JP7216067B2 - 糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの製造方法およびこれを利用して製造された糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シート - Google Patents

Description

本発明は、糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの製造方法およびこれを利用して製造された糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートに関する。

糖尿病性足部病症とは、特に、糖尿病を有するヒトの足の皮膚創傷による皮膚組織がただれて生じる足の潰瘍を意味する。これは、糖尿病による神経病症や末梢血管疾患が糖尿病患者の足に潰瘍を起こしたり、傷感染が悪化して生じる現象である。糖尿病を有する患者の約２０％が、必ず一回以上は糖尿病性足部病症を病むことになり、そのうち１～３％程度の患者が足の一部を切断する手術を受けている。

また、外傷による場合を除いた、足の一部を切断することになる原因のうち半分以上が糖尿病性足部病症であることが知られている。このように、糖尿病性足部病症は、糖尿病患者の生活の質を低下させる非常に重要な原因であって、これを治療するための手段が必要である。特に、糖尿病性足部病症により壊死される領域の皮膚組織を回復させて正常な生活を可能にするための研究が必要であるのが現状である。

本明細書は、糖尿病性足部病症患者の壊死部位の皮膚を正常皮膚に回復させることができる糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの製造方法およびこれを利用して製造された糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートを提供しようとする。

本発明の一実施様態は、Ａ）自己脂肪組織を抽出する段階；Ｂ）２ｍｍ～３ｍｍのポア（ｐｏｒｅ）直径を有する第１フィルターを利用して、自己脂肪組織内の繊維質を除去する段階；Ｃ）前記繊維質が除去された自己脂肪組織を、４５０μｍ～５５０μｍのポア直径を有する第２フィルター、および１５０μｍ～２５０μｍのポア直径を有する第３フィルターに順次に通過させて、自己脂肪組織を粉砕する段階；Ｄ）２５μｍ～７５μｍのポア直径を有する第４フィルターに捕集される前記粉砕された自己脂肪組織を抽出して、脂肪組織抽出物を収得する段階；Ｅ）３Ｄスキャナを利用して患者の皮膚欠損領域の３次元データを収得した後、これを基礎として３Ｄプリンタを利用して、皮膚欠損領域に対応する３Ｄモールドを製造する段階；Ｆ）前記脂肪組織抽出物とフィブリノーゲンを含む第１液を前記３Ｄモールド内に塗布して、前駆層（ｐｒｏｔｏ－ｌａｙｅｒ）を形成する段階；Ｇ）トロンビンを含む第２液を前記前駆層上に塗布して、皮膚再生層に硬化させる段階；およびＨ）前記３Ｄモールドを除去する段階；を含む、糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの製造方法を提供する。

本発明の他の実施様態は、前記製造方法を利用して製造された糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートを提供する。

本発明による糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの製造方法は、糖尿病性足部病症患者に適合した皮膚再生シートを迅速に製造することによって、高い細胞活性および細胞成長因子の皮膚再生促進効果を期待することができるので、効果的に患部の回復を具現することができる。

本発明による糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの製造方法は、糖尿病性足部病症患者の患部と一致する形状（すなわち、模様および深さが一致する形状）の皮膚再生シートを製造することになって、より効果的に患部の回復が可能である。

本発明の他の目的および利点は、下記の発明の詳細な説明、請求範囲および図面によりさらに明確に理解され得る。

実施例による脂肪組織抽出物の収得過程を段階的に示すものである。 実施例の患者オーダーメード型３Ｄモールドの製造過程を示すものである。 実施例による患者オーダーメード型皮膚再生シートを糖尿病性足部病症患者に適用した過程およびこれに伴う結果を示すものである。

本明細書において任意の部材が他の部材「上に」位置しているというとき、これは、任意の部材が他の部材に接している場合だけでなく、二つの部材の間にさらに他の部材が存在する場合をも含む。

本明細書において任意の部分が或る構成要素を「含む」とするというとき、これは、特に反対になる記載がない限り、他の構成要素を除くものではなく、他の構成要素をさらに含むことができることを意味する。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明の一実施様態は、Ａ）自己脂肪組織を抽出する段階；
Ｂ）２ｍｍ～３ｍｍのポア（ｐｏｒｅ）直径を有する第１フィルターを利用して、自己脂肪組織内の繊維質を除去する段階；
Ｃ）前記繊維質が除去された自己脂肪組織を、４５０μｍ～５５０μｍのポア直径を有する第２フィルター、および１５０μｍ～２５０μｍのポア直径を有する第３フィルターに順次に通過させて、自己脂肪組織を粉砕する段階；
Ｄ）２５μｍ～７５μｍのポア直径を有する第４フィルターに捕集される前記粉砕された自己脂肪組織を抽出して、脂肪組織抽出物を収得する段階；
Ｅ）３Ｄスキャナを利用して患者の皮膚欠損領域の３次元データを収得した後、これを基礎として３Ｄプリンタを利用して、皮膚欠損領域に対応する３Ｄモールドを製造する段階；
Ｆ）前記脂肪組織抽出物とフィブリノーゲンを含む第１液を前記３Ｄモールド内に塗布して、前駆層（ｐｒｏｔｏ－ｌａｙｅｒ）を形成する段階；
Ｇ）トロンビンを含む第２液を前記前駆層上に塗布して、皮膚再生層に硬化させる段階；および
Ｈ）前記３Ｄモールドを除去する段階；を含む、糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの製造方法を提供する。

以下、前記糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの製造方法の各段階について詳細に説明する。

段階Ａ）：自己脂肪組織を抽出する段階
前記段階Ａ）は、一般的な脂肪吸入術を利用して、糖尿病性足部病症患者の自己脂肪組織を抽出するものでありうる。具体的に、前記段階Ａ）の自己脂肪組織は、脂肪吸入術による抽出物から脂肪吸入術に使用された食塩水および共に混ざって出る血を除去したものでありうる。

本発明の一実施様態によれば、前記段階Ａ）は、脂肪吸入術を利用して収得される抽出物内の血および生理食塩水を除去して、自己脂肪組織を抽出するものでありうる。具体的に、前記段階Ａ）は、脂肪吸入術を利用して収得される抽出物を所定の時間の間放置して脂肪層と分離される血および生理食塩水層を取り除いて自己脂肪組織を抽出することができる。このように、血および生理食塩水を除去する場合、より効果的に下記の脂肪組織抽出物を抽出することができ、ひいては、抽出された脂肪組織抽出物は、治療に適合した成長因子および活性細胞をより効果的に含むことができる。

段階Ｂ）：自己脂肪組織内の繊維質を除去する段階
前記段階Ｂ）は、ポアの直径が相対的に大きい第１フィルターを利用して、抽出された自己脂肪組織内の繊維質を除去するものでありうる。具体的に、前記段階Ｂ）における前記第１フィルターは、ステンレス材質のシリンジフィルターでありうる。具体的に、前記第１フィルターは、強度の高いステンレス材質のフィルター部を有していて、前記自己脂肪組織から繊維質を効果的に分離させることができる。より具体的に、前記段階Ｂ）は、前記第１フィルターの両端に注射器を装着した後、注射器のピストン運動を利用して抽出された自己脂肪組織を２回以上、具体的に２～３回前記第１フィルターを通過させるものでありうる。前記段階Ｂ）の場合、一次的に自己脂肪組織内の繊維質を取り除いて、より効果的であり、早い時間のうちに自己脂肪組織の粉砕が行われるようにすることができる。

段階Ｃ）：自己脂肪組織を粉砕する段階
前記段階Ｃ）は、前記繊維質が除去された自己脂肪組織を前記第２フィルターに通過させて自己脂肪組織を粉砕させ、その濾過物を前記第３フィルターに通過させて追加的に自己脂肪組織を粉砕する段階を含むことができる。

本発明の一実施様態によれば、前記段階Ｃ）は、フィルターバッグ（ｆｉｌｔｅｒ ｂａｇ）に前記繊維質が除去された自己脂肪組織を注入した後、これを外部圧力を加えてフィルターに通過させて、前記繊維質が除去された自己脂肪組織を粉砕するものでありうる。具体的に、前記段階Ｃ）は、フィルターバッグに前記繊維質が除去された自己脂肪組織を注入した後、外部でシリコンしゃもじなどのようなツールを利用して前記繊維質が除去された自己脂肪組織が第２および第３フィルターを順次に通過するようにして、自己脂肪組織が粉砕されるようにするものでありうる。

本明細書において、フィルターバッグは、柔軟なプラスチック素材の密閉された袋形状のフィルターキットであって、一側に注入口が設けられ、他側に排出口が設けられ、フィルターで内部空間が分画された形態でありうる。

前記段階Ｃ）における第２フィルターおよび第３フィルターの一例は、Ｔｉｓｓ’ｙｏｕ社のＬｉｐｏｃｅｌｌキットのフィルターバックを変形して使用することができる。ただし、これに限定されるものではなく、本発明の目的に合うフィルターを利用することができる。

前記段階Ｃ）のように、次第にポア直径が小さいフィルターを利用して自己脂肪組織を粉砕する場合、自己脂肪組織を微粉砕するための時間を大きく短縮することができ、脂肪組織抽出物内の細胞が高い細胞活性を維持することができる。具体的に、前記段階Ｃ）を利用する場合、物理的な方法で脂肪組織を微粉砕するにも関わらず、効果的に治療に効果的な脂肪組織および活性細胞および活性タンパク質を多量確保することができる長所がある。ひいては、前記段階Ｃ）を利用する場合、細胞外基質および成長因子を最適な活性状態で収集可能であり、また、３Ｄバイオプリンティングを行うことができる物性を有するようにすることができる。

Ｄ）脂肪組織抽出物を収得する段階
前記段階Ｄ）は、前記段階Ｃ）を通じて粉砕された自己脂肪組織を前記第４フィルターで濾過した後、濾過された物質を捨てて、フィルターに捕集される物質を収得するものでありうる。具体的に、前記段階Ｄ）は、段階Ｃ）を通じて粉砕された自己脂肪組織を生理食塩水と混合した後、前記第４フィルターを利用して濾過して、濾過される物質を分離して除去した後、前記第４フィルターに捕集される物質を脂肪組織抽出物として利用するものでありうる。前記濾過されて除去される物質は、過度に微粉砕されて細胞活性が劣る脂肪組織、血、生理食塩水などを含むことができ、これは、本発明において意図する最終皮膚再生シートの活性を妨害することができるので、除去されなければならない。

前記段階Ｄ）は、フィルターバッグに前記繊維質が除去された自己脂肪組織および生理食塩水を注入した後、前記第４フィルターに濾過される物質を除去するものでありうる。具体的に、前記段階Ｄ）は、フィルターバッグに前記繊維質が除去された自己脂肪組織および生理食塩水を注入した後、適切な圧力を加えて前記粉砕された自己脂肪組織を前記第４フィルターに濾過させるものでありうる。

前記段階Ｄ）における第４フィルターの一例は、Ｔｉｓｓ’ｙｏｕ社のＬｉｐｏｃｅｌｌキットのフィルターバッグを変形して使用することができる。ただし、これに限定されるものではなく、本発明の目的に合うフィルターを利用することができる。

本発明によって製造される前記脂肪組織抽出物は、特に糖尿病性足部病症患者の皮膚回復に必要な成長因子（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、活性細胞および活性タンパク質などを豊富に含有することができる。ひいては、前記脂肪組織抽出物を利用したバイオプリンティング組成物（例えば、第１液）は、バイオプリンティング過程でノズルが詰まらなく、ひいては、適切な粘度を維持して一定の速度で噴出され得るので、精密なバイオプリンティングが要求される皮膚再生シートの製造に適合する。

また、前記脂肪組織抽出物は、早い時間のうちに成長因子活性細胞および活性タンパク質などを最大で含有して抽出され得るので、より効果的な治療を可能にすることができる。

段階Ｅ）：皮膚欠損領域に対応する３Ｄモールドを製造する段階
前記段階Ｅ）は、当業界において知られた３Ｄスキャナ装備または３Ｄプリント装備を利用することができる。ひいては、前記３Ｄモールドは、前記第１液および第２液の塗布時に患部の立体的形態（すなわち、模様、大きさ、深さなどの３次元的形態）を維持させることができるようにすることができ、皮膚再生シートが製造された後に除去され得る。前記３Ｄモールドは、当業界において一般的に使用される生体適合性高分子を利用して形成され得る。具体的に、前記３Ｄモールドは、ＰＣＬを利用して製造され得る。前記ＰＣＬは、低い溶融点を有し、高い柔軟性を有するので、製造される皮膚再生シートから容易に分離させることができる長所がある。ひいては、ＰＣＬは、患部の立体的形状に符合する最適なモールドを製作することができるようにすることができ、患部の立体的形状と同じ３Ｄモールドを利用して製造された皮膚再生シートは、効果的に患部に密着して回復を助けることができる。

段階Ｆ）：前駆層（ｐｒｏｔｏ－ｌａｙｅｒ）を形成する段階
段階Ｇ）：皮膚再生層に硬化させる段階
本明細書において前駆層（ｐｒｏｔｏ－ｌａｙｅｒ）とは、硬化する前のバイオ組成物が塗布された層を意味する。具体的に、３Ｄモールド内に塗布され、トロンビンを含む組成物により硬化する前の層を意味する。

前記段階Ｆ）および段階 Ｇ）は、それぞれインクジェットバイオプリンティングまたは３Ｄバイオプリンティングを利用して行われ得る。具体的に、前記段階Ｆ）および段階Ｇ）は、当業界において知られた２以上のノズルを有するバイオプリンティング装置を利用することができ、それぞれのノズルから前記第１液および第２液をそれぞれ吐出して立体形状を作ることができる。ひいては、前記前駆層の形成時に３Ｄバイオプリンタまたはインクジェットバイオプリンタを利用して、細胞および細胞外基質の均質な分布を有するようにし、ひいては、硬化後の皮膚再生層内の細胞固まり現象などを防止することができる。

本発明の一実施様態によれば、前記段階Ｇ）は、３０秒～５分以内、具体的に１０秒～１分以内に硬化が完了することができる。

本発明の一実施様態によれば、前記段階Ｂ）～段階Ｇ）は、３０分以内に完了することができる。具体的に、前記段階Ｂ）～段階Ｇ）は、脂肪組織抽出以後、１分～１５分、または、１分～５分以内に完了することができる。

前記製造方法を利用する場合、自己脂肪組織を抽出した後、患者オーダーメード型皮膚再生シートを非常に迅速に製造することができるようになって、患者オーダーメード型皮膚再生シート内の細胞および細胞外基質などの活性を最大化させることができる長所がある。

段階Ｈ）：３Ｄモールドを除去する段階
前記段階Ｈ）は、皮膚再生層を含む糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シート（選択的に後述する表皮再生層を含む）を３Ｄモールドから分離させるものでありうる。前記３Ｄモールドから除去された糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートは、糖尿病性足部病症患者の皮膚欠損部位に付着して患部の皮膚再生効果を最大化させることができる。

第１液および第２液
前記第１液は、脂肪組織抽出物とフィブリノーゲンを含むことができる。前記脂肪組織抽出物は、脂肪組織由来基質血管分画および脂肪組織由来細胞外基質を含むことができる。前記脂肪組織由来基質血管分画は、脂肪組織由来幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）を含むことができる。前記脂肪組織由来基質血管分画は、糖尿病性足部病症患者の患部で皮膚組織に分化して、前記脂肪組織由来細胞外基質と共に患部の回復を助けることができる。前記脂肪組織由来細胞外基質は、糖尿病性足部病症患者の患部で皮膚組織に分化する細胞が固定され得る環境を提供することができる。

本発明の一実施様態によれば、前記第１液は、インスリン、インスリン様成長因子（ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、顆粒性白血球（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ）、リンパ球（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）、内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）、単核白血球（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）、大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）、脂肪組織由来幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、アディポサイトカイン（ａｄｉｐｏｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）、アディポネクチン（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）、レプチン（ｌｅｐｔｉｎ）、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＭＣＰ－１およびＰＡＩ－１よりなる群から選択される少なくとも一つを含むことができる。具体的に、前記第１液は、糖尿病性足部病症患者の患部においてのインスリン濃度より高い含量のインスリンを含むか、インスリン様成長因子を含むことができ、これを通じて、糖尿病性足部病症患者の患部の毛細血管の壊死によるインスリン供給の不足を補完して、患部の回復が効果的に行われるようにすることができる。

前記第１液内のフィブリノーゲンは、前記第２液内のトロンビンと反応してフィブリンフィブリンネットワークを形成することができ、これは、前記皮膚再生層内の活性細胞が十分に固定されるようにする役割をすることができる。

本発明の一実施様態によれば、前記第１液内のフィブリノーゲンは、６０ＩＵのフィブリノーゲンを４０％～６０％に希釈したものでありうる。

また、本発明の一実施様態によれば、前記第２液内のトロンビンは、５００ＩＵのトロンビンを４０％～６０％に希釈したものでありうる。

前記フィブリノーゲンおよびトロンビンの濃度が前記範囲を超過すれば、前記皮膚再生層内のフィブリングルーの含量が過度に高くなって、皮膚細胞への分化が効果的でなく、細胞生存率が低くなる問題が発生し得、ひいては、前記皮膚再生層の硬度が過度に高くなって、患部適合性が低下し得る。ひいては、前記フィブリノーゲンおよびトロンビンの濃度が前記範囲未満である場合、前記皮膚再生層の硬度が過度に低くなって、ハンドリングが困難であり、製造された皮膚再生シートの流れ性が過度に高くて、患部への適用時に効果的でない問題が発生し得る。すなわち、前記フィブリノーゲンおよびトロンビンの濃度が前記範囲内である場合、細胞生存率を最大化させ、製造された皮膚再生シートの硬度および流れ性が適切であり、患部に適用時に最大の効果を具現することができ、ひいては、皮膚再生シート内のタンパク質および活性細胞の分布が均一に維持されて、効果的な治療が可能にすることができる。

本発明の一実施様態によれば、前記第１液は、アプロチニンをさらに含むことができる。前記アプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）は、すい臓から分泌されるプロテイン分解酵素の抑制剤であって、総５８個のアミノ酸からなるポリペプチドである。主に牛の肺から抽出され、血液中では、フィブリンの分解を阻止して、止血作用をするものと知られている。

本発明の一実施様態によれば、前記アプロチニンは、１ｍｌの第１液当たり９００ＫＩＵ～１，１００ＫＩＵ（ｋｉｎｉｎｏｇｅｎ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｕｎｉｔ）、具体的に１０００ＫＩＵで含まれ得る。

本発明の一実施様態によれば、前記第２液は、塩化カルシウム溶液内にトロンビンが分散したものでありうる。具体的に、前記第２液は、５ｍｇ～６．５ｍｇの塩化カルシウムを含むことができる。

前記第１液および第２液の溶媒は、水、具体的には、生理食塩水でありうる。また、前記第１液内のフィブリノーゲンと前記第２液内のトロンビンは、常用のフィブリングルーキットを通じて入手することができる。

本発明は、フィブリノーゲンおよびトロンビンから構成されるフィブリングルーを接着剤として使用し、これは、ヒアルロン酸接着剤またはコラーゲン接着剤より高い粘性を確保することができるので、前記皮膚再生層は、患部との優れた接着力を有し、ひいては、適切な強度を維持することができる。

本発明の一実施様態によれば、前記第１液内の脂肪組織抽出物とフィブリノーゲンの体積比は、３：１～５：１でありうる。前記第１液内の脂肪組織抽出物とフィブリノーゲンの体積比が前記範囲内である場合、製造される皮膚再生シートの強度および細胞分化能が最も効果的に具現され得る。

皮膚再生層
本発明の一実施様態によれば、前記皮膚再生層は、フィブリンマトリックス内に微粉砕された脂肪組織由来細胞および活性因子が備えられたものでありうる。具体的に、前記皮膚再生層は、脂肪組織由来細胞外基質、脂肪組織由来基質血管分画の他に多様な細胞および／または、活性因子を含むことができる。

表皮再生層
本発明の一実施様態によれば、脂肪組織抽出物、フィブリノーゲンおよびケラチノサイト（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）を含む追加の第１液を前記皮膚再生層上に塗布して追加の前駆層を形成した後、トロンビンを含む追加の第２液を前記追加の前駆層上に塗布して表皮再生層に硬化させる段階をさらに含むことができる。前記追加の第１液および追加の第２液は、前述した第１液および第２液の塗布方法と同じ方法を利用して前記３Ｄモールド内に塗布され得る。

本発明の一実施様態によれば、前記追加の第１液は、脂肪組織抽出物、フィブリノーゲンおよびケラチノサイトを含むものであって、前述した第１液にケラチノサイトをさらに含むものでありうる。ひいては、前記追加の第２液は、前述した第２液と同じものでありうる。

前記追加の第１液は、硬化した前記皮膚再生層上に塗布されて追加の前駆層を形成し、追加の第２液が前記追加の前駆層上に塗布されて皮膚再生層に硬化することができる。

すなわち、前記表皮再生層は、前述した皮膚再生層と同様に、フィブリンマトリックス内に微粉砕された脂肪組織由来細胞および活性因子を具備し、これに加えて、ケラチノサイトがさらに備えられたものでありうる。

前記表皮再生層は、前記糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの一部として含まれ得、特に患部の最外郭に位置して、患部の表皮再生をより効果的に助けることができる。具体的に、前記皮膚再生層は、効果的に患部の真皮層の回復を助けることができ、前記表皮再生層は、患部の最外郭に位置して、前記患部の表皮層の回復を助けることができるので、早い回復が可能であるという長所がある。

糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シート
本発明のさらに他の実施形態によれば、前記製造方法を利用して製造された糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートを提供する。前記糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートは、前述した皮膚再生層だけからなり得、または、前述した皮膚再生層と表皮再生層を全部含むこともできる。

本発明の一実施様態によれば、前記糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの厚さは、少なくとも１ｍｍでありうる。具体的に、前記糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの厚さが１ｍｍ未満である場合、真皮層から皮膚細胞の再生がなされないので、患部の回復が遅くなったり、回復される皮膚の表面が不均一になり得る。より具体的に、前記糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの厚さは、１ｍｍ～１０ｍｍ、または、１ｍｍ～５ｍｍでありうる。

以下、本発明を具体的に説明するために、実施例を取って詳細に説明することとする。しかしながら、本発明による実施例は、様々な他の形態に変形され得、本発明の範囲が下記で記述する実施例に限定されると解されない。本明細書の実施例は、当業界において平均的な知識を有する者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。

［実施例］
（１）脂肪組織抽出物の収得
糖尿病性足部病症患者を麻酔した後、脂肪吸入術を利用して糖尿病性足部病症患者の腹部から７０ｍｌ～１５０ｍｌの吸入物を抽出し、約５分間放置した後、脂肪組織と共に混ざって出た食塩水および血を沈めて、沈殿物を除去して、自己脂肪組織を収得した。

次に、患者の脂肪が入れた注射器と新しい注射器をポアが２．４ｍｍのステンレスシリンジフィルター（Ａｄｎｉｚｅｒ，ＳＫＴ－ＡＮ－２４００，ＢＳＬ）が含まれたコネクターの両方向注入口に装着し、ピストン運動で脂肪がフィルターを２～３回通過するようにして、自己脂肪組織から繊維質を除去した。

次に、繊維質が除去された脂肪をポア直径が５００μｍのＰＥＴフィルターが備わったＦｉｌｔｅｒ ｂａｇ（Ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｄｅｖｉｃｅ，Ｔｉｓｓ’ｙｏｕ）に注入し、シリコンしゃもじを利用して取り除く。ひいては、ポア直径が２００μｍのＰＥＴフィルターが備わったＦｉｌｔｅｒｂａｇ（Ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｄｅｖｉｃｅ，Ｔｉｓｓ’ｙｏｕ）を利用して、５００μｍのフィルターを通過した脂肪を同じ方法で取り除いた。ひいては、２００μｍフィルターを通過した脂肪をポア直径が５０μｍのＰＥＴフィルターが備わったＦｉｌｔｅｒ ｂａｇ（Ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｄｅｖｉｃｅ，Ｔｉｓｓ’ｙｏｕ）に同量の生理食塩水とともに注入し、生理食塩水とその他異物を取り除いて脂肪組織抽出物を収得した。

図１は、実施例による脂肪組織抽出物の収得過程を段階的に示したものである。具体的に、図１のＡは、シリンジフィルターを利用して自己脂肪組織から繊維質を除去する過程を示すものである。図１のＢ～Ｃは、Ｆｉｌｔｅｒ ｂａｇに繊維質が除去された自己脂肪組織を注入した後、シリコンしゃもじを利用して自己脂肪組織がフィルターを通過するようにすることを示すものである。図１のＤは、最終収得された脂肪組織抽出物を示すものである。

（２）第１液および第２液の製造
Ｂｅｒｉｐｌａｓｔキット（Ｂｅｒｉｐｌａｓｔ Ｐ Ｃｏｍｂｉ－Ｓｅｔ，ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｌ．Ｌ．Ｃ．）のフィブリノーゲン（６０ＩＵ）溶液とトロンビン（５００ＩＵ）溶液をそれぞれ生理食塩水で５０％希釈した。

５０％に希釈されたフィブリノーゲン溶液と前記脂肪組織抽出物を１：４の体積比で混合して第１液を製造した。そして、前記５０％に希釈されたトロンビン溶液を第２液として使用した。

（３）患者オーダーメード型３Ｄモールドの製造
蒸気滅菌して消毒した１０ｃｍ×１０ｃｍラテックス付きガラス板の中央に原点を表示した。そして、患者の患部より１ｍｍ～２ｍｍ大きいサイズで透析膜（Ｄｉａｌｙｓｉｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）１枚を四角形の形態に切った後、生理食塩水に濡らしてラテックス付きガラス板の重点に付着した。ガラス板の原点を３Ｄバイオプリンタ機（ＩＮＶＩＶＯ，ＲＯＫＩＴ ＨＥＬＴＨＣＡＲＥ）のベッドの原点に合わせてガラス板ベッドレーベリングを合わせた。ひいては、患部の模様と大きさに合うＰＣＬ ３Ｄモールドを製作するために、患部の模様を写真撮影し、３Ｄモデリングファイルに変換した。次に、３Ｄモデリングファイルを３Ｄバイオプリンタ機（ＩＮＶＩＶＯ，ＲＯＫＩＴ ＨＥＬＴＨＣＡＲＥ）に入力し、Ｍｅｄｉｃａｌ ｇｒａｄｅ ＰＣＬ（ＲＥＳＯＭＥＲ Ｃ ２０９，ＥＶＯＮＩＫ，ＭＷ ４５，０００）１ｇ～２ｇを３Ｄバイオプリンタ機（ＩＮＶＩＶＯ，ＲＯＫＩＴ ＨＥＬＴＨＣＡＲＥ）のＡｉｒ－ｄｉｓｐｅｎｓｅｒに入れた後、８０℃～１００℃の温度および６００ｋＰａ～８００ｋＰａの圧力条件で３Ｄモールドを出力した。

図２は、実施例の患者オーダーメード型３Ｄモールドの製造過程を示すものである。具体的に、図２のＡは、ラテックス付きガラス板に透析膜を付着したことを示すものである。図２のＢは、糖尿病性足部病症患者の患部を示すものであり、図２のＣは、患者の患部を３Ｄモデリングした結果である。ひいては、図２のＤは、最終製造された患者オーダーメード型３Ｄモールドを示すものである。

（４）患者オーダーメード型皮膚再生シートの製造
３Ｄバイオプリンタ機（ＩＮＶＩＶＯ，ＲＯＫＩＴ ＨＥＬＴＨＣＡＲＥ）のベッドの原点に合うように出力された３Ｄモールドを３Ｄバイオプリンタ機（ＩＮＶＩＶＯ，ＲＯＫＩＴ ＨＥＬＴＨＣＡＲＥ）に装着した。

そして、ノズルサイズ０．５ｍｍ、プリンティング速度１０ｍｍ／ｓ、押出量３００％、充填５０％、外壁厚さ０．５ｍｍに設定されたＤｉｓｐｅｎｓｅｒ １に前記第１液を装着し、ノズルサイズ０．５ｍｍ、プリンティング速度１０ｍｍ／ｓ、押出量５００％および充填７０％に設定されたＤｉｓｐｅｎｓｅｒ ２に前記第２液を装着した後、前記３Ｄモールド内に前記第１液を出力し、直ちに前記第２液を出力して硬化させた。ひいては、前記３Ｄモールドを除去して、患者オーダーメード型皮膚再生シートを収得した。

（５）糖尿病性足部病症患者に適用
糖尿病性足部病症患者の患部をきれいにした後、注射器に装着されたスプレーを利用して患部接着面にトロンビンを十分に噴射した。そして、前記製造された患者オーダーメード型皮膚再生シートを患部に付着し、湿潤ドレッシング処理をした後、患部の周辺にスポンジフォームを利用して患部および周囲を保護した。そして、一週間の間隔で患部のドレッシングを交替しつつ、経過を観察した。

図３は、実施例による患者オーダーメード型皮膚再生シートを糖尿病性足部病症患者に適用した過程およびこれに伴う結果を示すものである。具体的に、図３のＡは、糖尿病性足部病症患者の患部を示すものであり、図３のＢは、製造された皮膚再生シートを患部に付着したものを示すものである。ひいては、図３のＣは、施術後２週目の患部を示すものである。図３によれば、本発明による患者オーダーメード型皮膚再生シートを糖尿病性足部病症患者の患部に適用する場合、早い時間のうちに損失された領域が回復することを確認することができた。具体的に、図３のＣを参考すると、施術後２週目に過ぎない治療期間であるにもかかわらず、欠損部位が１００％回復して皮膚組織で埋められたことを確認することができた。

以上で本発明内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者において、このような具体的技術は、単に好ましい実施様態に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されるものではない点は明白だろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物により定義されると言える。
以下の項目は、国際出願時の請求の範囲に記載の要素である。
（項目１）
Ａ）自己脂肪組織を抽出する段階；
Ｂ）２ｍｍ～３ｍｍのポア（ｐｏｒｅ）直径を有する第１フィルターを利用して、自己脂肪組織内の繊維質を除去する段階；
Ｃ）前記繊維質が除去された自己脂肪組織を、４５０μｍ～５５０μｍのポア直径を有する第２フィルター、および１５０μｍ～２５０μｍのポア直径を有する第３フィルターに順次に通過させて、自己脂肪組織を粉砕する段階；
Ｄ）２５μｍ～７５μｍのポア直径を有する第４フィルターに捕集される前記粉砕された自己脂肪組織を抽出して、脂肪組織抽出物を収得する段階；
Ｅ）３Ｄスキャナを利用して患者の皮膚欠損領域の３次元データを収得した後、これを基礎として３Ｄプリンタを利用して、皮膚欠損領域に対応する３Ｄモールドを製造する段階；
Ｆ）前記脂肪組織抽出物とフィブリノーゲンを含む第１液を前記３Ｄモールド内に塗布して、前駆層（ｐｒｏｔｏ－ｌａｙｅｒ）を形成する段階；
Ｇ）トロンビンを含む第２液を前記前駆層上に塗布して、皮膚再生層に硬化させる段階；および
Ｈ）前記３Ｄモールドを除去する段階；を含む、糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの製造方法。
（項目２）
前記段階Ｂ）～段階Ｇ）は、３０分以内に完了することを特徴とする項目１に記載の糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの製造方法。
（項目３）
前記第１フィルターは、ステンレス材質のシリンジフィルターであることを特徴とする項目１に記載の糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの製造方法。
（項目４）
前記段階Ｃ）は、フィルターバッグ（ｆｉｌｔｅｒ ｂａｇ）に前記繊維質が除去された自己脂肪組織を注入した後、これを外部圧力を加えてフィルターに通過させて、前記繊維質が除去された自己脂肪組織を粉砕するものであることを特徴とする項目１に記載の糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの製造方法。
（項目５）
前記第１液内のフィブリノーゲンは、６０ＩＵのフィブリノーゲンを４０％～６０％に希釈したものであることを特徴とする項目１に記載の糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの製造方法。
（項目６）
前記第２液内のトロンビンは、５００ＩＵのトロンビンを４０％～６０％に希釈したものであることを特徴とする項目１に記載の糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの製造方法。
（項目７）
前記第１液内の脂肪組織抽出物とフィブリノーゲンの体積比は、３：１～５：１であることを特徴とする項目１に記載の糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの製造方法。
（項目８）
前記第１液は、インスリン、インスリン様成長因子（ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、顆粒性白血球（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ）、リンパ球（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）、内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）、単核白血球（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）、大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）、脂肪組織由来幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、アディポサイトカイン（ａｄｉｐｏｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）、アディポネクチン（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）、レプチン（ｌｅｐｔｉｎ）、ＩＬ－６，ＩＬ－１β、ＭＣＰ－１およびＰＡＩ－１よりなる群から選択される少なくとも一つを含むことを特徴とする項目１に記載の糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの製造方法。
（項目９）
脂肪組織抽出物、フィブリノーゲンおよびケラチノサイト（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）を含む追加の第１液を前記皮膚再生層上に塗布して追加の前駆層を形成した後、トロンビンを含む追加の第２液を前記追加の前駆層上に塗布して表皮再生層に硬化させる段階をさらに含むことを特徴とする項目１に記載の糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの製造方法。
（項目１０）
前記糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの厚さは、少なくとも１ｍｍであることを特徴とする項目１に記載の糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの製造方法。
（項目１１）
項目１に記載の製造方法を利用して製造された糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シート。

Claims (10)

1. Ａ）自己脂肪組織を抽出する段階；
   Ｂ）２ｍｍ～３ｍｍのポア（ｐｏｒｅ）直径を有する第１フィルターを利用して、自己脂肪組織内の繊維質を除去する段階；
   Ｃ）前記繊維質が除去された自己脂肪組織を、４５０μｍ～５５０μｍのポア直径を有する第２フィルター、および１５０μｍ～２５０μｍのポア直径を有する第３フィルターに順次に通過させて、自己脂肪組織を粉砕する段階；
   Ｄ）２５μｍ～７５μｍのポア直径を有する第４フィルターに捕集される前記粉砕された自己脂肪組織を抽出して、脂肪組織抽出物を収得する段階；
   Ｅ）３Ｄスキャナを利用して患者の皮膚欠損領域の３次元データを収得した後、これを基礎として３Ｄプリンタを利用して、皮膚欠損領域に対応する３Ｄモールドを製造する段階；
   Ｆ）前記脂肪組織抽出物とフィブリノーゲンを含む第１液を前記３Ｄモールド内に塗布して、前駆層（ｐｒｏｔｏ－ｌａｙｅｒ）を形成する段階；
   Ｇ）トロンビンを含む第２液を前記前駆層上に塗布して、皮膚再生層に硬化させる段階；および
   Ｈ）前記３Ｄモールドを除去する段階；
   を含み、
   前記Ｄ）の段階では、前記第４フィルターを備えるフィルターバッグを用い、
   前記Ｄ）の段階は、
   前記フィルターバッグに前記Ｃ）の段階で粉砕された前記自己脂肪組織と生理食塩液とを注入すること、
   前記フィルターバッグに外圧を付与すること、及び
   前記第４フィルター上に捕集された材料を前記脂肪組織抽出物として取得すること、を含む、糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの製造方法。
2. 前記段階Ｂ）～段階Ｇ）は、３０分以内に完了することを特徴とする請求項１に記載の糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの製造方法。
3. 前記第１フィルターは、ステンレス材質のシリンジフィルターであることを特徴とする請求項１又は２に記載の糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの製造方法。
4. 前記段階Ｃ）は、フィルターバッグに前記繊維質が除去された自己脂肪組織を注入した後、これを外部圧力を加えてフィルターに通過させて、前記繊維質が除去された自己脂肪組織を粉砕するものであることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの製造方法。
5. 前記第１液内のフィブリノーゲンは、６０ＩＵのフィブリノーゲンを４０％～６０％に希釈したものであることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの製造方法。
6. 前記第２液内のトロンビンは、５００ＩＵのトロンビンを４０％～６０％に希釈したものであることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの製造方法。
7. 前記第１液内の脂肪組織抽出物とフィブリノーゲンの体積比は、３：１～５：１であることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの製造方法。
8. 前記第１液は、インスリン、インスリン様成長因子（ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、顆粒性白血球（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ）、リンパ球（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）、内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）、単核白血球（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）、大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）、脂肪組織由来幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、アディポサイトカイン（ａｄｉｐｏｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）、アディポネクチン（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）、レプチン（ｌｅｐｔｉｎ）、ＩＬ－６，ＩＬ－１β、ＭＣＰ－１およびＰＡＩ－１よりなる群から選択される少なくとも一つを含むことを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの製造方法。
9. 脂肪組織抽出物、フィブリノーゲンおよびケラチノサイト（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）を含む追加の第１液を前記皮膚再生層上に塗布して追加の前駆層を形成した後、トロンビンを含む追加の第２液を前記追加の前駆層上に塗布して表皮再生層に硬化させる段階をさらに含むことを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載の糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの製造方法。
10. 前記糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの厚さは、少なくとも１ｍｍであることを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載の糖尿病性足部病症患者オーダーメード型皮膚再生シートの製造方法。

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