JP7161044B2 - 線維症における線維芽細胞活性化タンパク質（ｆａｐ）を標的とする撮像法および治療法 - Google Patents

線維症における線維芽細胞活性化タンパク質（ｆａｐ）を標的とする撮像法および治療法 Download PDF

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Description

発明の分野
本開示は、特発性肺線維症（IPF）を撮像および/または処置するための結合体およびその使用法を提供する。具体的には、線維芽細胞活性タンパク質（FAP）を標的とするイメージング剤または治療剤をIPFに送達し、IPFの診断の指標とするか、またはIPFの病的細胞外マトリックス沈着を有意に減少させる。
背景
線維性疾患は、多数の個人に影響を及ぼす世界的な健康上の主要な問題を構成するものである。
病的状況下では、正常な組織修復反応は恒常性調節機構を免れ、細胞外マトリックスの進行性の過剰産生によって特徴づけられる無制御の線維化プロセスに伸展し、これは正常な臓器構造を破壊し、最終的に臓器不全につながる。
ヒトの体の実質的にすべての臓器が、生理学的および病理学的線維化反応によって影響を受け得るが、最もよく影響を受ける臓器は、肺、腎臓、肝臓、皮膚、心臓、および膀胱である。例えば、肝臓の線維症はこの疾患の典型を表し、早い段階では可逆的であり得るが、肝硬変に進行するにつれて不可逆的になり、末期疾患に加えて肝臓癌をもたらす。線維症は複数の予防可能な病因を有する；それらは特にHBVおよびHCV感染、肥満、アルコール依存症、ならびにアフラトキシンを含み；それぞれ一次および/または二次予防に対する機会および重大な障壁を表す。他の多くの線維性疾患の場合、根本的病因はあまり明らかではないが、多くは、おそらくは誘発性刺激物（例えば、放射線、慢性感染症、毒素）に次ぐ、タンパク質分解酵素、線維形成サイトカイン、成長因子、および血管新生因子の慢性的な産生に関連している。その他は先天性であるか、または自己免疫に関連している。すべての種類の線維症について、不可逆性となる点およびそれが起こる分子メカニズムは詳細に定義されていない。臓器不全は、無制御の線維症の結果である。最終的な臓器不全および病的状態を予防するために、これらの臓器における線維性疾患の処置が必要である。
特発性肺線維症（IPF）は、肺の進行性線維性疾患である。これは、肺の内層への反復的な環境傷害およびその結果としての異常な創傷治癒反応によって引き起こされると考えられる。肺の組織が創傷治癒反応の長期間の活性化を経験すると、その結果は通常は、永久的瘢痕化、臓器機能不全、より重大には死亡である。
約128,000人がIPFを有していると推定され、米国だけで毎年48,000件の新しい症例が診断されている。その中で、毎年約40,000人のIPF患者が死亡している。診断後の生存期間中央値は約2～3年である。線維性疾患の広範かつ多臓器での発生のために、その総発生率を決定することは困難であるが、西洋先進国の死亡率の45％は、その集合的な発生によって引き起こされると推定されている。
最近まで、IPFの根治療法はなく、処置の選択肢は、肺リハビリテーションおよび酸素療法に限定されていた。
現在、FDAは2014年にIPFの処置のために2つの薬物：ピルフェニドンおよびニンテダニブを承認した。しかし、いずれの薬物も、IPF患者において、限られた、一貫性のない有効性を示す。ごく最近、いくつかのキナーゼ阻害剤がヒト臨床試験に導入され、これらは線維化プロセスの必須の段階を阻止するかもしれないと期待されたが、健常組織における同じ酵素に対するこれらの標的活性は、全身毒性に関する懸念を高めた。
より進行した症例では、肺移植が最終選択肢となり得るが、HLA適合を見つけることはしばしば困難であり、移植拒絶反応を避けることは課題であり得る。
したがって、IPFの進行を遅らせることができる治療法が緊急に必要とされている。
本開示は、線維性肺疾患において線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）発現細胞を標的とするための結合体を提供する。結合体は、FAPに対する標的指向リガンド（TL）、リンカー（L）およびエフェクター（E）を含み、ここでTLは10,000未満の分子量を有し、エフェクターがイメージング剤または放射性治療剤である場合、Lは非遊離型リンカーであり；エフェクターが治療薬である場合、Lは遊離可能リンカーである。リンカーは、ペグ化、アルキル、糖、またはペプチドベースのデュアルリンカーからなる群より選択される。
いくつかの好ましい態様において、前述のイメージング剤は蛍光分子である。
いくつかの好ましい態様において、前述の結合体は、以下のFAPL-FITCの構造を含む：
Figure 0007161044000001
。
いくつかの好ましい態様において、前述の蛍光色素は近赤外色素であり、かつ結合体は、
Figure 0007161044000002
の構造を有する。
いくつかの好ましい態様において、前述の蛍光分子は、
Figure 0007161044000003
の構造を含む。
いくつかの好ましい態様において、前述のエフェクターはPETイメージング剤である。
いくつかの好ましい態様において、前述のPETイメージング剤は、
Figure 0007161044000004
の構造を含む。
いくつかの好ましい態様において、前述のエフェクターは、DOTA、NOTA、TETA、またはNODAGAキレート剤
Figure 0007161044000005
を含む、99mTcイメージング剤である。
いくつかの好ましい態様において、前述の99mTcイメージング剤は、
Figure 0007161044000006
の構造を含む。
いくつかの好ましい態様において、前述の放射性治療剤は、
Figure 0007161044000007
の構造を含む。
いくつかの好ましい態様において、前述のTLは以下の構造を含む小分子である：
Figure 0007161044000008
式中、xは下記であり、
Figure 0007161044000009
式中、R1およびR2は同じかまたは異なり、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、およびC1-C4アルキルからなる群より選択され；
R3は、C1-C4アルキル、ニトリル、またはイソニトリルであり；
R4は、Hまたは-CH3であり
R5およびR6は同じかまたは異なり、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、およびC1-C4アルキルからなる群より選択され、
R7～R9は同じかまたは異なり、それぞれ独立に、水素、メトキシ、ハロゲン、CF3、およびC1-C4アルキルからなる群より選択される。
いくつかの好ましい態様において、前述のR1およびR2はハロゲンである。
いくつかの好ましい態様において、前述のR1およびR2はそれぞれフッ素である。
いくつかの好ましい態様において、前述のエフェクターは、VEGFR1、VEGFR2、VEDFR3、FGFR1、FGFR2、またはPDGFRのキナーゼ阻害剤である。
いくつかの好ましい態様において、前述のエフェクターはFAKまたはROCKのキナーゼ阻害剤である。
いくつかの好ましい態様において、前述のエフェクターはSMAD阻害剤である。
いくつかの好ましい態様において、前述のエフェクターは細胞毒性剤である。
いくつかの好ましい態様において、前述のエフェクターはPI-3キナーゼ阻害剤である。
本開示は、（PI3KI1）の構造を含むPI-3キナーゼ阻害剤をさらに提供する。
Figure 0007161044000010
いくつかの好ましい態様において、前述の結合体は、
Figure 0007161044000011
の構造を有する。
いくつかの好ましい態様において、前述のPI-3キナーゼ阻害剤は、以下の構造を含む：
Figure 0007161044000012
式中、Xは以下のいずれかであり得る：
Figure 0007161044000013
。
いくつかの好ましい態様において、前述のFAPに対する標的指向リガンドは、約1nM～約10nMの範囲のFAPに対する結合親和性を有する。
本開示は、対象におけるIPFの診断法であって、以下の段階を含む方法をさらに提供する：
対象から肺組織を得る段階であって、該組織は線維芽細胞中でFAPを発現してもよく、またはしなくてもよい、段階；
該組織にTL-L-Iの結合体を提供する段階であって、TLは線維性肺疾患において線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）発現細胞を標的とするための標的指向リガンドA結合体であり、ここで該TLは10,000未満の分子量を有し、該Lは非遊離型リンカーであり、該Iはイメージング剤である、段階；および
IPFの特徴としてのFAP発現活性化線維芽細胞として撮像法により示された線維芽細胞を特定する段階。
いくつかの好ましい態様において、前述のTLは、以下の構造を有する小分子である：
Figure 0007161044000014
式中、xは下記であり：
Figure 0007161044000015
式中、R1およびR2は同じかまたは異なり、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、およびC1-C4アルキルからなる群より選択され；
R3は、C1-C4アルキル、ニトリル、またはイソニトリルであり；
R4は、Hまたは-CH3であり；
R5およびR6は同じかまたは異なり、それぞれ独立に水素、ハロゲン、およびC1-C4アルキルからなる群より選択され；
R7～R9は同じかまたは異なり、それぞれ独立に、水素、メトキシ、ハロゲン、CF3、およびC1-C4アルキルからなる群より選択される。
本開示は、対象のIPFの処置法をさらに提供する。本方法は、以下の段階を含む：
IPF患者の細胞にTL-L-Dの結合体の薬学的有効量を提供する段階であって、TLは10,000未満の分子量を有する、FAPに対する標的指向リガンドであり、Lは遊離可能リンカーであり、かつDは汎PI-3キナーゼ阻害性効果を有する治療薬である、段階；および
TL-L-Dの処置後の肺組織細胞外マトリックス沈着量減少をモニターする段階。
いくつかの好ましい態様において、前述のTLは、以下の構造の構造を有する小分子である：
Figure 0007161044000016
式中、xは下記であり得：
Figure 0007161044000017
式中、R1およびR2は同じかまたは異なり、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、およびC1-C4アルキルからなる群より選択され；
R3は、C1-C4アルキル、ニトリル、またはイソニトリルであり；
R4は、Hまたは-CH3であり；
R5およびR6は同じかまたは異なり、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、およびC1-C4アルキルからなる群より選択され、
R7～R9は、同じかまたは異なり、それぞれ独立に、水素、メトキシ、ハロゲン、CF3、およびC1-C4アルキルからなる群より選択される。
いくつかの好ましい態様において、前述のDは以下の構造を有する：
Figure 0007161044000018
式中、Xは下記のいずれかであり得る：
Figure 0007161044000019
。
いくつかの好ましい態様において、前述の方法は、活性化線維芽細胞上のコラーゲンI沈着を減少させる結合体を用いる。
いくつかの好ましい態様において、前述の方法は、約0.75u/kgのブレオマイシンの連続10日間の気管内投与により誘導したマウスIPFモデルである対象を用いる。
いくつかの好ましい態様において、前述の方法は、約0.2～10umol/kgの結合体をマウスIPFモデルに連続10日間投与し、かつ結合体は、
Figure 0007161044000020
の構造を有するFAPL_PI3KI1である。
いくつかの好ましい態様において、前述の方法は、細胞外マトリックスコラーゲンIをモニターする。
いくつかの好ましい態様において、前述の方法は、線維芽細胞のヒドロキシプロリン産生を減少させる。
いくつかの好ましい態様において、前述の方法は、シリカまたは放射線で誘導したマウスIPFモデルの対象を用いる。
本発明のこれらおよび他の特徴、局面、および利点は、添付の図面、関連する説明、および特許請求の範囲を参照すれば、より良く理解されるであろう。
[本発明1001]
線維性肺疾患において線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）発現細胞を標的とするための結合体であって、
FAPに対する標的指向リガンド（TL）、リンカー（L）、およびエフェクター（E）を含み、
ここで該TLは10,000未満の分子量を有し；該エフェクターがイメージング剤または放射性治療剤である場合、該Lは非遊離型リンカーであるか、または該エフェクターが治療薬である場合、遊離可能リンカーであり；ここで該リンカーは、ペグ化、アルキル、糖またはペプチドベースのデュアルリンカーからなる群より選択される、
結合体。
[本発明1002]
前記イメージング剤が蛍光分子である、本発明1001の結合体。
[本発明1003]
蛍光分子がフルオレセインであり、かつ結合体（FAP-FITC）が、
Figure 0007161044000021
の構造を有する、本発明1002の結合体。
[本発明1004]
蛍光分子がS0456であり、かつ結合体が、
Figure 0007161044000022
の構造を有する、本発明1002の結合体。
[本発明1005]
蛍光分子が、
Figure 0007161044000023
の構造を含む、本発明1002の結合体。
[本発明1006]
エフェクターがPETイメージング剤である、本発明1001の結合体。
[本発明1007]
PETイメージング剤が
Figure 0007161044000024
の構造を含む、本発明1006の結合体。
[本発明1008]
エフェクターが、DOTA、NOTA、TETA、またはNODAGAキレート剤
Figure 0007161044000025
を含むイメージング剤または治療剤である、本発明1001の結合体。
[本発明1009]
99mTcイメージング剤が、
Figure 0007161044000026
の構造を含む、本発明1001の結合体。
[本発明1010]
放射性治療剤が、
Figure 0007161044000027
の構造を含む、本発明1001の結合体。
[本発明1011]
TLが、
Figure 0007161044000028
の構造を含む小分子であり、
式中、xは、
Figure 0007161044000029
であり、
式中、R 1 およびR 2 は同じかまたは異なり、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、およびC 1 -C 4 アルキルからなる群より選択され；
R 3 は、C 1 -C 4 アルキル、ニトリル、またはイソニトリルであり；
R 4 は、Hまたは-CH 3 であり
R 5 およびR 6 は同じかまたは異なり、それぞれ独立に水素、ハロゲン、およびC 1 -C 4 アルキルからなる群より選択され、
R 7 ～R 9 は同じかまたは異なり、それぞれ独立に水素、メトキシ、ハロゲン、CF 3 、およびC 1 -C 4 アルキルからなる群より選択される、
本発明1001の結合体。
[本発明1012]
R 1 およびR 2 がそれぞれハロゲンである、本発明1011の結合体。
[本発明1013]
R 1 およびR 2 がそれぞれフッ素である、本発明1011の結合体。
[本発明1014]
エフェクターが、VEGFR1、VEGFR2、VEDFR3、FGFR1、FGFR2、またはPDGFRのキナーゼ阻害剤である、本発明1001の結合体。
[本発明1015]
エフェクターがFAKまたはROCKのキナーゼ阻害剤である、本発明1001の結合体。
[本発明1016]
エフェクターがSMAD阻害剤である、本発明1001の結合体。
[本発明1017]
エフェクターが細胞毒性剤である、本発明1001の結合体。
[本発明1018]
エフェクターが汎PI-3キナーゼ/mTOR阻害剤である、本発明1001の結合体。
[本発明1019]
（PI3KI1）の構造
Figure 0007161044000030
を含む、汎PI-3キナーゼ/mTOR阻害剤。
[本発明1020]
Figure 0007161044000031
の構造を有する、本発明1001の結合体。
[本発明1021]
PI-3キナーゼ阻害剤が、以下の構造：
Figure 0007161044000032
を含み、
式中、Xが以下：
Figure 0007161044000033
のいずれかであり得る、本発明1018の結合体。
[本発明1022]
FAPに対する標的指向リガンドが、約1nM～約20nMの範囲のFAPに対する結合親和性を有する、本発明1001の結合体。
[本発明1023]
対象におけるIPFの診断法であって、
対象から肺組織を得る段階であって、該組織は線維芽細胞中でFAPを発現してもよく、またはしなくてもよい、段階；
該組織にTL-L-Iの結合体を提供する段階であって、TLは線維性肺疾患において線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）発現細胞を標的とするための標的指向リガンドA結合体であり、該TLは10,000未満の分子量を有し、該Lは非遊離型リンカーであり、該Iはイメージング剤である、段階；および
IPFの特徴としてのFAP発現活性化線維芽細胞として撮像法により示された線維芽細胞を特定する段階
を含む、方法。
[本発明1024]
TLが、
Figure 0007161044000034
の構造を有する小分子であり、
式中、xは、
Figure 0007161044000035
であり、
式中、R 1 およびR 2 は同じかまたは異なり、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、およびC 1 -C 4 アルキルからなる群より選択され；
R 3 は、C 1 -C 4 アルキル、ニトリル、またはイソニトリルであり；
R 4 は、Hまたは-CH 3 であり；
R 5 およびR 6 は同じかまたは異なり、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、およびC 1 -C 4 アルキルからなる群より選択され；
R 7 ～R 9 は同じかまたは異なり、それぞれ独立に、水素、メトキシ、ハロゲン、CF 3 、およびC 1 -C 4 アルキルからなる群より選択される、
本発明1023の方法。
[本発明1025]
対象のIPFの処置法であって、
IPF患者の細胞にTL-L-Dの結合体の薬学的有効量を提供する段階であって、TLは10,000未満の分子量を有する、FAPに対する標的指向リガンドであり、Lは遊離可能リンカーであり、かつDは汎PI-3キナーゼ阻害性効果を有する治療薬である、段階；および
TL-L-Dの処置後の肺組織細胞外マトリックス沈着量減少をモニターする段階
を含む、方法。
[本発明1026]
TLが、
Figure 0007161044000036
の構造の構造を有する小分子であり、
式中、xは、
Figure 0007161044000037
であり得、
式中、R 1 およびR 2 は同じかまたは異なり、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、およびC 1 -C 4 アルキルからなる群より選択され；
R 3 は、C 1 -C 4 アルキル、ニトリル、またはイソニトリルであり；
R 4 は、Hまたは-CH 3 であり；
R 5 およびR 6 は同じかまたは異なり、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、およびC 1 -C 4 アルキルからなる群より選択され、
R 7 ～R 9 は同じかまたは異なり、それぞれ独立に、水素、メトキシ、ハロゲン、CF 3 、およびC 1 -C 4 アルキルからなる群より選択される、
本発明1025の方法。
[本発明1027]
Dが、以下の構造：
Figure 0007161044000038
を有し、
式中、Xが以下：
Figure 0007161044000039
のいずれかであり得る、本発明1025の方法。
[本発明1028]
前記結合体が活性化線維芽細胞上のコラーゲンI沈着を減少させる、本発明1025の方法。
[本発明1029]
前記対象が、約0.75u/kgのブレオマイシンの連続10日間の気管内投与により誘導したマウスIPFモデルである、本発明1025の方法。
[本発明1030]
結合体の投与が、マウスIPFモデルに約0.2～20umol/kgを連続10日間であり、かつ結合体が、
Figure 0007161044000040
の構造を有するFAPL_PI3KI1である、本発明1025の方法。
[本発明1031]
モニターされる細胞外マトリックスがコラーゲンIである、本発明1025の方法。
[本発明1032]
線維芽細胞のヒドロキシプロリン産生を減少させる、本発明1025の方法。
[本発明1033]
前記対象が、シリカまたは放射線で誘導したマウスIPFモデルである、本発明1025の方法。
FAP標的指向の分析のためのFAPL-FITC結合体の設計および合成。 ヒト線維芽細胞株によるFAPL-FITCの結合および内部移行。FAPL-FITCは、HLF1細胞中のヒトFAPを標的とする。（A）FAPL-FITC内部移行の生細胞撮像。FAPL-FITC（10nM）と共にインキュベートしたHLF1-hFAP細胞の共焦点顕微鏡画像、FAP染色を緑で示す。0分（a）および30分（d）の時点の、HLF1-hFAP細胞株中のFAPL-FITCの空間局在。FAPおよびエンドソームの共局在：FAPL-FITCと共にインキュベートし、続いてエンドソーム（Rab7a-RFP；赤）および核（DRAQ5；青）染色した、HLF1-hFAP細胞。3つの画像のマージを右（cおよびf）に示す。黄色はFAPのエンドソームマーカーとの共局在を示した。 ヒトIPF患者細胞株によるFAPL-FITCの結合。IPF肺線維芽細胞中で主に発現され、FAP-FITCによって標的とされるαSMAおよびFAP。（A）IPF線維芽細胞および非IPF対照線維芽細胞を播種し、FAPまたはaSMAに対する抗体で染色した。（B）IPF細胞をFAPL-FITC（10nM）と共にインキュベートし、フローサイトメトリーで分析した。 PI3KI1およびFAPL-PI3KI1の設計および合成。新規汎Pi3K阻害剤の設計および合成。（A）Pi3Kg（PDBコード：3L08）の結晶構造に基づく、PI3KI1の推定結合。（B）ドッキングした化合物のドッキングスコア。（C）PI3KI1の合成スキーム。 新規なFAPを標的とする汎Pi3K阻害剤（FAPL_PI3KI1）の合成。 インビトロでのFAPを標的とするPI-3キナーゼ阻害剤による筋線維芽細胞不活性化の評価。PI3KI1はHLF-1線維芽細胞においてAktリン酸化、増殖、コラーゲン分泌、およびコラーゲンゲル収縮を阻害する。（A）PI3KI1構造。（B）コンフルエントなHLF-1線維芽細胞をTGFβ（1ng/mL）および表示のPI3KI1またはオミパリシブにより刺激し、溶解物をウェスタンブロッティングのために回収した。PI3KI1はTGF-β（1ng/mLで24時間）により誘導したAKTリン酸化をIC50 1.4nMで阻害する。コラーゲン1およびαSMA発現は、100nM PI3KI1によって抑制されたが、pSMAD2は、PI3K阻害剤によって影響されなかった。（C）MTTアッセイならびにカスパーゼ3および7活性（補足データ）は、PI3KI1がHLF-1増殖を＞100nMで阻害したことを示す。（D）HLF-1線維芽細胞をTGFβ（1ng/mL）により3日間刺激し、培地中に分泌されたコラーゲンのレベルをシリウスレッド染色により決定した。（E）PI3KI1（100nMで12時間）は、コラーゲンゲル収縮アッセイにより、活性化線維症に特徴的な線維芽細胞再編成および収縮を破壊した。データはt-検定による解析である；*P＜0.05、**P＜0.01。 エクスビボでのIPF患者細胞株データ。PI3KI1およびPI3KI1-FAPLは、IPF線維芽細胞において、TGFβにより誘導したコラーゲン産生を抑制した。（B）コンフルエントなIPF線維芽細胞を、TGFβ（1ng/mL）および漸増濃度のオミパリシブまたはPI3KI1またはPI3KI1-FAPLにより48時間刺激し、コラーゲンI発現を、ハイコンテント画像分析での分子クラウディングアッセイによりアッセイした。データを、TGFβ処理したIPF線維芽細胞（C）およびDAPI対比染色から得た細胞数（D）に対する相対蛍光強度として表す。 インビトロでのマウス線維芽細胞株におけるFAP標的指向の評価。FAPL-FITCは、マウス線維芽細胞においてマウスFAPを標的とする。HLF-hFAP細胞におけるFAPL_FITCの蛍光結合親和性試験。（C）TGFbにより誘導したマウスNIH-3T3細胞株へのFAPL_FITCの結合。 インビボでのIPFのマウスモデルにおけるIPF肺のFAP標的指向の評価。（I）マウスにおける実験的肺線維症のFAP-aを標的とするNIR色素による光学撮像法、オープンボディ（A）、生体分布（B）。第14日にPBS投与（a、d）および100倍過剰のFAPリガンド存在下（b、e）または非存在下（c、f）でブレオマイシン（0.75u/Kg）投与したマウスにおける代表的光学画像。画像は5nmoleのFAP_S0456注射の4時間後に取得した。カラーバーは放射効率を示す（低、2.7×108；高、5.9×108）。生体分布：（1）心臓、（2）肺、（3）脾臓、（4）筋肉、（5）胃、（6）小腸、（7）大腸、（8）肝臓、および（9）腎臓。（II）PBS投与した健常対照（a）、ブレオマイシン投与後7日（b）、14日（c）、および21日（d）のFAP_S0456による肺の代表的光学画像、ならびに経時的な肺の定量的蛍光強度変化。光学撮像については、全ての画像を5nmoleのFAP_S0456注射の4時間後に同じ条件下で取得し、比較した。カラーバーは放射効率を示す（低、1.7×108；高、3.6×108）。（III）PBS投与した健常対照（a）、ブレオマイシン投与後7日（b）、14日（c）、および21日（d）の肺の代表的CT画像。 インビボでのFAPLを標的とするPI-3キナーゼ阻害剤による筋線維芽細胞不活性化の評価。ブレオマイシン処置マウスにおけるFAP-aを標的とするPi3K阻害剤による治療。（A）マウスモデルにおける肺線維症の誘導、処置、および検査のための実験プロトコルの概略図。（B）食塩水対照に対するFAPL_PI3KI1処置マウスの生存確率。（C）第21日の対照（食塩水）、ブレオマイシン処置＋FAPL_PI3KI1処置、およびブレオマイシン処置単独のヒドロキシプロリン含有量（ug/肺）。（D）体重変化 ブレオマイシン（0.75ug/Kg）投与後の、経時的なマウスにおける肺線維症の特徴づけ。（B）第7日、第14日、および第21日の、ブレオマイシン処置マウスおよび食塩水処置マウスにおける疾患進行のヒドロキシプロリン分析。 ヒト肺線維症細胞株（HLF-1）におけるTGF-β（1ng/mlで24時間）により誘導したFAPおよびaSMA発現。HLF-1細胞を12時間0.4％血清飢餓培養し、次いでTGF-β（1ng/mL）で24時間刺激した。FAPLおよびaSMA発現を免疫蛍光分析により検出した。 化合物3の化学構造。 化合物8の化学構造。 化合物5の化学構造。 FAPL_PI3KI1の化学構造。 合成的に誘導した化合物の一般的作製法。 カスパーゼ3および7活性は、PI3KI1が＞100nMでHLF-1増殖を阻害したことを示す。 マウスにおける実験的肺線維症のFAPを標的とする99mTC結合体による放射性物質を用いた撮像法。19Aは、様々な臓器におけるFAPを標的とする99mTCを示し、19Bは肺におけるFAPを標的とする99mTCを示す。
詳細な説明
本開示の概念を、本明細書の図および説明に詳細に例示し、記載しているが、図およびそれらの説明における結果は特徴の例示であって、制限ではないと考えられるべきであり；例示的態様を示し、記載しているにすぎないこと、ならびに本開示の精神の範囲内に入るすべての変更および改変は保護されることが望ましいことが理解されよう。
特に定義されない限り、科学的および技術的用語は、本開示に関する分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。
IPFは、致死的、慢性、進行性の疾患であり、年齢とともに、特に50歳以上の個人で増加する。米国では、IPFにより乳がんと同じくらい多くの人（年間約40,000人）が死亡し、ほとんどの患者は診断から3～5年以内に死亡する。
最近まで、IPFの根治療法はなく、処置の選択肢は、肺リハビリテーションおよび酸素療法に限定されていた。しかし2014年に、2つの新薬、ピルフェニドンおよびニンテダニブが、IPFの処置のためにFDAによって承認された。残念ながら、いずれも限られた、一貫性のない有効性を示し、主に疾患の進行を遅らせるが、疾患の安定した回復にはつながらない。
ごく最近、いくつかのキナーゼ阻害剤がヒト臨床試験に導入され、これらは線維化プロセスの必須の段階を阻止するかもしれないと期待されたが、健常組織における同じ酵素に対するこれらの標的活性は、全身毒性に関する懸念を高めた。
より進行した症例では、肺移植が最終選択肢となり得るが、HLA適合を見つけることはしばしば困難であり、移植拒絶反応を避けることは課題であり得る。
病的な線維化に特に必要な酵素または経路を見つける困難さを考慮して、本発明者らはこれらの細胞を標的とする薬物の送達に利用し得る、線維症生成細胞上で主に発現される分子マーカーの同定を行った。
マクロファージおよびT細胞などの活性化免疫細胞による刺激に反応して、線維芽細胞は筋線維芽細胞に活性化され、次いで線維芽細胞巣と呼ばれる領域に蓄積し、ここで線維化を引き起こすコラーゲンを産生する。
これらの筋線維芽細胞は、コラーゲンリモデリングのプロセスにとって重要な膜貫通タンパク質、線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）のそれらの発現によって、非病的線維芽細胞とは容易に区別される。
筋線維芽細胞上のFAPの特有の発現は、筋線維芽細胞を標的とする薬物の送達のためにおそらく利用できると考えられるマーカーを提供する。
本試験において、線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）に特異的な低分子量リガンドを合成し、FAPをトランスフェクトしたFAP発現ヒト肺線維芽細胞株（HLF1-FAP）への結合について評価した。HLF1-hFAP細胞株およびIPF患者細胞株の両方によるコラーゲン合成および分泌の抑制における、FAPリガンドを標的とする新規PI-3キナーゼ阻害剤（FAPL_PI3KI1）の効力も調べた。次いで、FAPLを標的とするNIR色素（FAP-S0456）を用いて、線維化肺の特異的標的指向をインビボで評価した。最後に、標的指向阻害剤、FAPL-PI3KI1の、ブレオマイシン誘導マウスの肺におけるコラーゲン沈着および線維化を減少させる能力を評価した。
本発明者らは、FAPリガンドが、HLF1-FAP細胞において約3nMの親和性でFAPに結合することを示した。FAPL-PI3KI1は、HLF1-hFAPおよびIPF患者細胞株の両方においてコラーゲン分泌/合成を強力に阻害することが観察された（IC50＝＜10nM）。ブレオマイシン誘導マウスのNIR撮像は、FAPL-S0456 NIR色素が線維化肺を良好な競合性で特異的に標的とすることを示した。FAPL-PI3KI1によるインビボ療法は、実験的肺線維症を発症させるよう誘導したPBS処置対照マウスと比較して、生存率の増大およびヒドロキシプロリン/コラーゲン産生の減少を示した。これらの知見は、（1）FAPL-S0456が良好な特異性で線維化肺を標的とし得ること、（2）Pi3K阻害剤（FAPL-PI3KI1）の標的指向送達は、肺線維症、ならびに病的炎症および線維化によって特徴づけられる他の疾患の処置に有益であり得ることを示す。
FAP標的指向結合体の作製および使用、ならびにIPF症状の低減または排除に対するそれらの有望な効果、例えばコラーゲンI産生の減少を例示するために、様々な態様を提供する。様々な癌組織上のFAPの発現パターンに基づき、FAPLに結合した治療薬が疾患に対して特異的かつ有効である限り、FAPL結合弾頭を他の疾患モデルでも使用し得ることが企図される。
FAPタンパク質発現は、胚発生時に間葉系細胞上で高レベルに起こり、次いで出生直後に抑制されて制限され、その発現は、創傷治癒、癌、および線維症に関連する状態において、活性化線維芽細胞上でアップレギュレートされることが確立された。以下の実施例から、当業者であれば、FAPの発現パターンは、線維症の特徴である線維化細胞を標的とする薬物または他のエフェクターの送達のための良好なマーカーとして適格であることを理解するであろう。
以下の実施例で示すデータに基づき、FAPリガンドを標的とするPI-3キナーゼ療法は、成人患者が重篤な肺または他の組織外傷から回復せず、この薬物の使用により重大な非特異的毒性に遭遇しないと予想される場合に、成人に主に適用することができる。
また、線維化プロセスは、異なる種類の線維症の間でいくつかの類似点を共有していることも認識されており、したがって、筋線維芽細胞を不活性化し、静止線維芽細胞になるよう再プログラムする標的指向薬物は、肝臓、腎臓、心臓、皮膚、および膀胱器官の線維症の処置においても有用であることが証明され得る。いかなる理論にも限定されることなく、これは、これらのいくつかの種類の線維症における疾患進行の基本パターンが、不明の原因によって起こる免疫細胞活性化に関与し、線維芽細胞の活性化をもたらして筋線維芽細胞を形成し、それによりコラーゲンの過剰産生を誘発し得るためである。したがって、基本的に全ての公知の線維性疾患における共通の特徴は、線維化が起こる臓器に関係なくFAPを常に発現する筋線維芽細胞によるコラーゲンの産生である。
いくつかの治療用弾頭が、本発明者らのFAP標的指向リガンドを使用して送達するために選択されてきたが、例えば、VEGFR1、VEGFR2、VEDFR3、FGFR1、FGFR2、またはPDGFRに対するキナーゼ阻害剤が、送達のための候補であり得る。FAKまたはROCKに対するキナーゼ阻害剤などの他の弾頭、SMAD阻害剤、または細胞毒性剤などの他のエフェクターは、すべて本開示の企図の範囲内である。本適用において、強力な汎PI-3キナーゼ阻害剤を、主に以下の利点のために、クリニックにおける以前のPI-3キナーゼ阻害剤の多くの失敗を考慮して選択した。
PI-3キナーゼ経路活性化が、IPFにおける主要な病変である線維化巣で報告されている。PI-3キナーゼアイソフォームは、IPF組織および線維芽細胞株において発現の増加を示し、血小板由来成長因子および形質転換成長因子(TGF)-β1を含む、IPFに関与するいくつかの主要な線維化促進成長因子の下流でシグナル伝達が活性化されている。オミパリシブは、IPF由来肺線維芽細胞におけるPI-3キナーゼシグナル伝達および機能的応答を阻害し、IPF肺組織およびBAL由来細胞におけるAktリン酸化を阻害した。
PI-3キナーゼ経路の阻害は、増殖、アポトーシス、および代謝を含む正常な細胞機能にも影響を及ぼす。標的指向アプローチは、汎PI3K/mTOR阻害剤の累積毒性を防ぐために必須である。アイソフォーム特異的阻害剤が筋線維芽細胞への送達のために選択されたかもしれないが、3つの主要な節（PI3K、mTORC1、およびmTORC2）の阻害を通じて、アイソフォーム間の任意の機能的冗長性を克服し、補償メカニズムのクロストークおよびフィードバックの可能性を阻止するために、汎PI3K/mTORキナーゼ阻害剤を選択した25。このような一般的PI-3キナーゼ阻害剤は一般に毒性がより高くなるが、筋線維芽細胞は正常な肺機能に必須ではなく、一般に疾患の回復中にアポトーシスを起こすため、全てのPI-3キナーゼ依存性プロセスの抑制はそれほど望ましくない。ブレオマイシン誘導マウスの線維化肺における、本発明者らのFAPLを標的とする蛍光色素の特異的蓄積に注目することは興味深い。事実、本発明者らは、色素取り込みの強度は線維化の強度と相関していることに気づいた。他の疾患の処置のために開発された他の標的指向リガンドの試験において、本発明者らは、同じ標的指向リガンドを様々な有用なペイロードの送達に使用し得ることを観察した。同じFAP標的指向リガンドを線維化組織への放射性イメージング剤の送達に適応させることができれば、FAPを標的とするイメージング剤を、IPFにおける診断、病期分類、または治療への応答の評価に使用するために開発し得る可能性がある。
最後になったが、PI-3キナーゼは異なる細胞機能、特にいくつかの他の疾患モデルに広く関わっているため、所与の汎PI-3キナーゼ阻害剤の弾頭を特定の疾患マーカーに対する標的指向リガンドに結合させて、その特定の疾患モデルにおいてその阻害効果を発揮し得ることが企図される。例えば、PI-3キナーゼ阻害剤で処置した浸潤性膀胱癌は、最適な汎PI-3キナーゼ阻害剤と結合した、膀胱癌マーカーの上皮成長因子受容体（EPGR）を標的とするリガンドによって改善することができる。
疾患特異的標的指向リガンドに結合した汎PI-3キナーゼ弾頭の本発明者らのプラットフォームは、疾患組織上に特有の表面マーカー発現を有する、様々な疾患に取り組むための治療プラットフォームモデルを提供する。
実験手順
一般
H-Cys(Trt)-2-Cl-Trt樹脂および保護アミノ酸は、Chem-Impex Intlから購入した。2-(ヒドロキシメチル)ピリジン-5-ボロン酸ピナコールエステルは、Combi-Blocksから購入した。6-ブロモ-4-ヨードキノリン、2-4-ジフルロベンゼン-l-スルホニル-クロリド、および5-ブロモ-2-メトキシピリジン-3-アミンは、ArkPharmから購入した。他の化学物質は全て、SIGMA-AldrichおよびFisher Scientificから購入し、受領したままで使用した。薄層クロマトグラフィ（TLC）は、Merckシリカゲル60 F254 TLCプレート上で行った。シリカゲルカラムクロマトグラフィは、シリカゲル（粒径60～120μm）を用いて実施した。分取逆相高性能液体クロマトグラフィ（RP-HPLC）は、Waters、XBridgeTM Prep C18、5μm；19×100mmカラム、移動相A＝20mM酢酸アンモニウム緩衝液、pH5または7、B＝アセトニトリル、30分の勾配システム、13mL/分、λ＝254/280nmで実施した。LRMS-ESI（LC-MS）は、Agilent LCMS 1220システム、およびWaters、XBridgeTM RP18、3.5μm；3×50mmカラム、移動相A＝20mM炭酸水素アンモニウム緩衝液、pH5または7、B＝アセトニトリル、12～15分の勾配システム、0.75mL/分、λ＝254/280nmで記録した。高分解能質量測定は、LTQ Orbitrap XL質量分析計で、エレクトロスプレーイオン化（ESI）を用いて記録した。
合成
FAPリガンド（11）、FAP-FITCおよびFAP-S0456を以前に発表された手順に従って合成した。国際公開公報第2018111989A1号参照。
化合物3
Figure 0007161044000041
2-4-ジフルロベンゼン-l-スルホニル-クロリド2（1当量）を、ピリジン中の5-ブロモ-2-メトキシピリジン-3-アミン1（1当量）の冷溶液にゆっくり加えた。反応混合物を周囲温度で16時間撹拌し、その時点で反応混合物を水で希釈し、固体をろ過し、大量の水で洗浄した。沈澱を高減圧下で乾燥して化合物3を得、それ以上精製せずに次の段階で用いた。LRMS-LC/MS (m/z): [M + H] + C12H9BrF2N2O3S、計算値377.9；実測値378.9）
化合物5
Figure 0007161044000042
無水1,4-ジオキサン中のビス(ピナコラト)ジボロン4（1当量）、化合物3（1当量）、Pd(dppf)2Cl2（0.1当量）、KOAc（3当量）の混合物を、窒素を10分間通気することにより脱酸素した。次いで、混合物を3時間加熱還流した。室温まで冷却した後、混合物を減圧下で蒸発させ、残渣をEtOAcに溶解し、水で2回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィ（ヘキサン：EtOAc）で精製して、化合物5を得た。LRMS-LC/MS (m/z): [M + H] + C18H21BF2N2O5S、計算値426.1；実測値427.1）
化合物8
Figure 0007161044000043
6-ブロモ-4-ヨードキノリン6（212.37、0.636mmol）および2-(ヒドロキシメチル)ピリジン-5-ボロン酸7（150mg、0.636mmol）を、無水1,4-ジオキサン（15mL）に溶解した。これにPd(dppf)2Cl2（19.9mg、0.024mmol）と、続いて2M Na2C03（2.5mL）を加えた。次いで、混合物を6時間加熱還流した。室温まで冷却した後、固体をろ過し、蒸発させた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィ（EtOAc：MeOH）で精製して、化合物8を得た。LRMS-LC/MS (m/z): [M + H] + C15H11BrN2O、計算値314；実測値315）
PI3KI1
Figure 0007161044000044
化合物5（136mg、0.32mmol）および化合物8（110mg、0.32mmol）を無水1,4-ジオキサン（50mL）に溶解した。これにPd(dppf)2Cl2（10mg、0.012mmol）と、続いて2M Na2C03（8mL）を加えた。次いで、混合物を6時間加熱還流した。室温まで冷却した後、固体をろ過し、残渣を蒸発させた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィ（EtOAc：MeOH）で精製して、PI3KI1を得た。LRMS-LC/MS (m/z): [M + H] + C27H20F2N4O4S、計算値534.1；実測値535.1）
化合物10
Figure 0007161044000045
SUH78017（50mg、0.094mmol）および化合物9（32.7mg、0.094mmol）をDMF（1mL）に溶解し、撹拌した。反応の進行を、分析LRMS-LCMSでモニターした。反応完了後、粗生成物を分取RP-HPLC［A＝2mM酢酸アンモニウム緩衝液（pH7.0）、B＝アセトニトリル、溶媒勾配5％Bから80％B/35分］で精製して、80％の化合物10を得た。LRMS-LC/MS (m/z): [M + H] + C35H27F2N5O6S3、計算値747.1；実測値748.1）
FAP-PI3KI1
Figure 0007161044000046
化合物10（22.3mg、0.019）および化合物11（10mg、0.018mmol）を無水DMSOに溶解し、不活性雰囲気下で撹拌した。反応の進行を、分析LRMS-LCMSでモニターした。反応完了後、粗生成物を、分取RP-HPLC［A＝2mM酢酸アンモニウム緩衝液（pH7.0）、B＝アセトニトリル、溶媒勾配5％Bから80％B/35分］で精製して、80％の最終生成物FAP-PI3KI1を得た。LRMS-LC/MS (m/z): [M + H] + C52H48F4N10O12S3、計算値1177.2 実測値1179.1）。
細胞培養および動物飼育
IPF患者細胞株は、Dr. Ivan O. Rosas、M.D. Brigham and Women's Hospital、Boston、MAからご供与いただいた。C57BL6/6-NCrl（系統コード（Strain code）：027）マウスはCharles Riverから購入し、通常の齧歯類飼料で飼養した。マウスは試験期間中、標準の12時間明暗周期で滅菌環境に収容した。すべての動物手順は、NIHガイドラインに従い、Purdue Animal Care and Use Committee（PACUC）によって承認された。
インビトロ試験
FAP-FITC内部移行の生細胞撮像
HLF1-hFAP細胞をガラス底の皿に播種し、充分な量のエンドソームトラッカー（Rab7a-RFP、ThermoFisher）と共に終夜インキュベートした。次いで、細胞をFAP-FITC（10nM）と共に4℃で1時間インキュベートした。その後5nM DRAQ5核色素（ThermoFisher）で染色し、PBSで3回洗浄し、FAP-FITCの空間局在を周囲温度下、共焦点顕微鏡（FV 1000、Olympus）により、所与の時点でモニターした。共焦点画像をFV10-ASW、Olympusソフトウェアによりさらに加工した。
線維芽細胞におけるFAPおよびαSMA発現の免疫蛍光法
HLF1細胞、一次IPF線維芽細胞および非IPF線維芽細胞を、免疫蛍光染色のためにガラス底の皿で培養し、固定し、透過処理した。hFAPに対する一次抗体（1：200、FAB3715R、R&D Systems）またはαSMAに対する一次抗体（1：1000、ab2l027、Abcam）を、4℃で終夜インキュベートした。PBS洗浄後、Alexa Fluor(登録商標) 488 anti-Goat抗体（Abcam、1：400）の二次抗体と共にインキュベートした。共焦点顕微鏡で画像を取得し、分析した。
分泌された全コラーゲンのシリウスレッド染色
コンフルエントなHLF1細胞を、10％FBS含有DMEM培地に播種し、次いで0.4％血清飢餓培養を終夜行った後、コラーゲン分泌を刺激した。TGFb1（0.1ng/ml）を細胞に、PI3K阻害剤と共に、または阻害剤なしで加えた。同時インキュベーション後2日の時点で、全分泌コラーゲンレベルを定量するために、培地を回収した。全コラーゲンレベルを、Sirius Red Total Collagen Detection Kit（Chondrex, Inc）で定量した。基本的に、濃縮試料を500mlのシリウスレッド溶液と共に室温で20分間インキュベートした。10,000rpmで3分間遠心沈降してペレットを回収し、続いて500mlの洗浄溶液で3回洗浄した。シリウスレッド染色したペレットに250mlの抽出緩衝液を加え、510～550nmでODを読み取った。
培養した線維芽細胞のウェスタンブロット分析
血清飢餓培養したコンフルエントなHLF1細胞を、1ng/ml TGFb1含有培地中、指定の濃度のPI3K阻害剤と共に、または阻害剤なしで24時間同時インキュベートした。ウェスタンブロット分析のために細胞を回収し、溶解した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動およびブロッキングの後、膜をpSMAD2Ser465/467（#3101、Cell Signalling Technology）、またはpAktSer473（#4060、Cell Signalling Technology）を検出するための抗体と共にインキュベートし、シグナルをECL Western Blotting Detection Reagents（GE Healthcare）で可視化した。ストリッピングの後、膜をブロックし、全SMAD2（#3103、Cell Signalling Technology）または全Akt（#4060、Cell Signalling Technology）に特異的な抗体でリプローブした。
インビボ試験
ブレオマイシン誘導肺線維症モデル
8～10週齡のC57BL/6-NCrl（系統コード：027）雄マウス（Charles River）を麻酔（キシラジン/ケタミンの混合物）し、続いて50□Lの滅菌リン酸緩衝化食塩水（PBS）中で新しく調製した0.75mg/Kgの硫酸ブレオマイシン（Cayman Chemicals、Cat N13877）を、1回気管内注射した。対照マウスには、50□Lの滅菌PBSを注射した。試験期間中、体重をモニターした。縦断的試験においてFAP発現および線維症にアクセスするために、ブレオマイシン注入後7日、14日、および21日に肺を回収した。FAP-PI3K阻害剤による治療のために、同じ手順を実施してブレオマイシンを投与し、第21日に肺を回収して治療効果にアクセスした（第0日をブレオマイシン投与の日とした）。
ヒドロキシプロリンアッセイ
全肺コラーゲンを、以前に記載された通りにヒドロキシプロリンの分析によって定量した30。このアッセイのために右肺を常に供して比較を可能にした。簡単に言うと、回収した右肺をPBS（PH7.4）中でホモジナイズし、12N HClにより120℃で3時間消化した。クエン酸/酢酸緩衝液（PH6.0）およびクロラミン-T溶液を室温で20分間で加え、試料をエールリッヒ溶液と共に65℃で15分間インキュベートした。試料を室温まで冷却し、550nmで読み取った。0～100μg/mlの濃度のヒドロキシプロリン標準（Sigma、MO）を用いて標準曲線を作成した。
肺線維症の病理組織学的評価
左肺を膨張させ、4％パラホルムアルデヒドで固定した。肺組織をパラフィン中に包埋し、10□mの切片を調製し、H&Eおよびマッソントリクローム染色を用いて染色した。ブレオマイシン誘導線維症の重症度を、ブレオマイシン投与後の指定の日時に、半定量的病理組織学的スコアリングにより判定した。29
インビボ蛍光撮像法
マウスを、5nmolのFAPを標的とするNIR色素結合体（FAP-S0456）の尾静脈（i.v.）注射により処置し、注射の2時間後にSpectral AMI光学撮像システムを用いて撮像した。競合実験のために、100倍過剰の基本のFAPリガンドを用いた。設定は以下のとおりであった：対象物の高さ、1.5；励起、745nm；発光、790nm；FOV、25；ビニング、2；f-ストップ、2；取得時間、1秒。全身撮像の完了後、動物を解剖し、選択した臓器を回収し、完全な生体分布について再度撮像した。縦断的撮像試験のための条件は、マウスをブレオマイシン投与後7日、14日、および21日に撮像した以外は、同じままであった。
インビボマイクロCT撮像法
全肺のマイクロCT分析を、ブレオマイシン投与後7日、14日、および21日に実施した。簡単に言うと、動物をイソフルランで麻酔し、腹臥位で固定した。マイクロCT画像を、Quantum FX マイクロCTシステム（Perkin Elmer、Waltham、MA）で心ゲーティングを併用し（呼吸ゲーティングなし）、以下のパラメーターを用いて取得した：90kV；160μA；FOV、60×60×60mm；空間分解能、0.11mm、全取得時間は4～5分となった。
実施例1. FAP標的指向の分析のためのFAPL-FITC結合体の設計および合成
本実施例において、FAP標的指向リガンド（FAPL）およびFITCなどのフルオレセインを含むイメージング剤結合体を、図1に示すスキームに従って生成した。
結合体のFAPへの結合親和性などのインビトロ結合特性、およびFAP発現細胞内のその生体分布を判定するために、FAPL-FITC結合体をFAPをトランスフェクトした細胞株HLF1（ヒト線維芽細胞）と共にインキュベートし、共焦点顕微鏡法およびフローサイトメトリーを用いて、結合体のFAP発現細胞に対する特異的標的指向、およびその後の細胞株におけるそのエンドサイトーシスを観察する。図2およびその説明文を参照されたく、これはFAPL-FITCがhFAP-HLF1細胞株において良好な競合性で充分に結合することを示している。加えて、FAPリガンドは、良好な特異性でFAPを認識し、標的とすることができる。FAPL_FITC結合体は、受容体との結合後に内部移行する。これは、結合体がエフェクターのペイロード、例えば、イメージング剤、または治療薬を、活性化線維芽細胞に送達する可能性があることを示す。
実施例2. ヒトIPF患者細胞株によるFAPL-FITCの結合
本実施例において、ヒトIPF患者細胞株および非IPF対照細胞株を、それぞれFAP抗体およびaSMA抗体で染色した。共焦点顕微鏡法は、FAPおよびaSMAはいずれもIPF肺線維芽細胞で主に発現されることを示している。図3A参照。図3Bにおいて、IPF患者細胞株をFAPL_FITCと共にインキュベートした場合、フローサイトメトリー分析は、FAPL_FITCで染色された試料を示す。
実施例3. PI3KI1およびFAP-PI3KI1の設計、合成
本実施例において、本発明者らは、PI3KI1と命名した新規汎PI-3キナーゼ-mTOR阻害剤を提供した。この可能性のあるIPF薬は、標的指向リガンド、例えば、実施例2～3のFAPリガンドに結合するための遊離可能リンカーを組み込むための良好なハンドルを有する。
新規汎PI-3キナーゼ-mTOR阻害剤の設計および合成を図4に示す。
新規なFAPを標的とする汎Pi3K阻害剤（FAPL_PI3KI1）の合成スキームを図5に示す。
実施例4. インビトロでのFAPLを標的とするPI-3キナーゼ阻害剤による筋線維芽細胞不活性化の評価
本実施例において、本発明者らは、新規PI-3キナーゼ-阻害剤PI3KI1は、そのGSK対応物オミパリシブよりもAktリン酸化を良く阻害することを示した。後者はIPF治療薬のための臨床試験中である。PI3KI1はHLF-1細胞株でコラーゲン分泌およびコラーゲンゲル収縮も抑制する。新規PI-3キナーゼ阻害剤PI3KI1は遊離ヒドロキシル基を有するため、実施例2および3に示す、FAPリガンドへの容易な結合を可能にする。新規薬物は毒性を有さず、GSK薬オミパリシブと同様にはたらく。図6およびその説明文参照。
実施例5. エクスビボでのIPF患者細胞株データ
本実施例において、本発明者らは、FAPを標的とするPI-3キナーゼ阻害剤FAP_PI3KI1は、IPF患者細胞において遊離PI3KI1および遊離GSK薬オミパリシブよりも良好に、TGFβ誘導コラーゲン分泌を低い薬物濃度で抑制することを確立した。図7およびその説明文参照。
実施例6. インビトロでのマウス線維芽細胞株におけるFAP標的指向の評価
本実施例において、本発明者らは、FAPL_FITCはマウスFAPを認識し得ることを示した。簡単に言うと、NIH-3T3細胞をTGFβでFAPを発現するように誘導した（マウスにおける線維症の発病を模倣）。FAPL_FITCは、マウスFAPに対する特異的モノクローナル抗体に結合する細胞集団のほぼ98％を認識することができる。図8およびその説明文参照。
実施例7. インビボでのIPFのマウスモデルにおけるIPF肺のFAP標的指向の評価
本実施例において、薬物または他のエフェクターに結合したFAPLは、急性肺傷害後14日のマウスで、線維化肺を特異的に標的とする。簡単に言うと、食塩水処置およびFAP競合ありの線維化肺はいずれも、NIRシグナルの最小限の保持を示した一方で、競合なしの病的肺は、FAP_S0456色素の高い取り込みを示した。急性肺傷害後の異なる時点（7、14、21日）のマイクロCTおよびNIR撮像はいずれも、線維化の進行を示した。
ヒドロキシプロリンおよび免疫染色データと相関して、線維化のピークを示す最も高い光学強度は第14日に達成されたことが判明し、第21日あたりでゆっくり低下する。図9およびその説明文参照。
実施例8. インビボでのFAPLを標的とするPI-3キナーゼ阻害剤による筋線維芽細胞不活性化の評価
本実施例において、FAPL_PI3KI-SUH処置マウスで、非処置マウスに比べて、線維化の減弱が、生存率の増大およびヒドロキシプロリンの減少を伴って示された。図10およびその説明文参照。
実施例9. 肺線維症の分布の撮像
本実施例において、実験的肺線維症の放射性物質を用いた撮像を図19A（様々な臓器）および肺のFAPを標的とする99mTC（図19B）で示す。

Claims (7)

  1. 以下の構造：
    Figure 0007161044000047
    を有する、汎PI-3キナーゼ阻害物質。
  2. TL-L-Eの結合体であって、
    TLがFAP結合リガンドであり、
    Lがリンカーであり、および
    Eが請求項1記載の汎PI-3キナーゼ阻害物質である、
    結合体。
  3. TLが、1nM～20nMの範囲のFAPに対する結合親和性を有する、請求項2記載の結合体。
  4. TLが、10,000未満の分子量を有する、請求項2記載の結合体。
  5. リンカーが、ポリエチレングリコール(PEG)、アルキル、糖、およびペプチドからなる群より選択される、請求項2記載の結合体。
  6. リンカーがPEGである、請求項2記載の結合体。
  7. 以下の構造：
    Figure 0007161044000048
    を有するFAPL_PI3KI1である、請求項2記載の結合体。
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