JP7227822B2 - イオン化法及び質量分析方法 - Google Patents

Description

本発明は、イオン化法及び質量分析方法に関する。

質量分析等を行うために生体試料等の試料をイオン化する方法として、脱離エレクトロスプレーイオン化法（ＤＥＳＩ：Desorption Electrospray Ionization）が知られている（例えば、特許文献１参照）。脱離エレクトロスプレーイオン化法は、試料に対して、帯電した微小液滴（charged-droplets）を照射することにより、試料を脱離・イオン化する方法である。

特開２００７－１６５１１６号公報

脱離エレクトロスプレーイオン化法では、例えば質量分析において信号強度（感度）の向上を図るために、試料の成分を確実にイオン化することが求められている。

本発明は、帯電した微小液滴の照射によって試料の成分を確実にイオン化することができるイオン化法、及び信号強度の向上を図ることができる質量分析方法を提供することを目的とする。

本発明のイオン化法は、第１表面、及び第１表面とは反対側の第２表面、並びに、第１表面及び第２表面のそれぞれに開口する複数の貫通孔を有する電気絶縁性の基板と、基板に取り付けられた電気絶縁性のフレームと、を備える試料支持体を用意する第１工程と、載置部の載置面に試料を載置し、試料に第２表面が接触するように載置面に試料支持体を載置する第２工程と、第１表面に対して、帯電した微小液滴を照射することにより、複数の貫通孔を介して第１表面側に移動した試料の成分をイオン化し、イオン化された成分を吸引する第３工程と、を備える。

このイオン化法では、試料支持体の基板において、試料の成分が、複数の貫通孔を介して第２表面側から第１表面側に移動し、第１表面側に留まる。そして、試料支持体の基板及びフレームが電気絶縁性の部材であるため、例えば高電圧が印加された微小液滴照射部を第１表面に近付けても、微小液滴照射部と試料支持体との間での放電の発生が抑制される。よって、このイオン化法によれば、微小液滴照射部を第１表面に近付けて第１表面に対して帯電した微小液滴を照射することにより、複数の貫通孔を介して第１表面側に移動した試料の成分を確実にイオン化することができる。

本発明のイオン化法では、第３工程は、大気圧雰囲気から中真空雰囲気（真空度１０^－３Torr以上の雰囲気）までの条件下で実施されてもよい。これにより、試料を手軽に交換して試料の観察及び分析を容易に行うことができる。

本発明のイオン化法では、第３工程においては、第１表面に対して、帯電した微小液滴の照射領域を相対的に移動させてもよい。基板の第１表面側に留まっている試料の成分においては、試料の位置情報（試料を構成する分子の二次元分布情報）が維持されている。したがって、第１表面に対して、帯電した微小液滴の照射領域を相対的に移動させることにより、試料の位置情報を維持しつつ試料の成分をイオン化することができる。これにより、イオン化された成分を検出する後段の工程において、試料を構成する分子の二次元分布を画像化することができる。更に、上述したように微小液滴照射部を第１表面に近付けることが可能であるため、帯電した微小液滴の照射領域が拡大するのを抑制することができる。これにより、イオン化された成分を検出する後段の工程において、試料を構成する分子の二次元分布を高分解能で画像化することができる。

本発明の質量分析方法は、上述したイオン化法の第１工程、第２工程及び第３工程と、第３工程においてイオン化された成分を検出する第４工程と、を備える。

この質量分析方法では、上述したように、帯電した微小液滴の照射によって試料の成分が確実にイオン化されるため、イオン化された成分を検出する際における信号強度の向上を図ることができる。

本発明によれば、帯電した微小液滴の照射によって試料の成分を確実にイオン化することができるイオン化法、及び信号強度の向上を図ることができる質量分析方法を提供することが可能となる。

一実施形態の質量分析方法に用いられる試料支持体の平面図である。 図１に示されるII－II線に沿っての試料支持体の断面図である。 図１に示される試料支持体の基板の拡大像である。 一実施形態の質量分析方法の工程を示す図である。 一実施形態の質量分析方法の工程を示す図である。 一実施形態の質量分析方法が実施される質量分析装置の構成図である。 比較例の質量分析方法によって得られた質量スペクトルを示す図である。 実施例の質量分析方法によって得られた質量スペクトルを示す図である。 比較例の質量分析方法によって得られた特定イオンの二次元分布像を示す図である。 実施例の質量分析方法によって得られた特定イオンの二次元分布像を示す図である。

以下、本発明の実施形態について、図面を参照して詳細に説明する。なお、各図において同一又は相当部分には同一符号を付し、重複する説明を省略する。
［試料支持体］

図１及び図２に示されるように、試料支持体１は、基板２と、フレーム３と、接着層４と、を備えている。基板２は、第１表面２ａ及び第２表面２ｂ、並びに、複数の貫通孔２ｃを有している。第２表面２ｂは、第１表面２ａとは反対側の表面である。各貫通孔２ｃは、第１表面２ａ及び第２表面２ｂのそれぞれに開口している。本実施形態では、複数の貫通孔２ｃは、基板２の全体に一様に（均一な分布で）形成されており、各貫通孔２ｃは、基板２の厚さ方向（第１表面２ａ及び第２表面２ｂが互いに対向する方向）に延在している。

基板２は、電気絶縁性の部材である。本実施形態では、基板２の厚さは、１～５０μｍであり、各貫通孔２ｃの幅は、１～７００ｎｍ程度である。基板２の厚さ方向から見た場合における基板２の形状は、例えば、直径が数ｍｍ～数ｃｍ程度の略円形である。基板２の厚さ方向から見た場合における各貫通孔２ｃの形状は、例えば、略円形である（図３参照）。なお、貫通孔２ｃの幅とは、基板２の厚さ方向から見た場合における貫通孔２ｃの形状が円形である場合には、貫通孔２ｃの直径を意味し、当該形状が円形以外の形状である場合には、貫通孔２ｃに収まる仮想的な最大円柱の直径（有効径）を意味する。

フレーム３は、第３表面３ａ及び第４表面３ｂ、並びに、開口３ｃを有している。第４表面３ｂは、第３表面３ａとは反対側の表面であり、基板２側の表面である。開口３ｃは、第３表面３ａ及び第４表面３ｂのそれぞれに開口している。フレーム３は、電気絶縁性の部材であり、フレーム３の熱伝導率は、１．０Ｗ／ｍ・Ｋ以下である。本実施形態では、フレーム３の材料は、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ＰＥＮ（ポリエチレンナフタレート）又はＰＩ（ポリイミド）であり、また、フレーム３の厚さは、１０～５００μｍ（より好ましくは、１００μｍ未満）である。更に、本実施形態では、フレーム３は、可視光に対して透過性を有しており、また、フレーム３は、可撓性を有している。基板２の厚さ方向から見た場合におけるフレーム３の形状は、例えば、一辺が数ｃｍ程度の矩形である。基板２の厚さ方向から見た場合における開口３ｃの形状は、例えば、直径が数ｍｍ～数ｃｍ程度の円形である。なお、フレーム３の熱伝導率の下限値は、例えば、０．１Ｗ／ｍ・Ｋである。

フレーム３は、基板２に取り付けられている。本実施形態では、基板２の第１表面２ａのうち基板２の外縁に沿った領域と、フレーム３の第４表面３ｂのうち開口３ｃの外縁に沿った領域とが、接着層４によって互いに固定されている。接着層４の材料は、例えば、放出ガスの少ない接着材料（低融点ガラス、真空用接着剤等）である。試料支持体１では、基板２のうちフレーム３の開口３ｃに対応する部分が、複数の貫通孔２ｃを介して第２表面２ｂ側から第１表面２ａ側に試料の成分を移動させるための実効領域Ｒとして機能する。

図３は、基板２の厚さ方向から見た場合における基板２の拡大像ある。図３において、黒色の部分は貫通孔２ｃであり、白色の部分は貫通孔２ｃ間の隔壁部である。図３に示されるように、基板２には、略一定の幅を有する複数の貫通孔２ｃが一様に形成されている。実効領域Ｒにおける貫通孔２ｃの開口率（基板２の厚さ方向から見た場合に実効領域Ｒに対して全ての貫通孔２ｃが占める割合）は、実用上は１０～８０％であり、特に６０～８０％であることが好ましい。複数の貫通孔２ｃの大きさは互いに不揃いであってもよいし、部分的に複数の貫通孔２ｃ同士が互いに連結していてもよい。

図３に示される基板２は、Ａｌ（アルミニウム）を陽極酸化することにより形成されたアルミナポーラス皮膜である。具体的には、Ａｌ基板に対して陽極酸化処理を施し、酸化された表面部分をＡｌ基板から剥離することにより、基板２を得ることができる。なお、基板２は、Ｔａ（タンタル）、Ｎｂ（ニオブ）、Ｔｉ（チタン）、Ｈｆ（ハフニウム）、Ｚｒ（ジルコニウム）、Ｚｎ（亜鉛）、Ｗ（タングステン）、Ｂｉ（ビスマス）、Ｓｂ（アンチモン）等のＡｌ以外のバルブ金属を陽極酸化することにより形成されてもよいし、Ｓｉ（シリコン）を陽極酸化することにより形成されてもよい。
［イオン化法及び質量分析方法］

試料支持体１を用いたイオン化法及び質量分析方法について説明する。なお、図４及び図５では、試料支持体１において、貫通孔２ｃ及び接着層４の図示が省略されている。また、図１及び図２に示される試料支持体１と図４及び図５に示される試料支持体１とでは、図示の便宜上、寸法の比率等が異なっている。

まず、試料のイオン化用の試料支持体として、上述した試料支持体１を用意する（第１工程）。試料支持体１は、イオン化法及び質量分析方法の実施者によって製造されることにより用意されてもよいし、試料支持体１の製造者又は販売者等から譲渡されることにより用意されてもよい。

続いて、図４の（ａ）に示されるように、スライドグラス（載置部）６の載置面６ａに試料Ｓを載置する（第２工程）。試料Ｓは、例えば組織切片等の薄膜状の生体試料（含水試料）であり、凍結された状態にある。続いて、図４の（ｂ）に示されるように、試料Ｓに基板２の第２表面２ｂが接触するように載置面６ａに試料支持体１を載置する（第２工程）。このとき、基板２の厚さ方向から見た場合に試料Ｓが実効領域Ｒ内に位置するように、試料支持体１を配置する。続いて、図５の（ａ）に示されるように、電気絶縁性のテープ７を用いてフレーム３をスライドグラス６に固定する。この状態で、試料Ｓが解凍されると、図５の（ｂ）に示されるように、基板２においては、例えば毛細管現象によって、試料Ｓの成分Ｓ１が複数の貫通孔２ｃ（図２参照）を介して第２表面２ｂ側から第１表面２ａ側に移動し、例えば表面張力によって、試料Ｓの成分Ｓ１が第１表面２ａ側に留まる。

続いて、試料Ｓが乾燥したら、図６に示されるように、質量分析装置１０のイオン化室２０内のステージ２１上に、スライドグラス６、試料Ｓ及び試料支持体１を載置する。イオン化室２０内は、大気圧雰囲気から中真空雰囲気（真空度１０^－３Torr以上の雰囲気）までの条件下にある。続いて、基板２の第１表面２ａのうち実効領域Ｒに対応する領域に対して、帯電した微小液滴Ｉを照射することにより、第１表面２ａ側に移動した試料Ｓの成分Ｓ１をイオン化し、イオン化された成分である試料イオンＳ２を吸引する（第３工程）。本実施形態では、例えばステージ２１をＸ軸方向及びＹ軸方向に移動させることにより、基板２の第１表面２ａのうち実効領域Ｒに対応する領域に対して、帯電した微小液滴Ｉの照射領域Ｉ１を相対的に移動させる（つまり、当該領域に対して、帯電した微小液滴Ｉを走査する）。以上の第１工程、第２工程及び第３工程が、試料支持体１を用いたイオン化法（本実施形態では、脱離エレクトロスプレーイオン化法）に相当する。

イオン化室２０内では、ノズル２２から、帯電した微小液滴Ｉが噴射され、イオン輸送管２３の吸引口から試料イオンＳ２が吸引される。ノズル２２は、二重筒構造を有している。ノズル２２の内筒には、高電圧が印加された状態で溶媒が案内される。これにより、ノズル２２の先端に達した溶媒に、片寄った電荷が付与される。ノズル２２の外筒には、ネブライズガスが案内される。これにより、溶媒が微小液滴となって噴霧され、溶媒が気化する過程で生成された溶媒イオンが、帯電した微小液滴Ｉとして出射される。

イオン輸送管２３の吸引口から吸引された試料イオンＳ２は、イオン輸送管２３によって質量分析室３０内に輸送される。質量分析室３０内は、高真空雰囲気（真空度１０^－４Torr以下の雰囲気）の条件下にある。質量分析室３０内では、試料イオンＳ２がイオン光学系３１で収束され、高周波電圧が印加された四重極質量フィルタ３２に導入される。高周波電圧が印加された四重極質量フィルタ３２に試料イオンＳ２が導入されると、当該高周波電圧の周波数によって決定される質量数を有するイオンが選択的に通過させられ、通過させられたイオンが検出器３３で検出される（第４工程）。四重極質量フィルタ３２に印加する高周波電圧の周波数を走査することにより、検出器３３に到達するイオンの質量数を順次変化させて、所定の質量範囲の質量スペクトルを得る。本実施形態では、帯電した微小液滴Ｉの照射領域Ｉ１の位置に対応するように検出器３３にイオンを検出させて、試料Ｓを構成する分子の二次元分布を画像化する。以上の第１工程、第２工程、第３工程及び第４工程が、試料支持体１を用いた質量分析方法に相当する。
［作用及び効果］

試料支持体１を用いたイオン化法では、試料支持体１の基板２において、試料Ｓの成分Ｓ１が、複数の貫通孔２ｃを介して第２表面２ｂ側から第１表面２ａ側に移動し、第１表面２ａ側に留まる。そして、試料支持体１の基板２及びフレーム３が電気絶縁性の部材であるため、例えば高電圧が印加された微小液滴照射部であるノズル２２を第１表面２ａに近付けても、ノズル２２と試料支持体１との間での放電の発生が抑制される。よって、試料支持体１を用いたイオン化法によれば、ノズル２２を第１表面２ａに近付けて第１表面２ａに対して帯電した微小液滴Ｉを照射することにより、複数の貫通孔２ｃを介して第１表面２ａ側に移動した試料Ｓの成分Ｓ１を確実にイオン化することができる。

また、試料支持体１を用いたイオン化法では、大気圧雰囲気から中真空雰囲気（真空度１０^－３Torr以上の雰囲気）までの条件下で脱離エレクトロスプレーイオン化法が実施される。これにより、試料Ｓを手軽に交換して試料Ｓの観察及び分析を容易に行うことができる。特に、このような条件下では、ノズル２２から噴射された帯電した微小液滴Ｉが大気ガス分子等と接触して拡散し易い。そのため、上述したようにノズル２２を第１表面２ａに近付け得ることは、試料Ｓの成分Ｓ１を確実にイオン化する上で極めて有効である。

また、試料支持体１を用いたイオン化法では、基板２の第１表面２ａのうち実効領域Ｒに対応する領域に対して、帯電した微小液滴Ｉの照射領域Ｉ１を相対的に移動させる。基板２の第１表面２ａ側に留まっている試料Ｓの成分Ｓ１においては、試料Ｓの位置情報（試料Ｓを構成する分子の二次元分布情報）が維持されている。したがって、基板２の第１表面２ａのうち実効領域Ｒに対応する領域に対して、帯電した微小液滴Ｉの照射領域Ｉ１を相対的に移動させることにより、試料Ｓの位置情報を維持しつつ試料Ｓの成分Ｓ１をイオン化することができる。これにより、試料イオンＳ２を検出する後段の工程において、試料Ｓを構成する分子の二次元分布を画像化することができる。更に、上述したようにノズル２２を第１表面２ａに近付けることが可能であるため、帯電した微小液滴Ｉの照射領域Ｉ１が拡大するのを抑制することができる。これにより、試料イオンＳ２を検出する後段の工程において、試料Ｓを構成する分子の二次元分布を高分解能で画像化することができる。

また、試料支持体１を用いた質量分析方法では、上述したように、帯電した微小液滴Ｉの照射によって試料Ｓの成分Ｓ１が確実にイオン化されるため、試料イオンＳ２を検出する際における信号強度の向上を図ることができる。

ここで、比較例の質量分析方法及び実施例の質量分析方法のそれぞれによる分析結果について説明する。比較例の質量分析方法では、スライドグラスの載置面に生体試料を載置して、生体試料に対して、帯電した微小液滴を照射することにより、生体試料の成分をイオン化し、生体試料を構成する分子（イオン）について質量スペクトル及び特定イオンの二次元分布像を得た。実施例の質量分析方法では、上述した実施形態と同様に、スライドグラスの載置面に生体試料及び試料支持体を載置して、試料支持体の基板の第１表面に対して、帯電した微小液滴を照射することにより、生体試料の成分をイオン化し、生体試料を構成する分子（イオン）について質量スペクトル及び特定イオンの二次元分布像を得た。

比較例の質量分析方法及び実施例の質量分析方法のそれぞれにおいて、生体試料として、マウスの脳の凍結切片（厚さ４０μｍ）を用いた。また、比較例の質量分析方法及び実施例の質量分析方法のそれぞれにおいて、同様の条件で、帯電した微小液滴を照射することにより、生体試料の成分をイオン化した。また、比較例の質量分析方法及び実施例の質量分析方法のそれぞれにおいて、同様の条件で、生体試料を構成する分子（イオン）について質量スペクトルを得た。実施例の質量分析方法においては、次のような試料支持体１を用いた。
基板２の材料：アルミナ
基板２の厚さ：１０μｍ
貫通孔２ｃの幅：１９０ｎｍ
貫通孔２ｃの開口率：４３％
フレーム３の材料：ガラス
フレーム３の厚さ：１３０～１７０μｍ

図７は、比較例の質量分析方法によって得られた質量スペクトルを示す図であり、図８は、実施例の質量分析方法によって得られた質量スペクトルを示す図である。また、図９は、比較例の質量分析方法によって得られた特定イオンの二次元分布像を示す図であり、図１０は、実施例の質量分析方法によって得られた特定イオンの二次元分布像を示す図である。図９及び図１０のそれぞれにおいて、（ａ）は、質量電荷比（ｍ／ｚ）＝５０６．３２についての二次元分布像、（ｂ）は、質量電荷比（ｍ／ｚ）＝５２８．３０についての二次元分布像、（ｃ）は、質量電荷比（ｍ／ｚ）＝５３４．３４についての二次元分布像である。これらの結果から分かるように、実施例の質量分析方法によれば、比較例の質量分析方法に比べ、特に質量電荷比（ｍ／ｚ）≦６００において（例えば、リゾリン脂質において）高い信号強度が得られ、特定イオンの二次元分布も明確に表れた。ＭＡＬＤＩでは検出できず、ＤＥＳＩのみ（比較例）では感度が低かったものが、ＤＥＳＩ－ＤＩＵＴＨＡＭＥ（実施例）で初めて予想外に高感度で検出された。
［変形例］

本発明は、上述した実施形態に限定されない。例えば、フレーム３の材料は、ＰＥＴ、ＰＥＮ又はＰＩ以外の樹脂であってもよいし、セラミックス又はガラスであってもよい。その場合にも、電気絶縁性のフレーム３を容易に得ることができる。なお、電気絶縁性のフレーム３を実現することができれば、フレーム３の材料は、特に限定されない。また、フレーム３は、例えば顔料によって、着色されていてもよい。これにより、試料支持体１を用途に応じて分類することができる。

また、上述した実施形態では、基板２に１つの実効領域Ｒが設けられていたが、基板２に複数の実効領域Ｒが設けられていてもよい。また、上述した実施形態では、基板２の全体に複数の貫通孔２ｃが形成されていたが、基板２のうち少なくとも実効領域Ｒに対応する部分に複数の貫通孔２ｃが形成されていればよい。また、上述した実施形態では、１つの実効領域Ｒに１つの試料Ｓが対応するように試料Ｓが配置されたが、１つの実効領域Ｒに複数の試料Ｓが対応するように試料Ｓが配置されてもよい。

また、フレーム３に、開口３ｃとは別の開口を形成し、その開口を利用して、テープ７で試料支持体１をスライドグラス６に固定してもよい。また、テープ７以外の手段（例えば、接着剤、固定具等を用いる手段）で試料支持体１をスライドグラス６に固定してもよい。フレーム３の材料が樹脂である場合、静電気を利用して試料支持体１をスライドグラス６に固定することも可能である。

また、試料Ｓは、含水試料に限定されず、乾燥試料であってもよい。試料Ｓが乾燥試料である場合には、試料Ｓの粘性を低くするための溶液（例えばアセトニトリル混合液等）が試料Ｓに加えられる。これにより、例えば毛細管現象によって、複数の貫通孔２ｃを介して基板２の第１表面２ａ側に試料Ｓの成分Ｓ１を移動させることができる。

１…試料支持体、２…基板、２ａ…第１表面、２ｂ…第２表面、２ｃ…貫通孔、３…フレーム、６…スライドグラス（載置部）、６ａ…載置面、Ｉ…帯電した微小液滴、Ｉ１…照射領域、Ｓ…試料、Ｓ１…成分、Ｓ２…試料イオン（イオン化された成分）。

Claims (4)

1. 外部に露出した第１表面、及び前記第１表面とは反対側において外部に露出した第２表面、並びに、前記第１表面及び前記第２表面のそれぞれに開口する複数の貫通孔を有する電気絶縁性の基板と、前記基板に取り付けられた電気絶縁性のフレームと、を備える試料支持体を用意する第１工程と、
   載置部の載置面に試料を載置し、前記試料に前記第２表面が接触するように前記載置面に前記試料支持体を載置する第２工程と、
   前記第１表面に対して、帯電した微小液滴を照射することにより、前記複数の貫通孔を介して前記第１表面側に移動した前記試料の成分をイオン化し、イオン化された前記成分を吸引する第３工程と、を備える、イオン化法。
2. 前記第３工程は、大気圧雰囲気から中真空雰囲気までの条件下で実施される、請求項１に記載のイオン化法。
3. 前記第３工程においては、前記第１表面に対して、前記帯電した微小液滴の照射領域を相対的に移動させる、請求項１又は２に記載のイオン化法。
4. 請求項１～３のいずれか一項に記載のイオン化法の前記第１工程、前記第２工程及び前記第３工程と、
   前記第３工程においてイオン化された前記成分を検出する第４工程と、を備える、質量分析方法。

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