JP7136796B2 - Salmonella entericaを制御するためのバクテリオシン - Google Patents

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Description

本発明は、サルモシン(salmocins)と称される、Salmonellaに対して細胞傷害性作用を発揮することができるタンパク質を提供する。本発明は、医薬組成物を含めた、前記タンパク質の1種または複数を含む組成物も提供する。Salmonellaによる対象物の感染または汚染を予防するまたは減少させる方法、それを必要とする対象または患者のSalmonellaによる感染を処置する方法、および該タンパク質を含む組成物を生成する方法も提供される。
Salmonellaは、Enterobacteriaceae科の桿状グラム陰性細菌である。Salmonella entericaは基準種であり、6つの亜種にさらに分けられ、2500を超える血清型を含む亜種IとしてS.enterica ssp.entericaを含む。Salmonella感染はよく見られ、無症候性状態から非常に重度の疾患に及ぶ多様な臨床症状をもたらし得る。Salmonella entericaは、米国で毎年推定100万人の疾病を引き起こし、推定19,000人の入院および380人の死亡をもたらす。過去5年間で、46回のSalmonellaの大発生が米国で記録され、食中毒の多くは、汚染した家禽または野菜が原因であるが、赤肉および魚も原因である(CDCウェブサイト)。
Salmonella感染の予防またはSalmonellaによる食品の汚染の減少は、農場における農業生産から商業施設と家庭の台所の両方における食品の処理、製造および調製までのフードチェーンのすべての段階において、制御手段を必要とする。優れた衛生習慣はSalmonellaによる食品の汚染を減少させるが、生成物にSalmonellaが存在しないことを保証しない。家庭におけるSalmonellaに対する予防手段は、他の食品由来の細菌に対して使用されるものと類似している。「完全に調理する」などの基本的な食品衛生習慣は、サルモネラ症に対する予防手段として推奨される。www.who.int/mediacentre/factsheets/fs139/en/でWHOを参照されたい。
抗菌療法は、Salmonella感染を罹患しているヒトまたは動物を処置するのに使用され得る。しかし、抗菌剤抵抗性は世界的な公衆衛生上の懸念であり、Salmonellaは、フードチェーンに影響を及ぼす、いくつかの抵抗性血清型が出現している微生物のうちの1つである。
Salmonella感染を予防もしくは処置する、またはSalmonellaによる汚染を減少させる上述の方法の多くは、特定の病原性細菌から、またはSalmonellaの特定の血清型から本質的に独立している方法である。これは、対策をとるのに先だって、問題になっている特定のSalmonella株またはSalmonella enterica血清型の事前知識がほとんど必要とされないという利点がある。しかし、加熱などの、Salmonella感染を予防するまたはSalmonellaによる汚染を減少させる上述の方法は、必ずしも適用可能とは限らず、または処理された商品または食品を望ましくない形で変える。他の方法は、特定の患者で非効果的な結果になった可能性がある。したがって、Salmonella感染または汚染を予防もしくは処置するさらなる方法、またはSalmonellaによる、特に、Salmonella enterica ssp.entericaによる対象物の汚染を減少させるもしくは予防する方法が必要である。
食品由来のSalmonella感染などのSalmonella感染を予防または処置するための方法を提供することが、本発明の一目的である。Salmonellaによる対象物、特に食品の汚染を予防するまたは減少させるための方法を提供することが、別の目的である。幅広いSalmonella血清群に対して効果的な、Salmonella感染を予防もしくは処置するための方法および/またはSalmonellaによる対象物の汚染を減少させるための方法を提供することが、さらなる目的である。さらに、そのような方法のための化合物、薬剤および組成物が所望される。
したがって、本発明は、以下を提供する:
(1)好ましくはSalmonellaに対して細胞傷害性作用を発揮することができるタンパク質であって、以下のアミノ酸配列セグメント(a-i)から(a-vi)または(b-i)から(b-vi)、(c-i)から(c-vi)もしくは(d-i)から(d-vi)で定義されるそれらの誘導体のうちの少なくともいずれか1つを含むタンパク質:
(a-i)ScolE2(配列番号1)のアミノ酸残基316~449のセグメント、
(a-ii)ScolE3(配列番号2)のアミノ酸残基315~483のセグメント、
(a-iii)ScolE7(配列番号3)のアミノ酸残基318~451のセグメント、
(a-iv)ScolE1a(配列番号4)のアミノ酸残基174~297のセグメント、
(a-v)ScolE1b(配列番号5)のアミノ酸残基198~322のセグメント、もしくは
(a-vi)配列番号6のSpstの少なくとも200個の連続的なアミノ酸残基を含むセグメント、
または
(b-i)ScolE2(配列番号1)のアミノ酸残基316~449のセグメントに対して少なくとも75%の配列同一性を有するセグメント、
(b-ii)ScolE3(配列番号2)のアミノ酸残基315~483のセグメントに対して少なくとも70%の配列同一性を有するセグメント、
(b-iii)ScolE7(配列番号3)のアミノ酸残基318~451のセグメントに対して少なくとも77%の配列同一性を有するセグメント、
(b-iv)ScolE1a(配列番号4)のアミノ酸残基174~297のセグメントに対して少なくとも70%の配列同一性を有するセグメント、
(b-v)ScolE1b(配列番号5)のアミノ酸残基198~322のセグメントに対して少なくとも70%の配列同一性を有するセグメント、もしくは
(b-vi)配列番号6のSpstの少なくとも200個の連続的なアミノ酸残基を含むセグメントに対して少なくとも70%の配列同一性を有するセグメント、
または
(c-i)ScolE2(配列番号1)のアミノ酸残基316~449のセグメントに対して少なくとも85%の配列類似性を有するセグメント、
(c-ii)ScolE3(配列番号2)のアミノ酸残基315~483のセグメントに対して少なくとも80%の配列類似性を有するセグメント、
(c-iii)ScolE7(配列番号3)のアミノ酸残基318~451のセグメントに対して少なくとも85%の配列類似性を有するセグメント、
(c-iv)ScolE1a(配列番号4)のアミノ酸残基174~297のセグメントに対して少なくとも80%の配列類似性を有するセグメント、
(c-v)ScolE1b(配列番号5)のアミノ酸残基198~322のセグメントに対して少なくとも80%の配列類似性を有するセグメント、もしくは
(c-vi)配列番号6のSpstの少なくとも200個の連続的なアミノ酸残基を含むセグメントに対して少なくとも80%の配列類似性を有するセグメント、
または
(d-i)ScolE2(配列番号1)のアミノ酸残基316~449のセグメントに対して1~25個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
(d-ii)ScolE3(配列番号2)のアミノ酸残基315~483のセグメントに対して1~40個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
(d-iii)ScolE7(配列番号3)のアミノ酸残基318~451のセグメントに対して1~30個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
(d-iv)ScolE1a(配列番号4)のアミノ酸残基174~297のセグメントに対して1~40個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
(d-v)ScolE1b(配列番号5)のアミノ酸残基198~322のセグメントに対して1~40個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、もしくは
(d-vi)配列番号6のSpstの少なくとも200個の連続的なアミノ酸残基を含むセグメントに対して、1~40個のアミノ酸置換、付加、挿入または欠失を有するセグメント。
(2)以下の活性の任意の1つまたは複数を有する細胞傷害性ドメインまたは触媒ドメインを含む、(1)に記載のタンパク質:膜細孔形成活性、DNase活性、RNase活性または細胞壁分解活性、例えばムラミダーゼ活性。
(3)以下のアミノ酸配列セグメント(a-i)’から(a-vi)’、または(b-i)’から(b-vi)’、(c-i)’から(c-vi)’もしくは(d-i)’から(d-vi)’で定義されるそれらの誘導体もしくはアミノ酸配列セグメントのいずれか1つを含むか、それからなる細胞傷害性ドメインまたは触媒ドメインを含む、(1)または(2)に記載のタンパク質:
(a-i)’ScolE2(配列番号1)のアミノ酸残基453~582のセグメント、
(a-ii)’ScolE3(配列番号2)のアミノ酸残基501~584のセグメント、
(a-iii)’ScolE7(配列番号3)のアミノ酸残基455~584のセグメント、
(a-iv)’ScolE1a(配列番号4)のアミノ酸残基306~478のセグメント、
(a-v)’ScolE1b(配列番号5)のアミノ酸残基350~522のセグメント、もしくは
(a-vi)’Spst(配列番号6)のアミノ酸残基112~288のセグメント、
または
(b-i)’ScolE2(配列番号1)のアミノ酸残基453~582のセグメントに対して少なくとも70%の配列同一性を有するセグメント、
(b-ii)’ScolE3(配列番号2)のアミノ酸残基501~584のセグメントに対して少なくとも70%の配列同一性を有するセグメント、
(b-iii)’ScolE7(配列番号3)のアミノ酸残基455~584のセグメントに対して少なくとも70%の配列同一性を有するセグメント、
(b-iv)’ScolE1a(配列番号4)のアミノ酸残基306~478のセグメントに対して少なくとも70%の配列同一性を有するセグメント、
(b-v)’ScolE1b(配列番号5)のアミノ酸残基350~522のセグメントに対して少なくとも70%の配列同一性を有するセグメント、もしくは
(b-vi)’Spst(配列番号6)のアミノ酸残基112~288のセグメントに対して少なくとも70%の配列同一性を有するセグメント、
または
(c-i)’ScolE2(配列番号1)のアミノ酸残基453~582のセグメントに対して少なくとも80%の配列類似性を有するセグメント、
(c-ii)’ScolE3(配列番号2)のアミノ酸残基501~584のセグメントに対して少なくとも80%の配列類似性を有するセグメント、
(c-iii)’ScolE7(配列番号3)のアミノ酸残基455~584のセグメントに対して少なくとも80%の配列類似性を有するセグメント、
(c-iv)’ScolE1a(配列番号4)のアミノ酸残基306~478のセグメントに対して少なくとも80%の配列類似性を有するセグメント、
(c-v)’ScolE1b(配列番号5)のアミノ酸残基350~522のセグメントに対して少なくとも80%の配列類似性を有するセグメント、もしくは
(c-vi)’Spst(配列番号6)のアミノ酸残基112~288のセグメントに対して少なくとも80%の配列類似性を有するセグメント、
または
(d-i)’ScolE2(配列番号1)のアミノ酸残基453~582のセグメントに対して1~20個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
(d-ii)’ScolE3(配列番号2)のアミノ酸残基501~584のセグメントに対して1~20個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
(d-iii)’ScolE7(配列番号3)のアミノ酸残基455~584のセグメントに対して1~20個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
(d-iv)’ScolE1a(配列番号4)のアミノ酸残基306~478のセグメントに対して1~20個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
(d-v)’ScolE1b(配列番号5)のアミノ酸残基350~522のセグメントに対して1~20個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、もしくは
(d-vi)’Spst(配列番号6)のアミノ酸残基112~288のセグメントに対して、1~20個のアミノ酸置換、付加、挿入または欠失を有するセグメント。
(4)以下のアミノ酸配列セグメント(a-i)’’から(a-v)’’、または(b-i)’’から(b-v)’’、(c-i)’’から(c-v)’’もしくは(d-i)’’から(d-v)’’で定義されるそれらの誘導体(もしくはアミノ酸配列セグメント)のいずれか1つを含む(または、それからなる)転移ドメインを含む、(1)、(2)または(3)のいずれか1つに記載のタンパク質:
(a-i)’’ScolE2(配列番号1)のアミノ酸残基43~313のセグメント、
(a-ii)’’ScolE3(配列番号2)のアミノ酸残基35~315のセグメント、
(a-iii)’’ScolE7(配列番号3)のアミノ酸残基43~316のセグメント、
(a-iv)’’ScolE1a(配列番号4)のアミノ酸残基1~170のセグメント、もしくは
(a-v)’’ScolE1b(配列番号5)のアミノ酸残基1~195のセグメント、
または
(b-i)’’ScolE2(配列番号1)のアミノ酸残基43~313のセグメントに対して少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有するセグメント、
(b-ii)’’ScolE3(配列番号2)のアミノ酸残基35~315のセグメントに対して少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有するセグメント、
(b-iii)’’ScolE7(配列番号3)のアミノ酸残基43~316のセグメントに対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有するセグメント、
(b-iv)’’ScolE1a(配列番号4)のアミノ酸残基1~170のセグメントに対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有するセグメント、もしくは
(b-v)’’ScolE1b(配列番号5)のアミノ酸残基1~195のセグメントに対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有するセグメント、
または
(c-i)’’ScolE2(配列番号1)のアミノ酸残基43~313のセグメントに対して少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有するセグメント、
(c-ii)’’ScolE3(配列番号2)のアミノ酸残基35~315のセグメントに対して少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有するセグメント、
(c-iii)’’ScolE7(配列番号3)のアミノ酸残基43~316のセグメントに対して少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有するセグメント、
(c-iv)’’ScolE1a(配列番号4)のアミノ酸残基1~170のセグメントに対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも90、より好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有するセグメント、もしくは
(c-v)’’ScolE1b(配列番号5)のアミノ酸残基1~195のセグメントに対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有するセグメント、
または
(d-i)’’ScolE2(配列番号1)のアミノ酸残基43~313のセグメントに対して、1~50個、好ましくは1~40個、より好ましくは1~30個、さらにより好ましくは1~20個、最も好ましくは1~10個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
(d-ii)’’ScolE3(配列番号2)のアミノ酸残基35~315のセグメントに対して、1~50個、好ましくは1~40個、より好ましくは1~30個、さらにより好ましくは1~20個、最も好ましくは1~10個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
(d-iii)’’ScolE7(配列番号3)のアミノ酸残基43~316のセグメントに対して、アミノ酸残基35~315のセグメントのアミノ酸置換、付加、挿入または欠失に対して、1~30個、好ましくは1~20個、最も好ましくは1~10個のアミノ酸置換、付加、挿入または欠失を有するセグメント;
(d-iv)’’ScolE1a(配列番号4)のアミノ酸残基1~170のセグメントに対して、アミノ酸残基35~315のセグメントのアミノ酸置換、付加、挿入または欠失に対して、1~40個、好ましくは1~30個、より好ましくは1~20、最も好ましくは1~10個のアミノ酸置換、付加、挿入または欠失を有するセグメント、もしくは
(d-v)’’ScolE1b(配列番号5)のアミノ酸残基1~195のセグメントに対して、アミノ酸残基35~315のセグメントのアミノ酸置換、付加、挿入または欠失に対して、1~40個、好ましくは1~30個、より好ましくは1~20、最も好ましくは1~10個のアミノ酸置換、付加、挿入または欠失を有するセグメント。
(5)Salmonella、例えば、Salmonella enterica、好ましくはSalmonella enterica ssp.entericaによる感染または汚染を処置する方法で使用するための、(1)~(4)のいずれか1つに記載のタンパク質。
(6)Salmonella entericaに対する、請求項1、特に請求項1のクラス(b)から(d)に記載のタンパク質の毒性が、感受性Salmonella enterica株のcmあたり1x10cfu/mLの0.14mL細菌溶液を接種した軟寒天重層プレート上に、5マイクロリットルのクラス(b)から(d)の前記タンパク質および配列番号1のタンパク質の溶液をスポッティングし、その後37℃で寒天プレートをインキュベートしてから12時間に、前記タンパク質および配列番号1のタンパク質が、同じ直径の、Salmonella enterica ssp.enterica血清型Newport株ATCC(登録商標)6962(商標)の生存可能な細菌を含んでいないスポットを生成するというようなものであり、クラス(b)から(d)のタンパク質の濃度が、配列番号1のタンパク質の比較溶液のものの最大で5倍である、(1)~(5)のいずれか1つに記載のタンパク質。
(7)(1)~(6)のいずれか1つに記載の1種または複数のタンパク質を含む組成物。
(8)前記1種または複数のタンパク質がScolE1aもしくはScolE1bまたはScolE1aもしくはScolE1bの誘導体であるか、これらを含む、(7)に記載の組成物。
(9)請求項1で定義される少なくとも2つの異なるクラス(i)から(vi)から選択される2つ以上のタンパク質を含む、(7)または(8)に記載の組成物。
(10)(クラス(a)~(d)のいずれかの)サブクラス(i)のタンパク質および(クラス(a)~(d)のいずれかの)サブクラス(v)のタンパク質を少なくとも含む、(9)に記載の組成物。
(11)Salmonella、好ましくはSalmonella enterica、より好ましくはSalmonella enterica ssp.entericaによる感染を処置する方法で使用するための、(7)~(10)のいずれか1つに記載の組成物。
(12)前記組成物が植物材料またはその抽出物であり、植物材料が、前記タンパク質を発現した植物、好ましくは、前記タンパク質を発現した食用植物由来の材料である、(7)~(11)のいずれか1つに記載の組成物。
(13)前記植物材料がホウレンソウ、フダンソウ、ビートの根、ニンジン、サトウダイコン、リーフィービート、アマランス、Nicotianaからなる群から選択される植物由来の材料である、および/または前記植物材料が1つもしくは複数の葉、根、塊茎もしくは種子、もしくは前記葉、根、塊茎もしくは種子の破砕された、製粉された、もしくは粉砕された生成物である、(12)に記載の組成物。
(14)前記組成物が、前記タンパク質を含む水溶液である、(7)~(13)のいずれか1つに記載の組成物。
(15)前記タンパク質、または組成物が2つ以上の異なるタンパク質を含む場合は前記水溶液中の前記タンパク質の濃度が、0.0001~1mg/ml、好ましくは0.001~0.1mg/ml、より好ましくは0.005~0.05mg/mlである、または0.1~15mg/kg食品、好ましくは0.5~10mg/kg、より好ましくは0.1~5mg/kg食品である、(14)に記載の組成物。
(16)ScolE1aおよび/もしくはその誘導体、もしくはScolE1aもしくはその誘導体を含む、または項目(A-iv)、(B-iv)、(C-iv)、(D-iv)もしくは(E-iv)に記載のタンパク質、および/もしくは以下で定義される項目(A-v)、(B-v)、(C-v)、(D-v)もしくは(E-v)に記載のタンパク質を含む、または項目(A-iv)、(B-iv)、(D-iv)もしくは(E-iv)に記載のタンパク質、および/もしくは以下で定義される項目(A-v)、(B-v)、(D-v)もしくは(E-v)に記載のタンパク質を含む、または項目(A-iv)、(B-iv)、(D-iv)もしくは(E-iv)に記載のタンパク質、および以下で定義される項目(A-v)、(B-v)、(D-v)もしくは(E-v)に記載のタンパク質を含む、(7)~(15)のいずれか1つに記載の組成物であって、本明細書で定義される好ましい実施形態が本項目(16)で定義される実施形態と組み合わされてもよい、組成物。
(17)Salmonellaによる対象物の感染または汚染を予防するまたは減少させる方法であって、(1)~(6)のいずれか1つに記載のタンパク質または(7)~(16)のいずれか1つに記載の組成物と前記対象物を接触させることを含む方法。
(18)前記対象物が前記水溶液で噴霧される、または前記水溶液中に浸漬される、(17)に記載の方法。
(19)前記対象物が少なくとも10秒間、好ましくは少なくとも1分間、好ましくは少なくとも5分間、前記タンパク質の水溶液中に浸漬される、(17)~(18)に記載の方法。
(20)前記対象物が食品または動物飼料である、(17)~(19)のいずれか1つに記載の方法。
(21)前記食品が動物の死体全体、肉、卵、生の果物または野菜であり、好ましくは前記食品が肉、生の果物または野菜であり、より好ましくは前記食品が肉である、(20)に記載の方法。
(22)それらを必要とする対象のSalmonellaによる感染を処置する方法であって、(1)~(6)のいずれか1つに記載のタンパク質または(7)~(16)のいずれか1つに記載の組成物を前記対象に投与することを含む方法。
(23)前記SalmonellaがSalmonella enterica、好ましくはSalmonella enterica ssp.entericaである、(17)~(22)のいずれか1つに記載の方法。
(24)(1)~(6)のいずれか1つに記載のタンパク質を含む組成物を生成する方法であって、
(i)植物、好ましくは食用植物またはNicotiana中で前記タンパク質を発現させるステップ、
(ii)前記植物から発現タンパク質を含む植物材料を採取するステップ、
(iii)水性バッファーを使用して前記植物材料から前記タンパク質を抽出して、前記タンパク質を含む組成物を得るステップ、
(iv)場合により前記組成物から望ましくない混入物を除去するステップ
を含む方法。
本明細書において、その誘導体とともに「サルモシン」と称されるSalmonellaのバクテリオシンは、他のSalmonella株を死滅させる、またはその増殖を阻害する、ある種のSalmonella株によって生成される天然の非抗生物質の抗菌タンパク質である。比較的よく研究されているコリシンと呼ばれるEscherichia coliタンパク質類似体と異なり、サルモシンはほとんど注目されていなかった。公的に利用可能なゲノムデータベースに、コリシン配列に類似性を有するいくつかのSalmonella配列が存在し、それらの多くは、コリシンM、Ia、Ib、5および10に高い同一性を示す。本発明者らは、Salmonellaによる、特に、Salmonella enterica ssp.entericaによる感染または汚染を予防するまたは減少させるのに使用され得る、コリシンと類似しているが異なるサルモシンを同定した。
本発明者らは、試験したすべてのサルモシンが植物中で効率的に発現され得ることを発見した。本研究で使用されるもののような発現方法は、既にGMPコンプライアンスのレベルに至っており、現在、製造方法として様々な臨床試験で使用されている。ほとんどのサルモシンは、高収量(新鮮なグリーンバイオマス1キログラムあたり1.7g活性タンパク質まで)で発現され、これは、商業的に実行可能な低い製造費を意味する。生産は、特に、タバコおよび食用植物、例えば、リーフビートまたはホウレンソウを使用して行われ得る。様々なサルモシンの中で、サルモシンE1a(ScolE1a)およびE1b(ScolE1b)またはそれらの誘導体が好ましく、これは、これらが、主な病原性Salmonella株に対して最も広い抗菌活性を有することが発見されたからである。これらの2種のサルモシンのそれぞれはまた、試験したすべての36種の主な病原性株に対して非常に高い活性を示す。低い量のコリシン(例えば、処理される食品製品1kgあたり10mg未満のコリシン)による処理は、用いられたアッセイにおいて、様々な病原性株の細菌負荷を3~>6log減少させる。2~4種の病原体血清型をスパイクとして添加した家禽の肉を使用するスパイク実験において、コリシン(コリシンM、Iaおよび5)は病原性細菌のタイターを効率的に減少させた。したがって、上述のS.enterica ssp.enterica血清型に対して、言及したコリシンより高い抗菌活性を有するサルモシンは、家禽に対するSalmonella汚染のタイターをさらに一層効果的に減少させることが期待される。
本発明の実験データは、非抗生物質の抗菌性サルモシンが、臨床試験を現在受けている複数の生物製剤の標準的な製造宿主であるNicotiana benthamianaなどの植物において、非常に高いレベルで発現され得、植物で発現されたタンパク質は明らかに十分に活性であることを示す。ほとんどの場合の発現レベルは、方法の最適化なしで、全可溶性タンパク質の37%または新鮮葉バイオマスの1.74g/kgに達し、これは、サルモシンが植物に対して毒性がないこと、および安価な、トランスジェニック宿主におけるトランスフェクションまたは誘導の最適化された産業的手順が開発され得ることを意味する。これに対して、細菌宿主においてバクテリオシンタンパク質を高レベルで発現させようとする試みは、通常、同種の細菌種以外の種においてでさえも、このバクテリオシンクラスの一般的な毒性に遭う(例えば、Medinaら、PLoS One、2011;6(8):e23055;Diazら、1994)。したがって、植物はサルモシンを製造するための優れた宿主である。
本発明のデータは、サルモシンが、実際の曝露モデリング下で、Salmonella enterica ssp.entericaのほとんどまたはすべての主な病原性血清型を効率的に制御することができることを示す。Salmonellaによって生成されるサルモシンの間では、多様性が限られている。研究されたサルモシンは、より研究されたE.coliのコリシンと類似した、一般的な3つのドメイン(移行、受容体および細胞傷害性ドメイン)構成内にかなり多様な構造を有する。驚いたことに、事実上すべての試験されたサルモシンおよびコリシンは、単独で、または抗毒素(免疫タンパク質)とともに、植物で非常によく発現する。これは、植物細胞に対するサルモシンおよびコリシンの低毒性によって、ならびに「天然変性タンパク質(inherently disordered proteins)」(細菌の細胞壁および膜への移行の間にアンフォールド/リフォールドする能力に必須な特色)の古典的な代表であるこれらのバクテリオシンタンパク質は、おそらく植物細胞の翻訳および翻訳後の機構に異常な要求を課さないという事実によって、説明することができる。
本出願人らが知る限りでは、本発明は、Salmonellaの主な腸管病原性株に対するサルモシンの阻害効果に関する最初の研究を含む。E.coliによる食中毒の歴史的解析に基づいてFDAによって定義された主なE.coli株のリストと異なって、食品由来の主なSalmonella株のリストは規制当局によって定められておらず、これは、主として、大発生に関与する病原型の多様性がより高いからである。従来技術にこのガイダンスがないことに直面して、本発明者らは、それらの有病率および中毒重症度に基づいて病原型をランク付けした3つの現行の主な研究をプールすることを決めた。本発明者らの研究では、36種の血清型が選択されて解析され、そのうちの29種が、2003~2012年に疾病管理センターに報告された少なくとも100の発生の原因となり(National Enteric Disease Surveillance:Salmonella Annual Report、2013(CDC、2016年6月):2003~2012年にCDCに報告された実験室で確認されたヒトSalmonella感染(米国))、17種はCDCの上位20リストの最も周知の病原型であり、その数はFDAによって定められたE.coli病原型の数(7)よりも5倍多かった。
本特許出願で提示するデータは、主な病原性Salmonella株を制御するそれらの能力に基づいて、5つの異なるSalmonellaのサルモシンが3つの群に分けられ得ることを示す。SalmonellaのサルモシンE1aおよびE1bは普遍的に活性であることが分かり、それぞれ、試験したすべての病原型を死滅させることができ、最高の平均活性を示す。試験したすべての株に対する2つのサルモシンの平均活性は10AU/μgを超えた。例えば、サルモシンE1aの個々の活性は、36株のうちの35株について>10AU/μgであり、36株のうちの24株について>10AU/μgであり、36株のうちの13株について>10AU/μgであった。残りのサルモシンは2つの群に入り、サルモシンE2およびE7は80%を超える株について阻害性であったが、100倍低い平均活性(10AU/μg未満)を有しており、一方でサルモシンE3は、より低い平均活性(約10AU/μg)で約60%の株を阻害した。
コリシン(E.coli細胞によって生成されるサルモシン類似体)が7種のE.coli病原型に対してはるかに狭い抗菌活性スペクトルを示し、FDAによって定められた7種すべてのSTEC血清型を効率的に阻害するためには、2~5種のコリシンの混合物が好ましくは使用されなければならないので、これらの結果は予想外である。コリシンはまた、ヨーロッパにおいて2011年に大規模な大発生を引き起こした株H104:H4(>10AU/μg)および一般的な実験室株に対してはるかに高い活性が観察されたが、「ビッグセブン(Big Seven)」STEC株に対してはるかに低い平均活性を示した(平均<10AU/μg)。
それぞれE.coliおよびSalmonellaに対するサルモシンおよびコリシンの交差特異的活性の本発明者らの解析は、異なる属/種の細菌に対して低い活性を示す。特に、いくつかのサルモシン(例えば、E2、E7およびE1bであるが、驚いたことにE1aではない)は、H104:H4(10AU/μg)および実験室株DH10B(10AU/μg)に対してかなり活性であったが、「ビッグセブン」STEC株に対するサルモシンの活性は低かった(10AU/μg未満)。同様に、Salmonella病原型に対するコリシンの活性は低く、コリシンIaおよびIbは80%を超える株に対して活性であるが、コリシンIaのみの平均活性は3×10AU/μgよりも高い(または、サルモシンE1a/bよりも3~4桁低かった)ことが分かった。本発明者らは、これらの研究から、両方の病原性種と戦うためには、コリシンとサルモシンの混合物を使用しなければならないと結論する。これらの結果はまた、異なる属の細菌間における競合におけるコリシン様タンパク質の生態学的効果の最近の研究(Nedialkovaら、PLoS Pathog.2014年1月;10(1):e1003844)と部分的に一致しないように思われる。
本発明は、Salmonellaを制御するための新規の薬剤および組成物を提供する。本発明のサルモシンは、複雑でない方法で販売許可が得られ得るという利点を有する。例えば、FDAは、最近、植物で生成したコリシンにGRAS(一般に安全と認められる(Generally Regarded As Safe)ステータスを承認した(GRN573、FDAウェブサイト)。Salmonellaの制御のための天然の非抗生物質の抗菌薬に対する未だ対処されていない必要性のために、本発明者らは、Salmonellaのバクテリオシン(「サルモシン」)を探求することを構想した。それによって、本発明は達成された。
実施例で使用されるサルモシンおよび対応する免疫タンパク質の発現のためのウイルスベクターを概略的に示す図である。サルモシンの発現のためのコンストラクトはタバコモザイクウイルス(TMV)に基づくが、免疫タンパク質の発現のためのコンストラクトはジャガイモウイルスX(PVX)に基づく。 サルモシン発現ベクターとしては、それぞれサルモシンScolE2、ScolE3およびScolE7の発現のためのpNMD28161、pNMD28151およびpNMD28172(図1A)、それぞれサルモシンScolE1a、ScolE1bおよびSpstの発現のためのpNMD28191、pNMD28204およびpNMD28182(図1B)が挙げられる。 RBおよびLBは、バイナリーベクターのT-DNAのライトボーダーおよびレフトボーダーを示す。Pact2:Arabidopsisのアクチン2遺伝子のプロモーター;o:TVCV(カブ葉脈透化ウイルス)の5’末端;RdRp:cr-TMV(アブラナ感染性トバモウイルス)由来のRNA依存性RNAポリメラーゼのオープンリーディングフレーム(ORF);MP:cr-TMV由来の移行タンパク質のORF;ScolE2:サルモシンScolE2のコード配列;ScolE3:サルモシンScolE3のコード配列;ScolE7:サルモシンScolE7のコード配列;ScolE1a:サルモシンScolE1aのコード配列;ScolE1b:サルモシンScolE1bのコード配列;Spst:サルモシンSpstのコード配列;N:cr-TMV由来の3’非翻訳領域;T:Agrobacteriumのノパリン合成酵素ターミネーター;RdRpおよびMPのORF中で灰色セグメントを中断している白色セグメントは、植物細胞の細胞質におけるRNAレプリコン形成の可能性を高めるためにこれらのORF中に挿入されたイントロンを示し、これは、WO2005049839に詳細に記載されている。イントロンは、ScolE2、ScolE3およびScolE7のORF中にも、プラスミドクローニングで使用されるE.coli細胞に対するこれらのタンパク質の細胞傷害性作用を防ぐために挿入された。 免疫タンパク質の発現のためのPVXベースのベクターとしては、それぞれサルモシンScolE2およびScolE7の免疫タンパク質の発現のためのpNMD28222およびpNMD28232が挙げられる(図1A)。P35S:カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター;PVX-pol:PVX由来のRNA依存性RNAポリメラーゼ;CP:コートタンパク質ORF;25K、12Kおよび8Kは、一緒に、PVXからの25kDa、12kDaおよび8kDaの3重遺伝子ブロックモジュールを示す;N:PVX由来の3’非翻訳領域。SImmE2およびSImmE7は、それぞれサルモシンScolE2およびScolE7の免疫タンパク質のコード配列を表す。 実施例で使用されるサルモシンおよび対応する免疫タンパク質の発現のためのウイルスベクターを概略的に示す図である。サルモシンの発現のためのコンストラクトはタバコモザイクウイルス(TMV)に基づくが、免疫タンパク質の発現のためのコンストラクトはジャガイモウイルスX(PVX)に基づく。 サルモシン発現ベクターとしては、それぞれサルモシンScolE2、ScolE3およびScolE7の発現のためのpNMD28161、pNMD28151およびpNMD28172(図1A)、それぞれサルモシンScolE1a、ScolE1bおよびSpstの発現のためのpNMD28191、pNMD28204およびpNMD28182(図1B)が挙げられる。 RBおよびLBは、バイナリーベクターのT-DNAのライトボーダーおよびレフトボーダーを示す。Pact2:Arabidopsisのアクチン2遺伝子のプロモーター;o:TVCV(カブ葉脈透化ウイルス)の5’末端;RdRp:cr-TMV(アブラナ感染性トバモウイルス)由来のRNA依存性RNAポリメラーゼのオープンリーディングフレーム(ORF);MP:cr-TMV由来の移行タンパク質のORF;ScolE2:サルモシンScolE2のコード配列;ScolE3:サルモシンScolE3のコード配列;ScolE7:サルモシンScolE7のコード配列;ScolE1a:サルモシンScolE1aのコード配列;ScolE1b:サルモシンScolE1bのコード配列;Spst:サルモシンSpstのコード配列;N:cr-TMV由来の3’非翻訳領域;T:Agrobacteriumのノパリン合成酵素ターミネーター;RdRpおよびMPのORF中で灰色セグメントを中断している白色セグメントは、植物細胞の細胞質におけるRNAレプリコン形成の可能性を高めるためにこれらのORF中に挿入されたイントロンを示し、これは、WO2005049839に詳細に記載されている。イントロンは、ScolE2、ScolE3およびScolE7のORF中にも、プラスミドクローニングで使用されるE.coli細胞に対するこれらのタンパク質の細胞傷害性作用を防ぐために挿入された。 免疫タンパク質の発現のためのPVXベースのベクターとしては、それぞれサルモシンScolE2およびScolE7の免疫タンパク質の発現のためのpNMD28222およびpNMD28232が挙げられる(図1A)。P35S:カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター;PVX-pol:PVX由来のRNA依存性RNAポリメラーゼ;CP:コートタンパク質ORF;25K、12Kおよび8Kは、一緒に、PVXからの25kDa、12kDaおよび8kDaの3重遺伝子ブロックモジュールを示す;N:PVX由来の3’非翻訳領域。SImmE2およびSImmE7は、それぞれサルモシンScolE2およびScolE7の免疫タンパク質のコード配列を表す。 ウイルスベクターを保有するアグロバクテリアをNicotiana benthamiana植物にインフィルトレーションした後のサルモシンの発現の比較SDS-PAGE解析を示す図である。50mM HEPES(pH7.0)、10mM 酢酸カリウム、5mM酢酸マグネシウム、10%(v/v)グリセロール、0.05%(v/v)Tween-20および300mM NaClを含む5倍容量のバッファーで植物葉材料を抽出した。タンパク質抽出物を12%ポリアクリルアミドゲル中で分離した。ゲルローディングのために、0.4mg新鮮重の植物組織に対応する抽出物量を含む一定分量を使用した。ゲルにローディングする前に、タンパク質抽出物の一定分量を2×Laemmliバッファーと1:1の比例で混合し、95℃で10分間インキュベートした。上記ゲルレーンの上の数字は、以下の組換えタンパク質を発現する植物組織からのタンパク質抽出物を表す:1-サルモシンScolE2;2-サルモシンScolE3;3-サルモシンScolE7;4-サルモシンScolE1a;5-サルモシンScolE1b;6-サルモシンSpst。数字7は、陰性対照としての非感染葉組織からの抽出物に対応する。L-PageRuler(商標)プレステインドタンパク質ラダー(Thermo Fisher Scientific Inc.(Waltham、USA)、#SM0671)。矢印は、発現した組換えコリシンに対応する特異的タンパク質バンドを示す。 表5Aおよび5Bに列挙される36種のS.enterica ssp.enterica株に対する、サルモシン含有植物抽出物の特異的抗菌活性の半定量的評価を示す図である。抗菌活性は、スポットオンローン法による放射拡散アッセイを使用して試験した。サルモシン感受性Salmonella株のパーセンテージ(平均3回の独立の実験)をサルモシン:1-サルモシンScolE2;2-サルモシンScolE3;3-サルモシンScolE7;4-サルモシンScolE1a;5-サルモシンScolE1b;6-サルモシンSpstについて示す。 表5Aおよび5Bに列挙される36種のS.enterica ssp.enterica株に対する、サルモシン含有植物抽出物の平均抗菌活性の半定量的評価を示す図である。抗菌活性は、スポットオンローン法による放射拡散アッセイを使用して試験し、組換えサルモシンを発現する植物バイオマスのmg新鮮重(FW)あたりの任意単位(AU)で計算した(平均3回の独立の実験)。それによって、これは、バイオマスの単位あたりの特異的活性薬剤の収量、すなわち、宿主の特異的生産能力を反映する。任意単位は、放射拡散アッセイにおいて検出可能なクリアリング作用をもたらすタンパク質抽出物の最高の希釈に対する希釈係数として計算される。試験した組換えサルモシンを、1-サルモシンScolE2;2-サルモシンScolE3;3-サルモシンScolE7;4-サルモシンScolE1a;5-サルモシンScolE1b;6-サルモシンSpstとして示す。 表5Aおよび5Bに列挙される36種のS.enterica ssp.enterica株に対するサルモシン含有植物抽出物の平均特異的抗菌活性の半定量的評価を示す図である。抗菌活性は、スポットオンローン法による放射拡散アッセイを使用して試験し、μgの組換えサルモシンあたりの任意単位(AU)で計算し(平均3回の独立の実験)、これは、特定の株に対する特異的サルモシンの活性を反映し、すなわち、サルモシンの特異的抗菌効力が評価される。試験した組換えサルモシンを、1-サルモシンScolE2;2-サルモシンScolE3;3-サルモシンScolE7;4-サルモシンScolE1a;5-サルモシンScolE1b;6-サルモシンSpstとして示す。 表5Aおよび5Bに列挙される36種のS.enterica ssp.enterica株に対するサルモシンScolE2含有植物抽出物の平均特異的抗菌活性の半定量的評価を示す図である。抗菌活性は、スポットオンローン法による放射拡散アッセイを使用して試験し、mg FW植物バイオマスあたりの任意単位(AU)で計算した(平均3回の独立の実験)。 表5Aおよび5Bに列挙される36種のS.enterica ssp.enterica株に対するサルモシンScolE2含有植物抽出物の平均特異的抗菌活性の半定量的評価を示す図である。抗菌活性は、スポットオンローン法による放射拡散アッセイを使用して試験し、μgの組換えサルモシンあたりの任意単位(AU)で計算した(平均3回の独立の実験)。 表5Aおよび5Bに列挙される36種のS.enterica ssp.enterica株に対するサルモシンScolE3含有植物抽出物の平均特異的抗菌活性の半定量的評価を示す図である。抗菌活性は、スポットオンローン法による放射拡散アッセイを使用して試験し、mg FW植物バイオマスあたりの任意単位(AU)で計算した(平均3回の独立の実験)。 表5Aおよび5Bに列挙される36種のS.enterica ssp.enterica株に対するサルモシンScolE3含有植物抽出物の平均特異的抗菌活性の半定量的評価を示す図である。抗菌活性は、スポットオンローン法による放射拡散アッセイを使用して試験し、μgの組換えサルモシンあたりの任意単位(AU)で計算した(平均3回の独立の実験)。 表5Aおよび5Bに列挙される36種のS.enterica ssp.enterica株に対するサルモシンScolE7含有植物抽出物の平均特異的抗菌活性の半定量的評価を示す図である。抗菌活性は、スポットオンローン法による放射拡散アッセイを使用して試験し、mg FW植物バイオマスあたりの任意単位(AU)で計算した(平均3回の独立の実験)。 表5Aおよび5Bに列挙される36種のS.enterica ssp.enterica株に対するサルモシンScolE7含有植物抽出物の平均特異的抗菌活性の半定量的評価を示す図である。抗菌活性は、スポットオンローン法による放射拡散アッセイを使用して試験し、μgの組換えサルモシンあたりの任意単位(AU)で計算した(平均3回の独立の実験)。 表5Aおよび5Bに列挙される36種のS.enterica ssp.enterica株に対するサルモシンScolE1a含有植物抽出物の平均特異的抗菌活性の半定量的評価を示す図である。抗菌活性は、スポットオンローン法による放射拡散アッセイを使用して試験し、mg FW植物バイオマスあたりの任意単位(AU)で計算した(平均3回の独立の実験)。 表5Aおよび5Bに列挙される36種のS.enterica ssp.enterica株に対するサルモシンScolE1a含有植物抽出物の平均特異的抗菌活性の半定量的評価を示す図である。抗菌活性は、スポットオンローン法による放射拡散アッセイを使用して試験し、μgの組換えサルモシンあたりの任意単位(AU)で計算した(平均3回の独立の実験)。 表5Aおよび5Bに列挙される36種のS.enterica ssp.enterica株に対するサルモシンScolE1b含有植物抽出物の平均特異的抗菌活性の半定量的評価を示す図である。抗菌活性は、スポットオンローン法による放射拡散アッセイを使用して試験し、mg FW植物バイオマスあたりの任意単位(AU)で計算した(平均3回の独立の実験)。 表5Aおよび5Bに列挙される36種のS.enterica ssp.enterica株に対するサルモシンScolE1b含有植物抽出物の平均特異的抗菌活性の半定量的評価を示す図である。抗菌活性は、スポットオンローン法による放射拡散アッセイを使用して試験し、μgの組換えサルモシンあたりの任意単位(AU)で計算した(平均3回の独立の実験)。 実施例で使用されるコリシンの発現のための、タバコモザイクウイルス(TMV)に基づくウイルスベクターを概略的に示す図である。コリシン発現ベクターとしては、それぞれコリシンcolS4、col5、col10、colIa、colIbおよびcolMの発現のための、pNMD25856、pNMD15311、pNMD25848、pNMD19141、pNMD25861およびpNMD10221が挙げられる。 RBおよびLBは、バイナリーベクターのT-DNAのライトボーダーおよびレフトボーダーを示す。Pact2:Arabidopsisのアクチン2遺伝子のプロモーター;o:TVCVの5’末端(カブ葉脈透化ウイルス);RdRp:cr-TMV(アブラナ感染性トバモウイルス)由来のRNA依存性RNAポリメラーゼのオープンリーディングフレーム(ORF);MP:cr-TMV由来の移行タンパク質のORF;colS4:コリシンS4のコード配列;col5:コリシン5のコード配列;col10:コリシン10のコード配列;colIa:コリシンIaのコード配列;colIb:コリシンIbのコード配列;colM:コリシンMのコード配列;N:cr-TMV由来の3’非翻訳領域;T:Agrobacteriumノパリン合成酵素ターミネーター;RdRpおよびMPのORF中で灰色セグメントを中断している白色セグメントは、植物細胞の細胞質におけるRNAレプリコン形成の可能性を高めるためにこれらのORF中に挿入されたイントロンを示し、これは、WO2005049839に詳細に記載されている。 表5Aおよび5Bに列挙される35種のS.enterica ssp.enterica株(番号1~35)に対する、コリシン含有植物抽出物の特異的抗菌活性の半定量的評価を示す図である。抗菌活性は、スポットオンローン法による放射拡散アッセイを使用して試験した。コリシン感受性Salmonella株のパーセンテージ(平均3回の独立の実験)をコリシン:1-コリシンS4;2-コリシン5;3-コリシン10;4-コリシンIa;5-コリシンIb;6-コリシンMについて示す。 コリシンM、コリシンIaおよびコリシン5を含む3成分コリシン混合物での処理による、汚染したニワトリの胸肉片におけるS.enterica ssp.enterica細胞集団の減少を示す図である。肉は、それぞれ血清型TyphimuriumおよびEnteritidisのS.enterica ssp.enterica株ATCC(登録商標)14028(商標)およびATCC(登録商標)13076(商標)の2株混合物で汚染させた。星印は細菌数の統計的に有意な差を示す。 コリシンM、コリシンIaおよびコリシン5を含む3成分コリシン混合物での処理による、汚染したニワトリの胸肉片におけるS.enterica ssp.enterica細胞集団の減少を示す図である。肉は、それぞれ血清型Typhimurium、Enteritidis、AnatumおよびNewportのS.enterica ssp.enterica株ATCC(登録商標)14028(商標)、ATCC(登録商標)13076(商標)、ATCC(登録商標)9270(商標)およびATCC(登録商標)6962(商標)の4株混合物で汚染させた。星印は細菌数の統計的に有意な差を示す。 Clustal Omegaツール(Fast、scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega.(2011年10月11日)Molecular systems biology 7:539)を使用して作成した、サルモシンアミノ酸配列の複数配列のアラインメントを示す図である。ScolE2、ScolE3、ScolE7、ScolE1a、ScolE1bおよびSpstは、それぞれ配列番号1~6を指す。色標識は、アミノ酸残基の性質を示す(AVFPMILWとしての赤色の残基(小型、疎水性および芳香族-Y);DEとしての青色残基(酸性);RKとしてのマゼンタ残基(塩基性)およびSTYHCNGQとしての緑色残基(ヒドロキシルスルフヒドリルアミンおよびG))。コンセンサス記号(アステリスク)は、単一の完全に保存された残基を有する、アラインメント中の位置を示し、:(コロン)は強く類似した性質の群間の保存を示し、.(ピリオド)は弱く類似した性質の群間の保存を示す。 Clustal Omegaツール(Fast、scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega.(2011年10月11日)Molecular systems biology 7:539)を使用して作成した、サルモシンアミノ酸配列の複数配列のアラインメントを示す図である。ScolE2、ScolE3、ScolE7、ScolE1a、ScolE1bおよびSpstは、それぞれ配列番号1~6を指す。色標識は、アミノ酸残基の性質を示す(AVFPMILWとしての赤色の残基(小型、疎水性および芳香族-Y);DEとしての青色残基(酸性);RKとしてのマゼンタ残基(塩基性)およびSTYHCNGQとしての緑色残基(ヒドロキシルスルフヒドリルアミンおよびG))。コンセンサス記号(アステリスク)は、単一の完全に保存された残基を有する、アラインメント中の位置を示し、:(コロン)は強く類似した性質の群間の保存を示し、.(ピリオド)は弱く類似した性質の群間の保存を示す。 Clustal Omegaツール(Fast、scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega.(2011年10月11日)Molecular systems biology 7:539)を使用して作成した、サルモシンアミノ酸配列の複数配列のアラインメントを示す図である。ScolE2、ScolE3、ScolE7、ScolE1a、ScolE1bおよびSpstは、それぞれ配列番号1~6を指す。色標識は、アミノ酸残基の性質を示す(AVFPMILWとしての赤色の残基(小型、疎水性および芳香族-Y);DEとしての青色残基(酸性);RKとしてのマゼンタ残基(塩基性)およびSTYHCNGQとしての緑色残基(ヒドロキシルスルフヒドリルアミンおよびG))。コンセンサス記号(アステリスク)は、単一の完全に保存された残基を有する、アラインメント中の位置を示し、:(コロン)は強く類似した性質の群間の保存を示し、.(ピリオド)は弱く類似した性質の群間の保存を示す。 安定な植物形質転換に使用されるScolE1bをコードするプラスミドコンストラクト(pNMD35541)のT-DNA領域の概略図である。T-DNA領域は、1)カナマイシン抵抗性トランスジェニック植物の選択マーカーの構成的発現、2)alcR転写活性化因子の構成的発現、3)サルモシンScolE1bのエタノール誘導性発現および4)TMV MPのエタノール誘導性発現のための4つの発現カセットから構成される。矢印は発現カセットの方向を示す。非誘導性状態におけるウイルスレプリコン活性化の厳しい制御のために、ウイルスベクターは2成分、すなわちレプリコンおよびMP(発現カセット3および4)に分解される(Wernerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108、14061~14066(2011)。LBおよびRB、それぞれバイナリーのレフトボーダーおよびライトボーダー;TnosおよびPnos、Agrobacteriumノパリン合成酵素遺伝子のターミネーターおよびプロモーター;NPTII、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII;Pstls、ジャガイモST-LS1遺伝子のプロモーター;alcR、Aspergillus nidulansのalcR ORF;Tact2、Arabidopsis thalianaのアクチン2ターミネーター;T35S、CaMV 35Sターミネーター;3’TMV、TMVの3’非翻訳領域;RdRp、RNA依存性RNAポリメラーゼ;pAlcA、ScolE1b、サルモシンE1b(ScolE1b)のコード配列;Aspergillus nidulansアルコール脱水素酵素(alcA)プロモーター;MP、移行タンパク質;Tocs、Agrobacteriumオクトピン合成酵素遺伝子のターミネーター;[ ]発現カセット3におけるMPの欠失。 安定なトランスジェニックNicotiana benthamiana植物におけるサルモシンScolE1bの誘導性発現の結果を示す図である。粗抽出物のローディングは、(レーン1、3、5、7)非誘導性植物材料または(レーン2、4、6、8)エタノールでの誘導から4日目の植物材料からの、2×Laemmliバッファーで抽出した3mg FWに相当する。(レーン1、2)N.benthamiana WT植物、(レーン3、4)、(レーン5、6)、(レーン7、8)T0世代の単一コピーT-DNA挿入に対する異なるトランスジェニック植物候補(ScolE1bについて#4、12、37)。矢印は組換えタンパク質に印を付ける。 TMVまたはTMVおよびPVXベクターを保有するアグロバクテリアの注射器によるインフィルトレーションの際の、Spinacia oleracea cv.Fruhes Riesenblattにおけるサルモシンの一過的発現の結果を示す図である。TSP抽出物のローディングは、5倍容量の150mM NaClで抽出した3mg FWの植物材料に相当する。植物材料は、(a)ScolE1bについて5dpi(インフィルトレーション後の日数)、ScolE3、ScolE7およびScolE1aについて6dpiもしくはScolE2について7dpi、または(b)ScolE1bについて4dpi、ScolE3、ScolE7およびScolE1aについて5dpiならびにScolE2について6dpi、または(d)ScolE2、ScolE3、ScolE7、ScolE1aおよびScolE1bについて8dpiに採取した。(a、b、d)解析抽出物は、ScolE2(レーン1)、ScolE3(レーン2)、ScolE7(レーン3)、ScolE1a(レーン4)およびScolE1b(レーン5)を発現する植物材料から、または(WT)非トランスフェクト葉組織から調製した。ScolE2およびScolE7はそれらのそれぞれの免疫タンパク質と共発現した。矢印は組換えタンパク質に印を付ける。 Salmonella enterica ssp.entericaおよびE.coliビッグセブンSTEC血清型に対するSalmonellaおよびE.coli由来のバクテリオシンの活性スペクトルを示す図である。表9に列挙される36種(a、e)もしくは35種(b、f)のS.enterica ssp.enterica株または表10に列挙される7種のE.coliビッグセブンSTEC株(c、d、g、h)に対する、(a、c、e、g)サルモシン-および(b、d、f、h)コリシン-含有植物抽出物のスポットオンローン法による放射拡散アッセイによる、特異的抗菌活性の半定量的評価。試験したすべての株に対して、バクテリオシン感受性株のパーセンテージ(e、f、g、h)について、およびμgの組換えタンパク質あたりの任意単位(AU)で計算される特異的バクテリオシン活性(a、b、c、d)について、N=3およびN=2の独立実験の平均およびSTDVをそれぞれ(a、b、e、f)および(c、d、g、h)に示す。1-ScolE2(a、c、e、g)またはcolS4(b、d、f、h);2-ScolE3(a、c、e、g)またはcol5(b、d、f、h);3-ScolE7(a、c、e、g)またはcol10(b、d、f、h);4-ScolE1a(a、c、e、g)またはcolIa(b、d、f、h);5-ScolE1b(a、c、e、g)またはcolIb(b、d、f、h);6-colM(b、d、f、h)。 サルモシンによる、新鮮なニワトリ胸肉の切り身におけるS.enterica ssp.enterica汚染の減少を示す図である。(a)スプレー塗布によって汚染した肉の、サルモシン処理してからすぐに10℃で様々な期間にわたって保存した際の肉から回収された細菌集団(0時間の黒色バー、初期汚染レベル;白色バー、担体処理;1時間、24時間、48時間および72時間:ライトグレーバー、バクテリオシン処理、3mg/kg肉の濃度のScolE1a;灰色バー、バクテリオシン処理、3+1+1+1mg/kg肉の濃度のScolE1a+ScolE1b+ScolE2+ScolE7;ダークグレーバー、バクテリオシン処理、0.3+0.1+0.1+0.1mg/kg肉の濃度のScolE1a+ScolE1b+ScolE2+ScolE7)。エラーバーは生物学的反復、N=4の標準偏差を示す。(b)(a)で使用したニワトリの胸肉のトリム。
本発明のタンパク質はSalmonellaに対して細胞傷害性作用を有するタンパク質であり、「サルモシン」と本明細書で言及される。サルモシンは、一般に、標的Salmonellaの細胞の表面受容体構造へのサルモシンの結合を可能にする結合ドメイン(「受容体結合ドメイン」とも称される)を少なくとも有する。サルモシンは、触媒ドメインまたは孔形成ドメインでもよい細胞傷害性ドメインをさらに有する。触媒ドメインはRNaseまたはDNase触媒活性、細胞壁ペプチドグリカン(ムレイン)生合成に対する阻害活性を有し得、またはSalmonellaの細胞壁構造を分解することができる。さらに、サルモシンは、サルモシンが、その細胞傷害性機能を発揮する区画に移行するように、標的Salmonellaの細胞の膜タンパク質と相互作用することができる移行ドメインを有し得る。
Salmonellaに対する特異性にとって、結合ドメインは重要であり、(特に)サルモシンを他の類似したコリシンから区別する。したがって、本発明のタンパク質は、上記の項目(1)または請求項1で定義されるアミノ酸配列セグメントのいずれか1つを含む、またはそれらからなる、またそれらに含まれる結合ドメインを少なくとも有することによって定義され得る。項目(1)または請求項1の項目(a-i)から(a-v)は、それぞれ、サルモシンScolE2、ScolE3、ScolE7、ScolE1aおよびScolE1bの結合ドメインを定義する。Spstの結合ドメインは、請求項1の項目(a-vi)で定義されるアミノ酸配列セグメント中に含まれる。サルモシンScolE2、ScolE3、ScolE7、ScolE1a、ScolE1bおよびSpstのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号1~6として与えられる。上記の項目(1)の項目(b)から(d)は、誘導体結合ドメイン(またはアミノ酸配列セグメント)を有するか含む、ScolE2、ScolE3、ScolE7、ScolE1a、ScolE1bおよびSpstの誘導体を定義する。類似して、以下で定義される項目(b)から(d)、項目(B)から(E)および項目(α)から(δ)は、ScolE2、ScolE3、ScolE7、ScolE1a、ScolE1bおよびSpstの誘導体を定義する。ScolE2、ScolE3、ScolE7、ScolE1a、ScolE1bおよびSpstの誘導体は、好ましくはSalmonellaに対して細胞傷害性作用を発揮することができる。本発明では、サルモシンScolE1aおよびScolE1bおよび本明細書で定義されるそれらの誘導体が好ましい。
本明細書では、アミノ酸配列セグメント(または、手短に言えばセグメント)は、セグメントよりも多くの数のアミノ酸残基を有するタンパク質またはポリペプチドの複数の連続的なアミノ酸残基を指す。ドメインは本明細書では、「アミノ酸配列セグメント」または手短に言えば「セグメント」とも称する。
本発明のタンパク質は、結合ドメインを少なくとも含む。項目(b)から(d)のそれぞれの以下の項目(i)から(v)は、好ましい結合ドメインを定義する。以下の項目(b)から(d)のそれぞれの項目(vi)、すなわちサブ項目(b-vi)、(c-vi)および(d-vi)は、結合ドメインを含み、サルモシンSpstの誘導体である、好ましいアミノ酸配列セグメントを定義する。本発明のタンパク質は、以下のアミノ酸配列セグメントのいずれか1つを好ましくは含む:
(b-i)ScolE2(配列番号1)のアミノ酸残基316~449のセグメントに対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有するセグメント、
(b-ii)ScolE3(配列番号2)のアミノ酸残基315~483のセグメントに対して少なくとも75%、好ましくは80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有するセグメント、
(b-iii)ScolE7(配列番号3)のアミノ酸残基318~451のセグメントに対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有するセグメント、
(b-iv)ScolE1a(配列番号4)のアミノ酸残基174~297のセグメントに対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有するセグメント、
(b-v)ScolE1b(配列番号5)のアミノ酸残基198~322のセグメントに対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有するセグメント、もしくは
(b-vi)配列番号6のSpstの少なくとも200個の連続的なアミノ酸残基を含むセグメントに対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有するセグメント。一実施形態では、配列番号6のSpstの少なくとも250個の連続的なアミノ酸残基を含むセグメントに対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有するセグメント;さらなる実施形態では、さらなる実施形態では、タンパク質は、配列番号6の(全)アミノ酸配列に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、それからなる;
または
(c-i)ScolE2(配列番号1)のアミノ酸残基316~449のセグメントに対して少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有するセグメント、
(c-ii)ScolE3(配列番号2)のアミノ酸残基315~483のセグメントに対して少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有するセグメント、
(c-iii)ScolE7(配列番号3)のアミノ酸残基318~451のセグメントに対して少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有するセグメント、
(c-iv)ScolE1a(配列番号4)のアミノ酸残基174~297のセグメントに対して少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有するセグメント、
(c-v)ScolE1b(配列番号5)のアミノ酸残基198~322のセグメントに対して少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有するセグメント、もしくは
(c-vi)配列番号6のSpstの少なくとも200個の連続的なアミノ酸残基を含むセグメントに対して少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有するセグメント。一実施形態では、配列番号6のSpstの少なくとも250個の連続的なアミノ酸残基を含むセグメントに対して少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有するセグメント;さらなる実施形態では、タンパク質は、配列番号6の(全)アミノ酸配列に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有するアミノ酸配列を含むか、それからなる;
または
(d-i)ScolE2(配列番号1)のアミノ酸残基316~449のセグメントに対して、1~20個、好ましくは1~15個、より好ましくは1~10個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
(d-ii)ScolE3(配列番号2)のアミノ酸残基315~483のセグメントに対して、1~30個、好ましくは1~29個、より好ましくは1~10個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
(d-iii)ScolE7(配列番号3)のアミノ酸残基318~451のセグメントに対して、1~20個、好ましくは1~15個、より好ましくは1~10個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
(d-iv)ScolE1a(配列番号4)のアミノ酸残基174~297のセグメントに対して、1~30個、好ましくは1~20個、より好ましくは1~15個、さらにより好ましくは1~10個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
(d-v)ScolE1b(配列番号5)のアミノ酸残基198~322のセグメントに対して、1~30個、好ましくは1~20個、より好ましくは1~15個、さらにより好ましくは1~10個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、もしくは
(d-vi)配列番号6のSpstの少なくとも200個の連続的なアミノ酸残基を含むセグメントに対して、1~30個、好ましくは1~20個、より好ましくは1~15個、さらにより好ましくは1~10個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント。一実施形態では、配列番号6のSpstの少なくとも250個の連続的なアミノ酸残基を含むセグメントに対して、1~30個、好ましくは1~20個、より好ましくは1~15個、さらにより好ましくは1~10個のアミノ酸置換、付加、挿入または欠失を有するセグメント;さらなる実施形態では、タンパク質は、配列番号6の(全)アミノ酸配列に対して、1~30個、好ましくは1~20個、より好ましくは1~15個、さらにより好ましくは1~10個のアミノ酸置換、付加、挿入または欠失を有するアミノ酸配列を含むか、それからなる。
別の実施形態では、本発明は、好ましくはSalmonellaに対して細胞傷害性作用を発揮することができるタンパク質を提供し、前記タンパク質のアミノ酸配列は、上記の項目(a-i)から(a-vi)、(b-i)から(b-vi)、(c-i)から(c-vi)、または(d-i)から(d-vi)のいずれか1つで定義された通りである。
タンパク質が、アミノ酸置換、付加、挿入または欠失の数または数の範囲によって本明細書で定義される場合、アミノ酸置換、付加、挿入または欠失は組み合わされてもよいが、所与の数または数の範囲は、すべてのアミノ酸置換、付加、挿入および欠失の合計を指す。アミノ酸置換、付加、挿入および欠失の中で、アミノ酸置換、付加および欠失が好ましい。用語「挿入」は、参照配列の、すなわち、CまたはN末端における付加を除いたアミノ酸配列内の挿入に関する。付加という用語は、参照配列のアミノ酸配列のCまたはN末端における付加を意味する。欠失は、参照配列の末端または内部のアミノ酸残基の欠失でもよい。本明細書では、タンパク質またはその任意のドメインが、セグメントの示されるアミノ酸配列に対するアミノ酸置換、付加、挿入または欠失の数または数の範囲によって定義される場合、さらなる実施形態では、タンパク質またはドメインは、セグメントの示されるアミノ酸配列に対して、1つからいくつかのアミノ酸置換、付加、挿入または欠失を有し得る。
本発明のタンパク質の細胞傷害性ドメインまたは触媒ドメインは、上記の項目(3)で定義された通りでもよい。好ましい実施形態では、本発明のタンパク質は、以下のアミノ酸配列セグメントのいずれか1つを含むか、それからなる細胞傷害性ドメインまたは触媒ドメインを含む:
(b-i)’ScolE2(配列番号1)のアミノ酸残基453~582のセグメントに対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有するセグメント、
(b-ii)’ScolE3(配列番号2)のアミノ酸残基501~584のセグメントに対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有するセグメント、
(b-iii)’ScolE7(配列番号3)のアミノ酸残基455~584のセグメントに対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有するセグメント、
(b-iv)’ScolE1a(配列番号4)のアミノ酸残基306~478のセグメントに対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有するセグメント、
(b-v)’ScolE1b(配列番号5)のアミノ酸残基350~522のセグメントに対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有するセグメント、もしくは
(b-vi)’Spst(配列番号6)のアミノ酸残基112~288のセグメントに対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有するセグメント、
または
(c-i)’ScolE2(配列番号1)のアミノ酸残基453~582のセグメントに対して少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有するセグメント、
(c-ii)’ScolE3(配列番号2)のアミノ酸残基501~584のセグメントに対して少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有するセグメント、
(c-iii)’ScolE7(配列番号3)のアミノ酸残基455~584のセグメントに対して少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有するセグメント、
(c-iv)’ScolE1a(配列番号4)のアミノ酸残基306~478のセグメントに対して少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有するセグメント、
(c-v)’ScolE1b(配列番号5)のアミノ酸残基350~522のセグメントに対して少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有するセグメント、もしくは
(c-vi)’Spst(配列番号6)のアミノ酸残基112~288のセグメントに対して少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有するセグメント、
または
(d-i)’ScolE2(配列番号1)のアミノ酸残基453~582のセグメントに対して1~20個、好ましくは1~15個、より好ましくは1~10個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
(d-ii)’ScolE3(配列番号2)のアミノ酸残基501~584のセグメントに対して1~20個、好ましくは1~15個、好ましくは1~10個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
(d-iii)’ScolE7(配列番号3)のアミノ酸残基455~584のセグメントに対して1~20個、好ましくは1~15個、好ましくは1~10個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
(d-iv)’ScolE1a(配列番号4)のアミノ酸残基306~478のセグメントに対して1~30個、好ましくは1~20個、より好ましくは1~15個、好ましくは1~10個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
(d-v)’ScolE1b(配列番号5)のアミノ酸残基350~522のセグメントに対して1~30個、好ましくは1~20個、より好ましくは1~15個、好ましくは1~10個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、もしくは
(d-vi)’Spst(配列番号6)のアミノ酸残基112~288のセグメントに対して1~20個、好ましくは1~15個、より好ましくは1~10個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント。
本明細書では、任意の項目(x-y)’において、プライム‘は触媒ドメインまたはセグメントを示す。プライムを欠く項目(x-y)は、結合ドメインまたはセグメントを示す。ダブルプライム’’を保有する項目(x-y)’’は、転移ドメインまたはセグメントを示す。項目(a)から(d)の中で、項目(a)、(b)および(d)のものが好ましく、項目(a)および(d)がより好ましい。同様に、項目(a)’から(d)’の中で、項目(a)’、(b)’および(d)’のものが好ましく、項目(a)’および(d)’がより好ましい。同様に、項目(a)’’から(d)’’の中で、項目(a)’’、(b)’’および(d)’’のものが好ましく、項目(a)’’および(d)’’がより好ましい。
本発明のタンパク質が、本明細書で定義される結合ドメインおよび本明細書で定義される触媒ドメインを含む場合、上記で定義された任意の結合ドメイン(またはセグメント)は、任意の触媒ドメイン(またはセグメント)と組み合わされてもよい。好ましい実施形態では、(i)から(vi)の任意のサブ項目の結合ドメインは、それぞれ、サブ項目(i)’から(vi)’の触媒ドメインと組み合わされ、それによって、触媒ドメインはタンパク質のC末端側に存在し得る。一実施形態では、任意の項目(a)から(d)の結合ドメインは、それぞれ、項目(a)’から(d)’の触媒ドメインと組み合わされ、それによって、触媒ドメインはタンパク質のC末端側に存在し得る。
ある種の実施形態では、本発明のタンパク質は、Salmonellaに対して細胞傷害性作用を発揮することができ得、該タンパク質は、アミノ酸配列セグメントの以下の組み合わせの少なくとものいずれか1つを、好ましくはタンパク質のN末端からC末端への所与の順序で含む:
(α-i)配列番号1のアミノ酸残基316~449のセグメントおよび配列番号1のアミノ酸残基453~582のセグメント、
(α-ii)配列番号2のScolE3のアミノ酸残基315~483のセグメントおよび配列番号2のアミノ酸残基501~584のセグメント、
(α-iii)配列番号3のアミノ酸残基318~451のセグメントおよび配列番号3のアミノ酸残基455~584のセグメント、
(α-iv)配列番号4のアミノ酸残基174~297のセグメントおよび配列番号4のアミノ酸残基306~478のセグメント、
(α-v)配列番号5のアミノ酸残基198~322のセグメントおよび配列番号5のアミノ酸残基350~522のセグメント、もしくは
(α-vi)配列番号6のアミノ酸残基112~288のセグメントを含む、配列番号6の少なくとも200個の連続的なアミノ酸残基を含むセグメント、
または
(β-i)配列番号1のアミノ酸残基316~449のセグメントに対して少なくとも75%の配列同一性を有するセグメントおよび配列番号1のアミノ酸残基453~582のセグメントに対して少なくとも70%の配列同一性を有するセグメント、
(β-ii)配列番号2のアミノ酸残基315~483のセグメントに対して少なくとも70%の配列同一性を有するセグメントおよび配列番号2のアミノ酸残基501~584のセグメントに対して少なくとも70%の配列同一性を有するセグメント、
(β-iii)配列番号3のアミノ酸残基318~451のセグメントに対して少なくとも77%の配列同一性を有するセグメントおよび配列番号3のアミノ酸残基455~584のセグメントに対して少なくとも70%の配列同一性を有するセグメント、
(β-iv)配列番号4のアミノ酸残基174~297のセグメントに対して少なくとも70%の配列同一性を有するセグメントおよび配列番号4のアミノ酸残基306~478のセグメントに対して少なくとも70%の配列同一性を有するセグメント、
(β-v)配列番号5のアミノ酸残基198~322のセグメントに対して少なくとも70%の配列同一性を有するセグメントおよび配列番号5のアミノ酸残基350~522のセグメントに対して少なくとも70%の配列同一性を有するセグメント、もしくは
(β-vi)配列番号6のアミノ酸残基112~288のセグメントに対して少なくとも70%の配列同一性を有するセグメントを含む、配列番号6の少なくとも200個の連続的なアミノ酸残基を含むセグメントに対して少なくとも70%の配列同一性を有するセグメント、
または
(χ-i)配列番号1のアミノ酸残基316~449のセグメントに対して少なくとも85%の配列類似性を有するセグメントおよび配列番号1のアミノ酸残基453~582のセグメントに対して少なくとも80%の配列類似性を有するセグメント、
(χ-ii)配列番号2のアミノ酸残基315~483のセグメントに対して少なくとも80%の配列類似性を有するセグメントおよび配列番号2のアミノ酸残基501~584のセグメントに対して少なくとも80%の配列類似性を有するセグメント、
(χ-iii)配列番号3のアミノ酸残基318~451のセグメントに対して少なくとも85%の配列類似性を有するセグメントおよび配列番号3のアミノ酸残基455~584のセグメントに対して少なくとも80%の配列類似性を有するセグメント、
(χ-iv)配列番号4のアミノ酸残基174~297のセグメントに対して少なくとも80%の配列類似性を有するセグメントおよび配列番号4のアミノ酸残基306~478のセグメントに対して少なくとも80%の配列類似性を有するセグメント、
(χ-v)配列番号5のアミノ酸残基198~322のセグメントに対して少なくとも80%の配列類似性を有するセグメントおよび配列番号5のアミノ酸残基350~522のセグメントに対して少なくとも80%の配列類似性を有するセグメント、もしくは
(χ-vi)配列番号6のアミノ酸残基112~288のセグメントに対して少なくとも80%の配列類似性を有するセグメントを含む、配列番号6の少なくとも200個の連続的なアミノ酸残基を含むセグメントに対して少なくとも80%の配列類似性を有するセグメント、
または
(δ-i)配列番号1のアミノ酸残基316~449のセグメントに対して1~25個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメントおよび配列番号1のアミノ酸残基453~582のセグメントに対して1~30個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
(δ-ii)配列番号2のアミノ酸残基315~483のセグメントに対して1~40個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメントおよび配列番号2のアミノ酸残基501~584のセグメントに対して1~30個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
(δ-iii)配列番号3のアミノ酸残基318~451のセグメントに対して1~30個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメントおよび配列番号3のアミノ酸残基455~584のセグメントに対して1~30個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
(δ-iv)配列番号4のアミノ酸残基174~297のセグメントに対して1~40個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメントおよび配列番号4のアミノ酸残基306~478のセグメントに対して1~40個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、
(δ-v)配列番号5のアミノ酸残基198~322のセグメントに対して1~40個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメントおよび配列番号5のアミノ酸残基350~522のセグメントに対して1~40個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント、もしくは
(δ-vi)配列番号6のアミノ酸残基112~288のセグメントに対して1~30個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメントを含む、配列番号6の少なくとも200個の連続的なアミノ酸残基を含むセグメントに対して1~40個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するセグメント。
これらすべての実施形態は、本明細書で定義されるそれぞれのセグメントの、最小配列同一性もしくは類似性についての好ましい値、またはアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失の好ましい数と組み合わされてもよい。
上記の項目(4)は、ScolE2、ScolE3、Scol E7、ScolE1aおよびScolEbの転移ドメインおよびそれらの誘導体を定義する。転移ドメインおよびそれらの誘導体の定義は、細胞傷害性ドメインおよび結合ドメインまたはそれらの誘導体の定義と組み合わされてもよい。転移ドメインおよびそれらの誘導体の定義は、特に以下で定義されるタンパク質の定義と組み合わされてもよい。
本発明のタンパク質は、項目(a-i)から(a-vi)のいずれか1つによる、または項目(b-i)から(b-vi)、(c-i)から(c-vi)もしくは(d-i)から(d-vi)の誘導体のいずれかによる、結合ドメイン(または結合セグメント)を有し得る。任意のそのような結合ドメインは、いずれか1つの項目(a-i)’から(a-vi)’、(b-i)’から(b-vi)’、(c-i)’から(c-vi)’または(d-i)’から(d-vi)’による触媒/細胞傷害性ドメインと組み合わされてもよい。サルモシンのドメイン構造は、本発明の様々なサルモシン由来のドメインまたは本明細書で定義されるそれらの誘導体が組み合わされて新規なサルモシン(キメラサルモシン)を形成する、人工サルモシンの確立を可能にする。そのようなキメラサルモシンでは、N末端からC末端に、転移ドメイン(存在すれば)、結合ドメインおよび触媒または活性ドメインの、天然サルモシンのドメイン配列は維持されても、されなくてもよく、好ましくは、これは維持される。したがって、本発明のタンパク質は、N末端からC末端に、項目(a-i)から(a-vi)のいずれか1つの、または項目(b-i)から(b-vi)、(c-i)から(c-vi)もしくは(d-i)から(d-vi)の誘導体のいずれかによる結合ドメイン、および項目(a-i)’から(a-vi)’、(b-i)’から(b-vi)’、(c-i)’から(c-vi)’または(d-i)’から(d-vi)’のいずれか1つの触媒ドメイン(セグメント)を含む。好ましい実施形態では、本発明のタンパク質は、N末端からC末端に、項目(a-i)’’から(a-v)’’、(b-i)’’から(b-v)’’、(c-i)’’から(c-v)’’または(d-i)’’から(d-v)’’のいずれか1つの転移ドメイン、項目(a-i)から(a-vi)のいずれか1つの、または項目(b-i)から(b-vi)、(c-i)から(c-vi)もしくは(d-i)から(d-vi)の誘導体のいずれかによる結合ドメイン、および項目(a-i)’から(a-vi)’、(b-i)’から(b-vi)’、(c-i)’から(c-vi)’または(d-i)’から(d-vi)’のいずれか1つの触媒ドメイン(セグメント)を含む。
サルモシンの3種の細胞傷害性活性、ヌクレアーゼ、孔形成およびムラミダーゼ(表1)内で、ドメインは、同じタイプの細胞傷害活性のサルモシン間で好ましくは交換される。例えば、RNaseタイプの細胞傷害性を有する新規サルモシンは、ScolE2またはScolE7の移行ドメインおよび結合ドメイン(または、これらのドメインの誘導体)ならびにScolE3の細胞傷害性ドメインから形成されてもよい。しかし、好ましくは、サブ項目(i)から(vi)の結合ドメインは、天然サルモシンに対する類似性を高めるために、それぞれ、サブ項目(i)’から(vi)’の触媒ドメインと、好ましくは、項目(a)から(d)のいずれかのそれぞれと組み合わされる。しかし、より好ましくは、サブ項目(i)から(v)の結合ドメインは、天然サルモシンに対する類似性を高めるために、好ましくは、項目(a)から(d)のいずれかの、それぞれサブ項目(i)’から(v)’の触媒ドメイン、およびそれぞれサブ項目(i)’’から(v)’’の転移ドメインと組み合わされる。
本発明は、好ましくはSalmonellaに対して細胞傷害性作用を発揮することができるタンパク質も提供し、前記タンパク質は、以下のアミノ酸配列を含むか、それからなる:
(A-i)配列番号1、
(A-ii)配列番号2、
(A-iii)配列番号3、
(A-iv)配列番号4、
(A-v)配列番号5、もしくは
(A-vi)配列番号6、
または
(B-i)配列番号1のアミノ酸配列に対して、少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より一層好ましくは少なくとも90%、より一層好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
(B-ii)配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも93%、より一層好ましくは少なくとも96%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
(B-iii)配列番号3のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より一層好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
(B-iv)配列番号4のアミノ酸配列に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より一層好ましくは少なくとも90%、より一層好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
(B-v)配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より一層好ましくは少なくとも90%、より一層好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列、もしくは
(B-vi)配列番号6のアミノ酸配列に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より一層好ましくは少なくとも90%、より一層好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
または
(C-i)配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有するアミノ酸配列、
(C-ii)配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有するアミノ酸配列、
(C-iii)配列番号3のアミノ酸配列に対して少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有するアミノ酸配列、
(C-iv)配列番号4のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より一層好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有するアミノ酸配列、
(C-v)配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より一層好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有するアミノ酸配列、もしくは
(C-vi)配列番号6のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より一層好ましくは少なくとも95%の配列類似性を有するアミノ酸配列、
または
(D-i)配列番号1のアミノ酸配列に対して1~40個、好ましくは1~30個、より好ましくは1~20、最も好ましくは1~10個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、
(D-ii)配列番号2のアミノ酸配列に対して1~40個、好ましくは1~30個、より好ましくは1~20、最も好ましくは1~10個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、
(D-iii)配列番号3のアミノ酸配列に対して1~40個、好ましくは1~30個、より好ましくは1~20、最も好ましくは1~10個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、
(D-iv)配列番号4のアミノ酸配列に対して1~40個、好ましくは1~30個、より好ましくは1~20、最も好ましくは1~10個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、
(D-v)配列番号5のアミノ酸配列に対して1~40個、好ましくは1~30個、より好ましくは1~20、最も好ましくは1~10個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、もしくは
(D-vi)配列番号6のアミノ酸配列に対して1~40個、好ましくは1~30個、より好ましくは1~20、最も好ましくは1~10個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、
または
(E-i)配列番号1の少なくとも470個、好ましくは少なくとも525個、より好ましくは少なくとも555個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列、
(E-ii)配列番号2の少なくとも470個、好ましくは少なくとも525個、より好ましくは少なくとも555個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列、
(E-iii)配列番号3の少なくとも470個、好ましくは少なくとも525個、より好ましくは少なくとも555個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列、
(E-iv)配列番号4の少なくとも390個、好ましくは少なくとも435個、より好ましくは少なくとも460個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列、
(E-v)配列番号5の少なくとも425個、好ましくは少なくとも475個、より好ましくは少なくとも500個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列、もしくは
(E-vi)配列番号6の少なくとも250個、好ましくは少なくとも270個、より好ましくは少なくとも282個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列。
別の実施形態では、本発明は、好ましくはSalmonellaに対して細胞傷害性作用を発揮することができるタンパク質を提供し、前記タンパク質のアミノ酸配列は、項目(A-i)から(A-vi)、(B-i)から(B-vi)、(C-i)から(C-vi)、(D-i)から(D-vi)または(E-i)から(E-vi)のいずれか1つで定義された通りである。
配列番号1~6の全配列に関するタンパク質の上記の定義は、利用可能な場合、1つまたは複数の特定のドメイン、例えば、結合および/もしくは触媒もしくは細胞傷害性ドメインならびに/または転移ドメインに基づいて、タンパク質の上記の定義と組み合わされてもよい。
本明細書では、配列同一性および類似性の決定は、Align Sequences Protein BLAST(BLASTP2.6.1+)(Stephen F.Altschul、Thomas L.Madden、Alejandro A.Schaffer、Jinghui Zhang、Zheng Zhang、Webb MillerおよびDavid J.Lipman(1997)、「Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs」、Nucleic Acids Res.25:3389~3402.)を使用して行われる。
項目(b)から(d)、(b)’から(d)’、(b)’’から(d)’’、または項目(B)から(D)もしくは(E)において上記で定義された本発明のドメインおよび/またはタンパク質の誘導体は、上記で定義された実施形態によって可能になる配列多様性にもかかわらず、以下で定義されるアミノ酸残基を保存し得る。好ましい実施形態では、アミノ酸残基(複数可)は、以下のものに対応する。
配列番号4の残基125はAsnもしくはSerである;
配列番号4の残基145はLysもしくはArgである;
配列番号4の残基151はAlaもしくはGlyである;
配列番号4の残基154はAla、SerもしくはGlyである;
配列番号4の残基155はPhe、LeuもしくはIleである;
配列番号4の残基158はAlaもしくはGlyである;
配列番号4の残基163はGlu、AspもしくはSerである;
配列番号4の残基165はAla、ThrもしくはValである;
配列番号4の残基167はArgである;
配列番号4の残基172はThr、AlaもしくはSerである;
配列番号4の残基175はGlnである;
配列番号4の残基176はValもしくはLeuである;
配列番号4の残基178はGlnである;
配列番号4の残基181はGluもしくはAsp、好ましくはGluである;
配列番号4の残基184はArgもしくはGln、好ましくはArgである;
配列番号4の残基192はAlaもしくはThrである;
配列番号4の残基195はAlaもしくはValである;
配列番号4の残基196はGluもしくはGln、好ましくはGluである;
配列番号4の残基198はAlaもしくはThrである;
配列番号4の残基209はLeuもしくはIle、好ましくはLeuである;
配列番号4の残基273はLeuもしくはIleである;
配列番号4の残基280はArgである;
配列番号4の残基283はLysである;
配列番号4の残基286はGlnもしくはLysである;
配列番号4の残基290はAlaもしくはThrである;
配列番号4の残基299はAsp、AsnもしくはGluである;
配列番号4の残基301はLeuである;
配列番号4の残基302はAsnもしくはAspである;
配列番号4の残基346はAsn、AspもしくはGluである;
配列番号4の残基363はLysもしくはAsnである;または
配列番号4の残基364はLysもしくはGlnである。
表現「アミノ酸残基…に対応するアミノ酸残基(複数可)」は、図20A~Cに示すアラインメントを指し、配列番号4のアミノ酸残基、または前記アラインメントにおいて配列番号4の示されるアミノ酸残基と同じ位置(すなわち、互いに上部に書かれている)を有する配列番号1~3、5もしくは6のアミノ酸残基を意味する。
ScolE1aおよびScolE1bの誘導体ならび/またはScolE1aおよびScolE1bの誘導体ドメインでは、図20のScolE1aとScolE1bのアラインメント中で同じである対応するアミノ酸残基は、ScolE1aおよびScolE1bと同じアミノ酸残基であり得、ならびに/またはScolE1aおよびScolE1bの中で異なるアミノ酸残基に対応する場合、そのような異なるアミノ酸残基のいくつかまたはすべては、ScolE1aまたはScolE1bと同様のアミノ酸残基であり得る(しかし、別のアミノ酸残基ではない)。
ScolE2およびScolE7の誘導体ならびに/またはScolE2およびScolE7の誘導体ドメインでは、図20のScolE2およびScolE7のアラインメントで同じである対応するアミノ酸残基は、ScolE2もしくはScolE7と同じアミノ酸残基であり得、ならびに/またはScolE2とScolE7の中で異なるアミノ酸残基に対応する場合は、そのような異なるアミノ酸残基のいくつかまたはすべては、ScolE2またはScolE7と同様のアミノ酸残基であり得る(しかし、別のアミノ酸残基ではない)。
本発明によるサルモシンは、付加的なN末端またはC末端アミノ酸配列ストレッチ、例えば精製用タグを、例えば6個以上の連続的なヒスチジン残基のHisタグとして、含むことができ、該誘導体は、好ましくは、N末端アミノ酸残基付加を有さない。
本発明のタンパク質(サルモシン)は、好ましくはSalmonella、特に、Salmonella enterica、より好ましくはSalmonella enterica ssp.entericaに対して、細胞傷害性作用を発揮することができる。この条件が満たされるかどうかは、スポットオンローン法による放射拡散アッセイを使用して実験的に試験することができる。Salmonella entericaに対する、試験されるタンパク質の細胞傷害性は、感受性Salmonella enterica株のcmあたり1×10cfu/mLの0.14mL細菌溶液を接種した軟寒天重層プレート上に、5マイクロリットルの前記試験されるタンパク質および配列番号1のタンパク質の溶液をスポッティングし、その後37℃で寒天プレートをインキュベートしてから12時間後に、前記タンパク質および配列番号1のタンパク質が、同じ直径の、Salmonella enterica ssp.enterica血清型Newport株ATCC(登録商標)6962(商標)の生存可能な細菌を含んでいないスポットを生成するというようなものであり、試験されるタンパク質の濃度は、タンパク質配列番号1の比較溶液のものの最大で5倍である。好ましい実施形態では、参照のポイントは配列番号1のタンパク質ではなく、その他の点では同一の条件下での配列番号4または5のタンパク質である。
本発明の組成物は、上記のタンパク質(サルモシン)および場合により、必要に応じて担体などのさらなる成分を含む。組成物は、好ましくは、ScolE1aおよび/もしくはScolE1bまたは上記のその誘導体、ならびに場合により、必要に応じて担体などのさらなる成分を含む。組成物は、本明細書で定義される1種または複数の異なるタンパク質(サルモシン)、例えば、本明細書で定義される2種、3種または4種の異なるタンパク質(サルモシン)を含むことができる。「異なる」は、タンパク質が、少なくとも1つのアミノ酸残基が異なることを意味する。組成物は、上記の項目(i)から(vi)のいずれか1つによって代表される同じクラス由来の、または、好ましくは、上記の項目(i)から(vi)のいずれか1つによって代表される異なるクラス由来の、2種、3種またはそれ以上のサルモシンを含むことができる。組成物は、クラス(i)のタンパク質およびクラス(iv)または(v)のタンパク質を少なくとも含むことができる。組成物は、例えば、EHECなどの病原性E.coliを同時に制御するために、例えば、EP3097783A1に記載されているような1種または複数のE.coliコリシンまたはその誘導体をさらに含むことができる。
本発明のタンパク質は植物またはその細胞における発現によって好ましくは生成されるので、組成物は植物材料またはその抽出物でもよく、植物材料は、本タンパク質を発現した植物、好ましくは、前記タンパク質を発現したNicotianaまたは食用植物由来の材料である。植物材料の抽出物は、前記植物材料中に存在するか、前記植物材料中で発現している本発明のサルモシンを含めた水溶性タンパク質を含む水溶液であるか、そのような水溶液の乾燥生成物である。抽出物は、好ましくは、例えば濾過または遠心分離によって除去される、植物材料の水不溶性成分を有する。植物材料は、ホウレンソウ、フダンソウ、ビートの根、ニンジン、サトウダイコン、リーフィービート、アマランス、Nicotianaからなる群から選択される植物由来の材料でもよく、および/または前記植物材料は、1つもしくは複数の葉、根、塊茎もしくは種子、もしくは前記葉、根、塊茎もしくは種子の破砕された、製粉された、もしくは粉砕された生成物である。
組成物または植物材料からの前記抽出物は、前記サルモシン(複数可)を含む固体または液体組成物、例えば、溶液または分散体でもよい。液体組成物は、水性、例えば水溶液でもよい。前記水性分散体または溶液中の前記タンパク質の濃度は、0.0001~1mg/ml、好ましくは0.001~0.1mg/ml、より好ましくは0.005~0.05mg/mlでもよい。Salmonellaに対して細胞傷害性作用を発揮することができる1種より多いサルモシンが用いられる場合、これらの濃度はすべてのそのようなサルモシンの合計濃度に関する。
水溶液は、1種または複数のサルモシンの他に、バッファーを含むことができる。バッファーは、無機酸もしくは有機酸またはそれらの塩でもよい。無機酸の例はリン酸またはその塩である。有機酸の例は、HEPES、酢酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸、安息香酸、桂皮酸、グリコール酸、乳酸、クエン酸およびアスコルビン酸である。好ましい有機酸は、リンゴ酸、乳酸、クエン酸およびアスコルビン酸である。溶液のpHは一般に、4~8、好ましくは5~8、より好ましくは6.0~7.5でもよい。組成物が適用される対象物が肉である場合、溶液のpHは、一般に、4~8、好ましくは4.5~7、より好ましくは5.0~6.5、さらにより好ましくは5.0~6.0でもよい。さらに、溶液は、グリセロールまたは塩などの等張剤を含むことができる。使用するのに好ましい塩は塩化ナトリウムである。1種または複数のサルモシンを含む水溶液は、さらなる溶質、例えば塩、例えば、50~400mM NaCl、好ましくは100~200mM NaClを含むことができる緩衝化水溶液でもよい。水溶液は、スルフヒドリル化合物、例えば、ジチオスレイトール(DTT)、ジチオエリスリトール、チオエタノールまたはグルタチオン、好ましくはDTTをさらに含むことができる。水溶液中のスルフヒドリル化合物の合計の濃度は、1~50mM、好ましくは2~20mM、より好ましくは4~10mMでもよい。
本発明の組成物が固体組成物である場合、それは、上述の抽出物または溶液の凍結乾燥により得られる凍結乾燥化固体組成物などの粉末でもよい。粉末は、水溶液について上述したものなどのさらなる固体成分を含むことができる。使用前に、これは、適切な液体、例えば水またはバッファーで再構成され得る。固体組成物は、バッファー、塩または前述の他の成分を含むことができ、その結果、固体組成物の再構成または溶解の際に、上述される濃度が達成され得る。
組成物の担体の例は、溶媒、例えば水または水性バッファー(上記の通り)、塩、糖、例えば単糖類および二糖類、糖アルコール、ならびに他の担体、例えば医薬組成物で既知であるものである。後者の例は、デンプン、セルロースおよび他のタンパク質、例えばアルブミンである。糖の例は、グルコース、フルクトース、ラクトース、ショ糖およびマルトースである。
本発明の組成物は、組成物中のタンパク質の総重量に基づいて、少なくとも10重量%、好ましくは少なくとも20重量%、より好ましくは少なくとも30重量%、より一層好ましくは少なくとも50重量%、より一層好ましくは少なくとも75重量%の1種または複数の本発明のサルモシンを含むことができる。組成物中のサルモシン(複数可)含量は、組成物をSDS-PAGEにかけ、染色後に、ゲルのバンドの強度を決定することによって得られたゲルを解析することによって、決定され得る。それによって、サルモシンによるバンドの強度が、組成物中のすべてのタンパク質によるバンドの強度の合計に対して決定され得る。組成物中の全タンパク質含量は、周知のブラッドフォードプロテインアッセイを使用して決定され得る。
一実施形態では、本発明の組成物は医薬組成物である。医薬組成物は、本発明の1種または複数のサルモシン(複数可)の他に、場合により、E.coliコリシンおよび/または1種もしくは複数の医薬的に許容可能な適切な賦形剤を含むことができる。
本発明は、Salmonellaによる対象物の感染または汚染を予防するまたは減少させる方法であって、1種または複数の上記のタンパク質(サルモシン)または上記の組成物と前記対象物を接触させることを含む方法を提供する。対象物は、任意の非有機対象物または有機対象物、例えば食品の表面でもよい。Salmonellaによる対象物の汚染は、対象物への生存可能なSalmonella細胞の付着を意味する。Salmonellaによる汚染を減少させることは、対象物に付着している生存可能なSalmonella細胞の数を減らすことを意味する。Salmonellaによる対象物の汚染の確認は、一般的知識の一部である。例えば、実施例で行われるような、ホモジナイズした食品の溶液もしくは分散体の希釈プレーティング、または他の対象物の水洗溶液の希釈プレーティングを使用することができ、それに続いて細菌コロニーを数える。好ましくは、対象物は食品または動物飼料である。食品は、肉、例えば、家禽の死体全体、生肉、調理肉および挽肉、卵、例えば、生卵、全卵、殻をむいた調理卵、炒り卵、目玉焼き、生の果物、または生のもしくは調理された野菜でもよい。
対象物を前記タンパク質もしくは組成物で処理する、または前記タンパク質もしくは組成物と接触させるために、上記のタンパク質の溶液または液体組成物は、一般に対象物と接触させられる。例えば、前記対象物は、本発明の組成物としての水溶液で噴霧されるか、または水溶液中に浸漬される。対象物は、少なくとも10秒間、好ましくは少なくとも1分間、好ましくは少なくとも5分間、水溶液中に浸されてもよい。対象物を液体組成物と接触させることは、対象物の表面上に組成物を分布させるのに役立つ。十分に均一な分布を達成することができる場合、例えば、肉を細かく切ると、本発明による固体組成物と対象物を接触させることが可能である。
本発明は、それらを必要とする対象のSalmonellaによる感染を処置する方法であって、1種または複数の上記のタンパク質(サルモシン)または上記の組成物を前記対象に投与することを含む方法も提供する。対象は、ヒトまたは哺乳動物、例えば家畜でもよい。家畜の例は家禽およびウシである。一般に、サルモシン(複数可)および場合により上記のさらなる成分を含む液体または固体の医薬組成物は、動物またはヒトに投与するために調製される。液体組成物は上記の水溶液でもよい。固体組成物は、例えば凍結乾燥形態の、少なくとも1種のサルモシン(複数可)を含む粉末、またはそのような粉末から得られる錠剤、またはそのような粉末で満たされたカプセルでもよい。投与は経口でもよい。この場合、医薬調製物は、胃の酸媒体によって攻撃されることなしに胃の通過を可能にするものである。次いで、サルモシン(複数可)は、腸で医薬調製物から放出されなければならない。そのような医薬調製物は当技術分野で既知である。例は、胃の酸媒体に抵抗性の錠剤およびカプセルである。生物材料、例えば、発現されたサルモシン(複数可)を含むE.coliまたは植物材料を経口的に患者に投与することがさらに可能である。サルモシン(複数可)は、ヒト患者に対して1日あたり1mg~1000mg、好ましくは1日あたり10mg~250mgの量で、ヒトの成人に投与され得る。そのような量はまた、動物に投与されてもよい。プロバイオティックアプローチでは、少なくとも1種のサルモシン(複数可)を発現する遺伝子修飾微生物を患者に投与することによって、患者は処置され得る。遺伝子修飾微生物は、遺伝子修飾された非病原性E.coliまたは乳製品の発酵で一般に用いられる乳酸産生微生物でもよい。乳酸産生微生物の例は、Lactobacillus lactisなどのLactobacillus属の細菌、およびBifidobacterium bifidumまたはBifidobacterium breveなどのBifidobacteriumである。別の投与経路は、Salmonellaによる感染を予防するための、患者の血流中への注射による。この目的のために、サルモシン(複数可)は生理食塩水中に溶解されてもよく、この溶液は無菌化される。
上記の方法では、SalmonellaはSalmonella enterica、好ましくはSalmonella enterica ssp.entericaである。
サルモシンScolE1aおよびScolE1bは、以下の実施例で実証されるように、Salmonellaの、特にSalmonella entericaの、好ましくはSalmonella enterica ssp.entericaの多くの異なる血清型に対して特に広い活性を有する。したがって、ScolE1aおよびScolE1bまたはそれらの誘導体は、好ましくは、任意のSalmonella enterica、好ましくは任意のSalmonella enterica ssp.entericaによる感染を処置する、またはこれらによる汚染を予防するもしくは減少させるのに使用される。サルモシンE2、E3、E7およびSpstも標的Salmonellaに対して広い活性を有する。しかし、ScolE2およびそれらの誘導体は、表5Aおよび5Bで定義される株1、3、4、15、20、22~30に対して好ましくは使用され得る。ScolE3およびそれらの誘導体は、表5Aおよび5Bで定義される株1、3、4、17および20~25に対して好ましくは使用され得る。ScolE7およびそれらの誘導体は、表5Aおよび5Bで定義される株1、3、4、5、15、20、22~30および32に対して好ましくは使用され得る。
本発明によるサルモシンは、標準的な発現系におけるタンパク質発現の既知の方法によって生成されてもよい。サルモシンを生成するためには、それをコードするヌクレオチド配列が適切な宿主生物で発現され得る。目的のタンパク質を生成および精製するのに使用可能な方法は従来技術で説明されており、任意のそのような方法が使用され得る。例えば、一般に当技術分野で既知のE.coli発現系が使用され得る。真核生物の発現系が使用される場合、クローニングに使用される細菌生物に対する毒性を予防するために、サルモシンのコード配列中に1種または複数のイントロンが挿入され得る。
特に効率的な発現方法は、従来技術でも知られている植物発現系である。本発明によるサルモシンを発現させるのに使用可能な植物発現系は実施例に記載されている。植物において目的のヌクレオチド配列の発現を達成する可能な方法は、サルモシンをコードするヌクレオチド配列を含む自己複製(ウイルス)レプリコンの使用である。サルモシンのコード配列は、植物または発現宿主として使用される特定の植物における発現のためにコドン最適化されてもよい。植物ウイルス発現系は、多くの刊行物、例えば、WO2012019660、WO2008028661、WO2006003018、WO2005071090、WO2005049839、WO2006012906、WO02101006、WO2007137788またはWO02068664に記載されており、多くのさらなる刊行物がこれらの文献で引用されている。一過的発現のために、DNA分子などの核酸分子を植物または植物部分に導入するための様々な方法は、既知である。アグロバクテリアは、例えば、アグロインフィルトレーションまたはアグロバクテリア懸濁液のスプレーによって、核酸分子(ベクター)または核酸コンストラクトを植物にトランスフェクトするのに使用され得る。参考文献については、WO2012019660、WO2014187571,またはWO2013149726を参照されたい。
目的のタンパク質としてのサルモシンの強い発現が所望される実施形態では、サルモシンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトは、植物細胞中で複製してウイルスベクターのレプリコンを形成することができるウイルスベクターをコードすることができる。複製するために、ウイルスベクターおよびレプリコンは、植物細胞中に存在する核酸ポリメラーゼによって、例えば、レプリコンから発現されたウイルスポリメラーゼによって認識され得る複製開始点を含むことができる。RNAウイルスベクター(「RNAレプリコン」と称される)の場合は、レプリコンは、植物細胞の核にDNAコンストラクトが導入された後に、植物細胞におけるプロモーター活性の制御下にある転写によって、DNAコンストラクトから形成され得る。DNAレプリコンの場合は、レプリコンは、例えば、WO00/17365およびWO99/22003に記載されているように、DNAコンストラクト中のウイルスレプリコンをコードする配列に隣接する2つの組換え部位間の組換えによって形成され得る。レプリコンがDNAコンストラクトにコードされる場合は、RNAレプリコンが好ましい。DNAおよびRNAウイルスベクター(DNAまたはRNAレプリコン)の使用は、長年にわたって文献に広範に記載されている。いくつかの実施例は以下の特許公報である:WO2008028661、WO2007137788、WO2006003018、WO2005071090、WO2005049839、WO02097080、WO02088369、WO02068664。DNAウイルスベクターの例は、ジェミニウイルスに基づくものである。本発明については、ウイルスベクターまたはレプリコンは、植物RNAウイルス、特にプラス-センス一本鎖RNAウイルスに基づくものが好ましくは使用され得る。したがって、ウイルスレプリコンはプラス-センス一本鎖RNAレプリコンでもよい。そのようなウイルスベクターの例は、タバコモザイクウイルス(TMV)およびポルテクスウイルスX(PVX)に基づくものである。「に基づく」は、ウイルスベクターがレプリカーゼおよび/またはこれらのウイルスの複製に関与する他のタンパク質などの複製系を使用することを意味する。ポルテクスウイルスに基づくウイルスベクターおよび発現系は、EP2061890またはWO2008/028661に記載されている。
サルモシンは多細胞植物またはその一部、特に、高等植物またはその一部で発現され得る。単子葉植物と双子葉(作物)植物の両方が使用され得る。目的のタンパク質を発現させるのに使用可能な一般的な植物としては、Nicotiana benthamiana、Nicotiana tabacum、ホウレンソウ、Brassica campestris、B.juncea、ビート(Beta vulgaris)、クレソン、アルグラ、カラシナ、イチゴ、Chenopodium capitatum、レタス、ヒマワリ、キュウリ、ハクサイ、キャベツ、ニンジン、ネギ、タマネギ、ダイコン、レタス、フィールドピー、カリフラワー、ブロッコリー、ゴボウ、カブ、トマト、ナス、カボチャ、スイカ、プリンスメロンおよびメロンが挙げられる。好ましい植物は、ホウレンソウ、フダンソウ、ビートの根、ニンジン、サトウダイコン、Nicotiana tabacumおよびNicotiana benthamianaである。食用植物における発現は、植物またはそれから作られた食品のSalmonellaによる汚染を予防するのに使用され得る。一実施形態では、通常はヒトまたは動物のフードチェーンに入らない植物、例えば、N.tabacumおよびN.benthamianaなどのNicotiana種が使用される。
一般に、目的のタンパク質としてのサルモシンは、植物または植物部分の細胞サイトゾルで発現される。この場合、目的のタンパク質を特定の区画に導くシグナルペプチドはタンパク質に加えられない。あるいは、目的のタンパク質は植物の葉緑体で発現され得るか、そこにターゲッティングされ、後者では、プラスチドトランジットペプチドまたは葉緑体ターゲティングペプチドと一般に称されるN末端プレ配列が、目的のタンパク質としてのサルモシンのN末端またはC末端、好ましくはN末端に加えられる。
サルモシンは、植物組織に対する毒性を防ぐために、特にサルモシンがヌクレアーゼ活性を有する場合、実験セクションに記載されている免疫タンパク質とともに共発現され得る。共発現される得る適切な免疫タンパク質は、以下の表2に示されるものである。
少なくとも1種のサルモシンを含む組成物を生成する方法では、サルモシンは、第1ステップでは、植物または植物の細胞、例えば食用植物中で発現される。次のステップでは、サルモシンを発現した植物から発現サルモシンを含む植物材料が採取される。植物材料は、例えば、葉、根、塊茎もしくは種子、または葉、根、塊茎もしくは種子の破砕された、製粉された、もしくは粉砕された生成物でもよい。ステップ(iii)では、水性バッファーを使用してサルモシンが植物材料から抽出される。これは、植物材料がホモジナイズされること、および遠心分離または濾過によって不溶性物質が除去され得ることを含むことができる。サルモシンを含む可溶性成分は水性バッファー中に抽出されて、水性バッファー中のサルモシン溶液をもたらす。水性バッファーは、無機酸もしくは有機酸またはそれらの塩を含むことができ、本発明の組成物としての水溶液について上記で定義されたpHを有し得る。さらに、水性バッファーは、同様に本発明の組成物としての水溶液について上に記載した塩および/またはスルフヒドリル化合物を含むことができる。比較的純粋のサルモシン組成物が所望される場合、水性バッファー中のサルモシン溶液は、タンパク質精製の既知の方法に従ってステップ(iv)で望ましくない成分を除去することによって、さらに精製され得る。
したがって、本発明は、本発明によるタンパク質を含む組成物を生成する方法を提供し、前記方法は、
(i)上記の植物、好ましくは食用植物またはNicotiana中で前記タンパク質を発現させるステップ、
(ii)前記植物から発現タンパク質を含む植物材料を採取するステップ、
(iii)水性バッファーを使用して前記植物材料から前記タンパク質を抽出して、前記タンパク質を含む組成物を得るステップ、
場合により、前記組成物から望ましくない混入物を除去するステップ
を含む。
サルモシンが植物で発現される場合、タンパク質を発現する植物またはその組織が採取され、組織はホモジナイズされてもよく、不溶性物質は遠心分離または濾過によって除去されもよい。比較的純粋なサルモシンが所望される場合、サルモシンは他の宿主細胞タンパク質および植物代謝産物、例えば、アルカロイドおよびポリフェノールを除去することができるタンパク質精製の一般に既知の方法によって、例えば、クロマトグラフィー方法によって、さらに精製されてもよい。精製されたサルモシン溶液は、濃縮および/または凍結乾燥されてもよい。
サルモシンが食用植物中で発現される場合は、食用植物からの粗製タンパク質抽出物または半精製された濃縮物が、Salmonellaによる食品などの対象物の汚染を予防するまたは減少させるのに使用され得る。
実施例1:プラスミドコンストラクト(サルモシン)
4つの活性群を代表する6種のサルモシンを選択した(表1)。
Figure 0007136796000001
このリストは、サルモシンScolE2、ScolE3、ScolE7、ScolE1a、ScolE1bおよびSpstを含む。それぞれのアミノ酸配列はGenBankから取得し、Nicotiana benthamianaについて最適化されたコドン使用頻度を有する対応するヌクレオチド配列は、Thermo Fisher Scientific Inc.が合成した。サルモシンScolE2、ScolE3およびScolE7の場合は、クローニングに使用されるEscherichia coli細胞における細胞傷害性を防ぐために、コード配列をcat1イントロン(カタラーゼCat1に対するRicinus communiscat1遺伝子の第1イントロン(GenBank:D21161.1、ヌクレオチド位置679から867))の挿入によって中断した。サルモシンのコード配列をTMVベースのアセンブルしたウイルスベクターpNMD035(WO2012/019660に詳しく記載されている)に挿入して、図1A~Bに描写するプラスミドコンストラクトを得た。
予備的な発現研究において、ヌクレアーゼ(RNaseおよびDNase)活性を有するバクテリオシンは、通常、それが発現している植物組織に対して非常に有毒であることが分かった。その発現は、組織の壊死および組換えタンパク質の不十分な蓄積をもたらした。しかし、適切な免疫タンパク質との共発現は毒性作用を低減させ、これらのバクテリオシンの蓄積を劇的に増大させた。本発明者らの研究で使用したサルモシン免疫タンパク質を表2に列挙する。
Figure 0007136796000002
それぞれサルモシンScolE2およびScolE7に対する免疫タンパク質SImmE2およびSImmE7。免疫タンパク質のアミノ酸配列はGenBankから取得し、Nicotiana benthamianaについて最適化されたコドン使用頻度を有する対応するヌクレオチド配列は、Thermo Fisher Scientific Inc.が合成し、WO2012/019660に記載されているPVXベースのアセンブルしたウイルスベクターpNMD670にサブクローニングした。得られたプラスミドコンストラクトを図1Aに示す。
実施例2:サルモシンの発現スクリーニング
針なし注射器を使用して、サイトゾル性サルモシン発現のためのTMVベースのアセンブルしたベクターを保有する希釈したAgrobacterium tumefaciens培養物を6週齢のNicotiana benthamiana植物にインフィルトレートした。サルモシンScolE2およびScolE7の場合は、サルモシン発現のためのTMVベースのベクターを保有するAgrobacterium培養物を対応する免疫タンパク質の発現のためのPVXベースのベクターを保有する他の培養物と等比率で混合した。それぞれの一晩培養物をOD600=1.5に調整し、10mM MES、pH5.5および10mM MgSOを含むインフィルトレーションバッファーでさらに1:100に希釈した。本実験で使用したプラスミドコンストラクトを表3に概説する。最適な採取時点を決定するために、インフィルトレーション後のいくつかの時点で植物材料を採取し、これを50mM HEPES(pH7.0)、10mM酢酸カリウム、5mM酢酸マグネシウム、10%(v/v)グリセロール、0.05%(v/v)Tween-20および300mM NaClを含む5倍容量のバッファーを用いるタンパク質抽出に使用した。ブラッドフォードアッセイを使用して全可溶性タンパク質(TSP)の濃度を決定し、クマシー染色を用いるSDS-PAGEを使用してTSP抽出物を解析した。本発明者らの実験では、試験したすべてのサルモシンは、ウシ血清アルブミン(BSA)タンパク質との比較によって決定した場合に、1.2から1.8mg組換えコリシン/g FWの間または18から47%のTSPの間で変動して、適度に高レベルで発現していた(表4)。
Figure 0007136796000003
Figure 0007136796000004
実施例3:サルモシンの活性スクリーニング
本発明者らは、S.enterica ssp.entericaの33の異なる血清型の36株に対して、植物で作られた組換えサルモシンの抗菌活性を解析した。本実験で使用した株の詳細を表5Aおよび5Bに示す。
Figure 0007136796000005
組換えサルモシン含有植物抽出物の抗菌活性をスポットオンローン法による放射拡散アッセイで試験した。この目的のために、試験されるSalmonella株の細胞を含む軟寒天で覆われた寒天プレートを調製した。10×10cmの正方形ペトリ皿に15~20mlのLB寒天培地(1.5%w/v寒天)を注いだ。LB軟寒天培地(0.8%(w/v)寒天)を溶かし、20mlの一定分量を50mlプラスチックチューブに移し、その温度を50~55℃に合わせた。LB培地でOD600=1.0に調整したSalmonellaの一晩培養物を1:100の比で軟寒天培地に加えて、最終的にOD600=0.01またはおよそ1×10細胞/mlにし、事前に注がれたLBプレート上にSalmonella試験株を含む20mlのLB軟寒天を注いで、cmあたり1×10cfu/mLの0.14mL細菌溶液を得た。
実施例2に記載されているように植物葉材料を抽出した。同じ抽出バッファーを使用して、無希釈の試料から出発して、植物抽出物の1:1希釈系列を調製した。TSP希釈系列の5μlの一定分量を寒天プレートに加え、プレートを37℃で一晩インキュベートした。抗菌活性をクリアリングゾーンに基づいて評価した。
6種の試験したサルモシンの中で、1種は狭い抗菌活性を示し(Spst-12%の株を阻害した)、1種のサルモシンは中間の活性スペクトルを有し(ScolE3-60%の株を阻害した)、他の4種は広い活性スペクトルを有していた:ScolE2およびScolE7-約90%の株を阻害した。ScolE1aおよびScolE1b-100%の株を阻害した(図3)。
サルモシンScolE1およびScolE1bは、試験したSalmonella株に対して、広いだけでなく、著しく高い活性も示した(図4、5)。
半定量的な比較のために、任意単位(AU)での組換えコリシンの相対抗菌活性を示し、これは、放射拡散アッセイにおいて検出可能なクリアリング作用をもたらすタンパク質抽出物の最高の希釈に対する希釈係数として計算した。植物組織のmg FWあたりのAUで計算したSalmonella株に対するサルモシンの抗菌活性を、それぞれ、ScolE2、ScolE3、ScolE7、ScolE1aおよびScolE1bについて、図6、8、10、12および14に示す。これによって、バイオマスの単位あたりの特異的活性薬剤の収量、すなわち、宿主の特異的生産能力が反映される。
図7、9、11、13および15は、それぞれ、組換えサルモシンタンパク質ScolE2、ScolE3、ScolE7、ScolE1aおよびScolE1bのμgあたりのAUで計算した同じ活性を示し、これは、サルモシンの特異的抗菌効力を反映する。
実施例4:プラスミドコンストラクト(コリシン)
2つの活性群を代表する6種のコリシンを選択した(表6)。このリストは、コリシンcolS4、col5、col10、colIa、colIbおよびcolMを含む。それぞれのアミノ酸配列はGenBankから取得し、Nicotiana benthamianaについて最適化されたコドン使用頻度を有する対応するヌクレオチド配列は、Thermo Fisher Scientific Inc.が合成した。コリシンコード配列をTMVベースのアセンブルしたウイルスベクターpNMD035(WO2012/019660に詳しく記載されている)に挿入して、図16に描写するプラスミドコンストラクトを得た。コリシンMのコード配列を、cat1イントロン(カタラーゼCat1に対するRicinus communiscat1遺伝子の第1イントロン(GenBank:D21161.1、ヌクレオチド位置679から867))の挿入によって中断した。
Figure 0007136796000006
実施例5:コリシンの発現スクリーニング
針なし注射器を使用して、サイトゾル性コリシン発現のためのTMVベースのアセンブルしたベクターを保有する希釈したAgrobacterium tumefaciens培養液を6週齢のNicotiana benthamiana植物にインフィルトレートした。Agrobacterium一晩培養物をOD600=1.5に調整し、10mM MES、pH5.5および10mM MgSOを含むインフィルトレーションバッファーでさらに1:100に希釈した。本実験で使用したプラスミドコンストラクトを表7に概説する。最適な採取時点を決定するために、インフィルトレーション後のいくつかの時点で植物材料を採取し、これを50mM HEPES(pH7.0)、10mM酢酸カリウム、5mM酢酸マグネシウム、10%(v/v)グリセロール、0.05%(v/v)Tween-20および300mM NaClを含む5倍容量のバッファーを用いるタンパク質抽出に使用した。ブラッドフォードアッセイを使用して全可溶性タンパク質(TSP)の濃度を決定し、クマシー染色を用いるSDS-PAGEを使用してTSP抽出物を解析した。本発明者らの実験では、試験したすべてのコリシンは、ウシ血清アルブミン(BSA)タンパク質との比較によって決定した場合に、1.5から4.7mg組換えコリシン/g FWの間または16から41%のTSPの間で変動して、適度に高レベルで発現していた(表8)。
Figure 0007136796000007
Figure 0007136796000008
実施例6:コリシンの活性スクリーニング
本発明者らは、S.enterica ssp.entericaの32の異なる血清型の35株に対して、植物で作られた組換えコリシンの抗菌活性を解析した。本発明者ら実験で使用した株の詳細を表5Aおよび5B(株番号1~35)に示す。
組換えコリシン含有植物抽出物の抗菌活性を、実施例3に記載されているスポットオンローン法による放射拡散アッセイで試験した。
6種の試験したコリシンの中で、1種は狭い抗菌活性を示し(colS4-25%の株を阻害した)、3種のコリシンは中間の活性スペクトルを有し(col5、col10およびcolM-それぞれ48%、46%および42%の株を阻害した)、2種のコリシンは広い活性スペクトルを有していた:colIaおよびcolIb-それぞれ96%および89%の株を阻害した(図17)。
実施例7:肉マトリックスに加えたS.enterica ssp.entericaの病原性株に対するバクテリオシン(コリシン混合物)の殺菌作用の効果の決定
植物で生成したコリシンを、病原性Salmonellaで汚染したニワトリ胸肉の切り身の試料に対する抗菌活性について試験した。
効果の評価は、汚染した肉試料(後に、植物で作られた組換えコリシンの混合物または同じ生産宿主であるがコリシンを含まない植物抽出物からなる対照担体溶液で処理し、処理した肉試料を4℃で様々な期間にわたって保存した)における病原性S.enterica ssp.enterica集団の解析を包含する。
代表的な消費者向製品でバクテリオシン活性が評価されることを確実にするために、肉試料の特別な供給源は使用しない。生のニワトリ胸肉の切り身は実験の1日前に小売店で購入する(これらの研究については、ALDI supermarket、Halle、Germany)。肉は4℃で保存し、実験的曝露の前に洗浄または前処理しない。
肉試験マトリックスは、それぞれ血清型TyphimuriumおよびEnteritidis(ATCC(登録商標)9270(商標)、ATCC(登録商標)13076(商標))またはTyphimurium、Enteritidis、NewportおよびAnatum(ATCC(登録商標)9270(商標)、ATCC(登録商標)13076(商標)、ATCC(登録商標)6962(商標)およびATCC(登録商標)9270(商標))を代表する2または4種のSalmonella enterica ssp.enterica株の1:1または1:1:1:1混合物で、実験的に汚染させる(それぞれ、図18および19)。肉の汚染より前に、これらの株をOD600=0.3まで個々に増殖させ、1:1または1:1:1:1で混合する。株混合物を、約2×10cfu/g肉の初期接種菌液を得るための肉汚染懸濁液として使用するために、所望の細胞数(OD600=0.005~0.001、2×10~1.8×10cfu/ml)までLBブロスでさらに希釈する。ニワトリの胸肉のトリム(約25g重量の3片)を12mlの細菌懸濁液中に浸し、裏返して再び浸して、両面に接種する。30分間、汚染した肉は乾燥させ、細菌は、マトリックス試料に室温でコロニー形成させ、その間、ニワトリの胸肉のトリムを15分ごとに裏返す。
汚染した肉は、アトマイザーフラスコを使用する低圧スプレー(2~4バール)によって、担体またはコリシン混合溶液(N.benthamianaの非処理植物材料もしくはコリシン発現のためにAgrobacteriumを注射器で接種した際の植物材料のいずれか由来の、50mM HEPES pH7.0、10mM Kアセテート、5mM Mgアセテート、10%(v/v)グリセロール、0.05%(v/v)Tween-20、300mM NaClで調製されたTSP抽出物)のいずれかで処理する。提唱される添加量はコリシンMについて3mg/kgならびに混合物中で使用される任意の他のコリシンについて1mg/kg(コリシンIaおよびコリシン5)である。肉を15分ごとに裏返しながら室温で30分間さらにインキュベートする。
コリシンを加えてから30分後に、約25gのニワトリの胸肉のトリムの一定分量を反復して無菌試料袋(BagFilter(登録商標)400P)中に入れ、各試料の正確な重量を記録し、試料袋を閉じクリップ(BagClip(登録商標)400)を使用して閉じる。全体で、肉試料をコリシン処理してすぐに室温で1時間インキュベートしてから、次いで、密閉した肉試料を4℃で保存する。
マトリックス上の微生物汚染レベルを決定するために、4℃で1時間、48時間および72時間の保存で肉試料をサンプリングする。肉試料から病原性Salmonellaを回収するために、肉試料の各約25gの一定分量に約100mlの緩衝化ペプトン水を加える。実験用ブレンダー(BagMixer(登録商標)400CC(登録商標);設定:ギャップ0、時間30秒、スピード4)中で試料をホモジナイズする。保存袋の濾過部からの微生物懸濁液を収集し、1:10希釈系列を調製する。無希釈のまたは希釈した微生物懸濁液の100μlの一定分量をXLD寒天状上にプレーティングする。このプレートを37℃で18~24時間インキュベートし、CFU(コロニー形成単位)を数える。g試料あたりのCFU数を以下のように計算する:
全CFU実際のCFU×濃度係数×希釈係数×実際のmlペプトン水
g肉 0.1mlプレーティング量 実際のg試料
実験的に汚染させた肉試料中の生存可能な病原性Salmonellaの数の減少におけるコリシン処理の効果を、GraphPad Prism v.6.01を使用して一元配置ANOVA(チューキーの多重比較検定)および独立パラメトリックt検定によって、担体処理対照試料およびコリシン処理試料で得られたデータを比較することにより評価する。
それぞれ2株または4株のSalmonellaの汚染について、細菌数の結果を図18および19に示す。細菌集団の最も著しい減少(1.8log)は、コリシン処理してすぐに1時間保存した後に既に生じた。
要約すると、汚染した肉におけるSalmonella集団の統計学的に有意な減少は、コリシン混合物で肉を処理することによって達成することができる。
サルモシン混合物またはサルモシン/コリシン混合物は、Salmonellaからの食品製品の汚染除去について試験され、食品産業においてSalmonella汚染を減少させるのに使用されることが計画される。サルモシンScolE1aおよびScolE1bは、試験したSalmonella株に対して最も広い抗菌活性を示す。したがって、これらは、Salmonellaの制御のためのサルモシンカクテルの主要成分として使用することができる。
実施例8:安定なトランスジェニック宿主におけるサルモシンの生産
サルモシン発現のために、T0世代トランスジェニック植物の切り離した葉のEtOH誘導性の導入遺伝子の発現および誘導のためのベクターを使用するAgrobacterium媒介性リーフディスク形質転換によって、N.benthamianaを形質転換した。これは、Schulzら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.112、E5454~E5460(2015)に記載されているように行った。
ScolE1b発現のためにエタノールによって二重誘導が可能なTMVベースウイルスベクターのゲノム挿入を含む安定なトランスジェニックNicotiana benthamiana植物(図21)は、正常な生育および発生を示し、選択されたトランスジェニック系統は、エタノールで誘導すると期待されるレベルまでサルモシンを蓄積した(図22)。
実施例9:ホウレンソウにおけるサルモシンの生産
Spinacia oleracea cv.Fruhes Riesenblatt植物を温室(それぞれ19~23℃および17~20℃の昼および夜の温度、12時間光および35~70%湿度)で生育させた。6週齢の植物を実施例2に記載されている注射器によるインフィルトレーションに使用した。組換えタンパク質の発現は、クマシー染色を用いるSDS-PAGEを使用して確認した(図23)。
実施例10:拡張サルモシン活性スクリーニング
本発明者らは、実施例6に記載されているように、Salmonellaの他の株に対して植物で作られた組換えサルモシンの抗菌活性をさらに解析した。サルモシンの抗菌活性スペクトルを決定するために、105種のS.enterica ssp.enterica血清型を代表する109株を選択し、スクリーニングした(表9)。スクリーニングは、2003年~2012年にヒトSalmonella感染の少なくとも100の発生を引き起こしたとして米国疾病管理予防センター(CDC)(www.cdc.gov/nationalsurveillance/pdfs/salmonella-annual-report-2013-508c.pdf)で記述されている、(血清型TyphiおよびI4,5:12:r:-を除いて)すべての血清型のそれぞれ1株、血清型Typhimurium、EnteritidisおよびJavianaの2株ならびに100未満の発生を引き起こした、またはCDCに報告されていない6血清型を含んでいた。
Figure 0007136796000009
Figure 0007136796000010
Figure 0007136796000011
Figure 0007136796000012
Figure 0007136796000013
活性スペクトルの幅を推定するために、すべての株を少なくとも1回試験し、続いて、36または35株を、それぞれサルモシンおよびコリシンを用いて、3連実験で再スクリーニングした(図24)。最も広い抗菌活性スペクトルが、サルモシンScolE1aおよびScolE1bについて再び確認され、これらは、それぞれ評価したすべての株の100%および99%に対して、正の抗菌活性を示した。活性の有意な幅は、図24eに示される36株のサブセットに対するそれらの活性に反映されるように、サルモシンScolE2(94%)、ScolE3(70%)およびScolE7(95%)についても観察された。
解析した5種のサルモシンは、主な病原性Salmonella株を制御するそれらの能力に基づいて、4つの群に分けられた。サルモシンScolE1aおよびScolE1bは普遍的に活性であり、それぞれ、試験したすべての病原型を死滅させることができ、試験したすべての株に対して10AU/μg組換えタンパク質より高い(図24a)、ほとんどの場合個々の株に対して10AU/μgタンパク質より高い、最高の平均活性を示した。残りのサルモシンは2つの群に入り、1つの群のサルモシンScolE2およびScolE7は100倍低い平均活性(<10AU/μgタンパク質、図24a)を有し、別の群のScolE3は実質的により低い平均活性(10AU/μg、図24a)を示す。
腸管病原性S enterica株の阻害におけるサルモシンの高い効力と対照的に、コリシンIa、Ib、M、5、10およびS4の特異的活性(表6)は2~4桁低かった(2~3log AU/μg、図24b)が、109株の多くはコリシンIa(92%)およびIb(90%)によって阻害され、約1/3の株はコリシンS4(45%)、5(25%)、10(29%)およびM(34%)によって阻害され、これは、35株のサブセットの感受性パターンにも反映される(図24f)。一般に、サルモシンは、Salmonellaに対して、E.coliコリシンよりも高く、広い活性を示した。逆に、サルモシンは、E.coli STEC(表10)株に対して、種間では低い(10AU/μg未満)狭い活性を示した(図24c、g)。
実施例11:個別のサルモシンScolE1aおよびサルモシン混合物は汚染したニワトリ肉マトリックスにおいてSalmonellaを制御する
Salmonella汚染した肉表面の制御のための、植物で生成した個別のサルモシンScolE1aおよびサルモシン混合物の殺菌効果をシミュレーション研究で解析した。
ニワトリ胸肉の切り身は地域のスーパーマーケットから購入した。S.enterica ssp.enterica血清型Enteritidis(株ATCC(登録商標)13076(商標))、Typhimurium(株ATCC(登録商標)14028(商標))、Newport(株ATCC(登録商標)6962(商標))、Javiana(株ATCC(登録商標)10721(商標))、Heidelberg(株ATCC(登録商標)8326(商標))、Infantis(株ATCC(登録商標)BAA-1675(商標))およびMuenchen(株ATCC(登録商標)8388(商標))のナリジクス酸抵抗性変異体の株を25μg/mlナリジクス酸を補充したLB培地中で定常期まで個々に増殖させ、新鮮なLBで希釈し、対数期まで増殖させた。家禽の汚染のために、細菌培養物をLB培地でOD600=0.001(約2×10cfu/ml)に希釈し、1:1:1:1:1:1:1で混合した。約20g重量の小片に切られたニワトリ胸肉の切り身のプールに、100gの肉あたり約2×10cfu/mlの密度で7種のS.enterica株の1mlの混合物を室温で接種し、約3log CFU/gの病原性S.entericaの7種の血清型の混合物の、肉マトリックスの初期汚染レベルを得て、細菌を肉表面へ30分間室温で付着させた。続いて、植物抽出物対照(50mM HEPES pH7.0、10mM Kアセテート、5mM Mgアセテート、10%(v/v)グリセロール、0.05%(v/v)Tween-20、300mM NaClで調製された、サルモシンがないWT N.benthamiana植物材料のTSP抽出物)またはサルモシン溶液(植物抽出物対照と同じバッファーで調製された、サルモシンScolE1a、ScolE1b、ScolE2およびScolE7を発現するN.benthamiana植物材料の個々のTSP抽出物またはこれらのTSP抽出物の混合物のいずれか)のいずれかを3mg/kg ScolE1aまたは3mg/kg ScolE1a、1mg/kg ScolE1b、1mg/kg ScolE2、1mg/kg ScolE7または0.3mg/kg ScolE1a、0.1mg/kg ScolE1b、0.1mg/kg ScolE2および0.1mg/kg ScolE7の濃度でスプレーする(10ml/kg)ことによって、ニワトリの胸肉のトリムを処理した。処理した肉のトリムをさらに室温で30分間インキュベートした。約40gに相当する肉のトリムの一定分量をBagFilter(登録商標)400P無菌袋(Interscience)に詰め、1時間、1日および3日間10℃で保存し、これは、細菌の増殖について許容されているが最適以下である現実的な産業的肉加工条件に相当する。
全体で、サルモシン処理の間に肉試料を室温で1.5時間インキュベートしてから、これらを密閉し、10℃で保存した。細菌集団の解析のために、Bag Mixer(登録商標)400CC(登録商標)ホモジナイザー(設定:ギャップ0、時間30秒、スピード4;Interscience)を使用して、家禽の一定分量を4倍容量のペプトン水でホモジナイズし、微生物懸濁液の段階希釈物のプレーティングの後に、25μg/mlナリジクス酸を補充したXLD培地(Sifin Diagnostics)上でS.entericaのコロニー形成単位(CFU)を数えた。試料は4連で解析した。
実験的に汚染させた肉試料中の生存可能な病原性Salmonellaの数の減少におけるサルモシン処理の効果を、GraphPad Prism v.6.01を使用して、自由度6を用いる両側独立パラメトリックt検定によって、担体処理対照試料およびサルモシン処理試料で得られたデータを比較することにより評価した。
サルモシン処理した(3mg/kg肉の添加量の個別のScolE1aおよびそれぞれ3+1+1+1mg/kg肉で加えたScolE1a+ScolE1b+ScolE2+ScolE7からなるサルモシン混合物)肉試料に対するサルモシン処理の効果(両方とも植物抽出物対照処理した肉に対する)を病原性細菌集団レベルの減少の程度について評価し、解析したすべての時点において2~3log CFU/g肉の生存可能数の統計学的に有意な正味の減少が見出された(図25)。細菌集団の減少の最高のレベルは、4種のサルモシンの混合物(3+1+1+1mg/kg肉の濃度)について観察され、4時間の保存で最大3.39平均対数減少対担体処理であり、これは、細菌の99.6平均パーセント減少に相当する。単一のサルモシン、ScolE1a(3mg/kg肉で加えた)は、2倍の濃度(6mg/kg肉の全サルモシン)で加えた4種のサルモシンの混合物と同様の効果で肉のSalmonella汚染を制御することができた。非常に低用量(全サルモシン0.6mg/kg肉;ScolE1a+ScolE1b+ScolE2+ScolE7の混合物について0.3+0.1+0.1+0.1mg/kg肉)のサルモシンによる処理でさえも、最大で48時間の保存の間、約1log CFUという細菌集団の統計学的に有意な減少をもたらした。細菌汚染の初期の減少の後、生存可能な細菌の再増殖が72時間後に観察され、これは、サルモシンは食品に対して急速に作用するが、長期の技術的効果を有さないことを示唆する。
実施例12:組換えサルモシンは植物によって正確に発現される
植物TSP抽出物中に含まれる植物発現性組換えサルモシンの、翻訳後修飾を含めた一次構造を、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)飛行時間型(TOF)質量解析(MS)によって解析した。
タンパク質消化のために、5倍容量の20mM Naクエン酸、20mM NaHPO、30mM NaCl、pH5.5を用いてサルモシンを発現する植物材料から調製したTSP抽出物をSDS-PAGEにかけ、5μgのタンパク質を含む、クマシー染色されたSDSゲルバンドを切り取り、100mM NHHCOおよび100mM NHHCOのアセトニトリル(ACN)/HO(50;50、v/v)溶液で連続して洗浄することによって脱染色した。10mM DTTを用いて50℃で45分間ジスルフィド結合を還元し、それに続いて、10mg/mlのヨードアセトアミドを用いて60分間アルキル化した。次いで、異なるシーケンシンググレードのエンドプロテイナーゼ(Promega、Madison、USA)を用いて、脱染色およびアルキル化したゲルバンドをタンパク質消化にかけた。消化溶液のプロテアーゼ:タンパク質比を1:20(w/w)に調整し、12時間25℃(キモトリプシン)または37℃(Asp-N、Glu-C、Lys-C、トリプシン)で消化を行った。それぞれHO、ACN/HO/トリフルオロ酢酸(50;45;5、v/v/v)およびACNで連続して洗浄することによって、タンパク分解性ペプチドを抽出した。抽出溶液を混合し、真空遠心分離機中で濃縮し、HO/酢酸(90;10、v/v)中に再可溶化した。
上記のように得られたタンパク分解性サルモシンペプチドまたは植物で生成した精製されたインタクトなサルモシンScolE1a、ScolE1bおよびScolE7タンパク質を、C4またはC18結合シリカ材料(ZipTip(登録商標)、Millipore、Darmstadt、Germany)を使用して固相抽出によって、質量解析のために精製し、2,5-ジヒドロキシアセトフェノンおよび2,5-ジヒドロキシ安息香酸マトリックス(Bruker Daltonics、Bremen、Germany)を用いて、MALDIグラウンドスチールターゲットで溶出液を共結晶化した。
MALDI-TOF/TOF質量解析計(Autoflex SpeedTM、Bruker Daltonics、Bremen、Germany)において、分子量の決定についてリニアモードで、およびインソース分解(ISD)解析によるタンパク質シーケンシングのためにリフレクターモードで、正極性で質量スペクトルを得た。355nmの発光波長で、1kHzのパルス速度に設定して、Nd:YAGレーザー(Smart beam-IITM、Bruker Daltonics、Bremen、Germany)をマトリックス結晶に照射した。
MSおよびMS/MSスペクトルは、それぞれ(試料スポットあたり)少なくとも5000または10000レーザーショットの蓄積によって、flexControl(バージョン3.4、Bruker Daltonics、Bremen、Germany)で記録した。レーザーエネルギーは、MS実験については閾値のわずかに上に設定し、MS/MS解析については最大に設定した。スペクトル処理は、flexAnalysis(バージョン3.4、Bruker Daltonics、Bremen、Germany)を用いて、TopHatアルゴリズムを用いてベースライン減算を適用すること、Savitzky-Golayアルゴリズムを用いてスムージングすること、およびSNAPアルゴリズムを用いてピーク検出することによって、行った。
質量解析計は、既知の質量を有する標準のペプチドおよびタンパク質のセット(Peptide Calibration Standard II、Protein Calibration Standard I and II、Bruker Daltonics、Bremen、Germany)を使用して較正した。
インタクトな分子量の決定は、単一および複数の荷電分子イオンの質量電荷比(m/z)に基づいた。
タンパク質末端のシーケンシングはISD解析によって行った。ISDフラグメントスペクトルのアノテーションは、BioTools(バージョン3.2、Bruker Daltonics、Bremen、Germany)を使用して、フラグメントイオンに対するm/z値のインシリコ生成および得られたISDスペクトル内に観察されるフラグメントシグナルのm/z値とのそれらの比較によって、行った。このアプローチは、末端アミノ酸配列の特定および存在する修飾の特定を可能にした。
タンパク質シーケンシング解析については、タンパク分解性ペプチドの特定のためにフラグメント(MS/MS)スペクトルのみを使用し、アノテーションはPEAKS Studio(バージョン7.5、Bioinformatics Solutions Inc.、Waterloo、Canada)を用いて行った。タンパク質の特定およびそのアミノ酸配列の検証は、それぞれサルモシンの配列が加えられている、NCBI nrデータベースおよびUniProt/SwissProtデータベースに対して、MS/MSデータを検索することによって実施した。データベース検索は、50ppmの親質量誤差許容度および0.5Daのフラグメント質量誤差許容度を用いて実施した。1つのタンパク質分解フラグメントに対する誤った切断と翻訳後修飾の両方の最大数は3に設定した。非特異的切断は、両タンパク質末端について許可した。
UniProt/SwissProtデータベースに対する、サルモシンのタンパク分解性ペプチドからの各MS/MSデータセットの検索結果によって、解析したサルモシンのそれぞれの同一性が確認された(表11)。ISDおよび分子量決定方法を使用して、MSベースのタンパク質末端のシーケンシングによって、精製されたサルモシンScolE1a、ScolE1bおよびScolE7の完全性をさらに解析し、これによって、植物発現の際にすべてのサルモシンタンパク質がインタクトであることが確認された。観察された翻訳後修飾はScolE2、ScolE7、ScolE1aおよびScolE1bの場合はN末端メチオニンの切断に、ScolE7およびScolE1aについてはN末端アセチル化に限られていた(表11)。
Figure 0007136796000014
その優先権が主張される欧州特許出願第17162784.7号は、記載全体、特許請求の範囲および図を含めて、参照によって本明細書に組み込まれる。
アミノ酸およびヌクレオチド配列
配列番号1 サルモシンScolE2のアミノ酸配列
MSGGDGIGHN SGAHSTGGVN GSSSGRGGSS SGGGNNPNSG PGWGTTHTPD GHDIHNYNPG EFGGGGHKPG GNGGNHSGGT GDGQPPGAAM AFGFPALVPA GAGGLAVTVS GDALAAAIAD VLAVLKGPFK FGAWGIALYG ILPTEIAKDD PRMMSKIVTS LPADAVTESP VSSLPLDQAT VSVTKRVTDV VKDERQHIAV VAGVPASIPV VDAKPTTHPG VFSVSVPGLP DLQVSTVKNA PAMTALPRGV TDEKDRTVHP AGFTFGGSSH EAVIRFPKES GQAPVYVSVT DVLTPEQVKQ RQDEENRRQQ EWDATHPVEV AERNYRLASD ELNRANVDVA GKQERQIQAA QAVAARKGEL DAANKTFADA KEEIKKFERF AHDPMAGGHR MWQMAGLKAQ RAQNEVNQKQ AEFNAAEKEK ADADAALNVA LESRKQKEQK AKDASDKLDK ENKRNHPGKA TGKGQPVGDK WLEDAGKEAG APVPDRIADK LRDKEFKNFD DFRKKFWEEV SKDPELSKQF IPGNKKRMSQ GLAPRARNKD TVGGRRSFEL HHDKPISQDG GVYDMDNIRV TTPKLHIDIH RGK
配列番号2 サルモシンScolE3のアミノ酸配列
MSGGDGRGHN TGAHSTSGNI NGGPTGLGVS GGASDGSGWS SENNPWGGGS GSGIHWGGGS GRGNGGGNGN SGGGSGTGGN LSAVAAPVAF GFPALSTPGA GGLAVSISAS ELSAAIAGII AKLKKVNLKF TPFGVVLSSL IPSEIAKDDP NMMSKIVTSL PADDITESPV SSLPLDKATV NVNVRVVDDV KDERQNISVV SGVPMSVPVV DAKPTERPGV FTASIPGAPV LNISVNNSTP AVQTLSPGVT NNTDKDVRPA GFTQGGNTRD AVIRFPKDSG HNAVYVSVSD VLSPDQVKQR QDEENRRQQE WDATHPVEVA EREYENARAE LEAENKNVHS LQVALDGLKN TAEGLALSDA GRHPLTSSES RFVAVPGYSG GGVHFDATAT VDSRDRLNSL LSLGGAAYVN NVLELGEVSA PTEDGLKVGN AIKNAMIEVY DKLRQRLITR QNEINHAQVS LNTAIESRNK KEEKKRSAEN KLNEERNKPR KGTKDYGHDY HPAPETEEIK GLGDIKKGIP KTPKQNGGGK RKRWIGDKGR KIYEWDSQHG ELEGYRASDG QHLGSFDPKT GKQLKGPDPK RNIKKYL
配列番号3 サルモシンScolE7のアミノ酸配列
MSGGDGIGHN SGAHSTGGVN GSSSGSGGSS SGSGNNPNSG PGWGTTHTPN GDIHNYNPGE FGGGGNKPGG HGGNSGNHDG SSGNGQPSAA PMAFGFPALA PAGAGSLAVT VSGEALSAAI ADIFAALKGP FKFGAWGIAL YGIMPTEIAK DDPNMMSKIM TSLPADTVTD TPVSSLPLDQ ATVSVTKRVA DVVKDERQHI AVVAGVPMSV PVVDAKPTTR PGIFSATVPG LPALEVSTGK SIPASTALPR GITEDKDRTE HPAGFTFGGS SHDAVIRFPK ESGQAPVYVS VTDVLTPEQV KQRQDEESRR QQEWDATHPV EVAERNYRLA SDELNRVNAD VAGKQERQAQ AGQAVAARKG ELDAANKTFA DAKEEIKKFE HFARDPMAGG HRMWQMAGLK AQRAQNEVNQ KQAEFDAAEK EKADADAALN AALESRKQKE QKAKDTKERL DKENKRNQPG KATGKGQPVS DKWLEDAGKE SGSPIPDSIA DKLRDKEFRN FDDFRKKFWE EVSKDPELSK QFIKGNRDRM QVGKAPKSRK KDAAGKRTSF ELHHDKPVSQ DGGVYDMDNL RITTPKRHID IHRGQ
配列番号4 サルモシンScolE1aのアミノ酸配列
MADNTIAYYE DGVPHSADGK VVIVIDGKMP VDTGAGGTGG GGGGKVGGTS ESSAAIHATA KWSTAQLKKT LAEKAARERE TAAAMAAAKA KRDALTQHLK DIVNDVLRHN ASRTPSATDL AHANNMAMQA EAQRLGRAKA EEKARKEAEA AELAFQEAER QREEAVRQLA ETERQLKQAE EEKRLAALSD EARAVENARK NLDTAKSELA NVDSDIERQR SQLSSLDADV KKAEENLRLT MRIKGRIGRK MQAKSQAIVD DKKRIYSDAE NVLNTMTVNR NLKAQQVTDA ENELKVAIDN LNSSQMKNAV DATVSFYQTL TEKYGEKYSL IAQELAEKSK GKKIGNVDEA LAAFEKYKDV LDKKFSKADR DAIVNALKSF NYDDWAKHLD QFAKYLKITG HVSFGYDVVS DVLKASETGD WKPLFITLEQ KVLDTGMSYL VVLMFSLIAG TTLGIFGVAI ITAILCSFVD KYILNALNDA
LGI
配列番号5 サルモシンScolE1bのアミノ酸配列
MSDNTIAYYE DGVPYSADGQ VVIVIDGKMP VDTGAGGTGG GGGGKVGGTS ESSAAIHATA KWSKAQLQKS LEEKAARERE TAAAMAAAKA KRDALTQHLK DIVNDVLRYN ASRTPSATDL AHANNMAMQA EAQRLGRAKA EEKARKEAEA AEKSLQEAER QREEAARQRA EAERQLKQAE AEEKRLAALS EEARAVEITQ KNLAAAQSEL SKMDGEIKSL NVRLSTSIHA RDAEMNSLSG KRNELAQESA KYKELDELVK KLEPRANDPL QNRPFFDATS RRARAGDTLA EKQKEVTASE TRINELNTEI NQVRGAISQA NNNRNLKVQQ VTETENALKV AIDNLNSSQM KNAVDATVSF YQTLTAKYGE KYSLIAQELA EQSKGKKISN VDEALAAFEK YKDVLDKKFS KADRDAIVNA LKSVDYADWA KHLDQFSRYL KISGRVSTGY DIYSDIRKGM DTNDWRPLFL TLEKLAVDAG VGYIVALGFS VIASTALGIW GVAIITGVIC SFVDKKDLEK LNEALGI
配列番号6 サルモシンSpstのアミノ酸配列
MFIKSGGNLT IRTFGGLGVG GDFDSDTWRR RSTDSWVPYS EYIAIECIVA PNQLYQLLTD VAQVETVAAQ LAQVGYQYLQ GRLRLVREDG SCTDFSGKAM LDNLLNKSKD ILDLDFLHVS EGYRSEAYWP GQSSGITIGY GVDIGHQSEE GLHKWGVPQS IIDKIKDYFG ITGEAANTLL KGLKDKTLGL SDREIKQFSD IVKKQATADI INKYNAATKG ITFDKIPYNT RTAIIDLFYQ YSAPKGAPKS WGFIINNDWN GFYNELMNFG DKHTTRRERE AALVLSDIVN NQYIYK
配列番号7 サルモシンScolE2免疫タンパク質SImmE2のアミノ酸配列
MELKKSISDY TEAEFKKIIE AIINCEGDEK TQDDNLEFFI RVTEYPSGSD LIYYPEGDND GSTEAIIKEI KEWRAANGKP GFKQADSSYF VSFDYRDGDW
配列番号8 サルモシンScolE7免疫タンパク質SImmE7のアミノ酸配列
MELKNSISDY TEAEFIEFMK EIDKENVAET DDKLDLLLNH FEQVTEHPDG TDLIYYAASD AESTPEAITK KIKEWRAANG KPGFKQG
配列番号9 コリシンS4のアミノ酸配列
MAKELSVYGP TAGESMGGTG ANLNQQGGNN NSNSGVHWGG GSGSGNGGRE HGSQTGWGWS KTNNPDVPPY VDDNGQVRIT ITNGLVKTPV YGVPGAGGNS DVQGGYIPEN PNDEVARKWD KNNLPREIDV SIDGFKYRVT LNDNGRAIGI LRTGVRPYVG SEKAKAGIME KINHKTPEEI YEALGFNKDE SQRQEKAKQQ AEDAWDRLPP NVRKFDVDVE QFHYLVVLDD YGNVLSVTRT GVRPYVGSEK AKAGIMDKVD HKTPEEIYEA LGFNNEEPQR QNQAKKAAYD VFYSFSMNRD RIQSDVLNKA AEVISDIGNK VGDYLGDAYK SLAREIADDV KNFQGKTIRS YDDAMASLNK VLSNPGFKFN RADSDALANV WRSIDAQDMA NKLGNISKAF KFADVVMKVE KVREKSIEGY ETGNWGPLML EVESWVLSGI ASAVALGVFS ATLGAYALSL GAPAIAVGIV GILLAAVVGA LLDDKFADAL NKEIIKPAH
配列番号10 コリシン5のアミノ酸配列
MDKVTDNSPD VESTESTEGS FPTVGVDTGD TITATLATGT ENVGGGGGAF GGASESSAAI HATAKWSTAQ LKKHQAEQAA RAAAAEAALA KAKSQRDALT QRLKDIVNDA LRANAARSPS VTDLAHANNM AMQAEAERLR LAKAEQKARE EAEAAEKALR EAERQRDEIA RQQAETAHLL AMAEAAEAEK NRQDSLDEEH RAVEVAEKKL AEAKAELAKA ESDVQSKQAI VSRVAGELEN AQKSVDVKVT GFPGWRDVQK KLERQLQDKK NEYSSVTNAL NSAVSIRDAK KTDVQNAEIK LKEAKDALEK SQVKDSVDTM VGFYQYITEQ YGEKYSRIAQ DLAEKAKGSK FSSVDEALAA FEKYKNVLDK KISKVDRDAI FNALESVNYD ELSKNLTKIS KSLKITSRVS FLYDVGSDFK NAIETGNWRP LFVTLEKSAV DVGVAKIVAL MFSFIVGVPL GFWGIAIVTG IVSSYIGDDE LNKLNELLGI
配列番号11 コリシン10のアミノ酸配列
MDKVTDNSPD VESTESTEGS FPTVGVDTGD TITATLATGT ENVGGGGGAF GGASESSAAI HATAKWSTAQ LKKHQAEQAA RAAAAEAALA KAKSQRDALT QRLKDIVNDA LRANAARSPS VTDLAHANNM AMQAEAERLR LAKAEQKARE EAEAAEKALR EAERQRDEIA RQQAETAHLL AMAEAAEAEK NRQDSLDEEH RAVEVAEKKL AEAKAELAKA ESDVQSKQAI VSRVAGELEN AQKSVDVKVT GFPGWRDVQK KLERQLQDKK NEYSSVTNAL NSAVSIRDAK KTEVQNAEIK LKEAKDALEK SQVKDSVDTM VGFYQYITEQ YGEKYSRIAQ DLAEKAKGSK FNSVDEALAA FEKYKNVLDK KFSKVDRDDI FNALESITYD EWAKHLEKIS RALKVTGYLS FGYDVWDGTL KGLKTGDWKP LFVTLEKSAV DFGVAKIVAL MFSFIVGAPL GFWGIAIITG IVSSYIGDDE LNKLNELLGI
配列番号12 コリシンIaのアミノ酸配列
MSDPVRITNP GAESLGYDSD GHEIMAVDIY VNPPRVDVFH GTPPAWSSFG NKTIWGGNEW VDDSPTRSDI EKRDKEITAY KNTLSAQQKE NENKRTEAGK RLSAAIAARE KDENTLKTLR AGNADAADIT RQEFRLLQAE LREYGFRTEI AGYDALRLHT ESRMLFADAD SLRISPREAR SLIEQAEKRQ KDAQNADKKA ADMLAEYERR KGILDTRLSE LEKNGGAALA VLDAQQARLL GQQTRNDRAI SEARNKLSSV TESLNTARNA LTRAEQQLTQ QKNTPDGKTI VSPEKFPGRS STNHSIVVSG DPRFAGTIKI TTSAVIDNRA NLNYLLTHSG LDYKRNILND RNPVVTEDVE GDKKIYNAEV AEWDKLRQRL LDARNKITSA ESAVNSARNN LSARTNEQKH ANDALNALLK EKENIRNQLA GINQKIAEEK RKQDELKATK DAINFTTEFL KSVSEKYGAK AEQLAREMAG QAKGKKIRNV EEALKTYEKY RADINKKINA KDRAAIAAAL ESVKLSDISS NLNRFSRGLG YAGKFTSLAD WITEFGKAVR TENWRPLFVK TETIIAGNAA TALVALVFSI LTGSALGIIG YGLLMAVTGA LIDESLVEKA NKFWGI
配列番号13 コリシンIbのアミノ酸配列
MSDPVRITNP GAESLGYDSD GHEIMAVDIY VNPPRVDVFH GTPPAWSSFG NKTIWGGNEW VDDSPTRSDI EKRDKEITAY KNTLSAQQKE NENKRTEAGK RLSAAIAARE KDENTLKTLR AGNADAADIT RQEFRLLQAE LREYGFRTEI AGYDALRLHT ESRMLFADAD SLRISPREAR SLIEQAEKRQ KDAQNADKKA ADMLAEYERR KGILDTRLSE LEKNGGAALA VLDAQQARLL GQQTRNDRAI SEARNKLSSV TESLKTARNA LTRAEQQLTQ QKNTPDGKTI VSPEKFPGRS STNHSIVVSG DPRFAGTIKI TTSAVIDNRA NLNYLLTHSG LDYKRNILND RNPVVTEDVE GDKKIYNAEV AEWDKLRQRL LDARNKITSA ESAINSARNN VSARTNEQKH ANDALNALLK EKENIRSQLA DINQKIAEEK RKRDEINMVK DAIKLTSDFY RTIYDEFGKQ ASELAKELAS VSQGKQIKSV DDALNAFDKF RNNLNKKYNI QDRMAISKAL EAINQVHMAE NFKLFSKAFG FTGKVIERYD VAVELQKAVK TDNWRPFFVK LESLAAGRAA SAVTAWAFSV MLGTPVGILG FAIIMAAVSA LVNDKFIEQV NKLIGI
配列番号14 コリシンMのアミノ酸配列
METLTVHAPS PSTNLPSYGN GAFSLSAPHV PGAGPLLVQV VYSFFQSPNM CLQALTQLED YIKKHGASNP LTLQIISTNI GYFCNADRNL VLHPGISVYD AYHFAKPAPS QYDYRSMNMK QMSGNVTTPI VALAHYLWGN GAERSVNIAN IGLKISPMKI NQIKDIIKSG VVGTFPVSTK FTHATGDYNV ITGAYLGNIT LKTEGTLTIS ANGSWTYNGV VRSYDDKYDF NASTHRGIIG ESLTRLGAMF SGKEYQILLP GEIHIKESGK R
配列番号15 実施例でサルモシンScolE2の発現に使用したヌクレオチド配列
atgtctggtggtgatggtatcggtcacaatagcggtgctcattctactggtggtgtgaacggttcttcatctggtaggggtggtagttcttcaggtggtggtaacaaccctaactctggtcctggttggggtactactcatactcctgatggtcacgatatccacaactacaaccctggtgagtttggtggtggtggacataagcctggtggaaacggtggtaatcactctggtggtactggtgatggacaacctcctggtgctgctatggcttttggtttccctgctcttgttcctgctggtgctggtggtcttgctgttactgtttctggtgatgctctggctgctgcaattgctgatgtgcttgctgttctgaagggacctttcaagtttggtgcttggggtatcgctctgtacggtattcttcctaccgagatcgctaaggatgatccaaggatgatgagcaagatcgtgacctctttgcctgctgatgctgtgactgagtctcctgtgtcatctctgcctcttgatcaggctactgtgagcgttaccaagagggttaccgatgtggttaaggatgagaggcagcacattgctgttgttgctggtgtgcctgcttctatccctgttgttgatgctaagcctactacccaccctggtgtgttctctgtttctgttcctggtctgcctgatctgcaggtttcaactgtgaagaacgctcctgctatgactgctttgcctaggggtgttactgatgagaaggataggactgttcaccctgctggtttcaccttcggtggttcttctcatgaggctgtgatcaggttccctaaagagtctggtcaggctcctgtttacgtgtcagtgaccgatgttcttacccctgagcaggttaagcagagacaggatgaagagaatagaaggcagcaagagtgggatgctactcaccctgttgaagtggctgagaggaattacaggctggcttctgatgagctgaacagggctaatgtggatgtggctggtaagcaagagaggcagattcaagctgctcaagctgttgctgctagaaagggtgaactggatgctgctaacaagaccttcgctgatgctaaagaagagatcaagaagttcgagaggttcgctcacgatcctatggctggtggacacagaatgtggcaaatggctggtcttaaggctcagagggctcagaatgaggttaaccagaaacaagctgagttcaacgctgctgagaaagaaaaggctgatgcagatgctgctctgaacgtggcacttgagtctaggaagcagaaagaacaaaaggcaaaggatgctagcgataagctggataaggaaaacaagaggaaccaccctggaaaggctactggtaagggtcaacctgttggtgataagtggcttgaggatgctggtaaagaagctggagcacctgttccagataggatcgctgataagctgagagataaggaattcaagaacttcgatgattttaggaagaagttctgggaagaggtaaatttctagtttttctccttcattttcttggttaggacccttttctctttttatttttttgagctttgatctttctttaaactgatctattttttaattgattggttatggtgtaaatattacatagctttaactgataatctgattactttatttcgtgtgtctatgatgatgatgataactgcaggttagcaaggatcctgagctgagcaagcagttcatccctggtaacaagaaaaggatgagccagggtcttgctcctagggctagaaacaaggatactgtgggtggtagaagatccttcgagctgcatcacgataagccaatctctcaggatggtggtgtttacgatatggataacatcagggtgaccaccccaaagctgcacatcgatattcataggggaaagtaa
配列番号16 実施例でサルモシンScolE3の発現に使用したヌクレオチド配列
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配列番号17 実施例でサルモシンScolE7の発現に使用したヌクレオチド配列
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配列番号18 実施例でサルモシンScolE1aの発現に使用したヌクレオチド配列
atggctgataacaccattgcttactacgaggatggtgtgcctcacagcgctgatggtaaggtggtgattgtgatcgatggtaagatgcctgtggataccggtgctggtggtactggtggtggtggaggtggtaaggttggaggaacttctgaaagctctgctgctattcacgctaccgctaagtggtctaccgctcagcttaagaaaaccctggctgagaaggctgctagagagagagaaactgctgctgcaatggctgctgctaaggctaagagagatgctcttacccagcacctgaaggatatcgtgaacgatgtgcttaggcacaacgcttctaggaccccttctgctactgatcttgctcacgctaacaacatggctatgcaggctgaagctcagagacttggtagagctaaggctgaggaaaaggctagaaaagaggctgaggctgctgagcttgctttccaagaagctgaaagacagagggaagaggctgttagacagcttgctgaaactgagaggcagcttaagcaagctgaggaagagaagaggcttgctgctctttctgatgaggctagggctgttgagaacgctaggaagaatctggataccgcaaagtccgagctggctaatgtggattctgatatcgagaggcagaggtcccagctgtcatctcttgatgctgatgtgaagaaggctgaagagaacctgaggctgaccatgaggattaagggtaggatcggtaggaagatgcaggctaagtcacaggctatcgtggatgataagaaaaggatctactccgatgctgagaacgtgctgaataccatgaccgtgaataggaacctgaaggctcagcaggttaccgatgcagagaatgagcttaaggtggcaatcgataacctgaacagcagccagatgaagaacgctgtggatgctaccgtgtctttctaccagactctgaccgagaagtacggtgagaagtacagccttatcgctcaagagctggcagagaagtccaagggtaagaaaatcggaaatgtggatgaggctctggctgcattcgagaagtataaggatgtgctggataagaagttcagcaaggctgatagggatgctattgtgaacgctctgaagtccttcaactacgatgattgggctaagcacctggatcagttcgctaagtacctgaagatcaccggtcacgtgagcttcggttacgatgttgtgtctgatgtgctgaaggctagcgagactggtgattggaagcctctgttcattacccttgagcagaaggtgttggatactggtatgagctacctggtggtgctgatgttctctcttattgctggaaccaccctgggaatcttcggtgtggctattattaccgctatcctgtgcagcttcgtggataagtacatcctgaacgcactgaacgatgctctgggaatctaa
配列番号19 実施例でサルモシンScolE1bの発現に使用したヌクレオチド配列
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配列番号20 実施例でサルモシンSpstの発現に使用したヌクレオチド配列
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配列番号21 実施例でサルモシンScolE2免疫タンパク質SImmE2の発現に使用したヌクレオチド配列
atggaactgaagaagtccatcagcgattacaccgaggctgagttcaagaagatcatcgaggctatcatcaactgcgagggtgatgagaaaacccaggatgataaccttgagttcttcatcagggtgaccgagtacccttctggtagcgatcttatctactaccctgagggtgataacgatggtagcaccgaggcaattatcaaagaaatcaaggaatggagggctgctaacggtaagcctggttttaagcaagcttaa
配列番号22 実施例でサルモシンScolE7免疫タンパク質SImmE7の発現に使用したヌクレオチド配列
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配列番号23 実施例でサルモシンScolE1aの発現に使用したTMVベースのバイナリーベクターのヌクレオチド配列
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配列番号24 実施例でサルモシンScolE2免疫タンパク質ImmScolE2の発現に使用したPVXベースのバイナリーベクターのヌクレオチド配列
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Claims (25)

  1. Salmonellaによる対象物(ヒトを除く)の感染または汚染を予防するまたは減少させる方法であって、前記対象物を、以下のアミノ酸配列のいずれか1つを含むか、それからなるタンパク質と接触させることを含む方法:
    (A-i)配列番号1、
    (A-ii)配列番号2、
    (A-iii)配列番号3、
    (A-iv)配列番号4、
    (A-v)配列番号5、もしくは
    (A-vi)配列番号6、
    または
    (B-i)配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
    (B-ii)配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
    (B-iii)配列番号3のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
    (B-iv)配列番号4のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
    (B-v)配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、もしくは
    (B-vi)配列番号6のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
    または
    (D-i)配列番号1のアミノ酸配列に対して1~40個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、
    (D-ii)配列番号2のアミノ酸配列に対して1~40個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、
    (D-iii)配列番号3のアミノ酸配列に対して1~40個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、
    (D-iv)配列番号4のアミノ酸配列に対して1~40個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、
    (D-v)配列番号5のアミノ酸配列に対して1~40個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、もしくは
    (D-vi)配列番号6のアミノ酸配列に対して1~20個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、
    または
    (E-i)配列番号1の少なくとも525個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列、
    (E-ii)配列番号2の少なくとも555個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列、
    (E-iii)配列番号3の少なくとも555個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列、
    (E-iv)配列番号4の少なくとも435個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列、
    (E-v)配列番号5の少なくとも475個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列、もしくは
    (E-vi)配列番号6の少なくとも270個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列。
  2. 前記タンパク質が、項目
    -(A-iv)、(B-iv)、(D-iv)もしくは(E-iv)
    または
    -(A-v)、(B-v)、(D-v)もしくは(E-v)
    のものである、請求項1に記載の方法。
  3. Salmonellaによる感染または汚染を処置する方法で使用するための、以下のアミノ酸配列のいずれか1つを含むか、それからなるタンパク質:
    (A-i)配列番号1、
    (A-iii)配列番号3、
    (A-iv)配列番号4、
    (A-v)配列番号5、もしくは
    (A-vi)配列番号6、
    または
    (B-i)配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
    (B-iii)配列番号3のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
    (B-iv)配列番号4のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
    (B-v)配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、もしくは
    (B-vi)配列番号6のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
    または
    (D-i)配列番号1のアミノ酸配列に対して1~40個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、
    (D-iii)配列番号3のアミノ酸配列に対して1~40個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、
    (D-iv)配列番号4のアミノ酸配列に対して1~40個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、
    (D-v)配列番号5のアミノ酸配列に対して1~40個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、もしくは
    (D-vi)配列番号6のアミノ酸配列に対して1~20個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、
    または
    (E-i)配列番号1の少なくとも525個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列、
    (E-iii)配列番号3の少なくとも555個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列、
    (E-iv)配列番号4の少なくとも435個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列、
    (E-v)配列番号5の少なくとも475個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列、もしくは
    (E-vi)配列番号6の少なくとも270個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列。
  4. 前記タンパク質が、項目
    -(A-iv)、(B-iv)、(D-iv)もしくは(E-iv)または
    -(A-v)、(B-v)、(D-v)もしくは(E-v)
    のものである、請求項3に記載のタンパク質。
  5. SalmonellaがSalmonella entericaである、請求項3または4に記載のタンパク質。
  6. SalmonellaがSalmonella enterica ssp.entericaである、請求項3または4に記載のタンパク質。
  7. 請求項1または2に記載の方法であって、Salmonella entericaに対する、前記タンパク質の毒性が以下である:感受性Salmonella enterica株のcmあたり1x10cfu/mLの0.14mL細菌溶液を接種した軟寒天重層プレート上に、5マイクロリットルのクラス(b)から(d)の前記タンパク質および配列番号1のタンパク質の溶液をスポッティングし、その後37℃で寒天プレートをインキュベートしてから12時間に、前記タンパク質および配列番号1のタンパク質が、同じ直径の、Salmonella enterica ssp.enterica血清型Newport株ATCC(登録商標)6962(商標)の生存可能な細菌を含んでいないスポットを生成し、ここでクラス(b)から(d)のタンパク質の濃度が、配列番号1のタンパク質の比較溶液のものの最大で5倍である;
    前記方法。
  8. 請求項3~6のいずれか一項に記載のタンパク質であって、Salmonella entericaに対する、前記タンパク質の毒性が以下である:感受性Salmonella enterica株のcmあたり1x10cfu/mLの0.14mL細菌溶液を接種した軟寒天重層プレート上に、5マイクロリットルのクラス(b)から(d)の前記タンパク質および配列番号1のタンパク質の溶液をスポッティングし、その後37℃で寒天プレートをインキュベートしてから12時間に、前記タンパク質および配列番号1のタンパク質が、同じ直径の、Salmonella enterica ssp.enterica血清型Newport株ATCC(登録商標)6962(商標)の生存可能な細菌を含んでいないスポットを生成し、ここでクラス(b)から(d)のタンパク質の濃度が、配列番号1のタンパク質の比較溶液のものの最大で5倍である、
    前記タンパク質。
  9. 以下のアミノ酸配列のいずれか1つを有する1種または複数のタンパク質を含む組成物:
    (A-i)配列番号1、
    (A-iii)配列番号3、
    (A-iv)配列番号4、
    (A-v)配列番号5、もしくは
    (A-vi)配列番号6、
    または
    (B-i)配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
    (B-iii)配列番号3のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
    (B-iv)配列番号4のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
    (B-v)配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、もしくは
    (B-vi)配列番号6のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
    または
    (D-i)配列番号1のアミノ酸配列に対して1~40個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、
    (D-iii)配列番号3のアミノ酸配列に対して1~40個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、
    (D-iv)配列番号4のアミノ酸配列に対して1~40個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、
    (D-v)配列番号5のアミノ酸配列に対して1~40個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、もしくは
    (D-vi)配列番号6のアミノ酸配列に対して1~20個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、
    または
    (E-i)配列番号1の少なくとも525個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列、
    (E-iii)配列番号3の少なくとも555個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列、
    (E-iv)配列番号4の少なくとも435個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列、
    (E-v)配列番号5の少なくとも475個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列、もしくは
    (E-vi)配列番号6の少なくとも270個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列。
  10. -項目(A-iv)、(B-iv)、(D-iv)もしくは(E-iv)に記載の、および/または項目(A-v)、(B-v)、(D-v)もしくは(E-v)に記載のタンパク質;ならびに
    -項目(A-i)、(B-i)、(D-i)または(E-i)に記載のタンパク質
    を含む、請求項9に記載の組成物。
  11. 項目(A-iii)、(B-iii)、(D-iii)または(E-iii)に記載のタンパク質をさらに含む、請求項10に記載の組成物。
  12. Salmonellaによる感染を処置する方法で使用するための、請求項9から11のいずれか一項に記載の組成物。
  13. SalmonellaがSalmonella entericaである、請求項12に記載の組成物。
  14. SalmonellaがSalmonella enterica ssp.entericaである、請求項12に記載の組成物。
  15. 前記組成物が植物材料またはその抽出物であり、植物材料が、前記タンパク質を発現した植物由来の材料であり、または前記組成物が、前記タンパク質を含む水溶液である、請求項9から14のいずれか1項に記載の組成物。
  16. 前記植物材料が、前記タンパク質を発現した食用植物由来の材料である、請求項15に記載の組成物。
  17. 前記対象物が前記タンパク質の水溶液で噴霧される、もしくは前記タンパク質の水溶液中に浸漬される、または前記対象物が少なくとも10秒間、前記タンパク質の水溶液中に浸漬される、請求項1に記載の方法。
  18. 前記対象物が少なくとも1分間、前記タンパク質の水溶液中に浸漬される、請求項17に記載の方法。
  19. 前記対象物が食品もしくは動物飼料である、または前記食品が動物の死体全体、肉、卵、生の果物もしくは野菜である、請求項1、17、または18のいずれか1項に記載の方法。
  20. 前記SalmonellaがSalmonella entericaである、請求項1、2、および17~19のいずれか1項に記載の方法。
  21. 前記SalmonellaがSalmonella enterica ssp.entericaである、請求項20に記載の方法。
  22. 以下のアミノ酸配列:
    (A-i)配列番号1、
    (A-iii)配列番号3、
    (A-iv)配列番号4、
    (A-v)配列番号5、もしくは
    (A-vi)配列番号6、
    または
    (B-i)配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
    (B-iii)配列番号3のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
    (B-iv)配列番号4のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
    (B-v)配列番号5のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、もしくは
    (B-vi)配列番号6のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
    または
    (D-i)配列番号1のアミノ酸配列に対して1~40個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、
    (D-iii)配列番号3のアミノ酸配列に対して1~40個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、
    (D-iv)配列番号4のアミノ酸配列に対して1~40個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、
    (D-v)配列番号5のアミノ酸配列に対して1~40個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、もしくは
    (D-vi)配列番号6のアミノ酸配列に対して1~20個のアミノ酸置換、付加、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列、
    または
    (E-i)配列番号1の少なくとも525個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列、
    (E-iii)配列番号3の少なくとも555個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列、
    (E-iv)配列番号4の少なくとも435個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列、
    (E-v)配列番号5の少なくとも475個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸配列、もしくは
    (E-vi)配列番号6の少なくとも270個の連続的なアミノ酸残基を含むか、それからなるアミノ酸のいずれか1つを含むか、それからなるタンパク質を含む組成物を生成する方法であって、
    (i)植物中で前記タンパク質を発現させるステップ、
    (ii)前記植物から発現タンパク質を含む植物材料を採取するステップ、
    (iii)水性バッファーを使用して前記植物材料から前記タンパク質を抽出して、前記タンパク質を含む組成物を得るステップ、
    を含む方法。
  23. 前記タンパク質が、項目
    -(A-iv)、(B-iv)、(D-iv)もしくは(E-iv)または
    -(A-v)、(B-v)、(D-v)もしくは(E-v)
    のものである、請求項22に記載の方法。
  24. ステップ(i)の植物が、食用植物またはNicotianaである、請求項22または23に記載の方法。
  25. ステップ(iii)に続いて
    (iv)前記組成物から望ましくない混入物を除去するステップ
    をさらに含む、請求項22~24のいずれか一項に記載の方法。
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