JP7151468B2 - 蛍光標識剤 - Google Patents
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Description
本発明の蛍光標識剤は、一般式(1)で表される構造単位を有する重合体[A]を含むことを特徴とする。一般式(1)で表される構造単位は、重合体[A]の部分構造単位であり、このような構造を有することにより、900nm以上の波長領域で強い蛍光発光を示す。一般式(1)で表される構造単位は、繰り返し構造であることが好ましく、重合体[A]の主鎖に有することが好ましい。繰り返し単位は、特に制限はないが、5~250の範囲内であることが好ましく、10~150の範囲内であることがより好ましい。重合体[A]の質量平均分子量(Mw)は、2000~200000の範囲内であることが好ましく、5000~100000の範囲内であることがより好ましい。
表1
本発明の蛍光標識剤は、一般式(1)で表される構造単位を有する重合体[A]を含んでなることを特徴とする。本発明の蛍光標識剤の用途は特に限定されないが、例えば、タンパク質や生体内の低分子化合物を蛍光ラベルすることで、生体内での挙動を可視化することが挙げられる。
これらの用途の場合、水中で蛍光標識剤が蛍光を発光する必要があるが、蛍光標識剤を水溶性とするか、水中に分散させることが好ましい。重合体[A]にスルホン酸ナトリウム基やポリエチレングリコール基などを導入することにより水溶性とすることができるが、蛍光強度や分散安定性、耐光性の観点から、重合体[A]を含む粒子を水中に分散させた分散体として使用することが好ましい。
本発明における重合体[A]は、単独で水中に分散させることができる。分散体の作製方法は特に限定されないが、例えば、重合体[A]を有機溶媒中に溶解し、溶液を水中に注入した後、有機溶媒を留去することにより分散体が得られる。
本発明における分散体は、重合体[A]と水を含み、目的に応じて上記の両親媒性物質等を含んでもよい。本発明の分散体において、重合体[A]の濃度は特に限定されないが、例えば、細胞を扱う場合、細胞の機能障害や増殖阻害などへの影響を考量すると、濃度は低い方が好ましく、重合体[A]の濃度は、一般式[A]で表される構造単位の濃度が100μM以下であることが好ましい。また同様に、両親媒性物質の濃度も低い方が好ましく、両親媒性物質の量は重合体[A]に対して500倍質量以下が好ましく、200倍質量以下がより好ましく、100倍質量以下がさらに好ましい。
装置名:昭和電工社製GPC(ゲルパーミエーションクロマトグラフィー)「ShodexGPC System-21」
カラム:東ソー社製GMHXL:4本、東ソー社製HXL-H:1本を直列に連結した。
移動相溶媒 : テトラヒドロフラン(THF)
流量 : 1.0mL/分
カラム温度 : 40℃
重合体(1)の合成方法
反応式1~反応式4に従って重合体(1)を合成した。
窒素雰囲気下、tert-アミルアルコール125部中、攪拌下に水素化ナトリウム(含有量60%)4.28部を添加した。さらに、2-シアノチオフェン11.7部、コハク酸ジイソプロピル9.71部をtert-アミルアルコール9部に溶解し、添加した。100℃ まで加熱昇温し、4時間撹拌した。その後60℃ まで冷却し、この温度において酢酸12.6部及びメタノール180部の混合液を滴下し、滴下終了後、0.5時間60℃加熱を施した。次に、ろ過し、メタノールにより洗浄した後に60℃ で乾燥し、化合物(I)を8.88部得た。マススペクトル(ブルカーダルトニクス社製、Auto
flexII)、 1H‐NMR、および13C‐NMR(日本電子社製、ECX-400P)によって同定した。
窒素雰囲気下、ジメチルアセトアミド(DMAc)32部に、上記の方法により得られた化合物(I)を3.00部、tert-ブトキシナトリウム2.11部を加え、50℃
まで加熱し、30分間撹拌した。次に、9-(ブロモメチル)ノナデカン7.94部を加え、50℃において3時間攪拌した。反応液を氷水160部に注入し、25℃で1時間攪拌した。濾過した後、水、メタノール洗浄し、60℃で乾燥することにより、暗赤色粉末の粗成物を3.57部得た。得られた粗成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物(II)を得た。マススペクトル(ブルカーダルトニクス社製、A
utoflexII)、 1H‐NMR、および13C‐NMR(日本電子社製、ECX-400P)によって同定した。
窒素雰囲気下、上記の方法により得られた化合物(II)1.00部をクロロホルム1
50部に懸濁し、攪拌下に0℃ まで冷却した。この温度においてN-ブロモコハク酸イミド(NBS)0.45部を添加し、室温に戻し12時間攪拌した。水500部とメタノール400部の混合液中に滴下し、析出した固体粗成物を減圧濾過により濾集した。得られた粗成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物(III)を
得た。マススペクトル(ブルカーダルトニクス社製、AutoflexII)、 1H‐NMR、および13C‐NMR(日本電子社製、ECX-400P)によって同定した。
シュレンク管に、上記の方法により得られた(III)で表される化合物1.00部、2
,5-ビス(トリメチルスタンニル)チエノ[3,2-b]チオフェンを0.45部、トリ(o-トリル)ホスフィン(P(o-tol)3)を0.03部、トリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム(Pd2(dba)3)を0.02部、トルエンを80部入れ、凍結脱気法により酸素を除去した後、窒素雰囲気下とし、懸濁液を100℃で8時間加熱撹拌した。反応液をメタノール8000部に滴下し、析出した固体を減圧濾過により濾集し、重合体(1)を得た。得られた表1に示した重合体(1)の構造は、マススペクトル、 1H‐NMR、および13C‐NMRによって同定した。また、GPCによる分析の結果、質量平均分子量は53000であった。
重合体(1)の合成と同様に、以下に示す反応式5~8に従って、表1に示した重合体(2)~(45)および(50)をそれぞれ合成した。重合体(46)~(49)は、Ar1-CNおよびAr2-CNにおいて、臭素を有する原料を用い、反応式5、6、8に従って合成した。反応式5におけるAr1-CNおよびAr2-CNに相当する材料は、表2に示した材料を使用した。また、反応式6におけるR1-BrおよびR2-Brに相当する材料のR1およびR2は、表1中のそれぞれ相当するR1およびR2である。また、各合成における各材料の配合は、重合体(1)の合成と同じ当量比で行い、得られた表1に示した重合体(2)~(50)の構造は、マススペクトル、 1H‐NMR、および13C‐NMRによって同定した。また、得られた重合また、得られた重合体のMwは、いずれも2000~200000の範囲内であった。
<分散体K-1の作製>
蛍光標識剤として重合体(1)を1部、両親媒性物質としてポリエチレングリコール(PEG)・ポリカプロラクトン(PCL)ブロック共重合体(シグマアルドリッチ社製、PEG分子量5000、PCL分子量5000)100部をテトラヒドロフラン20000部に溶解した。得られた溶液を25℃で撹拌下、水25000部を素早く滴下した。さらに、25℃で12時間撹拌することでテトラヒドロフランを留去した後、0.45μmナイロン製メンブレンフィルターを通して濾過し、重合体(1)がPEG-PCLミセル内に可溶化された分散体を得た。
<分散体K-2~50の作製>
重合体(1)を重合体(2)~(50)にそれぞれ変更した以外は、実施例1と同様にして、分散体K-2~50をそれぞれ作成した。
<分散体K-51の作製>
両親媒性物質をポリエチレングリコール(PEG)・ポリ乳酸(PLGA)ブロック共重合体(シグマアルドリッチ社製、PEG分子量5000、PLGA分子量7000)に変更した以外は、実施例1と同様にして、分散体K-51を作成した。
<分散体K-52の作製>
蛍光標識剤として重合体(1)1部を、テトラヒドロフラン5000部に溶解し、700rpmで撹拌しながら水25000部に滴下した。25℃で24時間撹拌しテトラヒドロフランを完全に留去した。0.2μmのナイロン製メンブレンフィルターを通して濾過し、重合体(1)の分散体を得た。
<分散体K-53の作製>
重合体(1)をIR1061(4-[2-[2-クロロ-3-[(2,6-ジフェニル-4H-チオピラン-4-イリデン)エチリデン]-1-シクロヘキセン-1-イル]エテニル]-2,6-ジフェニルチオピリリウムテトラフルオロボラート、シグマアルドリッチ社製)に変更した以外は、実施例1と同様にして、本発明の分散体ではない分散体K-53を作成した。
各々の分散体について、蛍光光度計(日本分光株式会社製、FP-8700)を用いて蛍光スペクトルを測定し、蛍光波長950~1200nmにおける蛍光強度の積分値を求めた。比較例1で得られた分散体K-53の950~1200nmにおける蛍光強度の積分値を1とした時の、各分散体の蛍光強度の相対値を算出し、下記の基準に基づいて評価した。蛍光強度の相対値が1以上である場合、重合体(1)は蛍光標識剤としての特性を有するといえる。
△:0.8以上、1.2未満(やや不良)
〇:1.2以上、2未満(良好)
◎:2以上(極めて良好)
各々の分散体について、蛍光測定時の励起波長の光を、蛍光光度計(日本分光株式会社製、FP-8700)を用いて1時間照射し、照射前後の吸収スペクトルをそれぞれ分光光度計(株式会社日立ハイテクノロジーズ社製、U-4100)を用いて測定した。照射前の最大吸収波長の吸光度I0と照射後の最大吸収波長の吸光度I1を記録し、I1/I0値を耐光性の指標とした。I1/I0の値が1に近いほど耐光性が良好であり、評価が〇であれば良好である。
〇:I1/I0が0.9以上(良好)
×:I1/I0が0.9未満(不良)
表3
Claims (2)
- 重合体[A]を含んでなることを特徴とする蛍光標識剤であって、
前記重合体[A]が、下記一般式(2)で表される構造単位を有する重合体[B]であることを特徴とする蛍光標識剤。
- 重合体[A]および水を含んでなることを特徴とする分散体であって、
前記重合体[A]が、下記一般式(2)で表される構造単位を有する重合体[B]であることを特徴とする分散体。
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JP2004269698A (ja) | 2003-03-10 | 2004-09-30 | Toyo Ink Mfg Co Ltd | 有機エレクトロルミネッセンス素子材料およびそれを使用した有機エレクトロルミネッセンス素子 |
JP2009541548A (ja) | 2006-06-30 | 2009-11-26 | チバ ホールディング インコーポレーテッド | 有機半導体としてのジケトピロロピロールポリマー |
JP2013517374A (ja) | 2010-01-19 | 2013-05-16 | シリゲン グループ リミテッド | 指向性バイオマーカーシグナル増幅のための新規の試薬 |
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