JP7053697B2 - 癌特異的トランス－スプライシングリボザイム及びその用途 - Google Patents
癌特異的トランス－スプライシングリボザイム及びその用途 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7053697B2 JP7053697B2 JP2020028556A JP2020028556A JP7053697B2 JP 7053697 B2 JP7053697 B2 JP 7053697B2 JP 2020028556 A JP2020028556 A JP 2020028556A JP 2020028556 A JP2020028556 A JP 2020028556A JP 7053697 B2 JP7053697 B2 JP 7053697B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cancer
- gene
- mir
- ribozyme
- ecrt
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 title claims description 129
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 title claims description 128
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 title claims description 128
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims description 103
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims description 86
- 108091007780 MiR-122 Proteins 0.000 claims description 141
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 135
- 108091051828 miR-122 stem-loop Proteins 0.000 claims description 132
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 111
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 82
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 77
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 65
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 52
- 230000030833 cell death Effects 0.000 claims description 38
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 29
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 29
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 23
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 21
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 21
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 claims description 20
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 claims description 19
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 19
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 15
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 claims description 14
- 239000012830 cancer therapeutic Substances 0.000 claims description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 12
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims description 11
- 102100032938 Telomerase reverse transcriptase Human genes 0.000 claims description 10
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 claims description 10
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 9
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 8
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 claims description 7
- 208000006990 cholangiocarcinoma Diseases 0.000 claims description 7
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 claims description 7
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 7
- 206010004593 Bile duct cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 208000026900 bile duct neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 6
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 6
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 6
- 108091005957 yellow fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims description 5
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 5
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 5
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 claims description 4
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 108091005941 EBFP Proteins 0.000 claims description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 claims description 4
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 claims description 4
- 241001492404 Woodchuck hepatitis virus Species 0.000 claims description 4
- 108091005948 blue fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 108010082025 cyan fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 4
- 108010045262 enhanced cyan fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 4
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 4
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 4
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 claims description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 claims description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 3
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 claims description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 claims description 3
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 206010005949 Bone cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 claims description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims description 2
- 230000000118 anti-neoplastic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 2
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 2
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 108091093126 WHP Posttrascriptional Response Element Proteins 0.000 claims 2
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 claims 1
- 208000008338 non-alcoholic fatty liver disease Diseases 0.000 claims 1
- 201000008017 ovarian lymphoma Diseases 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 142
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 59
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 38
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 31
- 101000655352 Homo sapiens Telomerase reverse transcriptase Proteins 0.000 description 29
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 27
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 22
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 21
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 20
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 description 15
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 14
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 14
- MLDQJTXFUGDVEO-UHFFFAOYSA-N BAY-43-9006 Chemical compound C1=NC(C(=O)NC)=CC(OC=2C=CC(NC(=O)NC=3C=C(C(Cl)=CC=3)C(F)(F)F)=CC=2)=C1 MLDQJTXFUGDVEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000005511 L01XE05 - Sorafenib Substances 0.000 description 13
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 229960003787 sorafenib Drugs 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 12
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 12
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 9
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 9
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 9
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- 230000009471 action Effects 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 6
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 6
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 5
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 5
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 5
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 5
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- 210000002767 hepatic artery Anatomy 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 description 4
- 102000012406 Carcinoembryonic Antigen Human genes 0.000 description 4
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 206010019851 Hepatotoxicity Diseases 0.000 description 4
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 4
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 4
- 238000009125 cardiac resynchronization therapy Methods 0.000 description 4
- -1 cationic lipid Chemical class 0.000 description 4
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 4
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 231100000304 hepatotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000007686 hepatotoxicity Effects 0.000 description 4
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 4
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 4
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 4
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 4
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 4
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 4
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 4
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 108090000472 Phosphoenolpyruvate carboxykinase (ATP) Proteins 0.000 description 3
- 102100034792 Phosphoenolpyruvate carboxykinase [GTP], mitochondrial Human genes 0.000 description 3
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 3
- 231100000753 hepatic injury Toxicity 0.000 description 3
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 3
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 3
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 3
- 108700020534 tetracycline resistance-encoding transposon repressor Proteins 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000000311 Cytosine Deaminase Human genes 0.000 description 2
- 108010080611 Cytosine Deaminase Proteins 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 2
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 2
- 108700026223 Neurofibromatosis 1 Genes Proteins 0.000 description 2
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- 241000713896 Spleen necrosis virus Species 0.000 description 2
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 102100033254 Tumor suppressor ARF Human genes 0.000 description 2
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 2
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 208000005266 avian sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 2
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 2
- XRECTZIEBJDKEO-UHFFFAOYSA-N flucytosine Chemical compound NC1=NC(=O)NC=C1F XRECTZIEBJDKEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004413 flucytosine Drugs 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 2
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 2
- 108700025694 p53 Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 2
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 2
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 102000014898 transaminase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700001666 APC Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100036464 Activated RNA polymerase II transcriptional coactivator p15 Human genes 0.000 description 1
- 102100034540 Adenomatous polyposis coli protein Human genes 0.000 description 1
- 108010038310 Adenomatous polyposis coli protein Proteins 0.000 description 1
- 108010056962 Adenovirus E4 Proteins Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 102400000068 Angiostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010079709 Angiostatins Proteins 0.000 description 1
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 1
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 101150108519 CDK4 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 1
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102100031162 Collagen alpha-1(XVIII) chain Human genes 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 108010079505 Endostatins Proteins 0.000 description 1
- 239000004386 Erythritol Substances 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 108090000982 GIR1 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 206010073069 Hepatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101000621309 Homo sapiens Wilms tumor protein Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 108050009288 Interleukin-19 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 238000000719 MTS assay Methods 0.000 description 1
- 231100000070 MTS assay Toxicity 0.000 description 1
- 101150115920 MTS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 108700026224 Neurofibromatosis 2 Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 208000012868 Overgrowth Diseases 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 102100022151 Ragulator complex protein LAMTOR1 Human genes 0.000 description 1
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 1
- 101150019443 SMAD4 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 241000251131 Sphyrna Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 239000012163 TRI reagent Substances 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 101150046474 Vhl gene Proteins 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000009098 adjuvant therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N aspergillomarasmine B Natural products OC(=O)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 201000000053 blastoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000001465 calcium Nutrition 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000378 calcium silicate Substances 0.000 description 1
- 229910052918 calcium silicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012241 calcium silicate Nutrition 0.000 description 1
- OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N calcium;dioxido(oxo)silane Chemical compound [Ca+2].[O-][Si]([O-])=O OYACROKNLOSFPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000032677 cell aging Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000002875 cyclin dependent kinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940043378 cyclin-dependent kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 201000008184 embryoma Diseases 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 235000019414 erythritol Nutrition 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 229940009714 erythritol Drugs 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 230000008571 general function Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000334 hepatotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003082 hepatotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 238000007489 histopathology method Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 108090000681 interleukin 20 Proteins 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 231100000832 liver cell necrosis Toxicity 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000845 maltitol Substances 0.000 description 1
- 235000010449 maltitol Nutrition 0.000 description 1
- VQHSOMBJVWLPSR-WUJBLJFYSA-N maltitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O VQHSOMBJVWLPSR-WUJBLJFYSA-N 0.000 description 1
- 229940035436 maltitol Drugs 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 108700042657 p16 Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 208000015768 polyposis Diseases 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 102200082402 rs751610198 Human genes 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000005477 standard model Effects 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 108010057210 telomerase RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/12—Animals modified by administration of exogenous cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
- C12N2310/124—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes based on group I or II introns
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
- C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
- C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2330/00—Production
- C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
- C12N2330/51—Specially adapted vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/48—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating transport or export of RNA, e.g. RRE, PRE, WPRE, CTE
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor
- C12N2840/445—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor for trans-splicing, e.g. polypyrimidine tract, branch point splicing
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
本発明は、癌特異的トランス－スプライシングリボザイム及びその用途に関する。
テロメラーゼ（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ）は、リボ核タンパク質（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）であって、染色体の３'末端に存在するテロメアの終端部位にＴＴＡＧＧＧ配列を繰り返して添加することで、ＤＮＡ複製時に短くなるテロメア部位を修復して細胞の永続的な増殖を可能にする。テロメラーゼは、癌細胞の永続性（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｔｙ）及び増殖能力を調節する最も重要な酵素のうち一つであって、造血細胞及び８０～９０％の癌細胞がテロメラーゼ活性を有した一方、癌細胞隣近の正常細胞は、その活性を有しなく、さらに進行された転移癌の永続的成長にテロメラーゼの再活性が主な影響を及ばしている。
ヒトのテロメラーゼは、基質ＲＮＡで作用するヒトテロメラーゼＲＮＡ（ｈｕｍａｎｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ＲＮＡ、ｈＴＲ)と触媒機能をするヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈｕｍａｎ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ｈＴＥＲＴ）の２個で構成されている。ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子は、テロメラーゼ活性と比例して発現され、細胞内のｈＴＥＲＴレベルと細胞のテロメラーゼ活性は深い相関関係がある。特に、癌患者の９０％以上でＴＥＲＴ活性が観察される。
最近、このようなｈＴＥＲＴを標的にするトランス－スプライシングリボザイム（ｔｒａｎｓ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｒｉｂｏｚｙｍｅ）が知られるにつれ、これを用いた癌治療剤を開発しようとする試みが活発に進行されている。しかし、トランス－スプライシングリボザイムと組織特異的なプローモーターとの組み合わせは、高い組織特異性を示す反面、発現効率が非常に低いため、治療効率の側面における短所が問題になる。また、幹細胞、造血母細胞、生殖細胞、正常的に細胞分裂する肝細胞（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｎｏｒｍａｌ ｌｉｖｅｒ ｃｅｌｌ）などの正常細胞でもテロメラーゼ活性が現われるので、ｈＴＥＲＴを標的にする治療が上記細胞に対する毒性を誘発することができる。肝細胞は、弱いが正常肝細胞の５％がテロメラーゼ活性を有しており、再生中の肝（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｌｉｖｅｒ）は、テロメラーゼ活性が増加することで知られている。特に、肝細胞癌腫（Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＨＣＣ）は、大部分肝硬化が同伴され、このような肝硬化部位で再生結節を構成する非腫瘍性の肝細胞（ｎｏｎ－ｔｕｍｏｒｏｕｓ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）では、低いレベルであるがＴＥＲＴが発現される。
大韓民国公開特許第１０－２０１６－００３８６７４号は、組織特異的プローモーター、癌特異的遺伝子を標的にするトランス－スプライシングリボザイム、及び前記リボザイムの３'エクソンに連結された目的遺伝子を含むリボザイム－目的遺伝子発現カセットにマイクロＲＮＡ－１２２（ｍｉｃｒｏＲＮＡ－１２２、ｍｉＲ－１２２）を認識する核酸配列が追加的に連結された組換えベクターと、それから発現されたリボザイムの肝癌予防又は治療用途を開示している。前記ｍｉＲ－１２２は、正常の肝で非常に過量発現されると知られたマイクロＲＮＡとして、肝癌に進行される場合、その発現が低くなる。 従来技術は、このような現象に基づいてリボザイム発現ベクターの３'ＵＴＲ部位にｍｉＲ－１２２標的部位を導入することで、肝に伝達されたリボザイムが正常肝では過発現されたｍｉＲ－１２２により発現されないが、ｍｉＲ－１２２レベルが低くなった肝癌では発現されて作用するようにしたものである。
しかし、従来技術は、治療効果を示すためにベクターが導入されたウイルスを高い濃度で処理しなければならない問題があった。また、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ、ＨＣＶ）の感染が原因である肝癌組織では、多くの場合正常肝よりｍｉＲ－１２２の発現が増加するという報告があって、このようにｍｉＲ－１２２の発現が増加されている肝癌や肝癌以外の他の癌に適用可能であるかが問題になった。
本発明は、前記のような問題を解決するためのものであって、安全性及び発現効率に優れた癌特異的トランス－スプライシングリボザイムの癌治療用途を提供することにその目的がある。
本発明は、（ｉ）サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、ＣＭＶ）プローモーター；及び（ｉｉ）癌特異的遺伝子を標的にするトランス－スプライシングリボザイム、前記リボザイムの３'エクソンに連結された目的遺伝子を含む、リボザイム－目的遺伝子発現カセットを含み、前記発現カセットは、リボザイム－目的遺伝子発現カセットの５'末端にスプライシング供与体／スプライシング受容体配列（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｄｏｎｏｒ／ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｃｃｅｐｔｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＳＤ／ＳＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が連結され、３'末端にＷＰＲＥ（Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｅｌｅｍｅｎｔ）が連結されたもので、（ｉｉｉ）前記ＷＰＲＥの３'末端にマイクロＲＮＡ－１２２（ｍｉｃｒｏＲＮＡ－１２２、ｍｉＲ－１２２）を認識する核酸配列が追加に連結されたことを特徴とする組換えベクターを提供する。
また、本発明は、前記組換えベクターを含む遺伝子伝達システムを提供する。
また、本発明は、前記組換えベクターから発現されたリボザイムを提供する。
また、本発明は、前記組換えベクター、遺伝子伝達システム又はリボザイムを有効成分で含む癌の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
本発明によるトランス－スプライシングリボザイムは、正常組織には作用せず癌組織で特異的に発現されるので、安全性が高く、転写後レベルで発現効率に優れるので、癌の治療において有用に用いられ得る。具体的に、本発明の組換えベクターは、ＣＭＶプローモーター、ＳＤ／ＳＡ及びＷＰＲＥ配列を保有することで、リボザイムの発現効率が高く、ｍｉＲ－１２２Ｔを保有してｍｉＲ－１２２により活性が調節できるので、安全性に優れる。したがって、ＨＣＶが原因である肝癌のうち、ｍｉＲ－１２２の発現が正常組織より癌組織で高く現われる一部肝癌を除けば、全ての肝癌の治療において効果的に用いられ得、ｍｉＲ－１２２を実質的に発現しない他の癌の治療にも効果的に用いられ得る。
以下、本発明についてより詳細に説明する。
本発明で、ある部分がある構成要素を「含む」とするとき、これは、特に反対される記載がない限り、他の構成要素を除外するものではなく、他の構成要素をさらに含むことができることを意味する。
＜組換えベクター＞
本発明の一様態は、（ｉ）サイトメガロウイルスプローモーター；及び（ｉｉ）癌特異的遺伝子配列を標的にするトランス－スプライシングリボザイム、前記リボザイムの３'エクソンに連結された目的遺伝子を含む、リボザイム－目的遺伝子発現カセットを含み、前記発現カセットは、リボザイム－目的遺伝子発現カセットの５'末端にスプライシング供与体／スプライシング受容体配列（ＳＤ／ＳＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が連結され、３'末端にＷＰＲＥが連結されたもので、（ｉｉｉ）前記ＷＰＲＥの３'末端にマイクロＲＮＡ－１２２を認識する核酸配列が追加に連結されたことを特徴とする組換えベクターである。
本発明の一様態は、（ｉ）サイトメガロウイルスプローモーター；及び（ｉｉ）癌特異的遺伝子配列を標的にするトランス－スプライシングリボザイム、前記リボザイムの３'エクソンに連結された目的遺伝子を含む、リボザイム－目的遺伝子発現カセットを含み、前記発現カセットは、リボザイム－目的遺伝子発現カセットの５'末端にスプライシング供与体／スプライシング受容体配列（ＳＤ／ＳＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が連結され、３'末端にＷＰＲＥが連結されたもので、（ｉｉｉ）前記ＷＰＲＥの３'末端にマイクロＲＮＡ－１２２を認識する核酸配列が追加に連結されたことを特徴とする組換えベクターである。
本発明による組換えベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プローモーターを用い、リボザイム及び目的遺伝子の両末端にＳＤ／ＳＡ配列及びＷＰＲＥを構成要素で含ませるとき、生体内で癌治療効果が卓越であることに基づき、ＣＭＶプローモーター、ＳＤ／ＳＡ配列及びＷＰＲＥを同時に用い、ｍｉＲ－１２２を認識する核酸配列を追加に含むことで、肝癌細胞だけではなく多様な癌細胞の治療を可能にしたことを特徴とする。
本発明で用いられた用語「ベクター」は、適当な宿主細胞で目的遺伝子を発現することができる発現ベクターであって、ベクター内に含まれた遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須的な調節要素を含む遺伝子構造物のことを言う。
本発明で用いられた用語「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、一般的機能を行う核酸発現調節配列と目的する遺伝子をコーディングする核酸配列が機能的に連結（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｌｉｎｋａｇｅ）されていることを言う。
例えば、リボザイム暗号化配列をプローモーターに作動可能に連結させることによって、リボザイム暗号化配列の発現は、プローモーターの影響又は調節下に置かれるようになる。２本の核酸配列（リボザイム暗号化配列及びこの配列の５'末端のプローモーター部位配列）は、プローモーター作用が誘導されてリボザイム暗号化配列が転写されると、作動可能に連結されたものであり、前記２本の配列間の連結特性がフレームシフト突然変異（ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を誘導しなく、発現調節配列がリボザイムの発現を阻害しない場合、作動可能に連結されたと言う。組換えベクターとの作動可能な連結は、当該技術の分野においてよく知られた遺伝子組換え技術を用いて製造することができ、部位－特異的ＤＮＡ切断及び連結は、当該技術の分野において一般的に知られた酵素などを用いることができる。
本発明によるベクターは、プローモーター、オペレーター、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル、エンハンサーのような発現調節要素外にも、膜標的化又は分泌のためのシグナル配列又はリーダー配列を含み、目的に応じて様々に製造され得る。ベクターのプローモーターは、構成的又は誘導性であってもよい。また、発現ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択性マーカーを含み、複製可能な発現ベクターの場合は複製起点を含むことができる。ベクターは、自己複製するか宿主ＤＮＡに統合され得る。
本発明によるベクターは、好ましくは、プラスミドベクター、コズミドベクター又はウイルスベクターなどであってもよく、より好ましくは、ウイルスベクターであってもよい。前記ウイルスベクターは、好ましくは、レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、例えば、ヒト免疫欠乏ウイルス（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ、ＨＩＶ）、マウス白血病ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ、ＭＬＶ）、鳥類肉腫／白血病ウイルス（Ａｖｉａｎ ｓａｒｃｏｍａ／ｌｅｕｃｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＡＳＬＶ）、脾臓壊死ウイルス（Ｓｐｌｅｅｎ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＳＮＶ）、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ、ＲＳＶ）、マウス乳房腫瘍ウイルス（Ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ、ＭＭＴＶ）など、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノ関連ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ、ＡＡＶ）又は単純ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ、ＨＳＶ）などに由来したベクターであってもよいが、これに制限されない。本発明による組換えベクターは、さらに好ましくは、組換えアデノウイルスベクターであってもよい。
本発明で用いられた用語「発現カセット」は、ＣＭＶプローモーターとトランス－スプライシングリボザイム－目的遺伝子を含み、トランス－スプライシングリボザイム－目的遺伝子の各末端にＳＤ／ＳＡ配列及びＷＰＲＥ配列が存在し、前記ＷＰＲＥの３'末端には、ｍｉＲ－１２２を認識する核酸配列が追加に連結されたことを特徴として、トランス－スプライシングリボザイム－目的遺伝子を発現させることができる単位カセットを意味する。
本発明によるトランス－スプライシングリボザイム－目的遺伝子発現カセットは、前記トランス－スプライシングリボザイム－目的遺伝子が連結された配列に転写レベルを調節する配列、すなわち、調節誘導体をさらに含むものであってもよい。これに制限されるものではないが、本発明では、特にスプライシング供与体／スプライシング受容体配列（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｄｏｎｏｒ／ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｃｃｅｐｔｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＳＤ／ＳＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）及び／又はＷＰＲＥ（Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｅｌｅｍｅｎｔ）が連結され、前記ＷＰＲＥの３'末端には、ｍｉＲ－１２２を認識する配列が追加に連結されていてもよい。これにより、リボザイム－目的遺伝子の発現レベルを調節することができ、ｍｉＲ－１２２が一定レベル以下であるときのみリボザイムが発現されるようにして正常肝細胞に及ぶ影響を最小化することができる。
本発明によるリボザイム－目的遺伝子発現カセットは、好ましくは、リボザイムの５'末端にスプライシング供与体／スプライシング受容体配列（ＳＤ／ＳＡ）が連結され、目的遺伝子の３'末端には、ＷＰＲＥが連結され、前記ＷＰＲＥの３'末端にｍｉＲ－１２２を認識する配列が連結されたものであってもよい。
本発明によるＳＤ／ＳＡは、転写開始（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）とＲＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）ＩＩのプロセッシング（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）及びｍＲＮＡの核から細胞質への移動（ｎｕｃｌｅｏｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｅｘｐｏｒｔ）を増加させ、本発明によるＷＰＲＥは、ｍＲＮＡのプロセッシングと核から細胞質への移動を増加させることによって、それぞれｐｒｅ－ｍＲＮＡのレベルを増加させることができる。上記のような構成を通じて、細胞内でリボザイムのＲＮＡレベルを顕著に増加させて生体内で癌細胞の死滅は高めると共に癌細胞特異的に発現が行われるようにすることで、正常細胞に及ぼす毒性は却って減少させることができる。
本発明によるＳＤ／ＳＡ配列は、ＲＮＡ転写体のイントロンを除去するスプライシング反応において切り離されるイントロンの開始部分と終止部分に該当する配列であって、一般的に、ＳＤ配列は、イントロン５'末端のＧＵ配列であってもよく、ＳＡ配列は、イントロンの３'末端のＡＧ配列であってもよい。
本発明によるＷＰＲＥは、ＤＮＡに転写を促進する３次構造を誘導して遺伝子の発現を増加させる配列を意味する。
本発明で、前記ＳＤ／ＳＡ配列及びＷＰＲＥ配列は、それぞれ配列番号６及び配列番号７の配列を含むことができるが、目的遺伝子発現カセット内に存在しながら目的遺伝子の発現を促進させることができる限り、これに制限されない。
本発明によるｍｉＲ－１２２を認識する核酸配列は、本明細書内でｍｉＲ－１２２Ｔ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ－１２２ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ）と名付けられる。前記ｍｉＲ－１２２Ｔは、配列番号５の配列を１回以上含むことができ、例えば、１回～１０回、好ましくは、１回～５回、より好ましくは、１回～３回繰り返して含むことができる。ｍｉＲ－１２２は、正常肝細胞では正常的に発現されるが、肝癌細胞では発現量が減少する特徴がある。これを用いて肝癌細胞に対する敏感度及び特異度を増加させた治療剤を開発することができ、本発明では、目的遺伝子が連結されたリボザイムにｍｉＲ－１２２を認識する核酸配列を連結することで肝癌細胞特異的なリボザイムの発現が行われるようにした。
本発明の一実施例で、ＳＤ／ＳＡ及びＷＰＲＥが追加に連結された場合、リボザイムの発現が増加して細胞死を誘導する効果が一層増加する。また、ｍｉＲ－１２２を標的にするｍｉＲ－１２２Ｔを連結することで、ｍｉＲ－１２２の発現が正常的に行われる正常肝細胞に対しては細胞死を誘導せず、ｍｉＲ－１２２の発現が減少された肝癌細胞に対してのみ細胞死を誘導して肝癌細胞特異的に治療が可能であることを確認した（図２）。
本発明で用いられた用語「癌特異的遺伝子」は、癌細胞でのみ特異的に発現されるか又は顕著に過発現される遺伝子を意味する。前記癌特異的遺伝子は、本発明によるリボザイムが癌特異的に作用できる特徴を付加することができる。このような癌特異的遺伝子は、好ましくは、ＴＥＲＴ（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）ｍＲＮＡ、ＡＦＰ（ａｌｐｈａｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）ｍＲＮＡ、ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）ｍＲＮＡ、ＰＳＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）ｍＲＮＡ、ＣＫＡＰ２（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）ｍＲＮＡ又はｍｕｔａｎｔ ＲＡＳ（Ｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ）ｍＲＮＡであってもよく、より好ましくは、ＴＥＲＴ（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）ｍＲＮＡであってもよく、さらに好ましくは、ｈＴＥＲＴ（ｈｕｍａｎ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）ｍＲＮＡ配列であってもよい。
本発明で用いられた用語「ＴＥＲＴ」は、癌細胞の永続性（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｔｙ）及び増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）能力を調節する最も重要な酵素のうち一つであって、染色体に末端小粒（ｔｅｌｏｍｅｒｅ）構造を形成して染色体の末端を保護する役目を通じて細胞の老化を抑制する酵素を意味する。正常的な細胞では、細胞が分裂する度に末端小粒の長さが少しずつ短くなり、ついには遺伝物質が損失されて、細胞が死滅するようになる。しかし、癌細胞では、この酵素が末端小粒を継続的に延長させるため、細胞が死滅せず、癌細胞の不滅性に直接寄与することにより、癌の治療において重大な障害要素と知られている。本発明では、癌特異的遺伝子として配列番号２の配列を含むｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡを用いることができるが、これに制限されない。
本発明で用いられた用語「プローモーター」は、ＤＮＡの一部分に転写を開始することができるようにＲＮＡ重合酵素の結合に関与する。一般的に、標的遺伝子に隣接してその上流に位置しており、ＲＮＡ重合酵素又はＲＮＡ重合酵素を誘導するタンパク質である転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）が結合する場所であって、前記酵素又はタンパク質が正確な転写開始部位に位置するように誘導することができる。すなわち、センスストランド（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）で転写しようとする遺伝子の５'部位に位置してＲＮＡ重合酵素が直接又は転写因子を介して該当位置に結合して、標的遺伝子に対するｍＲＮＡ合成を開始するように誘導するものであって、特定の遺伝子配列を有する。
本発明によるプローモーターは、遺伝子の発現を高めるための観点で、配列番号１の配列を含むサイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、ＣＭＶ）プローモーターであることが好ましい。
本発明の一実施例で、本発明による組換えベクターにＣＭＶプローモーターを導入すると、リボザイムの発現効率に優れ、組換えベクターが保有したｍｉＲ－１２２ＴによりｍｉＲ－１２２の調節を受けるが、高いリボザイム発現によってある程度のｍｉＲ－１２２発現にもかかわらず細胞死を誘導して抗癌効果を示すことを確認した（図３及び図４）。
本発明で用いられた用語「リボザイム」は、酵素のように作用するＲＮＡ分子又はそのＲＮＡ分子を含むタンパク質から構成される分子であって、ＲＮＡ酵素又は触媒的ＲＮＡとも呼ばれる。明確な３次構造を有するＲＮＡ分子で化学反応を行い、触媒的又は自己触媒的特性を有する。一部のリボザイムは、自己又は他のＲＮＡ分子を切断して活性を阻害し、他のリボザイムは、リボソームのアミノ基転移酵素（ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）活性を触媒することが確認された。このようなリボザイムには、ハンマーヘッド（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）リボザイム、ＶＳリボザイム及びヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ）リボザイムなどが含まれ得る。
本発明によるリボザイムは、トランス－スプライシング反応を通じて癌特異的遺伝子の活性を阻害させて選択的な抗癌効果を示すことができるだけではなく、癌治療遺伝子と接合された形態で発現されて癌治療遺伝子を活性化させることができる。したがって、癌特異的遺伝子を不活性化させ、癌治療遺伝子を活性化させることができる特性を示すものであれば、如何なる形態のものでも使用することができる。
本発明によるリボザイムは、好ましくは、上述したｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡを標的するリボザイムであってもよく、ｈＴＥＲＴが過多発現される癌細胞を標的にしてｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡを特異的に切断して発現を抑制させ、治療遺伝子を特異的に発現させる役目を果たすことができる。
本発明で用いられた用語「トランス－スプライシング（ｔｒａｎｓ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ）」は、互いに異なる遺伝子からのＲＮＡを互いに連結することを意味する。好ましくは、癌に特異的なｈＴＥＲＴのｍＲＮＡを認知してトランス－スプライシングする能力が検証されたｈＴＥＲＴ標的トランス－スプライシンググループＩリボザイムを用いるものであってもよい。
本発明で用いられた用語「目的遺伝子」は、前記リボザイムにより癌特異的遺伝子のｍＲＮＡと連結されて発現が誘導される遺伝子を意味する。
本発明による目的遺伝子は、好ましくは、癌治療用遺伝子又はレポーター遺伝子であってもよく、より好ましくは、癌治療用遺伝子であってもよい。
本発明で用いられた用語「癌治療遺伝子（ａｎｔｉ－ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｅｎｅ）」は、癌細胞で発現するとき治療学的効果を示すポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド配列を意味する。前記癌治療遺伝子は、前記リボザイムと接合された形態で発現されるか又は独立的に発現されて抗癌活性を示すことができる。このような癌治療遺伝子は、好ましくは、薬剤感受性遺伝子、細胞死滅遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、細胞毒性遺伝子、腫瘍抑制因子遺伝子、抗原性遺伝子、サイトカイン遺伝子及び抗新生血管生成遺伝子からなる群より選択される一つ以上であってもよく、より好ましくは、薬剤感受性遺伝子であってもよい。
本発明では、前記癌治療遺伝子を単独で用いるか、又は二つ以上の遺伝子を複合的に用いることができる。
本発明による薬剤感受性遺伝子（ｄｒｕｇ－ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ ｇｅｎｅ）は、毒性のない前駆体（ｐｒｏｄｒｕｇ）を毒性物質に転換させる酵素をコーディングする遺伝子であって、遺伝子が導入された細胞が死滅するようになるので、自殺遺伝子（ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ）とも呼ばれる。すなわち、正常細胞には毒性のない前駆体を全身に投与したとき、癌細胞にのみ前駆体が毒性代謝物（ｔｏｘｉｃ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ）に転換されて薬剤に対する感受性を変化させることで癌細胞を破壊させる方法である。このような薬剤感受性遺伝子は、好ましくは、ガンシクロビル（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）を前駆体で用いるＨＳＶｔｋ（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ－ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）遺伝子、又は５－フルオロシトシン（５－ｆｌｕｏｒｏｃｙｔｏｓｉｎｅ、５－ＦＣ）を前駆体にする大膓菌のシトシン脱アミノ酵素（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ、ＣＤ）遺伝子であってもよく、より好ましくは、配列番号４の配列を含むＨＳＶｔｋ遺伝子であってもよい。
本発明による細胞死滅遺伝子（ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｇｅｎｅ）は、発現されるとプログラムされた細胞死を誘導するヌクレオチド配列を言う。当業者に公知された細胞死滅遺伝子には、ｐ５３、アデノウイルスＥ３－１１．６Ｋ（Ａｄ２及びＡｄ５由来）又はアデノウイルスＥ３－１０．５Ｋ（Ａｄ由来）、アデノウイルスＥ４遺伝子、ｐ５３経路遺伝子及びカスパーゼをコーディングする遺伝子が含まれ得る。
本発明による細胞増殖抑制遺伝子（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ ｇｅｎｅ）は、細胞内で発現されて細胞周期の途中で細胞周期を停止させるヌクレオチド配列を意味する。その例として、ｐ２１、網膜芽細胞腫遺伝子、Ｅ２Ｆ－Ｒｂ融合タンパク質遺伝子、サイクリン従属性キナーゼ抑制因子をコーディングする遺伝子(例えば、ｐ１６、ｐ１５、ｐ１８及びｐ１９)、成長中止特異性ホメオバックス（ｇｒｏｗｔｈ ａｒｒｅｓｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｏｍｅｏｂｏｘ、ＧＡＸ）遺伝子などがあり、これに制限されるものではない。
本発明による細胞毒性遺伝子（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｇｅｎｅ）は、細胞内で発現されて毒性効果を現わすヌクレオチド配列を言う。その例として、シュードモナス外毒素（ｅｘｏｔｏｘｉｎ）、リシン毒素、ジフテリア毒素などをコーディングするヌクレオチド配列などがあり、これに制限されるものではない。
本発明による腫瘍抑制因子遺伝子（ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ）は、標的細胞内で発現されて腫瘍表現型を抑制することができるか細胞死滅を誘導することができるヌクレオチド配列を意味する。代表的なものとして、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α、ＴＮＦ－α）、ｐ５３遺伝子、ＡＰＣ遺伝子、ＤＰＣ－４／Ｓｍａｄ４遺伝子、ＢＲＣＡ－１遺伝子、ＢＲＣＡ－２遺伝子、ＷＴ－１遺伝子、網膜芽細胞腫遺伝子、ＭＭＡＣ－１遺伝子、大腸腺腫症ポリポーシスタンパク質（ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ ｃｏｉｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）、欠損された結腸腫瘍（ＤＣＣ）遺伝子、ＭＭＳＣ－２遺伝子、ＮＦ－１遺伝子、染色体３ｐ２１．３に位置した鼻咽喉腫瘍抑制因子遺伝子、ＭＴＳ１遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＮＦ－１遺伝子、ＮＦ－２遺伝子、ＶＨＬ遺伝子又はｓＰＤ－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－１）が含まれ得る。
本発明による抗原性遺伝子（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｇｅｎｅ）は、標的細胞内で発現されて免疫システムで認識できる細胞表面抗原性タンパク質を生産するヌクレオチド配列を言う。当業者に公知された抗原性遺伝子の例には、癌胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ、ＣＥＡ）及びｐ５３が含まれ得る。
本発明によるサイトカイン遺伝子（ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｇｅｎｅ）は、細胞内で発現されてサイトカインを生成するヌクレオチド配列を意味する。代表的なものとして、ＧＭＣＳＦ、インターロイキン（ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、ＩＬ－１０、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０）、インターフェロンα、β、γ（インターフェロンα－２ｂ）及びインターフェロンα－２α－１のような融合体などが含まれ得る。
本発明による抗新生血管生成遺伝子（ａｎｔｉ－ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｇｅｎｅ）は、発現されて抗新生血管生成因子を細胞の外に放出するヌクレオチド配列を言う。その例として、アンギオスタチン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の抑制因子、エンドスタチンなどが含まれ得る。
本発明で用いられた用語「ＨＳＶ－ｔｋ（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ－ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）」は、単純疱疹ウイルスに由来するチミジンリン酸化酵素を意味する。この酵素は、毒性のない前駆体（ｐｒｏｄｒｕｇ）を毒性物質に転換させることで、その遺伝子が移入された細胞を死滅させる薬剤感受性遺伝子の代表的な例である。本発明において、ＨＳＶｔｋ遺伝子は、本発明によるリボザイムに接合された形態で発現されて抗癌活性を示す癌治療遺伝子として用いられ得る。このようなＨＳＶｔｋ遺伝子は、好ましくは、ジェンバンク（ｇｅｎｂａｎｋ）登録番号ＡＡＰ１３９４３、Ｐ０３１７６、ＡＡＡ４５８１１、Ｐ０４４０７、Ｑ９ＱＮＦ７、ＫＩＢＥＴ３、Ｐ１７４０２、Ｐ０６４７８、Ｐ０６４７９、ＡＡＢ３０９１７、Ｐ０８３３３、ＢＡＢ８４１０７、ＡＡＰ１３８８５、ＡＡＬ７３９９０、ＡＡＧ４０８４２、ＢＡＢ１１９４２、ＮＰ＿０４４６２４、ＮＰ＿０４４４９２、ＣＡＢ０６７４７などに記載されたものであってもよい。
本発明で用いられた用語「レポーター遺伝子」は、本発明の一例による組換えベクターの導入有無又はリボザイムの発現効率をモニタリングするために用いられる遺伝子であって、感染された細胞又は組織の損傷を伴うことなくモニタリングすることができる遺伝子であれば、制限なしに用いられ得る。好ましくは、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、変形された緑色蛍光タンパク質（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｍＧＦＰ）、増強された緑色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、変形された赤色蛍光タンパク質（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｍＲＦＰ）、増強された赤色蛍光タンパク質（ＥＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、増強された青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、増強された黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）又は増強されたシアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）であってもよい。
目的遺伝子としてレポーター遺伝子を挿入して癌細胞特異的なリボザイムの発現程度を観察することができ、特に、本発明のリボザイムは、プローモーター及びマイクロＲＮＡ標的部位を含んでいるため、正常細胞では発現されなく癌細胞特異的に発現することができる。これを用いて特定の組織で癌が発生したか否かを診断するのに適用できることは、当業者にとって自明なことである。
＜遺伝子伝達システム＞
本発明の他の様態は、本発明による組換えベクターを含む遺伝子伝達システムである。
本発明の他の様態は、本発明による組換えベクターを含む遺伝子伝達システムである。
本発明で用いられた用語「遺伝子伝達システム（ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）」は、目的する遺伝子及び／又は核酸配列の細胞内部への伝達効率を高めて発現効率を増加させることができるシステムを意味し、ウイルス媒介システム及び非ウイルスシステムに分類され得る。
ウイルス媒介システムは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターのようなウイルス性ベクターを用い、ヒト細胞に感染を起こすウイルス固有の細胞内浸透機序を用いるので、非ウイルス性システムより細胞内遺伝子伝達効率が比較的高いと知られている。また、細胞内に入った後、非ウイルス性ベクターは、エンドソームがリボソームと融合された後にエンドリボソームで遺伝子が分解される問題点があるが、ウイルス性ベクターは、リボソームを通過せず核内に遺伝子を伝達する機序により遺伝子の損失が小さいので遺伝子伝達効率が高い長所がある。
本発明で用いられるウイルス性ベクターは、前記組換えベクターで説明したように、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスなどに由来したベクターであってもよい。このようなウイルス性ベクターは、ウイルス粒子に組み立てられた後、感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）のような形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）方法で細胞の内部に導入され得る。
本発明の一実施例で、遺伝子伝達体の例として上述した組換えベクターを含む組換えアデノウイルスを考案した。すなわち、前記組換えアデノウイルスは、癌特異的遺伝子に特異的なトランス－スプライシングリボザイムを発現する組換えベクターを目的する細胞（例えば、癌細胞）に伝達する機能を行い、細胞内に伝達された組換えベクターは、細胞内の転写システムにより発現される。発現されたトランス－スプライシングリボザイムは、癌細胞内にたくさん存在する癌特異的遺伝子の転写体にリボザイムに連結された目的遺伝子を挿入することができる。
前記非ウイルス性システムは、核酸及び／又は遺伝子の伝達媒介体として陽イオン性脂質伝達体又は陽イオン性高分子伝達体などを用いるか、電気穿孔法を用いる方法である。
陽イオン性脂質伝達体は、主に陽イオン性脂質からなったナノメートルサイズのリボソームや脂質素材ナノ粒子の陽電荷を用いて陰電荷である遺伝子、遺伝子を含む発現ベクター又は核酸と複合体を形成させた後、この複合体を貪食作用によって細胞内に伝達する方法である。細胞内に伝達された複合体は、エンドソームからリボソームに１次伝達された後、細胞質に抜け出て発現される。陽イオン性高分子伝達体は、脂質の代わりに高分子を用いること以外は、陽イオン性脂質伝達体と類似な方式で遺伝子を伝達し、代表的な陽イオン性高分子としては、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）、ポリＬ－リシン（ｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ）、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）などがある。
したがって、本発明の組換えベクターが陽イオン性脂質伝達体又は陽イオン性高分子伝達体と結合して形成された複合体は、遺伝子伝達体で用いられ得る。
本発明で、前記遺伝子伝達システムは、上述した組換えベクターを含み、ウイルス媒介システム及び非ウイルスシステムに全て用いられ得るが、ウイルス媒介システムを用いることが好ましい。
＜リボザイム＞
本発明の他の様態は、本発明による組換えベクターから発現されたリボザイムである。
本発明の他の様態は、本発明による組換えベクターから発現されたリボザイムである。
本発明による組換えベクター又はリボザイムに関する内容は、上述した通りである。
＜薬学的組成物＞
本発明の他の様態は、本発明による組換えベクター、前記組換えベクターを含む遺伝子伝達システム又はリボザイムを有効成分で含む癌の予防又は治療用薬学的組成物である。
本発明の他の様態は、本発明による組換えベクター、前記組換えベクターを含む遺伝子伝達システム又はリボザイムを有効成分で含む癌の予防又は治療用薬学的組成物である。
本発明による組換えベクター、遺伝子伝達システム又はリボザイムに関する内容は、上述した通りである。
本発明で用いられた用語「癌」は、細胞の正常的な分裂、分化及び死滅の調節機能に問題が発生して非正常的に過多増殖し、周囲組織及び臓器に浸潤して塊りを形成し、既存の構造を破壊するか変形させた状態を意味する。
本発明による癌は、好ましくは、肝癌、膠芽腫、胆管癌、肺癌、膵臓癌、黒色腫、骨癌、乳房癌、大腸癌、胃癌、前立腺癌、白血病、子宮癌、卵巣癌、リンパ種又は脳癌であってもよく、より好ましくは、肝癌、膠芽腫又は胆管癌であってもよく、さらに好ましくは、肝癌であってもよい。
また、本発明による癌は、好ましくは、癌組織で発現されるｍｉＲ－１２２のコピー数（発現量）が前記薬学的組成物により癌組織で発現されるリボザイムのコピー数の１００倍未満のものであってもよい。
本発明の一実施例で、細胞死を誘導することができるｍｉＲ－１２２Ｔを保有したｈＴＥＲＴ標的リボザイムの発現量と細胞内ｍｉＲ－１２２の発現量を比較した結果、リボザイムに対するｍｉＲ－１２２の割合が高くなるほどリボザイムの発現が減少して細胞死の誘導効果が減少した（図４、８及び９）。したがって、癌組織内のｍｉＲ－１２２発現量によって抗癌効果を現わすためのリボザイムの量を類推してリボザイムを発現するアデノウイルスの注入量を決めることができる。具体的に、ｍｉＲ－１２２の最小コピー数がリボザイムのコピー数の約１００倍以上であると、ｍｉＲ－１２２標的部位を有するリボザイムの機能（発現）が弱化されるので、癌組織で発現されるｍｉＲ－１２２のコピー数が本発明による薬学的組成物により癌組織で発現されるリボザイムのコピー数の１００倍未満であれば、高い抗癌効能が得られることを確認した（図１０）。
また、本発明による癌は、好ましくは、癌組織でｍｉＲ－１２２が実質的に発現されない癌であってもよい。前記「癌組織でｍｉＲ－１２２が実質的に発現されない癌」とは、癌組織でｍｉＲ－１２２が発現されるが、ｍｉＲ－１２２標的部位を有するリボザイムの機能に実質的な影響を及ぼさないほどに癌組織で発現されるｍｉＲ－１２２のコピー数が少ない癌を意味する。
本発明の一実施例で、癌組織でｍｉＲ－１２２が実質的に発現されない大腸癌、膠芽腫、黒色腫、子宮頸部癌、肺癌、骨肉種、乳房癌及び胆管癌細胞株で本発明によるリボザイムの抗癌効能を確認した（図１３及び図１４）。
また、本発明による肝癌は、好ましくは、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）、肝癌組織でｍｉＲ－１２２の発現が低下されるＣ型肝炎ウイルス、アルコール、慢性肝炎、肝硬変症、非アルコール性脂肪肝疾患、アフラトキシン及び家族力からなる群より選択されるいずれか一つ以上を原因とするものであってもよい。
本発明の一実施例で、多様な病因因子により発生した肝癌でｍｉＲ－１２２の発現量を分析した。その結果、ＨＣＶが病因である肝癌のうち一部と残り病因による肝癌は、正常の肝組織でのｍｉＲ－１２２発現量が肝癌組織での発現量より高かった。したがって、本発明によるリボザイムは、ｍｉＲ－１２２により正常肝組織ではその機能が弱化され、ｍｉＲ－１２２の発現が減少した肝癌組織では作用できることを確認した（図１１）。
また、本発明による肝癌は、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）に抵抗性があるものであってもよい。ソラフェニブは、進行性肝癌に対する１次治療剤であり、本発明の一実施例で、本発明によるリボザイムは、ソラフェニブに対して感受性がある細胞株とない細胞株の両方で細胞死を誘発するので、ソラフェニブにより治療されないソラフェニブ抵抗性肝癌患者群にも適用が可能であることを確認した（図６）。
本発明で用いられた用語「予防」は、本発明による組換えベクターを含む組成物の投与により癌を抑制させるか発病を遅延させる全ての行為を意味する。
本発明で用いられた用語「治療」は、本発明によるベクターを含む組成物の投与により癌が好転されるか良好に変更する全ての行為を意味する。
本発明による薬学的組成物は、 薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含むことができる。本発明の薬学的組成物に用いられる薬学的に許容可能な担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、 澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、炭酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油などが挙げられる。
本発明の薬学的組成物は、目的とする方法によって経口投与するか非経口投与することができるが、非経口で投与することが好ましい。
本発明の一実施例によると、本発明による薬学的組成物は、静脈内、動脈内、癌組織内又は皮下に直接投与され得、注射剤で投与され得る。本発明による注射剤は、患者に投与するときそのまま用いられるように滅菌媒質に分散された形態であってもよく、投与するとき注射用蒸溜水を加えて適切な濃度で分散させた後に投与する形態であってもよい。また、注射剤で製造されるとき、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などと混合され得、単位投薬アンプル又は多重投薬形態で製造され得る。
本発明の薬学的組成物の投与量は、患者の状態及び体重、重症度、薬物形態、投与経路及び時間によって異なるが、当業者によって適切に選択され得る。一方、本発明による薬学的組成物は、単独で用いられるか、又は外科的手術療法などの補助治療方法と並行して用いられ得る。
以下、本明細書を具体的に説明するために実施例を挙げて詳細に説明する。しかし、本明細書による実施例は、様々な他の形態に変形されることができ、本明細書の範囲が下で詳述する実施例によって限定されるものではない。本明細書の実施例は、当業界において平均的な知識を有した者に本明細書をより完全に説明するために提供されるものである。
実施例１：ｈＴＥＲＴ標的トランスースプライシングリボザイム組換えベクターの製作
ｍｉＲ－１２２標的部位であるｍｉＲ－１２２Ｔを有するとともに高い発現率を示すｈＴＥＲＴ標的トランス－スプライシングリボザイムを製作するために、既存のトランス－スプライシングリボザイムを変形した組換えベクターを考案した。
ｍｉＲ－１２２標的部位であるｍｉＲ－１２２Ｔを有するとともに高い発現率を示すｈＴＥＲＴ標的トランス－スプライシングリボザイムを製作するために、既存のトランス－スプライシングリボザイムを変形した組換えベクターを考案した。
具体的に、ｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡの＋２１番部位を標的にして、３２６ヌクレオチド長さのアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）配列（配列番号８）を保有し、治療遺伝子としてＨＳＶ－ｔｋを保有する既存のトランス－スプライシングリボザイムにＣＭＶプローモーターを導入した。ＣＭＶプローモーターとリボザイムの間には、ＳＶ４０イントロンスプライシング供与体／受容体（ＳＶ４０ ｉｎｔｒｏｎ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｄｏｎｏｒ／ａｃｃｅｐｔｏｒ、ＳＤ／ＳＡ）配列を挿入して転写効率を高めた。治療遺伝子であるＨＳＶ－ｔｋの３'部位には、Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓの転写後調節因子（ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｅｌｅｍｅｎｔ）であるＷＰＲＥを挿入して治療遺伝子のタンパク質発現効率を高め、コンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）の３'末端部位に３コピー（ｃｏｐｙ)のｍｉＲ－１２２Ｔを挿入してｍｉＲ－１２２により調節されるようにした。
考案されたトランス－スプライシングリボザイムの全体ベクター構造は、図１に示した通りであり、これをＥＣＲＴ－１２２Ｔと名付けた。
実施例２：ｍｉＲ－１２２を発現するＨｅｐ３Ｂ安定化細胞株（ｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）の製作
Ｈｅｐ３Ｂ細胞を３５ｍｍ培養皿に２×１０５個分注した後、３７℃、５％のＣＯ２インキュベーターで培養した。Ｔｅｔ－ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ（ＴｅｔＲ）ｍｉＲ－１２２発現ベクター１μｇとＯｐｔｉ－ＭＥＭ １００μｌを１．５ｍｌチューブに入れて混ぜ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００ ５μｌと無血清培地１００μｌを他の１．５ｍｌチューブに入れて混合した後、５分間常温に放置した。その後、上記二つのチューブの内容物を混合し、リボソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）形態の複合体をなすように２０分間常温で保管した。２０分後、チューブを１０秒間遠心分離した後にそれぞれの細胞上に振りかけて形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、４時間後に新しい培地に交替した。３７℃、５％のＣＯ２インキュベーターで２４時間の間培養した後、１Ｘ ＰＢＳで細胞を洗浄し、トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）を処理して細胞を離した後、１００ｍｍ培養皿に移して培養した。２日～３日に一回ずつ抗生剤であるブラストサイジン（ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）を５μｇ／ｍｌの濃度で含む培地に交替した。細胞クローンを選別してそれぞれを育てた後、ＲＴ－ＰＣＲでＴｅｔＲの発現を確認した。
Ｈｅｐ３Ｂ細胞を３５ｍｍ培養皿に２×１０５個分注した後、３７℃、５％のＣＯ２インキュベーターで培養した。Ｔｅｔ－ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ（ＴｅｔＲ）ｍｉＲ－１２２発現ベクター１μｇとＯｐｔｉ－ＭＥＭ １００μｌを１．５ｍｌチューブに入れて混ぜ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００ ５μｌと無血清培地１００μｌを他の１．５ｍｌチューブに入れて混合した後、５分間常温に放置した。その後、上記二つのチューブの内容物を混合し、リボソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）形態の複合体をなすように２０分間常温で保管した。２０分後、チューブを１０秒間遠心分離した後にそれぞれの細胞上に振りかけて形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、４時間後に新しい培地に交替した。３７℃、５％のＣＯ２インキュベーターで２４時間の間培養した後、１Ｘ ＰＢＳで細胞を洗浄し、トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）を処理して細胞を離した後、１００ｍｍ培養皿に移して培養した。２日～３日に一回ずつ抗生剤であるブラストサイジン（ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）を５μｇ／ｍｌの濃度で含む培地に交替した。細胞クローンを選別してそれぞれを育てた後、ＲＴ－ＰＣＲでＴｅｔＲの発現を確認した。
実験例１：ＥＣＲＴ－１２２Ｔの抗癌効能の確認（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
１－１．ｍｉＲ－１２２発現によるＥＣＲＴ－１２２Ｔの抗癌効能の比較
実施例１で製作したＥＣＲＴ－１２２Ｔの抗癌効能がｍｉＲ－１２２発現有無によって変わるかを確認した。
１－１．ｍｉＲ－１２２発現によるＥＣＲＴ－１２２Ｔの抗癌効能の比較
実施例１で製作したＥＣＲＴ－１２２Ｔの抗癌効能がｍｉＲ－１２２発現有無によって変わるかを確認した。
ｈＴＥＲＴは発現してｍｉＲ－１２２は発現しないＨｅｐ３Ｂ細胞株、ｈＴＥＲＴ及びｍｉＲ－１２２を全て発現するＨｕｈ－７．５肝癌細胞株を準備し、１×１０４個の細胞を９６－ウェルに分注した。翌日、細胞に処理する感染多重度（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、ＭＯＩ）によってアデノウイルス（ｔｙｐｅ５）を細胞培養培地で段階別に希釈し、総体積１００μｌで作った後に各ウェルに処理した。用いたベクターは次のようである：ｍｉＲ－１２２Ｔを有するＥＣＲＴ－１２２Ｔ；ｍｉＲ－１２２Ｔを有しないＥＣＲＴ；及びＣＭＶプローモーター、ｈＴＥＲＴ標的トランス－スプライシングリボザイム及びＨＳＶｔｋで構成されたＣＲＴ。アデノウイルスを処理して２４時間後にＧＣＶ（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）を細胞培養培地に希釈し、最終的に、２００μＭになるように混ぜた後に各ウェルに処理した。２日間隔で総３回のＧＣＶを処理し、最後のＧＣＶ処理２４時間後にＭＴＳ ａｓｓａｙ試薬を入れた後、４５０ｎｍの波長で吸光度を測定して生きている細胞を確認した。
その結果、図２の（ａ）に示したように、ｍｉＲ－１２２を発現しないＨｅｐ３Ｂ細胞株では、ｍｉＲ－１２２標的部位の有無に関係なく（ＥＣＲＴ、ＥＣＲＴ－１２２Ｔ）同一な細胞死が誘導された。ＳＤ／ＳＡ、ＷＰＲＥ及びｍｉＲ－１２２Ｔを保有しないＣＲＴは、細胞死を誘導したが、ＥＣＲＴ及びＥＣＲＴ－１２２Ｔより効果が落ちた。その結果から、ＥＣＲＴ及びＥＣＲＴ－１２２Ｔに導入された因子によりリボザイムの作用効率が高くなったことが分かった。
一方、図２の（ｂ）に示したように、ｍｉＲ－１２２を発現するＨｕｈ－７．５細胞株では、ＥＣＲＴ－１２２Ｔによる細胞死誘導効果が減少した。それを通じて、ＥＣＲＴ－１２２Ｔに導入されたｍｉＲ－１２２標的部位にｍｉＲ－１２２が作用してリボザイムの作用を妨害したことが分かった。しかし、ＥＣＲＴ－１２２Ｔは相変らずＣＲＴを処理したレベルの細胞死を誘導した。それを通じて、ｍｉＲ－１２２ＴによりｍｉＲ－１２２の調節を受けたが、リボザイムの高い発現によりある程度のｍｉＲ－１２２発現にもかかわらず抗癌効果を示すことができることを確認した。
１－２．プローモーターによるＥＣＲＴ－１２２Ｔの抗癌効能の比較
実施例１で製作したＥＣＲＴ－１２２Ｔの抗癌効果を構成が異なる他のベクターと比較した。
実施例１で製作したＥＣＲＴ－１２２Ｔの抗癌効果を構成が異なる他のベクターと比較した。
具体的に、ｈＴＥＲＴは発現されてｍｉＲ－１２２は発現されないＨｅｐ３Ｂ、ＳＮＵ３９８及びＳＮＵ４４９細胞株と、ｈＴＥＲＴ及びｍｉＲ－１２２が全て発現されるＨｕｈ－７及びＨｕｈ－７．５肝癌細胞株を準備した。前記細胞株に、ＥＣＲＴ－１２２Ｔ、ＥＣＲＴ、ＣＲＴに肝特異的プローモーターであるＰＥＰＣＫプローモーター、ＳＤ／ＳＡ、ＷＰＲＥ及びｍｉＲ－１２２Ｔを導入したＥＰＲＴ－１２２Ｔ又はｍｉＲ－１２２Ｔを有しないＥＰＲＴを処理した後、相対的な細胞生存率を比較した。細胞増殖分析は、実験例１－１と同一の方法で行った。
その結果、図３に示したように、ｍｉＲ－１２２を発現しない細胞株では、ｍｉＲ－１２２標的部位の有無に関係なく（ＥＣＲＴ、ＥＣＲＴ－１２２Ｔ）同一な細胞死が誘導された。ＥＣＲＴ－１２２Ｔは、ＥＰＲＴ－１２２Ｔより低いウイルスＭＯＩ処理サンプルでも高い割合で細胞死滅を誘導した。それを通じて、組織特異的プローモーターであるＰＥＰＣＫよりＣＭＶプローモーターが一層強力にリボザイムの発現を増加させて少ない量のウイルスが処理されたサンプルでも高い抗癌効能を示すことができることが分かった。また、ＥＣＲＴ－１２２Ｔは、ｍｉＲ－１２２ＴがないＥＣＲＴと同一な抗癌効能を示したことから、ｍｉＲ－１２２Ｔ導入によるリボザイムの活性低下がないことが分かった。
一方、図４に示したように、ｍｉＲ－１２２を発現する細胞株では、ＥＰＲＴ－１２２Ｔによる細胞死が観察されなかった。その結果から、ｍｉＲ－１２２がｍｉＲ－１２２Ｔに作用してリボザイムの発現を減少させたことが分かった。しかし、ＥＣＲＴ－１２２Ｔは、ｍｉＲ－１２２の発現にもかかわらず細胞死滅を誘導したことから、ＰＥＰＣＫよりＣＭＶプローモーターが一層強力にリボザイムの発現を増加させることが分かった。ただし、ｍｉＲ－１２２のない細胞株と異なりＥＣＲＴ－１２２Ｔによる細胞死程度がＥＣＲＴよりは低かったことから、ＥＣＲＴ－１２２ＴのｍｉＲ－１２２ＴがｍｉＲ－１２２により調節されてリボザイムの発現が低くなったことが分かった。
追加に、多様な肝癌細胞株でＣＲＴ－１２２Ｔ、ＥＣＲＴ－１２２Ｔ及びＥＰＲＴ－１２２Ｔの抗癌効果を比較した。その結果、図５に示したように、ほとんど全ての肝癌細胞株でＥＣＲＴ－１２２ＴのＭＯＩが増加するによって細胞死が増加し、比較群（ＣＲＴ－１２２Ｔ及びＥＰＲＴ－１２２Ｔ）よりＥＣＲＴ－１２２Ｔの抗癌効果が優れた。
本実験例の結果から、リボザイムにＣＭＶプローモーター、ＳＤ／ＳＡ及びＷＰＲＥを導入することで、リボザイムの発現が増加して抗癌効果が増加し、ｍｉＲ－１２２Ｔの導入によってｍｉＲ－１２２によるリボザイムの活性が調節できるので、ＥＣＲＴ－１２２Ｔは、肝癌治療において抗癌効能と安全性が最適化された物質であることが分かった。
１－３．ＥＣＲＴ－１２２Ｔのソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）抵抗性肝癌への適用
進行性肝癌に対して、１次治療剤で用いられているソラフェニブに感受性のある肝癌でＥＣＲＴ－１２２Ｔの抗癌効能を確認した。
進行性肝癌に対して、１次治療剤で用いられているソラフェニブに感受性のある肝癌でＥＣＲＴ－１２２Ｔの抗癌効能を確認した。
具体的に、ソラフェニブに対して感受性のある肝癌患者又は感受性のない（抵抗性がある）肝癌患者由来の細胞株を準備し、ＥＣＲＴ－１２２Ｔ又はＥＣＲＴを処理した後、相対的な細胞生存率を比較した。細胞増殖分析は、実験例１－１と同一の方法で行った。
その結果、図６に示したように、ソラフェニブに対して感受性のある細胞株と感受性のない細胞株で全て細胞死が観察された。その結果から、ＥＣＲＴ－１２２Ｔは、ソラフェニブにより治療できないソラフェニブ抵抗性肝癌患者群にも適用可能であることが分かった。
実験例２：ＥＣＲＴ－１２２Ｔの抗癌効能の確認（ｉｎ ｖｉｖｏ）
肝癌動物モデルでＥＣＲＴ－１２２Ｔによる抗癌効能及び肝毒性を確認した。
肝癌動物モデルでＥＣＲＴ－１２２Ｔによる抗癌効能及び肝毒性を確認した。
脾臓内肝転移マウスモデルに、ｍｉＲ－１２２を発現しないＨｅｐ３Ｂ細胞株を脾臓に注入して同所の（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）多発性（ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ）肝癌を誘発し、ＥＣＲＴ又はＥＣＲＴ－１２２Ｔを発現するアデノウイルスを尾静脈注入（ｔａｉｌ－ｖｅｉｎ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）で全身投与した後、ＧＣＶを注入して抗癌効能を確認した。
その結果、図７の（ａ）及び図７の（ｂ）に示したように、対照群（ＰＢＳ注入）に比べてＥＣＲＴ－１２２Ｔを注入した実験群では、大部分の癌が死滅した。このとき、同一量のウイルスを注入した実験群で、ｍｉＲ－１２２Ｔを保有しないＥＣＲＴよりＥＣＲＴ－１２２Ｔが一層優れた抗癌効能を示した。その結果から、ｍｉＲ－１２２Ｔの導入により正常肝組織ではリボザイムの発現が抑制されるので、正常肝では安全性を確保することができ、癌組織では高い抗癌効能を示すことが分かった。また、図７の（ｃ）に示したように、対照群（ＰＢＳ注入）に比べてＥＣＲＴ－１２２Ｔを注入した実験群は類似なレベルの肝毒性数値を示した。その結果から、アデノウイルスを用いたＥＣＲＴ－１２２Ｔ生体内伝達が適切であることが分かった。
実験例３：ｍｉＲ－１２２発現量とリボザイム発現量の相関関係
ｍｉＲ－１２２の発現量によるリボザイムの作用を分析するために、ｍｉＲ－１２２発現量とリボザイム発現量の相関関係を分析した。
ｍｉＲ－１２２の発現量によるリボザイムの作用を分析するために、ｍｉＲ－１２２発現量とリボザイム発現量の相関関係を分析した。
ｈＴＥＲＴ及びｍｉＲ－１２２が全て発現されるＨｕｈ－７及びＨｕｈ－７．５肝癌細胞株を準備し、ＥＣＲＴ、ＥＣＲＴ－１２２Ｔ、ＥＰＲＴ又はＥＰＲＴ－１２２Ｔを発現するアデノウイルスを処理した後、ＴＲＩ試薬で総ＲＮＡ ５μｇを抽出した。
抽出した総ＲＮＡに、ランダムプライマー（５'－ＮＮＮＮＮＮ－３'）で逆転写過程を行ってｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡ ２μｌに１０× ＰＣＲバッファー、ｄＮＴＰ １０ｍＭ、それぞれのプライマー１０ｐｍｏｌｅ、ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２．５ｕｎｉｔ、１０ｘ ｃｙｂｅｒｇｒｅｅｎ １μｌを添加した後、ｄＨ２Ｏで最終体積７０μｌを合わせた。これを２０μｌずつ分注し、９５℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で３０秒、４０サイクルの条件でリアルタイムＰＣＲを行ってリボザイムの発現量を確認した。リボザイムのＰＣＲに用いたプライマー配列は、下記表１の通りである。
次に、抽出した総ＲＮＡからｍａｔｕｒｅ ｍｉＲ－１２２ ｐｒｏｂｅ（ＡＢＩ）を用いてｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡ ２μｌに２０ｘ Ｔａｑｍａｎ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ａｓｓａｙ ３．５μｌ、２ｘ Ｔａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＩＩ（ＡＢＩ）３５μｌを添加して、ｄＨ２Ｏで最終体積７０μｌを合わせた。これを２０μｌずつ分注し、９５℃で１５秒、６０℃で６０秒、４０サイクルの条件でＰＣＲを行ってｍｉＲ－１２２の発現量を確認した。ｍｉＲ－１２２のＰＣＲは、ＡＢＩ社で提供するＴａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅを用いた（Ａｓｓａｙ ＩＤ：００２２４５）。
その結果、図８の（ｃ）に示したように、Ｈｕｈ－７細胞株では、ｍｉＲ－１２２が約１０００～２０００コピー程度発現されることを確認し、図８の（ｂ）に示したように、ＥＣＲＴ－１２２Ｔ又はＥＣＲＴ処理群は全てＭＯＩが増加するによってリボザイムの発現量が増加することが分かった。また、感染濃度５ＭＯＩ以下では、ＥＣＲＴ処理群よりＥＣＲＴ－１２２Ｔ処理群でリボザイムが一層たくさん発現されるが、１０ ＭＯＩを処理すると、ＥＣＲＴ処理群よりＥＣＲＴ－１２２Ｔ処理群でリボザイム発現量が減少した。それを通じて、Ｈｕｈ－７が発現するｍｉＲ－１２２がｍｉＲ－１２２Ｔに作用してリボザイムの発現を減少させたことが分かった。
一方、ＥＣＲＴ－１２２Ｔを１０ ＭＯＩで処理したときのリボザイム及びｍｉＲ－１２２のコピー数割合は、約１：２．５（６００コピー：１５００コピー）であって、ＭＯＩによる細胞死割合を確認した図４の（ａ）で、１０ ＭＯＩでもＥＣＲＴ－１２２Ｔによる細胞死が誘導されることは、リボザイムに対するｍｉＲ－１２２の割合が低くてｍｉＲ－１２２によるリボザイムの発現抑制が不十分に行われたからであることが分かった。
一方、図９の（ｃ）に示したように、Ｈｕｈ－７．５細胞株では、ｍｉＲ－１２２が約１００００～１５０００コピー程度発現された。これは、Ｈｕｈ－７より高い数値として、リボザイムによる細胞死誘導程度がＨｕｈ－７でより低いことが分かった。また、図９の（ｂ）に示したように、Ｈｕｈ－７とは反対に、同一な感染条件でＥＣＲＴ－１２２Ｔ処理群よりＥＣＲＴ処理群のリボザイム発現量が同一であるか高く、１０ ＭＯＩを処理した場合、発現されるリボザイムのコピー数がＨｕｈ－７（約６００コピー）でより一層低かった（約１２０コピー）。前記結果とＭＯＩによる細胞死割合を示した図４の（ｂ）の結果から、リボザイムとｍｉＲ－１２２の割合が高くなるほどリボザイムの発現が減少して細胞死誘導効果が減少することが分かった。
実験例４：ｍｉＲ－１２２の発現量によるリボザイムの作用
ｍｉＲ－１２２の発現量とリボザイムの相互作用をより詳しく分析するため, ｍｉＲ－１２２の発現量によるリボザイムの作用を分析した。
ｍｉＲ－１２２の発現量とリボザイムの相互作用をより詳しく分析するため, ｍｉＲ－１２２の発現量によるリボザイムの作用を分析した。
実施例２で製作したｍｉＲ－１２２テトラサイクリン－オンシステムを有した安定化細胞株（Ｈｅｐ３Ｂ）に、ＥＰＲＴ、ＥＰＲＴ－１２２Ｔ又はｍｉＲ－１２２が結合しないように任意に配列を変えた突然変異ｍｉＲ－１２２標的部位を保有したＥＰＲＴ－ｍｔ １２２Ｔベクターを発現するアデノウイルスを処理した後、相対的な細胞生存率を比較した。実施例２で製作した細胞株は、テトラサイクリン処理濃度に依存的にｍｉＲ－１２２の発現が増加し、発現程度がそれぞれ異なる３個のクローンの安定化細胞株を用いて実験を行った。細胞増殖分析は、実験例１－１と同一の方法で行った。
その結果、図１０に示したように、ＥＰＲＴ－１２２Ｔ処理群は、テトラサイクリン処理濃度が増加するによってｍｉＲ－１２２コピー数が増加し、それによって、ＥＰＲＴ－１２２Ｔによる細胞死が減少した。一方、ＥＰＲＴ、ＥＰＲＴ－ｍｔ １２２Ｔ処理群又は陽性対照群であるＰＴの場合、ｍｉＲ－１２２発現量とは関係なく細胞死誘導効果が維持された。また、テトラサイクリン処理濃度が増加するによってｍｉＲ－１２２のコピー数は増加し、それによって、リボザイムのコピー数は減少した。前記効果は、実験に用いた３個の独立的クローンで全て同一であった。
前記実験で確認されたｍｉＲ－１２２とリボザイムのコピー数間の相関関係を数値化した。その結果、下記表２に示したように、細胞株ごとにその割合は異なるが、ｍｉＲ－１２２の最小コピー数がリボザイムコピー数の約１００倍以上であると、ｍｉＲ－１２２標的部位を有するリボザイムの機能が顕著に弱化された。この結果から、ｍｉＲ－１２２標的部位を保有したトランス－スプライシングリボザイムは、ｍｉＲ－１２２により発現が調節できるので、ｍｉＲ－１２２の発現量によって抗癌効果を示すためのリボザイムの量を類推してリボザイムを発現するアデノウイルスの注入量を決定することができることが分かった。
実験例５：肝癌患者組織でｍｉＲ－１２２の発現分析
肝癌患者の正常肝組織と肝癌組織でｍｉＲ－１２２の発現をリアルタイムＰＣＲで分析した。
肝癌患者の正常肝組織と肝癌組織でｍｉＲ－１２２の発現をリアルタイムＰＣＲで分析した。
具体的に、大韓民国内肝癌患者７０人の人体由来物組織の分譲を受けてｍｉＲ－１２２発現を分析した。肝癌患者の正常肝組織、肝癌組織をそれぞれ１ｍｌのＴｒｉｚｏｌ溶液に浸した後、均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）して粉砕して常温に５分間放置した。その後、０．２ｍｌのクロロホルムを添加して常温で３分間放置し、これを１２，０００ｒｐｍで４℃で３０分間遠心分離して上層液のみ分離した。分離した上層液に０．５ｍｌのイソプロパノールを添加して－２０℃で反応させ、これをさらに１４，０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離してＲＮＡペレットを得た後、１００μｌのＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒにとかした。抽出したＲＮＡ ５０ｎｇをＴａｑＭａｎ ｍｉＲＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ方法によって逆転写してｃＤＮＡを合成し、合成されたｃＤＮＡ １μｌをＴａｑＭａｎ ２Ｘ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘと混ぜてＡＢＩ ＳｔｅｐＯｎｅ ｐｌｕｓ装備でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＡＢＩ社で提供するＴａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅを用いて行った（Ａｓｓａｙ ＩＤ：００２２４５）。
その結果、図１１の（ａ）に示したように、７０人のうち４８人の患者（６８．６％）で正常肝組織より肝癌組織でのｍｉＲ－１２２の発現量が低く現われた。病因によって分析した結果、図１１の（ｂ）、図１１の（ｄ）～図１１の（ｆ）に示したように、ＨＢＶ連関患者８人のうち８人、アルコール連関患者２人のうち２人、慢性肝炎連関患者７人のうち６人、その以外の肝癌病因患者３５人のうち２６人が肝癌組織でｍｉＲ－１２２の発現が正常肝組織より低いことで現われた。一方に、図１１の（ｃ）に示したように、ＨＣＶ連関患者群では１８人のうち６人だけが肝癌組織でｍｉＲ－１２２の発現が低く現われた。その結果から、ＨＣＶが原因である肝癌では他の病因とは反対に、むしろ肝癌が進行される場合にｍｉＲ－１２２の発現が増加又は維持される患者がもっと多いことが分かった。
また、統計分析を実施した結果、下記表３に示したように、ＨＣＶ連関患者の場合、ｍｉＲ－１２２の発現が正常肝組織より肝癌組織で高く観察される現象が統計的に有意であり、他の肝炎ウイルスであるＨＢＶの場合は、全ての肝癌組織でｍｉＲ－１２２の発現が減少される現象が統計的に有意であった。その結果から、ＨＣＶ連関患者の肝癌組織でｍｉＲ－１２２の発現が減少されないか増加する結果は統計的に意味があり、これは肝炎ウイルスによる一般的現象ではないＨＣＶ特異的現象であることが分かった。
前記結果から、ＨＣＶが病因である肝癌のうちｍｉＲ－１２２発現が正常肝組織より肝癌組織で増加された患者を除いた残り肝癌患者にＥＣＲＴ－１２２Ｔを適用すると、ｍｉＲ－１２２により正常肝組織では作用せず、ｍｉＲ－１２２の発現が減少している肝癌組織では作用するので、癌特異的に抗癌作用を示すことができる。
追加に、患者の肝癌細胞に由来した肝癌細胞株でｈＴＥＲＴのｍＲＮＡ及びタンパク質レベル及びｍｉＲ－１２２レベルを分析した。肝癌細胞株を培養して当業界に知られた方法によってＲＮＡ及びタンパク質を分離した。ＲＮＡは、ｑＲＴ－ＰＣＴに用い、タンパク質は電気永動してウエスタンブロッティングを行った。
その結果、図１２の（ａ）及び図１２の（ｂ）に示したように、大部分の肝癌細胞株でＥＣＲＴ－１２２Ｔの標的分子であるｈＴＥＲＴ ｍＲＮＡが発現されることを確認することができ、ｈＴＥＲＴタンパク質レベルも類似な傾向を示した。また、肝癌で発現が減少しているという報告と同様に各肝癌細胞株でｍｉＲ－１２２がほとんど発現されないことを確認した（図１２の（ｃ））。
実験例６：ｍｉＲ－１２２を発現しない肝癌外の他の癌腫への適用
６－１．細胞実験（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
ｍｉＲ－１２２を実質的に発現しない組織の癌細胞株でＥＣＲＴ－１２２Ｔの抗癌効能を確認した。
６－１．細胞実験（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
ｍｉＲ－１２２を実質的に発現しない組織の癌細胞株でＥＣＲＴ－１２２Ｔの抗癌効能を確認した。
具体的に、ｈＴＥＲＴを発現する膠芽腫細胞株、大腸癌細胞株、黒色腫細胞株、子宮頸部癌細胞株、肺癌細胞株、骨肉種細胞株、乳房癌細胞株及び胆管癌細胞株に、ＥＣＲＴ－１２２Ｔを発現するアデノウイルスを処理した後、相対的な細胞生存率を比較した。細胞増殖分析は、実験例１－１と同一の方法で行った。
その結果、図１３に示したように、ほとんど全ての癌細胞株でＭＯＩが増加するによって細胞死が増加し、比較群（ＣＲＴ－１２２Ｔ及びＥＰＲＴ－１２２Ｔ）よりＥＣＲＴ－１２２Ｔの抗癌効果が優れた。具体的に、肝組織特異的プローモーターを含むＥＰＲＴ－１２２Ｔは、細胞死を誘導することができない場合が多く、ＣＲＴ－１２２Ｔは、細胞死は誘導するがＥＣＲＴ－１２２Ｔよりその効率が低かった。
膠芽腫細胞株であるＴ９８ＧとＵ８７ＭＧ細胞株では、約１ ＭＯＩ以下で９０％程度の細胞死が現われ、ＬＮ２２９細胞株では、５ ＭＯＩ以上で９０％程度の細胞死が現われた。また、子宮頸部癌細胞株であるＨｅＬａ細胞株では、０．５ ＭＯＩ以下で９０％以上の細胞死が現われ、黒色腫細胞株であるＳＫ－ＭＥＬ２細胞株では、約１ ＭＯＩ以下で９０％程度の細胞死を確認することができた。
また、図１４に示したように、胆管癌細胞であるＳＮＵ４７８とＳＮＵ８６９細胞株でもＭＯＩが増加するによって細胞死が増加した。
６－２．動物実験（ｉｎ ｖｉｖｏ）
６週齢の雄Ｂａｌｂ／ｃ－ｎｕｎｕマウスに膠芽腫細胞であるＬＮ２２９細胞株１ｘ１０７個（１００μｌ）又はＵ８７ＭＧ細胞株５ｘ１０６個（１００μｌ）を皮下に注入して腫瘍形成を誘導した。腫瘍が一定サイズに成長すると、ＥＣＲＴ－１２２Ｔを発現するアデノウイルスを１．０ｘ１０９ＶＰ（１００μｌ）用量で２日に一回ずつ総３回注入した。ＧＣＶは、一番目のウイルス注入２４時間後から５０ｍｇ／ｋｇ用量を一日に２回ずつ１０日間投与（総２０回）した。
６週齢の雄Ｂａｌｂ／ｃ－ｎｕｎｕマウスに膠芽腫細胞であるＬＮ２２９細胞株１ｘ１０７個（１００μｌ）又はＵ８７ＭＧ細胞株５ｘ１０６個（１００μｌ）を皮下に注入して腫瘍形成を誘導した。腫瘍が一定サイズに成長すると、ＥＣＲＴ－１２２Ｔを発現するアデノウイルスを１．０ｘ１０９ＶＰ（１００μｌ）用量で２日に一回ずつ総３回注入した。ＧＣＶは、一番目のウイルス注入２４時間後から５０ｍｇ／ｋｇ用量を一日に２回ずつ１０日間投与（総２０回）した。
実験結果、図１５に示したように、対照群（Ａｄ－ＥＧＦＰ注入）では腫瘍サイズが継続増加するが、ＥＣＲＴ－１２２Ｔを注入した実験群では腫瘍がほとんど生長しないことが分かり、腫瘍の重量も全てのＥＣＲＴ－１２２Ｔを注入した実験群で少なかった。また、図１６に示したように、Ｕ８７ＭＧ細胞株を用いた実験でもＥＣＲＴ－１２２Ｔの腫瘍生長抑制効果を確認することができた。
本実験例の結果から、ＥＣＲＴ－１２２Ｔから発現されるリボザイムは、肝癌以外にｍｉＲ－１２２を発現しない多様な癌腫に対しても効果的に適用できることを確認した。また、ＥＣＲＴ－１２２Ｔを肝癌以外の他の癌に対する抗癌剤で全身又は局所投与すると、正常肝に導入されるが、このとき、ｍｉＲ－１２２Ｔの作用により正常肝での毒性誘導を抑制することができる。
実験例７：ＥＣＲＴ－１２２Ｔの生体内分布の確認
７－１．静脈注入
正常ＩＣＲマウスにＥＣＲＴ－１２２Ｔを発現するアデノウイルスを２．５ｘ１０１０ＶＰ用量で静脈注射で注入し、８日、１１日及び１５日後に各主要臓器を分離してＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを主型にして、リボザイム検出用プライマーセットでＰＣＲを行って主要組織でＥＣＲＴ－１２２Ｔの分布を確認した。
７－１．静脈注入
正常ＩＣＲマウスにＥＣＲＴ－１２２Ｔを発現するアデノウイルスを２．５ｘ１０１０ＶＰ用量で静脈注射で注入し、８日、１１日及び１５日後に各主要臓器を分離してＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを主型にして、リボザイム検出用プライマーセットでＰＣＲを行って主要組織でＥＣＲＴ－１２２Ｔの分布を確認した。
その結果、図１７に示したように、注入した大部分のアデノウイルスが肝に分布することを確認することで、肝癌を標的にするＥＣＲＴ－１２２Ｔの伝達にアデノウイルスが適合であることが分かった。 また、注入したＥＣＲＴ－１２２Ｔは、全身導入した後１１日目に血液内で完全に消失し、全身注入８日後から２週以内にウイルス性ＤＮＡの７０％が消失されることを確認することができた。
７－２．肝動脈（ｈｅｐａｔｉｃ ａｒｔｅｒｙ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）注入
ラット（ｒａｔ）にＥＣＲＴ－１２２Ｔを発現するアデノウイルスを２．５ｘ１０１１ＶＰ用量で肝動脈注射（ｈｅｐａｔｉｃ ａｒｔｅｒｙ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）で注入し、前記７－１と同一の方法で主要組織でＥＣＲＴ－１２２Ｔの分布を確認した。
ラット（ｒａｔ）にＥＣＲＴ－１２２Ｔを発現するアデノウイルスを２．５ｘ１０１１ＶＰ用量で肝動脈注射（ｈｅｐａｔｉｃ ａｒｔｅｒｙ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）で注入し、前記７－１と同一の方法で主要組織でＥＣＲＴ－１２２Ｔの分布を確認した。
その結果、図１８に示したように、注入後２日目に肝で最も多い量のＥＣＲＴ－１２２Ｔ ＤＮＡが現われることを確認することができ、このような傾向は、注入後１４日まで維持された。ウイルス性ＤＮＡは、注入後１４日に肝で９８％が消失され、他の組織でもほとんど大部分消失された。
また、ラットの各臓器でゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を分離してＨＳＶｔｋ ＤＮＡを定量した。その結果、図１９に示したように、注入後１４日目にほとんど全ての臓器でＨＳＶｔｋ ＤＮＡが消失されることが分かった。
ラットの肝で総ＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲでリボザイム発現程度を確認した。 その結果、図２０の（ａ）に示したように、ＥＣＲＴ－１２２Ｔを注入した後２日目からリボザイムが発現されることが分かり、注入後１４日には、２日目に比べて約３．８５％のリボザイムのみ発現されることを確認することができた。ゲノムＤＮＡでも確認した結果、図２０の（ｂ）に示したように、注入後２日目に比べて１４日目には、アデノウイルスのｇＤＮＡがほとんど消失されて約２．２３％程度のみ残っていることが分かった。
前記結果を通じて、ＥＣＲＴ－１２２Ｔアデノウイルスを静脈又は動脈に注入しても生体内分布は類似に現われ、注入後１４日が経過すると、ウイルス性ＤＮＡはほとんど消失されることが分かった。
実験例８：ＧＣＶ処理有無によるＥＣＲＴ－１２２Ｔの毒性確認
８－１．ＧＣＶ未処理
正常ＩＣＲマウスにＥＣＲＴ－１２２Ｔアデノウイルスを１回注入し、注入後１５日、２９日にＡＳＴ及びＡＬＴレベルを測定した。
８－１．ＧＣＶ未処理
正常ＩＣＲマウスにＥＣＲＴ－１２２Ｔアデノウイルスを１回注入し、注入後１５日、２９日にＡＳＴ及びＡＬＴレベルを測定した。
その結果、図２１に示したように、２．５ｘ１０１０ＶＰ実験群で微弱な毒性が現われ、残り用量の実験群では、ＰＢＳ注入群と類似な程度のＡＳＴ及びＡＬＴレベルが現われて毒性がほとんどないことが分かった。
また、図２２に示したように、実験期間の間マウスの体重、飼料消費量及び肝重量において異常所見は確認されなかった。アデノウイルスを静脈内に１回投与した後２９日後に実施した肝の組織病理学的検査結果、図２３に示したように、２．５ｘ１０１０ＶＰ実験群（Ｇ３）で肝細胞壊死（矢印）と炎症が観察されて微弱な肝損傷が誘発されたことが分かった。１．０ｘ１０１０ＶＰ実験群（Ｇ２）では、炎症性細胞が局所的に浸潤（矢印）されたが、肝損傷は誘発されないことを確認することができた。図２１で、ｃｖは、中心静脈（ｃｅｎｔｒａｌ ｖｅｉｎ）、ｐは、門脈空間（ｐｏｒｔａｌ ａｒｅａ）を意味する。
下記表４に組織病理学的検査結果を整理した。
８－２．ＧＣＶ処理
正常ＩＣＲマウスにＥＣＲＴ－１２２Ｔアデノウイルスを注入し、ＧＣＶを１日２回ずつ１０日間投与した後、ＡＳＴ及びＡＬＴレベルを測定した。
正常ＩＣＲマウスにＥＣＲＴ－１２２Ｔアデノウイルスを注入し、ＧＣＶを１日２回ずつ１０日間投与した後、ＡＳＴ及びＡＬＴレベルを測定した。
その結果、図２４に示したように、２．５ｘ１０１０ＶＰ実験群を除いた残り用量の実験群では、対照群（ＰＢＳ注入群）と類似な程度のＡＳＴ及びＡＬＴレベルが現われて毒性がほとんどないことが分かった。
また、図２５の（ａ）及び図２５の（ｂ）に示したように、実験過程の間マウスの体重、飼料消費量は有意味した変化がなく、図２５の（ｃ）に示したように、肝重量も異常所見が確認されなかった。
肝の組織病理学的分析結果、図２６に示したように、ＰＢＳ注入群（Ｇ１）、ＰＢＳ＋ＧＣＶ投与群（Ｇ２）及び０．２５ｘ１０１０ＶＰ＋ＧＣＶ投与群（Ｇ５）では、異常所見が確認されなかった。一方、１．０ｘ１０１０ＶＰ＋ＧＣＶ投与群（Ｇ３）では、中性区の浸潤により形成された局所微細膿瘍（ｍｉｃｒｏａｂｓｃｅｓｓ）（太い矢印）が確認されたが、肝損傷は誘発されなかった。２．５ｘ１０１０ＶＰ＋ＧＣＶ投与群（Ｇ４）では、大きい核を有する肥大化された肝細胞、怪死性肝細胞（太い矢印）、多発性炎症細胞浸潤（原）、増加された肝細胞類似分裂（太い矢印）及び胆細管（ｂ）周辺のリンパ構成細胞の浸潤が観察されて肝損傷が誘発されたことが分かった。ＧＣＶを投与しないＧ６（１．０ｘ１０１０ＶＰ注入群）では、類似分裂する肝細胞（矢印）の数が多少増加した。
下記表５に組織病理学的検査結果を整理した。
ＡＳＴ及びＡＬＴレベル、組織病理学的検査結果、アデノウイルスを２．５ｘ１０１０ＶＰ／ｈｅａｄ用量で静脈内に投与し、ＧＣＶを１日２回、１０日間投与すると、肝細胞怪死と炎症を誘発するなど肝損傷が誘導されることで現われた。しかし、０．２５ｘ１０１０ＶＰ／ｈｅａｄ及び１．０ｘ１０１０ＶＰ／ｈｅａｄで単独又はＧＣＶと併用投与したとき、投与後１５日までは肝損傷と関連されたＡＳＴ及びＡＬＴ数値が増加したが、２９日目に実施した組織学的検査では、肝でアデノウイルス投与と関連されたと判断される意味のある毒性学的変化は観察されなかった。
比較例１：ＣＲＴ－１２２Ｔ及びＥＣＲＴ－１２２Ｔの効能の比較
１－１．抗癌効能の比較
マウス国際標準モデルにＨｅｐ３Ｂ細胞を３ｘ１０６個注入して肝癌形成を誘導し、ＣＲＴ－１２２Ｔ又はＥＣＲＴ－１２２Ｔベクターを含むアデノウイルスを投与して抗癌効能を比較した。前記ＣＲＴ－１２２Ｔは、ＥＣＲＴ－１２２ＴでＳＶ４０イントロンスプライシング供与体／受容体（ＳＤ／ＳＡ）配列、ＷＰＲＥが除去された形態である。
１－１．抗癌効能の比較
マウス国際標準モデルにＨｅｐ３Ｂ細胞を３ｘ１０６個注入して肝癌形成を誘導し、ＣＲＴ－１２２Ｔ又はＥＣＲＴ－１２２Ｔベクターを含むアデノウイルスを投与して抗癌効能を比較した。前記ＣＲＴ－１２２Ｔは、ＥＣＲＴ－１２２ＴでＳＶ４０イントロンスプライシング供与体／受容体（ＳＤ／ＳＡ）配列、ＷＰＲＥが除去された形態である。
その結果、図２７に示したように、アデノウイルスを２．５ｘ１０１０ＶＰ（ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅ）で注入したとき、ＣＲＴ－１２２Ｔに比べてＥＣＲＴ－１２２Ｔの抗癌効能がさらに優れたことが分かった。ＣＲＴ－１２２Ｔの抗癌効能は、ＥＣＲＴ－１２２Ｔを１．２５ｘ１０１０ＶＰ用量で投与したものと類似であった。
１－２．抗癌効能の比較
マウス異種移植皮下モデル（ｍｏｕｓｅ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｍｏｄｅｌ）にＳＮＵ３９８細胞を注入して腫瘍形成を誘導し、腫瘍が一定サイズ以上に成長すると、ＣＲＴ－１２２Ｔ又はＥＣＲＴ－１２２Ｔベクターを含むアデノウイルスを１ｘ１０９ＶＰ用量で２日に一回ずつ、総２回癌組織内に注入（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、Ｉ．Ｔ．ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。 アデノウイルスを注入した後、マウスを飼育しながら３日間隔で腫瘍サイズ、体重を測定し、２２日後にマウスを犠牲させて最終腫瘍サイズ、肝重量、ＡＳＴ（ａｓｐａｒｔａｔｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）及びＡＬＴ（ａｌａｎｉｎｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）レベルを測定した。
マウス異種移植皮下モデル（ｍｏｕｓｅ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｍｏｄｅｌ）にＳＮＵ３９８細胞を注入して腫瘍形成を誘導し、腫瘍が一定サイズ以上に成長すると、ＣＲＴ－１２２Ｔ又はＥＣＲＴ－１２２Ｔベクターを含むアデノウイルスを１ｘ１０９ＶＰ用量で２日に一回ずつ、総２回癌組織内に注入（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、Ｉ．Ｔ．ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。 アデノウイルスを注入した後、マウスを飼育しながら３日間隔で腫瘍サイズ、体重を測定し、２２日後にマウスを犠牲させて最終腫瘍サイズ、肝重量、ＡＳＴ（ａｓｐａｒｔａｔｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）及びＡＬＴ（ａｌａｎｉｎｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）レベルを測定した。
その結果、図２８の（ａ）及び図２８の（ｂ）に示したように、ＣＲＴ－１２２Ｔに比べてＥＣＲＴ－１２２Ｔの抗癌効能がさらに優れることを確認することができた。マウスの体重と肝重量は、実験群の間に有意味した差がなく、ＡＳＴ及びＡＬＴレベルからアデノウイルスが肝毒性を誘導しないことが分かった（図２８の（ｃ）～図２８の（ｅ））。
前記結果を通じて、少量のアデノウイルスのみ注入しても十分な抗癌効果を得ることができることを確認し、ＣＲＴ－１２２Ｔに比べてＥＣＲＴ－１２２Ｔの抗癌効能が顕著に優れることが分かった。
１－３．毒性の比較
アデノウイルスの注入用量による毒性を確認するために、正常ＩＣＲマウスにＥＣＲＴ又はＥＣＲＴ－１２２Ｔアデノウイルスを注入し、注入後２日、７日及び１４日にＡＳＴ及びＡＬＴレベルを測定した。
アデノウイルスの注入用量による毒性を確認するために、正常ＩＣＲマウスにＥＣＲＴ又はＥＣＲＴ－１２２Ｔアデノウイルスを注入し、注入後２日、７日及び１４日にＡＳＴ及びＡＬＴレベルを測定した。
その結果、図２９に示したように、ＥＣＲＴを２．５ｘ１０１０ＶＰ用量で投与したマウスでは、非常に高い肝毒性が注入後１４日目まで維持されたが、ＥＣＲＴ－１２２Ｔを２．５ｘ１０１０ＶＰ用量で投与したマウスでは、ＥＣＲＴに比べて肝毒性が非常に低いことが分かった。
Claims (17)
- （ｉ）サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、ＣＭＶ）プローモーター；及び
（ｉｉ）癌特異的遺伝子配列を標的にするトランス－スプライシングリボザイム、前記リボザイムの３'エクソンに連結された目的遺伝子を含む、リボザイム－目的遺伝子発現カセットを含み、
前記発現カセットは、リボザイム－目的遺伝子発現カセットの５'末端にスプライシング供与体／スプライシング受容体配列（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｄｏｎｏｒ／ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｃｃｅｐｔｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＳＤ／ＳＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が連結され、３'末端にＷＰＲＥ（Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｅｌｅｍｅｎｔ）が連結されたもので、
（ｉｉｉ）前記ＷＰＲＥの３'末端にマイクロＲＮＡ－１２２（ｍｉｃｒｏＲＮＡ－１２２、ｍｉＲ－１２２）を認識する核酸配列が追加に連結され、
前記癌特異的遺伝子配列は、ＴＥＲＴ（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）ｍＲＮＡであることを特徴とする、組換えベクター。 - 前記ＴＥＲＴ ｍＲＮＡ配列は、配列番号２の核酸配列を含むものであることを特徴とする、請求項１に記載の組換えベクター。
- 前記トランス－スプライシングリボザイムは、配列番号３の核酸配列を含むものであることを特徴とする、請求項１に記載の組換えベクター。
- 前記目的遺伝子は、癌治療用遺伝子又はレポーター遺伝子であることを特徴とする、請求項１に記載の組換えベクター。
- 前記癌治療用遺伝子は、薬剤感受性遺伝子、細胞死滅遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、細胞毒性遺伝子、腫瘍抑制因子遺伝子、抗原性遺伝子、サイトカイン遺伝子及び抗新生血管生成遺伝子からなる群より選択されるものであることを特徴とする、請求項４に記載の組換えベクター。
- 前記薬剤感受性遺伝子は、ＨＳＶｔｋ（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ－ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）遺伝子であることを特徴とする、請求項５に記載の組換えベクター。
- 前記ＨＳＶｔｋ遺伝子は、配列番号４の核酸配列を含むものであることを特徴とする、請求項６に記載の組換えベクター。
- 前記レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、変形された緑色蛍光タンパク質（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｍＧＦＰ）、増強された緑色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、変形された赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ）、増強された赤色蛍光タンパク質（ＥＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、増強された青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、増強された黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）又は増強されたシアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）であることを特徴とする、請求項４に記載の組換えベクター。
- 前記マイクロＲＮＡ－１２２を認識する核酸配列は、配列番号５の核酸配列を１コピー以上含むものであることを特徴とする、請求項１に記載の組換えベクター。
- 請求項１に記載の組換えベクターを含むことを特徴とする、遺伝子伝達システム。
- 請求項１に記載の組換えベクター又は請求項１０に記載の遺伝子伝達システムを有効成分で含むことを特徴とする、癌の予防又は治療用薬学的組成物。
- 前記癌は、肝癌、膠芽腫、胆管癌、肺癌、膵臓癌、黒色腫、骨癌、乳房癌、大腸癌、胃癌、前立腺癌、白血病、子宮癌、卵巣癌、リンパ腫又は脳癌であることを特徴とする、請求項１１に記載の癌の予防又は治療用薬学的組成物。
- 前記癌は、癌組織で発現されるｍｉＲ－１２２のコピー数が前記薬学的組成物により癌組織で発現されるリボザイムのコピー数の１００倍未満であることを特徴とする、請求項１１に記載の癌の予防又は治療用薬学的組成物。
- 前記癌は、癌組織でｍｉＲ－１２２が実質的に発現されないものであることを特徴とする、請求項１３に記載の癌の予防又は治療用薬学的組成物。
- 前記肝癌は、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）、肝癌組織でｍｉＲ－１２２の発現が低下されるＣ型肝炎ウイルス、アルコール、慢性肝炎、肝硬変症、非アルコール性脂肪肝、及びアフラトキシンからなる群より選択されるいずれか一つ以上を原因とするものであることを特徴とする、請求項１２に記載の癌の予防又は治療用薬学的組成物。
- 前記薬学的組成物は、静脈内、動脈内、癌組織内及び皮下からなる群より選択される経路で投与されるものであることを特徴とする、請求項１１～請求項１５のうちいずれか一項に記載の癌の予防又は治療用薬学的組成物。
- 前記薬学的組成物は、注射剤形態で投与されるものであることを特徴とする、請求項１１～請求項１５のうちいずれか一項に記載の癌の予防又は治療用薬学的組成物。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20190021191 | 2019-02-22 | ||
| KR10-2019-0021191 | 2019-02-22 | ||
| KR1020200021014A KR102252423B1 (ko) | 2019-02-22 | 2020-02-20 | 암 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이의 용도 |
| KR10-2020-0021014 | 2020-02-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2020146033A JP2020146033A (ja) | 2020-09-17 |
| JP7053697B2 true JP7053697B2 (ja) | 2022-04-12 |
Family
ID=70285382
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2020028556A Active JP7053697B2 (ja) | 2019-02-22 | 2020-02-21 | 癌特異的トランス－スプライシングリボザイム及びその用途 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11078487B2 (ja) |
| JP (1) | JP7053697B2 (ja) |
| CN (1) | CN111607610A (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109609505A (zh) * | 2019-01-14 | 2019-04-12 | 中国科学院成都生物研究所 | 一种体内筛选的剪切rna的锤头状核酶 |
| EP3992292A4 (en) * | 2020-02-28 | 2023-06-21 | Rznomics Inc. | APOE4 RNA-SPECIFIC TRANSSPLICING RIBOZYME AND ITS USE |
| AU2022210147B2 (en) * | 2021-01-25 | 2025-06-26 | Rznomics Inc. | Cancer-specific trans-splicing ribozyme expressing immune checkpoint inhibitor, and use thereor |
| WO2023014206A1 (ko) * | 2021-08-06 | 2023-02-09 | 알지노믹스 주식회사 | 방사선 치료와 병용되는 유전자 치료제로서 암 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 |
| CN117347621B (zh) * | 2023-08-25 | 2024-03-12 | 广东省农业科学院农业生物基因研究中心 | 一种用蛋白模拟抗原-纳米抗体检测黄曲霉毒素b1的方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017532032A (ja) | 2014-09-29 | 2017-11-02 | インダストリー−アカデミック コーペレーション ファウンデーション，タングク ユニバーシティー | 癌特異的トランススプライシングリボザイム及びその用途 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101478869B1 (ko) * | 2011-05-26 | 2015-01-06 | 단국대학교 산학협력단 | 마이크로ｒｎａ를 이용한 조절을 통한 암 특이적 유전자 치료제 |
| WO2016052851A1 (ko) | 2014-09-29 | 2016-04-07 | 단국대학교 산학협력단 | 암 특이적 트랜스-스플라이싱 라이보자임 및 이의 용도 |
| GB2572716B (en) * | 2016-11-29 | 2022-06-22 | Articure Co Ltd | Gene Therapy Vector System and Prodrug Genes |
-
2020
- 2020-02-21 JP JP2020028556A patent/JP7053697B2/ja active Active
- 2020-02-21 CN CN202010107272.7A patent/CN111607610A/zh active Pending
- 2020-02-21 US US16/797,663 patent/US11078487B2/en active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017532032A (ja) | 2014-09-29 | 2017-11-02 | インダストリー−アカデミック コーペレーション ファウンデーション，タングク ユニバーシティー | 癌特異的トランススプライシングリボザイム及びその用途 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Hepatology, 2018; 68, Suppl 1, AASLD Abstract (Poster) 882A, Abstract Number: 1550 |
| Kim., J., et al., Scientific Reports, 2015; 5, 12315, |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US11078487B2 (en) | 2021-08-03 |
| JP2020146033A (ja) | 2020-09-17 |
| US20200270612A1 (en) | 2020-08-27 |
| CN111607610A (zh) | 2020-09-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7053697B2 (ja) | 癌特異的トランス－スプライシングリボザイム及びその用途 | |
| US7048920B2 (en) | Recombinant oncolytic adenovirus for human melanoma | |
| US10280420B2 (en) | Cancer specific-splicing ribozyme and use thereof | |
| US20080213220A1 (en) | Cancer-targeted viral vectors | |
| US20090156796A1 (en) | Metastatic colon cancer specific promoter and uses thereof | |
| JP2002507382A (ja) | 組織特異的複製および遺伝子発現のためのベクター | |
| KR102252423B1 (ko) | 암 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이의 용도 | |
| JP2007508036A (ja) | 肝細胞癌特異的プロモーターおよびその使用 | |
| KR101478869B1 (ko) | 마이크로ｒｎａ를 이용한 조절을 통한 암 특이적 유전자 치료제 | |
| CN116670172A (zh) | 表达免疫检查点抑制剂的癌症特异性反式剪接核酶及其用途 | |
| KR102471898B1 (ko) | 면역관문 억제제를 발현하는 암 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임 및 이의 용도 | |
| US20230390320A1 (en) | Cancer-specific trans-splicing ribozyme expressing immune checkpoint inhibitor, and use thereor | |
| EP4382135A1 (en) | Cancer-specific trans-splicing ribozyme as gene therapy product combined with radiotherapy | |
| WO2012121071A1 (ja) | VA-RNAsが発現しないアデノウイルスベクター | |
| JP2004512380A (ja) | 核酸移送のための糖類と組み合わせたデキストリンポリマーを含む製剤 | |
| KR20230030063A (ko) | 암 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임과 키나아제 억제제를 포함하는 암 치료적 병용물 | |
| CN118139649A (zh) | 作为与放射线治疗联合使用的基因治疗剂的癌症特异性反式剪接核酶 | |
| CN121443731A (zh) | 靶向ets家族转录因子异常相关肿瘤的经修饰病毒 | |
| CN115651932A (zh) | 一种靶向消化道肿瘤双靶向溶瘤腺病毒的构建方法及其应用 | |
| HK1082958A1 (zh) | 在肿瘤细胞中选择性增殖的肿瘤溶解病毒 | |
| HK1082958B (en) | Tumor-lysing virus growing selectively in tumor cells | |
| WO2015118056A1 (en) | Conditionally replicating adenovirus and use thereof in the treatment of cancer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200804 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200804 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20210519 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210531 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210830 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220131 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220217 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220307 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220331 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7053697 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |