JP7146676B2

JP7146676B2 - 分泌促進能評価試験方法

Info

Publication number: JP7146676B2
Application number: JP2019048000A
Authority: JP
Inventors: 恭久長▲崎▼; 篤史大木
Original assignee: Nissin Foods Holdings Co Ltd
Current assignee: Nissin Foods Holdings Co Ltd
Priority date: 2019-03-15
Filing date: 2019-03-15
Publication date: 2022-10-04
Anticipated expiration: 2039-03-15
Also published as: JP2020148695A

Description

本発明は、培養細胞の分泌促進能評価試験方法に関する。より詳しくは、ヒト培養細胞におけるGLP-1分泌促進能評価試験方法に関する。

糖尿病には発症の原因によって、１型、２型、その他、妊娠糖尿病などが存在する。このうち、糖尿病患者の９５％以上が２型と言われている。２型糖尿病は、遺伝的要因に食生活、運動習慣などの生活習慣が加わることで発症するのではないかと考えられているが、いまだ不明な点が多い。２型糖尿病の特徴としては、インスリンは分泌されているものの、働きが悪くて血糖値が下がらないインスリン抵抗タイプと、分泌そのものが減っているインスリン分泌低下タイプに大別できる。

近年、２型糖尿病治療の標的としてGLP-1（グルカゴン様ペプチド１）が注目されている。GLP-1はインクレチンの一つである。また、インクレチンとは消化管ホルモンの総称であり、栄養素の摂取により消化管から分泌されるインスリンを促進する。消化管から分泌されたインスリンはグルコース依存的に増加する。そして、分泌されたインスリンは血糖値を下げるために、食欲を抑制すると考えられている。糖尿病の治療に用いられているDPP-4阻害薬やGLP-1受容体作動薬などは、インクレチンの作用に基づくものである。そして、これらの治療薬は、国内の７割以上の患者に用いられている（非特許文献１参照）。

さらに、最新の基礎研究の結果から、GLP-1には食欲抑制や糖尿病関連以外にも膵内作用としてβ細胞量増加、グルカゴン分泌の抑制、大血管障害として脳血管障害を改善、虚血性心疾患を改善、高血圧を改善、脂質異常症を改善、慢性炎症を改善、抹消動脈疾患を改善する。細血管障害として網膜症を改善、腎症を改善、神経障害を改善する。併存疾患として認知症を改善、脂肪肝を改善、肥満を改善、骨折を改善するなどの効果があることが発見された（非特許文献２参照）。

ところで、機能性成分の評価方法としては、生体内（in vivo）試験と、試験管内（in vitro）試験が一般的に知られている（特許文献１～３参照）。

Seino Y, et al : J Diabetes Investig, 7 Suppl 1 : 102-109,2016 Seino Y & Yabe D : J Diabetes Investig,4 : 108-130,2013

特開２０１４-２０１５６７号公報特許６２９４１５３号公報特許６２８０３９８号公報

試験施設や動物愛護法などの観点から、最近ではin vitro試験が主流となりつつある。in vitro系は安定した試験結果が得られるというメリットがあるが、結果が出るまでに時間がかかるという問題がある。

また、in vitro系に用いられる培養細胞の中には、培養時に特殊な形態をとる培養細胞も存在する。そのため、取扱う培養細胞によっては、細胞本来の挙動を見ることができない場合がある。

本発明は上記問題点を鑑みてなされたものである。すなわち、本発明の課題は、短時間で効率よく、しかも低コストで培養細胞の分泌促進能を評価できる試験方法を提供することを目的とする。また、培養時に特殊な形態をとる培養細胞であっても用いることができる分泌促進能評価試験方法を提供することを目的とする。

本発明者らはGLP-1の分泌促進が知られている物質を指標にして、物質とGLP-1の関係について検討を行った。その結果、GLP-1産生細胞であるNCL-H716細胞の上清を用いることで、簡便かつ短時間で、しかも高精度でGLP-1分泌促進能を評価できることを見出し、本発明を完成するに至った。

上記課題解決のため、本発明は、培養細胞の分泌促進能評価試験方法であって、培養細胞の分泌促進能評価試験方法であって、被験試料に培養細胞を添加する工程と、被験試料添加後、37℃,5% CO₂存在下で2時間以上培養する工程と、培養後、培養上清を用いて分泌促進能を評価する工程と、を備える。

かかる構成によれば、従来24時間以上かかっていた細胞培養時間を、最短２時間に縮めることができる。これにより、短時間で効率よく細胞の分泌促進能を評価することができる。また、培養細胞に被験試薬ではなく、被験試薬に培養細胞を添加することで、培養時に特殊な形態をとる細胞に対しても挙動を調べることができる。

前記した構成において、評価対象がGLP-1であり、培養細胞がヒト由来NCI-H716細胞（ATCC）であることが好ましい。

かかる構成によれば、ヒト由来細胞においてGLP-1の分泌促進能を調べることができるため、迅速に新たな機能性成分の模索が可能となる。

本発明により、短時間で効率よく、しかも低コストで培養細胞の分泌促進能を評価できるため、研究開発の速度を飛躍的に上げることができる。

各被験試料に対するNCI－H716株のGLP-1分泌促進能を示すグラフである。

以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下では培養細胞としてNCI-H716細胞を用いた場合を例に説明する。また、被験試料としては、GLP-1の分泌促進が報告されているForskolin,IL6,PMA,OEA,Ginsenosideを用いた。

＜細胞培養＞
本発明で用いる培養細胞としては、GLP-1分泌促進能を備える細胞であることが好ましい。具体的には、ヒト由来のNCI-H716細胞や、マウス由来のGlutag細胞を挙げることができる。このうち、取り扱いしやすいNCI-H716細胞を用いることが好ましい。なお、NCI-716H細胞は、培養時に底面に付着するものと、浮遊しながら凝集するものとが混在する。

NCI-H716細胞の培養は次のようにして行った。まず、RPMI1640培地（gibco社製）に対して、10％ウシ胎児血清（Biological Industries社製）、100 U/mlペニシリン（Sigma社製）、100 μg/mlストレプトマイシン、25ug/mlアムホテリシンB（Sigma社製）、0.2% NaHCO3（gibco社製）、1mM L-Glutamine（gibco社製）、4.5g/L D-Glucose（gibco社製）、2.383g/L HEPES Buffer（gibco社製）、110mg/L Sodium Pyruvate（gibco社製）を加え、培養培地とした。次に、CELLCOAT（登録商標）ポリ‐D‐リジン（greuner Bio-One社製；以下、単に「培養容器」という。）でNCI-H716細胞を37℃,5% CO₂条件下で培養した。

＜被験試料の調製＞
GLP-1分泌促進能力評価に用いる被験試料（Folskolin,IL6,PMA,OEA,Ginsenoside）は、ジメチルスルホキシド（DMSO）もしくは水に懸濁して調製した。具体的には、Folskolinは終濃度100μg/well、IL6は終濃度1μg/well、PMAは終濃度50μg/well、OEAは終濃度10μg/well、Ginsenosideは終濃度100μg/wellになるよう調製した。

＜GLP-1分泌促進能評価試験方法＞
先ず、培養容器から培養培地を50mlコーニングチューブに移した。50mlコーニングチューブを300×g、4℃で5分間遠心し、上清を除去した。次に、PBS(-)を13ml加え、培養容器内を洗浄した。洗浄したPBS(-)を先ほどの50mlコーニングチューブに移した。再び50mlコーニングチューブを300×g、4℃で5分間遠心し、上清を除去した。最後に、培養容器にAccutase（Innova Cell Technologies社製）を3ml加え、37℃で10分間静置し、培養容器の底面に付着したNCI-H716細胞を剥がした。PBS(-)を13ml加え、剥がした細胞を先ほどの50mlコーニングチューブに移した。再度50mlコーニングチューブを300×g、4℃で5分間遠心し、上清を除去することで、NCI-H716細胞を回収した。

次に、回収した細胞を、セルカウンター（商品名Countess；invitrogen社製）を用いて2×10⁵Cell/mlとなるように培養培地で懸濁した。次に、調製した被験試料を最終添加濃度が１％となるように、CELLCOAT（登録商標）ポリ‐D‐リジンの24ウェルプレート（greuner Bio-One社製）にあらかじめ添加した。なお、コントロールとして、被験試料を添加していないウェルを設けた。そして、各試験試料が添加されたウェルに対して、細胞数を調製したNCI-H716細胞を500μlずつ播種した。播種後、37℃,5%CO₂で2時間インキュベーションを行った。なお、インキュベーション時間については、最大12時間以内であることが好ましい。本発明にかかる試験方法では、初期段階における立ち上がりが早く、その後頭打ちとなる。そのため、長時間インキュベーションしても効果に差が認められなくなるためである。

インキュベーション後、ウェルごとに培養上清を回収した。回収した培養上清を300×g、4℃で4分間遠心し、上清を得た。得られた上清を試験試料ごとの測定サンプルとした。

＜EIA法によるGLP-1分泌量の測定＞
次に、EIA法を用いて、各サンプルに含まれるGLP-1分泌量の測定を行った。測定にはGLP-1（7-36）Human Simple Step ELISA（登録商標）kit（Abcam）を用いた。
まず、各サンプルをPre-coatied 96 well Microplateのウェルに、50μlずつ加えた。次に、抗体溶液を50μl加えて、室温、遮光条件下、プレートミキサーを用いて500rpmで振盪しながら1時間インキュベーションさせた。インキュベーション後、付属のwash bufferを用いて、各ウェルを350μl/wellで3回洗浄した。TMB Development solutionを100μlずつ各ウェルに加え、室温、遮光条件下、プレートミキサーを用いて500rpmで振盪しながら１５分間インキュベーションさせた。反応停止剤100μlを各ウェルに加えて反応を停止させ、450nmの波長で吸光度を測定した。
なお、検量線用の測定試料は付属のGLP-1 Standardを1000pg/ml, 625pg/ml, 390.6pg/ml, 244.1pg/ml, 152.6pg/ml, 95.4pg/ml, 59.6pg/ml, 0pg/mlに調製して用いた。

結果を図１に示す。図１から明らかなように、本発明にかかる評価方法を用いた場合、従来からGLP-1の分泌を促進することが知られていた被験試料において、コントロールに比べて分泌量が増加していることが認められた。特にPMA，OEAで顕著であった。この増加割合は、先願公報に記載されている従前の評価方法から算出された増加割合と同様の傾向を示していた。
以上の結果から、従来のin vitro試験におけるGLP-1の分泌促進能評価試験方法よりも簡便かつ短期間で結果が得られることが確認された。

以上説明したように、本願発明は短時間で効率よく、しかも低コストで培養細胞の分泌促進能を評価できる。また、上記実施例ではGLP-1について見たが、本発明はこれに限られるものでなく、その他の分泌物についても応用可能である。

Claims

ヒト由来ＮＣＩ－Ｈ７１６細胞（ＡＴＣＣ）のＧＬＰ－１分泌促進能評価試験方法であって、
被験試料にヒト由来ＮＣＩ－Ｈ７１６細胞（ＡＴＣＣ）を添加する工程と、
被験試料にヒト由来ＮＣＩ－Ｈ７１６細胞（ＡＴＣＣ）を添加後、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２時間以上培養する工程と、
培養後、回収した培養上清を凍結することなくＧＬＰ－１分泌促進能を評価する工程と、
を備えた、ヒト由来ＮＣＩ－Ｈ７１６細胞（ＡＴＣＣ）のＧＬＰ－１分泌促進能評価試験方法。