JP7090406B2 - 光学装置における光線の強度を調整するための方法、および対応する光学装置 - Google Patents

Description

本発明は、光学装置における光線の強度を調整するための方法であって、前記光線を、音響光学フィルタ、すなわちＡＯＴＦに通し、前記光線の強度を、前記ＡＯＴＦを動作させる音波の周波数および／または振幅に依存して調整する方法に関する。

本発明はさらに、光線の強度を調整するための方法を実施するための、好ましくは顕微鏡における光学装置であって、前記光線を、音響光学フィルタ、すなわちＡＯＴＦに通し、前記光線の強度を、前記ＡＯＴＦを動作させる音波の周波数および／または振幅に依存して調整する光学装置に関する。

光線の強度を調整するための方法ならびに光学装置は、実践から公知である。この場合に広く普及している１つの可能性は、このために例えばレーザ走査型顕微鏡における励起光の強度を変化させる音響光学可変波長フィルタ（Acousto-Optical Tunable Filter、すなわちＡＯＴＦ）を使用することである。

この場合には、音響的な音波（通常は無線周波数範囲にある）がトランスデューサを介して光学結晶に印加され、この音波によって結晶の局地的な屈折率の周期的な変調が生成される。この変調は、光学格子またはブラッグ格子のように機能し、対応する波長の光を回折させることができる。音響光学フィルタは、このような音響波を迅速に変調することができるので、他の方法（例えば電気光学効果）に比べて低コストであることも併せて、例えばレーザ走査型顕微鏡における光変調のための標準的なツールとなっている。非常に広く普及しているのは、可視光領域のレーザ波長のための音響光学フィルタであるが、赤外光（多光子顕微鏡）または紫外光のための構成も存在する。

図１は、レーザ走査型顕微鏡または共焦点レーザ走査顕微鏡におけるＡＯＴＦの使用例を示す。それぞれ異なる波長を有する一連のレーザ１．１～１．Ｎの光線が、波長選択性光学要素２、例えばエッジフィルタ、バンドパスフィルタ、またはノッチフィルタを使用して１つに統合され、１つの共通の光路に位置するＡＯＴＦ３に衝突する。ビーム直径を適合させるための任意選択の光学系４を通過した後、励起ビーム５は、顕微鏡の主ビームスプリッタ６と走査ユニット７とに衝突する。光線は、その後、フィールド光学系８によって走査ユニット７から対物レンズ９に結像され、最後には試料１０に集束される。そこで生成された蛍光は、検出光路１１において主ビームスプリッタ６を通過した後、集束光学系１２と共焦点ピンホール１３とコリメーション光学系１４とに衝突し、最後に検出モジュール１５において検出される。

図２には、同じ顕微鏡が示されている。ただし、図１の個々のレーザ１．１～１．Ｎの代わりに１つのスーパーコンティニウムレーザ１６（いわゆる白色光レーザＷＬＬ）が使用されており、また、図１の主ビームスプリッタ６の代わりに音響光学ビームスプリッタ１７（Acousto-Optical Beam Splitter、すなわちＡＯＢＳ）が使用されている。

図３には、音響光学フィルタ、すなわちＡＯＴＦの動作に特徴的な関数が示されている。図３の左半分には、音響波または音波の特定の周波数に対する回折効率１８が、強度を調整すべき光の波長の関数として示されており、その一方で、図３の右半分には、回折効率が音響波または音波の振幅の関数として示されている。伝達関数は、振幅が小さい場合にはｓｉｎｃ関数の２乗によって良好な近似で記述することができる。伝達関数の幅は、波長が所与の場合にはトランスデューサの形状および寸法に依存しており、典型的には０．１ｎｍ～１０ｎｍの間の範囲で変動する。音響波または音波の振幅に依存した回折効率は、極大値（振幅Ａ_ｏｐｔ）に到達後、再び減少し、２Ａ_ｏｐｔにおいて最小値を有することとなる。ＡＯＴＦが光強度のための純粋な変調器として使用される場合には、通常、顕微鏡の制御ソフトウェアに調整要素が設けられており、この調整要素によって音響振幅を、ゼロとＡ_ｏｐｔとの間で、すなわち図３に図示された領域において調整することが可能である。任意選択的に図示の曲線を計算によって線形にしてもよく、これにより、調整値を２倍にすることによって光線の強度も２倍になる。

種々異なる用途において、少なくとも白色光レーザの個々の波長のために、例えば光退色実験のために従前一般的であった照明強度よりも高い照明強度を利用できることが望まれている。

さらには、蛍光励起のために従来使用されているガスレーザ、例えばヘリウムネオンレーザまたはアルゴンレーザやダイオード励起固体レーザの代わりに、より低コストのダイオードレーザを使用すると、このダイオードレーザのレーザスペクトルが比較的広い（数ナノメータ）ことに起因して回折効率の損失が大きくなり、ひいては利用可能な光出力が比較的小さくなってしまう。これに関して、対応する音響光学要素の帯域幅を拡大することは、簡単に実現することができ、最終的により高い光出力を実現するために蛍光顕微鏡検査法にとって有益であろう。

したがって、本発明の基礎となる課題は、特に高い光出力が簡単に達成可能となるように、冒頭に述べた形式の方法および光学装置を構成および改善することである。

本発明によれば、上記の課題は、請求項１に記載の特徴を有する方法と、請求項８に記載の特徴を有する光学装置とによって解決される。

したがって、請求項１によれば、本方法は、前記音波の所与の周波数における前記音波の振幅が、前記光線の所与の波長または所与の波長スペクトルに対する回折効率の第１の極大値に到達するために選択される振幅よりも大きくなるように選択されるように、前記音波の振幅がさらに、前記ＡＯＴＦの伝達関数と前記光線の波長スペクトルとの積の積分値が、前記第１の極大値に到達するために選択される前記振幅の大きさにおける積分値よりも大きくなるように選択されるように、構成および改善されている。

さらに請求項８によれば、本光学装置は、前記音波の所与の周波数における前記音波の振幅を、前記光線の所与の波長または所与の波長スペクトルに対する回折効率の第１の極大値に到達するために選択される振幅よりも大きくなるように選択されるように、前記音波の振幅がさらに、前記ＡＯＴＦの伝達関数と前記光線の波長スペクトルとの積の積分値が、前記第１の極大値に到達するために選択される前記振幅の大きさにおける積分値よりも大きくなるように選択されるように、構成および改善されている。

本発明によればまず、通常のＡＯＴＦの動作方式が、通常の実践に限定されていないことが判明した。本発明によればさらに、ＡＯＴＦの巧妙な代替的な動作方式によって、上記の課題が驚くほど簡単に解決されることが判明した。このためにまず、音波の所与の周波数における音波の振幅が、光線の所与の波長または所与の波長スペクトルに対する回折効率の第１の極大値に到達するために選択される振幅よりも大きくなるように選択される。すなわち、回折効率の第１の極大値に到達するために必要な振幅を上回る振幅が選択される。これによって通常はまず回折効率が減少する。さらなる制約として、音波の振幅はさらに、ＡＯＴＦの伝達関数と光線の波長スペクトルとの積の積分値が、第１の極大値に到達するために選択される振幅の大きさにおける積分値よりも大きくなるように選択される。すなわち振幅は、単純に、光線の所与の波長または所与の波長スペクトルに対する回折効率の第１の極大値に到達するために選択される振幅よりも大きくなるように選択されるだけではない。そのように選択しただけでは、回折効率は、第１の極大値を単に下回っているだけになろう。しかしながら、本発明によれば、振幅をさらに増大させることによって回折効率が最初の減少後に再び増加すること、より詳細には第１の極大値における回折効率の値を超えることが判明した。このときに付随して発生しうる、伝達関数のピークの広がりは、広帯域のスペクトル光線の場合には決定的な役割を果たす。なぜなら、全体として達成可能な光強度は、ＡＯＴＦの伝達関数と光線の波長スペクトルとの積の積分値に依存しているからである。この積分値が、回折効率の第１の極大値に到達するために必要な振幅における積分値よりも大きい場合には、全体として比較的高い光強度が得られる。この際、とりわけ例えば光退色作用を増大させたいだけの場合には、このときに発生する、通常はたった数ナノメータである光線のスペクトル幅の拡大は、使用されている色素が有する典型的な広帯域の吸収スペクトルのおかげで結局のところさほど重要ではないことに留意すべきである。

したがって、本発明による方法および本発明による光学装置によれば、特に高い光出力が簡単に達成可能となるような、冒頭に述べた形式の方法および光学装置が示されている。

光出力の特に効果的な増加に鑑みて、前記光線を生成する１つの光源または複数の光源を、生成される前記光線の波長スペクトルが前記ＡＯＴＦの波長依存性の前記伝達関数の幅と同じか、またはそれよりも広くなるように選択または調整することができる。換言すれば、光線の波長スペクトルがＡＯＴＦの伝達関数の幅に比べてより広い幅を有する場合には、ＡＯＴＦの伝達関数と光線の波長スペクトルとの積の積分値を、音波の振幅の増大によって特に確実に大きくすることが可能となる。

具体的な実施形態では、前記振幅を、前記第１の極大値に到達するために選択される前記振幅の２倍超に選択することができる。この場合には、光線の所与の波長または所与の波長スペクトルに対する回折効率が、（振幅をさらに増大させると）第１の極大値の値を超えて増大する。

ＡＯＴＦの特に確実な動作に鑑みて、前記振幅を、前記第１の極大値に到達するために選択される前記振幅の３倍以下に選択することができる。基本的には、振幅をこれより大きく選択することも可能ではあるが、振幅の増大は、ＡＯＴＦの機械的頑強性によって、かつ／またはＡＯＴＦの結晶、トランスデューサ、または電子ドライバにおいて発生しうる不所望な非線形性によって基本的には制限されている。振幅を過度に大きく選択すると、ＡＯＴＦが損傷するおそれがある。

別の具体的な実施例では、前記光線は、設定可能な波長帯域幅を有することができる。この場合には、その都度の使用事例に合わせるべきである。

本方法を特に確実かつ簡単にすることに鑑みて、前記光線を、白色光レーザまたは１つまたは複数のダイオードレーザによって供給することができる。この場合にも、その都度の使用事例に合わせるべきであり、個々の使用事例にとって最も有利な変形例を選択することができる。

とりわけ光線を生成するために複数の個々のレーザを使用する場合には、前記光線を、１つに統合された光線として供給することができる。

本光学装置の特に有利な実施形態では、前記光学装置が顕微鏡に組み込まれている場合に、励起光を遮断するためのノッチフィルタを検出光路に配置することができる。とりわけ光線を生成する光源として白色光レーザを使用する場合に、より高い光強度が望まれる、白色光レーザのいくつかの選択された波長に限定する場合には、このような配置構成が適当である。

本光学装置の特に有利な実施形態では、前記光学装置が顕微鏡に組み込まれている場合であって、前記光学装置の音響光学ビームスプリッタ、すなわちＡＯＢＳが２結晶構造で構成されている場合に、試料によって反射された励起光を検出光路から回折するための前記ＡＯＢＳの第２の結晶を、前記ＡＯＴＦと同様に、対応する大きさに選択された振幅で動作させることが可能である。これにより、反射された励起光が検出光路から確実に回折される。

以上をまとめると、本発明による方法および本発明による光学装置では、ＡＯＴＦに作用する音波の選択された周波数および／または振幅の関数関係と、影響を与えるべき光線の波長と、得られる回折効率とに鑑みて、ＡＯＴＦの挙動における非線形性が利用し尽くされ、これによってＡＯＴＦの通過後に結果的に生じる光線の強度および幅が増加されることを確認することができる。

本発明の教示を有利に構成および改善するための種々異なる可能性が存在する。このために一方では従属請求項を参照すべきであり、他方では図面に基づく本発明の好ましい実施例の後続の説明を参照すべきである。図面に基づく本発明の好ましい実施例の説明に関連して、本教示の一般的に好ましい実施形態および改善形態についても説明する。

光線の強度を調整するためのＡＯＴＦを有する光学装置の概略図である。 光線の強度を調整するためのＡＯＴＦを有する別の光学装置の概略図である。 ＡＯＴＦの動作に特徴的な関数を示す２つの線図である。 複数の異なる振幅における波長に依存した回折効率と、音波の振幅に依存した光強度とを示す３つの線図である。 本発明の１つの実施例に基づく追加的なノッチフィルタを有する顕微鏡の形態の光学装置の概略図である。 本発明の別の実施例に基づく試料領域における光学装置の部分領域を示す図である。 本発明の１つの実施例に基づく相応の制御による２つの可能な動作モードの概略図である。

図３に示したＡＯＴＦの通常の動作方式を、本発明の枠内では、より高い光強度の達成に鑑みて最適化できることが判明している。したがって本発明では、ＡＯＴＦまたは図１および図２に示された構造および光路における構造的な変更を加えることなく照明強度の増加を可能にする、新しい動作モード（拡張出力（Enhanced-Power）モード）が説明される。

スペクトル狭帯域レーザ（蛍光顕微鏡の場合には典型的にヘリウムネオンレーザ、アルゴンレーザ、またはダイオード励起固体レーザ）の強度を変化させるためにＡＯＴＦを使用する場合には、ＡＯＴＦ（図３参照）の波長依存性の伝達関数の正確な形状は実際には重要ではなく、その代わりに最大回折効率だけが重要となる。したがって、音響波または音波の振幅は、通常はゼロとＡ_ｏｐｔとの間だけで変化する。しかしながら、Ａ_ｏｐｔを上回る振幅に関してＡＯＴＦの伝達関数を考慮してみると、まず伝達関数の側波帯が増加し、中央の最大値が減少することが確認される。この最大値は、振幅が２Ａ_ｏｐｔの場合にはゼロまで減少し、振幅が増大するにつれて再び増加する。図４の左側には、この挙動が示されている。見易くするために、Ａ_ｏｐｔと３Ａ_ｏｐｔとの間の振幅Ａの曲線が２つの線図で図示されている。既に説明した中央の最大値の挙動の他に、振幅が増大するにつれてこの最大値またはピーク値が広がることも確認することができる。スペクトル広帯域レーザの場合には、全回折効率のために、最大値の値だけではなく、図４の左側に示された曲線の下の積分値も（より具体的に言えば、伝達関数とレーザスペクトルまたは光線スペクトルとの積の積分値も）重要である。ここから得られる光強度は、振幅に依存した図４の右側（同様に「回折効率」と記載されている）に、レーザスペクトルがＡＯＴＦの伝達関数よりも格段に広い場合に関して示されている。この場合には、第１の極大値がＡ_ｏｐｔの振幅において発生し、第２の極大値が３Ａ_ｏｐｔにおいて発生する。このようにして、ＡＯＴＦの一次回折における光強度を２倍超にも増加させることができる。この場合に発生する、励起光の比較的広いスペクトル幅（数ナノメータ）は、蛍光顕微鏡で使用される色素が有する広い励起スペクトルにとってさほど重要ではない。

本発明による新しい動作モードを、レーザ走査型顕微鏡に関連して実際に使用するためには、この関連において２つの重要な条件を満たすことが必要である：
１． 図１の主ビームスプリッタ６または図２のＡＯＢＳ１７の出射効率が十分に高くなければならない。
２． 光学要素および／または被検試料１０において反射される励起光の抑制が阻害されてはならない。

１．に関して：ノッチフィルタまたはエッジフィルタを使用する場合には、励起光の若干拡大されたスペクトル幅は、典型的な構成の場合には問題ではない。なぜなら、このようなフィルタの帯域幅は、ＡＯＴＦによって回折されるレーザ光の帯域幅よりも依然として格段に大きいからである。ビームスプリッタとしてＡＯＢＳを使用する場合には、このＡＯＢＳは、当該ＡＯＢＳの伝達関数が、前置接続されているＡＯＴＦの伝達関数よりも大きい帯域幅（典型的には約２倍）を有するように、設計毎に構成されている。比較的広い励起スペクトルによってＡＯＢＳの回折効率は低下するが、上述した考察と同じように単純に考察すると、比較的低い効率にもかかわらず、Ａ_ｏｐｔの最大振幅を有する通常動作モードよりも依然として６０～７０％多い励起光が試料に到着することが分かる。

２．に関して：励起光の抑制は、フィルタをベースにした構成の場合には、１．と同じ理由から問題ではない。ＡＯＢＳの場合には、選択されたＡＯＴＦおよびＡＯＢＳの設計に依存して反射抑制が悪化する。励起光の抑制はさらに、使用されている検出器と、とりわけその配置構成とに強く依存しているので、どの点まで抑制が容認されうるのかを示す一般的な基準を定めることはできない。それどころか、低下した反射抑制が容認されうるかどうかを、適用毎に判別しなければならない。ここでは、どのようにして抑制をさらに改善することができるかについての２つの可能性を、実施例に基づいて端的に説明する：

●一方の可能性では、検出光路に１つまたは複数のノッチフィルタを配置することができる。白色光レーザの場合に、拡張出力モードが許可されるいくつかの選択された波長に限定する場合には、励起光を遮断するための追加的なノッチフィルタを検出光路に取り付けることができる。図５は、このような可能な実施例を示す。ただし、光路１１におけるノッチフィルタ１９の厳密な位置は重要ではない。

●第２の可能性およびさらに別の実施例に基づいてＡＯＢＳが２結晶構造で構成される場合には、結晶２も、ＡＯＴＦと同様に拡張出力モードで、すなわち増大された振幅で動作させることができる。このことは、改めて励起光をより強力に抑制するために作用する。図６は、さらに別の実施例におけるこのような配置構成を示す。励起光５は、通常動作モードにある第１のＡＯＢＳ結晶から試料へと偏向される。反射された励起光２０は、結晶１（通常動作モードにある）と、結晶２（拡張出力モードにある）とによって検出光路１１から回折される。

反射された励起光２０の複数の異なる回折方向は、光の種々異なる偏光から結果的に生じる。

本発明による方法に基づく拡張出力モードを光退色実験のためだけに使用する場合には、反射抑制はさほど重要ではない。なぜなら、光退色中には通常、検出は行われず、光退色に後続する測定のために再び通常動作モードに戻すことができるからである。

図７は、２つの可能な動作モードと、可能な有利な制御の実施方法と、を図示している。通常動作モードでは、調整要素によって音響振幅または音波振幅がゼロとＡ_ｏｐｔとの間で変化される。これによって光強度は０～１００％の間で変化する。拡張出力モードをスイッチオンすると、第２の調整要素によって振幅をＡ’_ｏｐｔと極大値との間で調整することができ、これによって１００％の光と、達成可能な最大パーセンテージ数ＭＡＸの光と、の間で光強度を変化させることができる。２つの調整要素を（場合によってはそれぞれ異なる数学的な関数によって）線形にしてもよい。

本発明による方法および本発明による光学装置のさらなる有利な構成に関しては、繰り返しを避けるために明細書の概要部分および添付の特許請求の範囲が参照される。

最後に、上述した実施例が、特許請求する教示を説明するためだけに使用されており、特許請求する教示をこれらの実施例に限定していないこと明示的に指摘しておく。

１．１～１．Ｎ レーザ
２ 光学要素
３ ＡＯＴＦ
４ 光学系
５ 励起ビーム
６ 主ビームスプリッタ
７ 走査ユニット
８ フィールド光学系
９ 対物レンズ
１０ 試料
１１ 検出光路
１２ 集束光学系
１３ ピンホール
１４ コリメーション光学系
１５ 検出モジュール
１６ レーザ
１７ ＡＯＢＳ
１８ 回折効率
１９ ノッチフィルタ
２０ 励起光

Claims (9)

1. 光学装置における光線の強度を調整するための方法であって、
   前記光線を、音響光学フィルタであるＡＯＴＦ（３）に通し、
   前記光線の強度を、前記ＡＯＴＦ（３）を動作させる音波の周波数および振幅に依存して調整する方法において、
   前記音波の所与の周波数における前記音波の振幅を、前記光線の所与の波長または所与の波長スペクトルに対する回折効率（１８）の第１の極大値に到達するために選択される振幅よりも大きくなるように選択し、
   前記音波の振幅をさらに、前記ＡＯＴＦ（３）の伝達関数と前記光線の波長スペクトルとの積の積分値が、前記第１の極大値に到達するために選択される前記振幅の大きさにおける前記ＡＯＴＦ（３）の伝達関数と前記光線の波長スペクトルとの積の積分値よりも大きくなるように選択し、
   前記光線を生成する１つの光源（１６）または複数の光源（１．１～１．Ｎ）を、生成される前記光線の波長スペクトルが前記ＡＯＴＦ（３）の波長依存性の前記伝達関数の幅と同じか、またはそれよりも広くなるように選択または調整する、
   方法。
2. 前記振幅を、前記第１の極大値に到達するために選択される前記振幅の２倍超に選択する、
   請求項１記載の方法。
3. 前記振幅を、前記第１の極大値に到達するために選択される前記振幅の３倍以下に選択する、
   請求項１または２記載の方法。
4. 前記光線は、設定可能な波長帯域幅を有する、
   請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
5. 前記光線を、白色光レーザ（１６）またはダイオードレーザによって供給する、
   請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
6. 前記光線を、複数の個々のレーザ（１．１～１．Ｎ）によって１つに統合された光線として供給する、
   請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
7. とりわけ請求項１から６までのいずれか１項記載の光線の強度を調整するための方法を実施するための、好ましくは顕微鏡における光学装置であって、
   前記光線を、音響光学フィルタであるＡＯＴＦ（３）に通し、
   前記光線の強度を、前記ＡＯＴＦ（３）を動作させる音波の周波数および振幅に依存して調整する光学装置において、
   前記音波の所与の周波数における前記音波の振幅を、前記光線の所与の波長または所与の波長スペクトルに対する回折効率（１８）の第１の極大値に到達するために選択される振幅よりも大きくなるように選択し、
   前記音波の振幅をさらに、前記ＡＯＴＦ（３）の伝達関数と前記光線の波長スペクトルとの積の積分値が、前記第１の極大値に到達するために選択される前記振幅の大きさにおける前記ＡＯＴＦ（３）の伝達関数と前記光線の波長スペクトルとの積の積分値よりも大きくなるように選択し、
   前記光線を生成する１つの光源（１６）または複数の光源（１．１～１．Ｎ）を、生成される前記光線の波長スペクトルが前記ＡＯＴＦ（３）の波長依存性の前記伝達関数の幅と同じか、またはそれよりも広くなるように選択または調整する、
   ことを特徴とする光学装置。
8. 前記光学装置が顕微鏡に組み込まれている場合に、励起光を遮断するためのノッチフィルタ（１９）が検出光路に配置されている、
   請求項７記載の光学装置。
9. 前記光学装置が顕微鏡に組み込まれている場合であって、前記光学装置の音響光学ビームスプリッタであるＡＯＢＳが２結晶構造で構成されている場合に、試料（１０）によって反射された励起光（２０）を検出光路（１１）から回折するための前記ＡＯＢＳの第２の結晶を、前記ＡＯＴＦ（３）と同様に、対応する大きさに選択された振幅で動作させることが可能である、
   請求項７または８記載の光学装置。

Images