JP7068338B2 - 4,4-ジフェニルピペリジン化合物又はその医薬的に許容される塩、医薬組成物及びそれらの使用。 - Google Patents
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Description
gが、C1-8アルキリデン、置換C1-8アルキリデン、カルボニル及びC1-8アルキリデンアシルからなる群から選択され;
Rが、C5-20アリール、置換C5-20アリール、C4-20ヘテロシクリル及び置換C4-20ヘテロシクリルからなる群から選択され;
前記置換C1-8アルキリデン、置換C5-20アリール及び置換C4-20ヘテロシクリルのそれぞれが、独立して1つ以上の置換基で置換され、前記置換基が、ハロゲン、C1-8アルキル、C1-8アルコキシ、C3-8シクロアルキル、シアノ、ニトロ、メルカプト、メチルチオ、エチルチオ、トリフルオロメチル、アミノ、アミド、モノ-C1-8アルキルアミノ、ジ-C1-8アルキルアミノ、C1-8アルキルスルホニル、ヒドロキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ及びヘテロシクリルオキシからなる群から選択される)
の化合物又はその医薬的に許容される塩に関する。
(1)6-(3-(4,4-ジフェニルピペリジニル)-プロピオニル)ベンゾオキサゾリン-2-オン;
(2)6-(3-(4,4-ジフェニルピペリジニル)-アセチル)ベンゾオキサゾリン-2-オン;
(3)1-(4-ジメチルアミノベンジル)-4,4-ジフェニルピペリジン;
(4)1-(3,4,5-トリメトキシベンジル)-4,4-ジフェニルピペリジン;
(5)1-(2-メチルチエニル)-4,4-ジフェニルピペリジン;
(6)4,4-ジフェニル-1-ベンジルピペリジン。
(1)N-ベンジル-4-ピペリドンをトリフルオロメタンスルホン酸の存在下でベンゼンと反応させ、式IIの化合物を形成する工程、
(2)前記式IIの化合物を、クロロギ酸エチルと反応させ、式IIIの化合物を形成する工程、
(3)前記式IIIの化合物が、アルカリ条件下で加水分解され、式IVの化合物を形成する工程、
(4)前記式IVの化合物を、ハロゲン化合物又はアルデヒドと反応させ、式Iの化合物を形成する工程、
上記式I中のR又はgの定義は、本発明の第1の態様における化合物又はその医薬的に許容される塩の何れか1つとして記載される。
用語「ハロゲン」は、フッ素(F)、塩素(Cl)、臭素(Br)、ヨウ素(I)及びアスタチン(At)を含むVIIA元素群を指す。
1.本発明の化合物又はその医薬的に許容される塩及びそれらを含む医薬組成物は、N型カルシウムイオンチャンネルを遮断又は阻害するという顕著かつ、具体的な効果を奏する。
2.本発明の化合物又はその医薬的に許容される塩及びそれらを含有する医薬組成物は、優れた薬物動態学的性質を有し、及び痛みを効果的に軽減することができる。
3.本発明の化合物又はその医薬的に許容される塩及びそれらを含有する医薬組成物は、疼痛、脳卒中、脳虚血、アルコール嗜癖、アルコール依存症、急性腎不全、慢性腎不全、腎不全、鎮痛薬に起因する中毒性障害又は鎮痛薬に起因する寛容障害を予防又は治療することができる。
実施例1: 6-(3-(4,4-ジフェニルピペリジニル)-プロピオニル)ベンゾオキサゾリン-2-オン(化合物(1))の合成
1.実験目的:マウス酢酸ライジングモデル(mouse acetic acid writhing model)における化合物(4)塩酸塩及び化合物(1)、(2)、(3)、(5)の鎮痛活性を測定すること。
2.実験材料:半分雄及び半分雌の昆明マウス(18~22g)は、軍事医学科学アカデミーの実験動物センター(Experimental Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences)により提供された。
3.実験方法及び結果:
マウスは、秤量され、そしてラベルを付けられた。各群10匹のマウス(半分雌及び半分雄)は、5つの実験群(それぞれ、化合物(4)塩酸塩、化合物(1)、(2)、(3)、(5))、陽性コントロール群(NMED-160を用いる)及び陰性コントロール群(生理食塩水を用いる)を含む7つの群に分けられた。これらのうち、陽性コントロール群に用いられたNMED-160は、選択的小分子N型カルシウムイオンチャンネル遮断薬であり、これは、第II相臨床試験に入っており、文献[11]を参照することによって合成され得、その構造式は、以下の通りである:
Aは、陰性コントロール群の身もだえするような症状の回数を表す;
Bは、実験群又は陽性コントロール群の身もだえするような症状の回数を表す)
1.実験目的:本発明の化合物(4)塩酸塩、化合物(1)、(2)、(3)、(5)のアフリカツメガエル卵母細胞において一過性に発現されるN型カルシウムイオンチャンネル(α1B/β1b/α2δ)に対する電流抑制効果を決定すること。
2.実験材料:
アフリカツメガエル卵母細胞
N型カルシウムイオンチャンネルcDNAプラスミドα1B (GeneBank受入番号AF055477)/α2δ、(AF286488)/β1b(L06110)、ラビットα1C(X15539)、ヒトα1A(NM000068)、ラットα1E(NM009782)及びラットHERG(U04270)。
3.実験方法
(1)カルシウムチャンネルの異なるサブユニットcDNAの増幅:
α1B、α2δ、β1bプラスミド(cDNAプラスミド)を含むE.coliコンピテントセルを、アンピシリン(50μg/mL)を含むLB溶液(100mL)に別々に入れ、37℃、200rpmで12~17時間振とうし、翌日に用いた。
(2)プラスミドの抽出:
4mLの上記E.coli培養液は、卓上遠心機で5分間遠心分離され(12000g)、上清を捨て、チューブをペーパータオル上に倒置して残りの培養液を吸収させた。250μLの細胞懸濁溶液が、上記のチューブに加えられ、ボルテックス又はブロー(blow)して細胞を完全に懸濁させ、懸濁した細胞は、5mLの滅菌遠心分離チューブに移された。250μLの細胞溶解溶液が、これに加えられ、チューブを4回転させ、よく混合した。インキュベーション時間は、約1~5分間であった。さらに、10μLのアルカリプロテアーゼ溶液が加えられ、4回転倒混和され、室温で5分間インキュベートされた。アルカリプロテアーゼは、単離されたプラスミドの品質に影響を与える細胞溶解中に放出されたヌクレアーゼ及び他のタンパク質を不活性化することができた。次いで、350μLの中和溶液を遠心分離チューブに加え、チューブを直ちに4回転倒混和し、遠心分離チューブは、室温で10分間、最高速度(14,000g)で遠心分離にかけられた。
外科用器具を、75%(w/w)エタノールに30分間浸漬し、取り出して乾燥させた。5番糸が、沸騰水中で10分間滅菌された。
α1B、α2δ、β1bプラスミドが、アフリカツメガエル卵母細胞に、1:1:1の濃度比で注入され、1細胞当たり注入された3つのプラスミドの総容量は、約46nLであった。注射された細胞は、ND-96培地に18℃で48時間置かれ、次いで発現された電流が記録された。
灌流投与法が、流速3mL/分及び試験濃度10μMで採用された。二電極電圧クランプ法を用いて、細胞が、-100mVにクランプされ、10mVにステップされ、+60mVに減極され、そして電流が記録された。
(1)P/Q型及びHergチャンネルDNAの酵素消化直線化
1.P/Q型カルシウムチャンネルのサブユニット(α2δ、β1b、α1B、α1E、α1A、α1C)及びHergチャンネルDNAは、試験例2と同じ供給源からのものであり、そして、以下のシステムに従って酵素消化が行われた:
HpaI 1μL
10×Mバッファー 2μL
DNA(α2δ) ≦1μg
滅菌水 20μLの総容量まで加えた;
XbaI 1μL
10×Mバッファー 2μL
DNA(β1b) ≦1μg
滅菌水 20μLの総容量まで加えた;
NotXbaI 1μL
10×Mバッファー 2μL
DNA(α1B) ≦1μg
滅菌水 20μLの総容量まで加えた;
XbaI 1μL
10×Mバッファー 2μL
DNA(α1E) ≦1μg
滅菌水 20μLの総容量まで加えた;
XbaI 1μL
10×Mバッファー 2μL
DNA(α1A) ≦1μg
滅菌水 20μLの総容量まで加えた;
XbaI 1μL
10×Mバッファー 2μL
DNA(α1C) ≦1μg
滅菌水 20μLの総容量まで加えた;
XbaI 1μL
10×Mバッファー 2μL
DNA(Herg) ≦1μg
滅菌水 20μLの総容量まで加えた;
プラスミドDNAは、上記反応系に従って酵素消化に供され、37℃で1時間インキュベートされた。
a.酵素消化されたプラスミドDNAサンプルに、0.1倍容量の10×プロテイナーゼKバッファー、0.1倍容量の5%SDS溶液、20mg/mLプロテイナーゼK(最終濃度100μg/mL)が加えられ、インキュベーション反応が、37℃1時間で行われた;
b.上記反応混合物が、1.5mLエッペンドルフチューブに移され、等容量のトリス平衡フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)が加えられ、1分間シェイクされ、12000rpmで2分間、室温(20~25℃)で遠心された(有機相と無機相が十分に分離されていない場合、遠心分離が時間を延長するために繰り返された);
c.上部の水相が、別のきれいな1.5mLエッペンドルフチューブに慎重に移され、2つの相と有機相との間の界面相が破棄された;
d.等量のクロロホルム:イソアミルアルコール(24:1)が、それに加えられ、室温(20~25℃)で2分間、12000rpmで遠心分離された;
e.上部の水相が、別のきれいな1.5mLエッペンドルフチューブに慎重に移され、0.1倍容量の3M酢酸ナトリウム(pH5.2)及び2.5倍容量の95%(w/w)エタノールが加えられ、よく混ぜるためにシェイクされ、-20℃で一晩(12~16時間)貯蔵された;
f.遠心分離は、低温(<4℃)で、12000rpm、40分間行われた。
g.沈殿物を攪拌せずに上清が慎重に除去され、チューブの壁に付着した全ての液滴を吸い込み管で吸い出された;
h.前の工程で得られた沈殿物に、70%エタノールのハーフチューブが加えられ、よくシェイクされ、低温(<4℃)、12000rpmで2分間遠心された;
i.上清は、慎重に除去され、前の工程が繰り返された;
j.1.5mLエッペンドルフチューブは、残留液体が蒸発するまで、室温(20~25℃)、解放状態で保持された;
k.チューブの壁を十分にすすぎながら適量のヌクレアーゼフリーの水が加えられ、十分に混合され、鋳型DNAが完全に溶解され、濃度値を決定するために測定され、その後の使用のために-20℃で貯蔵された。
反応物は、以下の反応系指示で加えられた:
α1A、β1b、α2δ、α1E、α1A、α1Cサブユニット及びHergチャンネルサブユニットの線状化鋳型;
T7転写5×バッファー20μL;
rNTP(25mM ATP、CTP、UT、各7.5μL+3mM GTP、0.6μL+ヌクレアーゼフリーの水、6.9μL);
線状DNA鋳型(合計5~10μg)+ヌクレアーゼフリーの水32.5μL;
Ribom7ハットアナログ、40mM、7.5μL;
MixE、10μL。
a.反応混合物は、インキュベーターから取り出され、RQ1 RnaseフリーDnase(1μgの鋳型DNA当たり1u酵素の割合)が加えられ、インキュベーション反応は、37℃で15分間行われた;
b.等量の水平衡フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)が、それに加えられ、1分間シェイクされ、室温(20~25℃)で12,000rpmで2分間遠心された(有機相と無機相が十分に分離されていない場合、遠心分離が時間を延長するために繰り返された);
c.上部の水相は、別のきれいな1.5mLエッペンドルフチューブに慎重に移され、等容量のクロロホルム:イソアミルアルコール(24:1)が加えられ、室温(20~25℃)、12000rpnで2分間遠心された;
d.上清は、別のきれいな1.5mLエッペンドルフチューブに慎重に移され、0.1倍容量の3M酢酸ナトリウム(pH5.2)及び2.5倍容量の95%(w/w)エタノールが加えられ、よく混合するためにシェイクされ、-20℃で一晩(12~16時間)貯蔵された。
e.遠心分離は、低温(<4℃)で12,000rpmで40分間行われた;
f.沈殿物を攪拌することなく上清が慎重に除去され、チューブの壁に付着した全ての液は、吸い込み管で吸い出された;
g.前の工程で得られた沈殿物に、ハーフチューブの70%エタノールが加えられた;
h.上清は、慎重に除去され、前の工程が繰り返された;
i.1.5mLエッペンドルフチューブは、残留液体が蒸発するまで、室温(20~25℃)、解放状態で保持された、チューブの壁を十分にすすぎながら適量のヌクレアーゼフリーの水が加えられ、十分に混合され、mRNAが完全に溶解され、その後の使用のために-70℃で貯蔵された。
二段電極引き抜き装置で特殊注射針を引き抜いた後、針の先端の直径を大きくするために針を用いてきれいな薄いティッシュペーパーに穴をあけ、針の先端を滑らかかつ、平らにするために研磨器具で研磨した。針先の直径は、6~10μmが好ましい。注射針を取り付ける前に、ライトミネラルオイルが、注射針に注入され、チューブの壁を滑らかにした。元のサブユニットcRNAの濃度に基づき、注入濃度は、約2ng/nLに調整され、別々に混合された(1:1:1)。1μLの混合cRNAは、きれいなパラフィンフィルム上に慎重に滴下され、マイクロインジェクターを用いることによってcRNAが、注射針に引き込まれた(注、RNaseの混入を防ぐべきである;注射針への空気の巻き込みを防ぐべきである;どちらも卵母細胞でのcRNAの発現に影響を与える可能性がある)。フェーズV及びVIの選択された健康な成熟卵母細胞は、底部にメッシュ(細胞が皿の中で滑り落ちるのを防止した)ペトリ皿に入れられた。針の先端が細胞表面に触れるように、3Dマイクロマニピュレーターが、慎重に調整された。細胞が良好な状態であれば、針の先端が細胞に触れた際に抵抗が感じられ、細胞膜の聴力によって形成されたしわが確認できるだろう。針の先端は、細胞を深く刺しすぎてはならない、針の先端を細胞膜に通すのみが賢明である。46.5nlのcRNAが卵母細胞に注入され、注射後わずかに細胞が膨潤した。30秒待った後、注射針は引き抜かれ、細胞内容物がこぼれたか否かを観察し、そうであれば細胞は廃棄された。加えて、突き破る感覚なしに針の先端が簡単に細胞に刺さった場合、それは、細胞が、無張力かつ、劣悪な状態であることを示し、これは細胞が所望の電位に固定され得ないことを意味し、その細胞も同様に廃棄されるべきである。注入された卵母細胞は、ND-96溶液に入れられ、バイオケミカルインキュベーター(18℃)中で48時間インキュベートされ(ND-96溶液は毎日交換された)、P/Q型カルシウムイオンチャンネル電流及びHergチャンネル電流の発現が、別々に記録された。
細胞外液(mM):BaCl2、N-メチル-D-グルカミン50、KCl5、HEPES5、メタンスルホン酸でpH7.4に調整。
(2)初代培養海馬ニューロン
1.海馬ニューロンの培養
新生Wistarラットを採取し、75%(w/w)エタノールで殺菌した。無菌状態で脳が採取され、海馬が剥がされ、氷浴中の解剖溶液に入れられた。海馬は、1~2mm3の組織ブロックに切断され、0.25%トリプシンを含む解剖溶液で37℃、30分間消化され、次いで、消化された組織塊は、植え付け液に移され、消化を終了させた。適切な口径(先端直径2mm)を有するピペットを用いて、細胞が均一に分散するように植え付け溶液中の細胞をブローしかつ、叩き、細胞懸濁液が調製され、少量の懸濁液を採取し、トリパンブルー染色液中の細胞が数えられた。適量の植え付け液が加えられ、細胞は、予め1×105/mLの密度で、ポリリシンで被覆された35mm培養皿中で接種され、36℃で一晩二酸化炭素インキュベーターに置かれた。培地は、24時間後に交換され、植え付け液は、2mLの培養液に交換された。その後、培養液は、3日毎に1回、半容量で交換され、12~15日の期間に培養細胞は、パッチクランプ実験に用いられた。非ニューロン性過剰増殖を抑制するために、培養3日目に適量のシタラビンが培地に加えられた(6μLのシタラビン原液が、各皿に加えられ、3μg/mLの最終濃度に到達させた)。
全細胞記録に用いられた記録液は、主に電極内液と細胞外液であった。
1.材料及び装置:
化合物(1)は、25%(w/v)のヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン水性溶液に溶解された;
メゲストロール:中国の検査機関から購入した内部標準物質;
ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン:西安デリバイオケミカル社から購入、25%(w/v)のヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン水性溶液として調製;
アセトニトリル、メタノール:クロマトグラフィー用純度、Fisher Companyから購入;
純水;
成体SDラット、体重180~220g、雄、軍事医学科学アカデミーの実験動物センターから購入、動物証明書SCXK-(Army)-2012-0004;
液体クロマトグラフィー-質量分析計(LC-MS/MS)、三連四重極カスケードLC-MS/MS(API5000);
LDZ5-2型遠心分離機(北京メディカル遠心機製造所);
MicroCL21R高速冷凍遠心分離機(Thermo Company、USA);
JJ-1型精密ブースター電気ミキサー(常州Guohua電気株式会社);
XW-80A型ボルテックスミキサー(上海青浦Huxishi装置製造所);
ザルトリウスBS110S電子分析天秤(北京ザルトリウス天秤株式会社)、リブラーEB-330D電子分析天秤(島津、日本)
1mg/mLの化合物(1)の母液は、アセトニトリルで調製され、徐々に希釈され、一連の濃度の標準液を得た; ブランクラットの多数の部分が、0.05mLで採取され、一連の濃度の0.005mL標準溶液及び0.3mLのアセトニトリル含有内部標準物質メゲストロールが、別々に加えられた、その結果、化合物(1)の最終濃度は、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500mg/mL、1000mg/mL、2000ng/mLのそれぞれであった。次いで、ボルテックスミキサーで1分間ボルテックスし、10分間遠心分離し(14000g)、約0.15mLの上清が採取され、注入バイアルに入れられ、分析のためにLC-MS/MSに5μL注入された。
カラム:Kromasil 100-5 C18、Dim 50×2.1mm(スウェーデン);
移動相組成:移動相Aは、水(0.1%のギ酸を含有)、移動相Bは、アセトニトリル(10mM酢酸アンモニウム及び0.1%ギ酸を含有)であり、グラジエント溶出手順は、表5に示される。
イオン化モードは、エレクトロスプレー(ESI)条件、陽イオン検出であった;
6匹の成体SDラットは、無作為に番号付けられ、静脈内注射(i.v.、1.85mg/kg)及び化合物(1)の経口投与(p.o.、11mg/kg)をそれぞれ受けるために2つの群に分けられた; 投与前並びに投与後2分、5分、15分、30分、60分、2時間、4時間、7時間、及び24時間に血液サンプルが採取され、抗凝固チューブに入れられ、15分間遠心分離され(3500rpm)、血漿を分離され、0.05mLの血漿サンプルが正確に採取され、後の試験のために-30℃の冷凍庫で凍結された。
1.材料及び装置: 試験例4のものと同じ。
2.標準曲線の作成:
これは、試験例4のセクション2の方法を参考にして実施された; さらに、ブランクラット血漿が、ブランクラット脳ホモジネートに置き換えられ、ラット脳ホモジネートについての化合物(1)の標準曲線が描かれた。
化合物(1)は、25%(w/v)のヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン水性溶液を用いて4mg/mLの濃度で調製された。3匹の成体SDラットが、無作為に番号付けられ、最初に0.4mLの化合物(1)の溶液が静脈内注射され、次いで、化合物(1)溶液(0.4mL/h)がそれぞれ2時間ゆっくりと導入された。投与前、並びに投与後30分、60分、及び2時間後に血液サンプルがそれぞれ、0.1mL採取され、抗凝固チューブに入れられ、15分間遠心分離され(3500rpm)、血漿を分離され、0.05mLの血漿サンプルが正確に採取され、後の試験のために-30℃の冷凍庫で凍結された。
Claims (8)
- 以下の化合物:
6-(3-(4,4-ジフェニルピペリジニル)-プロピオニル)ベンゾオキサゾリン-2-オン;
6-(3-(4,4-ジフェニルピペリジニル)-アセチル)ベンゾオキサゾリン-2-オン;
1-(4-ジメチルアミノベンジル)-4,4-ジフェニルピペリジン;
1-(3,4,5-トリメトキシベンジル)-4,4-ジフェニルピペリジン;
1-(2-メチルチエニル)-4,4-ジフェニルピペリジン;
及びその医薬的に許容される塩からなる群から選択される、請求項1に記載の式Iの化合物又はその医薬的に許容される塩。 - 請求項1又は2に記載の化合物又はその医薬的に許容される塩を含む医薬組成物。
- 医薬的に許容される賦形剤をさらに含む請求項3に記載の医薬組成物。
- N型カルシウイオンチャンネル遮断薬又は阻害薬の製造における、請求項1又は2に記載の化合物若しくはその医薬的に許容される塩又は請求項3に記載の医薬組成物の使用。
- 疼痛、脳卒中、脳虚血、アルコール嗜癖、アルコール依存症、腎臓病、鎮痛薬に起因する中毒性障害又は鎮痛薬に起因する寛容障害の予防又は治療のための薬物の製造における、請求項1又は2に記載の化合物若しくはその医薬的に許容される塩又は請求項3に記載の医薬組成物の使用。
- 前記疼痛が、術後疼痛、片頭痛、内臓痛又は神経因性疼痛である、請求項6に記載の使用。
- 前記腎臓病が、急性腎不全、慢性腎不全又は腎不全である、請求項6に記載の使用。
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