が、受容体、受容体断片、および親和性タンパク質から選択され、前記適したレポーター分子が、色素、酵素、化学触媒または検出されるべき前記分析物の存在を示す光学的にもしくは別の形で検出可能なシグナルをもたらす化学反応を開始可能である試薬の混合物である、請求項19に記載の方法。
- 前記親和性タンパク質がストレプトアビジンである、請求項18および20のいずれかに記載の方法。
- 前記予め製作された微粒子が、特異的に標識される、請求項1から21のいずれかに記載の方法。
- 予め製作された微粒子の集合体を使用して実施され、前記予め製作された微粒子が、請求項1から22のいずれかに定義される通りである、請求項1から22のいずれかに記載の方法。
- 前記予め製作された微粒子の集合体において、前記予め製作された微粒子が、検出されるべき異なる分析物に特異的であるという点で互いに異なり、各予め製作された微粒子が、異なる予め製作された微粒子およびその対応する検出される分析物が、前記予め製作された微粒子の特異的標識によって区別され得るように特異的に標識される、請求項23に記載の方法。
- 試料中の分析物もしくは複数の分析物のデジタル検出を実施するための、または複数の規定される容量中の複数の分析物を濃縮し集中させるための、請求項1から24のいずれかに記載の予め製作された微粒子の、または予め製作された微粒子の集合体の使用を含む、請求項1から24のいずれかに記載の方法。
- 前記複数の規定される容量中の前記規定される容量のすべてが同等である、請求項25に記載の方法。
- 前記曝露するステップb)の後に、1つまたはいくつかの洗浄ステップがある、請求項1から26のいずれかに記載の方法。
- ステップa)において、前記予め製作された微粒子が乾燥した形態で提供され、ステップb)において、前記予め製作された微粒子が水溶液中で再構成され、次いで、検出されるべき分析物を含有すると疑われる試料に対して曝露され、必要に応じて、前記再構成のステップ後に、1つまたはいくつかの洗浄ステップがある、請求項1から27のいずれかに記載の方法。
- ステップb)において、予め製作された微粒子数および前記試料中の分析物分子数が、予め製作された微粒子あたりの単一分析物分子の結合が、ポワソン分布に従うように、必要に応じて維持され、調整される、請求項1から28のいずれかに記載の方法。
- ステップb)において、予め製作された微粒子数および前記試料中の分析物分子数が、平均して、微粒子あたり1つ以下の分析物分子が結合し、したがって、予め製作された微粒子あたり単一の分析物分子の検出が可能になるように、必要に応じて維持され、調整される、請求項29に記載の方法。
- ステップc)の間に、存在する場合には、前記予め製作された微粒子または前記予め製作された微粒子の集合体が、前記非水相に懸濁されるか、そして/または予め製作された微粒子をそれぞれその他の予め製作された微粒子から隔離する固体基材上に位置する、請求項1から30のいずれかに記載の方法。
- 前記固体基材がフィルター、篩、ウェル、陥凹、溝、チャネル、塹壕、クレーター、孔、柱または前述の任意の組合せのパターンを有する基材である、請求項31に記載の方法。
- ステップc)の間またはステップc)の後に、前記ゲル形成剤が、液化され、非水相中の水性液滴をもたらす、請求項1から32のいずれかに記載の方法。
- ステップc)の間またはステップc)の後に、前記ゲル形成剤が、熱もしくは光の印加を通じて、またはpH、酸化還元電位、イオン強度、温度、磁場もしくは電磁放射の変化によって、または酵素に対する、もしくは、前記ゲル形成剤自体が酵素を含む場合には、このような酵素の基質に対する曝露の際に、または前述の任意の組合せで液化され、非水相中の水性液滴をもたらす、請求項33に記載の方法。
- 前記試料中の分析物の検出を実施する方法は、分析物のデジタル検出を実施する方法である、請求項1から34のいずれかに記載の方法。
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