CN110087664A

CN110087664A - 用于治疗骨科疾病的组合物和方法

Info

Publication number: CN110087664A
Application number: CN201780072625.0A
Authority: CN
Inventors: J·拉斐; R·拉斐
Original assignee: Klrm Co Ltd
Current assignee: Klrm Co Ltd
Priority date: 2016-09-29
Filing date: 2017-09-29
Publication date: 2019-08-02
Anticipated expiration: 2037-09-29
Also published as: EP3518951B1; KR20190061045A; KR102491748B1; JP7075136B2; ES2971281T3; US20190381124A1; JP2019529569A; IL265571B; US20200215146A1; US10426812B2; CN110087664B; EP3518951A4; EP3518951A1; IL265571A; WO2018064469A1; US20180104300A1; AU2017336916A1; EP3518951C0; US10792324B2

Abstract

一种用于增强骨科疾病治疗的组合物，当施用药学有效量的该组合物足够的时间时，其刺激iNOS并增强骨科疾病的治疗。该组合物包含姜；铁青树碱；瓜拉那；和L‑精氨酸和L‑瓜氨酸组成的组中的至少一种。

Description

用于治疗骨科疾病的组合物和方法

技术领域

本发明涉及用于治疗骨科疾病的组合物和方法。根据一个实施例，本发明涉及用于治疗骨折和/或增加其愈合速度的组合物和方法。根据这样的实施例，刺激诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的营养组合物增强了骨折的愈合，如生物力学性质所证明的。骨折后迅速使用营养组合物增强了骨折的愈合。此外，本发明涉及用于治疗、抑制发病和/或减缓骨质疏松症发展速率的组合物、剂型和方法。特别地，本发明涉及通过上调iNOS来治疗和/或预防骨质疏松症的营养组合物、剂型和方法。

背景技术

对肢体施加超过骨骼的强度的力或压力(例如，弯曲、扭矩和/或压缩力)会导致骨折。当断骨穿透皮肤时会发生开放性或有复合性骨折，而在闭合性骨折中，皮肤保持完整。骨折可以是横向的、纵向的，和/或骨骼可以在多个位置断裂。除了物理损伤外，骨骼的病理性骨折可以由疾病导致，例如骨质疏松症或骨癌。无论原因如何，与骨折相关的显著的疼痛和功能障碍通常是改变生活的经历，骨骼充分愈合以使其正常发挥功能所需的长时间加剧了这种经历。长期以来一直需要加速骨折愈合的治疗药物和方法。

骨折愈合是由复杂的和连续的细胞事件级联引起的，这些细胞事件使骨骼恢复到骨折前的状态。骨折的两端之间的空间充满了血肿，这种血肿富含间充质细胞和细胞因子，其代表软骨痂最终经历炎症阶段然后是修复和重塑阶段。

虽然尚未完全了解这些阶段确切的调节机制，但愈合组织部位处的新血管生成以及成骨细胞募集似乎对成功愈合起关键作用。

关于骨质疏松症，骨质疏松症是一种导致骨量损失的医学病症，而骨量损失会导致骨结构恶化和骨折风险增加。骨质疏松症可能由于另一种医学病症而原发性或继发性地发生。骨质疏松症通常影响50岁及以上的男性和女性，虽然继发性骨质疏松症会影响任何年龄的人。虽然有多种方法可以治疗骨质疏松症，但仍需要一种更简单、可靠和有成本效益的方法来治疗患有骨质疏松症的患者。

在过去的几十年中，使用膳食补充剂治疗疾病的科学依据有所增加。这包括将天然食品或产品与特定化合物结合使用。然而，这些天然产品的生物和生物化学作用仍在阐明中，因此即使制剂中微小的变化仍然存在明显的不可预测性和/或取决于不同的患者特异性因素。

几十年来，已知精氨酸和其他氨基酸通常在人和动物的生物功能中发挥着重要的作用。在食物中通常将姜和其他草药组合。Darland等人的美国专利申请公开号2002/0051826教导了迷迭香与其他成分(例如姜黄素和槲皮素)的组合，用于治疗炎症相关的疾病。除了这些主要成分外，Darland还建议可选地使用可以来自D-柠檬烯或橙皮苷的柠檬烯，或者使用180mg至220mg的姜；该制剂可以任选地包含180mg至220mg的瓜氨酸和其他维生素。这些报告表明了成分(例如姜、瓜氨酸和精氨酸)作为长期膳食补充是安全的。尽管表明复合制剂，例如现有技术中公开的那些，通常对健康有益，但是对特定制剂需要增加的测试并确定它们对健康的不同方面的积极和消极影响。

因此，天然草药的益处和损害仍有很大的不可预测性，各种相互矛盾和不可靠的教导，许多基于轶事的报道无法可靠地重复。为了做医疗治疗推荐，西方医学研究领域的普通技术人员需要来自研究的数据，这些研究使用公认的科学方法。这些科学方法包括在每次研究之前、期间和之后的对照(例如，安慰剂或基线制剂)、独立客观的分析、患者病史和患者监测。在可能的情况下，科学方法应该包括双盲临床试验和具有可靠的和一致的成分和分析的一致的组合物。否则，基于正确进行的研究，数据和/或结论会受到主观、轶事和/或错误的批判，例如，美国食品和药物管理局(US FDA)接受的类型研究，其可以包括IRB协议(提交给其他科学家并经其他科学家批准的机构审查委员会协议)。

可以被在现代医学和科学方面受过训练的临床医生依赖的研究结果是优选的。虽然希望使用天然产品，其具有良好的安全性作为食物代替合成的化学药物制剂，但这种使用必须基于充分的研究，以证明代替或补充符合监管和科学审查的药物的合理性。本发明人面临寻求治疗和抑制骨质疏松症的组合物和方法的问题的挑战，这些组合物和方法对于长期常规施用是实用的(同时避免现有制剂的副作用)，能够在不能利用现有的骨质疏松症治疗的患者中治疗和预防骨质疏松症，和/或提供新的实用的且有成本效益的组合物以预防和治疗骨质疏松症。

发明内容

因此，本发明的一个目的是提供一种用于增强骨科疾病治疗的组合物，其中施用药学有效量的该组合物足够的时间来刺激iNOS并增强骨科疾病的治疗。

本发明的另一个目的是提供一种用于增强骨科疾病治疗的组合物，其中该组合物包含姜或姜衍生物；铁青树碱(Muira puama)；瓜拉那(Paullinia cupana)；以及由L-精氨酸和L-瓜氨酸组成的组中的至少一种。

本发明的另一个目的是提供一种用于增强骨科疾病治疗的组合物，其中该组合物包含250mg至2g的姜或姜衍生物。

本发明的再一个目的是提供一种用于增强骨科疾病治疗的组合物，其中姜衍生物来自生姜(Zingiber officinale roscoe)或来自生姜的根茎。

本发明的另一个目的是提供一种用于增强骨科疾病治疗的组合物，其中姜或姜衍生物选自由新鲜的部分干燥的姜、干燥的姜、6-姜酚(6-gingerol)组成的组。

本发明的另一个目的是提供一种用于增强骨科疾病治疗的组合物，该组合物包括10mg至3g的L-精氨酸、L-瓜氨酸或L-精氨酸和L-瓜氨酸的混合物。

本发明的再一个目的是提供一种用于增强骨科疾病治疗的组合物，该组合物包括10mg至2g的L-精氨酸、L-瓜氨酸或L-精氨酸和L-瓜氨酸的混合物。

本发明的另一个目的是提供一种用于增强骨科疾病治疗的组合物，该组合物包括100mg至3g的铁青树碱。

本发明的另一个目的是提供一种用于增强骨科疾病治疗的组合物，该组合物包括500mg至1.5g的铁青树碱。

本发明的再一个目的是提供一种用于增强骨科疾病治疗的组合物，该组合物包括至少250mg的瓜拉那。

本发明的另一个目的是提供一种用于增强骨科疾病治疗的组合物，该组合物包括500mg的瓜拉那。

本发明的另一个目的是提供一种用于增强骨科疾病治疗的组合物，该组合物包括250mg至2g的姜或姜衍生物；250mg至2g的L-精氨酸、L-瓜氨酸或L-精氨酸和L-瓜氨酸的混合物；500mg至1.5g的铁青树碱和500mg的瓜拉那。

本发明的再一个目的是提供一种用于增强骨科疾病治疗的组合物，其中施用药学有效量的该组合物足够的时间将增加骨折愈合的速度。

本发明的另一个目的是提供一种用于增强骨科疾病治疗的组合物，其中施用药学有效量的该组合物足够的时间对骨质疏松症的治疗是有效的。

本发明的另一个目的是提供一种用于增强骨科疾病治疗的组合物，其中该组合物是口服剂型，包括片剂、胶囊、锭剂或悬浮液。

本发明的再一个目的是提供一种增强骨科疾病治疗的方法，该方法包括施用药学有效量的组合物足够的时间以刺激iNOS并增强骨科疾病的治疗。

当结合附图时，在以下详细说明中本发明的其他目的和优点将是显而易见的，附图阐述了本发明的某些实施例。

附图说明

图1是解释上调一氧化氮-cGMP途径的三种机制的示意图。

图2是本发明的营养品组合物作用于生物途径以上调一氧化氮-cGMP途径来治疗骨折的示意图。

图3示出了三(3)组的代表性qCT图像。在每个骨折部位下方1mm处拍摄qCT图像以在骨折水平消除骨骼碎片重叠。通过结合三个切片(骨折部位和上方1mm处、下方1mm处)的值来计算骨折的总矿物质含量和愈合组织体积。右侧条表示骨矿物质密度。

图4示出了第42天愈合骨折的最大扭矩(强度)和刚度。结果表示为平均值±S.E。与对照组相比*p<0.05。

图5示出了股骨骨折后第14天和第42天，他达拉非(tadalafl)和COMB-4(本发明的营养组合物)对iNOS表达的影响。在骨折后第14天或第42天通过免疫组织化学确定iNOS的表达，并且在骨折后立即每天开始用他达拉非或COMB-4治疗。示出了每个细胞强度的定量图像分析，结果表示为平均值±S.E。与对照组相比*p<0.05。

图6是本发明的组合物作用于生物途径以上调一氧化氮-cGMP途径来治疗骨质疏松症的示意图。

图7是在治疗骨质疏松症中测试本发明的组合物的功效所采用的实验设计的示意图。

图8-27显示了在治疗骨质疏松症中支持本发明的组合物的功效的测试数据。

图28-32显示了证明本发明的组合物在体内研究中使用的剂量对成骨细胞的增殖没有抑制作用的数据。

具体实施方式

本文中公开了本发明详细的实施例。然而，当理解，所公开的实施例仅仅是本发明的示例，而本发明可以以各种形式实施。因此，本文公开的细节不应解释为限制性的，而仅仅是教导本领域技术人员如何制造和/或使用本发明的基础。

本发明提供了用于治疗骨科疾病的组合物和方法。特别地，本发明提供了用于治疗骨折和/或增加其愈合速度的营养组合物。本发明还提供了用于治疗骨质疏松症的营养组合物。该营养组合物(在本文和在各个图中称为COMB-4)包含有效量的姜或姜衍生物，所述姜或姜衍生物选自由新鲜的部分干燥的植物姜、干燥的植物姜、6-姜酚及其混合物组成的组；由精氨酸和瓜氨酸(优选地，L-精氨酸、L-瓜氨酸或L-精氨酸和L-瓜氨酸的组合)组成的组中的至少一种；铁青树碱和瓜拉那(瓜拿纳(guarana))。

当单独使用和/或与其他化合物组合使用时，姜是一种复杂的天然组合物，具有许多声称的性质。例如，传统中药在组合物中使用或包含姜，以治疗或预防各种基于各种抽象原因的疾病。在过去的一个世纪中，科学方法已经表明许多传统中药不会产生声称的效果和/或甚至可能使目标疾病恶化。尽管如此，已经发现一些传统中药包含可能是医疗用途的活性剂，即使对于传统中药声称的用途无效或不安全。姜的复杂性及其各式各样的特性由具有以下结构的某些组分化合物反映：

其中，例如，在6-姜酚中，香草基(vanillyl)官能团(即4-羟基-3-甲氧基苯基)的R侧链是：

因此，6-姜酚(也称为姜酚)为(S)-5-羟基-1-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-3-癸酮，并具有以下结构：

由于姜包含多种化合物，这些化合物具有不同的复杂性和化学活性，因此本领域中关于化合物的生物活性存在矛盾的教导，这些化合物可以用于诱导一氧化氮(NO)产生或在治疗中具有潜在的作用。此外，关于如何理解，更不用说控制相关的代谢途径，仍存在相当大的不可预测性。然而，申请人发现当将姜与铁青树碱、瓜拉那以及由精氨酸和瓜氨酸(优选地，L-精氨酸、L-瓜氨酸或L-精氨酸和L-瓜氨酸的组合)组成的组中的至少一种进行组合时，可以有效地用于治疗骨科疾病。

根据本发明的营养组合物的口服剂型选自由包含前述组分的片剂、胶囊、锭剂、粉末或悬浮液组成的组。优选的悬浮液是水基和/或醇(乙醇)基的。

在配制成口服剂型之前可以将原料和成分物质干燥，例如通过冷冻干燥或真空干燥。单剂型可以包括压制的片剂、胶囊、锭剂或可以以小袋提供。可以提供悬浮制剂。姜、姜根提取物、L-精氨酸、L-瓜氨酸、铁青树碱和瓜拉那都单独购买，下文提供了优选的来源和分析。优选地，将成分组合并包封在明胶胶囊中，但预期其它剂型将产生相同的结果。

可以使用调味剂或味道掩蔽剂。片剂或其他剂型可以包括稀释剂(例如乳糖)、崩解剂(例如交联羧甲基纤维素钠(cross carmelose sodium))或粘合剂(例如聚乙烯吡咯烷酮)。可以使用润滑剂(例如硬脂酸镁)或其他常规赋形剂(例如二氧化硅、碳水化合物等)。可以提供薄膜包衣片剂。

使用熟知的和标准的方法和试剂来组合本发明的组合物的活性成分。优选地，明胶胶囊含有粉末形式的组合成分。粉末制剂中的标准成分用于制备和配制本发明优选的示例性制剂。例如，载体二氧化硅(例如，来自美国新泽西州帕西帕尼赢创工业公司(EvonikDegusa Industries of Parsippany)的Spernat)可以用于将液体转化为自由流动的粉末和/或可以用于增强粉末产品(尤其是容易结块的粉末)的流动性和保质期。硬脂酸镁(十八烷酸，镁盐，例如来自荷兰Peter Greven的LIGAMED)可以用作具有润滑性质的稀释剂，有助于防止组合物及其成分粘到生产设备上，并且还可以用作粘合剂。对粉末形式的成分检查、称重、混合并包封在明胶胶囊中。混合过程包括在标准温度和至少足以用于食品补充的无菌环境中的标准筛选、混合和金属检测。

活性成分的来源可以包括：

示例性活性成分来源

姜

供应商1.索拉雷姜(SOLARAY GINGER)根提取物

姜根-250mg(5％姜酚)

姜酚-12.5mg/5％

其他成分：硬脂酸镁、交联羧甲基纤维素钠

帕克城，犹他州(Park City,UT)

www.Solaray.com

供应商2.自然答案股份有限公司(NATURE'S ANSWER,INC.)姜根茎提取物

姜根茎提取物-125mg标准化的5％姜酚+姜烯酚(shogoals))

其他成分：植物纤维素、米粉、磷酸二钙、硅酸钙

霍波格，纽约州 11788-3943

http://www.naturesanswer.com/

供应商3.SOLGAR姜根提取物

姜根提取物-300mg(5％姜酚)

未加工的姜粉末-150mg

C-抗坏血酸、β-胡萝卜素、硬脂酸镁、单晶纤维素

维罗尼卡，纽约州

SOLGAR姜粉

姜粉-500mg

根姜提取物4:1-5mg

L-瓜氨酸

源美(SOURCE NATURALS)L-瓜氨酸游离形式氨基酸补充剂：

L-瓜氨酸2g

其他成分：明胶(胶囊)、微晶纤维素、胶体二氧化硅和硬脂酸镁。

源美股份有限公司

邮政信箱 2118

圣塔鲁斯，加州 95062

http://www.sourcenaturals.com/

L-精氨酸

维生素专柜(THE VITAMIN SHOPPE)L-精氨酸

L-精氨酸-500mg

维生素B6 10mg

其他成分：明胶、米粉、硬脂酸镁

铁青树碱

供应商1.SOLARAY铁青树碱巴西榥榥木膳食补充剂：

铁青树碱巴西榥榥木(根)-600mg

其他成分：明胶胶囊和纤维素。

由营养公司(Nutraceutical Corp.)生产

帕克城，犹他州 84060

http://www.solaray.com

供应商2.自然答案铁青树碱有机酒精提取物：

铁青树碱根提取物(1:1)-2000mg

其他成分：纯净水、植物甘油、12-15％认证的有机酒精

瓜拉那(瓜拿纳)

源美瓜拿纳增能膳食补充剂：

瓜拿纳种子提取物(22％咖啡因)-900mg

其他成分：微晶纤维素、磷酸氢钙、硬脂酸、改性纤维素胶和胶体二氧化硅。

源美股份有限公司

邮政信箱 2118

圣塔鲁斯，加州 95062

http://www.sourcenaturals.com/

由于本发明营养组合物某些优选的制剂包含在食物中发现的或从食物中提取的化合物，因此它们可以称为“营养物”。虽然传统上营养组合物以药物形式发现，例如胶囊或片剂，但越来越多的食物添加了营养物。根据本发明，使用姜成分的类似物和/或同源物与铁青树碱、瓜拉那(瓜拿纳)以及L-精氨酸和/或L-瓜氨酸的组合，以促进iNOS，其足以减轻、停止或逆转与骨质疏松症相关的纤维化事件，或增强与骨折相关的骨骼愈合。因此，本发明的营养组合物可以以与使用者的生活方式和饮食偏好相匹配的各种方式和形式施用，以每天一次或两次膳食补充剂，混合到食物或“思慕”等中。

以其天然形式(如提取物)或浓缩物使用天然产物产生了显著的医学进步。例如，乙酰水杨酸(或阿司匹林)来自柳树。同样地，从西洋紫衫树中分离了抗癌药物紫杉醇。结果，多年来天然产物已经用于治疗多种疾病。据说很多天然产物可增加性能力、治疗性问题或作为壮阳药。

然而，由于生物系统的复杂性、基于土壤和气候的植物及其衍生物的变化、以及与其他化合物的相互作用等，存在大量的不可预测性。申请人发现通过使用本发明的营养组合物，骨质疏松症的症状似乎降低超过本发明的营养组合物预测的生物利用度。类似地，申请人发现本发明的营养组合物改善了骨折的愈合。

本发明中使用的“有效量”旨在表示，当施用于人类患者足够长的时间时，营养组合物的剂型包含的每种成分的量足以产生有益的骨科效果，例如，治疗骨折和/或增加其愈合速度，或治疗、抑制发病和/或减缓骨质疏松症的发展速度。在治疗骨折的情况下，有益效果包括骨矿物质密度(BMD)增加、骨折愈合加速、畸形愈合或不愈合(无论是主要地还是辅助地)的愈合以及需要骨生长以获得最佳功能的植入物上的更快速的骨内生长(bony in-growth)或增长(on-growth)中的至少一种在骨质疏松症的情况下，有益效果包括骨矿物质密度(BMD)增加、骨折愈合加速、畸形愈合或不愈合(无论是主要地还是辅助地)的愈合以及需要骨生长以获得最佳功能的植入物上更快速的骨内生长或增长中的至少一种。

本文所用的“单个剂量”是指作为给药方案的一部分施用于人类患者的营养组合物的单剂量中营养组合物的量。

本文所用的“总日剂量”是指在一天中施用于人类患者的营养组合物累积的量，无论该营养组合物作为给药方案的一部分一天施用一次还是一天施用多次。

本文所用的“约”是指指定值+/-10％的值的范围。

用于促进骨折愈合的组合物和方法

已经证明诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在骨折愈合过程中起主要作用。本发明考虑了iNOS上调因子对骨折愈合的影响。特别地，考虑了他达拉非(磷酸二酯酶(PDE)抑制剂)和本发明的营养组合物COMB-4(由L-瓜氨酸、瓜拉那、姜和铁青树碱组成)单独或组合给予对骨折愈合的影响。大鼠模型被认为是人类适用性良好的基础，证实了施用本发明的营养组合物对骨折愈合的益处。例如，对具有单侧开放性骨折的大鼠每天给予本发明的营养组合物制剂，并且在早期(第14天)和晚期(第42天)处死后，分析骨折愈合。令人惊讶地发现，本发明的营养组合物引起骨折愈合明显增强。相反，尽管其已知的iNOS活性，他达拉非未显示出骨折愈合的明显改善。虽然可以使用更高剂量的他达拉非，但是剂量耐受性的实际限制将受到挑战。鉴于他达拉非(和其他PDE抑制剂)众所周知的副作用，本发明的营养组合物具有意想不到的益处，包括甚至在比该研究中使用的剂量更高时耐受性良好，并且其由已广泛使用且没有不利的健康影响的成分形成。以下实验细节证明了单独或与PDE抑制剂组合来使用本发明的营养组合物以改善骨折愈合的优选的非限制性实例。

根据优选的实施例，营养组合物的总日剂量为

·至多约3g(优选地约250mg至约2g)的姜或姜衍生物，

·约10mg至约2g(优选地约400mg至约2g)的L-瓜氨酸、L-精氨酸或L-精氨酸和L-瓜氨酸的组合，

·约100mg至约3g(优选地约500mg至约1.5g)的铁青树碱，和

·至少约125mg(优选地约500mg)的瓜拉那(瓜拿纳)。

具体的单个剂量，其形成用于本文提供的测试结果的基础，其中每天仅服用营养组合物一次，包括

·约500mg的姜或姜衍生物，

·约1600mg的L-瓜氨酸，

·约500mg的铁青树碱，和

·约500mg的瓜拉那。

虽然在测试期间每天施用本发明的营养组合物，但是应当理解，营养组合物可以一天施用多次，并且因此调整单个剂量以便不超过如上文所述优选的总日剂量。无论营养组合物是一天施用一次还是一天中施用多次，施用营养组合物足够长的时间以治疗骨折和/或增加其愈合速度。此外，用于制备本发明的组合物的瓜拉那制剂可任选地包含咖啡因。

营养组合物可以包括任选的药学上可接受的赋形剂、填充剂、粘合剂和着色剂，并且可以包装在标准的明胶胶囊中或形成固体片剂，采用颗粒形式，或混合在和/或悬浮在溶液中。

本发明的营养组合物反映了姜、铁青树碱、瓜拉那(瓜拿纳)和L-瓜氨酸和/或L-精氨酸的组合治疗骨折和/或增加其愈合速度的能力。可以无限期服用该营养组合物以维持有益效果。

现在考虑本发明组合物起作用的机制，已知一氧化氮(NO)是许多生理系统中重要的信号分子。也已知一氧化氮是有效的抗氧化剂和抗凋亡分子(表明它对抗细胞死亡)。更进一步，已知一氧化氮通过sGC(可溶性鸟苷酸环化酶)活化介导成骨细胞中的17β雌二醇的促存活作用。Maratheet al.Pro-Survival effects of 17 beta-estradiol onosteocytes are mediated by nitric oxide/cGMP via differential actions ofcGMP-dependent protein kinases 1 and 11.J Biol Chem 2012，287(2)978-88)。Treatment with a combination of ginger,L-citrulline,Muira puama and Paulliniacupana cane reverse the progression of corporal smooth muscle loss,fibrosisand veno-occlusive dysfunction in the aging rat.Andrology(Los Angeles)2015Jun；4(l).pii：132.Epub 2015May 25。进一步认识到，通过如下文更详细地讨论的一氧化氮、cGMP(环磷酸鸟苷)和PKG(蛋白激酶G)途径，机械刺激诱导成骨细胞增殖。Rajfer R etal.Enhancement of fracture healing in the rat,modulated by compounds thatstimulate inducible nitric oxide synthase:Acceleration of fracture healingvia inducible nitric oxide synthase.BJR Feb；6(2):90-97。一氧化氮本身可以直接在线粒体内起作用以淬灭或停止氧化应激，或者一氧化氮可以将称为GTP(鸟苷三磷酸)的分子转化为cGMP。本发明的营养组合物上调一氧化氮-cGMP途径以增强成骨细胞功能/增殖，目的是治疗骨折和/或增加其愈合速度。

新生血管和成骨细胞募集是一氧化氮的已知作用，一氧化氮似乎与骨折愈合过程有关。Hikiji H,Shin WS,Oida S,et al.Direct action of nitric oxide onosteoblastic differentiation.FEBS Lett 1997；410:238-242。Baldik Y,Talu U,Altinel L,et al.Bone healing regulated by nitric oxide:an experimental studyin rates.Clin Orthop Relat Res 2002:343-352。

一氧化氮由一氧化氮合酶(NOS)的三种同种型中的一种产生，取决于组织位置和生理功能。Bredt DS.Endogenous nitric oxide synthesis:biological functions andpathophysiology.Free Radic Res 1991；31:577-596。U,Gath I,Schwarz P,et al.Isoforms of nitric oxide synthase.Properties,cellular distribution andexpressional control.Biochem Pharmacol 1995；50:1321-1332。虽然所有这三种NOS同种型都参与骨折愈合过程，但诱导型NOS(iNOS)似乎是参与一氧化氮刺激成骨细胞的主要同种型。Corbett SA,Hukkanen M,Batten J,et al.Nitric Oxide in fracturerepair.Differential localisation,expression and activity of nitric oxidesynthases.J Bone Joint Surg[Br]1991；81-B:531-537。Diwan AD,Wang MX,Jang D,etal.Nitric oxide modulates fracture healing.J Bone Miner Res 2000；15:342-351。Zhu W,Murrell GA,Lin J,et al.Localization of nitric oxide synthases duringfracture healing.J Bone Miner Res 2002；17:1470-1477。Hukkanen M,Hughes FJ,Buttery LD,et al.Cytokine-stimulated expression of inducible nitric oxidesynthase by mouse,rat,and human osteoblast-like cells and its functional rolein osteoblast metabolic activity.Endocrinology 1995；136:5445-5453。WimalawansaSJ.Nitric oxide and bone.Ann N Y Acad Sci 2010；119:391-403。此外，当选择性删除iNOS基因时，骨折愈合受损。这可以通过用iNOS基因处理来逆转。Baldik Y,Diwan AD,Appleyard RC,et al.Deletion of iNOS gene impairs mouse fracture healing.Bone2005；37:32-36。

一氧化氮的作用通常由其第二信使cGMP介导，cGMP由细胞内磷酸二酯酶(PDE)调节。Katsuki S,Arnold W,Mittal C,Murad F.Stimulation of guanylate cyclase bysodium nitroprusside,nitroglycerin and nitric oxide in various tissuepreparations and comparison to the effects of sodium azide andhydroxylamine.J Cyclic Nucleotide Res 1997；3:23-35。Arnold WP,Mittal CK,Katsuki S,Murad F.Nitric oxide activates guanylate cyclase and increaseguanosine 3’:5’-cyclic monophosphate levels in various tissuepreparations.Proc Natl Acad Sci USA 1997；74:3203-3207。Weiss B.Differentialactivation and inhibition of the multiple forms of cyclic nucleotidephosphodiesterase.Adv Cyclic Nucleotide Res 1975；5:195-211。已知PDE抑制剂，如他达拉非，增加细胞内cGMP，并且在小鼠中已显示出加速早期骨折愈合。最近，Ferrini等人报道了四种草药化合物L-瓜氨酸、姜、瓜拉那和铁青树碱的组合(COMB-4)的组合，最初认为是抗纤维化的化合物，出现在一项体内研究中，以在大鼠中产生iNOS酶明显的刺激作用。Histing T,Marciniak K,Scheuer C,et al.Sildenafil accelerates fracture healingin mice.J Orthop Res 2011；29:867-873。G,Arikan M,Korkusuz,P,etal.Positive effect of tadalafil,a phosphodiesterase-5inhibitor,on fracturehealing in rat femur.Eklem Hastalik Cerrahisi 2015；26:137-144。Ferrini MG,Hlaing SM,Chan A,Artaza JN.Treatment with a combination of ginger,L-citrulline,Muira puama and Paullinia cupana cane reverse the progression ofcorporal smooth muscle loss,fibrosis and veno-occlusive dysfunction in theaging rat.Andrology(Los Angeles)2015；4:132。

考虑到上述情况，本发明的营养组合物，其由(1)姜或姜衍生物、(2)L-瓜氨酸、L-精氨酸或L-精氨酸和L-瓜氨酸的混合物、(3)铁青树碱和(4)瓜拉那组成，用于治疗骨折和/或增加其愈合速度。该营养组合物导致一氧化氮-cGMP途径上调，这导致骨折的治疗和/或其愈合速度增加。

如图1所示，有三种机制上调一氧化氮-cGMP途径。根据第一种机制，通过称为一氧化氮合酶(NOS)的酶的作用由L-精氨酸制备一氧化氮。NOS是一种将L-精氨酸转化为一氧化氮的酶。如上文所示，当L-精氨酸用于制备一氧化氮时，L-精氨酸转化为L-瓜氨酸。身体是非常聪明的，然后细胞将摄取L-瓜氨酸并通过另一中酶促途径将其重新转化至L-精氨酸。

根据第二种机制，可以理解，一旦形成一氧化氮，它以仅持续几秒的气体存在(如果有的话)。但它是非常有效的，它会刺激另一种称为可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)的酶。sGC是将GTP转化为一氧化氮-cGMP途径中的第二信使(环GMP)的酶。因此，理论上，如果上调sGC，则可以实现更有效的cGMP产生。

最后，根据第三种机制，PDE抑制剂用于防止cGMP分解为5’GMP。当产生cGMP或任何环状核苷酸如环AMP(腺苷一磷酸)时，身体具有的酶(即PDE5)将其分解以调理或调节生理过程。cGMP在细胞内分解产生5’GMP，其是一种无活性的化合物。如果PDE5酶被阻断，则cGMP的水平升高，因为cGMP未以其正常方式降解。

如上文所述，在体内，一氧化氮通过三种不同的机制产生。根据本发明考虑的机制涉及利用酶iNOS，其在细胞内产生。iNOS是一种酶，通常只位于抵抗感染的细胞中。根据本发明，已经发现，一旦人们开始衰老，则iNOS开始在细胞内产生。

参考图2，本发明着重于成骨细胞，其是与骨代谢密切相关的细胞。成骨细胞，在其他尚未完全理解的作用内，分泌用于骨形成的基质。本发明的营养组合物通过增加一氧化氮产生和降低cGMP转化至5’GMP来增加一氧化氮-cGMP途径。通过增加pERK(磷酸化细胞外信号调节激酶)、pAKT(磷酸化AKT(蛋白激酶B)和OB基因(肥胖基因))，这导致成骨细胞增殖、分化和存活增加。

如上文简单所述的，测试了本发明的营养组合物的功效。将58只雄性斯普拉格-杜勒(Sprague-Dawley)大鼠(10周龄，体重(BW)：344±11g)用于该研究，其由查尔斯·R.德鲁医科大学(Charles R.Drew University of Medicine)的动物护理和使用机构委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准。在实验步骤之前，将大鼠圈养一周以适应环境，然后随机分成三组。对照组(n＝19只大鼠)通过舌后(retro-lingual)施用接受0.2ml由10％二甲亚砜(DMSO)、花生酱和水组成的载体。他达拉非组(n＝20只大鼠)每日给予口服剂量2.0mg/kg体重(BW)的PDE5抑制剂，他达拉非(礼来(Eli Lilly)，印第安纳波利斯，印第安纳州)，与载体混合。已经表明该剂量相当于人体中20mg/天的日剂量。

COMB-4组(纳图瑞克斯(Naturex)，哈肯萨克市，新泽西州；n＝19只大鼠)，即接受根据本发明的营养组合物的组，接受溶解在载体中铁青树碱(45mg/kg体重BW)、瓜拉那(45mg/kg BW)、姜(45mg/kg BW)和L-瓜氨酸(133mg/kg BW)的组合。基于先前报道的等效推荐的人日剂量，计算COMB-4的四种组分中每一种适当的大鼠剂量。关于COMB-4中的成分、成分范围及其在治疗勃起功能障碍和心血管疾病中的有益效果的更多细节，参见国际专利公布号WO2012/067745A1。

在手术前三天，所有动物仅接受载体以使动物适应味道，并且在骨折的同一天(第0天)开始接受它们对应指定的对照或实验日剂量的他达拉非或COMB-4。

所有手术均由一位对大鼠实验任务不知情的骨科医生进行。在整个手术过程中，用3％异氟烷诱导麻醉并用2.5％异氟烷维持麻醉。所有大鼠接受皮下注射0.05mg/kg体重的丁丙诺啡，用于术前和术后疼痛控制。

然后每只大鼠经历内侧固定的单侧股骨骨折。简而言之，在剃刮皮肤后，将大鼠置于仰卧位置，并且在上髌骨上的中心处在中线中间制成1.5cm长的纵向切口。在髌腱内侧缘处切开下筋膜，并且髌骨侧向脱位。用1.0mm钻头打开滑车(trochlea)，用21-3规格的皮下注射器针头对髓腔和大转子进行扩大。用18号针头依次对髓腔进行扩大，并用16号针头进一步打开上髁。通过横向清除股内肌进入股骨干。使用放置在股骨干的中间和远端三分之一的连接处的猫爪剪刀(Petco，圣迭戈，加州)进行横向骨折。使用随机化表来确定截骨术的侧向性。在保持对两个骨折片段控制的同时，以向后的(retrograde)方式应用钛压缩髓内螺钉(RI系统，达沃斯，瑞士)，同时直接观察骨折复位。在骨折部位观察到少量压缩，表明髓内螺钉在大转子处获得近端固定，并且手动测试该部位的任何移动。

使用4-0Vicryl皮肤胶(爱惜康有限公司，萨默维尔市，新泽西州)和VetBond皮肤胶(3M，圣保罗，明尼苏达州)将筋膜和皮肤分成两层。将少量三重抗生素软膏(阿特维斯(Actavis)，帕西帕尼，新泽西州)施用到皮肤。在髋部和膝部处进行运动范围以确保螺钉没有近端穿透并且充分追踪髌骨。术后立即允许无保护的负重，并且在第14天，使用吸入CO₂对每组中的5只大鼠实施安乐死，并且收获股骨用于qCT(定量计算机断层扫描)和组织学评估。在第42天，将每组中的十五(15)只大鼠实施安乐死，用于qCT和组织学评估。对剩余的大鼠实施安乐死，用于生物力学测试。

通过qCT进行愈合组织发育分析

矿物质含量和愈合组织体积通过定量计算机断层扫描(qCT：XCT 3000，史泰克公司(Stratec)，普福尔茨海姆，德国)获得第14天和第42天愈合组织发育的定量确定。选择qCT是因为它允许对骨折愈合进行三维定量评估，包括骨折部位处的愈合组织发育。量化三个参数：横截面横向面积、骨矿物质含量和骨密度。

在移除髓内螺钉后，使用厚度为1.1mm且像素尺寸为0.1×0.1mm的三个连续横向qCT扫描分析3mm长的骨切片，骨切片包括中间的骨折。获得三个图像：一个图像是骨折近端的骨碎片，一个图像是骨折部位本身，而一个图像是远端骨碎片。使用XCT系列软件包(版本5.21，史泰克公司，普福尔茨海姆，德国)计算每个图像的矿物质含量、矿物质化的愈合组织面积和骨矿物质密度。

通过组合所有三个切片值来计算3mm段的总矿物质含量和愈合组织体积。为了评估重塑的进展，测量更高密度的愈合组织(>500mg/cm³)并与总愈合组织(>299mg/cm³)分离。认为大于850mg/cm³矿物质密度是皮质骨密度，并从新形成的愈合组织计算中去除。

iNOS的免疫组化学表达在qCT测量后，将样本固定在4％多聚甲醛中，并在10％甲酸中脱钙5天。在磷酸盐缓冲盐水中冲洗每个股骨，去除两个骨骺，并将其纵向切成两半。处理两个半部用于石蜡包埋切片。使用5微米石蜡包埋的切片用于用抗iNOS的多克隆抗体进行免疫染色。简而言之，将切片通过一系列二甲苯浴脱蜡，并通过梯度醇再水合。

用0.3％过氧化氢淬灭内源过氧化物酶活性20分钟，用10％正常山羊血清阻断非特异性结合40分钟。将切片用抗iNOS的初级多克隆抗体(BO Pharmagen，稀释1：250)于4摄氏度(℃)孵育过夜。然后将切片分别用物素化的抗兔IgG孵育，然后通过ABC复合物(载体实验室(Vector labs)，蒂梅丘拉，加州)孵育，并用苏木精溶液复染3,3'-二氨基联苯胺(Sigma)载玻片。将染色的切片脱水，然后用Permount固定。用Leica显微镜以20x放大率对每个切片拍摄至少六张照片。使用Image Pro 7.1软件(图像分析系统(MediaCybernetics)，银泉，密苏里州，美国)测定每个细胞的集成光密度(100)。在校准图像用于背景照明后，100个结果与未加权平均光密度成比例，未加权平均光密度用于确定免疫反应性抗原的浓度。

测定的每个载玻片具有其相应的阴性对照。在所有情况下，每个组织切片筛选6个非重叠区域，并且每个动物分析至少3个切片。

生物力学评估在第42天安乐死后，收获每个股骨，并且在移除髓内螺钉后，将股骨的两端嵌入聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)块中。仅露出12mm长的骨段，该骨包括在中心的骨折。然后将样本固定到扭转测试设备上，该扭转测试设备安装在MTS双轴加载框架(MTS mini-bionix 858，明尼阿波利斯，明尼苏达州)中。以12度/分钟的速率施加扭矩至失效。

从每个样本加载至失效测试的扭矩-位移曲线得出两个参数：扭转刚度和最大扭矩。此外，使用失效模式，将每个样本分为骨折修复四个生物力学阶段的一个，如White等人所述(The four biomechanical stages of fracture repair,J Bone Joint SurgAm.1977 Mar；59(2):188-92)。阶段I骨折呈橡皮状，表明仅有软骨痂形成。阶段II至IV表现出较高的刚度，表明骨质逐渐变高的矿物质化组织失效。阶段I和II骨折通过原始骨折线失效。阶段III失效部分地通过原始骨折线发生并且部分地通过完整骨发生，而阶段IV失效完全通过完整骨发生。

统计分析使用方差分析(ANOVA)比较结果变量，包括失效时的愈合组织体积、骨矿物质含量、骨密度、扭转刚度和最大扭矩。独立变量是第14天和第42天以及治疗类型(包括对照的四个类别)。ANOVA之后进行最小显著性差异法(LSD)事后检验以比较组的独立对。

使用非参数检验比较四组间的骨折修复阶段。对于组织学观察的定量图像分析，将值表示为平均值±SEM。使用Wilk-Shapiro检验建立数据的正态分布。通过方差的单因素分析进行多重比较，然后根据用于Windows(GraphPad微软，圣迭戈，加州)的GraphPadPrism(版本5.1)与Tukey检验进行事后比较。p<0.05时差异被认为是显著的。

结果由于在骨折部位(n＝4)发现感染或术后粉碎性骨折(n＝1)，5只大鼠(2只在第14天而3只在第42天)排除在研究之外。

愈合组织发育分析

矿物含量和愈合组织体积在截骨部位处，与第14天相比，所有三组在第42天显示出矿物质含量和矿物质化愈合组织体积增加约50％(见表1)。然而，在这两个时间点，与对照组相比，他达拉非和COMB-4组均未显示出统计学差异。虽然愈合组织与愈合过程有关，但未观察到统计学差异的事实被认为与骨折治疗中COMB-4的疗效无关。

表1.截骨部位处第14天和第42天新形成的愈合组织、总的和硬的愈合组织以及新形成的硬的愈合组织(平均值±S.D.)

第14天对照组、他达拉非组和第42天COMB4组，n＝4

第14天COMB-4组和第42天对照组和他达拉非组，n＝5

图3显示了在两个不同的时间点三组的代表性CT图像。

生物力学性质第42天，COMB-4组中所有三个生物力学参数(骨折修复阶段、最大扭矩和扭转刚度)的平均值最高(参见表2和图2)。

表2.第42天愈合的骨折的生物力学性质(来自扭转试验，平均值±S.D.)

*骨折修复阶段数值转换：I＝1，II＝2，III＝3，IV＝4

与对照组的那些相比，COMB-4组令人惊讶地表现出高出46％的最大强度(p＝O.093)和高出92％的刚度(p＝0.016)。与对照组相比，他达拉非组表现出高出15％的最大强度和高出28％的硬度，但这种变化无统计学意义。

所有的骨折在第42天愈合并且大于骨折修复的生物力学分类的阶段II。在他达拉非和对照组中均未观察到阶段IV骨折修复，但在22％的COMB-4治疗组中观察到。

三组中剩余的骨折是阶段II或阶段III(见表2)。

骨折愈合中iNOS的表达骨折后第14天，与对照组相比，他达拉非组和COMB-4组中，在愈合组织水平测量的iNOS表达显著增加，而在第42天，如预期的那样，所有三组中iNOS表达均已恢复到基线值(见图5)。

设计上述实验以确定，在骨折后立即开始通过iNOS延长NO-cGMP途径的上调是否会增强骨折愈合过程。该假设建立在观察的基础上：a)NO参与骨折愈合，如在骨折愈合过程中以特定顺序方式诱导NOS的所有三种同种型所证明的)已知iNOS在不同组织中响应损伤而表达，并且其在这种受损组织中的诱导被认为是对异常的伤口愈合的保护机制)。iNOS是骨折后第一个立即并迅速诱导的NOS同种型，但随后在一到两周的高峰期后逐渐减少。iNOS与成骨细胞功能和骨形成密切相关。

此外，虽然抑制所有三种NOS酶都会导致骨形成和正常骨折愈合的延迟，但已经表明，iNOS酶的特异性靶向抑制或缺失将对骨折愈合过程产生负面影响，而将缺陷的iNOS基因替换到iNOS缺陷的动物将导致正常的骨折愈合。

如上文所述，磷酸二酯酶(PDE)抑制剂是可以通过NO-cGMP途径上调iNOS的化合物，并且已经报道可以增强骨折愈合以及促进成骨前体细胞向成骨细胞分化。然而，在每天服用他达拉非42天后，骨折愈合，如通过生物力学骨折修复阶段、最大扭矩或扭转刚度所测量的，与对照组相比没有明显增强。

相比之下，COMB-4对骨折愈合具有令人惊讶的益处。COMB-4包含L-瓜氨酸、姜、铁青树碱和瓜拉那的混合物，并且显著增强骨折愈合，如通过骨折修复阶段和扭转刚度所测量的。关于最大扭矩，COMB-4显示出比对照组高46％以及比他达拉非组高29％的值。这表明随着时间的推移，最大扭矩强度有改善的趋势。在这些COMB-4动物中观察到的较小的矿物质化愈合组织体积和新矿物质化的愈合组织可能表明桥接愈合组织更快的重塑，与他达拉非组和对照组相比这归功于COMB-4组优异的生物力学性质。

本发明在治疗骨折中的益处已通过前述实验证明，其是第一个随机化的盲法对照研究，在哺乳动物中证明了骨折后天然产物增强骨的功能强度的功效。与对照组或他达拉非组的观察相比，COMB-4本身导致与骨折愈合相关的优异的生物力学性能。L-瓜氨酸、铁青树碱、瓜拉那和姜，COMB-4的成分，人们已知它们具有无害的副作用特征。可以使用L-精氨酸部分或完全取代L-瓜氨酸，尽管因为其生物利用度L-瓜氨酸是优选的。

在一个实施例中，将PDE抑制剂，例如但不限于他达拉非，与包含COMB-4的组合物组合，并在骨折后将其以药学有效量施用于人或其他哺乳动物足够的时间以增强骨折愈合。在另一个实施例中，使用COMB-4本身；这对于不耐受PDE抑制剂的患者特别有益。

根据本发明治疗骨折包括向患者重复施用本发明的营养组合物足够的时间以获得所需的结果。本领域普通技术人员将认识到，在大鼠模型中施用的剂量比例化至接受该剂量的哺乳动物(例如人)的大小。虽然COMB-4营养组合物可以以单一组合物施用，但是在每个定期施用期间其各个成分可以分开给予足够的持续时间，以具有骨折愈合所需的益处。

用于治疗和预防骨质疏松症的方法和组合物

除了在骨折治疗中使用本发明的营养组合物外，本发明提供了用于治疗和/或预防骨质疏松症的营养组合物。

本发明的营养组合物反映了姜、铁青树碱、瓜拉那(瓜拿纳)和L-瓜氨酸和/或L-精氨酸的组合治疗和/或预防骨质疏松症的能力，甚至逆转导致骨质疏松症的生理过程的能力，因此在施用后有益结果可以持续一段时间。营养品组合物可以无限期服用以维持有益效果和/或推迟或减少骨质疏松症的进展。

如上文所述，并且根据优选的实施例，营养组合物的总日剂量为

·至多约3g(优选地约250mg至约2g)的姜或姜衍生物，

·约100mg至约3g(优选地约500mg至约1.5g)的铁青树碱，和

·至少约125mg(优选地约500mg)的瓜拉那(瓜拿纳)。

·约500mg的姜或姜衍生物，

·约1600mg的L-瓜氨酸，

·约500mg的铁青树碱，和

·约500mg的瓜拉那。

虽然在测试期间简单地每日施用本发明的营养组合物，但是应当理解，营养组合物可以一天施用多次，因此将调整单个剂量以便不超过如上文所述优选的总日剂量。无论营养组合物是一天施用一次还是一天施用多次，施用营养组合物足够长的时间以治疗和/或预防骨质疏松症。此外，用于制备本发明的组合物的瓜拉那制剂可任选地包含咖啡因。

本发明的营养组合物反映了姜、铁青树碱、瓜拉那(瓜拿纳)和L-瓜氨酸和/或L-精氨酸的组合治疗和/或预防骨质疏松症的能力。该营养品组合物可以无限期服用以维持有益效果。

根据本发明的另一方面，口服剂型包含根据本发明的营养组合物，其中剂型选自由包含前述成分的片剂、胶囊、锭剂、粉末或悬浮液组成的组。优选的悬浮液是水基和/或醇(乙醇)基的。

现在考虑本发明的营养组合物起作用的机制，上文已经描述了已知一氧化氮(NO)在许多生理系统中是重要的信号传导分子。

考虑到上述情况，本发明的营养组合物，其由(1)姜或姜衍生物、(2)L-瓜氨酸、L-精氨酸或L-精氨酸和L-瓜氨酸的混合物、(3)铁青树碱和(4)瓜拉那组成，用于治疗和/或预防骨质疏松症。该营养组合物导致一氧化氮-cGMP途径上调，这导致骨质疏松症的治疗和/或预防。

如图1所示，并且如上文所讨论的，存在三种上调一氧化氮-cGMP途径的机制。

参考图6，本发明着重于成骨细胞，其是与骨代谢密切相关的细胞。成骨细胞，在其他尚未完全理解的作用内，分泌用于骨形成的基质。本发明的营养组合物通过增加一氧化氮产生和降低cGMP转化至5’GMP来增加一氧化氮-cGMP途径。通过增加pERK(磷酸化细胞外信号调节激酶)、pAKT(磷酸化AKT(蛋白激酶B)和OB基因(肥胖基因)，这导致成骨细胞增殖、分化和存活增加。

如图7所示，在建立本发明的营养组合物治疗骨质疏松症的功效中所使用的实验设计包括治疗6个月大的不能生育的斯普拉格-杜勒大鼠，在实验的第一天开始使用营养组合物进行预防性治疗或在实验开始后第90天开始使用营养组合物进行治愈性治疗。

根据在实验的第一天开始使用营养组合物进行预防性治疗，在实验的第一天也进行假(SHAM)手术或卵巢切除术(OVX)。在治疗60天后进行第一次DEXA(双能X射线吸收测量法)扫描，然后在治疗100天后再次进行扫描。根据治愈性治疗，在实验的第一天进行假手术或卵巢切除术(OVX)，并且直到实验开始后的第90天才开始使用营养组合物。为了对比的目的，用雌二醇(E2)类似地处理大鼠，已知雌二醇是用于治疗骨质疏松症的组合物。此后，在实验开始后的第190天(或开始用营养组合物治疗后的第100天)进行第一次DEXA扫描。

通过DEXA扫描研究大鼠以确定BMD、LEAN(排除脂肪的无脂肪组织)+BMC(骨矿物质含量)、FAT和％FAT。此外，研究和量化血清中的骨标记物(特别是骨钙素和TRAP5c)。

图8至27中所示的图表总结了数据，其建立了营养组合物在治疗和预防骨质疏松症中的功效。

通过图28-32所示的图表总结的进一步测试支持以下结论：本发明的营养组合物对成骨细胞的增殖无毒，而生姜(参见图29)和铁青树碱(参见图30)，COMB-4中发现的四种成分中的两种，当成骨细胞以COMB-4中包含的剂量的单个基准暴露在这两种成分时，实际上对成骨细胞的增殖有毒。在以各种剂量施用四种组合物中的三种之后，通过研究成骨细胞的细胞培养物的光密度(OD)一段时间来进行测试。例如，在各种浓度下测试姜、铁青树碱、瓜拉那(瓜拿纳)和营养组合物(COMB-4)。具体地，测试以下浓度以确定它们对细胞增殖的影响：姜浓度为0.02mg/ml和0325mg/ml(姜0.02和姜0.325，分别如图28和29所示)；铁青树碱(MP)浓度为0.90mg/ml和14.4mg/ml(MP 0.90和MP 14.4，分别如图28和30所示)；瓜拉那(PC)浓度为0.90mg/ml和0.045mg/ml(PC 0.90和PC.045，分别如图28和31所示)；和营养组合物(由500mg的姜或姜衍生物、约1600mg的L-瓜氨酸、约500mg的铁青树碱和约500mg的瓜拉那组成)浓度为0.67mg/ml和1.70mg/ml(COMB-4 0.67和COMB-4 1.70，分别如图28和32所示)。

本发明的营养组合物阻止BMD的降低以及血清骨钙素的增加和TRAP-5(抗酒石酸性酸性磷酸酶)的减少。结果，本发明的营养组合物可以用于治疗和/或预防骨质疏松症。治疗可以由定期服用的短期自我施用口服剂量组成(例如，每天至少一次或在剂量之间的其他时间段，直到达到期望的效果或作为个体的长期的一部分，甚至是一生的每日营养)。

应当理解，用于治疗骨质疏松症的本发明的营养组合物还可以包括其他化合物，但姜、铁青树碱和瓜拉那和L-精氨酸或L-瓜氨酸在组合物及其治疗骨质疏松症的能力中是必需的。

如上文所述，在本发明的营养组合物中，姜优选的总日剂量包含约250mg至约2g。本发明的营养组合物的总日剂量还包含约10mg至约2g的L-瓜氨酸。可以使用约10mg至约2g的L-精氨酸代替L-瓜氨酸和/或除L-瓜氨酸之外使用约10mg至约2g的L-精氨酸。然而，由于已经发现，用于内源性产生一氧化氮的较大量的体内L-精氨酸可以通过较小剂量的L-瓜氨酸诱导而不是口服L-精氨酸，因此本发明优选的组合物包含L-瓜氨酸代替L-精氨酸和/或除L-精氨酸之外包含L-瓜氨酸(参见Schwedhelm,et al.British Journal of ClinicalPharmacology,65:pp 51-59，(2007))。此外，本发明的营养组合物中，铁青树碱的总日剂量为约100mg至约3g(优选地约500mg至约1.5g)，并且本发明的营养组合物中，瓜拉那(瓜拿纳)的总日剂量为至少约125mg(优选地约500mg)。考虑到这一点，并且如上文所述，单个剂量，其中一天仅服用营养组合物一次，包括约500mg的姜或姜衍生物、约1600mg的L-瓜氨酸、约500mg的铁青树碱和约500mg的瓜拉那。如上文所述，应当理解，营养组合物可以一天施用多次，因此可以调节单个剂量，使得不超过如上所述的优选的总日剂量。无论是每天服用单剂量还是一天服用多剂量，在延长的时间段内提供本发明的组合物的重复剂量直至获得所需的效果。向表现出骨质疏松症症状的患者重复施用本发明的组合物，直至获得所需的骨质疏松症治疗结果，并且此后可以作为预防剂继续施用。

在一个实施例中，并且如上文所述，根据本发明使用的单个剂量，其中一天仅服用营养组合物一次，包括约500mg的姜或姜衍生物、约1600mg的L-瓜氨酸、约500mg的铁青树碱、约500mg的瓜拉那。无论营养组合物如上文所述那样每天施用一次或营养组合物在一天中施用多次，施用营养组合物足够的时间以治疗骨质疏松症并获得所需的结果。然而，测试表明，各种元素的量可以变化并且营养组合物的总日剂量可以包含至多约3g(优选地约250mg至约2g)的姜或姜衍生物，约10mg至约2g(优选地约400mg至约3g)的L-瓜氨酸、L-精氨酸或L-精氨酸和L-瓜氨酸的组合，约100mg至约3g(优选地约500mg至1.5g)的铁青树碱，和至少约125mg(优选地约500mg)的瓜拉那(瓜拿纳)。上述剂量可以另外地或代替生姜包含约20mg至约1000mg的6-姜酚，优选地约220mg的6-姜酚，尽管本发明人发现使用生姜是优选的。

虽然描述了本发明的某些实施例的细节，但是提供它们作为说明性实例，以使本领域普通技术人员能够实践本发明。所提供的细节并不意味着限制本发明的范围，而是示例性的。在使用已知的成分部分或完全实现本发明的某些要素的情况下，仅描述了理解和生产本发明所必需的这些已知成分的那些部分，并且省略了对其他成分或配制过程的详细描述，以简化本发明的说明。此外，本发明包括本文提及的组合物和方法现有和未来已知的等同物。本发明能够具有其他实施例并且能够以各种方式实践和实施，并且因此，本领域技术人员将理解，本发明所基于的概念可以容易地用作基础，用于设计实现本发明的若干目的的方法和组合物。

Claims

1.一种用于增强骨科疾病治疗的组合物，其中施用药学有效量的所述组合物足够的时间来刺激iNOS并增强骨科疾病的治疗。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含姜或姜衍生物；铁青树碱；瓜拉那；和由L-精氨酸和L-瓜氨酸组成的组中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述组合物包含250mg至2g的姜或姜衍生物。

4.根据权利要求2所述的组合物，包含10mg至3g的L-精氨酸、L-瓜氨酸或L-精氨酸和L-瓜氨酸的混合物。

5.根据权利要求2所述的组合物，包含10mg至2g的L-精氨酸、L-瓜氨酸或L-精氨酸和L-瓜氨酸的混合物。

6.根据权利要求2所述的组合物，包含100mg至3g的铁青树碱。

7.根据权利要求2所述的组合物，包含500mg至1.5g的铁青树碱。

8.根据权利要求2所述的组合物，包含至少250mg的瓜拉那。

9.根据权利要求2所述的组合物，包含500mg的瓜拉那。

10.根据权利要求2所述的组合物，包含250mg至2g的姜或姜衍生物；250mg至2g的L-精氨酸、L-瓜氨酸或L-精氨酸和L-瓜氨酸的混合物；500mg至1.5g的铁青树碱和500mg的瓜拉那。

11.根据权利要求1所述的组合物，其中施用药学有效量的所述组合物足够的时间来增加骨折愈合的速度。

12.根据权利要求1所述的组合物，其中施用药学有效量的所述组合物足够的时间对骨质疏松症的治疗是有效的。

13.一种用于增强骨科疾病治疗的方法，包括：

施用药学有效量的组合物足够的时间以刺激iNOS并增强骨科疾病的治疗。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述组合物包含姜或姜衍生物；铁青树碱；瓜拉那；和由L-精氨酸和L-瓜氨酸组成的组中的至少一种。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述组合物包含250mg至2g的姜或姜衍生物。

16.根据权利要求14所述的方法，包含10mg至3g的L-精氨酸、L-瓜氨酸或L-精氨酸和L-瓜氨酸的混合物。

17.根据权利要求14所述的方法，包含10mg至2g的L-精氨酸、L-瓜氨酸或L-精氨酸和L-瓜氨酸的混合物。

18.根据权利要求14所述的方法，包含100mg至3g的铁青树碱。

19.根据权利要求14所述的方法，包含500mg至1.5g的铁青树碱。

20.根据权利要求14所述的方法，包含至少250mg的瓜拉那。

21.根据权利要求14所述的方法，包含500mg的瓜拉那。

22.根据权利要求14所述的方法，包含250mg至2g的姜或姜衍生物；250mg至2g L-精氨酸、L-瓜氨酸或L-精氨酸和L-瓜氨酸的混合物；500mg至1.5g的铁青树碱和500mg的瓜拉那。

23.根据权利要求13所述的方法，其中施用药学有效量的所述组合物足够的时间将增加骨折愈合的速度。

24.根据权利要求13所述的方法，其中施用药学有效量的所述组合物足够的时间对骨质疏松症的治疗是有效的。