JP7181556B2 - 小腸上皮様細胞 - Google Patents
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Description
1.以下の工程を含む、多能性幹細胞から小腸上皮様細胞への分化誘導方法:
1)多能性幹細胞を内胚葉細胞に分化誘導する工程;
2)前記分化誘導により得られた内胚葉細胞を、LY2090314を含む系で培養し、腸管前駆細胞に分化誘導する工程。
2.前記2)の工程の後、さらに以下の3)の工程を含む、前項1に記載の小腸上皮様細胞への分化誘導方法:
3)Wnt3a及びEGF(epidermal growth factor)を含む系で培養し、小腸上皮様細胞へ分化誘導する工程。
3.前記3)の工程で、Wnt3a及びEGFと、さらにp38 MAPK阻害剤、IGF-1(insulin-like growth factor-1)、R-spondin、Noggin及びDEX(dexamethasone)から選択されるいずれか2種以上を含む系で培養する、前項2に記載の分化誘導方法。
4.前記3)の工程で、Wnt3a及びEGFと、さらにp38 MAPK阻害剤、IGF-1、R-spondin、Noggin及びDEX含む系で培養する、前項2に記載の分化誘導方法。
5.前項1~4のいずれかに記載の分化誘導方法により得られた小腸上皮様細胞。
6.前項1~4のいずれかに記載の分化誘導方法の工程で培養された培養物。
7.前項5に記載の小腸上皮様細胞を、薬物毒性評価又は薬物動態評価に使用する方法。
8.LY2090314を含む、小腸上皮様細胞への分化誘導用培地。
9.Wnt3a及びEGFを含む、小腸上皮様細胞への分化誘導用培地。
10.Wnt3a、EGF、p38 MAPK阻害剤、IGF-1、R-spondin、Noggin及びDEXから選択されるいずれか2種以上の液性因子化合物を含む前項9に記載の分化誘導用培地。
11.Wnt3a、EGF、p38 MAPK阻害剤、IGF-1、R-spondin、Noggin及びDEXを含む、前項10に記載の分化誘導用培地。
12.LY2090314、Wnt3a、EGF、p38 MAPK阻害剤、IGF-1、R-spondin、Noggin及びDEXから選択されるいずれか1種又は複数種の液性因子化合物を含む試薬を少なくとも2種以上を構成として含む、小腸上皮様細胞への分化誘導用培地調製用キット。
1)多能性幹細胞を内胚葉細胞に分化誘導する工程;
2)前記分化誘導により得られた内胚葉細胞を、GSK3β阻害剤を含む系で培養し、腸管前駆細胞に分化誘導する工程。
(A)ヒトES/iPS細胞未分化維持培地としては、ReproStem(商品名)、iPSellon(商品名)、Essential 8(商品名)、TeSR-E8(商品名)、StemFit(R)AK03N(商品名)、StemFit(R)AK02N(商品名)などの各種幹細胞維持培地を使用することができる。
(B)分化誘導用培地として、例えばRPMI1640培地(Sigma社)に1×Glutamax(Thermo fisher scientific社)、B27 Supplement(Thermo fisher scientific社)、ペニシリン/ストレプトマイシンを含む培地も使用することができる。内胚葉細胞を分化誘導する際に使用する培地は同等の機能を発揮しうるものであれば、上記に限定されない。
(C)内胚葉細胞以降の分化誘導にはdifferentiation DMEM-high Glucose培地、10% Knock Serum Replacement(Thermo fisher scientific社)、1% Non Essential Amino Acid Solution(Thermo fisher scientific社)、ペニシリン/ストレプトマイシン、1×Glutamax(Thermo fisher scientific社)を含むDMEM-high Glucose培地(Wako社)を使用することができる。
本実施例で示す培養方法では、ヒトiPS細胞に対する培地が必要である。本参考例では、各種培養に使用可能な培養液の組成について説明する。
本実施例では、ELCへの分化誘導工程における多能性幹細胞を内胚葉細胞に分化誘導する工程について説明する。本実施例では、ヒトiPS 細胞株としてTic(JCRB1331)を用いた。上記多能性幹細胞は、50μg/cm2の濃度でGrowth Factor Reduced(GFR)Matrigel(R)Matrix(Corning社)をコートした細胞培養用マルチプレート(住友ベークライト社)を用い、フィーダー細胞上にて、Tiss. Cult. Res. Commun., 27: 139-147 (2008) に記載の方法に従い培養した。培地は上記培地1のうち、ReproStem(商品名)を用いて培養した。
本実施例では、ELCへの分化誘導工程における内胚葉細胞から腸管前駆細胞に分化誘導する工程について説明する。
BIO: 6BIO (2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-oxime
DAPT: N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-(S)-phenylglycine t-butyl ester
本実施例では、実施例2の結果より内胚葉細胞から腸管前駆細胞への分化にはLY2090314を作用させた場合に最も効果的に腸管前駆細胞への分化することが確認されたことから、最も効果的なLY2090314の使用濃度を確認した。
これらの結果より、LY2090314を用いて内胚葉細胞から腸管前駆細胞への分化を行うには、10 nM 以上の濃度が適していることが示唆された。
本実施例では、ELCへの分化誘導工程における内胚葉細胞から腸管前駆細胞を経てELCに分化誘導する工程について説明する。腸管前駆細胞からELCへの分化誘導に効果的な液性因子化合物のスクリーニングのための実験プロトコールを図9に示した。
本実施例では、ELCへの分化誘導における培養期間の最適化について検討した。実験プロトコールは、図13に示した。
本実施例では、以下の実験例6-1~6-6により性状を確認するためのELCを作製した。実験プロトコールを図18に示した。実施例1と同手法により、Tic(JCRB1331)を内胚葉細胞へと分化誘導した後、LY2090314(20 nM)を内胚葉細胞に4日間作用させて腸管前駆細胞へ分化誘導し、Wnt3a、R-spondin、Nogginを含む培地3にEGF(50 ng/ml)、IGF-1(20 ng/ml)、SB202190(10μM)、DEX(1μM)を含む培地で20日間(ヒトiPS 細胞からの培養開始より28日)培養した。本実施例で作製したELCを、以下の実験例6-1~6-6で使用した。なお、以下の実験例6-5で作製したELCは、Cell Culture insert上で分化誘導して得た。
実施例6で作製したELCについて、腸に関連する各種発現遺伝子を確認した。
以上の結果から、前記ELCは小腸型の腸管上皮細胞である可能性が示唆された。
実施例6で作製したELCにおける薬物代謝酵素・薬物抱合酵素であるCYP2C9(cytochrome P450 family 2 subfamily C member 9)、CYP2J2、CYP3A4、UGT1A1(UDP glucuronosyltransferase family 1 member A1)、UGT1A3、CES2(carboxylesterase 2)の遺伝子発現量を定量的RT-PCR法により解析した。前記ELCにおけるCYP2J2、CYP3A4、UGT1A1、UGT1A3、CES2の遺伝子発現量は、ヒト成人小腸(AI)より低い値を示した。一方、CYP3A4の遺伝子発現量は、ヒト成人結腸(colon)に比べ高発現していた(図21)。
CES2は小腸に局在し、膜透過性に係る酵素である。実施例6で作製したELCにおけるCES2の活性をCES2の基質であるFD(Fluorescein diacetate)を用いて評価した。また、CES2の阻害剤としてロペラミド(1 mM)を使用した。前記ELCにおけるCES2の活性は、CES2阻害剤であるロペラミドにより有意に阻害された。以上の結果より、前記ELCはCES2の活性を評価できる可能性が示唆された(図23)。
実施例6で作製したELCにおける頂端膜側に発現する薬物トランスポーターであるMDR1(multidrug resistance protein 1)、BCRP(breast cancer resistance protein)、PEPT1(peptide transporter 1)、MRP2(multidrug resistance-associated protein 2)、MRP4及び、MRP6の遺伝子発現量を定量的RT-PCR法により解析した。前記ELCにおけるBCRP、PEPT1、MRP2、MRP4及び、MRP6の遺伝子発現量は、ヒト成人小腸(AI)に近い値を示したが、MDR1の遺伝子発現量は、ヒト成人小腸(AI)に比べ約1/66であった。一方で、PEPT1の遺伝子発現量はヒト成人結腸(colon)に比べ100倍以上高発現していた(図24)。
ELCでのバリア能を細胞膜抵抗(TEER)及びルシファーイエロー(LY)の膜透過係数により評価した。本実験例では、実施例6の手法でCell Culture insert上で分化誘導したELCを用いた。Cell Culture insert上で分化誘導したELCは、膜を通した細胞輸送アッセイに適している。
実施例6で作製したELCにおける薬物輸送機能をMDR1輸送能により評価した。MDR1輸送能はローダミン123(Rhodamine123)を用いて、頂端膜側から基底膜側への透過量を指標に測定した。その結果、前記ELCにおいてMDR1阻害剤であるシクロスポリンA(CysA、10 μM)の作用により、ローダミン123の透過量は増加した。以上の結果より前記ELCはMDR1の頂端膜側から基底膜側への輸送能を評価できる可能性が示唆された(図27)。
実施例6に記載の方法と同様に図18に記載のプロトコールによりヒトiPS細胞株Tic(JCRB1331)から腸管上皮様細胞を作製した。以下、本実施例においても得られた腸管上皮様細胞を、単に「ELC」という。
実施例7で作製したELCについて、細胞間接着マーカーであるE-カドヘリン及び、Zonula occludens-1(ZO-1)の発現を細胞免疫染色により解析した。細胞免疫染色のために、細胞を固定液(PFA: paraformaldehyde)を用いて10分間固定し、2%仔牛血清アルブミン(BSA)及び0.2%界面活性剤(TritonX-100)を含むPBS溶液で細胞をブロッキングした後、一次抗体を加えて4℃一夜おき、二次抗体を加えて室温で1時間置いた。一次抗体としてAnti-E Cadherin antibody、Anti-ZO-1 antibody、二次抗体としてDonkey anti-rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugateを用いた。細胞免疫染色によりE-カドヘリン及びZO-1の発現を確認できた(図29AB)。
実施例7のELC作製工程で得た腸管前駆細胞について、CDX2及びE-カドヘリンの発現を、上記と同手法を用いた細胞免疫染色により評価した。一次抗体としてAnti-CDX2 antibody、Anti-E Cadherin antibody、二次抗体としてDonkey anti-mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate、Donkey anti-rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugateを用いた。ヒトiPS細胞由来腸管前駆細胞はCDX2及びE-カドヘリンを発現しており、円柱上皮様細胞の形態を示した(図30)。
実施例7で作製したELCが極性を有しているかを評価した。頂端膜側に発現するvillin及びPEPT1の発現を免疫染色により確認したところ、ELCは円柱上皮様の形態を示し、頂端膜側にvillin及びPEPT1の発現を観察でき、極性を有することが確認された(図31)。
実施例7で作製したELCがALP活性を有しているかを評価した。ALP活性は、Blue-Color Staining Kit(System Bioscience社)を用いて細胞をALP染色(Blue-Color Staining Kit, System Bioscience)した。ELCはALP活性を有していることが示された(図32)。
実施例7で作製したELCについて、透過型電子顕微鏡(Transmission Electron Microscope: TEM)を用いて観察し、形態学的評価を行った。ELCは円柱上皮様の形態を示し、頂端膜における微絨毛構造を観察できた(黒色矢印)(図33)。
実施例7で作製したELCからなる細胞集団において、小腸を構成する細胞である腸内分泌細胞、パネート細胞及び杯細胞が存在するかを免疫染色により評価した。得られた細胞集団には、腸内分泌細胞マーカーであるChromograninAの陽性細胞、パネート細胞マーカーであるリゾチームの陽性細胞、杯細胞マーカーであるMucin2の陽性細胞を観察できた(図34)。その結果、ELCは生体の小腸上皮細胞と似た形態学的な特徴を示し、細胞集団には、生体と同様に小腸を構成する4種類の細胞が存在することが示唆された。
実施例7で作製したELCについて、小腸型又は大腸型の腸管上皮細胞なのかを確認した。評価のために、マイクロアレイにより網羅的な遺伝子発現量の解析を行った。実施例7で作製したELCは、ヒト成人大腸(colon)よりもヒト成人小腸(AI)に似た遺伝子発現パターンを示した(図35)。
以上の結果より、実施例7のELCは小腸型の腸管上皮様細胞である可能性が示唆された。
本実験例では、実験例6-5と同様にCell Culture insert上で分化誘導したELCにおけるバリア能を、平均分子量3000-5000のFITC-デキストラン(Fluorescein isothiocyanate-dextran: FD4)の膜透過係数により評価した。1 mg/mlのFD4(Sigma-Aldrich)を含むHBSS溶液を細胞に加え、37℃で90分間反応させたときのFD4透過量を測定した。FD4透過量は蛍光プレートリーダー(TroStar LB941, Berthold)を用い、励起波長485nm、放射波長535nmで測定した。タイトジャンクション開口剤であるカプリン酸(C10、10 mM)を作用させたとき、FD4透過量が増加し、膜透過性が増したことが確認された(図36)。
Papp= δCr / δt × Vr / (A × C0 )
δCr = final receiver concentration;
δt = assay time;
Vr = receivervolume;
A = transwell growth area;
C0 = FD4 concentration in the donor compartment
本実験例では、実施例7の手法でCell Culture insert上で分化誘導したELCについて、FD4、ルシファーイエロー(LY)及びローダミン123の透過量を経時的に測定した。LY又はローダミン123による膜透過性は、上記FD4の測定と同様に蛍光プレートリーダー(TroStar LB941, Berthold)を用いて測定した。その結果、経時的にFD4、LY及びローダミン123の透過量の増加が確認された。さらに、タイトジャンクション開口剤であるC10の作用によりFD4及びLYの透過量が増加したことが確認され、MDR1阻害剤であるシクロスポリンA(CysA)の作用によりCysAを含まない系(DMSO)に比べてローダミン123透過量が増加したことが確認された(図37)。上記結果より、前記ELCはMDR1の頂端膜側から基底膜側への輸送能を評価できる可能性が示唆された。
Claims (6)
- 以下の工程を含む、多能性幹細胞から小腸上皮様細胞への分化誘導方法:
1)多能性幹細胞を内胚葉細胞に分化誘導する工程;
2)前記分化誘導により得られた内胚葉細胞を、LY2090314を含む系で培養し、腸管前駆細胞に分化誘導する工程。 - 前記2)の工程の後、さらに以下の3)の工程を含む、請求項1に記載の小腸上皮様細胞への分化誘導方法:
3)Wnt3a、EGF(epidermal growth factor)、R-spondin及びNogginと、さらにp38 MAPK阻害剤、IGF-1(insulin-like growth factor-1)及びDEX(dexamethasone)から選択されるいずれか1種以上を含む系で培養し、小腸上皮様細胞へ分化誘導する工程。 - 前記3)の工程で、Wnt3a、EGF、p38 MAPK阻害剤、IGF-1、R-spondin、Noggin及びDEXを含む系で培養する、請求項2に記載の分化誘導方法。
- 以下の工程を含む、小腸上皮様細胞を、薬物毒性評価又は薬物動態評価に使用する方法:
1)多能性幹細胞を内胚葉細胞に分化誘導する工程;
2)前記分化誘導により得られた内胚葉細胞を、LY2090314を含む系で培養し、腸管前駆細胞に分化誘導する工程;
3)前記分化誘導により得られた腸管前駆細胞をさらに培養し、小腸上皮様細胞に分化誘導する工程;
4)前記分化誘導により得られた小腸上皮様細胞を薬物毒性評価又は薬物動態評価に使用する工程。 - LY2090314を含む、内胚葉細胞から腸管前駆細胞への分化誘導用培地。
- Wnt3a、EGF、p38 MAPK阻害剤、IGF-1、R-spondin、Noggin及びDEXを含む、腸管前駆細胞から小腸上皮様細胞への分化誘導用培地。
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