JP7057912B2 - タンパク質の分離精製方法および装置 - Google Patents
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やバイオ医薬品の生産に用いる製造装置ができることを発案した。
(1)対象タンパク質の精製工程における対象タンパク質濃度の測定方法において、培養液または精製過程で得られる多様な混合溶液に含まれる対象タンパク質の濃度の測定を、モノリスシリカ担体を有する検出用カラムを用いて分離精製することで得られる対象タンパク質の濃度測定により行うことを特徴とする測定方法、
(2)精製工程が精製用クロマトグラフィーであることを特徴とする(1)記載の測定方法、
(3)培養液または精製過程で得られる多様な混合溶液に含まれる対象タンパク質の濃度測定が、1分間以内に行われることを特徴とする(1)または(2)記載の測定方法、
(4)対象タンパク質の濃度測定が低圧条件下で行われることを特徴とする(1)~(3)いずれかに記載の測定方法、
(5)対象タンパク質が、抗体であることを特徴とする(1)~(4)いずれかに記載の測定方法、
(6)対象タンパク質の分離精製工程において、各工程の通過液をサンプリングし、各サンプルにおける対象タンパク質の濃度測定を、モノリスシリカ担体を有する検出用カラムを用いて分離精製することで得られる対象タンパク質の濃度を経時的に測定し、モニターすることを特徴とする対象タンパク質の製造方法、
(7)精製用クロマトグラフィーの注入液およびカラム通過液中の対象タンパク質のモニター結果の相違から、精製用クロマトグラフィーに充填された担体への対象タンパク質の吸着量を測定することを特徴とする(6)記載の対象タンパク質の製造方法、
(8)対象タンパク質が抗体であることを特徴とする(6)または(7)記載の製造方法、
(9)対象タンパク質の精製工程における対象タンパク質濃度の測定装置において、培養液または精製過程で得られる多様な混合溶液に含まれる対象タンパク質の濃度測定を、モノリスシリカ担体を有する検出用カラムを用いて分離精製することで得られる対象タンパク質の濃度測定により行うことを特徴とする測定装置、
(10)精製工程が精製用クロマトグラフィーを用いる工程であることを特徴とする(9)記載の測定装置
(11)送液部、サンプル注入部および検出部から構成されることを特徴とする(9)または(10)記載の測定装置、
(12)送液部は対象タンパク質の精製プラント上の培養液または精製過程で得られる多様な混合溶液を移送する主配管上に設けられた分岐バルブにより分岐した配管と、接続可能な形状を持ち、ポンプにより培養液または精製過程で得られる多様な混合溶液をサンプル注入部に吐出することを特徴とする(11)記載の測定装置、
(13)サンプル注入部が注入切り替えバルブを介して検出用カラムまたは排出口に接続する機能を持つことを特徴とする(11)または(12)記載の測定装置、
(14)検出部が、検出用カラムを通過した液を検出セルに導き、光源から導かれた波長280nmの光を検出セルに照射し、検出セルを透過した光を検出することにより、吸光度をオンラインでモニターする機能を持つことを特徴とする(11)~(13)いずれかに記載の測定装置、
(15)検出部がモノリスシリカ担体を有する検出用カラムを含むことを特徴とする(11)~(14)いずれかに記載の測定装置、
(16)送液部、サンプル検出部および検出部の各構成要素に対して通信を行い、動作の状態に対応する命令の送信、応答を取得する制御部を有することを特徴とする(11)~(15)いずれかに記載の測定装置、および
(17)精製用クロマトグラフィーを用いた対象タンパク質の分離精製装置において、培養液または精製用クロマトグラフィーで得られる多様な混合溶液の流路に(10)~(16)いずれかに記載のタンパク質濃度の測定装置を接続することにより、精製工程中の対象タンパク質の濃度をモニターすることを特徴とする分離精製装置、に関する。
可能になるとともに、計測データをバイオ医薬品の製造工程の操作に反映させて、より高い生産効率でバイオ医薬品を製造することができる。
リガンドを用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いることが好ましい。具体的にはイムノグロブリンとの結合を利用したプロテインA、プロテインG、プロテインL、レクチン等をリガンドとして用いたアフィニティークロマトグラフィー、ヘパリンをリガンドとして用いたアフィニティークロマトグラフィー、グルタチオンをリガンドとして用いたアフィニティークロマトグラフィーが挙げられるが、これらのリガンドを改変したアフィニティークロマトグラフィーでもよい。
ジエチルアミノエチル(DEAE),ジエチルアミノプロピル(ANX)等を持つ陰イオン交換クロマトグラフィー、官能基にスルフォプロピル(SP)、メチルスルフォネート(S),カルボキシメチル(CM)を持つ陽イオン交換クロマトグラフィー等があげられる。ゲルろ過クロマトグラフィーとしては具体的にはスーパーデックス、セファクリル、セファデックス等の樹脂を用いたクロマトグラフィーが挙げられる。
また、上記装置はインジェクションポンプを取り外せば、配管(6)にサンプル注入口を設けることにより手動でのサンプルの注入が可能になり、インジェクションポンプを主配管部分に取り付けることにより、培養物または精製工程上の溶出物中の対象タンパク質の測定を行うこともできる。
特殊な精製プラントに本発明のタンパク質濃度測定装置(21)が装着された例を図2に示した。
検出用カラムは次のようにして製造した。まず、水溶性高分子であるポリエチレンオキシド(アルドリッチ製 商品番号85,645-2)0.90g及び尿素0.90gを0.01規定酢酸水溶液10gに溶解し、この溶液にテトラメトキシシラン4mlを攪拌下で加えて、加水分解反応を行った。数分間攪拌した後、得られた透明溶液を内径6mmのガラスチューブ内に注入し30℃の恒温漕中に保持したところ約30分後に固化した。
図1に示したように、前記検出用カラム(3)の先端を六方バルブ(C75H-1696EMH、Valco Instruments Co. Inc.)(2)および後端をUVモニター(MU701、ジーエルサイエンス株式会社)(15)と結ぶ形で配管を接続し、六方バルブ(2)は他に試料を保持するためのサンプルループ(5)を接続し、また、プランジャーポンプ(MU7710、ジーエルサイエンス株式会社)(10)、精製プラント等外部と接続するための配管(6)と接続した。更にプランジャーポンプ(10)にはポンプ製造元からオプションとして販売されている低圧グラジエントユニット(低圧グラジエントユニット、ジーエルサイエンス株式会社)、即ち、四液切り替えバルブ(11)と接続し、四液切り替えバルブ(11)は吸着洗浄溶液を入れる供給容器(12)、溶出溶液を入れる供給容器(13)、再生溶液を入れる供給容器(14)と接続し、タンパク質濃度測定装置を完成した。
抗体サンプル溶液として、ヒトイムノグロブリンとして販売されているポリクローナル抗体(「IgG from human serum Technical grade」、Sigma社)を、吸着洗浄溶液として用いる1MのNaClを含む50mMリン酸緩衝液(pH7.0)で希釈し、1倍、1.5倍、3倍、5倍、7.5倍、10倍、15倍、25倍、50倍の各倍率に調製した。次に、分光光度計(U-2900、株式会社日立ハイテクサイエンス)を用いてこれら希釈系列の抗体濃度を決定した。抗体濃度の定量にあたっては280nmの吸光度を測定し、光路長1cm、濃度1g/Lにおける抗体の吸光係数を14として用いた。その結果、前記希釈系列の濃度は、10.9g/L、7.25g/L、3.59g/L、2.21g/L、1.44g/L、1.09g/L、0.71g/L、0.43g/L、0.21g/Lであり、これら各濃度の抗体溶液を注入試料として用いた。
図3に示したように、精製工程をモニターするために本発明のタンパク質濃度測定装置を精製用HPLC装置に接続した。具体的には本装置で抗体濃度を測定する対象として、市販の精製用HPLC(AKTA pure 25 M2、GEヘルスケア・ジャパン株式会社)(g)を用いた。精製用HPLCで精製対象とする試料注入口(31)から注入した精製用試料を分離精製するために、精製用HPLC(g)で精製対象とする試料注入口(31)から注入した精製用試料を送液するためのサンプルポンプ(32)と、吸着液(36)、洗浄液(37)、溶出液(38)、再生液(39)の各溶液を送液するためのシステムポンプ(40)を、分岐バルブ(33)を介して精製用カラム(34)の先端と接続した。また、精製用カラム(34)の後端を、精製用カラム(34)から流れ出てくる液体の吸光度を検出するためのUVモニター(42)に電気的に接続されたフローセル(41)と接続した。このように構成された精製用HPLC(g)に対して、精製用HPLC(g)のフローセルを通過した液体をタンパク質濃度測定装置(f)の切り替えバルブ(51)に接続することにより、実施例2で作製したタンパク質濃度測定装置{図3、(51)~(61)}(f)と接続した。サンプルループ(52)への液体の充填は精製用HPLC(g)の液体の流れを利用し、切り替えバルブ(51)で流路を切り替えることにより行った。
前記実施例4で図3に示した装置系を使用し、精製用HPLC(g)を用いて試料溶液に含まれる抗体をプロテインAカラムによって分離精製し、その過程でカラム通過液を間欠的にタンパク質濃度測定装置(f)でサンプリングし、その抗体濃度の推移をモニターした。具体的には、精製用HPLC(g)で精製対象となる精製用試料(31)としてモノクローナル抗体を発現させたCHO細胞培養上清を用いた。また、精製用HPLC(g)に接続する精製用カラム(34)として市販のプロテインAカラム(HiTrap rProtein A FF 1mL、GEヘルスケア・ジャパン株式会社)を用いた。精製用HPLC(g)における分離精製は0.5mL/minの流量で行い、吸着液(36)として150mMのNaClを含む50mMリン酸緩衝液(pH7.0)、洗浄液(37)として1MのNaClを含む50mMリン酸緩衝液(pH7.0)、溶出液(38)として0.1Mグリシン-塩酸緩衝液(pH3.5)、再生液(39)として0.1Mグリシン-塩酸緩衝液(pH2.5)を使用し、10mLの吸着液(36)で精製用カラム(34)を平衡化した後、60mLの精製用試料(31)を通液し、次に15mLの吸着液(36)を通液し、次に5mLの洗浄液(37)を通液し、次に5mLの溶出液(38)を通液し、最後に5mLの再生液(39)を通液することにより分離精製を行った。精製用カラム(34)を流れ出た液体は精製用HPLC(g)のUVモニター(42)で吸光度を測定されるとともに、タンパク質濃度測定装置(f)の切り替えバルブ(51)により、サンプルループ(52)を介して間欠的に検出用カラム(53)に注入され、実施例3に示した検出用カラムにおける分析手順により1分間で分離精製され、溶出画分の吸光度に対応するクロマトグラムを分析して試料の抗体濃度を測定した。
前記実施例4で図3に示した装置系を使用し、精製用HPLC(g)を用いて試料溶液に含まれる抗体をカチオン交換カラムによって分離精製し、その過程でカラム通過液を間欠的にタンパク質濃度測定装置(f)でサンプリングし、その抗体濃度の推移をモニターした。具体的には、精製用HPLC(g)で精製対象となる精製用試料(31)としてモノクローナル抗体を発現させたCHO細胞培養上清を吸着液(36)で5倍希釈した後、少量の塩酸を加えて吸着液(36)と同じpHに調製し、0.2μmのフィルターで濾過して用いた。また、精製用HPLC(g)に接続する精製用カラム(34)として市販のカチオン交換カラム(HiTrap SP FF 1mL、GEヘルスケア・ジャパン株式会社)を用いた。精製用HPLC(g)における分離精製は1.0mL/minの流量で行い、吸着液(36)として20mMクエン酸緩衝液(pH5.5)、洗浄液(37)として20mM酢酸緩衝液(pH5.0)、溶出液(38)として1MのNaClを含む20mM酢酸緩衝液(pH5.0)を使用した。なお、再生液(39)は使用しなかった。10mLの吸着液(36)で精製用カラム(34)を平衡化した後、300mLの精製用試料(31)を通液し、次に15mLの吸着液(36)を通液し、次に5mLの洗浄液(37)を通液し、次に洗浄液(37)と溶出液(38)を混合しながら30mLかけて通液することにより溶出液(38)の濃度を0%から30%までリニアに増加させた。更に、その濃度を維持したまま5mL通液し、最後に溶出液(38)の濃度100%で12mLを通液することにより分離精製を行った。実施例5と同様に、精製用カラム(34)を流れ出た液体は精製用HPLC(g)のUVモニター(42)で吸光度を測定されるとともに、タンパク質濃度測定装置(f)の切り替えバルブ(51)により、サンプルループ(52)を介して間欠的に検出用カラム(53)に注入され、実施例3に示した検出用カラムにおける分析手順により1分間で分離精製され、溶出画分の吸光度に対応するクロマトグラムを分析して試料の抗体濃度を測定した。
Claims (9)
- 対象タンパク質の分離精製工程において、各工程の通過液をサンプリングし、各サンプルにおける対象タンパク質の濃度測定を、モノリスシリカ担体を有する検出用カラムを用いて分離精製することで得られる対象タンパク質の濃度を経時的に測定し、モニターすることを特徴とする対象タンパク質の製造方法において、精製用クロマトグラフィーの注入液およびカラム通過液中の対象タンパク質のモニター結果の相違から、精製用クロマトグラフィーに充填された担体への対象タンパク質の吸着量を測定することを特徴とする対象タンパク質の製造方法。
- 対象タンパク質が抗体であることを特徴とする請求項1記載の製造方法。
- 対象タンパク質の精製工程における対象タンパク質濃度の測定方法において、培養液または精製過程で得られる多様な混合溶液に含まれる対象タンパク質を、精製工程の混合溶液の流路から分岐接続されたカラムであって、モノリスシリカ担体を有し高速液体クロマトグラフィーに装着された検出用カラムを、滞留時間12秒以下の条件を用いて分離精製することで、得られる対象タンパク質の濃度測定を行うことを特徴とする測定方法。
- 滞留時間12秒以下の条件が流量6mL/minで得られる請求項3記載の測定方法。
- 対象タンパク質が抗体であることを特徴とする請求項3または4記載の測定方法。
- 容量が20~500μLの検出用カラムを用いることを特徴とする請求項3~5のいずれか1項記載の測定方法。
- バイオ医薬品の製造工程において、リアルタイムに対象タンパク質の濃度を測定する装置であって、培養液または精製過程で得られる多様な混合溶液に含まれる対象タンパク質を分離するための精製工程の混合溶液の流路から分岐接続された流量6mL/minにおける滞留時間が12秒以下であるモノリスシリカ担体を有し高速液体クロマトグラフィーに装着された検出用カラムと対象タンパク質の濃度を測定するために検出用カラムと接続した検出セルを持つUVモニターから構成されることを特徴とする測定装置。
- 容量が20~500μLの検出用カラムを用いることを特徴とする請求項7記載の測定装置。
- 精製用クロマトグラフィーを用いた対象タンパク質の分離精製装置において、培養液または精製用クロマトグラフィーで得られる多様な混合溶液の流路に請求項7または8記載のタンパク質濃度の測定装置を接続することにより、精製工程中の対象タンパク質の濃度をモニターすることを特徴とする分離精製装置。
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