JP7075136B2 - 整形外科疾患の治療のための組成物および方法 - Google Patents

Description

本発明は、整形外科疾患の治療のための組成物および方法に関する。一実施形態において、本発明は、骨折を治療および／またはその治癒率を高めるための組成物および方法に関する。そのような実施形態において、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）を促進する栄養補助組成物は、生体力学特性によって実証した通り、骨折治癒を高める。骨折後の速やかな栄養補助組成物の使用は、骨折の治癒を高める。さらに本発明は、骨粗鬆症の治療、その発症の阻害および／または進行速度を遅延させる組成物、剤型および方法に関する。特に本発明は、ｉＮＯＳの上方調節による骨粗鬆症の治療および／または予防のための栄養補助組成物、剤型および方法に関する。

骨折は、骨の強度を超える肢部への力または圧力（例えば、曲げ力、トルクおよび／または圧搾力）によって引き起こされる。折れた骨が皮膚を貫通すると、開放性または複雑性骨折が起きるが、閉鎖性骨折では、皮膚は損傷されない。骨折は横方向、縦方向および／または複数個所で生じ得る。病的骨折は、身体的外傷に加えて、骨粗鬆症または骨肉腫などの疾患により引き起こされ得る。原因に関わらず、骨折に関わる激しい痛みおよび機能障害はしばしば、人生を変える程の経験であり、骨が十分に治癒して正常に機能するまでの長い時間によって悪化する。骨折治癒を促進する薬および治療方法が長年、必要とされてきた。

骨折治癒は、骨を骨折前の状態に修復する複雑で連続した細胞事象の結果、生じる。骨折の両端の間のスペースは、間葉細胞およびサイトカインが豊富なヘマトーマで満たされており、これは、最終的に炎症期と、それに続く修復期、その後の再形成期に移行する柔らかい仮骨を表している。

これらの段階の正確な制御機構は、未だ完全に理解されていないが、仮骨部分の新生血管および骨芽細胞の増加は、治癒の成功に重要な役割を担っているように思われる。

骨粗鬆症に関して、骨粗鬆症は骨量の減少を招き、その結果、骨構造の悪化および骨折のリスクを増加させる病気である。骨粗鬆症は、原発性、または続発性として別の病気の結果、生じ得る。続発性骨粗鬆症はあらゆる年齢の人に悪影響を及ぼすが、骨粗鬆症は一般に５０歳以上の男女両方に悪影響を及ぼす。骨粗鬆症を治療する様々な方法があるが、骨粗鬆症に苦しむ人々を治療するための、よりシンプルで信頼性があり、さらに費用効率の高い方法に対する需要が依然として存在する。

疾病を治療するための栄養補助食品の使用を裏打ちする科学分野の研究は、過去数十年間に渡って増えている。これは、特定の化合物と組み合わせた天然食品または製品の使用を含む。しかし、これらの天然製品の生物的および生化学的な役割は、未だ解明途中にあり、製剤のごく僅かな変化および／または患者特有の様々な要因に対する重大な予測不可能性が残っている。

アルギニンおよび他のアミノ酸は、何十年もの間、ヒトおよび一般的な動物の生体機能に重要な役割を担っていることが知られている。ショウガや他のハーブは、しばしば、食品と配合される。Ｄａｒｌａｎｄらの米国特許第２００２／００５１８２６号には、ローズマリーと他の成分（例えば、クルクミンやケルセチン）との組み合わせを、炎症関連疾病の治療に使用できることを教示している。これらの主成分に加えて、Ｄａｒｌａｎｄはまた、Ｄ体のラモネンまたはヘスペリジンに由来するリモネンの任意の使用、または１８０ｍｇから２２０ｍｇのショウガの使用を教示している。上記製剤は、任意に１８０ｍｇから２２０ｍｇのシトルリンまたは他のビタミンを含み得る。このような報告は、ショウガ、シトルリンおよびアルギニンなどの成分が長期間の栄養補助食品として安全であることを教示している。上記先行技術に開示されている複雑な製剤は、健康上への一般的な利益をもたらすことを示唆するが、特定製剤の試験の増加および健康の様々な側面に及ぼす良い影響、悪い影響の両側面を決定するというニーズが存在する。

このように天然ハーブの利益と不利益には多くの不確実性が残っており、その大部分は、完全に再現できない事例報告に基づく広範囲の競合する不確実な教示内容と一緒になっている。内科療法を推奨するため、西洋医学研究に携わる当業者には、許容されている科学的手法を用いた研究に基づくデータが要求される。このような科学的手法には、各試験の前後とその間に、対照群（例えば、プラシーボまたはベースライン製剤）、独立した客観的解析、患者の病歴および患者のモニタリングが含まれる。可能であれば、科学的手法には、信頼性があり一貫性のある成分と分析の均一な構成を含む二重盲目臨床試験が含まれるべきである。そうでなければ、上記のデータおよび／または結論は、適切に行われた研究、例えばＩＲＢプロトコル（他の科学者によって提出され、承認された機関審査委員会プロトコル）を含んでもよい米国食品医薬品局（ＵＳ ＦＤＡ）によって承認された種類の研究に基づく主観的、逸話的および／または誤った批判に曝される。

現代医学および科学に熟練した臨床医が信頼できる研究結果を得ることが好ましい。合成化学医薬製剤の代わりに、十分に確立された安全性を有する天然物を食品として使用することが望ましいが、その場合の使用は、規制上および科学的な精査を満足する医薬品の補充または補足を正当化する十分な研究に基づくべきである。本発明者らは、（既存製剤の副作用を回避しつつ）長期間の連続投与に実用的であり、従来の骨粗鬆症の治療を利用できない患者への骨粗鬆症の治療および予防を可能にし、または骨粗鬆症を予防および治療するための新規で実用的費用効率の高い製剤を提供し得る骨粗鬆症の治療および抑制のための組成物および方法を提供するという問題に直面した。

したがって、本発明の目的は、整形外科疾患の治療を高めるための組成物であって、十分な期間に渡って薬学的に有効な量を投与することにより、ｉＮＯＳを刺激して整形外科疾患の治療を高められる組成物を提供することにある。

本発明の他の目的はまた、整形外科疾患の治療を高めるための組成物であって、ショウガまたはショウガ誘導体、ムイラプアマ、ポーリニアクパナ、並びにＬ－アルギニンおよびＬ－シトルリンの少なくとも１つを含む組成物を提供することにある。

本発明の他の目的は、整形外科疾患の治療を高めるための組成物であって、２５０ｍｇから２ｇのショウガまたはショウガ誘導体を含む組成物を提供することにある。

本発明のさらなる目的は、整形外科疾患の治療を高めるための組成物であって、Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ ｒｏｓｃｏｅまたはＺｉｎｇｉｂｅｒ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ ｒｏｓｃｏｅの地下茎に由来するショウガ誘導体組成物を提供することにある。

本発明の目的はまた、整形外科疾患の治療を高めるための組成物であって、新鮮で部分的に乾燥したショウガ、乾燥したショウガ、６－ジンゲロールよりなる群から選ばれるショウガまたはショウガ誘導体の組成物を提供することにある。

本発明の他の目的は、１０ｍｇから３ｇのＬ－アルギニン、Ｌ－シトルリン、またはＬ－アルギニンとＬ－シトルリンの混合物を含む、整形外科疾患の治療を高めるための組成物を提供することにある。

本発明のさらなる目的は、１０ｍｇから２ｇのＬ－アルギニン、Ｌ－シトルリン、またはＬ－アルギニンとＬ－シトルリンの混合物を含む、整形外科疾患の治療を高めるための組成物を提供することにある。

本発明の目的はまた、１００ｍｇから３ｇのムイラプアマを含む、整形外科疾患の治療を高めるための組成物を提供することにある。

本発明の他の目的は、５００ｍｇから１．５ｇのムイラプアマを含む、整形外科疾患の治療を高めるための組成物を提供することにある。

本発明のさらなる目的は、少なくとも２５０ｍｇのポーリニアクパナを含む、整形外科疾患の治療を高めるための組成物を提供することにある。

本発明の目的はまた、５００ｍｇのポーリニアクパナを含む、整形外科疾患の治療を高めるための組成物を提供することにある。

本発明の他の目的は、２５０ｍｇから２ｇのショウガまたはショウガ誘導体、２５０ｍｇから２ｇのＬ－アルギニン、Ｌ－シトルリン、またはＬ－アルギニンとＬ－シトルリンの混合物、５００ｍｇから１．５ｇのムイラプアマおよび５００ｍｇのポーリニアクパナを含む、整形外科疾患の治療を高めるための組成物を提供することにある。

本発明のさらなる目的は、整形外科疾患の治療を高めるための組成物であって、十分な期間に渡って薬学的に有効な量を投与することにより、骨折治癒率を高めることができる組成物を提供することにある。

本発明の目的はまた、整形外科疾患の治療を高めるための組成物であって、十分な期間に渡って薬学的に有効な量を投与することにより、骨粗鬆症の治療に有効な組成物を提供することにある。

本発明の他の目的は、整形外科疾患の治療を高めるための組成物であって、錠剤、カプセル、トローチまたは懸濁剤を含む経口剤型組成物を提供することにある。

本発明のさらなる目的は、整形外科疾患の治療を高めるための方法であって、ｉＮＯＳを刺激して整形外科疾患の治療を高めるため、薬学的に有効な量の組成物を十分な期間に渡って投与する方法を提供することにある。

本発明の他の目的および利点は、本発明の特定の実施形態を明らかにしている添付の図と共に参照したとき、下記の詳細な説明から明らかになるであろう。

図１は、一酸化窒素－ｃＧＭＰ経路の上方調節に対する３つのメカニズムを説明する概略図である。 図２は、骨折治癒の目的のため一酸化窒素－ｃＧＭＰ経路を上方調節するために本発明の栄養補助組成物が機能する生物的な経路の概略図である。 図３は、３つの群のそれぞれの代表的なｑＣＴ画像を示す。上記ｑＣＴ画像は、骨折面での骨片の重なりをなくすため、骨折部位からそれぞれ１ｍｍ下で撮影した。骨折の総ミネラル含有量および仮骨の体積は、骨折部位とその上下１ｍｍの３つのセクションの値の合計を計算した。右方の棒は骨密度を表す。 図４は、４２日目における骨折治癒の最大トルク（強度）および剛性を示す。対照群と比較した結果を、平均±Ｓ．Ｅ．＊ｐ＜０．０５で表す。 図５は、大腿骨骨折後１４日目および４２日目におけるｉＮＯＳ発現に対するタダラフィルおよびＣＯＭＢ－４（本発明の栄養補助組成物）の効果を示す。ｉＮＯＳの発現は、骨折および骨折後直ちに日常的に開始したタダラフィルまたはＣＯＭＢ－４による治療後、１４日目および４２日目における免疫組織染色により測定した。細胞１個当たりの強度の定量的画像解析を示し、対照群と比較した結果を平均±Ｓ．Ｅ．＊ｐ＜０．０５とで表す。 図６は、骨粗鬆症の治療目的のため、本発明の組成物が一酸化窒素－ｃＧＭＰ経路の上方調節のために機能する生物的な経路の概略図である。 図７は、骨粗鬆症の治療における本発明組成物の有効性試験で採用した実験計画の概略図である。 図８－２７は、骨粗鬆症の治療における本発明組成物の有効性をサポートする試験データを示す。 図２８－３２は、イン・ビボ研究で使用した投与量では本発明の組成物が骨芽細胞の増殖抑制効果を有しないことを実証するデータを示す。

ここに本発明の詳細な実施形態を開示する。しかし、開示した実施形態は本発明の単なる例であって、様々な形態で具体化されても良いことを理解すべきである。したがって、ここに開示した詳細は限定して解釈すべきでなく、単に本発明を作製および／または使用する方法を教示するための基礎として解釈すべきである。

本発明は、整形外科疾患の治療のための組成物および方法を提供する。特に本発明は、骨折した骨を治療するため、および／またはそれの治癒率を高めるための栄養補助的組成物を提供する。本発明はまた、骨粗鬆症を治療するための栄養補助的組成物を提供する。上記栄養補助的組成物（ここでは、様々な図中においてもＣＯＭＢ－４と呼ぶ。）は、新鮮な部分乾燥植物性ショウガ、乾燥植物性ショウガ、６－ジンゲロール、およびそれらの混合物から選ばれる有効量のショウガ、またはショウガの誘導体；アルギニンおよびシトルリン（好ましくはＬ－アルギニン、Ｌ－シトルリンまたはＬ－アルギニンとＬ－シトルリンの配合体）から選ばれる少なくとも１つ；ムイラプアマ；ポーリニアクパナ（ガラナ）を含む。

ショウガは、単独でおよび／または他の化合物と組み合わせて使用した場合、多くの特性を発揮するといわれている複雑な天然組成物である。例えば、伝統的な漢方薬では、様々な形而上学理由に基づいて種々の疾病を治療または予防するためにショウガを用い、またはショウガを組成物に含んでいる。過去１００年以上の間、科学的手法によって、多くの伝統的な漢方薬が所望とする効果を発揮しないこと、および／またはターゲットとなる疾病を悪化させることさえあることが示された。それにも拘らず、一部の伝統的な漢方薬は、たとえ伝統的な漢方薬では意図している使用に対して効果的または安全でないとしても、医学的用途の可能性がある活性物質を含んでいることが分った。ショウガの複雑さ、およびその無数の特性は、下記構造を有する特定の構成化合物によって反映される：

式中、例えば６－ジンゲロールにおいてバニリル官能基（例えば、４－ヒドロキシ－３－メトキシフェニル基）のＲ側鎖は以下のとおりである。

したがって、６－ジンゲロール（ジンゲロールとも呼ばれる）は、（Ｓ）－５－ヒドロキシ－１－（４－ヒドロキシ－３－メトキシフェニル）－３－デカノンであり、下記の構造を示す。

ショウガは、様々な複雑さおよび化学活性を有する複数の化合物を含んでいるため、一酸化窒素（ＮＯ）の生成を誘導する、または治癒において潜在的な役割を果たすのに有用であり得る化合物の生物活性について、当該分野にて競合する教示が存在する。さらに、関連する代謝経路をどのように理解すれば良いのか、それほど制御できないかについて多くの不確実性が残っている。しかし、本出願人は、ショウガを、ムイラプアマ、ポーリニアクパナ（ガラナ）、並びにアルギニンおよびシトルリン（好ましくは、Ｌ－アルギニン、Ｌ－シトルリンまたはＬ－アルギニン、Ｌ－シトルリンとの組み合わせ）の少なくとも１つと組み合わせた場合、整形外科疾患の治療に有効に使用できることを発見した。

本発明による栄養補助的組成物の経口投与剤型は、上記成分を含む錠剤、カプセル、トローチ、粉末または懸濁剤から選択される。好ましい懸濁剤は、水および／またはアルコール（エタノール）をベースとしたものである。

原材料および成分物質は、経口投与剤型に成型する前に、例えばフリーズドライまたは真空乾燥によって乾燥してもよい。個々の剤型は、圧縮錠剤、カプセル、トローチであってもよいし、小袋に入れて提供してもよい。懸濁製剤を提供することもできる。ショウガ、ショウガ根エキス、Ｌ－アルギニン、Ｌ－シトルリン、ムイラプアマ、およびポーリニアクパナはすべて、別々に市販されており、好ましい供給源および分析を以下に示す。好ましくは、上記成分を組み合わせて、ゼラチンカプセルに封入するが、他の剤型も同様の結果をもたらすことが予想される。

調味料または矯味剤を使用してもよい。錠剤または他の剤型は、希釈剤（例えばラクトース）、崩壊剤（例えば、クロスカメロースナトリウム）、または結着剤（ポリビニルピロリドン）を含んでいてもよい。例えば、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤または他の従来の賦形剤（例えば、シリカや炭水化物など）を用いてもよい。フィルムコーティング錠を提供してもよい。

本発明組成物の有効成分を、周知の標準的な工程および薬剤を用いて混合する。好ましくは、ゼラチンカプセルは粉末状で組み合わせた成分を含んでいる。粉末製剤中の標準成分は、本発明の好ましい代表的な製剤を調製および合成するために用いる。例えば、シリカ担体（例えば、アメリカ合衆国、ニュージャージー州、パーシッパニーのＥｖｏｎｉｋ Ｄｅｇｕｓａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ製、Ｓｐｅｒｎａｔ ５０Ｓ（登録商標））は液体を流動性粉末に変換するために用いることができ、および／または粉末製品（特に固化し易い粉末）の流動性および貯蔵寿命を高めるために用いることができる。ステアリン酸マグネシウム（オクタデカン酸、マグネシウム塩、例えば、オランダ王国のＰｅｔｅｒ Ｇｒｅｖｅｎ製ＬＩＧＡＭＥＤ）は、組成物およびその成分が製造装置に付着するのを防ぐのに作用する潤滑性の希釈剤として使用してもよく、結着剤としても作用し得る。粉末状成分を検査し、秤量し、混合し、次いでゼラチンカプセルに封入する。上記の混合工程は、標準的な温度で、栄養補助食品として少なくとも十分な滅菌環境下での標準的なスクリーニング、混合および金属検出を含んでいる。

有効成分の供給源は以下のとおりである。
代表的な有効成分の供給源
ショウガ
供給源１．ＳＯＬＡＲＡＹ ＧＩＮＧＥＲ 根エキス
ショウガ根－２５０ｍｇ（５％ジンゲロール）
ジンゲロール－１２．５ｍｇ／５％
他の成分：ステアリン酸マグネシウム、クロスカメロースナトリウム
ユタ州、パークシティ
ｗｗｗ．Ｓｏｌａｒａｙ．ｃｏｍ
供給者源．ＮＡＴＵＲＥ‘Ｓ ＡＮＳＷＥＲ， ＩＮＣ． ショウガ地下茎エキス
ショウガ地下茎エキス－５％ジンゲロール＋ショウガオールに対して１２５ｍｇが標準化されている）
他の成分：植物性セルロース、米粉、リン酸二カルシウム、ケイ酸カルシウム
１１７８８－３９４３ ニューヨーク州、ホーポージ
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅｓａｎｓｗｅｒ．ｃｏｍ／
供給源３．ＳＯＬＧＡＲ ＧＩＮＧＥＲ 根エキス
ショウガ根エキス－３００ｍｇ（５％ショウガフェノール）
生のショウガ末－１５０ｍｇ
Ｃ－アスコルビン酸、ベータカロテン、ステアリン酸マグネシウム、単結晶セルロース
ニュージャージー州、ヴェロニカ
ＳＯＬＧＡＲ ＧＩＮＧＥＲ 粉末
ショウガ末－５００ｍｇ
ショウガ根エキス ４：１－５ｍｇ

Ｌ－シトルリン
ＳＯＵＲＣＥ ＮＡＴＵＲＡＬＳ Ｌ－シトルリン フリーフォームアミノ酸サプリメント：
Ｌ－シトルリン ２ｇ
他の成分：ゼラチン（カプセル）、微結晶セルロース、コロイド状二酸化ケイ素およびステアリン酸マグネシウム
Ｓｏｕｒｃｅ Ｎａｔｕｒａｌｓ， Ｉｎｃ．
２１１８ 私書箱
９５０６２ カリフォルニア州、サンタクルーズ
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｏｕｒｃｅｎａｔｕｒａｌｓ．ｃｏｍ／

Ｌ－アルギニン
ＴＨＥ ＶＩＴＡＭＩＮ ＳＨＯＰＰＥ Ｌ－ＡＲＧＩＮＩＮＥ
Ｌ－アルギニン－５００ｍｇ
ビタミンＢ６ １０ｍｇ
他の成分：ゼラチン、米粉、ステアリン酸マグネシウム

ムイラプアマ
供給者源．ＳＯＬＡＲＡＹ ムイラプアマ Ｐｔｙｃｈｏｐｅｔａｌｕｍ Ｏｌａｃｏｉｄｅｓ 栄養補助食品：
ムイラプアマ Ｐｔｙｃｈｏｐｅｔａｌｕｍ Ｏｌａｃｏｉｄｅｓ（根）－６００ｍｇ
他の成分：ゼラチンカプセルおよびセルロース
Ｎａｔｕｒａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．製
８４０６０ ユタ州、パークシティ
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｏｌａｒａｙ．ｃｏｍ
供給源２．ＮＡＴＵＲＥ‘Ｓ ＡＮＳＷＥＲ ムイラプアマ オーガニックアルコールエキス：
ムイラプアマ根エキス（１：１）－２０００ｍｇ
他の成分：精製水、植物性グリセリン、１２～１５％の有機認証されたアルコール

ポーリニアクパナ（ガラナ）
ＳＯＵＲＣＥ ＮＡＴＵＲＡＬＳ ガラナエナジャイザー栄養補助食品：
ガラナ種エキス（２２％カフェイン）－９００ｍｇ
他の成分：微結晶セルロース、第二リン酸カルシウム、ステアリン酸、変性セルロースガムおよびコロイド状二酸化ケイ素
Ｓｏｕｒｃｅ Ｎａｔｕｒａｌｓ， Ｉｎｃ．
２１１８私書箱
９５０６２ カリフォルニア州、サンタクルーズ
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｏｕｒｃｅｎａｔｕｒａｌｓ．ｃｏｍ／

本発明の栄養補助組成物の特定の好ましい製剤は、食品中に見出された組成物または食品から抽出された組成物を含んでいるので、「栄養補助食品群」と呼ばれることがある。栄養補助組成物は従来、カプセルまたは錠剤のような薬用フォーマットで見出されてきたが、多くの食品が栄養補助食品群により栄養価が益々強化されてきた。ムイラプアマ、ポーリニアクパナ（ガラナ）、並びにＬ－アルギニンおよび／またはＬ－シトルリンと組み合わせたショウガ成分の類似体および／または同族体は、本発明に使用することにより、骨粗鬆症に関連する繊維症事象を改善、阻害または逆行させるのに十分なｉＮＯＳを促進するか、または骨折に関連する骨の治癒を促進する。したがって本発明の栄養補助組成物は、「サプリメント」または「スムージー」など、１日に１回または２回の栄養補助食品として、使用者のライフスタイルおよび食品の好みに合うように広範囲の方法および形態で服用することができる。

著しい医学的な進歩は、天然型をそのままの形で、抽出物として、または濃縮物として使用することによりもたらされてきた。例えば、アセチルサリチル酸（またはアスピリン）は、柳の木に由来する。同様に抗がん剤タキソールは、太平洋イチイから単離したものである。その結果、天然物は長年の間、様々な疾病の治療に使用されてきた。多くの天然物は、性的能力を増加させるため、性障害を治療するため、または媚薬として作用すると考えられてきた。

しかし、生体システムの複雑さ、土壌および気候に基づく植物およびそれらの誘導体の相違、並びに他の化合物との相互作用などのために、多くの予測不可能性が存在する。本出願人は、本発明栄養補助組成物の使用により、骨粗鬆症の症状は、本発明の栄養補助組成物で予測される生物学的利用能を超えて低減され得ることを発見した。同様に本出願人は、本発明の栄養補助組成物は、骨折の治癒を改善することを発見した。

本開示で用いる「有効量」は、栄養補助組成物の剤型が、例えば骨折した骨の治癒および／またはそれの治癒率の増加、または骨粗鬆症発症の治癒、阻害および／または骨粗鬆症の進行速度を遅延させる際に有効な整形外科効果を得るために十分な時間に渡ってヒト患者へ投与するとき、各成分を十分な量含むことを意味することを意図している。上記の有効な効果は、骨折した骨の治癒状況において、最適な機能のために骨の成長を必要とする骨ミネラル量（ＢＭＤ）の増加、骨折治癒の促進、（主体的にまたは補助的に）変形癒合または癒着不能の治癒、および急速なインプラント内またはインプラント上の骨の成長の少なくとも１つを含む。上記の有効な効果は、骨粗鬆症の状況において、最適な機能のために骨の成長を必要とする骨ミネラル量（ＢＭＤ）の増加、骨折治癒の促進、（主体的にまたは補助的に）変形癒合または癒着不能の治癒、および急速なインプラント内またはインプラント上の骨の成長の少なくとも１つを含む。

ここで用いる「個々の投与用量」は、投与計画の一部としてヒト患者に投与する栄養補助組成物の、単回投与当たりの栄養補助組成物の量を意味する。

ここで用いる「１日当たりの総量」は、栄養補助組成物を投与計画の一部として１日に１回または複数回投与するかにかかわらず、１日に渡ってヒト患者に投与する栄養補助組成物の累計量を意味する。

ここで用いる「約」は、特定の値の＋／－１０％の範囲の値を意味する。

骨折の治癒を促進するための組成物および方法
誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）は、骨折治癒の過程において主要な役割を果たすことが示されている。本発明では、骨折治癒におけるｉＮＯＳの上方調節の効果を考慮する。特に、タダラフィル（ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害薬）および本発明の栄養補助組成物ＣＯＭＢ－４（Ｌ－シトルリン、ポーリニアクパナ、ショウガ、およびムイラプアマからなる）の、単独または組み合わせによる骨折治癒の効果を考慮する。ヒトへの応用性に当たって優れた根拠を示すと考えられるラットモデルでの実験は、骨折治癒における本発明栄養補助組成物の投与による利点を立証する。例えば、本発明栄養補助組成物の配合物を、片側開放骨折を有するラットに毎日投与し、早期（１４日目）および後期（４２日目）に屠殺した後、骨折治癒を分析した。驚くべきことに、本発明の栄養補助組成物により、骨折治癒は有意な増強を示すことが見出された。これとは対照的に、タダラフィルは、その既知のｉＮＯＳ活性にも関わらず、骨折治癒の有意な改善は認められなかった。より高用量のタダラフィルを投与してもよいが、許容量の実際的な限界にチャレンジすることになる。タダラフィル（および他のＰＤＥ阻害薬）の既知の副作用を考慮すると、本発明の栄養補助組成物は、研究に用いるよりも更に高用量を十分に許容可能であり、健康への悪影響なしに、広く用いてきた成分で構成されるという驚くべき利点を有している。下記実験の詳細は、骨折治癒を改善するため、本発明の栄養補助組成物を単独またはＰＤＥ阻害薬と組み合わせて使用したときの好ましい非限定的な例を示している。

好ましい一実施形態によれば、上記栄養補助組成物の１日当たりの総量は、以下のとおりである。
・最大約３ｇまで（好ましくは、約２５０ｍｇから約２ｇ）のショウガおよびショウガ誘導体
・約１０ｍｇから約２ｇ（好ましくは約４００ｍｇから約２ｇ）のＬ－シトルリン、Ｌ－アルギニン、またはＬ－アルギニンとＬ－シトルリンとの組み合わせ
・約１００ｍｇから約３ｇ（好ましくは約５００ｍｇから約１．５ｇ）のムイラプアマ、および
・少なくとも約１２５ｍｇ（好ましくは約５００ｍｇ）のポーリニアクパナ（ガラナ）

ここに示す試験結果の基礎を形成する特定の個々の投与量は、栄養補助組成物を１日に１回だけ服用する場合、以下のとおりである。
・約５００ｍｇのショウガまたはショウガ誘導体、
・約１６００ｍｇのＬ－シトルリン、
・約５００ｍｇのムイラプアマ、および
・約５００ｍｇのポーリニアクパナ
試験中、本発明の栄養補助組成物を毎日投与したが、栄養補助組成物を１日に複数回投与してもよく、個々の投与量は、上記で記載した通りの好ましい１日当たりの総量を超えないように調整することを理解できる。上記栄養補助組成物を１日に１回または複数回投与するか否かにかかわらず、上記栄養補助組成物は、骨折した骨の治癒および／またはその治癒率を向上させるため、十分な期間に渡って投与する。さらに本発明の組成物を作製するのに用いるポーリニアクパナ製剤は、カフェインを任意に含む。

上記栄養補助組成物は、任意の薬学的に許容可能な賦形剤、フィラー、結着剤、および着色剤を含んでもよく、標準的なゼラチンカプセルに包装するか、固形の錠剤に成型するか、微粒子状にするか、または溶液に混合および／または懸濁することができる。

本発明の栄養補助組成物によれば、ショウガ、ムイラプアマ、ポーリニアクパナ（ガラナ）、並びにＬ－シトルリンおよび／またはＬ－アルギニンの組み合わせが、骨折した骨を治癒および／またはその治癒率を高めるための能力を反映している。上記栄養補助組成物は、上記の有益な効果を維持するため、無期限に摂取することができる。

ここで本発明の組成物によるメカニズムを考慮すると、一酸化窒素（ＮＯ）は多くの生理的システムにおいて重要なシグナル伝達分子であることが知られている。一酸化窒素は、強力な抗酸化剤および抗アポトーシス分子（細胞死と戦うことを意味する）として知られている。さらに一酸化窒素は、ｓＧＣ（水溶性グアニル酸シクラーゼ）の活性化を介して骨芽細胞内の１７βエストラジオールの生存促進効果を媒介することが知られている。ＭａｒａｔｈｅらのＪ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１２； ２８７（２）：９７８－８８）によれば、骨細胞における１７βエストラジオールの生存促進効果（Ｐｒｏ－Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ）は、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ１および１１の異なる作用を介して一酸化窒素／ｃＧＭＰによって仲介される。ショウガ、Ｌ－シトルリン、ムイラプアマ、およびポーリニアクパナの組み合わせによる治療により、加齢ラットの身体の平滑筋損失の進行、繊維症の進行、および静脈閉塞性機能障害の進行を逆行させることができる。Ａｎｄｒｏｌｏｇｙ（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌ）、２０１５ Ｊｕｎ；４（１）、ｐｉｉ： １３２、Ｅｐｕｂ ２０１５ Ｍａｙ ２５。機械的刺激は更に、後に詳述するように、一酸化窒素、ｃＧＭＰ（環状グアノシン一リン酸）、およびＰＫＧ（プロテインキナーゼＧ）経路を介して骨芽細胞の増殖を誘導することが認識されている。Ｒａｊｆｅｒ Ｒら、誘導型一酸化窒素合成酵素を活性化させる組成物により調節されるラットの骨折治癒の向上：誘導型一酸化窒素合成酵素による骨折治癒の促進、ＢＪＲ ２０１７ Ｆｅｂ；６（２）：９０－９７。一酸化窒素自体はミトコンドリア内部に直接作用して酸化ストレスを抑制するか停止する、または一酸化窒素はＧＴＰ（グアノシン三リン酸）と呼ばれる分子をｃＧＭＰに変換することができる。本発明の栄養補助組成物は、骨折した骨を治療および／またはその治癒率向上の目的のため、一酸化窒素－ｃＧＭＰ経路を上方調節して骨芽細胞の機能／増殖を増強する。

新生血管および骨芽細胞の漸増は、骨折治癒過程に関与すると考えられている一酸化窒素による既知の作用である。Ｈｉｋｉｊｉ Ｈ、Ｓｈｉｎ ＷＳ、Ｏｉｄａ Ｓら、骨芽細胞分化に対する一酸化窒素の直接作用、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ １９９７；４１０：２３８－２４２。Ｂａｄｉｋ Ｙ、Ｔａｌｕ Ｕ、Ａｌｔｉｎｅｌ Ｌら、一酸化窒素により調節された骨治癒ラットでの実験的研究、Ｃｌｉｎ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｌａｔ Ｒｅｓ ２００２：３４３－３５２。

一酸化窒素は、組織の部位および生理学的機能に応じて、一酸化窒素合成酵素の３つのアイソフォームのうちの１つによって産生される。Ｂｒｅｄｔ ＤＳ．、内因性一酸化窒素合成：生物学的機能および病態生理学、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｒｅｓ １９９９；３１：５７７－５９６。Ｆｏｒｓｔｅｒｍａｎｎ Ｕ、Ｇａｔｈ Ｉ、Ｓｃｈｗａｒｚ Ｐら、一酸化窒素合成酵素のアイソフォーム、特性、細胞分布および発現制御、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９９５；５０：１３２１－１３３２。これらのＮＯＳアイソフォームの３つ全てが骨折治癒過程に関与しているが、誘導型ＮＯＳ（ｉＮＯＳ）は、一酸化窒素による骨芽細胞の刺激に関与する主要なアイソフォームであるように思われる。Ｃｏｒｂｅｔｔ ＳＡ、Ｈｕｋｋａｎｅｎ Ｍ、Ｂａｔｔｅｎ Ｊら、骨折修復における一酸化窒素、一酸化窒素合成酵素の特異的局在化、発現および活性；Ｊ Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ ［Ｂｒ］ １９９９；８１－Ｂ：５３１－５３７．Ｄｉｗａｎ ＡＤ、Ｗａｎｇ ＭＸ、Ｊａｎｇ Ｄら、一酸化窒素は骨折治癒を調節する；Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ２０００；１５：３４２－３５１。Ｚｈｕ Ｗ、Ｍｕｒｒｅｌｌ ＧＡ、Ｌｉｎ Ｊら、骨折治癒中の一酸化窒素合成酵素の局在化；Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ２００２；１７：１４７０－１４７７。Ｈｕｋｋａｎｅｎ Ｍ、Ｈｕｇｈｅｓ ＦＪ、Ｂｕｔｔｅｒｙ ＬＤら、マウス、ラットおよびヒト骨芽細胞様細胞による誘導性一酸化窒素合成酵素のサイトカイン刺激性発現および骨芽細胞の代謝活性におけるその機能性役割；Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １９９５；１３６：５４４５－５４５３。Ｗｉｍａｌａｗａｎｓａ ＳＪ．、一酸化窒素および骨；Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ２０１０；１１９２：３９１－４０３。さらにｉＮＯＳの遺伝子が選択的に欠失すると、骨折治癒は損なわれる。これは、ｉＮＯＳ遺伝子による治療によって元に戻すことができる。Ｂａｌｄｉｋ Ｙ、Ｄｉｗａｎ ＡＤ、Ａｐｐｌｅｙａｒｄ ＲＣら、ｉＮＯＳ遺伝子の欠失はマウスの骨折治癒を損なう、Ｂｏｎｅ ２００５；３７：３２－３６。

一酸化窒素の上記効果は通常、細胞内ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）によって調節されるセカンドメッセンジャーであるｃＧＭＰを介して媒介される。Ｋａｔｓｕｋｉ Ｓ、Ａｒｎｏｌｄ Ｗ、Ｍｉｔｔａｌ Ｃ、Ｍｕｒａｄ Ｆ、様々な組織標本内でのニトロプルシドナトリウム、ニトログリセリンおよび一酸化窒素によるグアニル酸シクラーゼの刺激およびアジ化ナトリウムおよびヒドロキシルアミンの効果との比較；Ｊ Ｃｙｃｌｉｃ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｓ １９７７；３：２３－３５。Ａｒｎｏｌｄ ＷＰ、Ｍｉｔｔａｌ ＣＫ、Ｋａｔｓｕｋｉ Ｓ、Ｍｕｒａｄ Ｆ、一酸化窒素は、様々な組織標本内でのグアニル酸シクラーゼを活性化し、３’：５’－環状グアノシン一リン酸レベルを増加させる；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９７７；７４：３２０３－３２０７。Ｗｅｉｓｓ Ｂ．、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼの複数の形状の分化活性化および阻害；Ａｄｖ Ｃｙｃｌｉｃ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｓ １９７５；５：１９５－２１１。タダラフィルなどのＰＤＥ阻害剤は、細胞内ｃＧＭＰを増加させることが知られており、マウスでの早期骨折治癒を促進することを示している。近年、Ｆｅｒｒｉｎｉらは、もともと抗線維化化合物として考えられていたＬ－シトルリン、ショウガ、ポーリニアクパナ、およびムイラプアマ（ＣＯＭＢ－４）の４つのハーブ化合物の組み合わせが、イン・ビボでの研究におけるラット内でのｉＮＯＳ酵素の著しい刺激をもたらすようであることを報告した。Ｈｉｓｔｉｎｇ Ｔ、Ｍａｒｃｉｎｉａｋ Ｋ、Ｓｃｈｅｕｅｒ Ｃら、シルデナフィルは、ラットの骨折治癒を促進させる。Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ ２０１１；２９：８６７－８７３。Ｔｏｇｒａｌ Ｇ、Ａｒｉｋａｎ Ｍ、Ｋｏｒｋｕｓｕｚ Ｐら、タダラフィル、ホスホジエステラーゼ５阻害薬のラット大腿骨の骨折治癒における好ましい効果；Ｅｋｌｅｍ Ｈａｓｔａｌｉｋ Ｃｅｒｒａｈｉｓｉ ２０１５；２６：１３７－１４４．Ｆｅｒｒｉｎｉ ＭＧ、Ｈｌａｉｎｇ ＳＭ、Ｃｈａｎ Ａ、Ａｒｔａｚａ ＪＮ、ショウガ、Ｌ－シトルリン、ムイラプアマ、およびポーリニアクパナの組み合わせによる治療は、加齢ラットでの身体平滑筋の損失、線維化、および静脈閉塞性機能障害の進行を回復させることができる、Ａｎｄｒｏｌｏｇｙ（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｓ）２０１５；４：１３２。

上記の点を踏まえると、（１）ショウガまたはショウガ誘導体、（２）Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン、またはＬ－アルギニンとＬ－シトルリンとの混合物、（３）ムイラプアマ、および（４）ポーリニアクパナよりなる本発明の栄養補助組成物は、骨折した骨の治療および／またはその治癒率を高めるのに有用である。この栄養補助組成物は、一酸化窒素－ｃＧＭＰ経路の上方調節を引き起こすため、骨折した骨の治療および／またはその治癒率の向上をもたらす。

図１に示すように、一酸化窒素－ｃＧＭＰ経路の上方調節には３つのメカニズムが存在する。１つ目のメカニズムにおいて、一酸化窒素は、一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）と呼ばれる酵素の作用を介してＬ－アルギニンから生成する。ＮＯＳは、Ｌ－アルギニンを一酸化窒素に変換する酵素である。上記に示すように一酸化窒素の生成にＬ－アルギニンを使用すると、Ｌ－アルギニンはＬ－シトルリンに変換する。身体は非常に賢明であり、細胞がＬ－シトルリンを摂取すると、それを別の酵素経路を介してＬ－アルギニンに再変換する。

２つ目のメカニズムにおいて、一酸化窒素が一旦、生成すると、それが存在するとしても数秒程度しか持続しないガスとして存在することが理解される。しかし、それは非常に強力であり、水溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）と呼ばれる別の酵素を刺激する。ｓＧＣは、ＧＴＰを、一酸化窒素－ｃＧＭＰ経路内の第二メッセンジャーである環状ＧＭＰに変換する酵素である。そのため、理論的には、ｓＧＣを上方調節すると、より効率的なｃＧＭＰの産生が達成される。

最後に３つ目のメカニズムにおいて、ＰＤＥ阻害薬は、ｃＧＭＰの５’ＧＭＰへの分解を防止するために使用される。ｃＧＭＰまたは環状ＡＭＰ（アデノシン一リン酸）のような環状ヌクレオチドのいずれかが生成されると、身体は、生理的プロセスを緩和または調節するため、それを分解する酵素（即ちＰＤＥ５）を有する。ｃＧＭＰは、細胞内で分解されて不活性化合物である５’ＧＭＰを産生する。ＰＤＥ５酵素が阻害されると、ｃＧＭＰは通常の方法では分解されないので、ｃＧＭＰのレベルは上昇する。

上記で説明したように、一酸化窒素は、３つの異なるメカニズムによって体内で生成される。本発明において考えられるメカニズムは、細胞内で産生される酵素ｉＮＯＳの使用を含む。ｉＮＯＳは通常、感染症と戦う細胞内に局在する酵素である。本発明によれば、ヒトの老化が進行すると、ｉＮＯＳが細胞内で産生され始めることが分った。

図２を参照すると、本発明は、骨代謝に密接に関連する細胞である骨芽細胞に焦点を当てている。骨芽細胞は、十分理解されていない他の役割の中でも、骨形成のためのマトリックスを分泌する。本発明の栄養補助組成物は、一酸化窒素の生成を増加させ、ｃＧＭＰの５’ＧＭＰへの変換を減少させることによって、一酸化窒素－ｃＧＭＰ経路を増加させる。これは、ｐＥＲＫ（リン酸化細胞外シグナル調節キナーゼ）、ｐＡＫＴ（リン酸化ＡＫＴ（プロテインキナーゼＢ）、およびＯＢ遺伝子（肥満遺伝子）を増加させることによって骨芽細胞の増殖、分化および生存の増加をもたらす。

上記に簡潔に述べた通り、本発明の栄養補助組成物の有効性を試験した。チャールズ Ｒ. ドリュー・ユニバーシティ・オブ・メディスン・アンド・サイエンスの動物実験委員会によって承認された５８匹の雄のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（１０週齢、体重（ＢＷ）：３４４±１１ｇ）を本研究に用いた。ラットを馴化させるため、実験開始前に１週間飼育した後、３つの群にランダムに割り当てた。対照群（ｎ＝１９匹のラット）には、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ピーナッツバター、および水よりなる０．２ｍｌのビヒクルを舌下投与により投与した。タダラフィル群（ｎ＝２０匹のラット）には、上記ビヒクルと混合したＰＤＥ５阻害薬、タダラフィル（イーライリリー、インディアナポリス、インディアナ州）の２．０ｍｇ／ｋｇ体重の経口投与を毎日投与した。この投与量は、ヒトの一日当たり２０ｍｇ／日の投与量に相当することが示されている。

ＣＯＭＢ－４群（Ｎａｔｕｒｅｘ、ハックンサック、ニュージャージー州；ｎ＝１９匹のラット）、即ち本発明の栄養補助組成物を投与した群には、上記ビヒクルに溶解させたムイラプアマ（４５ｍｇ／ｋｇ体重）、ポーリニアクパナ（４５ｍｇ／ｋｇ体重）、ショウガ（４５ｍｇ／ｋｇ体重）およびＬ－シトルリン（１３３ｍｇ／ｋｇ体重）の組み合わせを投与した。前に報告したように、ＣＯＭＢ－４の４つの構成成分のそれぞれの適切なラット投与量を、ヒトに推奨されたのと等価な一日投与量に基づいて計算した。ＣＯＭＢ－４中の成分、成分の範囲、並びに勃起不全および心血管疾患の治療におけるそれらの有益な効果に関する更なる詳細については、国際公開第２０１２／０６７７４５Ａ１号を参照することができる。

味覚を馴らすため、手術前の３日間、全動物に上記ビヒクルを投与した後、骨折直後と同じ日（０日目）に、タダラフィルまたはＣＯＭＢ－４用に割り当てられた対照群または実験群のそれぞれに、１日用量の投与を開始した。

全ての手術は、ラットの実験的割り当てを知らされていない１人の整形外科医によって行われた。麻酔は３％イソフルランで誘発し、手術中、２．５％イソフルランを維持した。手術前および手術後の疼痛管理のため、全てのラットに０．０５ｍｇ／ｋｇ体重のブプレノルフィンを皮下注射した。

次いで、各ラットを内部固定して、片側大腿骨を骨折させた。簡潔に述べると、皮膚を剃毛した後、ラットを仰向けにして、上膝蓋骨を中心として長さ１．５ｃｍの縦切開を正中線のちょうど内側で行なった。下層にある筋膜を内側膝蓋腱境界で切開し、膝蓋骨を側方向に脱臼させた。滑車を１．０ｍｍのドリルビットで開き、骨髄内管および大転子を２１～３ゲージの皮下注射針で広げた。骨髄内管を順次、１８ゲージの注射針で広げ、上顆をさらに１６ゲージの注射針で広げた。大腿骨骨幹部は、内側広筋を横方向に掃引することによってアクセスした。大腿骨骨幹部の中央部と遠位部の３分の１の接合部に配置したキャットクローシザー（Ｐｅｔｃｏ、サンディエゴ、カリフォルニア州）を使用して、横方向の骨折を行なった。ランダム化表を用いて、骨切術の偏側性を判定した。両方の骨折破片の制御を維持しながら、チタン製圧縮髄内ネジ（ＲＩＳｙｓｔｅｍ、ダボス、スイス）を、骨折整復術を直接視覚化させながら逆行的に適用した。骨折部位には少量の圧搾が見られ、髄内ネジが大転子で近位方向に固定されたことを示したので、その部位を任意の動作のため手動で試験した。

筋膜および皮膚は、４－０バイクリル（Ｅｔｈｉｃｏｎ Ｉｎｃ．、サマービル、ニュージャージー州）およびベットボンド皮膚接着剤（３Ｍ、セントポール、ミネソタ州）を用いて２層で閉じた。少量のトリプル・アンチバイオティクス・オイントメント（Ａｃｔａｖｉｓ、パーシッパニー、ニュージャージー州）を皮膚に塗布した。股関節および膝関節の可動域は、近位方向にネジが貫通していないこと、および膝蓋骨が適切にトラッキングされていることを確実にするために行なった。保護されていない体重負荷は、手術後直ちに許可されて、１４日目に、各群から５匹のラットをＣＯ_２吸引によって安楽死させ、その大腿骨を、ｑＣＴ（定量的コンピューター断層撮影）および組織学的評価のために採取した。４２日目に、各群から１５匹のラットを、ｑＣＴおよび組織学的評価のために安楽死させた。残りのラットは、生体力学的試験のために安楽死させた。

ｑＣＴによる仮骨発達の分析
ミネラル含有量および仮骨の体積
１４日目および４２日目における仮骨発達の定量的測定は、定量的コンピューター断層撮影（ｑＣＴ：ＸＣＴ ３０００、Ｓｔｒａｔｅｃ、プフォルツハイム、ドイツ）により行なった。上記ｑＣＴは、骨折部位における仮骨の発達を含み、骨折治癒の三次元定量的評価が可能であるため選択した。３つのパラメーターとして横断面積、骨塩量および骨密度を定量した。

骨髄内スクリューを除去した後、中央の骨折を含む長さ３ｍｍの骨切片を、厚さ１．１ｍｍ、ピクセルサイズ０．１ｍｍ×０．１ｍｍの３つの連続横断ｑＣＴスキャンを用いて分析した。以下の３つの画像を得た：１つは骨折近位骨片の画像、もう１つは骨折部位自体の画像、もう１つは遠位骨片の画像である。ＸＣＴシリーズソフトウェアパッケージ（バージョン５．２１、Ｓｔｒａｔｅｃ、プフォルツハイム、ドイツ）を用いて、各画像のミネラル含有量、ミネラル化した仮骨部位、および骨密度を計算した。

３ｍｍ断片の全ミネラル含有量および仮骨体積は、３つの断片全ての値を合計することによって計算した。再構築の進行を評価するため、より高密度の（＞５００ｍｇ／ｃｍ３）仮骨を測定し、全仮骨（＞２９９ｍｇ／ｃｍ３）から分離した。ミネラル密度が８５０ｍｇ／ｃｍ３を超えたものは、皮質骨密度を考慮して、新たに形成された仮骨の計算から除外した。

ｉＮＯＳの免疫組織化学的発現
ｑＣＴの測定後、標本は、４％ｐ－ホルムアルデヒドに固定し、１０％ギ酸で５日間脱灰した。各大腿骨を、リン酸緩衝生理食塩水でリンスし、両方の骨端を取り除いた後、骨幹部を長軸方向に半分に切断した。両半分を、パラフィン包埋切片用に処理した。５マイクロメーターのパラフィン包埋切片を、ｉＮＯＳに対するポリクローナル抗体を用いた免疫染色に用いた。簡潔に説明すると、切片を一連のキシレン浴を介して脱パラフィンし、グレードされたアルコールで再水和させた。

内因性ペルオキシダーゼ活性については、０．３％過酸化水素で２０分間クエンチし、非特異的結合を１０％ヤギ正常血清で４０分間ブロックした。切片は、ｉＮＯＳに対する一次ポリクローナル抗体（ＢＯ Ｐｈａｒｍａｇｅｎ、希釈率１：２５０）と共に４℃で一晩培養した。次に、各切片を、ビオチン化抗ウサギＩｇＧで培養した後、ＡＢＣ複合体（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｓ、テメクラ、カリフォルニア州）および３，３’ジアミノベンジジン（シグマ）のスライドをヘマトキシリン溶液で対比染色した。染色後の切片を脱水した後、ペルマウント（Ｐｅｒｍｏｕｎｔ）に固定した。切片１個当たり少なくとも６枚の画像を、Ｌｅｉｃａ顕微鏡を用いて２０倍の倍率で撮影した。細胞１個当たりの積分光学濃度（１００）は、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ ７．１ソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、シルバースプリング、ミズーリ州、アメリカ合衆国）を用いて測定した。背景光で画像を調整した。１００の結果は、平均光学濃度に比例するため、免疫反応性抗原の濃度を測定するために用いた。

分析した各スライドは、対応するネガティブコントロールを有していた。全ての場合において、線維切片１個当たり重複していない６つの視野を検査し、動物１匹当たり少なくとも３つの切片を分析した。

生物力学的評価
４２日目に安楽死させた後、各大腿骨を摘出して、骨髄内ネジを除去した後、大腿骨の両端をポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）のブロックに包埋した。中心の骨折を含む骨の長さ１２ｍｍの切片のみを露出させた。次いで標本を、ＭＴＳ二軸ロードフレーム（ＭＴＳ ｍｉｎｉ－ｂｉｏｎｉｘ ８５８、ミネアポリス、ミネソタ州）に搭載した捻回試験機に固定した。破損に対する捻回は、１２°／分の割合で加えた。

破損試験への各標本荷重に対するトルク変位曲線から、ねじり剛性および最大トルクの２つのパラメーターを導出した。さらに上記破損パターンを用いて、Ｗｈｉｔｅら（骨折治癒の４つの生物力学的段階、Ｊ Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ Ａｍ、１９９７ Ｍａｒ；５９（２）：１８８－９２）に記載されているように、各標本を骨折治癒の４つの生物力学的段階の１つに分類した。骨折段階１は、弾性があり、柔らかい仮骨の形成のみを示していた。骨折段階２から４は、より高い剛性を示し、徐々に、より高い石灰化組織を伴う骨の不全を示した。骨折段階１と２の骨折は、元の骨折ラインを介して失敗した。骨折段階３の失敗は、元の骨折ラインを介して部分的に生じ、損傷していない骨を介して部分的に生じたが、骨折段階４の失敗は、損傷していない骨を介して完全に生じた。

統計的分析
骨折部分の仮骨体積、骨塩量、骨密度、ねじり剛性、および最大破壊トルクを含む結果因子を、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて比較した。独立変数は、１４日目、４２日目、および治療の種類（対照群を含む４つのカテゴリー）であった。ＡＮＯＶＡの後、個々の対の群を比較するため、最小有意差（ＬＳＤ）事後検定を行った。

ノンパラメトリック検定を用いて、上記４群の骨折治癒修復段階を比較した。組織学的観察の定量的画像分析のため、値は、平均±平均の標準誤差として表した。データの正規分布は、シャピロ・ウィルク検定を用いて確立された。多重比較は、Ｗｉｎｄｏｗｓ用のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン５．１）（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア、サンディエゴ カリフォルニア州）によるチューキー検定の一元配置分散分析、それに続く事後比較によって分析した。ｐ＜０．０５を、有意な差であるとみなした。

結果
骨折部位で発見された感染症（ｎ＝４）または手術後の粉砕骨折（ｎ＝１）のため、５匹のラット（２匹は１４日目、３匹は４２日目）は、研究から除外した。

骨発達分析
ミネラル含有量および仮骨体積
３つの群全てについて、１４日目と比較したときの、４２日目における骨切術部位のミネラル含有量およびミネラル化仮骨体積は共に、約５０％の増加を示した（表１を参照）。しかし、これらの時点において、タダラフィル群およびＣＯＭＢ－４群は、対照群と比較して統計的な差を示さなかった。仮骨は治癒過程に関連し得るが、統計的な差が見られなかったという事実により、ＣＯＭＢ－４は、骨折の治療に対する有効性に関連しないと考えられた。

図３は、２つの異なる時点における３つの群の代表的なＣＴ画像を示す。

生物力学的特性
４２日目における、３つ全ての生物力学的なパラメーター（骨折修復段階、最大トルク、およびねじり剛性）の平均値は、ＣＯＭＢ－４群で最も高かった（表２および図２を参照）。

驚くべきことに、ＣＯＭＢ－４群は、対照群と比較して、４６％高い最大強度（ｐ＝Ｏ．０９３）および９２％高い剛性（ｐ＝０．０１６）を示した。タダラフィル群は、対照群と比較して、１５％高い最大強度および２８％高い剛性を示したが、この変化は、統計的に有意でなかった。

骨折は全て、４２日目に治癒し、骨折修復の生物力学的分類の段階２よりも優れていた。段階４の骨折修復は、タダラフィル群および対照群では見られなかったが、ＣＯＭＢ－４治療群の２２％で見られた。

３つの群の残りの骨折は、段階２または段階３のいずれかであった（表２を参照）。

骨折治癒におけるｉＮＯＳの発現
骨折後１４日目において、仮骨レベルを測定したｉＮＯＳの発現は、対照群と比較して、タダラフィル群およびＣＯＭＢ－４群で有意に増加したが、４２日目には予想通り、３つの群全てで、ｉＮＯＳ発現は基準値に回復した（図５を参照）。

前述した実験は、骨折直後に開始されたｉＮＯＳによるＮＯ－ｃＧＭＰ経路の長期上方調節が骨折治癒過程を高めるかどうかを決定するために設計したものである。この仮説は、ａ）ＮＯは、骨折治癒過程の間の特定の連続要領でのＮＯＳの３つのアイソフォーム全ての誘導によって証明されるように、骨折治癒に関連しているという観察に基づいていた。そのような損傷組織における傷害およびその誘導は、異常な創傷治癒に対する防護メカニズムと考えられている。ｉＮＯＳは、骨折後、迅速に誘発される最初のＮＯＳアイソフォームであるが、１、２週間後にピークを迎えた後、次第に減少する。ｉＮＯＳは、骨芽細胞の機能および骨形成と最も密接に関連している。

さらに３つ全てのＮＯＳ酵素の阻害は、骨形成および正常な骨折治癒の両方の遅延を引き起こすが、ｉＮＯＳ酵素の特異的標的阻害または欠失は、欠損ｉＮＯＳ遺伝子の置換中、骨折治癒過程で悪影響を与えるが、ｉＮＯＳ欠損動物に対する正常な骨折治癒を引き起こすことを示す。

上記で説明した通り、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害薬は、ＮＯ－ｃＧＭＰ経路を介してｉＮＯＳを上方調節することができる化合物であり、骨折治癒を高めると共に、骨折前駆体細胞の骨芽細胞への分化を促進することが報告されている。しかし、タダラフィルを毎日投与して４２日後に、生物力学的骨折修復段階、最大トルク、またはねじれ剛性のいずれかを測定した通り、骨折治癒は、対照群と比較して有意に増強しなかった。

それとは対照的に、ＣＯＭＢ－４は、骨折治癒に驚くべき利点をもたらした。ＣＯＭＢ－４は、Ｌ－シトルリン、ショウガ、ムイラプアマ、およびポーリニアクパナの混合物を含み、骨折修復段階およびねじれ剛性の両方を測定した通り、骨折治癒を有意に増強する。最大トルクについて、ＣＯＭＢ－４は、対照群に比べて４６％、タダラフィル群に比べて２９％高い値を示した。これは、最大トルク強度が経時的に改善する傾向にあることを示唆している。これらのＣＯＭＢ－４動物に見られる、より少ないミネラル化仮骨体積および新しくミネラル化された仮骨は、タダラフィル群および対照群の両方と比較して、ＣＯＭＢ－４群の優れた生物力学的特性に寄与する架橋仮骨の、より速やかな再形成を示している。

骨折治療における本発明の利点は、哺乳類を用いた、骨折後の骨の機能的強度の増強における天然物の有効性を実証する最初の無作為化盲検対照試験である上記実験によって実証されている。ＣＯＭＢ－４それ自体は、対照群またはタダラフィル群のいずれかと比較した場合、骨折治癒に関連した優れた生物力学的特性を引き起こした。Ｌ－シトルリン、ムイラプアマ、ポーリニアクパナ、およびショウガ、ＣＯＭＢ－４の構成成分は、ヒトには無害な副作用を有することが知られている。Ｌ－シトルリンは、とりわけその生物学的利用能のため好ましいが、Ｌ－シトルリンを、部分的または全体的に置き換えてＬ－アルギニンを用いることができる。

一実施形態において、タダラフィルに限定されないがタダラフィルなどのＰＤＥ阻害薬は、ＣＯＭＢ－４を含む組成物と組み合わせて、骨折後の十分な期間に渡って骨折治癒を高めるため、薬学的に有効な量をヒトまたは他の哺乳動物に投与する。他の実施形態において、ＣＯＭＢ－４は単独で使用するが、これは、ＰＤＥ阻害薬を許容しない患者にとって特に有益である。

本発明による骨折の治療は、所望の結果を得るために十分な期間に渡って、患者に本発明の栄養補助組成物を繰り返し投与することを含む。当業者は、ラットモデルに投与した投与量が、投与量を受ける哺乳類（例えばヒト）の体格に応じて調節し得ることを理解できる。ＣＯＭＢ－４の栄養補助組成物は、単一の組成物として投与することができるが、その個々の成分は、骨折治癒にとって望ましい利益を得るのに十分な期間に渡って、定期的な投与中、別々に投与することができる。

骨粗鬆症の治療および予防のための方法および組成物
骨折の治療における本発明の栄養補助組成物の使用に加えて、本発明は、骨粗鬆症の治療および／または予防のための栄養補助組成物を提供する。

本発明の栄養補助組成物は、ショウガ、ムイラプアマ、ポーリニアクパナ（ガラナ）、並びにＬ－シトルリンおよび／またはＬ－アルギニンの組み合わせによる、骨粗鬆症を治療および／または予防する能力、さらには骨粗鬆症を引き起こす生理的過程を逆行させる能力さえも反映しており、投与後しばらくの間、有益な結果が続くであろう。栄養補助組成物は、有益な効果を持続させるため、および／または骨粗鬆症の進行を遅延または軽減するために、無期限に服用してもよい。

上記で述べた通り、好ましい実施形態によると、上記栄養補助組成物の１日の総投与量は以下のとおりである。
・約３ｇまで（好ましくは、約２５０ｍｇから約２ｇ）のショウガまたはショウガ誘導体、
・約１０ｍｇから約２ｇ（好ましくは約４００ｍｇから約２ｇ）のＬ－シトルリン、Ｌ－アルギニンまたはＬ－アルギニンおよびＬ－シトルリンの配合体、
・約１００ｍｇから約３ｇ（好ましくは約５００ｍｇから約１．５ｇ）のムイラプアマ、および
・約少なくとも約１２５ｍｇ（好ましくは約５００ｍｇ）のポーリニアクパナ（ガラナ）。

ここに示す上記試験結果の根拠を形成している特定の個々の投与量は、栄養補助組成物を１日に１回だけ服用する場合、以下のとおりである。
・約５００ｍｇのショウガまたはショウガ誘導体、
・約１６００ｍｇのＬ－シトルリン、
・約５００ｍｇのムイラプアマ、および
・約５００ｍｇのポーリニアクパナ
試験中では、本発明の栄養補助組成物を単純に毎日投与したが、栄養補助組成物は、１日に複数回投与してもよく、したがって個々の投与量は、上記で説明した通りの好ましい合計１日量を超えないように調節することを理解し得る。栄養補助組成物を１日に１回または１日に複数回投与するかどうかにかかわらず、栄養補助組成物は、骨粗鬆症を治療および／または予防するために十分な期間に渡って投与する。さらに本発明の組成物を製造するのに使用したポーリニアクパナ製剤は、任意にカフェインを含んでもよい。

栄養補助組成物は、任意の薬学的に許容される賦形剤、フィラー、結着剤、および着色剤を含んでもよく、標準的なゼラチンカプセルに包装するか、または固形錠剤へ成型して、微粒子型に取り込み、または溶液に混合および／または懸濁することができる。

本発明の栄養補助組成物は、ショウガ、ムイラプアマ、ポーリニアクパナ（ガラナ）、並びにＬ－シトルリンおよび／またはＬ－アルギニンの組み合わせが骨粗鬆症を治療および／または予防する能力を反映している。上記栄養補助組成物は、有益な効果を維持するために無制限に服用してもよい。

本発明の他の実施形態によれば、経口投与剤型は、本発明による栄養補助組成物を含み、剤型は、前述の成分を含む錠剤、カプセル、トローチ、粉末、または懸濁剤よりなる群から選択される。好ましい懸濁剤は、水および／またはアルコール（エタノール）ベースである。

ここで本発明の栄養補助組成物が機能するメカニズムを考察すると、一酸化窒素（ＮＯ）が多くの生理的なシステムに重要なシグナリング分子であることが知られていることは上記で説明したとおりである。

上記の点を踏まえると、（１）ショウガまたはショウガ誘導体、（２）Ｌ－シトルリン、Ｌ－アルギニン、またはＬ－アルギニンとＬ－シトルリンの混合物、（３）ムイラプアマ、および（４）ポーリニアクパナからなる本発明の栄養補助組成物は、骨粗鬆症の治療および／または予防に有用である。この栄養補助組成物は、一酸化窒素－ｃＧＭＰ経路の上方調節を引き起こすため、骨粗鬆症の治療および／または予防をもたらす。

図１に示す通り、そして上記で説明した通り、一酸化窒素－ｃＧＭＰ経路の上方調節に対して３つのメカニズムが存在する。

図６に関して、本発明は、骨代謝と密接に関連している細胞である骨芽細胞に焦点を当てている。完全に理解されていない他の役割の中でも、骨芽細胞は、骨形成前のマトリックスを分泌する。本発明の栄養補助組成物は、一酸化窒素の生成を増加させ、ｃＧＭＰの５’ＧＭＰへの変換を減少させることにより、一酸化窒素－ｃＧＭＰ経路を増加させている。このことは、ｐＥＲＫ（リン酸化細胞外シグナル調節キナーゼ）、ｐＡＫＴ（リン酸化ＡＫＴ（プロテインキナーゼＢ）、およびＯＢ遺伝子（肥満遺伝子）の増加による骨芽細胞の増殖、分化、および生存を引き起こす。

図７に示す通り、骨粗鬆症の治療における本発明の栄養補助組成物の有効性を確立するために用いた実験計画は、実験の初日に開始した栄養補助組成物の適用による予防処置、または実験開始後９０日目に開始した栄養補助組成物の適用による治療処置のいずれかによる、６ヶ月齢の引退した繁殖用Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットの治療を含む。

実験の初日に開始した栄養補助組成物の適用による予防処置において、シャム手術または卵巣摘出術（ＯＶＸ）も行った。１回目のＤＥＸＡ（二重エネルギーＸ線吸収測定法）スキャンを、治療の６０日目後に行い、次いで、治療の１００日後に再度行った。治療処置において、シャム手術または卵巣摘出術（ＯＶＸ）を実験の初日に行い、栄養補助組成物の適用は、実験開始後９０日目まで開始しなかった。比較の目的で、ラットを、骨粗鬆症の治療に使用することが知られている組成物であるエストラジオール（Ｅ２）で同様に治療した。その後、１回目のＤＥＸＡスキャンを、実験開始後１９０日目（または栄養補助組成物による治療開始後１００日目）に行った。

ＤＥＸＡスキャンによりラットを調べて、ＢＭＤ、ＬＥＡＮ（脂肪を除く除脂肪組織）＋ＢＭＣ（骨塩量）、ＦＡＴ（体脂肪）および％ＦＡＴ（体脂肪率）を測定した。さらに血清中の骨マーカー（特に、オステオカルシンおよびＴＲＡＰ５ｃ）を調べて定量化した。

図８～２７に示すチャートは、骨粗鬆症の治療および予防における栄養補助組成物の有効性を確立するデータを要約している。

図２８～３２に示すグラフで要約するさらなる試験は、本発明の栄養補助組成物が骨芽細胞の増殖に対して毒性でないが、ＣＯＭＢ－４に見出される４つの構成成分の内の２つであるショウガ（図２９を参照）およびムイラプアマ（図３０を参照）は、骨芽細胞がＣＯＭＢ－４に含まれる各投与用量に基づいて上記２つの構成成分に曝されると、実際に骨芽細胞の増殖に対して毒性があるという結論を支持している。試験は、４つの組成物の内３つを様々な用量で投与した後の一定期間、骨芽細胞の細胞培養液の光学密度（ＯＤ）を調べることにより行った。例えばショウガ、ムイラプアマ、ポーリニアクパナ（ガラナ）、および栄養補助組成物（ＣＯＭＢ－４）を様々な濃度で調べた。特に、細胞増殖における、これらの効果を測定するため、以下の濃度を調べた：濃度０．０２ｍｇ／ｍｌおよび０３２５ｍｇ／ｍｌのショウガ（図２８および２９でそれぞれ設定した通り、ショウガ０．０２、およびショウガ０．３２５）；濃度０．９０ｍｇ／ｍｌおよび１４．４ｍｇ／ｍｌのムイラプアマ（ＭＰ）（図２８および３０でそれぞれ設定した通り、ＭＰ０．９０、およびＭＰ１４．４）；濃度０．９０ｍｇ／ｍｌおよび０．０４５ｍｇ／ｍｌのポーリニアクパナ（ＰＣ）（図２８および３１でそれぞれ設定した通り、ＰＣ．９０、およびＰＣ．０４５）；および濃度０．６７ｍｇ／ｍｌおよび１．７０ｍｇ／ｍｌの栄養補助組成物（図２８および３２でそれぞれ設定した通り、ＣＯＭＢ－４０．６７、およびＣＯＭＢ－４１．７０）（５００ｍｇのショウガまたはショウガ誘導体、約１６００ｍｇのＬ－シトルリン、約５００ｍｇのムイラプアマ、および約５００ｍｇのポーリニアクパナからなる）。

本発明の栄養補助組成物は、血清オステオカルシンの増加およびＴＲＡＰ－５（骨型酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ）の減少と並行して、ＢＭＤの減少を抑制した。その結果、本発明の栄養補助組成物は、骨粗鬆症の治療および／または予防に用いることができる。治療は、定期的に行なわれる短期間の自己経口投与（例えば所望の効果が得られまでの投与中、少なくとも１日１回または他の投与間隔、毎日の栄養として生涯期間）で構成することができる。

骨粗鬆症の治療のための本発明の栄養補助組成物は、さらに他の化合物を含んでもよいが、ショウガ、ムイラプアマ、およびポーリニアクパナ、並びにＬ－アルギニンまたはＬ－シトルリンは上記組成物の必須成分であり、骨粗鬆症治療能を有することが理解される。

上記で説明した通り、本発明の栄養補助組成物中、ショウガの好ましい１日の総投与量は約２５０ｍｇから約２ｇの間である。本発明に係る栄養補助組成物の１日の総投与量は、さらに約１０ｍｇから約２ｇのＬ－シトルリンを含む。Ｌ－シトルリンの代わりに、および／またはＬ－シトルリンに加えて、約１０ｍｇから約２グラムのＬ－アルギニンを用いることができる。しかし、イン・ビボにおいて、一酸化窒素の体内生成に使用するための多量のＬ－アルギニンは、Ｌ－アルギニンの経口投与に比べて少量のＬ－シトルリンによって誘発され得ることが発見されたので、本発明の組成物は、Ｌ－アルギニンの代わりに、および／またはＬ－アルギニンに加えてＬ－シトルリンを含むことが好ましい（Ｓｃｈｗｅｄｈｅｌｍら、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、６５：ｐｐ５１－５９、（２００７）を参照）。さらに本発明の栄養補助組成物中、ムイラプアマの１日当たりの総量は約１００ｍｇから約３ｇ（好ましくは、約５００ｍｇから約１．５ｇ）であり、また本発明の栄養補助組成物中、ポーリニアクパナ（ガラナ）の１日当たりの総量は少なくとも約１２５ｍｇ（好ましくは、約５００ｍｇ）である。これを踏まえて、上記で説明した通り、栄養補助組成物を１日１回投与する場合の個々の投与量は、約５００ｍｇのショウガまたはショウガ誘導体、約１６００ｍｇのＬ－シトルリン、約５００ｍｇのムイラプアマ、および約５００ｍｇのポーリニアクパナを含む。上記に記載した通り、栄養補助組成物は、１日に複数回投与してもよく、その場合の個々の投与量は、前述した１日当たりの好ましい総量を超えないように調節され得ることが理解される。毎日１回投与する、または１日に複数回投与するかにかかわらず、本発明の組成物は、所望の効果が得られるまで長期間に渡って反復投与する。骨粗鬆症の症状を呈している患者への本発明栄養補助組成物の反復投与は、所望の骨粗鬆症の治療結果が得られるまで行い、その後も予防薬として続けてもよい。

一実施形態において、上記で説明した通り、本発明により使用する栄養補助組成物を１日に１回投与する場合の個々の投与量は、約５００ｍｇのショウガまたはショウガ誘導体、約１６００ｍｇのＬ－シトルリン、約５００ｍｇのムイラプアマ、および約５００ｍｇのポーリニアクパナを含む。上記に記載した通り、栄養補助組成物を１日に１回投与するか、栄養補助組成物を１日の間に複数回投与するかどうかにかかわらず、栄養補助組成物は、骨粗鬆症を治療し、所望の結果を得るために十分な期間投与する。しかし、試験では、様々な成分の量を変化させてもよく、栄養補助組成物の１日当たりの総量は、最大で約３ｇ（好ましくは約２５０ｍｇから約２ｇ）のショウガまたはショウガ誘導体、約１０ｍｇから約２ｇ（好ましくは約４００ｍｇから約３ｇ）のＬ－シトルリン、Ｌ－アルギニン、またはＬ－アルギニンとＬ－シトルリンの組み合わせ、約１００ｍｇから約３ｇ（好ましくは約５００ｍｇから約１．５ｇ）のムイラプアマ、および少なくとも約１２５ｍｇ（好ましくは約５００ｍｇ）のポーリニアクパナ（ガラナ）を含み得ることを示した。本発明者らはショウガの使用が好ましいことを見出したが、上記の投与量は、さらにショウガの代わりに、約２０ｍｇから約１０００ｍｇの６－ジンゲロール、好ましくは約２２０ｍｇの６－ジンゲロールを含み得る。

本発明の特定の実施形態を詳述したが、これらは、当業者が本発明の実施を可能にするための例示的な例として提供したものである。上記で提供した詳細例は、本発明の範囲を制限することを意図するものではなく、例示的であることを意図している。本発明の特定の要素が周知の構成成分を用いて部分的または完全に実施できる場合、本発明の理解および作製に必要な周知の構成成分の部分のみを説明し、その他の構成要素または製剤工程の詳細な説明は、本発明の説明を簡潔にするため省略する。さらに本発明は、ここに言及している組成物および方法に対する現在および将来の周知となり得る同等物を包含する。本発明は他の実施形態も可能であり、様々な方法で実施および実行することができるので、当業者は、本開示の基礎となる概念が、他の実施形態の設計への基礎として容易に利用できることを理解するであろう。

Claims (11)

1. 骨粗鬆症の治療および予防、並びに骨折の治療のための組成物であって、
   前記組成物は、
   ショウガ；
   ムイラプアマ；
   ポーリニアクパナ；および
   Ｌ－シトルリンを含み、
   前記組成物の十分な期間に渡っての薬学的に有効な量の投与により、ｉＮＯＳを刺激してｉＮＯＳ発現増加作用、骨折修復促進作用、及び骨粗鬆症治療作用を高めることを特徴とする組成物。
2. 前記組成物は、２５０ｍｇから２ｇの前記ショウガを含む請求項１に記載の組成物。
3. １０ｍｇから３ｇのＬ－シトルリンを含む請求項１に記載の組成物。
4. １０ｍｇから２ｇのＬ－シトルリンを含む請求項１に記載の組成物。
5. １００ｍｇから３ｇのムイラプアマを含む請求項１に記載の組成物。
6. ５００ｍｇから１．５ｇのムイラプアマを含む請求項１に記載の組成物。
7. 少なくとも２５０ｍｇのポーリニアクパナを含む請求項１に記載の組成物。
8. ５００ｍｇのポーリニアクパナを含む請求項１に記載の組成物。
9. ２５０ｍｇから２ｇのショウガ、２５０ｍｇから２ｇのＬ－シトルリン、５００ｍｇから１．５ｇのムイラプアマおよび５００ｍｇのポーリニアクパナを含む請求項１に記載の組成物。
10. 前記組成物の十分な期間に渡っての薬学的に有効な量の投与により骨折治癒率を高める請求項１に記載の組成物。
11. 前記組成物の十分な期間に渡っての薬学的に有効な量の投与は、骨粗鬆症の治療に有効である請求項１に記載の組成物。

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