JP7137883B2 - 自家血小板由来の血小板溶解物 - Google Patents
自家血小板由来の血小板溶解物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7137883B2 JP7137883B2 JP2021566326A JP2021566326A JP7137883B2 JP 7137883 B2 JP7137883 B2 JP 7137883B2 JP 2021566326 A JP2021566326 A JP 2021566326A JP 2021566326 A JP2021566326 A JP 2021566326A JP 7137883 B2 JP7137883 B2 JP 7137883B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- platelets
- cell
- platelet lysate
- stem cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000006166 lysate Substances 0.000 title claims description 81
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 207
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 133
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 58
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 58
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 53
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims description 49
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 30
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 29
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 23
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 15
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 14
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 11
- 238000002161 passivation Methods 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 238000001802 infusion Methods 0.000 claims description 7
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000003074 dental pulp Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000005059 placental tissue Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000005222 synovial tissue Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 34
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 20
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 19
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 19
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 19
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 18
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 18
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 17
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 16
- 239000000463 material Substances 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 13
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 11
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 11
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 description 10
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 10
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 10
- 230000008859 change Effects 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 8
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 8
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 8
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 8
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 8
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 8
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 7
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 6
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 6
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 6
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 6
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 6
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 6
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 6
- 108010081589 Becaplermin Proteins 0.000 description 5
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 5
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 5
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 5
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 5
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 5
- 235000003170 nutritional factors Nutrition 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 210000001557 animal structure Anatomy 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 4
- 230000014818 extracellular matrix organization Effects 0.000 description 4
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 4
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 210000004409 osteocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 3
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 3
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 3
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 3
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 3
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 3
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 3
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 3
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 3
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 3
- NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N Oil red O Chemical compound Cc1ccc(C)c(c1)N=Nc1cc(C)c(cc1C)N=Nc1c(O)ccc2ccccc12 NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000006837 decompression Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 3
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 239000003634 thrombocyte concentrate Substances 0.000 description 3
- ABJSOROVZZKJGI-OCYUSGCXSA-N (1r,2r,4r)-2-(4-bromophenyl)-n-[(4-chlorophenyl)-(2-fluoropyridin-4-yl)methyl]-4-morpholin-4-ylcyclohexane-1-carboxamide Chemical compound C1=NC(F)=CC(C(NC(=O)[C@H]2[C@@H](C[C@@H](CC2)N2CCOCC2)C=2C=CC(Br)=CC=2)C=2C=CC(Cl)=CC=2)=C1 ABJSOROVZZKJGI-OCYUSGCXSA-N 0.000 description 2
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 2
- 102100023995 Beta-nerve growth factor Human genes 0.000 description 2
- 101710129634 Beta-nerve growth factor Proteins 0.000 description 2
- -1 CD79a Proteins 0.000 description 2
- 108010004942 Chylomicron Remnants Proteins 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 2
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 2
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 2
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 description 2
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 2
- 101001059454 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase MARK2 Proteins 0.000 description 2
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 2
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 2
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 2
- 108091008611 Protein Kinase B Proteins 0.000 description 2
- 102000005765 Proto-Oncogene Proteins c-akt Human genes 0.000 description 2
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 2
- 102100028904 Serine/threonine-protein kinase MARK2 Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 2
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 2
- 108010062497 VLDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N alizarin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=C(O)C(O)=CC=C3C(=O)C2=C1 RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 2
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 2
- 230000027746 artery morphogenesis Effects 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 230000012820 cell cycle checkpoint Effects 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 2
- 230000024321 chromosome segregation Effects 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 102000027412 enzyme-linked receptors Human genes 0.000 description 2
- 108091008592 enzyme-linked receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000027291 mitotic cell cycle Effects 0.000 description 2
- 230000023823 muscle structure development Effects 0.000 description 2
- 230000032405 negative regulation of neuron apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 2
- 230000025342 organ morphogenesis Effects 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000005407 pharyngeal system development Effects 0.000 description 2
- 230000026229 positive regulation of cell death Effects 0.000 description 2
- 230000010644 positive regulation of cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000027747 positive regulation of peptidyl-tyrosine phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 230000004029 positive regulation of stress-activated MAPK cascade Effects 0.000 description 2
- 230000033960 protein localization to cytoskeleton Effects 0.000 description 2
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000009550 regulation of ERK1 and ERK2 cascade Effects 0.000 description 2
- 230000016616 regulation of JNK cascade Effects 0.000 description 2
- 230000031509 regulation of bone mineralization Effects 0.000 description 2
- 230000007532 regulation of cardioblast proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000024155 regulation of cell adhesion Effects 0.000 description 2
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 2
- 230000012760 regulation of cell migration Effects 0.000 description 2
- 230000015721 regulation of epithelial cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000004985 regulation of immune system process Effects 0.000 description 2
- 230000018064 regulation of mitotic metaphase/anaphase transition Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 230000026618 small molecule metabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- LXMSZDCAJNLERA-ZHYRCANASA-N spironolactone Chemical compound C([C@@H]1[C@]2(C)CC[C@@H]3[C@@]4(C)CCC(=O)C=C4C[C@H]([C@@H]13)SC(=O)C)C[C@@]21CCC(=O)O1 LXMSZDCAJNLERA-ZHYRCANASA-N 0.000 description 2
- 230000029156 striated muscle tissue development Effects 0.000 description 2
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000025366 tissue development Effects 0.000 description 2
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 229940099456 transforming growth factor beta 1 Drugs 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 2
- JKYKXTRKURYNGW-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydroxy-9,10-dioxo-9,10-dihydroanthracene-2-sulfonic acid Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)C2=C1C(O)=C(O)C(S(O)(=O)=O)=C2 JKYKXTRKURYNGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 1
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010008111 Cerebral haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 206010019196 Head injury Diseases 0.000 description 1
- 101001134456 Homo sapiens Pancreatic triacylglycerol lipase Proteins 0.000 description 1
- 206010060860 Neurological symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 230000011759 adipose tissue development Effects 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- TZSMWSKOPZEMAJ-UHFFFAOYSA-N bis[(2-methoxyphenyl)methyl] carbonate Chemical compound COC1=CC=CC=C1COC(=O)OCC1=CC=CC=C1OC TZSMWSKOPZEMAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000022159 cartilage development Effects 0.000 description 1
- 208000015114 central nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000012520 frozen sample Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000001364 upper extremity Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0644—Platelets; Megakaryocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
- C12N2502/115—Platelets, megakaryocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
- C12N2502/1352—Mesenchymal stem cells
- C12N2502/1358—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本開示は、血小板溶解物を用いた細胞培養、およびこれに関連する技術に関する。
中枢神経疾患（脳梗塞、脳出血、頭部外傷、パーキンソン病等）に対する新たな治療法として再生医療が注目されており、複数の細胞医薬の開発が進められている。本発明者らは、以前、脳内に細胞を直接送り込む直接移植による治療を開発し、高い治療成績が得られた（非特許文献１）。
Shichinohe, Kawabori et al. Research on advanced intervention using novel bone marrOW stem cell (RAINBOW): a study protocol for a phase I, open-label, uncontrolled, dose-response trial of autologous bone marrow stromal cell transplantation in patients with acute ischemic stroke BMC Neurol. 2017 Sep 8;17(1):179
移植される細胞を調製するためには、長い時間と労力を要するものであったため、本発明者らは、鋭意検討した結果、高い効率で培養でき、かつ安全性の高い培養培地および培養方法を見出した。具体的には、本発明者らは、培養培地として使用される血小板溶解物（ＰＬ）を特定の調製条件を使用することによって、高い効率で細胞を培養することができることを見出した。
本開示は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
個体から得られた細胞の培養において使用される血小板溶解物を調製するための方法であって、該方法は、
該個体から得られた血小板またはその同等物を凍結解凍して、血小板溶解物を得る工程を含み、該方法が非動化する工程を含まない、方法。
（項目２）
個体から得られた細胞を培養する、または個体から得られた細胞を培養して細胞製品を得るための方法であって、
Ａ）個体から該細胞を得る工程、
Ｂ）該個体から血小板またはその同等物を得る工程、
Ｃ）該血小板またはその同等物を、非動化せずに凍結解凍して、血小板溶解物を得る工程、および
Ｄ）該細胞を該血小板溶解物の存在下で培養する工程
を含む、方法。
（項目３）
前記血小板またはその同等物が２回以上凍結解凍される、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記血小板またはその同等物が３回凍結解凍される、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－２０℃を下回る温度で凍結される、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－３０℃以下の温度で凍結される、項目１～５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－８０℃以下の温度で凍結される、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－８０℃～－１９６℃の温度で凍結される、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－８０℃の温度で凍結される、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記細胞が、幹細胞、神経細胞、角膜細胞、上皮細胞および肝細胞からなる群から選択される、項目１～９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記細胞が幹細胞である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記幹細胞が、間葉系幹細胞である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記間葉系幹細胞が、骨髄、脂肪組織、胎盤組織、滑膜組織、臍帯組織（例えば、臍帯血）、歯髄、または羊膜由来の間葉系幹細胞幹細胞、あるいは、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞から分化させた間葉系幹細胞である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記間葉系幹細胞が、骨髄由来間葉系幹細胞である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記細胞が、細胞注入療法および創薬研究において使用される細胞であって、該細胞注入療法を受ける被験体から得られた細胞である、項目１～１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記血小板が、前記被験体から得られた血小板である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
項目１～１６のいずれか一項に記載の方法に従って調製された血小板溶解物。
（項目１８）
個体から得られた細胞の培養のための血小板溶解物を含む製剤であって、該血小板溶解物は、該個体から得られた血小板またはその同等物から調製された血小板溶解物であり、該血小板溶解物は、非動化されていない、製剤。
（項目１Ａ）
個体から得られた細胞を培養するための方法であって、該方法は
Ａ）個体から該細胞を得る工程、
Ｂ）該個体から血小板またはその同等物を得る工程、
Ｃ）該血小板またはその同等物を、非動化せずに凍結解凍して、血小板溶解物を得る工程、および
Ｄ）該細胞を該血小板溶解物の存在下で培養する工程を含む
方法。
（項目２Ａ）
個体から得られた細胞を培養して細胞製品を得るための方法であって、
Ａ）個体から該細胞を得る工程、
Ｂ）該個体から血小板またはその同等物を得る工程、
Ｃ）該血小板またはその同等物を、非動化せずに凍結解凍して、血小板溶解物を得る工程、および、
Ｄ）該細胞を該血小板溶解物の存在下で培養し、必要に応じて得られた細胞を細胞製品とする工程を含む、方法。
（項目３Ａ）
前記血小板またはその同等物が２回以上凍結解凍される、項目１Ａまたは２Ａに記載の方法。
（項目４Ａ）
前記血小板またはその同等物が３回凍結解凍される、項目３Ａに記載の方法。
（項目５Ａ）
前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－２０℃を下回る温度で凍結される、項目１Ａ～４Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目６Ａ）
前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－３０℃以下の温度で凍結される、項目１Ａ～５Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目７Ａ）
前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－８０℃以下の温度で凍結される、項目１Ａ～６Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目８Ａ）
前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－８０℃～－１９６℃の温度で凍結される、項目１Ａ～７Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目９Ａ）
前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－８０℃の温度で凍結される、項目１Ａ～８Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目１０Ａ）
前記細胞が、幹細胞、神経細胞、角膜細胞、上皮細胞および肝細胞からなる群から選択される、項目１～９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１Ａ）
前記細胞が幹細胞である、項目１０Ａに記載の方法。
（項目１２Ａ）
前記幹細胞が、間葉系幹細胞である、項目１１Ａに記載の方法。
（項目１３Ａ）
前記間葉系幹細胞が、骨髄、脂肪組織、胎盤組織、滑膜組織、臍帯組織（例えば、臍帯血）、歯髄、または羊膜由来の間葉系幹細胞幹細胞、あるいは、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞から分化させた間葉系幹細胞である、項目１２Ａに記載の方法。
（項目１４Ａ）
前記間葉系幹細胞が、骨髄由来間葉系幹細胞である、項目１３Ａに記載の方法。
（項目１５Ａ）
前記細胞が、細胞注入療法および創薬研究において使用される細胞であって、該細胞注入療法を受ける被験体から得られた細胞である、項目１Ａ～１４Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目１６Ａ）
前記血小板が、前記被験体から得られた血小板である、項目１５Ａに記載の方法。
（項目１Ｂ）
それを必要とする個体において細胞注入療法を行う方法であって、該方法は、
該個体から得られた血小板またはその同等物を非動化せずに凍結解凍して、血小板溶解物を得る工程、
該個体からの細胞を、該血小板溶解物を培養する工程、および
該培養された細胞の有効量を、該個体に注入する工程
を包含する方法。
（項目２Ｂ）
前記血小板またはその同等物が２回以上凍結解凍される、項目１Ｂに記載の方法。
（項目３Ｂ）
前記血小板またはその同等物が３回凍結解凍される、項目１Ｂまたは２Ｂに記載の方法。
（項目４Ｂ）
前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－２０℃を下回る温度で凍結される、項目１Ｂ～３Ｂのいずれか一項に記載の方法。
（項目５Ｂ）
前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－３０℃以下の温度で凍結される、項目１Ｂ～４Ｂのいずれか一項に記載の方法。
（項目６Ｂ）
前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－８０℃以下の温度で凍結される、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
（項目７Ｂ）
前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－８０℃～－１９６℃の温度で凍結される、項目１Ｂ～６Ｂのいずれか一項に記載の方法。
（項目８Ｂ）
前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－８０℃の温度で凍結される、項目１Ｂ～７Ｂのいずれか一項に記載の方法。
（項目９Ｂ）
前記細胞が、幹細胞、神経細胞、角膜細胞、上皮細胞および肝細胞からなる群から選択される、項目１Ｂ～８Ｂのいずれか一項に記載の方法。
（項目１０Ｂ）
前記細胞が幹細胞である、項目９Ｂに記載の方法。
（項目１１Ｂ）
前記幹細胞が、間葉系幹細胞である、項目１０Ｂに記載の方法。
（項目１２Ｂ）
前記間葉系幹細胞が、骨髄、脂肪組織、胎盤組織、滑膜組織、臍帯組織（例えば、臍帯血）、歯髄、または羊膜由来の間葉系幹細胞幹細胞、あるいは、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞から分化させた間葉系幹細胞である、項目１１Ｂに記載の方法。
（項目１３Ｂ）
前記間葉系幹細胞が、骨髄由来間葉系幹細胞である、項目１２Ｂに記載の方法。
（項目１４Ｂ）
前記細胞が、細胞注入療法および創薬研究において使用される細胞であって、該細胞注入療法を受ける被験体から得られた細胞である、項目１Ｂ～１３Ｂのいずれか一項に記載の方法。
（項目１５Ｂ）
前記血小板が、前記被験体から得られた血小板である、項目１４Ｂに記載の方法。
（項目１）
個体から得られた細胞の培養において使用される血小板溶解物を調製するための方法であって、該方法は、
該個体から得られた血小板またはその同等物を凍結解凍して、血小板溶解物を得る工程を含み、該方法が非動化する工程を含まない、方法。
（項目２）
個体から得られた細胞を培養する、または個体から得られた細胞を培養して細胞製品を得るための方法であって、
Ａ）個体から該細胞を得る工程、
Ｂ）該個体から血小板またはその同等物を得る工程、
Ｃ）該血小板またはその同等物を、非動化せずに凍結解凍して、血小板溶解物を得る工程、および
Ｄ）該細胞を該血小板溶解物の存在下で培養する工程
を含む、方法。
（項目３）
前記血小板またはその同等物が２回以上凍結解凍される、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記血小板またはその同等物が３回凍結解凍される、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－２０℃を下回る温度で凍結される、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－３０℃以下の温度で凍結される、項目１～５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－８０℃以下の温度で凍結される、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－８０℃～－１９６℃の温度で凍結される、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－８０℃の温度で凍結される、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記細胞が、幹細胞、神経細胞、角膜細胞、上皮細胞および肝細胞からなる群から選択される、項目１～９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記細胞が幹細胞である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記幹細胞が、間葉系幹細胞である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記間葉系幹細胞が、骨髄、脂肪組織、胎盤組織、滑膜組織、臍帯組織（例えば、臍帯血）、歯髄、または羊膜由来の間葉系幹細胞幹細胞、あるいは、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞から分化させた間葉系幹細胞である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記間葉系幹細胞が、骨髄由来間葉系幹細胞である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記細胞が、細胞注入療法および創薬研究において使用される細胞であって、該細胞注入療法を受ける被験体から得られた細胞である、項目１～１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記血小板が、前記被験体から得られた血小板である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
項目１～１６のいずれか一項に記載の方法に従って調製された血小板溶解物。
（項目１８）
個体から得られた細胞の培養のための血小板溶解物を含む製剤であって、該血小板溶解物は、該個体から得られた血小板またはその同等物から調製された血小板溶解物であり、該血小板溶解物は、非動化されていない、製剤。
（項目１Ａ）
個体から得られた細胞を培養するための方法であって、該方法は
Ａ）個体から該細胞を得る工程、
Ｂ）該個体から血小板またはその同等物を得る工程、
Ｃ）該血小板またはその同等物を、非動化せずに凍結解凍して、血小板溶解物を得る工程、および
Ｄ）該細胞を該血小板溶解物の存在下で培養する工程を含む
方法。
（項目２Ａ）
個体から得られた細胞を培養して細胞製品を得るための方法であって、
Ａ）個体から該細胞を得る工程、
Ｂ）該個体から血小板またはその同等物を得る工程、
Ｃ）該血小板またはその同等物を、非動化せずに凍結解凍して、血小板溶解物を得る工程、および、
Ｄ）該細胞を該血小板溶解物の存在下で培養し、必要に応じて得られた細胞を細胞製品とする工程を含む、方法。
（項目３Ａ）
前記血小板またはその同等物が２回以上凍結解凍される、項目１Ａまたは２Ａに記載の方法。
（項目４Ａ）
前記血小板またはその同等物が３回凍結解凍される、項目３Ａに記載の方法。
（項目５Ａ）
前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－２０℃を下回る温度で凍結される、項目１Ａ～４Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目６Ａ）
前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－３０℃以下の温度で凍結される、項目１Ａ～５Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目７Ａ）
前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－８０℃以下の温度で凍結される、項目１Ａ～６Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目８Ａ）
前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－８０℃～－１９６℃の温度で凍結される、項目１Ａ～７Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目９Ａ）
前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－８０℃の温度で凍結される、項目１Ａ～８Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目１０Ａ）
前記細胞が、幹細胞、神経細胞、角膜細胞、上皮細胞および肝細胞からなる群から選択される、項目１～９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１Ａ）
前記細胞が幹細胞である、項目１０Ａに記載の方法。
（項目１２Ａ）
前記幹細胞が、間葉系幹細胞である、項目１１Ａに記載の方法。
（項目１３Ａ）
前記間葉系幹細胞が、骨髄、脂肪組織、胎盤組織、滑膜組織、臍帯組織（例えば、臍帯血）、歯髄、または羊膜由来の間葉系幹細胞幹細胞、あるいは、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞から分化させた間葉系幹細胞である、項目１２Ａに記載の方法。
（項目１４Ａ）
前記間葉系幹細胞が、骨髄由来間葉系幹細胞である、項目１３Ａに記載の方法。
（項目１５Ａ）
前記細胞が、細胞注入療法および創薬研究において使用される細胞であって、該細胞注入療法を受ける被験体から得られた細胞である、項目１Ａ～１４Ａのいずれか一項に記載の方法。
（項目１６Ａ）
前記血小板が、前記被験体から得られた血小板である、項目１５Ａに記載の方法。
（項目１Ｂ）
それを必要とする個体において細胞注入療法を行う方法であって、該方法は、
該個体から得られた血小板またはその同等物を非動化せずに凍結解凍して、血小板溶解物を得る工程、
該個体からの細胞を、該血小板溶解物を培養する工程、および
該培養された細胞の有効量を、該個体に注入する工程
を包含する方法。
（項目２Ｂ）
前記血小板またはその同等物が２回以上凍結解凍される、項目１Ｂに記載の方法。
（項目３Ｂ）
前記血小板またはその同等物が３回凍結解凍される、項目１Ｂまたは２Ｂに記載の方法。
（項目４Ｂ）
前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－２０℃を下回る温度で凍結される、項目１Ｂ～３Ｂのいずれか一項に記載の方法。
（項目５Ｂ）
前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－３０℃以下の温度で凍結される、項目１Ｂ～４Ｂのいずれか一項に記載の方法。
（項目６Ｂ）
前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－８０℃以下の温度で凍結される、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
（項目７Ｂ）
前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－８０℃～－１９６℃の温度で凍結される、項目１Ｂ～６Ｂのいずれか一項に記載の方法。
（項目８Ｂ）
前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－８０℃の温度で凍結される、項目１Ｂ～７Ｂのいずれか一項に記載の方法。
（項目９Ｂ）
前記細胞が、幹細胞、神経細胞、角膜細胞、上皮細胞および肝細胞からなる群から選択される、項目１Ｂ～８Ｂのいずれか一項に記載の方法。
（項目１０Ｂ）
前記細胞が幹細胞である、項目９Ｂに記載の方法。
（項目１１Ｂ）
前記幹細胞が、間葉系幹細胞である、項目１０Ｂに記載の方法。
（項目１２Ｂ）
前記間葉系幹細胞が、骨髄、脂肪組織、胎盤組織、滑膜組織、臍帯組織（例えば、臍帯血）、歯髄、または羊膜由来の間葉系幹細胞幹細胞、あるいは、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞から分化させた間葉系幹細胞である、項目１１Ｂに記載の方法。
（項目１３Ｂ）
前記間葉系幹細胞が、骨髄由来間葉系幹細胞である、項目１２Ｂに記載の方法。
（項目１４Ｂ）
前記細胞が、細胞注入療法および創薬研究において使用される細胞であって、該細胞注入療法を受ける被験体から得られた細胞である、項目１Ｂ～１３Ｂのいずれか一項に記載の方法。
（項目１５Ｂ）
前記血小板が、前記被験体から得られた血小板である、項目１４Ｂに記載の方法。
本開示において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供されうることが意図される。本開示のさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
以下、本開示を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。本明細書において、「約」とは、後に続く値の±１０％を意味する。
（定義）
本明細書において「個体」とは、任意の個別の生物実体をいい、遺伝学的に等価な個体は別個体であっても本開示の趣旨においては同一個体と判断する。
本明細書において「個体」とは、任意の個別の生物実体をいい、遺伝学的に等価な個体は別個体であっても本開示の趣旨においては同一個体と判断する。
本明細書において「個体から得られた細胞」とは、いわゆる初代細胞のほか、初代細胞を継代培養して得られる細胞を含む。
本明細書において「個体から得られた血小板」とは、いわゆる初代細胞たる血小板のほか、その同等物、すなわち、初代細胞血小板を継代培養して得られる血小板や当該個体から得られた前駆細胞から誘導して得られる血小板、あるいは、その個体から生成したｉＰＳ細胞から誘導した血小板など、遺伝学的にその個体と等価な血小板を含む。
本明細書において「血小板溶解物」とは、血小板を溶解することで放出された血小板に含有される増殖因子の組み合わせを指す。これは、化学的手段（例えば、ＣａＣｌ２）、浸透圧手段（例えば、蒸留されたＨ２Ｏの使用）、超音波破砕、膜通過剪断法、または凍結融解によって得ることができる。
本明細書において「非動化」とは、血清中の補体成分を失活させるために行う操作を指し、例えば、加熱処理（例えば、約５８℃で１時間）により達成される。
本明細書において「間葉系幹細胞」とは、間葉系間質細胞ともいい、骨芽細胞、脂肪細胞、筋細胞、軟骨細胞など、間葉系に属する細胞への分化能をもつ幹細胞を指す。間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪組織、胎盤組織、滑膜組織、臍帯組織（例えば、臍帯血）、歯髄、または羊膜由来の間葉系幹細胞幹細胞、あるいは、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞から分化させた間葉系幹細胞を包含し得る。
本明細書において「凍結解凍」は「凍結融解」と同義であり、細胞などの材料を、凍結し、その後解凍または融解することをいう。凍結および解凍または融解は本明細書において他の個所において詳述される。
本明細書において「試料」とは、対象として使う物質や生物をいい、血小板などを含みうる。
本明細書において「Ready-to-Use製剤」とは、保存後の細胞をさらに培養することなくそのまま使用可能な製剤を指す。
（好ましい実施形態）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本開示の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本開示の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。これらの実施形態について、当業者は適宜、任意の実施形態を組み合わせ得る。
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本開示の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本開示の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。これらの実施形態について、当業者は適宜、任意の実施形態を組み合わせ得る。
（血小板溶解物調製方法）
一つの局面において、本開示は、個体から得られた細胞の培養において使用される血小板溶解物を調製するための方法であって、該方法は、該個体から得られた血小板またはその同等物を凍結解凍して、血小板溶解物を得る工程を含み、該方法が非動化する工程を含まない、方法を提供する。
一つの局面において、本開示は、個体から得られた細胞の培養において使用される血小板溶解物を調製するための方法であって、該方法は、該個体から得られた血小板またはその同等物を凍結解凍して、血小板溶解物を得る工程を含み、該方法が非動化する工程を含まない、方法を提供する。
別の局面において、本開示は、個体から得られた細胞を培養する、または個体から得られた細胞を培養して細胞製品を得るための方法であって、Ａ）個体から該細胞を得る工程、Ｂ）該個体から血小板またはその同等物を得る工程、Ｃ）該血小板またはその同等物を、非動化せずに凍結解凍して、血小板溶解物を得る工程、および、Ｄ）該細胞を該血小板溶解物の存在下で培養する工程を含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、培養された細胞を細胞製品とする工程をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、得られた細胞製品を使用時まで凍結または非凍結で保存する工程をさらに含み得る。得られた細胞製品は、すぐに使用可能な（ready-to-use）製剤であり得る。培養された細胞を細胞製品とする工程は、培養された細胞を保存液とともに容器に収容することを含み得る。
いくつかの実施形態において、細胞が収容される容器としては、例えば、チューブ、バイアル瓶、シリンジ、ディッシュ、プレート（１２、２４、４８または９６ウェルプレート）等が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、血小板またはその同等物は、１回または複数回凍結解凍され得る。血小板の栄養因子をより多く抽出するために、複数回凍結解凍することが好ましく、２回以上、例えば、２回、３回、４回、５回、６回、またはそれより多く凍結解凍され得る。特定の実施形態において、血小板またはその同等物は、３回凍結解凍され得る。
いくつかの実施形態において、血小板またはその同等物は、少なくとも１回約－２０℃またはそれを下回る温度で凍結され得る。いくつかの実施形態において、血小板またはその同等物は、少なくとも１回約－２０℃以下、約－３０℃以下、約－４０℃以下、約－５０℃以下、約－６０℃以下、約－７０℃以下、または約－８０℃以下の温度で凍結され得る。複数回凍結される場合は、異なる温度で凍結されても同じ温度で凍結されてもよい。特定の実施形態において、血小板を含む試料は、約－８０℃～約－１９６℃の温度で凍結され得る。約－１９６℃で凍結する場合は、液体窒素を使用して凍結してもよい。本明細書においては、液体窒素での凍結は、約－１９６℃での凍結を意味する。特定の実施形態において、血小板またはその同等物は、少なくとも１回－８０℃の温度で凍結され得る。
本開示の方法において調製される血小板溶解物は、任意の細胞を培養するために使用される。培養される細胞としては、例えば、幹細胞、神経細胞、角膜細胞、上皮細胞、および肝細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、細胞は幹細胞であり得る。特定の実施形態において、幹細胞は、間葉系幹細胞（間葉系間質細胞）であり得る。さらに特定の実施形態において、間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪組織、胎盤組織、滑膜組織、臍帯組織（例えば、臍帯血）、歯髄、または羊膜由来の間葉系幹細胞幹細胞、あるいは、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞から分化させた間葉系幹細胞であり得る。好ましい実施形態において、細胞は、骨髄由来間葉系幹細胞であり得る。
これらの細胞は、細胞注入療法および創薬研究において使用される細胞であり得る。細胞注入療法において、細胞は、被験体から得られた細胞であっても、異なる被験体から得られた細胞であってもよい。血小板は、被験体から得られた血小板であってもよく、異なる被験体から得られた血小板であってもよい。培養される細胞と血小板は、同じ由来（すなわち、自家）であっても、異なる由来（すなわち他家）であってもよい。好ましい実施形態において、血小板は、自家であり得る。
本開示の血小板溶解物は、ｉＰＳ細胞から特定の細胞群（例えば骨とか）に分化させてそれを効率良く培養させるために使用し得る（例えば、ｉＰＳの創薬研究において）。
（血小板溶解物および製剤）
一つの局面において、本開示は、上記方法に従って調製された血小板溶解物を提供する。本開示の血小板溶解物は、高い効率で細胞を培養することができ有利である。
一つの局面において、本開示は、上記方法に従って調製された血小板溶解物を提供する。本開示の血小板溶解物は、高い効率で細胞を培養することができ有利である。
さらなる局面において、本開示は、個体から得られた細胞の培養のための血小板溶解物を含む製剤であって、該血小板溶解物は、該個体から得られた血小板またはその同等物から調製された血小板溶解物であり、該血小板溶解物は、非動化されていない、製剤を提供する。
（細胞培養・細胞製品製造）
別の局面において、本開示は、個体から得られた細胞を培養するための方法であって、Ａ）個体から該細胞を得る工程、Ｂ）該個体から血小板またはその同等物を得る工程、Ｃ）該血小板を、非動化せずに凍結解凍して、血小板溶解物を得る工程、およびＤ）該細胞を該血小板溶解物の存在下で培養する工程を含む、方法を提供する。
別の局面において、本開示は、個体から得られた細胞を培養するための方法であって、Ａ）個体から該細胞を得る工程、Ｂ）該個体から血小板またはその同等物を得る工程、Ｃ）該血小板を、非動化せずに凍結解凍して、血小板溶解物を得る工程、およびＤ）該細胞を該血小板溶解物の存在下で培養する工程を含む、方法を提供する。
本開示の技術によって得られる細胞または細胞培養において、従来の技術に比べて顕著な効果を奏する。
例えば、細胞増殖において、本開示の血小板溶解物の存在は、血小板溶解物を使用しない方法、例えば、ウシ血清（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、１０％）の存在と比較して、約２～約４０倍、約２～約２０倍、約５～約２０倍、例えば、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１２倍、約１４倍、約１６倍、約１８倍、約２０倍の増殖効率（所望の細胞数を達成するのに要する時間）の改善がみられ、ウシ血清無添加かつ血小板溶解物無添加と比較して、約２０～約２００倍、約２０～約１００倍、約５０～約１００倍、例えば、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約６０倍、約７０倍、約８０倍、約９０倍、約１００倍の増殖効率（所望の細胞数を達成するのに要する時間）の改善がみられる（Ｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．， ＡＬＴＥＸ． ２０１１；２８（４）：３０５－１６． ｄｏｉ： １０．１４５７３／ａｌｔｅｘ．２０１１．４．３０５．）。また、本開示の血小板溶解物の存在は、従来の血小板溶解物（例えば、他家血小板由来、非動化あり、凍結解凍１回のみ）と比べた場合に、存在させると、約２～約２０倍、約２～約１０倍、約５～約１０倍、例えば、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍の増殖効率（所望の細胞数を達成するのに要する時間）の改善がみられる。
得られた細胞は、従来の血小板溶解物で培養した細胞と同等の品質が担保されているにもかかわらず、培養効率が顕著に向上しており、有利である。
本開示の方法において、所望の細胞数は、約２００万～約２０億個であり得る。約２００万～約２０億個であれば、例えば、脳梗塞の治療のための細胞注入に十分であるからである。好ましい実施形態では、所望の細胞数は、約２０００万～約２億であり得る。
別の局面において、本開示は、個体から得られた細胞を培養して細胞製品を得るための方法であって、Ａ）個体から該細胞を得る工程、Ｂ）該個体から血小板またはその同等物を得る工程、Ｃ）該血小板を、非動化せずに凍結解凍して、血小板溶解物を得る工程、および、Ｄ）該細胞を該血小板溶解物の存在下で培養し、必要に応じて得られた細胞を細胞製品とする工程を含む、方法を提供する。
細胞製品の製造において、従来の血小板溶解物（例えば、他家血小板由来、非動化あり、凍結解凍１回のみ）を使用した場合と比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、または少なくとも約５０％の製品製造期間の短縮がみられる。例えば、実施例３の結果によれば、非動化なし、凍結解凍３回により作製された血小板溶解物は、非動化あり、凍結解凍１回により作製された血小板溶解物と比べて、８倍量の細胞が取得できた。細胞分裂速度を３６時間（骨髄幹細胞の分裂周期は概ね２４～４８時間）と仮定するとこれは既定の細胞数にするためには例えば２１日かかるところを１６日で増殖させることが出来ることになり、培養時間の２３％短縮が得られる。また、細胞製品の製造において、従来の血小板溶解物（他家血小板由来、非動化あり、凍結解凍１回）に比べた場合に、存在させると、約２～約２０倍、約２～約１０倍、約５～約１０倍、例えば、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍の増殖効率（所望の細胞数を達成するのに要する時間）の改善がみられる。
得られた細胞製品は、従来の血小板溶解物で培養した細胞と同等の品質が担保されているにもかかわらず、培養効率が顕著に向上しており、有利である。
いくつかの実施形態において、血小板溶解物は、典型的には、以下のように調製され得る。当業者であれば、使用する試薬の量および凍結／解凍温度、回数などの条件を適宜変更することができる。
１．使用する濃厚血小板のドナーの採血後７０日検査で、パルボウイルスが陰性であることを確認する
２．凍結してある濃厚血小板３名分を超低温フリーザーから取り出し、パスボックスを経由して調製室内に持ち込む
３．凍結バッグをキャニスターから取り出し、ＣＯ２インキュベータ内に静置する
４．凍結バッグは時々裏返したり位置をずらしながら完全に解凍する
５．バイオハザード対策用キャビネット内で、凍結バッグのポートに操作アダプターを刺入する
６．１８Ｇ注射針を付けた３０ｍｌシリンジ（ロック付）で解凍濃厚血小板を抜き取り、２２５ｍｌ遠心チューブに偶数本になるよう分注する
７．５．の遠心チューブに１０ｍｌ針付シリンジでヘパリンを血小板４０ｍｌあたり１ｍｌ添加し、５０ｍｌピペットでよく混和する
８．ＢＡＲＴ＝６，２０００×ｇ，２０分間，２０℃，アクセルｆａｓｔ，ブレーキｓｌｏｗで遠心する
９．５０ｍｌピペットで上清を新しい２２５ｍｌ遠心チューブに回収する（偶数本）
１０．ＢＡＲＴ＝６，２０００×ｇ，２０分間，２０℃，アクセルｆａｓｔ，ブレーキｓｌｏｗで遠心する
１１．５０ｍｌピペットで上清を新しい５０ｍｌ遠心チューブに回収する（偶数本）
１２．５８℃に温めたｅサーモ恒温槽のヒートブロックに１０．の遠心チューブを入れ、１時間静置して非動化する
１３．ＢＡＲＴ＝２，５００×ｇ，５分間，２０℃，アクセルｆａｓｔ，ブレーキｓｌｏｗで遠心する
１４．５０ｍｌピペットで上清を新しい２２５ｍｌ遠心チューブに回収する（偶数本）
１５．ＢＡＲＴ＝６，５００×ｇ，５分間，２０℃，アクセルｆａｓｔ，ブレーキｓｌｏｗで遠心する
１６．５０ｍｌピペットで上清を１０００ｍｌボトルにまとめてよく混和する
１７．１０ｍｌピペットで約７ｍｌを抜き取り５０ｍｌ遠心チューブに入れ、予め定められたロット番号を付与する。約２ｍｌ（ＥＬＩＳＡ用）を抜き取り５ｍｌチューブに入れ、ＰＬ製造番号を付与する。
１８．５０ｍｌ遠心チューブに４５ｍｌずつ分注し、１本ずつにラベルを貼付して冷凍庫付薬用保冷庫の冷凍部分に保管する。
１．使用する濃厚血小板のドナーの採血後７０日検査で、パルボウイルスが陰性であることを確認する
２．凍結してある濃厚血小板３名分を超低温フリーザーから取り出し、パスボックスを経由して調製室内に持ち込む
３．凍結バッグをキャニスターから取り出し、ＣＯ２インキュベータ内に静置する
４．凍結バッグは時々裏返したり位置をずらしながら完全に解凍する
５．バイオハザード対策用キャビネット内で、凍結バッグのポートに操作アダプターを刺入する
６．１８Ｇ注射針を付けた３０ｍｌシリンジ（ロック付）で解凍濃厚血小板を抜き取り、２２５ｍｌ遠心チューブに偶数本になるよう分注する
７．５．の遠心チューブに１０ｍｌ針付シリンジでヘパリンを血小板４０ｍｌあたり１ｍｌ添加し、５０ｍｌピペットでよく混和する
８．ＢＡＲＴ＝６，２０００×ｇ，２０分間，２０℃，アクセルｆａｓｔ，ブレーキｓｌｏｗで遠心する
９．５０ｍｌピペットで上清を新しい２２５ｍｌ遠心チューブに回収する（偶数本）
１０．ＢＡＲＴ＝６，２０００×ｇ，２０分間，２０℃，アクセルｆａｓｔ，ブレーキｓｌｏｗで遠心する
１１．５０ｍｌピペットで上清を新しい５０ｍｌ遠心チューブに回収する（偶数本）
１２．５８℃に温めたｅサーモ恒温槽のヒートブロックに１０．の遠心チューブを入れ、１時間静置して非動化する
１３．ＢＡＲＴ＝２，５００×ｇ，５分間，２０℃，アクセルｆａｓｔ，ブレーキｓｌｏｗで遠心する
１４．５０ｍｌピペットで上清を新しい２２５ｍｌ遠心チューブに回収する（偶数本）
１５．ＢＡＲＴ＝６，５００×ｇ，５分間，２０℃，アクセルｆａｓｔ，ブレーキｓｌｏｗで遠心する
１６．５０ｍｌピペットで上清を１０００ｍｌボトルにまとめてよく混和する
１７．１０ｍｌピペットで約７ｍｌを抜き取り５０ｍｌ遠心チューブに入れ、予め定められたロット番号を付与する。約２ｍｌ（ＥＬＩＳＡ用）を抜き取り５ｍｌチューブに入れ、ＰＬ製造番号を付与する。
１８．５０ｍｌ遠心チューブに４５ｍｌずつ分注し、１本ずつにラベルを貼付して冷凍庫付薬用保冷庫の冷凍部分に保管する。
いくつかの実施形態において、細胞培養液は、典型的には、以下のように調製され得る。当業者であれば、使用する試薬の量および凍結／解凍温度、回数などの条件を適宜変更することができる。
１．ＰＬを３７℃のｅ－サーモ恒温槽で解凍する
２．α－ＭＥＭ１本（５００ｍｌ）に対して抗生物質０．５ｍｌを１ｍｌ針付シリンジで添加する
３．２．のα－ＭＥＭ１本に対してＰＬ５０ｍｌを５０ｍｌピペットで添加する
４．フィルターユニットと吸引ポンプを吸引用チューブでつなぐ
５．３．の培養液を５０ｍｌピペットでフィルターユニットの上部に注ぎ、吸引ポンプを作動させる
６．注いだ培養液がすべてフィルターを通過したら新たな培養液を注ぐ
７．吸引速度が著しく低下した場合はいったんポンプを止め、吸引用チューブをフィルターからはずして、ボトルトップフィルターを新しいものに取り替える
８．フィルターユニット下部の保存ボトルに濾過済みの培養液が約５００ｍｌたまったらポンプを止め、吸引用チューブをフィルターからはずす
９．ボトルトップフィルターを保存用キャップに取り換える
１０．３．の培養液をすべて濾過するまで４～９を繰り返す
１１．濾過済みの培養液ボトルに培養液番号を記載したラベルを貼付する
１２．各培養液ボトルから約５ｍｌ（外注用）を抜き取り、５０ｍｌ遠心チューブに入れ、あらかじめ定められたロット番号を付与する。
１．ＰＬを３７℃のｅ－サーモ恒温槽で解凍する
２．α－ＭＥＭ１本（５００ｍｌ）に対して抗生物質０．５ｍｌを１ｍｌ針付シリンジで添加する
３．２．のα－ＭＥＭ１本に対してＰＬ５０ｍｌを５０ｍｌピペットで添加する
４．フィルターユニットと吸引ポンプを吸引用チューブでつなぐ
５．３．の培養液を５０ｍｌピペットでフィルターユニットの上部に注ぎ、吸引ポンプを作動させる
６．注いだ培養液がすべてフィルターを通過したら新たな培養液を注ぐ
７．吸引速度が著しく低下した場合はいったんポンプを止め、吸引用チューブをフィルターからはずして、ボトルトップフィルターを新しいものに取り替える
８．フィルターユニット下部の保存ボトルに濾過済みの培養液が約５００ｍｌたまったらポンプを止め、吸引用チューブをフィルターからはずす
９．ボトルトップフィルターを保存用キャップに取り換える
１０．３．の培養液をすべて濾過するまで４～９を繰り返す
１１．濾過済みの培養液ボトルに培養液番号を記載したラベルを貼付する
１２．各培養液ボトルから約５ｍｌ（外注用）を抜き取り、５０ｍｌ遠心チューブに入れ、あらかじめ定められたロット番号を付与する。
いくつかの実施形態において、細胞は個体の骨髄液から採取され得る。骨髄液からの細胞は、典型的には、以下のとおり採取され得る。当業者であれば、使用する試薬の量および凍結／解凍温度、回数などの条件を適宜変更することができる。
１．受入試験の外観試験およびドナースクリーニングの結果を確認する
２．受入規格を満たしていればＣＰＣへ持ち込む
３．アイソレーターが生産状態にあるか確認し、なっていない場合はアイソレーターマニュアルに従い生産開始の状態にする
４．以降の操作はアイソレーター内で行い、アイソレーターへの原料・試薬・資材の搬入出はアイソレーターマニュアルに従って実施する
５．骨髄液の総量（１）を確認する（小数点以下第一位まで）
６．２２５ｍｌ遠心チューブに骨髄液をすべて入れてピペットでよく混和する
７．受入試験用検体７ｍｌを５０ｍｌチューブ（２）に、保管用検体１ｍｌを０．５ｍｌずつクライオチューブ２本（３）（４）に抜き取る。
８．受入試験用検体に検体番号ラベルを貼付し、保管用検体はチューブに検体番号／製造番号ラベルを貼付する
９．受入試験用検体を品質担当者に引き渡す
１０．以下の計算式に従い、比重分離液を分注する本数を決定する
検体抜取り総量（５）＝（２）＋（３）＋（４）
分注本数（６）＝（骨髄液総量（１）－（５））×２÷２０
分注本数（７）＝（骨髄液総量（１）－（５））×２÷２５
分注本数（本）：（６）と（７）の間の整数
１１．１０．で決定した本数分のリューコセップに、１０ｍｌピペットで比重分離液を１５ｍｌずつ分注する
１２．ＢＡＲＴ＝３，９７０×ｇ，３０秒間，２２℃，アクセルｆａｓｔ，ブレーキｆａｓｔで遠心する
１３．以下の計算式に従い、骨髄液を希釈する細胞培養液とヘパリンの量を求める
細胞培養液（ｍｌ）＝（（１）－（５））×０．９
ヘパリン（ｍｌ）＝（（１）－（５））×０．１
１４．２００ｍｌ遠心チューブに、１３．で求めた量の細胞培養液（２５ｍｌピペット使用）とヘパリン（１０ｍｌ針付シリンジ使用）を入れる
１５．２５ｍｌピペットで骨髄希釈液をよく混和し、比重分離液入リューコセップに２０～２５ｍｌずつ注入する
１６．ＢＡＲＴ＝３，９７０×ｇ，１０分間，２２℃，アクセルｆａｓｔ，ブレーキｓｌｏｗで遠心する
１７．中間の単核球層の上約５ｍｍを残して、上層の血漿部分を１０ｍｌピペットを用いて除去する
１８．単核球層を、１０ｍｌピペットで５０ｍｌ遠心チューブに約２０ｍｌずつ回収する
１９．回収した単核球に、１０ｍｌピペットで同量程度の生理食塩液を加える
２０．ＢＡＲＴ＝３，８００×ｇ，５分間，１５℃，アクセルｆａｓｔ，ブレーキｓｌｏｗで遠心する
２１．２５ｍｌピペットを用いて上清を静かに除去する
２２．ペレットに生理食塩液を加えて懸濁し、１本の遠心チューブにまとめる
２３．ＢＡＲＴ＝３，８００×ｇ，５分間，１５℃，アクセルｆａｓｔ，ブレーキｓｌｏｗで遠心する
２４．２５ｍｌピペットを用いて上清を静かに除去する
２５．ペレットに細胞培養液を１０ｍｌ加えて懸濁し、総液量を確認する
２６．細胞懸濁液から約０．１ｍｌを５ｍｌチューブに取り、検体をチャック付袋に入れ、品質担当者に連絡して、出荷用パスボックスから検体を引き渡す
２８．品質担当者より試験結果を入手する（総細胞数（８））
２９．以下の計算式に従って播種するフラスコの枚数を決定するが、少なくとも２枚以上になるようにする
枚数（９）＝総細胞数（８）／０．５×１０８
枚数（１０）＝総細胞数（８）／２×１０８
播種枚数：（９）と（１０）の間の整数または２枚の多い方
３０．細胞懸濁液が以下の計算式で求めた液量になるよう、２５ｍｌピペットで細胞培養液を添加する
添加培養液量＝（１７５ｃｍ２フラスコ枚数×５）－細胞液量
３１．細胞培養液を２５ｍｌピペットで１７５ｃｍ２フラスコに２０ｍｌずつ注入する
３２．３０．の細胞懸濁液を１０ｍｌピペットで１７５ｃｍ２フラスコに５ｍｌずつ添加する
３３．細胞が均一になるようにフラスコを傾けてよく混和する
３４．フラスコをＣＯ２インキュベータに入れ、３７±１℃、炭酸ガス濃度５±１％にて培養する。
１．受入試験の外観試験およびドナースクリーニングの結果を確認する
２．受入規格を満たしていればＣＰＣへ持ち込む
３．アイソレーターが生産状態にあるか確認し、なっていない場合はアイソレーターマニュアルに従い生産開始の状態にする
４．以降の操作はアイソレーター内で行い、アイソレーターへの原料・試薬・資材の搬入出はアイソレーターマニュアルに従って実施する
５．骨髄液の総量（１）を確認する（小数点以下第一位まで）
６．２２５ｍｌ遠心チューブに骨髄液をすべて入れてピペットでよく混和する
７．受入試験用検体７ｍｌを５０ｍｌチューブ（２）に、保管用検体１ｍｌを０．５ｍｌずつクライオチューブ２本（３）（４）に抜き取る。
８．受入試験用検体に検体番号ラベルを貼付し、保管用検体はチューブに検体番号／製造番号ラベルを貼付する
９．受入試験用検体を品質担当者に引き渡す
１０．以下の計算式に従い、比重分離液を分注する本数を決定する
検体抜取り総量（５）＝（２）＋（３）＋（４）
分注本数（６）＝（骨髄液総量（１）－（５））×２÷２０
分注本数（７）＝（骨髄液総量（１）－（５））×２÷２５
分注本数（本）：（６）と（７）の間の整数
１１．１０．で決定した本数分のリューコセップに、１０ｍｌピペットで比重分離液を１５ｍｌずつ分注する
１２．ＢＡＲＴ＝３，９７０×ｇ，３０秒間，２２℃，アクセルｆａｓｔ，ブレーキｆａｓｔで遠心する
１３．以下の計算式に従い、骨髄液を希釈する細胞培養液とヘパリンの量を求める
細胞培養液（ｍｌ）＝（（１）－（５））×０．９
ヘパリン（ｍｌ）＝（（１）－（５））×０．１
１４．２００ｍｌ遠心チューブに、１３．で求めた量の細胞培養液（２５ｍｌピペット使用）とヘパリン（１０ｍｌ針付シリンジ使用）を入れる
１５．２５ｍｌピペットで骨髄希釈液をよく混和し、比重分離液入リューコセップに２０～２５ｍｌずつ注入する
１６．ＢＡＲＴ＝３，９７０×ｇ，１０分間，２２℃，アクセルｆａｓｔ，ブレーキｓｌｏｗで遠心する
１７．中間の単核球層の上約５ｍｍを残して、上層の血漿部分を１０ｍｌピペットを用いて除去する
１８．単核球層を、１０ｍｌピペットで５０ｍｌ遠心チューブに約２０ｍｌずつ回収する
１９．回収した単核球に、１０ｍｌピペットで同量程度の生理食塩液を加える
２０．ＢＡＲＴ＝３，８００×ｇ，５分間，１５℃，アクセルｆａｓｔ，ブレーキｓｌｏｗで遠心する
２１．２５ｍｌピペットを用いて上清を静かに除去する
２２．ペレットに生理食塩液を加えて懸濁し、１本の遠心チューブにまとめる
２３．ＢＡＲＴ＝３，８００×ｇ，５分間，１５℃，アクセルｆａｓｔ，ブレーキｓｌｏｗで遠心する
２４．２５ｍｌピペットを用いて上清を静かに除去する
２５．ペレットに細胞培養液を１０ｍｌ加えて懸濁し、総液量を確認する
２６．細胞懸濁液から約０．１ｍｌを５ｍｌチューブに取り、検体をチャック付袋に入れ、品質担当者に連絡して、出荷用パスボックスから検体を引き渡す
２８．品質担当者より試験結果を入手する（総細胞数（８））
２９．以下の計算式に従って播種するフラスコの枚数を決定するが、少なくとも２枚以上になるようにする
枚数（９）＝総細胞数（８）／０．５×１０８
枚数（１０）＝総細胞数（８）／２×１０８
播種枚数：（９）と（１０）の間の整数または２枚の多い方
３０．細胞懸濁液が以下の計算式で求めた液量になるよう、２５ｍｌピペットで細胞培養液を添加する
添加培養液量＝（１７５ｃｍ２フラスコ枚数×５）－細胞液量
３１．細胞培養液を２５ｍｌピペットで１７５ｃｍ２フラスコに２０ｍｌずつ注入する
３２．３０．の細胞懸濁液を１０ｍｌピペットで１７５ｃｍ２フラスコに５ｍｌずつ添加する
３３．細胞が均一になるようにフラスコを傾けてよく混和する
３４．フラスコをＣＯ２インキュベータに入れ、３７±１℃、炭酸ガス濃度５±１％にて培養する。
いくつかの実施形態において、細胞の継代培養は、典型的には、以下のように行われ得る。当業者であれば、使用する試薬の量および凍結／解凍温度、回数などの条件を適宜変更することができる。
１．アイソレーターが生産状態にあるか確認し、なっていない場合はアイソレーターマニュアルに従い生産開始の状態にする
２．以降の操作はアイソレーター内で行い、アイソレーターへの原料・試薬・資材の搬入出はアイソレーターマニュアルに従って実施する
３．フラスコをＣＯ２インキュベータから取り出す
４．少なくともフラスコ１枚を観察モジュールで観察し、写真を撮影する
５．１７５ｃｍ２フラスコは１０ｍｌピペットで、５段フラスコはデカンタで、フラスコ内の培養液を廃棄する
６．１０ｍｌピペットでＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを以下の量添加して、フラスコ底面全体に広げる
１７５ｃｍ２フラスコ ４ｍｌ
５段フラスコ ２０ｍｌ
７．フラスコをＣＯ２インキュベータ内に５分静置する
８．フラスコ側面を叩くなどして付着細胞を十分にはがす
９．１０ｍｌピペットでＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを５０ｍｌ遠心チューブに回収する１０．１０ｍｌピペットで生理食塩液を以下の量添加する
１７５ｃｍ２フラスコ ４ｍｌ
５段フラスコ ２０ｍｌ
１１．ピペッティングしてフラスコ底面をよくリンスし、９．の５０ｍｌ遠心チューブに回収する
１２．ＢＡＲＴ＝３，８００×ｇ，５分間，１５℃，アクセルｆａｓｔ，ブレーキｓｌｏｗで遠心する
１３．１０ｍｌピペットを用いて上清を静かに除去する
１４．１０ｍｌピペットでペレットに生理食塩液を１０ｍｌ加えて懸濁する
１５．ＢＡＲＴ＝３，８００×ｇ，５分間，１５℃，アクセルｆａｓｔ，ブレーキｓｌｏｗで遠心する
１６．１０ｍｌピペットを用いて上清を静かに除去する
１７．１０ｍｌピペットでペレットに培養液を１０ｍｌ加えて懸濁する
１８．細胞懸濁液から約０．１ｍｌを５ｍｌチューブに取る
１９．品質担当者に連絡し、出荷用パスボックスから検体を引き渡す
２０．品質担当者より試験結果を入手する（総細胞数（１））
２１．以下の計算式に従って播種するフラスコの枚数を決定する
面数（２）＝総細胞数（１）／５×１０５
計算５段フラスコ数（３）＝（（２）－１７５ｃｍ２フラスコ枚数）／５
播種５段フラスコ数（４）＝（３）を四捨五入
※１７５ｃｍ２フラスコは、観察用として少なくとも１枚、最後の継代時には工程管理試験用としてもう２枚（計３枚）播種する
２２．細胞懸濁液が以下の計算式で求めた液量になるよう、１０ｍｌピペットで細胞培養液を添加する
添加培養液量＝（１７５ｃｍ２フラスコ枚数＋５段フラスコ枚数×５）－細胞液量
２３．細胞培養液を５０ｍｌピペットで１７５ｃｍ２フラスコに２４ｍｌずつ、５段フラスコに１２０ｍｌずつ注入する
２４．２２．の細胞懸濁液を１０ｍｌピペットで１７５ｃｍ２フラスコに１ｍｌずつ、５段フラスコに５ｍｌずつ添加する
２５．細胞が均一になるようにフラスコを傾けてよく混和する
２６．フラスコをＣＯ２インキュベータに入れ３７±１℃、炭酸ガス濃度５±１％にて培養する。
１．アイソレーターが生産状態にあるか確認し、なっていない場合はアイソレーターマニュアルに従い生産開始の状態にする
２．以降の操作はアイソレーター内で行い、アイソレーターへの原料・試薬・資材の搬入出はアイソレーターマニュアルに従って実施する
３．フラスコをＣＯ２インキュベータから取り出す
４．少なくともフラスコ１枚を観察モジュールで観察し、写真を撮影する
５．１７５ｃｍ２フラスコは１０ｍｌピペットで、５段フラスコはデカンタで、フラスコ内の培養液を廃棄する
６．１０ｍｌピペットでＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを以下の量添加して、フラスコ底面全体に広げる
１７５ｃｍ２フラスコ ４ｍｌ
５段フラスコ ２０ｍｌ
７．フラスコをＣＯ２インキュベータ内に５分静置する
８．フラスコ側面を叩くなどして付着細胞を十分にはがす
９．１０ｍｌピペットでＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを５０ｍｌ遠心チューブに回収する１０．１０ｍｌピペットで生理食塩液を以下の量添加する
１７５ｃｍ２フラスコ ４ｍｌ
５段フラスコ ２０ｍｌ
１１．ピペッティングしてフラスコ底面をよくリンスし、９．の５０ｍｌ遠心チューブに回収する
１２．ＢＡＲＴ＝３，８００×ｇ，５分間，１５℃，アクセルｆａｓｔ，ブレーキｓｌｏｗで遠心する
１３．１０ｍｌピペットを用いて上清を静かに除去する
１４．１０ｍｌピペットでペレットに生理食塩液を１０ｍｌ加えて懸濁する
１５．ＢＡＲＴ＝３，８００×ｇ，５分間，１５℃，アクセルｆａｓｔ，ブレーキｓｌｏｗで遠心する
１６．１０ｍｌピペットを用いて上清を静かに除去する
１７．１０ｍｌピペットでペレットに培養液を１０ｍｌ加えて懸濁する
１８．細胞懸濁液から約０．１ｍｌを５ｍｌチューブに取る
１９．品質担当者に連絡し、出荷用パスボックスから検体を引き渡す
２０．品質担当者より試験結果を入手する（総細胞数（１））
２１．以下の計算式に従って播種するフラスコの枚数を決定する
面数（２）＝総細胞数（１）／５×１０５
計算５段フラスコ数（３）＝（（２）－１７５ｃｍ２フラスコ枚数）／５
播種５段フラスコ数（４）＝（３）を四捨五入
※１７５ｃｍ２フラスコは、観察用として少なくとも１枚、最後の継代時には工程管理試験用としてもう２枚（計３枚）播種する
２２．細胞懸濁液が以下の計算式で求めた液量になるよう、１０ｍｌピペットで細胞培養液を添加する
添加培養液量＝（１７５ｃｍ２フラスコ枚数＋５段フラスコ枚数×５）－細胞液量
２３．細胞培養液を５０ｍｌピペットで１７５ｃｍ２フラスコに２４ｍｌずつ、５段フラスコに１２０ｍｌずつ注入する
２４．２２．の細胞懸濁液を１０ｍｌピペットで１７５ｃｍ２フラスコに１ｍｌずつ、５段フラスコに５ｍｌずつ添加する
２５．細胞が均一になるようにフラスコを傾けてよく混和する
２６．フラスコをＣＯ２インキュベータに入れ３７±１℃、炭酸ガス濃度５±１％にて培養する。
いくつかの実施形態において、培養細胞の回収および洗浄は、典型的には、以下のように行われ得る。当業者であれば、使用する試薬の量および凍結／解凍温度、回数などの条件を適宜変更することができる。
１．アイソレーターが生産状態にあるか確認し、なっていない場合はアイソレーターマニュアルに従い生産開始の状態にする
２．以降の操作はアイソレーター内で行い、アイソレーターへの原料・試薬・資材の搬入出はアイソレーターマニュアルに従って実施する
３．フラスコをＣＯ２インキュベータから取り出す
４．少なくともフラスコ１枚を観察モジュールで観察し、写真を撮影する
５．１７５ｃｍ２フラスコは１０ｍｌピペットで、５段フラスコはデカンタで、フラスコ内の培養液を廃棄する
６．１０ｍｌピペットでＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを以下の量添加して、フラスコ底面全体に広げる
１７５ｃｍ２フラスコ ４ｍｌ
５段フラスコ ２０ｍｌ
７．フラスコをＣＯ２インキュベータ内に５分静置する
８．フラスコ側面を叩くなどして付着細胞を十分にはがす
９．１０ｍｌピペットでＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを５０ｍｌ遠心チューブに回収する
１０．１０ｍｌピペットで生理食塩液を以下の量添加する
１７５ｃｍ２フラスコ ４ｍｌ
５段フラスコ ２０ｍｌ
１１．ピペッティングしてフラスコ底面をよくリンスし、９．の５０ｍｌ遠心チューブに回収する
１２．ＢＡＲＴ＝３，８００×ｇ，５分間，１５℃，アクセルｆａｓｔ，ブレーキｓｌｏｗで遠心する
１３．１０ｍｌピペットを用いて上清を静かに除去する
１４．１０ｍｌピペットを用いてペレットを生理食塩液３０ｍｌで懸濁し、１本のチューブにまとめる
１５．ＢＡＲＴ＝３，８００×ｇ，５分間，１５℃，アクセルｆａｓｔ，ブレーキｓｌｏｗで遠心する
１６．遠心中に１０ｍｌ針付シリンジでアートセレブを抜き取り、５０ｍｌ遠心チューブに移しておく
１７．１０ｍｌピペットを用いて新たな５０ｍｌチューブに上清を静かに除去する
１８．１０ｍｌピペットでペレットにアートセレブを４ｍｌ加えて懸濁する
１９．細胞懸濁液から約０．１ｍｌを５ｍｌチューブに取り、規格試験（細胞数・生存率）用検体としてラベルを貼付する
２０．１７の上清から、以下の検体を抜き取る
・５０ｍｌチューブ３本に５ｍｌずつ（ａ，ｂ，ｃ）
・５０ｍｌチューブに５．３ｍｌ（ｄ）
・クライオチューブ２本に１ｍｌずつ（ｅ，ｆ）
２１．２０の各チューブにラベルを貼付する
２２．１９．の検体および２１．のａ，ｂ，ｃの検体を、それぞれ別のチャック付袋に入れ、出荷用パスボックスから品質担当者に引き渡す
ａ：迅速品質試験の無菌試験用
ｂ：迅速品質試験のエンドトキシン試験用
ｃ：規格試験の無菌・エンドトキシン試験用
２３．品質担当者より試験結果を入手する（細胞濃度（１））
２４．チューブｄに加える細胞液量を計算する
試験用液量（μｌ）＝（５．３×１０５／細胞濃度（１））×１０００
２５．マイクロピペットで、２４．で計算した液量の細胞懸濁液を抜き取り、２１．のチューブｄに添加する
２６．チューブｄからクライオチューブ２本に１００μｌずつ抜き取って保管用検体としてラベルを貼付し、残りは規格試験（マイコプラズマ否定試験）用検体とする
２７．投与に必要な細胞懸濁液量（２）を計算する
高用量群：細胞液量（ｍｌ）＝５×１０７／細胞濃度（１）
低用量群：細胞液量（ｍｌ）＝２×１０７／細胞濃度（１）
２８．２７．で計算した液量の細胞懸濁液をマイクロピペットで５ｍｌチューブに抜き取る
２９．ＢＡＲＴ＝５，８００×ｇ，５分間，１５℃，アクセルｆａｓｔ，ブレーキｓｌｏｗで遠心する
３０．最終液量が高用量群は１ｍｌ、低用量群は０．４ｍｌ
になるよう上清除去量を計算する
高用量群（μＬ）＝（懸濁液量（２）－１．０）×１０００
低用量群（μＬ）＝（懸濁液量（２）－０．４）×１０００
３１．３０．で計算した液量の上清をマイクロピペットで抜き取る
３２．ペレットを十分に懸濁する
３３．外観試験担当者に引き渡す
３４．２６．の規格試験（マイコプラズマ否定試験）用検体は、チャック付袋に入れて出荷用パスボックスから品質担当者に引き渡す
３５．２１．のチューブｅ，ｆおよび２６．のクライオチューブ２本は保管用検体として細胞保存室の－１５０℃フリーザーに保管する。
１．アイソレーターが生産状態にあるか確認し、なっていない場合はアイソレーターマニュアルに従い生産開始の状態にする
２．以降の操作はアイソレーター内で行い、アイソレーターへの原料・試薬・資材の搬入出はアイソレーターマニュアルに従って実施する
３．フラスコをＣＯ２インキュベータから取り出す
４．少なくともフラスコ１枚を観察モジュールで観察し、写真を撮影する
５．１７５ｃｍ２フラスコは１０ｍｌピペットで、５段フラスコはデカンタで、フラスコ内の培養液を廃棄する
６．１０ｍｌピペットでＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを以下の量添加して、フラスコ底面全体に広げる
１７５ｃｍ２フラスコ ４ｍｌ
５段フラスコ ２０ｍｌ
７．フラスコをＣＯ２インキュベータ内に５分静置する
８．フラスコ側面を叩くなどして付着細胞を十分にはがす
９．１０ｍｌピペットでＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを５０ｍｌ遠心チューブに回収する
１０．１０ｍｌピペットで生理食塩液を以下の量添加する
１７５ｃｍ２フラスコ ４ｍｌ
５段フラスコ ２０ｍｌ
１１．ピペッティングしてフラスコ底面をよくリンスし、９．の５０ｍｌ遠心チューブに回収する
１２．ＢＡＲＴ＝３，８００×ｇ，５分間，１５℃，アクセルｆａｓｔ，ブレーキｓｌｏｗで遠心する
１３．１０ｍｌピペットを用いて上清を静かに除去する
１４．１０ｍｌピペットを用いてペレットを生理食塩液３０ｍｌで懸濁し、１本のチューブにまとめる
１５．ＢＡＲＴ＝３，８００×ｇ，５分間，１５℃，アクセルｆａｓｔ，ブレーキｓｌｏｗで遠心する
１６．遠心中に１０ｍｌ針付シリンジでアートセレブを抜き取り、５０ｍｌ遠心チューブに移しておく
１７．１０ｍｌピペットを用いて新たな５０ｍｌチューブに上清を静かに除去する
１８．１０ｍｌピペットでペレットにアートセレブを４ｍｌ加えて懸濁する
１９．細胞懸濁液から約０．１ｍｌを５ｍｌチューブに取り、規格試験（細胞数・生存率）用検体としてラベルを貼付する
２０．１７の上清から、以下の検体を抜き取る
・５０ｍｌチューブ３本に５ｍｌずつ（ａ，ｂ，ｃ）
・５０ｍｌチューブに５．３ｍｌ（ｄ）
・クライオチューブ２本に１ｍｌずつ（ｅ，ｆ）
２１．２０の各チューブにラベルを貼付する
２２．１９．の検体および２１．のａ，ｂ，ｃの検体を、それぞれ別のチャック付袋に入れ、出荷用パスボックスから品質担当者に引き渡す
ａ：迅速品質試験の無菌試験用
ｂ：迅速品質試験のエンドトキシン試験用
ｃ：規格試験の無菌・エンドトキシン試験用
２３．品質担当者より試験結果を入手する（細胞濃度（１））
２４．チューブｄに加える細胞液量を計算する
試験用液量（μｌ）＝（５．３×１０５／細胞濃度（１））×１０００
２５．マイクロピペットで、２４．で計算した液量の細胞懸濁液を抜き取り、２１．のチューブｄに添加する
２６．チューブｄからクライオチューブ２本に１００μｌずつ抜き取って保管用検体としてラベルを貼付し、残りは規格試験（マイコプラズマ否定試験）用検体とする
２７．投与に必要な細胞懸濁液量（２）を計算する
高用量群：細胞液量（ｍｌ）＝５×１０７／細胞濃度（１）
低用量群：細胞液量（ｍｌ）＝２×１０７／細胞濃度（１）
２８．２７．で計算した液量の細胞懸濁液をマイクロピペットで５ｍｌチューブに抜き取る
２９．ＢＡＲＴ＝５，８００×ｇ，５分間，１５℃，アクセルｆａｓｔ，ブレーキｓｌｏｗで遠心する
３０．最終液量が高用量群は１ｍｌ、低用量群は０．４ｍｌ
になるよう上清除去量を計算する
高用量群（μＬ）＝（懸濁液量（２）－１．０）×１０００
低用量群（μＬ）＝（懸濁液量（２）－０．４）×１０００
３１．３０．で計算した液量の上清をマイクロピペットで抜き取る
３２．ペレットを十分に懸濁する
３３．外観試験担当者に引き渡す
３４．２６．の規格試験（マイコプラズマ否定試験）用検体は、チャック付袋に入れて出荷用パスボックスから品質担当者に引き渡す
３５．２１．のチューブｅ，ｆおよび２６．のクライオチューブ２本は保管用検体として細胞保存室の－１５０℃フリーザーに保管する。
（培養された細胞の遺伝子発現プロファイルの確認）
いくつかの実施形態において、培養された細胞における遺伝子プロファイルを確認してもよい。特定の実施形態において、細胞は、幹細胞（例えば、骨髄由来間葉系幹細胞）であり得、例えば、実施例４に従って、遺伝子プロファイルが確認され得る。いくつかの実施形態において、培養された細胞において、例えば、以下
1. Protein localization to cytoskeleton
2. Regulation of mitotic metaphase/anaphase transition
3. Cell cycle checkpoint
4. Chromosome segregation
5. Extracellular matrix organization
6. Wound healing
7. Cell division
8. Mitotic Cell Cycle process
9. Tissue development
10. Animal organ development
からなる群から選択される１つまたは複数に関連する遺伝子の発現が亢進され得る。好ましくは、細胞分裂に関連する上記２，３，７、および組織修復に関連する上記６からなる群から選択される１つまたは複数に関連する遺伝子の発現が亢進され得る。
いくつかの実施形態において、培養された細胞における遺伝子プロファイルを確認してもよい。特定の実施形態において、細胞は、幹細胞（例えば、骨髄由来間葉系幹細胞）であり得、例えば、実施例４に従って、遺伝子プロファイルが確認され得る。いくつかの実施形態において、培養された細胞において、例えば、以下
1. Protein localization to cytoskeleton
2. Regulation of mitotic metaphase/anaphase transition
3. Cell cycle checkpoint
4. Chromosome segregation
5. Extracellular matrix organization
6. Wound healing
7. Cell division
8. Mitotic Cell Cycle process
9. Tissue development
10. Animal organ development
からなる群から選択される１つまたは複数に関連する遺伝子の発現が亢進され得る。好ましくは、細胞分裂に関連する上記２，３，７、および組織修復に関連する上記６からなる群から選択される１つまたは複数に関連する遺伝子の発現が亢進され得る。
いくつかの実施形態において、培養された細胞において、以下
1. Histone dephosphorylation
2. Very-low-density lipoprotein particle clearance
3. regulation of cardioblast proliferation
4. Chylomicron remnant clearance
5. pharyngeal system development
6. artery morphogenesis
7. regulation of bone mineralization
8. Response to cAMP
9. negative regulation of small molecule metabolic process
10. Regulation of receptor signaling pathway via JAK-STAT
11. Negative regulation of neuron apoptotic process
12. Extracellular matrix organization
13. Positive regulation of peptidyl-tyrosine phosphorylation
14. Response to reactive oxygen species
15. Positive regulation of stress-activated MAPK cascade
16. Positive regulation of protein kinase B signaling
17. Regulation of JNK cascade
18. Striated muscle tissue development
19. Regulation of epithelial cell proliferation
20. Regulation of ERK1 and ERK2 cascade
21. Regulation of MAP kinase activity
22. Positive regulation of protein serine/threonine kinase activity
23. Response to acid chemical
24. Muscle structure development
25. Cytokine-mediated signaling pathway
26. Cellular response to hormone stimulus
27. Response to lipid
28. Cellular response to growth factor stimulus
29. Enzyme linked receptor protein signaling pathway
30. Regulation of cell adhesion
31. Positive regulation of cell differentiation
32. Positive regulation of cell death
33. Regulation of cell migration
32. Anatomical structure formation involved in morphogenesis
33. Positive regulation of cell population proliferation
34. Cellular response to oxygen-containing compound
35. Animal organ morphogenesis
36. Cell migration
37. Positive regulation of multicellular organismal process
38. Regulation of cell cycle
39. Positive regulation of transcription, DNA-templated
40. Regulation of immune system process
41. Cell differentiation
からなる群から選択される１つまたは複数に関連する遺伝子の発現が低下され得る。好ましくは、細胞分化促進に関連する上記６，７，１８，１９，２４，３２，３７，４１および細胞死の促進に関連する上記３２からなる群から選択される１つまたは複数に関連する遺伝子の発現が低下され得る。
1. Histone dephosphorylation
2. Very-low-density lipoprotein particle clearance
3. regulation of cardioblast proliferation
4. Chylomicron remnant clearance
5. pharyngeal system development
6. artery morphogenesis
7. regulation of bone mineralization
8. Response to cAMP
9. negative regulation of small molecule metabolic process
10. Regulation of receptor signaling pathway via JAK-STAT
11. Negative regulation of neuron apoptotic process
12. Extracellular matrix organization
13. Positive regulation of peptidyl-tyrosine phosphorylation
14. Response to reactive oxygen species
15. Positive regulation of stress-activated MAPK cascade
16. Positive regulation of protein kinase B signaling
17. Regulation of JNK cascade
18. Striated muscle tissue development
19. Regulation of epithelial cell proliferation
20. Regulation of ERK1 and ERK2 cascade
21. Regulation of MAP kinase activity
22. Positive regulation of protein serine/threonine kinase activity
23. Response to acid chemical
24. Muscle structure development
25. Cytokine-mediated signaling pathway
26. Cellular response to hormone stimulus
27. Response to lipid
28. Cellular response to growth factor stimulus
29. Enzyme linked receptor protein signaling pathway
30. Regulation of cell adhesion
31. Positive regulation of cell differentiation
32. Positive regulation of cell death
33. Regulation of cell migration
32. Anatomical structure formation involved in morphogenesis
33. Positive regulation of cell population proliferation
34. Cellular response to oxygen-containing compound
35. Animal organ morphogenesis
36. Cell migration
37. Positive regulation of multicellular organismal process
38. Regulation of cell cycle
39. Positive regulation of transcription, DNA-templated
40. Regulation of immune system process
41. Cell differentiation
からなる群から選択される１つまたは複数に関連する遺伝子の発現が低下され得る。好ましくは、細胞分化促進に関連する上記６，７，１８，１９，２４，３２，３７，４１および細胞死の促進に関連する上記３２からなる群から選択される１つまたは複数に関連する遺伝子の発現が低下され得る。
（治療法・治療技術）
別の局面において、本開示は、それを必要とする個体において細胞注入療法を行う方法であって、該方法は、該個体から得られた血小板またはその同等物を凍結解凍して、血小板溶解物を得る工程、該個体からの細胞を、該血小板溶解物を非動化せずに用いて培養する工程、および該培養された細胞の有効量を、該個体に注入する工程を包含する方法を提供する。
別の局面において、本開示は、それを必要とする個体において細胞注入療法を行う方法であって、該方法は、該個体から得られた血小板またはその同等物を凍結解凍して、血小板溶解物を得る工程、該個体からの細胞を、該血小板溶解物を非動化せずに用いて培養する工程、および該培養された細胞の有効量を、該個体に注入する工程を包含する方法を提供する。
（脳梗塞の治療における使用）
典型的には、調製された細胞は、脳梗塞患者において以下のように使用され得る。
（１）対象患者
脳梗塞急性期（発症早期）の患者であって、同意取得時における年齢が２０歳以上、８０歳未満である；同意取得時において脳梗塞発症後１４日以内である；内頚動脈灌流域に生じた脳梗塞である；脳梗塞発症前のｍＲＳが０又は１である；脳梗塞による中等～重度の神経症状（ＮＩＨＳＳ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔｒｏｋｅ Ｓｃａｌｅ）：≧６）を有する（ただしＮＩＨＳＳの「５．上肢の運動」と「６．下肢の運動」項目において総計６点以上であること）という５つの基準を満たし、所定の除外基準に抵触せず、かつ本研究に同意が得られた患者を対象とする。
（２）骨髄幹細胞の調製及び投与
症例登録後、速やかに患者の骨髄を採取し、北海道大学病院臨床研究開発センター細胞プロセッシング室において細胞培養および骨髄幹細胞の調製を施行した。調製した骨髄幹細胞（２０００万個又は５０００万個／患者）を、骨髄採取の３～５週後に患者の脳内に直接投与する。
典型的には、調製された細胞は、脳梗塞患者において以下のように使用され得る。
（１）対象患者
脳梗塞急性期（発症早期）の患者であって、同意取得時における年齢が２０歳以上、８０歳未満である；同意取得時において脳梗塞発症後１４日以内である；内頚動脈灌流域に生じた脳梗塞である；脳梗塞発症前のｍＲＳが０又は１である；脳梗塞による中等～重度の神経症状（ＮＩＨＳＳ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔｒｏｋｅ Ｓｃａｌｅ）：≧６）を有する（ただしＮＩＨＳＳの「５．上肢の運動」と「６．下肢の運動」項目において総計６点以上であること）という５つの基準を満たし、所定の除外基準に抵触せず、かつ本研究に同意が得られた患者を対象とする。
（２）骨髄幹細胞の調製及び投与
症例登録後、速やかに患者の骨髄を採取し、北海道大学病院臨床研究開発センター細胞プロセッシング室において細胞培養および骨髄幹細胞の調製を施行した。調製した骨髄幹細胞（２０００万個又は５０００万個／患者）を、骨髄採取の３～５週後に患者の脳内に直接投与する。
以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
以下、実施例に基づいて本開示をより具体的に説明する。
（実施例１：凍結解凍の回数と栄養因子抽出の違い）
（材料および方法）
液体の状態で採取された血小板濃厚液（日赤作成）を凍結用バック（ニプロ社のフローズバッグＦ－１００；カタログ番号８９－１００、５０ｍｌ）に入れ替え、－８０℃で保管した。その後、４℃の冷蔵庫で一晩かけて解凍した（「解凍のみ」）。これを－２０℃もしくは－８０℃で一晩かけて凍結させ、再び４℃で解凍した（「解凍＋１回凍結」）。同様の手順をおこなったものを「解凍＋２回凍結」、さらにもう１回凍結解凍したものを「解凍＋３回凍結」で示す。得られた血小板溶解物（１０ｍｌ）にヘパリン０．２５ｍｌ混和し、複数回の遠心の後に、ＭＥＭα１００ｍｌに混ぜて、フィルター（０．４５μｍ）に通した。その後ＥＬＩＳＡを行った。
（材料および方法）
液体の状態で採取された血小板濃厚液（日赤作成）を凍結用バック（ニプロ社のフローズバッグＦ－１００；カタログ番号８９－１００、５０ｍｌ）に入れ替え、－８０℃で保管した。その後、４℃の冷蔵庫で一晩かけて解凍した（「解凍のみ」）。これを－２０℃もしくは－８０℃で一晩かけて凍結させ、再び４℃で解凍した（「解凍＋１回凍結」）。同様の手順をおこなったものを「解凍＋２回凍結」、さらにもう１回凍結解凍したものを「解凍＋３回凍結」で示す。得られた血小板溶解物（１０ｍｌ）にヘパリン０．２５ｍｌ混和し、複数回の遠心の後に、ＭＥＭα１００ｍｌに混ぜて、フィルター（０．４５μｍ）に通した。その後ＥＬＩＳＡを行った。
（結果）
－２０℃も－８０℃も区別しない結果を以下の（Ａ／Ｂ／Ｃ－１）に示し、－２０℃と－８０℃とを比較した結果を（Ａ／Ｂ／Ｃ－２）に示す。
－２０℃も－８０℃も区別しない結果を以下の（Ａ／Ｂ／Ｃ－１）に示し、－２０℃と－８０℃とを比較した結果を（Ａ／Ｂ／Ｃ－２）に示す。
（Ａ－１）血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）
表１に、各試料中の血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）の量をまとめた。図１は、表１をグラフに表したものである。表１に示されるように、凍結解凍を繰り返すことで、溶液中のＰＤＧＦが増加した。ＦＢＳに含まれるＰＤＧＦは非常に少なかった。市販ＰＬと「解凍のみ」は同程度であった。凍結した試料では、ＰＤＧＦが多く含まれており、「解凍＋凍結3回」が最も多かった。市販ＰＬは、ＰＵＲＥ：ＨＥＬＩＯＳ ＵｌｔｒａＧＲＯ－ＰＵＲＥ、ＰＵＲＥ ＧＭＰ：ＨＥＬＩＯＳ ＵｌｔｒａＧＲＯ－ＰＵＲＥ（ＧＭＰ Ｇｒａｄｅ）、およびＡｄｖａｎｃｅｄ ＧＭＰ：ＨＥＬＩＯＳ ＵｌｔｒａＧＲＯ－Ａｄｖａｎｃｅｄ（ＧＭＰ Ｇｒａｄｅ）の混合物として使用された。
表１に、各試料中の血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）の量をまとめた。図１は、表１をグラフに表したものである。表１に示されるように、凍結解凍を繰り返すことで、溶液中のＰＤＧＦが増加した。ＦＢＳに含まれるＰＤＧＦは非常に少なかった。市販ＰＬと「解凍のみ」は同程度であった。凍結した試料では、ＰＤＧＦが多く含まれており、「解凍＋凍結3回」が最も多かった。市販ＰＬは、ＰＵＲＥ：ＨＥＬＩＯＳ ＵｌｔｒａＧＲＯ－ＰＵＲＥ、ＰＵＲＥ ＧＭＰ：ＨＥＬＩＯＳ ＵｌｔｒａＧＲＯ－ＰＵＲＥ（ＧＭＰ Ｇｒａｄｅ）、およびＡｄｖａｎｃｅｄ ＧＭＰ：ＨＥＬＩＯＳ ＵｌｔｒａＧＲＯ－Ａｄｖａｎｃｅｄ（ＧＭＰ Ｇｒａｄｅ）の混合物として使用された。
（Ａ－２）ＰＤＧＦ
表２は、－２０℃と－８０℃で凍結した試料の比較を示す。図２は、表２をグラフに表したものである。凍結解凍を－２０℃もしくは－８０℃で繰り返すことで、ＰＤＧＦが増加し（「解凍のみ」に比較し－８０℃で凍結した「解凍＋３回凍結」は２．２倍）、凍結３回目で－８０℃の方が－２０℃よりも多くＰＤＧＦが抽出された。
表２は、－２０℃と－８０℃で凍結した試料の比較を示す。図２は、表２をグラフに表したものである。凍結解凍を－２０℃もしくは－８０℃で繰り返すことで、ＰＤＧＦが増加し（「解凍のみ」に比較し－８０℃で凍結した「解凍＋３回凍結」は２．２倍）、凍結３回目で－８０℃の方が－２０℃よりも多くＰＤＧＦが抽出された。
（Ｂ－１）脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）
表３に、各試料中の脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の量をまとめた。図３は、表３をグラフに表したものである。ＰＤＧＦと同様に、凍結解凍を繰り返すことで、溶液中のＢＤＮＦが増加した（表３）。ＦＢＳにＢＤＮＦはほとんど含まれていなかった。ＢＤＮＦ量は「解凍のみ」よりも市販品で多かったが、凍結解凍１～３回の試料でこれらよりもさらに多かった。「解凍＋凍結１回」よりも「解凍＋凍結２回」および「解凍＋凍結３回」の方が多く、「解凍＋凍結２回」および「解凍＋凍結３回」におけるＢＤＮＦ量は同程度であった。
表３に、各試料中の脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の量をまとめた。図３は、表３をグラフに表したものである。ＰＤＧＦと同様に、凍結解凍を繰り返すことで、溶液中のＢＤＮＦが増加した（表３）。ＦＢＳにＢＤＮＦはほとんど含まれていなかった。ＢＤＮＦ量は「解凍のみ」よりも市販品で多かったが、凍結解凍１～３回の試料でこれらよりもさらに多かった。「解凍＋凍結１回」よりも「解凍＋凍結２回」および「解凍＋凍結３回」の方が多く、「解凍＋凍結２回」および「解凍＋凍結３回」におけるＢＤＮＦ量は同程度であった。
（Ｂ－２）ＢＤＮＦ
表４は、－２０℃と－８０℃で凍結した試料の比較を示す。図４は、表４をグラフに表したものである。凍結解凍を－２０℃もしくは－８０℃で繰り返すことで、ＢＤＮＦが増加した（「解凍のみ」に比較して－８０℃で凍結した「解凍＋３回凍結」で１．８倍）。「解凍＋３回凍結」では－８０℃で凍結した方が－２０℃よりもＢＤＮＦが多く抽出された。
表４は、－２０℃と－８０℃で凍結した試料の比較を示す。図４は、表４をグラフに表したものである。凍結解凍を－２０℃もしくは－８０℃で繰り返すことで、ＢＤＮＦが増加した（「解凍のみ」に比較して－８０℃で凍結した「解凍＋３回凍結」で１．８倍）。「解凍＋３回凍結」では－８０℃で凍結した方が－２０℃よりもＢＤＮＦが多く抽出された。
（Ｃ－１）トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）
表５に、各試料中のトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）の量をまとめた。図５は、表５をグラフに表したものである。凍結解凍を繰り返すことで、溶液中のＴＧＦβ１が増加した。ＦＢＳにＴＧＦβ１はほとんど含まれていなかった。ＴＧＦβ１量は「解凍のみ」よりも市販品で高かったが、凍結解凍１～３回の試料でこれらよりもさらに多かった。「解凍＋凍結１回」よりも「解凍＋凍結２回」および「解凍＋凍結３回」の方が多く、「解凍＋凍結２回」および「解凍＋凍結３回」におけるＴＧＦβ１量は同程度であった。
表５に、各試料中のトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）の量をまとめた。図５は、表５をグラフに表したものである。凍結解凍を繰り返すことで、溶液中のＴＧＦβ１が増加した。ＦＢＳにＴＧＦβ１はほとんど含まれていなかった。ＴＧＦβ１量は「解凍のみ」よりも市販品で高かったが、凍結解凍１～３回の試料でこれらよりもさらに多かった。「解凍＋凍結１回」よりも「解凍＋凍結２回」および「解凍＋凍結３回」の方が多く、「解凍＋凍結２回」および「解凍＋凍結３回」におけるＴＧＦβ１量は同程度であった。
（Ｃ－２）ＴＧＦβ１
表６は、－２０℃と－８０℃で凍結した試料の比較を示す。図６は、表６をグラフに表したものである。凍結解凍を－２０℃もしくは－８０℃で繰り返すことで、ＴＧＦβ１が増加した（「解凍のみ」に比較して－８０℃で凍結した「解凍＋３回凍結」で１．４倍）。「解凍＋３回凍結」では－８０℃で凍結した方が－２０℃よりもＴＧＦβ１が多く抽出された。
表６は、－２０℃と－８０℃で凍結した試料の比較を示す。図６は、表６をグラフに表したものである。凍結解凍を－２０℃もしくは－８０℃で繰り返すことで、ＴＧＦβ１が増加した（「解凍のみ」に比較して－８０℃で凍結した「解凍＋３回凍結」で１．４倍）。「解凍＋３回凍結」では－８０℃で凍結した方が－２０℃よりもＴＧＦβ１が多く抽出された。
（考察）
以上の結果から、凍結解凍を複数回、特に３回繰り返すことにより、血小板溶解物中の栄養因子が増加することが明らかになり、このような血小板溶解物を有利に細胞培養に使用し得ることが示唆される。また、凍結温度を－８０℃とすることにより、多くの栄養因子が分泌された。－８０℃で凍結することにより、凍結時間も短縮され、細胞培養も効率的に行われることが示唆されるため、有利である。したがって、凍結解凍は、２回以上行うことが好ましく、－２０℃よりも低い温度（例えば、－８０℃）で行うことがより好ましいと考えられる。
以上の結果から、凍結解凍を複数回、特に３回繰り返すことにより、血小板溶解物中の栄養因子が増加することが明らかになり、このような血小板溶解物を有利に細胞培養に使用し得ることが示唆される。また、凍結温度を－８０℃とすることにより、多くの栄養因子が分泌された。－８０℃で凍結することにより、凍結時間も短縮され、細胞培養も効率的に行われることが示唆されるため、有利である。したがって、凍結解凍は、２回以上行うことが好ましく、－２０℃よりも低い温度（例えば、－８０℃）で行うことがより好ましいと考えられる。
（実施例２：凍結解凍後の非動化の有無による栄養因子抽出の違い）
（材料および方法）
液体の状態で採取された血小板濃厚液（日赤作成）を凍結用バック（ニプロ社のフローズバッグＦ－１００；カタログ番号８９－１００、５０ｍｌ）に入れ替え、－８０℃で保管した。その後、４℃の冷蔵庫で一晩かけて解凍した（「解凍のみ」）。様々な方法で凍結解凍を行い、得られた血小板溶解物（１０ｍｌ）にヘパリン０．２５ｍｌ混和し、複数回の遠心をした。その後作成した血小板溶解物を、非動化（５８℃で１時間）するものと非動化しない（「非動化なし」）ものに分けて処理を行った。その後ＭＥＭα１００ｍｌに混ぜて、フィルター（０．４５μｍ）を通した（詰まった場合にはフィルターを交換）。その後ＥＬＩＳＡを行った。
（材料および方法）
液体の状態で採取された血小板濃厚液（日赤作成）を凍結用バック（ニプロ社のフローズバッグＦ－１００；カタログ番号８９－１００、５０ｍｌ）に入れ替え、－８０℃で保管した。その後、４℃の冷蔵庫で一晩かけて解凍した（「解凍のみ」）。様々な方法で凍結解凍を行い、得られた血小板溶解物（１０ｍｌ）にヘパリン０．２５ｍｌ混和し、複数回の遠心をした。その後作成した血小板溶解物を、非動化（５８℃で１時間）するものと非動化しない（「非動化なし」）ものに分けて処理を行った。その後ＭＥＭα１００ｍｌに混ぜて、フィルター（０．４５μｍ）を通した（詰まった場合にはフィルターを交換）。その後ＥＬＩＳＡを行った。
（結果）
非動化をしないことでＰＤＧＦは２０％、ＢＤＮＦは１０％ほど増えたが、ＴＧＦβ１に変化はなかった。非動化をしないことでフィルターが詰まって交換する工程は大幅に削減された（１／１０程度）。
非動化をしないことでＰＤＧＦは２０％、ＢＤＮＦは１０％ほど増えたが、ＴＧＦβ１に変化はなかった。非動化をしないことでフィルターが詰まって交換する工程は大幅に削減された（１／１０程度）。
（Ａ）ＰＤＧＦ
表７に、非動化した試料および非動化していない試料におけるＰＤＧＦの量をまとめる。図７は、表７をグラフで表したものである。
表７に、非動化した試料および非動化していない試料におけるＰＤＧＦの量をまとめる。図７は、表７をグラフで表したものである。
（Ｂ）ＢＤＮＦ
表８に、非動化した試料および非動化していない試料におけるＢＤＮＦの量をまとめる。図８は、表８をグラフで表したものである。
表８に、非動化した試料および非動化していない試料におけるＢＤＮＦの量をまとめる。図８は、表８をグラフで表したものである。
（Ｃ）ＴＧＦβ１
表９に、非動化した試料および非動化していない試料におけるＴＧＦβ１の量をまとめる。図９は、表９をグラフで表したものである。
表９に、非動化した試料および非動化していない試料におけるＴＧＦβ１の量をまとめる。図９は、表９をグラフで表したものである。
（実施例３：細胞培養速度の違い）
（材料および方法）
表１０に示すように、骨髄幹細胞（ｎ＝３）を非動化の有無と凍結解凍２回（すでに凍結されたものを使用するため、合計で３回の凍結解凍）の有無に分けて、４つの方法（非動化〇凍結解凍×、非動化×凍結解凍×、非動化〇凍結解凍〇、非動化×凍結解凍〇）で培養した。
（材料および方法）
表１０に示すように、骨髄幹細胞（ｎ＝３）を非動化の有無と凍結解凍２回（すでに凍結されたものを使用するため、合計で３回の凍結解凍）の有無に分けて、４つの方法（非動化〇凍結解凍×、非動化×凍結解凍×、非動化〇凍結解凍〇、非動化×凍結解凍〇）で培養した。
新鮮な骨髄液を採取し、以下の３つの工程で細胞数をカウント、Ａを基準として何倍多く増えていたかを計算した。
工程１：２５ｃｍ２のフラスコに１ｘ１０７個の単核球を播種し培養、８日後にカウント工程２：工程１の細胞を採取、全細胞のうち４５０００個を再播種、１週後カウント
工程３：工程２の細胞を採取、全細胞のうち４５０００個を再播種、１週後カウント
工程１：２５ｃｍ２のフラスコに１ｘ１０７個の単核球を播種し培養、８日後にカウント工程２：工程１の細胞を採取、全細胞のうち４５０００個を再播種、１週後カウント
工程３：工程２の細胞を採取、全細胞のうち４５０００個を再播種、１週後カウント
（結果）
３回の凍結解凍と非動化を行わないことによって、同じ時間内で作ることが出来る細胞数は約８倍ほど増加した（図１０）。また興味深いことに３回の凍結解凍と無－非動化はともに栄養因子が増加したが、予想外にも相乗効果的に細胞増殖が早まっていた。自分のＰＬ（骨髄液を採取した被験体から得られたＰＬ、すなわち自家ＰＬ）と他人のＰＬ（他家ＰＬ）で無非動化により培養速度に違いは見られなかった。
３回の凍結解凍と非動化を行わないことによって、同じ時間内で作ることが出来る細胞数は約８倍ほど増加した（図１０）。また興味深いことに３回の凍結解凍と無－非動化はともに栄養因子が増加したが、予想外にも相乗効果的に細胞増殖が早まっていた。自分のＰＬ（骨髄液を採取した被験体から得られたＰＬ、すなわち自家ＰＬ）と他人のＰＬ（他家ＰＬ）で無非動化により培養速度に違いは見られなかった。
（実施例４：幹細胞の品質）
（栄養因子分泌力）
（材料および方法）
培養上清の栄養因子（ｂＮＧＦ，ＨＧＦ）をＥＬＩＳＡで検出した。試料はＰ３の培養上清を使用し、以下の方法で培養した。培養上清を用いるため、結果を出す際には細胞数で除することで１細胞あたりの濃度を計算し、比較した。
他家従来法：実施例１に従って、１回解凍のみの他家血小板溶解物を使用してヒトＢＭＳＣ（骨髄由来間葉系幹細胞）を培養した。
自家－８０℃新法：実施例３に従って、３回－８０°で凍結解凍し、かつ非動化していない自家血小板溶解物を使用してヒトＢＭＳＣを培養した。
（栄養因子分泌力）
（材料および方法）
培養上清の栄養因子（ｂＮＧＦ，ＨＧＦ）をＥＬＩＳＡで検出した。試料はＰ３の培養上清を使用し、以下の方法で培養した。培養上清を用いるため、結果を出す際には細胞数で除することで１細胞あたりの濃度を計算し、比較した。
他家従来法：実施例１に従って、１回解凍のみの他家血小板溶解物を使用してヒトＢＭＳＣ（骨髄由来間葉系幹細胞）を培養した。
自家－８０℃新法：実施例３に従って、３回－８０°で凍結解凍し、かつ非動化していない自家血小板溶解物を使用してヒトＢＭＳＣを培養した。
（結果）
結果を図１１に示す。培養液中の全ＨＧＦ量は自家－８０℃新法で上がっていたが、自家－８０℃新法は細胞数が多くなっているため細胞数で割るとわずかに少ない結果（有意差無し）であった。またｂＮＧＦは一つの細胞当たり同じ程度の分泌量であった。よってまとめると培養速度は速くなったが出来た細胞が分泌する栄養因子の量は変わらない（同じ程度）であり、粗悪な細胞が作成されたというわけではなかった。
結果を図１１に示す。培養液中の全ＨＧＦ量は自家－８０℃新法で上がっていたが、自家－８０℃新法は細胞数が多くなっているため細胞数で割るとわずかに少ない結果（有意差無し）であった。またｂＮＧＦは一つの細胞当たり同じ程度の分泌量であった。よってまとめると培養速度は速くなったが出来た細胞が分泌する栄養因子の量は変わらない（同じ程度）であり、粗悪な細胞が作成されたというわけではなかった。
さらに、図１２に、１５００個／ｃｍ２で培養して４日後および７日後の細胞数の結果を示す。示されるように、自家－８０℃新法で作製されたＰＬは、従来法と比較して顕著に細胞数が増加していた（図１２）。
（遺伝子発現）
（材料および方法）
１回解凍のみの他家ＰＬで作成したヒトＢＭＳＣ（ｎ＝４）（以下従来法）と３回凍結解凍＆無－非動化した自家ＰＬで作成したヒトＢＭＳＣ（ｎ＝３）（以下自家－８０℃新法）をマイクロアレー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ， ＧｅｎｅＣｈｉｐ ＷＴ ＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ）で解析した。結果をＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｖｉｅｗｅｒ（Ｋｕｒａｂｏ）を用いて、従来法をコントロールに自家－８０℃新法で発現が亢進している遺伝子（ｐ＜０．０５ｏｒ０．０１、かつＬｏｇ ｒａｔｉｏ＞１ｏｒ３（発現比２ｏｒ８倍以上））、もしくは低下（ｐ＜０．０５ｏｒ０．０１、かつ、Ｌｏｇ ｒａｔｉｏ＜－１ｏｒ－３（発現比１／２ｏｒ１／８倍以下））の遺伝子を抽出した。
（材料および方法）
１回解凍のみの他家ＰＬで作成したヒトＢＭＳＣ（ｎ＝４）（以下従来法）と３回凍結解凍＆無－非動化した自家ＰＬで作成したヒトＢＭＳＣ（ｎ＝３）（以下自家－８０℃新法）をマイクロアレー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ， ＧｅｎｅＣｈｉｐ ＷＴ ＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ）で解析した。結果をＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｖｉｅｗｅｒ（Ｋｕｒａｂｏ）を用いて、従来法をコントロールに自家－８０℃新法で発現が亢進している遺伝子（ｐ＜０．０５ｏｒ０．０１、かつＬｏｇ ｒａｔｉｏ＞１ｏｒ３（発現比２ｏｒ８倍以上））、もしくは低下（ｐ＜０．０５ｏｒ０．０１、かつ、Ｌｏｇ ｒａｔｉｏ＜－１ｏｒ－３（発現比１／２ｏｒ１／８倍以下））の遺伝子を抽出した。
（結果）
厳しく判定すると２００００個の遺伝子のうち、１００個が明らかに発現亢進していて、１００個が明らかに発現低下していた。それらをＧＯ ｔｅｒｍで関係性を調べたところ、発現亢進には細胞分裂（２，３，７）に関係するもの、組織修復（６）に関係するものがあった。一方、低下しているものは細胞分化促進（６，７，１８，１９，２４，３２，３７，４１→つまり未分化がキープされる）や細胞死を促す因子（３２、つまり生存率上昇）であった。
厳しく判定すると２００００個の遺伝子のうち、１００個が明らかに発現亢進していて、１００個が明らかに発現低下していた。それらをＧＯ ｔｅｒｍで関係性を調べたところ、発現亢進には細胞分裂（２，３，７）に関係するもの、組織修復（６）に関係するものがあった。一方、低下しているものは細胞分化促進（６，７，１８，１９，２４，３２，３７，４１→つまり未分化がキープされる）や細胞死を促す因子（３２、つまり生存率上昇）であった。
その中で、一番厳しい亢進しているDをPanther GO analysisで分析すると
1. Protein localization to cytoskeleton
2. Regulation of mitotic metaphase/anaphase transition
3. Cell cycle checkpoint
4. Chromosome segregation
5. Extracellular matrix organization
6. Wound healing
7. Cell division
8. Mitotic Cell Cycle process
9. Tissue development
10. Animal organ development
に関係する遺伝子の発現が亢進していた。
1. Protein localization to cytoskeleton
2. Regulation of mitotic metaphase/anaphase transition
3. Cell cycle checkpoint
4. Chromosome segregation
5. Extracellular matrix organization
6. Wound healing
7. Cell division
8. Mitotic Cell Cycle process
9. Tissue development
10. Animal organ development
に関係する遺伝子の発現が亢進していた。
また同様に一番厳しいHをPanther GO analysisで分析すると
1. Histone dephosphorylation
2. Very-low-density lipoprotein particle clearance
3. regulation of cardioblast proliferation
4. Chylomicron remnant clearance
5. pharyngeal system development
6. artery morphogenesis
7. regulation of bone mineralization
8. Response to cAMP
9. negative regulation of small molecule metabolic process
10. Regulation of receptor signaling pathway via JAK-STAT
11. Negative regulation of neuron apoptotic process
12. Extracellular matrix organization
13. Positive regulation of peptidyl-tyrosine phosphorylation
14. Response to reactive oxygen species
15. Positive regulation of stress-activated MAPK cascade
16. Positive regulation of protein kinase B signaling
17. Regulation of JNK cascade
18. Striated muscle tissue development
19. Regulation of epithelial cell proliferation
20. Regulation of ERK1 and ERK2 cascade
21. Regulation of MAP kinase activity
22. Positive regulation of protein serine/threonine kinase activity
23. Response to acid chemical
24. Muscle structure development
25. Cytokine-mediated signaling pathway
26. Cellular response to hormone stimulus
27. Response to lipid
28. Cellular response to growth factor stimulus
29. Enzyme linked receptor protein signaling pathway
30. Regulation of cell adhesion
31. Positive regulation of cell differentiation
32. Positive regulation of cell death
33. Regulation of cell migration
32. Anatomical structure formation involved in morphogenesis
33. Positive regulation of cell population proliferation
34. Cellular response to oxygen-containing compound
35. Animal organ morphogenesis
36. Cell migration
37. Positive regulation of multicellular organismal process
38. Regulation of cell cycle
39. Positive regulation of transcription, DNA-templated
40. Regulation of immune system process
41. Cell differentiation
に関係する遺伝子の発現が低下していた。
1. Histone dephosphorylation
2. Very-low-density lipoprotein particle clearance
3. regulation of cardioblast proliferation
4. Chylomicron remnant clearance
5. pharyngeal system development
6. artery morphogenesis
7. regulation of bone mineralization
8. Response to cAMP
9. negative regulation of small molecule metabolic process
10. Regulation of receptor signaling pathway via JAK-STAT
11. Negative regulation of neuron apoptotic process
12. Extracellular matrix organization
13. Positive regulation of peptidyl-tyrosine phosphorylation
14. Response to reactive oxygen species
15. Positive regulation of stress-activated MAPK cascade
16. Positive regulation of protein kinase B signaling
17. Regulation of JNK cascade
18. Striated muscle tissue development
19. Regulation of epithelial cell proliferation
20. Regulation of ERK1 and ERK2 cascade
21. Regulation of MAP kinase activity
22. Positive regulation of protein serine/threonine kinase activity
23. Response to acid chemical
24. Muscle structure development
25. Cytokine-mediated signaling pathway
26. Cellular response to hormone stimulus
27. Response to lipid
28. Cellular response to growth factor stimulus
29. Enzyme linked receptor protein signaling pathway
30. Regulation of cell adhesion
31. Positive regulation of cell differentiation
32. Positive regulation of cell death
33. Regulation of cell migration
32. Anatomical structure formation involved in morphogenesis
33. Positive regulation of cell population proliferation
34. Cellular response to oxygen-containing compound
35. Animal organ morphogenesis
36. Cell migration
37. Positive regulation of multicellular organismal process
38. Regulation of cell cycle
39. Positive regulation of transcription, DNA-templated
40. Regulation of immune system process
41. Cell differentiation
に関係する遺伝子の発現が低下していた。
（実施例５：無－非動化によって作られたＰＬでは他種（ラット）の細胞は育たない）
（材料および方法）
ラットＢＭＳＣを採取し、Ｐ２－４を培養に使用した。使う培地はヒトＰＬで無－非動化のものと、非動化したものを使用した。
（材料および方法）
ラットＢＭＳＣを採取し、Ｐ２－４を培養に使用した。使う培地はヒトＰＬで無－非動化のものと、非動化したものを使用した。
非動化したものは細胞が通常通り生着・分裂したが、無－非動化では細胞は全く生存できなかった（図１３）。非動化することによって除去される未知の成分が除去されないことによって、ラットの細胞は育つことが出来無かったと考えられる。実施例３において示されたように、ヒトであれば他人のＰＬでも無－非動化で非動化と同様に育つことが出来たが、今回の結果を考えると、他人のＰＬでヒト幹細胞を育てた場合にも免疫駆除されたりするリスクがあることを意味しており、自家ＰＬを使用することが安全性が高いと考えられる。
（実施例６：凍結解凍の温度）
（材料および方法）
実験（１）
血小板の凍結温度（－１０，－２０，－３０，－８０，－１９６℃）及び凍結時間（０，９０，１２０，１８０，２４０ｍｉｎ）別増殖因子の変化
実験（２）
－８０℃凍結血小板における解凍温度別（４（一晩），２０（一晩），３７（１時間）℃）増殖因子の変化
実験（３）
－８０℃と－１９６℃（液体窒素）凍結での増殖因子の確認とそのＰＬを用いたＨ－ＢＭＳＣの培養増殖確認
いずれの実験も日赤濃厚血小板製剤譲渡分を使用した。ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ社）使用して、ＰＤＧＦ－ＢＢ Ｔｏｔａｌ－ＢＤＮＦ ＴＧＦ－β１を測定した。
（材料および方法）
実験（１）
血小板の凍結温度（－１０，－２０，－３０，－８０，－１９６℃）及び凍結時間（０，９０，１２０，１８０，２４０ｍｉｎ）別増殖因子の変化
実験（２）
－８０℃凍結血小板における解凍温度別（４（一晩），２０（一晩），３７（１時間）℃）増殖因子の変化
実験（３）
－８０℃と－１９６℃（液体窒素）凍結での増殖因子の確認とそのＰＬを用いたＨ－ＢＭＳＣの培養増殖確認
いずれの実験も日赤濃厚血小板製剤譲渡分を使用した。ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ社）使用して、ＰＤＧＦ－ＢＢ Ｔｏｔａｌ－ＢＤＮＦ ＴＧＦ－β１を測定した。
実験（１）および（２）は、全て－８０℃新法にてＰＬ作製
実験（３）は、－８０℃凍結は治験法及び－８０℃新法、－１９６℃凍結は－１８０℃新法にてＰＬ作製した。
実験（３）は、－８０℃凍結は治験法及び－８０℃新法、－１９６℃凍結は－１８０℃新法にてＰＬ作製した。
培養液はＭＥＭ－α＋ペニシリンストレプトマイシン混合液＋各ＰＬ１０％を使用した。
用語の説明
治験法（従来法）：－８０℃で凍結されているものを解凍してそのまま使用。非動化（６０℃３０分）あり。その後フィルターで除菌するのだが、フィルターがすぐ詰まるため交換（１０回ほど）必要。
治験法（従来法）：－８０℃で凍結されているものを解凍してそのまま使用。非動化（６０℃３０分）あり。その後フィルターで除菌するのだが、フィルターがすぐ詰まるため交換（１０回ほど）必要。
－８０℃新法：－８０℃で凍結されているものを解凍、もしくは新鮮な血小板を、その後任意の回数（１－６回）－８０℃で凍結し、解凍（色々な温度）を繰り返す。非動化（６０℃３０分）は無し。フィルターで除菌するが、フィルターがほとんど詰まらなくなった。
－１８０℃新法：－８０℃で凍結されているものを解凍して、その後任意の回数（１－６回）－１８０℃で凍結し、解凍（色々な温度）を繰り返す。非動化（６０℃３０分）は無し。フィルターで除菌あり。
（結果）
実験（１）
図１４～１６に結果を示す。いずれも液体窒素での凍結で有意に上昇した。凍結時間は特に大差は無いと思われる。
実験（１）
図１４～１６に結果を示す。いずれも液体窒素での凍結で有意に上昇した。凍結時間は特に大差は無いと思われる。
実験（２）
結果を図１７～２０に示す。４℃での解凍が一番増殖因子の放出が多かった。図１７～２０は、２つの血小板（血小板ａおよび血小板ｂ）の結果を示す。
結果を図１７～２０に示す。４℃での解凍が一番増殖因子の放出が多かった。図１７～２０は、２つの血小板（血小板ａおよび血小板ｂ）の結果を示す。
実験（３）
結果を図２１～２３に示す。
結果を図２１～２３に示す。
（実施例７：凍結解凍の回数）
本実施例では、凍結解凍の最適回数を検討した。本実施例は、実施例１の方法に準じて実施した。凍結解凍の回数を１～６回とした。
本実施例では、凍結解凍の最適回数を検討した。本実施例は、実施例１の方法に準じて実施した。凍結解凍の回数を１～６回とした。
（結果）
－８０℃では、凍結解凍３回目以降は、ほとんど栄養因子の上昇は認められなかった。－１９６℃で凍結解凍した場合は、５回目以降わずかに上昇していた。－８０℃および－１９６℃の凍結解凍のどちらの場合でも、３回目でほぼプラトーに達していると言える。以上から、効率的な栄養因子の抽出のための凍結解凍の最小限の回数は、３回であることが示唆された（図２４）。
－８０℃では、凍結解凍３回目以降は、ほとんど栄養因子の上昇は認められなかった。－１９６℃で凍結解凍した場合は、５回目以降わずかに上昇していた。－８０℃および－１９６℃の凍結解凍のどちらの場合でも、３回目でほぼプラトーに達していると言える。以上から、効率的な栄養因子の抽出のための凍結解凍の最小限の回数は、３回であることが示唆された（図２４）。
（実施例７：分化能の確認）
本実施例では、本開示の血小板溶解物を用いて培養した幹細胞が正常な分化能を有しているかどうかを確認した。３回凍結融解を繰り返し、非動化をせずに作製した血小板溶解物を用いて培養した間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を使用した。
本実施例では、本開示の血小板溶解物を用いて培養した幹細胞が正常な分化能を有しているかどうかを確認した。３回凍結融解を繰り返し、非動化をせずに作製した血小板溶解物を用いて培養した間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を使用した。
（脂肪細胞への分化）
（材料）
・１２ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ）
・脂肪細胞分化誘導培地（Ｇｉｂｃｏ， ＳｔｅｍＰｒｏＴＭ Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）
・通常培地（ＭＥＭ－α＋５％ＰＬ＋ＰＳ）
・Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ（Ｃａｙｍａｎ）：４℃保存（使用時に試薬と蒸留水と６：４の割合で希釈し、０．４５μｍフィルターでろ過した）
・４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液：４℃保存
（材料）
・１２ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ）
・脂肪細胞分化誘導培地（Ｇｉｂｃｏ， ＳｔｅｍＰｒｏＴＭ Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）
・通常培地（ＭＥＭ－α＋５％ＰＬ＋ＰＳ）
・Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ（Ｃａｙｍａｎ）：４℃保存（使用時に試薬と蒸留水と６：４の割合で希釈し、０．４５μｍフィルターでろ過した）
・４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液：４℃保存
（方法）
（１）ＢＭＳＣの播種
１２ウェルプレートに１００００／ｃｍ２の濃度で通常培地１ｍｌを用いて播種した。１ウェルあたり１００００×４ｃｍ２（ウェル底面積）＝４００００個の細胞を播種した。
（２）ＢＭＳＣの培養
８０％コンフルエントになるまで培養した（２～３日程度）。
（３）培地を除去し、脂肪細胞分化誘導培地を９００μＬ入れた。
分化しないコントロールには通常培地９００μＬを入れた。
（４）３～４日ごとに培地を交換した（全量）。
（５）分化開始から１４日間培養した。
（６）Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色を開始し、培地を除去した。
（７）ＰＢＳ１．６ｍｌを入れ、洗浄した。
（８）４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液０．８ｍｌを入れ、５分間室温で固定した。
（９）固定液を除去した。
（１０）ＰＢＳ１．６ｍｌを入れ、洗浄を２回行った。
（１１）Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色液０．８ｍｌを入れ、室温で振とうしながら１５分間染色した。
（１２）染色液を除去した。
（１３）ＰＢＳ１．６ｍｌで洗浄を３回行った（染色の強度に応じて洗浄時間、洗浄回数を適宜変更する）。
（１４）ＰＢＳ０．８ｍｌを入れ、顕微鏡で観察した。
（１）ＢＭＳＣの播種
１２ウェルプレートに１００００／ｃｍ２の濃度で通常培地１ｍｌを用いて播種した。１ウェルあたり１００００×４ｃｍ２（ウェル底面積）＝４００００個の細胞を播種した。
（２）ＢＭＳＣの培養
８０％コンフルエントになるまで培養した（２～３日程度）。
（３）培地を除去し、脂肪細胞分化誘導培地を９００μＬ入れた。
分化しないコントロールには通常培地９００μＬを入れた。
（４）３～４日ごとに培地を交換した（全量）。
（５）分化開始から１４日間培養した。
（６）Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色を開始し、培地を除去した。
（７）ＰＢＳ１．６ｍｌを入れ、洗浄した。
（８）４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液０．８ｍｌを入れ、５分間室温で固定した。
（９）固定液を除去した。
（１０）ＰＢＳ１．６ｍｌを入れ、洗浄を２回行った。
（１１）Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色液０．８ｍｌを入れ、室温で振とうしながら１５分間染色した。
（１２）染色液を除去した。
（１３）ＰＢＳ１．６ｍｌで洗浄を３回行った（染色の強度に応じて洗浄時間、洗浄回数を適宜変更する）。
（１４）ＰＢＳ０．８ｍｌを入れ、顕微鏡で観察した。
（骨細胞への分化）
（材料）
・コラーゲンがコーティングされた１２ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ）
・骨細胞分化誘導培地（Ｇｉｂｃｏ， ＳｔｅｍＰｒｏＴＭ Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）
・通常培地（ＭＥＭ－α＋５％ＰＬ＋ＰＳ）
・Ａｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ Ｓ（Ｓｉｇｍａ）：室温保存
１％溶液を調製して保存した。
（ｉ）１ｇをＭｉｌｌｉＱ９５ｍｌにスターラーで撹拌しながら溶解した。
（ｉｉ）０．１Ｎ ＨＣｌでｐＨ４．２に合わせた。
（ｉｉｉ）１００ｍｌにメスアップし、０．８μｍフィルターでろ過した。
・４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液：４℃保存
（方法）
（１）ＢＭＳＣの播種
コラーゲンでコーティングされた１２ウェルプレートに１００００／ｃｍ２の濃度で通常培地１ｍｌを用いて播種した。１ウェルあたり１００００×４ｃｍ２（ウェルの底面積）＝４００００個の細胞を播種した。
（２）ＢＭＳＣの培養（１日間）
（３）培地を除去し、脂肪細胞分化誘導培地を８００μＬ入れた。
分化しないコントロールには通常培地８００μＬを入れた。
（４）３～４日ごとに培地を交換した。
初回の培地交換のみ全量交換した。２回目以降の交換はピペットで２００μＬほどを残して古い培地を除去し、新しい培地を８００μＬ、壁を伝わらせてゆっくり入れた（細胞が剥がれやすいので注意する）。
（５）分化開始から２１～２８日間培養した。
（６）ＡｌｉｚａｒｉｎＲｅｄでの染色を開始し、培地を除去した。
（７）ＰＢＳ１．６ｍｌを入れ、洗浄した。
（８）４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液０．８ｍｌを入れ、５分間室温で固定した。
（９）固定液を除去した。
（１０）ＰＢＳ１．６ｍｌを入れ、洗浄を２回行った。
（１１）ＡｌｉｚａｒｉｎＲｅｄ染色液０．８ｍｌを入れ、室温で振とうしながら１５分間染色した。
（１２）染色液を除去した。
（１３）ＭｉｌｌｉＱ１ｍｌで３分間振とう洗浄を５回行った（強く染まることが多いので場合によっては回数を増やす）。
（１４）ＭｉｌｌｉＱ１ｍｌを入れ、顕微鏡で観察した。
（材料）
・コラーゲンがコーティングされた１２ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ）
・骨細胞分化誘導培地（Ｇｉｂｃｏ， ＳｔｅｍＰｒｏＴＭ Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）
・通常培地（ＭＥＭ－α＋５％ＰＬ＋ＰＳ）
・Ａｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ Ｓ（Ｓｉｇｍａ）：室温保存
１％溶液を調製して保存した。
（ｉ）１ｇをＭｉｌｌｉＱ９５ｍｌにスターラーで撹拌しながら溶解した。
（ｉｉ）０．１Ｎ ＨＣｌでｐＨ４．２に合わせた。
（ｉｉｉ）１００ｍｌにメスアップし、０．８μｍフィルターでろ過した。
・４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液：４℃保存
（方法）
（１）ＢＭＳＣの播種
コラーゲンでコーティングされた１２ウェルプレートに１００００／ｃｍ２の濃度で通常培地１ｍｌを用いて播種した。１ウェルあたり１００００×４ｃｍ２（ウェルの底面積）＝４００００個の細胞を播種した。
（２）ＢＭＳＣの培養（１日間）
（３）培地を除去し、脂肪細胞分化誘導培地を８００μＬ入れた。
分化しないコントロールには通常培地８００μＬを入れた。
（４）３～４日ごとに培地を交換した。
初回の培地交換のみ全量交換した。２回目以降の交換はピペットで２００μＬほどを残して古い培地を除去し、新しい培地を８００μＬ、壁を伝わらせてゆっくり入れた（細胞が剥がれやすいので注意する）。
（５）分化開始から２１～２８日間培養した。
（６）ＡｌｉｚａｒｉｎＲｅｄでの染色を開始し、培地を除去した。
（７）ＰＢＳ１．６ｍｌを入れ、洗浄した。
（８）４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液０．８ｍｌを入れ、５分間室温で固定した。
（９）固定液を除去した。
（１０）ＰＢＳ１．６ｍｌを入れ、洗浄を２回行った。
（１１）ＡｌｉｚａｒｉｎＲｅｄ染色液０．８ｍｌを入れ、室温で振とうしながら１５分間染色した。
（１２）染色液を除去した。
（１３）ＭｉｌｌｉＱ１ｍｌで３分間振とう洗浄を５回行った（強く染まることが多いので場合によっては回数を増やす）。
（１４）ＭｉｌｌｉＱ１ｍｌを入れ、顕微鏡で観察した。
（軟骨細胞への分化）
（材料）
・２４ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ）
・軟骨細胞分化誘導培地（Ｇｉｂｃｏ， ＳｔｅｍＰｒｏＴＭ Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）
・通常培地（ＭＥＭ－α＋５％ＰＬ＋ＰＳ）
・ＡｌｕｃｉａｎＢｌｕｅ（Ｓｉｇｍａ）：室温保存
１％溶液を調製して保存
（ｉ）５０ｍｌチューブを用い、０．２ｇを０．１Ｎ ＨＣｌ２０ｍｌに転倒混和もしくは振とうしながら４０分間溶解した。
（ｉｉ）０．８μｍフィルターでろ過した。
・４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液：４℃保存
（材料）
・２４ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ）
・軟骨細胞分化誘導培地（Ｇｉｂｃｏ， ＳｔｅｍＰｒｏＴＭ Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）
・通常培地（ＭＥＭ－α＋５％ＰＬ＋ＰＳ）
・ＡｌｕｃｉａｎＢｌｕｅ（Ｓｉｇｍａ）：室温保存
１％溶液を調製して保存
（ｉ）５０ｍｌチューブを用い、０．２ｇを０．１Ｎ ＨＣｌ２０ｍｌに転倒混和もしくは振とうしながら４０分間溶解した。
（ｉｉ）０．８μｍフィルターでろ過した。
・４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液：４℃保存
（１）ＢＭＳＣの播種
ＢＭＳＣを１．６×１０４／μＬに調製し、２４ウェルプレートに１ウェルにつき５μＬ＝８×１０４をウェルの中央に入れた（ｍｉｃｒｏ ｍａｓｓ ｃｕｌｔｕｒｅ）。
（２）ＢＭＳＣの培養（６０分間）
（３）培地を除去し、脂肪細胞分化誘導培地を４００μＬ入れた。
分化しないコントロールには通常培地４００μＬを入れた。
（４）３～４日ごとに培地を交換した。
軟骨が塊状になっていたので、剥がしたり除去の際に失ったりしないよう注意した。
（５）分化開始から１４日間培養した。
（６）Ａｌｕｃｉａｎ ｂｌｕｅでの染色を開始し、培地を除去した。
（７）ＰＢＳ０．４ｍｌを入れ、洗浄を３回行った。
（８）４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液０．４ｍｌを入れ、３０分間室温で固定した。
（９）固定液を除去した。
（１０）ＭｉｌｌｉＱ０．４ｍｌを入れ、洗浄、除去を行った。
（１１）Ａｌｕｃｉａｎ ｂｌｕｅ染色液０．４ｍｌを入れ、室温で振とうしながら３０分間染色した。
（１２）染色液を除去した。
（１３）ＭｉｌｌｉＱ１ｍｌで洗浄を５回行った。
（１４）ＭｉｌｌｉＱ１ｍｌを入れ、顕微鏡で観察した。
ＢＭＳＣを１．６×１０４／μＬに調製し、２４ウェルプレートに１ウェルにつき５μＬ＝８×１０４をウェルの中央に入れた（ｍｉｃｒｏ ｍａｓｓ ｃｕｌｔｕｒｅ）。
（２）ＢＭＳＣの培養（６０分間）
（３）培地を除去し、脂肪細胞分化誘導培地を４００μＬ入れた。
分化しないコントロールには通常培地４００μＬを入れた。
（４）３～４日ごとに培地を交換した。
軟骨が塊状になっていたので、剥がしたり除去の際に失ったりしないよう注意した。
（５）分化開始から１４日間培養した。
（６）Ａｌｕｃｉａｎ ｂｌｕｅでの染色を開始し、培地を除去した。
（７）ＰＢＳ０．４ｍｌを入れ、洗浄を３回行った。
（８）４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液０．４ｍｌを入れ、３０分間室温で固定した。
（９）固定液を除去した。
（１０）ＭｉｌｌｉＱ０．４ｍｌを入れ、洗浄、除去を行った。
（１１）Ａｌｕｃｉａｎ ｂｌｕｅ染色液０．４ｍｌを入れ、室温で振とうしながら３０分間染色した。
（１２）染色液を除去した。
（１３）ＭｉｌｌｉＱ１ｍｌで洗浄を５回行った。
（１４）ＭｉｌｌｉＱ１ｍｌを入れ、顕微鏡で観察した。
（結果）
結果を図２５に示す。本開示の血小板溶解物を用いて培養した幹細胞は、脂肪細胞、骨細胞、および軟骨細胞に分化する能力を有しており、正常な分化能を有していることが示された。
結果を図２５に示す。本開示の血小板溶解物を用いて培養した幹細胞は、脂肪細胞、骨細胞、および軟骨細胞に分化する能力を有しており、正常な分化能を有していることが示された。
（実施例８：エクソソーム分泌能力の確認）
本実施例では、本開示の血小板溶解物を用いて培養した幹細胞のエクソソーム分泌能力を確認した。
本実施例では、本開示の血小板溶解物を用いて培養した幹細胞のエクソソーム分泌能力を確認した。
・治験法（従来法）（実施例６を参照のこと）で作製した血小板溶解物を用いた培地（５％ＰＬ＋ＭＥＭ－α）
・新法（実施例６を参照のこと、凍結回数は３回で作製した血小板溶解物を用いた培地（５％ＰＬ＋ＭＥＭ－α）
この２種類の培地を使用してｈＢＭＳＣを培養し、その培養上清におけるエクソソームの変化を観察した。
・新法（実施例６を参照のこと、凍結回数は３回で作製した血小板溶解物を用いた培地（５％ＰＬ＋ＭＥＭ－α）
この２種類の培地を使用してｈＢＭＳＣを培養し、その培養上清におけるエクソソームの変化を観察した。
（方法）
（培養上清の回収）
（１）ｈＢＭＳＣを用意した
６ウェルプレートに培養した。（１５００／ｃｍ２、底面積が９ｃｍ２のため１ウェルあたり１３５００細胞が必要）。１つの培地につき３ウェル培養した（Ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）。１ウェルにつき２ｍｌの培地で培養した。３日に１回培地を交換した。
（２）大体８０～９０％コンフルエントになったら、培地を全量除去し、ＰＢＳで２回洗浄した。
（３）ＰＬの入っていない基礎培地（ＭＥＭ－α）を２ｍｌ加え、４８ｈ培養した。
（４）培地をファルコンチューブに回収した。
（５）回収した培地を０．２μｍフィルターでフィルタリングし、測定サンプルとした。
（６）上清を回収したプレートの細胞数をカウントした。
（培養上清の回収）
（１）ｈＢＭＳＣを用意した
６ウェルプレートに培養した。（１５００／ｃｍ２、底面積が９ｃｍ２のため１ウェルあたり１３５００細胞が必要）。１つの培地につき３ウェル培養した（Ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）。１ウェルにつき２ｍｌの培地で培養した。３日に１回培地を交換した。
（２）大体８０～９０％コンフルエントになったら、培地を全量除去し、ＰＢＳで２回洗浄した。
（３）ＰＬの入っていない基礎培地（ＭＥＭ－α）を２ｍｌ加え、４８ｈ培養した。
（４）培地をファルコンチューブに回収した。
（５）回収した培地を０．２μｍフィルターでフィルタリングし、測定サンプルとした。
（６）上清を回収したプレートの細胞数をカウントした。
（エクソソームの回収）
（１）培地を２０００Ｇ、１０分遠心し、死細胞などを沈殿させた。
（２）上清を回収した。
（３）１００００Ｇ、３０分、４℃で遠心し、オルガネラ等を沈殿させた。
（４）上清を回収した。ここで回収した上清は超遠心用のチューブに移した。
（５）１，０００，０００Ｇ（２８５００ｒｐｍ）、７０分、４℃で超遠心した。
（６）沈殿物を回収した。チューブを逆さまにしてキムワイプで完全に上清を除いた。キムワイプはピンセットを用いてチューブ内に入れて拭き取った。
（７）ペレットをＰＢＳ等で懸濁し、ナノパーティクルアナライザーにかけた。ウェスタンブロットを実施した（Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ）。
（１）培地を２０００Ｇ、１０分遠心し、死細胞などを沈殿させた。
（２）上清を回収した。
（３）１００００Ｇ、３０分、４℃で遠心し、オルガネラ等を沈殿させた。
（４）上清を回収した。ここで回収した上清は超遠心用のチューブに移した。
（５）１，０００，０００Ｇ（２８５００ｒｐｍ）、７０分、４℃で超遠心した。
（６）沈殿物を回収した。チューブを逆さまにしてキムワイプで完全に上清を除いた。キムワイプはピンセットを用いてチューブ内に入れて拭き取った。
（７）ペレットをＰＢＳ等で懸濁し、ナノパーティクルアナライザーにかけた。ウェスタンブロットを実施した（Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ）。
（結果）
ＭＳＣから分泌されるエクソソームは神経機能改善効果など種々の臓器改善効果を有するため、ＭＳＣの品質の指標として確認した。結果を図２６にしめす。エクソソーム分泌量は従来法で作製された血小板溶解物と大きな差はなかった。栄養因子の分泌量が、従来法の血小板溶解物で培養した細胞と本開示の血小板溶解物で培養した細胞とで同程度であったことを示した実施例４の結果も考慮すれば、本開示の血小板溶解物で培養した細胞は、従来法に劣らない品質であることが実証された。
ＭＳＣから分泌されるエクソソームは神経機能改善効果など種々の臓器改善効果を有するため、ＭＳＣの品質の指標として確認した。結果を図２６にしめす。エクソソーム分泌量は従来法で作製された血小板溶解物と大きな差はなかった。栄養因子の分泌量が、従来法の血小板溶解物で培養した細胞と本開示の血小板溶解物で培養した細胞とで同程度であったことを示した実施例４の結果も考慮すれば、本開示の血小板溶解物で培養した細胞は、従来法に劣らない品質であることが実証された。
（実施例９：細胞表面マーカーの確認）
本実施例では、本開示の血小板溶解物を用いて培養した間葉系幹細胞が、細胞表面マーカーの基準を満たしているかどうか確認した。間葉系幹細胞の定義として、一般的にはプラスチックフラスコ底面に接着能を有する線維芽細胞様の細胞であることが挙げられ、国際細胞治療学会は「細胞表面マーカーのＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０が陽性、かつ、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９α、ＣＤ１９、ＨＬＡ－ＤＲが陰性」という条件を示しているため、これらの細胞表面マーカーの発現を確認した。
本実施例では、本開示の血小板溶解物を用いて培養した間葉系幹細胞が、細胞表面マーカーの基準を満たしているかどうか確認した。間葉系幹細胞の定義として、一般的にはプラスチックフラスコ底面に接着能を有する線維芽細胞様の細胞であることが挙げられ、国際細胞治療学会は「細胞表面マーカーのＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０が陽性、かつ、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９α、ＣＤ１９、ＨＬＡ－ＤＲが陰性」という条件を示しているため、これらの細胞表面マーカーの発現を確認した。
（材料）
・ＦＡＣＳＢｕｆｆｅｒ（２％ＦＢＳ加ＰＢＳ（－））
ＰＢＳ（－）３００ｍｌに対してＦＢＳ６ｍｌを加えた。
（方法）
（１）細胞を準備した。
１本あたり３×１０５～１×１０６になるように調製した。適量ＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。
（２）Ｆｃブロッカーでブロッキングを行った。
１×１０６につき１００μＬのＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、５μＬのＨｕｍａｎ ＢＤ ＦｃＢｌｏｃｋを加えた（３×１０５の場合５００μＬのＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒ、２５μLのＦｃＢｌｏｃｋ）。室温、１０分間遮光でインキュベートした。洗浄せずに次の工程に進んだ。
（３）細胞を３等分（無染色、染色Ａ、染色Ｂ）した。
（４）抗体で染色した。
各抗体を以下の容量で加えた（１×１０６までは以下の量で染色出来る）。
染色Ａ：ＣＤ７９ａ－ＰＥ １μＬ
ＣＤ７３－ＢＶ４２１ １μＬ
ＣＤ９０－ＡＰＣ １μＬ
ＣＤ１９－ＡＰＣ－Ｈ７ １μＬ
ＣＤ３４－ＦＩＴＣ １μＬ
ＣＤ４５－Ｖ５００ １μＬ
染色Ｂ：ＣＤ１１ｂ－ＰＥ １μＬ
ＣＤ１０５－ＢＶ４２１ １μＬ
ＨＬＡ－ＤＲ－ＡＰＣ １μＬ
ＣＤ１４－ＡＰＣ－Ｈ７ １μＬ（全てＢＤの抗体）
等分した細胞浮遊液にそれぞれ加え、４℃、遮光で３０分間インキュベートした。
（５）洗浄
ＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒ２ｍｌで洗浄を２回行った（２５０Ｇ、５分間）。
（６）測定前準備
洗浄した細胞を５００μＬのＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒで懸濁した。セルストレーナーキャップ付チューブ（ＢＤ，３５２２３５）に入れた（フィルターを通す）。測定まで４℃暗所で保存した。測定直前に７－ＡＡＤを５μＬ加えた（最終濃度：０．２５μｇ／ｍｌ）。
・ＦＡＣＳＢｕｆｆｅｒ（２％ＦＢＳ加ＰＢＳ（－））
ＰＢＳ（－）３００ｍｌに対してＦＢＳ６ｍｌを加えた。
（方法）
（１）細胞を準備した。
１本あたり３×１０５～１×１０６になるように調製した。適量ＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。
（２）Ｆｃブロッカーでブロッキングを行った。
１×１０６につき１００μＬのＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、５μＬのＨｕｍａｎ ＢＤ ＦｃＢｌｏｃｋを加えた（３×１０５の場合５００μＬのＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒ、２５μLのＦｃＢｌｏｃｋ）。室温、１０分間遮光でインキュベートした。洗浄せずに次の工程に進んだ。
（３）細胞を３等分（無染色、染色Ａ、染色Ｂ）した。
（４）抗体で染色した。
各抗体を以下の容量で加えた（１×１０６までは以下の量で染色出来る）。
染色Ａ：ＣＤ７９ａ－ＰＥ １μＬ
ＣＤ７３－ＢＶ４２１ １μＬ
ＣＤ９０－ＡＰＣ １μＬ
ＣＤ１９－ＡＰＣ－Ｈ７ １μＬ
ＣＤ３４－ＦＩＴＣ １μＬ
ＣＤ４５－Ｖ５００ １μＬ
染色Ｂ：ＣＤ１１ｂ－ＰＥ １μＬ
ＣＤ１０５－ＢＶ４２１ １μＬ
ＨＬＡ－ＤＲ－ＡＰＣ １μＬ
ＣＤ１４－ＡＰＣ－Ｈ７ １μＬ（全てＢＤの抗体）
等分した細胞浮遊液にそれぞれ加え、４℃、遮光で３０分間インキュベートした。
（５）洗浄
ＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒ２ｍｌで洗浄を２回行った（２５０Ｇ、５分間）。
（６）測定前準備
洗浄した細胞を５００μＬのＦＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒで懸濁した。セルストレーナーキャップ付チューブ（ＢＤ，３５２２３５）に入れた（フィルターを通す）。測定まで４℃暗所で保存した。測定直前に７－ＡＡＤを５μＬ加えた（最終濃度：０．２５μｇ／ｍｌ）。
（結果）
結果を図２７に示す。ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５が陽性であり、かつ、Ｄ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９α、ＣＤ１９、ＨＬＡ－ＤＲは陰性であり、間葉系幹細胞の細胞表面マーカーの基準を満たしていた。
結果を図２７に示す。ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５が陽性であり、かつ、Ｄ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９α、ＣＤ１９、ＨＬＡ－ＤＲは陰性であり、間葉系幹細胞の細胞表面マーカーの基準を満たしていた。
以上より、本開示の血小板溶解物により、細胞増殖を促進することができ、培養された間葉系幹細胞は、正常な品質が保たれていた。
以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
本出願は、令和２年７月３１日に出願された特願２０２０－１３０７４４の優先権の利益を請求し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
高い効率で細胞を培養することができる培養培地として使用される血小板溶解物（ＰＬ）またはその製造方法が提供される。培養された細胞は細胞注入療法に使用されるため、製薬等の分野において利用可能である。
Claims (16)
- 単一個体における細胞注入療法において使用される自家細胞の培養において使用される血小板溶解物を調製するための方法であって、該方法は、
該単一個体から得られた血小板またはその同等物を３回以上凍結解凍して、血小板溶解物を得る工程を含み、該方法が非動化する工程を含まない、方法。 - 単一個体における細胞注入療法において使用される自家細胞を培養するための方法であって、該方法は、
Ｃ）該単一個体から得られた血小板またはその同等物を、非動化せずに３回以上凍結解凍して、血小板溶解物を得る工程、および
Ｄ）該単一個体から得られた細胞を該血小板溶解物の存在下で培養する工程を含む
方法。 - 単一個体における細胞注入療法において使用される自家細胞を培養して細胞製品を得るための方法であって、該方法は、
Ｃ）該単一個体から得られた血小板またはその同等物を、非動化せずに３回以上凍結解凍して、血小板溶解物を得る工程、および、
Ｄ）該単一個体から得られた細胞を該血小板溶解物の存在下で培養し、必要に応じて得られた細胞を細胞製品とする工程を含む、方法。 - 前記血小板またはその同等物が３回凍結解凍される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－２０℃を下回る温度で凍結される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－３０℃以下の温度で凍結される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－８０℃以下の温度で凍結される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－８０℃～－１９６℃の温度で凍結される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記血小板またはその同等物が、少なくとも１回－８０℃の温度で凍結される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、幹細胞、神経細胞、角膜細胞、上皮細胞および肝細胞からなる群から選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が幹細胞である、請求項１０に記載の方法。
- 前記幹細胞が、間葉系幹細胞である、請求項１０に記載の方法。
- 前記間葉系幹細胞が、骨髄、脂肪組織、胎盤組織、滑膜組織、臍帯組織（例えば、臍帯血）、歯髄、または羊膜由来の間葉系幹細胞幹細胞、あるいは、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞から分化させた間葉系幹細胞である、請求項１２に記載の方法。
- 前記間葉系幹細胞が、骨髄由来間葉系幹細胞である、請求項１３に記載の方法。
- 請求項１に記載の方法、または請求項４～１４のいずれか一項のうち請求項１を引用する部分に記載の方法に従って調製された血小板溶解物。
- 単一個体における細胞注入療法において使用される自家細胞の培養のための血小板溶解物を含む製剤であって、該血小板溶解物は、該単一個体から得られた血小板またはその同等物から調製された血小板溶解物であり、該血小板溶解物は、該単一個体から得られた血小板またはその同等物を非動化せずに３回以上凍結融解することによって調製される、製剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022093099A JP2022120063A (ja) | 2020-07-31 | 2022-06-08 | 自家血小板由来の血小板溶解物 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2020130744 | 2020-07-31 | ||
| JP2020130744 | 2020-07-31 | ||
| PCT/JP2021/028298 WO2022025238A1 (ja) | 2020-07-31 | 2021-07-30 | 自家血小板由来の血小板溶解物 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022093099A Division JP2022120063A (ja) | 2020-07-31 | 2022-06-08 | 自家血小板由来の血小板溶解物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2022025238A1 JPWO2022025238A1 (ja) | 2022-02-03 |
| JP7137883B2 true JP7137883B2 (ja) | 2022-09-15 |
Family
ID=80035822
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021566326A Active JP7137883B2 (ja) | 2020-07-31 | 2021-07-30 | 自家血小板由来の血小板溶解物 |
| JP2022093099A Pending JP2022120063A (ja) | 2020-07-31 | 2022-06-08 | 自家血小板由来の血小板溶解物 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022093099A Pending JP2022120063A (ja) | 2020-07-31 | 2022-06-08 | 自家血小板由来の血小板溶解物 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230270791A1 (ja) |
| EP (1) | EP4190892A1 (ja) |
| JP (2) | JP7137883B2 (ja) |
| WO (1) | WO2022025238A1 (ja) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011529706A (ja) | 2008-08-04 | 2011-12-15 | アローキュア インコーポレイテッド | 間充織間質細胞集団、ならびにそれを単離および使用する方法 |
| JP2014522833A (ja) | 2011-06-27 | 2014-09-08 | エモリー ユニバーシティ | 血小板溶解物の組成物、用途および調製 |
| JP2016529283A (ja) | 2013-08-27 | 2016-09-23 | クック・ジェネラル・バイオテクノロジー・エルエルシー | 濃厚血小板から誘導可能な生理活性組成物並びにその調製方法及び使用方法 |
| JP2018517771A (ja) | 2015-05-29 | 2018-07-05 | ジャディ セル エルエルシー | 粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6184971B2 (ja) * | 2011-11-23 | 2017-08-23 | セル セラピー リミテッドＣｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ | 血小板溶解物ゲル |
| BR112016009753B1 (pt) * | 2013-11-04 | 2023-11-28 | Isopogen Pty Ltd | Métodos in vitro de cultura de amostras de células estromais mesenquimais e para a preparação de células estromais mesenquimais |
| TWI744300B (zh) * | 2016-03-23 | 2021-11-01 | 里爾中央醫學中心 | 改良性熱處理的血小板顆粒裂解液在製備用於治療神經系統疾病的組合物的用途 |
| JP6958578B2 (ja) | 2019-02-21 | 2021-11-02 | 花王株式会社 | 肌状態計測装置 |
-
2021
- 2021-07-30 WO PCT/JP2021/028298 patent/WO2022025238A1/ja unknown
- 2021-07-30 EP EP21850066.8A patent/EP4190892A1/en active Pending
- 2021-07-30 JP JP2021566326A patent/JP7137883B2/ja active Active
- 2021-07-30 US US18/007,372 patent/US20230270791A1/en active Pending
-
2022
- 2022-06-08 JP JP2022093099A patent/JP2022120063A/ja active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011529706A (ja) | 2008-08-04 | 2011-12-15 | アローキュア インコーポレイテッド | 間充織間質細胞集団、ならびにそれを単離および使用する方法 |
| JP2014522833A (ja) | 2011-06-27 | 2014-09-08 | エモリー ユニバーシティ | 血小板溶解物の組成物、用途および調製 |
| JP2016529283A (ja) | 2013-08-27 | 2016-09-23 | クック・ジェネラル・バイオテクノロジー・エルエルシー | 濃厚血小板から誘導可能な生理活性組成物並びにその調製方法及び使用方法 |
| JP2018517771A (ja) | 2015-05-29 | 2018-07-05 | ジャディ セル エルエルシー | 粒状の凍結乾燥血小板溶解物組成物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20230270791A1 (en) | 2023-08-31 |
| WO2022025238A1 (ja) | 2022-02-03 |
| EP4190892A1 (en) | 2023-06-07 |
| JPWO2022025238A1 (ja) | 2022-02-03 |
| JP2022120063A (ja) | 2022-08-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102491558B1 (ko) | 세포 배양 배지를 사용한 제대 양막(umbilical cord amniotic membrane)으로부터 중간엽 줄기세포를 분리하는 방법 | |
| KR101310578B1 (ko) | 심혈관 증상의 치료에 지방조직-유래 세포를 사용하는 방법 | |
| US20180015128A1 (en) | Amniotic Fluid-Derived Preparation with a Standardized Biologic Activity | |
| Pollock et al. | Improved post-thaw function and epigenetic changes in mesenchymal stromal cells cryopreserved using multicomponent osmolyte solutions | |
| CN106465710B (zh) | 脂肪组织冻存液及脂肪组织冻存方法 | |
| Bernacki et al. | Isolation of human mesenchymal stem cells from bone and adipose tissue | |
| TW201130977A (en) | Mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from mobilized peripheral blood | |
| AU2016342387B2 (en) | Stem cell therapy based on adipose-derived stem cells | |
| KR20100084620A (ko) | 조직 재생을 위한 세포 조성물 | |
| JP2018531269A6 (ja) | 脂肪由来幹細胞に基づく幹細胞治療 | |
| CN116077448B (zh) | 人间充质干细胞注射液及其应用 | |
| JP7137883B2 (ja) | 自家血小板由来の血小板溶解物 | |
| Shaik et al. | Non-toxic freezing media to retain the stem cell reserves in adipose tissues | |
| US20220098553A1 (en) | Method for mesenchymal stem cell isolation and osteoblast differentiation | |
| US20180000869A1 (en) | Amniotic fluid-derived preparations | |
| WO2013185913A1 (en) | Method for isolating stem cells and their use in cell therapy | |
| WO2011145110A1 (en) | A novel cord blood plasma nutrient formulation and a method for the preparation thereof | |
| EP2960329A1 (en) | Methods of upscaling mesenchymal stromal cell production, compositions and kit thereof | |
| Pellegrini | Myoblast Transplantation: Murine Studies |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20211108 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20211108 |
|
| A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20211108 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20211210 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20220311 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220608 |
|
| C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60 Effective date: 20220608 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20220615 |
|
| C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21 Effective date: 20220616 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220803 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220808 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220819 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220829 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7137883 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R3D04 |