JP7039039B2 - Fzd10に対するモノクローナル抗体およびその使用 - Google Patents
Fzd10に対するモノクローナル抗体およびその使用 Download PDFInfo
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Description
Frizzledタンパクは7回膜貫通型タンパクであり、N末端に細胞外システインリッチドメインを有する。このシステインリッチドメインがWntリガンドの結合部位である。WntリガンドとFrizzled受容体との結合は必ずしも一対一ではなく、一種のWntリガンドが複数種のFrizzled受容体と、一種のFrizzled受容体に複数種のWntリガンドが結合することが確認されている。
受容体結合により活性化されたWnt/β-カテニンシグナル伝達経路は、Frizzled受容体と直接相互作用する細胞質タンパク質であるDishevelled(Dsh)によって仲介されて、β-カテニンの細胞質での安定化および蓄積をもたらす。Wntシグナルが存在しない場合、β-カテニンは腫瘍抑制タンパク質である大腸腺腫様ポリポーシス(APC)およびアキシンを含む細胞質の分解複合体に局在する。これらのタンパク質はグリコーゲン合成酵素キナーゼ(GSK)-3βがβ-カテニンに結合してリン酸化し、これをユビキチン/プロテアソーム経路を介した分解用に指定するための重大な足場として機能する。(特許文献1)β-カテニン非依存経路は多数のプロセスに関係していることが示されているが、細胞骨格系の制御に関与する細胞内平面極性(PCP)、細胞の運動および接着に関与しているWnt/Ca2+経路、プロテインキナーゼAを介して筋新生の制御に関与する経路などが存在する。Frizzled受容体は2量体化することができ、この2量体化はWntシグナル経路の活性化に関与しているとの報告がある(非特許文献1)。
〔1〕SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を含むCDR1;
SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列を含むCDR2;および
SEQ ID NO:3に示されるアミノ酸配列を含むCDR3
を含む重鎖可変領域、ならびに
SEQ ID NO:4に示されるアミノ酸配列を含むCDR1;
SEQ ID NO:5に示されるアミノ酸配列を含むCDR2;および
SEQ ID NO:6に示されるアミノ酸配列を含むCDR3
を含む軽鎖可変領域
のいずれかまたは両方を含む、FZD10タンパク質またはその部分ペプチドに結合することができる、抗体またはその抗原結合性断片。
〔2〕SEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:8に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のいずれかまたは両方を含む、〔1〕に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
〔3〕SEQ ID NO:9に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する、〔1〕または〔2〕に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
〔4〕FZD10への特異的な結合について、〔1〕~〔3〕のいずれかに記載の抗体と競合する、抗体またはその抗原結合性断片。
〔5〕アフィニティー標識、酵素標識、放射性同位体標識、または蛍光標識と結合している、〔1〕~〔4〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
〔6〕〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチド。
〔7〕〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む、FZD10関連疾患を診断、FZD10阻害剤による治療後の薬効を判定、またはFZD10阻害剤による治療効果の高い対象をスクリーニングするための試薬。
〔8〕以下の段階を含む、対象におけるFZD10関連疾患または該疾患の発症素因を診断する方法:
(a) 該対象から単離した試料を〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させる段階;
(b) 該抗体またはその抗原結合性断片と該試料との結合を検出することによって、該試料中のFZD10タンパク質を検出する段階:および
(c) 該試料中のFZD10タンパク質レベルを対照と比較する段階であって、対照と比較してFZD10タンパク質レベルが高いときに該対象が該疾患を患っているかまたはその発症リスクを有することが示される、段階。
〔9〕前記FZD10関連疾患が、FZD10を発現しているがんである、〔7〕に記載の試薬または〔8〕に記載の方法。
〔10〕前記がんが、滑膜肉腫、肺がん、食道がん、結腸直腸がん(大腸がん)、胃がん、慢性骨髄性白血病(CML)および急性骨髄性白血病(AML)からなる群より選択される、〔9〕に記載の試薬または方法。
〔11〕以下の段階を含む、試料中のFZD10タンパク質を検出する方法:
(a) 対象から単離した試料を〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させる段階;および
(b) 該抗体またはその抗原結合性断片と該試料との結合を検出することによって、該試料中のFZD10タンパク質を検出する段階。
〔12〕以下の段階を含む、対象におけるFZD10阻害剤による治療後の薬効を判定する方法:
(a) 該対象から単離した試料を〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させる段階;
(b) 該抗体またはその抗原結合性断片と該試料との結合を検出することによって、該試料中のFZD10タンパク質を検出する段階;
(c) 該試料中のFZD10タンパク質レベルを薬剤投与前の発現レベルと比較する段階であって、薬剤投与前と比較してFZD10タンパク質レベルが低いときに該対象における薬効があったことが示される、段階。
〔13〕以下の段階を含む、FZD10阻害剤による治療効果の高い対象をスクリーニングする方法:
(a) 該対象から単離した試料を〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させる段階;
(b) 該抗体または抗原結合性断片と該試料との結合を検出することによって、該試料中のFZD10タンパク質を検出する段階;
(c) 該試料中のFZD10タンパク質レベルを対照と比較する段階であって、対照と比較してFZD10タンパク質レベルが同程度かそれよりも高いときに、該対象におけるFZD10阻害剤による治療効果が高いことが示される、段階。
〔14〕前記試料が、前記対象から単離した細胞または組織である、〔8〕~〔13〕のいずれかに記載の方法。
〔15〕以下の工程を含む、FZD10タンパク質またはその部分ペプチドに結合することができる抗体を製造する方法:
(a) 〔6〕に記載のポリヌクレオチドが導入されたベクターを含む細胞を培養する段階;および
(b) 該細胞の培養物または培養培地から前記抗体を回収する段階。
〔16〕以下の段階を含む、FZD10関連疾患または該疾患の発症素因の診断マーカーを検出する方法:
(a) 該対象から単離した試料を〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させる段階;および
(b) 該抗体または抗原結合性断片と該試料との結合を検出することによって、該試料中のFZD10タンパク質を該マーカーとして検出する段階。
〔17〕FZD10関連疾患または該疾患の発症素因の診断における使用のための、〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
〔18〕FZD10関連疾患または該疾患の発症素因を診断するための試薬の製造における、〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片の使用。
〔19〕以下の段階を含む、FZD10阻害剤の薬効マーカーを検出する方法:
(a) 該対象から単離した試料を〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させる段階;および
(b) 該抗体または抗原結合性断片と該試料との結合を検出することによって、該試料中のFZD10タンパク質を該マーカーとして検出する段階。
〔20〕FZD10阻害剤による治療後の薬効の判定における使用のための、〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
〔21〕FZD10阻害剤による治療後の薬効を判定するための試薬の製造における、〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片の使用。
〔22〕以下の段階を含む、FZD10阻害剤治療応答性マーカーを検出する方法:
(a) 該対象から単離した試料を〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させる段階;および
(b) 該抗体または抗原結合性断片と該試料との結合を検出することによって、該試料中のFZD10タンパク質を該マーカーとして検出する段階。
〔23〕FZD10阻害剤による治療効果の高い対象のスクリーニングにおける使用のための、〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
〔24〕FZD10阻害剤による治療効果の高い対象をスクリーニングするための試薬の製造における、〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片の使用。
本発明の態様を実施または試験するにあたって、本明細書に記載の方法および材料と類似のまたは同等の任意の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料をここに記載する。しかしながら、本発明の材料および方法について記載する前に、本明細書に記載の特定の大きさ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコル等は慣例的な実験法および最適化に応じて変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。本記載に使用する専門用語は特定の型または態様のみを説明する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも、また理解されるべきである。
10A8H4G4、重鎖可変領域アミノ酸配列(シグナル配列を除く):
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGLGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITSVDTADTATYYCARRAYYGNYYALDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:7)
10A8H4G4、軽鎖可変領域アミノ酸配列(シグナル配列を除く):
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRKSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPVTFGAGTKLELKRAD(SEQ ID NO:8)
本発明の抗体は、前記アミノ酸配列をコードするDNAを用いる組み換え技術によって製造することもできる。
本明細書で用いる「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」という単語は、他に特記されない限り「少なくとも1つの」を意味する。
物質(例えば、ペプチド、抗体、ポリヌクレオチド等)に関して用いる「単離された」および「精製された」という用語は、該物質がそうでなければ天然源中に含まれ得る少なくとも1種の物質を実質的に含まないことを示す。したがって、単離または精製された抗体は、その抗体が由来する細胞もしくは組織源からの他の細胞材料、例えば糖質、脂質および他の混入タンパク質を実質的に含まない抗体を指す。好ましい態様では、本発明の抗体は単離または精製されている。
本発明では、抗FZD10モノクローナル抗体を用いる。当該抗体は当技術分野において周知の方法によって提供される。
本発明によって用いられる例示的な抗体産生技術について以下に記載する。
モノクローナル抗体は実質的に均一な抗体の集団から得られる。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、わずかな量で存在しうる可能性のある天然の変異を除き同一である。このように、「モノクローナル」という修飾語は、別個の抗体との混合物ではないという抗体の特徴を示す。
例えばモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて産生することができ、または組換えDNA法(US4,816,567号)によっても産生されうる。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980)の30スキャッチャード分析によって判定することができる。
所望の特異性、親和性、および/または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後に、このクローンを限界希釈法によってサブクローニングし、標準的な方法によって増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986))。この目的に適した培養培地の例として、D-MEM培地またはRPMI-1640培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞は動物における腹水腫瘍のようなインビボで増殖させることもできる。
SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を含むCDR1;
SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列を含むCDR2;および
SEQ ID NO:3に示されるアミノ酸配列を含むCDR3
を含み、該軽鎖可変領域は、
SEQ ID NO:4に示されるアミノ酸配列を含むCDR1;
SEQ ID NO:5に示されるアミノ酸配列を含むCDR2;および
SEQ ID NO:6に示されるアミノ酸配列を含むCDR3
を含む、抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
本発明において用いられる抗体の産生のため、該抗体(抗体遺伝子)をコードするポリヌクレオチドを、発現制御要素(例えば、エンハンサー、プロモーター)の制御下で抗体遺伝子が発現できるように、発現ベクターに組み込む。発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。
他のプロモーター/エンハンサー系、例えば、ウイルス(例えば、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルスおよびサルウイルス40(SV40))に由来するもの、ならびに哺乳類細胞に由来するもの(例えば、ヒト伸長因子1α(HEF1α))を本発明における抗体の発現に用いることもできる。
SV40プロモーター/エンハンサー系が用いられる場合、遺伝子発現はMulliganら(Nature (1979) 277, 108-14.)の方法によって容易に行うことができる。HEF1αプロモーター/エンハンサー系が用いられる場合、遺伝子発現はMizushimaら(Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322.)の方法によって容易に行うことができる。
さまざまな技術が抗体断片の産生のために開発されている。従来は、インタクトな抗体のタンパク質分解消化を介してこれらの断片が得られていた(例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992)およびBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照されたい)。しかしながら、これらの断片は現在、組換え宿主細胞によって直接産生することができる。例えば、抗体断片を抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Fab'-SH断片を大腸菌から直接回収し、化学的にカップリングして、F(ab')2断片を形成させてもよい(Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992))。別のアプローチによれば、F(ab')2断片を組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体断片の産生のための他の技術は、当業者には明らかであろう。他の態様において、最適な抗体とは一本鎖Fv断片(scFv)である。WO93/16185号;US5,571,894号;およびUS5,587,458号を参照されたい。また抗体断片は、例えばUS5,641,870号に例えば記載されているように、「直鎖状抗体」であってもよい。そのような直鎖状抗体断片は単一特異性または二重特異性を有しうる。
本発明の抗体を、任意で、アフィニティー標識、酵素標識、放射性同位体標識、蛍光標識、または化学発光標識と結合させる。例えば、FZD10を発現しているがん組織に存在しかつ検出可能な標識の存在によって、診断される対象におけるがんまたは腫瘍の有無の判定が可能になる。また、がん組織における標識の局在性によって、疾患の拡大を判定することもできる。
使用に適した標識には、例えば、フルオレセインおよびローダミン等の蛍光標識;ならびにルシフェラーゼ等の酵素標識が含まれる。使用される検出可能な/検出用の標識は、使用するイメージング様式にしたがって選択される。そのような標識と抗体との結合体は、当技術分野で公知のプロトコルおよび技術を用いて作製することができる。本発明において、本発明の抗体は使用の直前に所望の標識と結合されてもよいし、標識と結合した抗体として提供されてもよい。
FZD10は、FZD10関連疾患の診断マーカーとして、ならびに当該疾患に罹患している対象におけるFZD10阻害剤に対する応答性および当該阻害剤の薬効を評価するためのマーカーとして有用である。したがって、本発明の抗体は、がんなどのFZD10関連疾患を診断するため、FZD10阻害剤による治療効果の高い対象をスクリーニングするため、またはFZD10阻害剤による治療後の薬効を判定するためのマーカーの検出試薬として用いることができる。
より具体的には、本発明の抗体によって対象から単離した試料中のFZD10タンパク質を検出し、FZD10関連疾患の診断、FZD10阻害剤による治療効果の高い対象のスクリーニング、またはFZD10阻害剤による治療後の薬効の判定を実施することができる。したがって、本発明は、対象から単離した試料において本発明の抗体を用いてFZD10タンパク質を検出することによる、対象においてFZD10関連疾患または該疾患の発症素因を診断する方法、FZD10阻害剤による治療効果の高い対象をスクリーニングする方法、および、FZD10阻害剤による治療後の薬効を判定する方法を提供する。これらの方法は以下の段階を含む:
(a) 対象から単離した試料を本発明の抗体またはその抗原結合性断片と接触させる段階;
(b) 該抗体またはその抗原結合性断片と該試料との結合を検出することによって、該試料中のFZD10タンパク質を検出する段階:および
(c) 該試料中のFZD10タンパク質レベルを対照と比較する段階。
また、FZD10阻害剤による治療効果の高い対象のスクリーニングの場合、前記段階(c)において、対照レベル(好ましくは、FZD10関連疾患と診断された対象の組織におけるFZD10タンパク質の発現レベル)と比較してFZD10タンパク質レベルが同程度かそれよりも高いときに、対象におけるFZD10阻害剤による治療効果が高いことが示される。
一方、FZD10阻害剤による治療後の薬効の判定の場合、前記段階(c)において、対照レベル(好ましくは、薬剤投与前の対象から単離した試料中のFZD10タンパク質の発現レベル)と比較してFZD10タンパク質レベルが低いときに、対象における薬効があったことが示される。
すなわち本発明は、以下の群から選択されるいずれかの患者を本発明の方法によって特定し、当該患者にFZD10阻害剤を投与する工程を含む、FZD10関連疾患の治療方法に関する;
本発明の診断方法によって、FZD10関連疾患を有することが示された患者;
FZD10阻害剤の治療効果が高い可能性が示された患者;そして
FZD10阻害剤の投与を受けた患者において、当該阻害剤の治療効果が有ったことが示された患者。
一方、FZD10関連疾患を患っている(例えば、がん性である)とわかっている生体試料から測定された対照レベルは「疾患対照レベル(例えば、がん性対照レベル)」と称される。FZD10阻害剤による治療前の対象から単離された試料におけるFZD10タンパク質レベルが疾患対照レベルと同程度かそれよりも高い場合、対象はFZD10阻害剤による治療効果が高い、と診断されうる。
また、FZD10阻害剤による治療後の対象から単離された試料におけるFZD10タンパク質レベルが薬剤投与前の同対象の疾患対照レベルより低い場合、治療による薬効があった、すなわち、対象はFZD10阻害剤による治療効果が高い、と診断されうる。
本発明はまた、FZD10関連疾患または該疾患の発症素因の診断における使用のための、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を提供する。あるいは、本発明は、FZD10関連疾患または該疾患の発症素因を診断するための試薬の製造における、本発明の抗体またはその抗原結合性断片の使用を提供する。
本発明はまた、FZD10阻害剤による治療効果の高い対象のスクリーニングにおける使用のための、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を提供する。あるいは、本発明は、FZD10阻害剤による治療効果の高い対象をスクリーニングするための試薬の製造における、本発明の抗体またはその抗原結合性断片の使用を提供する。
本発明はまた、FZD10阻害剤による治療後の薬効の判定における使用のための、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を提供する。あるいは、本発明は、FZD10阻害剤による治療後の薬効を判定するための試薬の製造における、本発明の抗体またはその抗原結合性断片の使用を提供する。
本発明は、FZD10関連疾患の診断、FZD10阻害剤による治療効果の高い対象のスクリーニング、またはFZD10阻害剤による治療後の薬効の判定のための試薬またはキットを提供する。具体的には、これらのキットは、FZD10タンパク質の検出試薬として、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を含む。一態様において、本発明の診断試薬またはキットのための抗体を蛍光物質、発光物質、または放射性同位体で標識することができる。抗体を標識するための方法および標識抗体を検出するための方法は、当技術分野において周知であり、任意の標識および方法を本発明のために利用することができる。
細胞培養
ATCCから購入したヒト大腸がん細胞株であるDLD1にFZD10発現ベクターを導入させたFZD10強制発現細胞株(FZD10/DLD1)を作製し、陰性対照としてEmpty Vectorを導入させた細胞株(Mock/DLD1)を作製した。5%CO2の加湿雰囲気中37℃で、10%ウシ胎仔血清(FBS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシンおよび0.8mg/mL GENETICINを補充したRPMI-1640中で維持した。国立がん研究センター希少がんセンターから分与されたヒト滑膜肉腫細胞株であるSYO-1は、5%CO2の加湿雰囲気中37℃で、10%ウシ胎仔血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEM中で維持した。JCRBから購入したヒト食道がん細胞株であるT.Tは、5%CO2の加湿雰囲気中37℃で、10%ウシ胎仔血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEM/F12(1:1)中で維持した。ATCCから購入したヒト肺がん細胞株であるH727は、5%CO2の加湿雰囲気中37℃で、10%ウシ胎仔血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したRPMI-1640中で維持した。ATCCから購入したヒト大腸がん細胞株であるCOLO201は、5%CO2の加湿雰囲気中37℃で、10%ウシ胎仔血清(FBS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、10mM HEPES、1mM Sodium pyruvateおよび4.5g/L グルコースを補充したRPMI-1640中で維持した。ATCCから購入したヒト大腸がん細胞株であるLoVoは、CO2の加湿雰囲気中37℃で、20%ウシ胎仔血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したF12中で維持した。
外科的に切除された肺がんからの組織試料(ホルマリン固定パラフィン切片、凍結組織)、ならびにそれらの対応する臨床的情報は、書面によるインフォームドコンセントをとった上で、神奈川がんセンターから入手した。
ホルマリン固定パラフィン切片化したFZD10/DLD1、Mock/DLD1、SYO1、T.T、H727、LoVo、COLO201および臨床検体を、キシレンに3分間3回浸漬して脱パラフィンした後、100%エタノールに1分間2回、90%、70%、および50%エタノールにてそれぞれ1分間浸漬して再水和させた。抗原賦活化処理のために抗原賦活化液pH9(ニチレイバイオサイエンス)に浸漬させた切片をFZD10/DLD1、Mock/DLD1は125℃30秒間、SYO1、T.T、H727、LoVo、COLO201および臨床検体は95℃40分間インキュベートした。インキュベート後、20分間室温放置し、流水にて5分間水洗した。3.0%過酸化水素水にて10分間浸漬して内因性ペルオキシダーゼのブロッキングを行ない、Wash Buffer(TBS-T(Takara Bio))にて、5分間3回洗浄した。さらに、非特異的な反応をブロックする目的で切片上にProtein Block液(Dako)を適量滴下し、10分間静置した。湿潤箱にて1次抗体(FZD10Ab(10A8H4G4)、FZD10(L164)pAb、FZD10 PolyclonalAb)をそれぞれ適量適下し、60分間静置後、Wash Bufferにて、5分間3回洗浄した。湿潤箱にて2次抗体としてヒストファイン シンプルステイン MAX-PO(ニチレイバイオサイエンス)を適量適下し、30分間静置した。Wash Bufferにて、5分間3回洗浄した。DAB基質溶液(ニチレイバイオサイエンス)により発色反応を行なった。スライド切片をヘマトキシリン(Dako)に20秒間浸漬し、流水で洗浄した。50%、70%、および90%エタノールにてそれぞれ1分間、および100%エタノールに1分間2回浸漬して脱水を行なった。最後に、切片をキシレンで3分間2回浸漬して透徹し、Mount-Quick(DAIDO SANGYO)によって封入した。
RNeasy Mini kit(QIAGEN)を用いてがん細胞株(SYO-1、COLO201)より総RNAを抽出した。臨床凍結組織(肺扁平上皮がん)については、TRIzol Reagent(Invitrogen)に凍結組織片を浸けてすり潰しクロロホルム抽出を行なった。得られた抽出液におおよそ等量の70%エタノールを加えて、RNeasy Mini kit(QIAGEN)を用いて総RNAを抽出した。SuperScript III Reverse Transcriptase(Invitrogen)の逆転写酵素を用いて総RNAよりcDNAを合成した。cDNAを鋳型としてKAPA SYBR FAST ABI Prism qPCR kit(KAPA Biosystems)を用いてPCR反応を行なった。発現解析目的遺伝子はFZD10、ハウスキーピング遺伝子はGAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)とした。FZD10は、FZD10-11F:5'-GTGTGCAGCCGTAGGTTAAAG-3'(SEQ ID NO:12)、FZD10 R5:5'-GACTGGGCAGGGATCTCATA-3'(SEQ ID NO:13)のプライマーセットを用いて、GAPDHは、GAPDH RT-PCR Fw:5'-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3'(SEQ ID NO:14)、GAPDH RT-PCR Re:5'-GGTCCACCACTGACACGTTG-3'(SEQ ID NO:15)のプライマーセットを用いてリアルタイムPCR反応を行なった。PCR増幅産物量を経時的にモニタリングし、PCR増幅産物が指数関数的に増幅している領域に閾値を設定してCt値を算出した。検量線にCt値をあてはめて未知サンプルの濃度を算出した。FZD10遺伝子の定量値をGAPDH遺伝子の定量値で割ることにより、サンプル間の鋳型量の標準化を行ない、FZD10遺伝子の発現量を比較した。
SYO1、T.T、H727、およびLoVoを、初期コンフルエント(early-confluent)までそれぞれ推奨される培養培地中で維持した。細胞表面抗原の変性を回避するため、次に細胞を、細胞剥離用溶液(Cell Dissociation Solution; SIGMA, MO)で分離させ、0.5% BSA/PBSで懸濁した。セルストレイナーに懸濁した細胞を通して塊をのぞき細胞数をカウントした。細胞を96Wellアッセイプレートに分注した(2×105個/50μL)。希釈済みの試験抗体もしくは培養上清50μLを添加し、4℃で1時間静置した。プレートを1500rpm、4℃で5分間遠心し、上清を除去した後、0.5% BSA/PBS 150μLで2度洗浄した。Alexa Fluor488ヤギ抗マウスIgG(H+L)(Invitrogen, CA)20 mg/mLと混合し、暗所中4℃で1時間静置した。プレートを1500rpm、4℃で5分間遠心し、上清を除去した後、0.5% BSA/PBS 150μLで2度洗浄し、120μLの0.5% BSA/PBSで細胞を懸濁した。試験抗体の結合様式および特異性をFACS Calibur(Becton Dickinson, NJ)により製造元の使用説明書にしたがって評価した。
(1)可溶型FZD10タンパク質を免疫原とした抗FZD10抗体産生ハイブリドーマの取得
FZD10は膜タンパク質であるため、固定された膜タンパク質に反応する抗体作製には細胞外領域が免疫原となりうる。FZD10のN末端以外の細胞外領域は非常に短く、抗原とするには困難であると考えられたことから、N末端の細胞外領域(1-161アミノ酸)を免疫原として選択し、シグナルペプチドを除く可溶型FZD10タンパク質(21-161アミノ酸領域)(SEQ ID NO:9)を免疫原としてモノクローナル抗体を作製した。Freund Adjuvantに抗原ペプチド50μgを加えた後、エマルジョン化して、Balb/cマウス(日本エスエルシー株式会社)の皮下に注射する事により初回免疫を行った。2回目以降の免疫は同様に調製した25μg抗原ペプチド量相当を皮下に注射することにより実施した。最終免疫から3日後にマウスから脾臓細胞を無菌的に調製し、常法に従って、ポリエチレングリコール法によりマウスミエローマ細胞SP2/0との細胞融合を行った。
抗FZD10抗体の選抜は、まず可溶性FZD10タンパク質をもちいたELISA法によりFZD10と結合性を有する抗体をスクリーニングした。ELISA法で選択された抗体について更に免疫染色法による選抜を行った。免疫染色法による選抜は、全長FZD10タンパク質(SEQ ID NO:22)を発現するFZD10強制発現細胞株FZD10/DLD1を用いた免疫組織化学染色により行った。すなわち、全長FZD10タンパク質を強制発現させたFZD10強制発現細胞株FZD10/DLD1をホルマリン固定パラフィン切片化した後、免疫染色を実施し、強い反応が認められたハイブリドーマを選抜した。
一方、市販抗体(FZD10(L164)Ab、FZD10PolyclonalAb)を用いて染色した場合、FZD10/DLD1とMock/DLD1いずれにおいても染色が観察された(高い割合の細胞にシグナルが検出された)。そのため、これらの市販の抗体による検出結果には偽陽性シグナルが含まれている可能性が疑われた。
以上の結果より、本発明の抗FZD10抗体(10A8H4G4)は、免疫組織化学染色法において、市販の抗FZD10抗体と比較して高い特異性でFZD10を検出できるという有利な性質を有していることが明らかとなった。
次に、FZD10の発現量が異なる種々の細胞株を用いて、10A8H4G4の特異性を評価した。すなわち、10A8H4G4を用いた免疫組織化学染色およびフローサイトメトリーの結果を比較し、FZD10タンパク質の発現量に応じた染色が認められるか検討した。ここで、各がん種毎の細胞株を用いたmRNAの発現解析データベース Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)において、肺がん、食道がん、結腸直腸がん(大腸がん)で顕著な上方制御が示されている(図1)。そこで、これらのがん種に由来する細胞株を以下の解析に用いた。
まず、10A8H4G4を用いたフローサイトメトリーにより、種々のヒトがん組織由来細胞株の細胞膜上における内因性のFZD10タンパク質の発現を確認した。図3に示されているように、内因性のFZD10タンパク質の発現が知られているヒト滑膜肉腫由来SYO-1の他、ヒト食道がん由来細胞株T.Tおよびヒト肺がん由来細胞株H727においても、10A8H4G4を用いたフローサイトメトリーによって陽性シグナルが検出された。一方、FZD10非発現細胞株であることが知られているヒト大腸がん由来細胞株LoVoにおいては、10A8H4G4を用いたフローサイトメトリーによって陽性シグナルが検出されなかった。
続いて、これらの細胞株から作製されたパラフィン切片について、10A8H4G4を用いて免疫組織化学染色を行った。図3Bに示されているように、10A8H4G4を用いて染色した結果、FZD10を発現していることが確認された細胞株SYO-1、T.T、H727から作製されたパラフィン切片において染色が認められた。これらのパラフィン切片には、フローサイトメトリーの結果と相関して高い割合の細胞に陽性のシグナルが検出された。一方、FZD10非細胞株であるLoVoから作製されたパラフィン切片はほとんど染色されず、陽性のシグナルがほとんど検出されなかった。
以上の結果より、本発明の抗FZD10抗体(10A8H4G4)は、フローサイトメトリーにおいても免疫組織化学染色法においても高い特異性で試料中のFZD10タンパク質を検出できる有用なツールであることが示された。
本発明の抗FZD10抗体(10A8H4G4)の免疫組織化学染色における特異性を、がん細胞株のマウスXenograft腫瘍から作製されたパラフィン切片ならびに肺がん臨床検体を用いて評価した。SYO-1、COLO201細胞株のマウスXenograft腫瘍から作製されたパラフィン切片ならびに肺がん臨床検体1~6の腫瘍領域および非腫瘍領域におけるFZD10のタンパク質およびRNAの発現をそれぞれ免疫組織化学染色およびRealTime-PCRによって検出した結果を図4に示す。
図4に示されているように、FZD10のRNAの高発現が確認された細胞株SYO-1のマウスXenograft腫瘍から作製されたパラフィン切片においては、10A8H4G4により染色された細胞、すなわちFZD10陽性細胞が検出されたが、FZD10のRNAの発現量が少なかった細胞株COLO201のマウスXenograft腫瘍から作製されたパラフィン切片においては、10A8H4G4により染色された細胞、すなわちFZD10陽性細胞も少なかった。この結果は、本発明の抗FZD10抗体(10A8H4G4)は、免疫組織化学染色法において試料中のFZD10タンパク質の発現量と相関した検出結果を得るために有用なツールであることを示している。
また、腫瘍領域特異的なFZD10のRNAの発現が確認された肺がん臨床検体5においては10A8H4G4により染色された細胞、すなわちFZD10陽性細胞が検出されたが、腫瘍領域特異的なFZD10のRNAの発現が確認されなかった他の肺がん臨床検体はほとんど染色されず、FZD10陽性細胞がほとんど検出されなかった。この結果は、10A8H4G4は臨床検体においても特異的にFZD10タンパク質を検出できることを示している。
本発明の抗FZD10抗体(10A8H4G4)の可変領域のアミノ酸配列を分析した。
RNeasy mini kit(QIAGEN)を用いて、総RNAをハイブリドーマ10A8H4G4から抽出した。Super Script II Reverse Transcriptase(Invitrogen)を用いて、総RNAからcDNAを合成した。cDNA合成用のプライマーは以下の通りである。
重鎖3'プライマーのmIGCUniRv:
5'-CTGGGAAGGTGTGCACAC-3'(SEQ ID NO:16)
軽鎖3'プライマーのmIGKRv2:
5'-GTTGTTCAAGAAGCACACGAC-3'(SEQ ID NO:17)
5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends(Invitrogen)を用いてcDNA末端にdCのポリマーを付加し、Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitrogen)を用いて、モノクローナル抗体の可変領域をコードするポリヌクレオチドを増幅した。増幅用のプライマーは以下の通りである。プライマー配列中の塩基「I」は、イノシンを示す。
重鎖5'および軽鎖5'プライマーの5' RACE Abridged Anchor Primer:
5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3'(SEQ ID NO:18)、
重鎖3'プライマーのmIGCUniRv2:
5'-TGGACAGGGATCCAGAGTTCC-3'(SEQ ID NO:19)、ならびに
軽鎖3'プライマーのmIGKNesRv2:
5'-CAGATGTTAACTGCTCACTGGATGG-3'(SEQ ID NO:20)。
PCR産物をpGEM-T Easy Vector(Promega)にクローニングした。挿入断片領域を配列決定し、10A8H4G4の可変領域(シグナル配列を除く)の核酸配列を決定した。
10A8H4G4、重鎖可変領域アミノ酸配列(シグナル配列を除く):
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGLGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITSVDTADTATYYCARRAYYGNYYALDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:7)(SEQ ID NO:10に示される核酸配列によってコードされる)
10A8H4G4、重鎖可変領域核酸配列:
5'-CAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTCTGGGTGTGAGCTGGATTCGTCAGCCTTCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTACTGGGATGATGACAAGCGCTATAACCCATCCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCCAGCAACCAGGTATTCCTCAAGATCACCAGTGTGGACACTGCAGATACTGCCACATACTACTGTGCTCGAAGAGCCTACTATGGTAATTACTATGCTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA-3'(SEQ ID NO:10)
10A8H4G4、軽鎖可変領域アミノ酸配列(シグナル配列を除く):
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRKSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPVTFGAGTKLELKRAD(SEQ ID NO:8)(SEQ ID NO:11に示される核酸配列によってコードされる)
10A8H4G4、軽鎖可変領域核酸配列:
5'-GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGACCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACTGGGCATCCACTAGGAAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATTATAGTTATCCGGTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCTGAT-3'(SEQ ID NO:11)
重鎖CDR1(CDR-H1):TSGLGVS(SEQ ID NO:1);
重鎖CDR2(CDR-H2):HIYWDDDKRYNPSLKS(SEQ ID NO:2);
重鎖CDR3(CDR-H3):RAYYGNYYALDY(SEQ ID NO:3);
軽鎖CDR1(CDR-L1):KSSQSLLNSGNQKNYLT(SEQ ID NO:4);
軽鎖CDR2(CDR-L2):WASTRKS(SEQ ID NO:5);および
軽鎖CDR3(CDR-L3):QNDYSYPVT(SEQ ID NO:6)
Claims (15)
- SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を含むCDR1;
SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列を含むCDR2;および
SEQ ID NO:3に示されるアミノ酸配列を含むCDR3
を含む重鎖可変領域、ならびに
SEQ ID NO:4に示されるアミノ酸配列を含むCDR1;
SEQ ID NO:5に示されるアミノ酸配列を含むCDR2;および
SEQ ID NO:6に示されるアミノ酸配列を含むCDR3
を含む軽鎖可変領域
の両方を含む、SEQ ID NO:9に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体またはその抗原結合性断片。 - SEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:8に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の両方を含む、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
- アフィニティー標識、酵素標識、放射性同位体標識、または蛍光標識と結合している、請求項1または2に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
- 請求項1~3のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項1~3のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む、FZD10関連疾患を診断、FZD10阻害剤による治療後の薬効を判定、またはFZD10阻害剤による治療効果の高い対象をスクリーニングするための試薬。
- 以下の段階を含む、対象におけるFZD10関連疾患または該疾患の発症素因の診断マーカーを検出する方法:
(a) 該対象から単離した試料を請求項1~3のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させる段階;および
(b) 該抗体またはその抗原結合性断片と該試料との結合を検出することによって、該試料中のFZD10タンパク質を該マーカーとして検出する段階。 - 前記FZD10関連疾患が、FZD10を発現しているがんである、請求項5に記載の試薬。
- 前記がんが、滑膜肉腫、肺がん、食道がん、結腸直腸がん(大腸がん)、胃がん、慢性骨髄性白血病(CML)および急性骨髄性白血病(AML)からなる群より選択される、請求項7に記載の試薬。
- 前記FZD10関連疾患が、FZD10を発現しているがんである、請求項6に記載の方法。
- 前記がんが、滑膜肉腫、肺がん、食道がん、結腸直腸がん(大腸がん)、胃がん、慢性骨髄性白血病(CML)および急性骨髄性白血病(AML)からなる群より選択される、請求項9に記載の方法。
- 以下の段階を含む、試料中のFZD10タンパク質を検出する方法:
(a) 対象から単離した試料を請求項1~3のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させる段階;および
(b) 該抗体またはその抗原結合性断片と該試料との結合を検出することによって、該試料中のFZD10タンパク質を検出する段階。 - 以下の段階を含む、対象におけるFZD10阻害剤による治療後の薬効を判定する方法:
(a) 該対象から単離した試料を請求項1~3のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させる段階;
(b) 該抗体またはその抗原結合性断片と該試料との結合を検出することによって、該試料中のFZD10タンパク質を検出する段階;
(c) 該試料中のFZD10タンパク質レベルを薬剤投与前の発現レベルと比較する段階であって、薬剤投与前と比較してFZD10タンパク質レベルが低いときに該対象における薬効があったことが示される、段階。 - 以下の段階を含む、FZD10阻害剤による治療効果の高い対象をスクリーニングする方法:
(a) 該対象から単離した試料を請求項1~3のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させる段階;
(b) 該抗体またはその抗原結合性断片と該試料との結合を検出することによって、該試料中のFZD10タンパク質を検出する段階;
(c) 該試料中のFZD10タンパク質レベルを対照と比較する段階であって、対照と比較してFZD10タンパク質レベルが同程度かそれよりも高いときに、該対象におけるFZD10阻害剤による治療効果が高いことが示される、段階。 - 前記試料が、前記対象から単離した細胞または組織である、請求項6、および9~13のいずれか一項に記載の方法。
- 以下の工程を含む、SEQ ID NO:9に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体またはその抗原結合性断片を製造する方法:
(a) 請求項4に記載のポリヌクレオチドが導入されたベクターを含む細胞を培養する段階;および
(b) 該細胞の培養物または培養培地から前記抗体を回収する段階。
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