JP2022068145A - Fzd10に対するモノクローナル抗体およびその使用 - Google Patents
Fzd10に対するモノクローナル抗体およびその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2022068145A JP2022068145A JP2022004142A JP2022004142A JP2022068145A JP 2022068145 A JP2022068145 A JP 2022068145A JP 2022004142 A JP2022004142 A JP 2022004142A JP 2022004142 A JP2022004142 A JP 2022004142A JP 2022068145 A JP2022068145 A JP 2022068145A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fzd10
- antibody
- sample
- antigen
- binding fragment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 101000819451 Homo sapiens Frizzled-10 Proteins 0.000 claims abstract description 337
- 102100021261 Frizzled-10 Human genes 0.000 claims abstract description 335
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 89
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 79
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 64
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 64
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 34
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 32
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 27
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 23
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 110
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 110
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 79
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 79
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 78
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 76
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 66
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 57
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 51
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 38
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 31
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 18
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 17
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 17
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 17
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 17
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 17
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 17
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 16
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 13
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 11
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 claims description 10
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 claims description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 10
- 206010042863 synovial sarcoma Diseases 0.000 claims description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 8
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 8
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 claims description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 7
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 6
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 claims description 5
- 239000007801 affinity label Substances 0.000 claims description 5
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 144
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 77
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 43
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 35
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 28
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 22
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 22
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 18
- 101150042537 dld1 gene Proteins 0.000 description 17
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 16
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 16
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 13
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 13
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 13
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 12
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 description 11
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 10
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 10
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 108010045438 Frizzled receptors Proteins 0.000 description 9
- 102000005698 Frizzled receptors Human genes 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 9
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 9
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 7
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 6
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 6
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 6
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 6
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 6
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 5
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 5
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 5
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 4
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 101150013134 Fzd10 gene Proteins 0.000 description 3
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 3
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 3
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 3
- 101100151763 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SYO1 gene Proteins 0.000 description 3
- 230000004156 Wnt signaling pathway Effects 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- -1 antibodies Proteins 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N (8S)-8-amino-7-oxononanoic acid zwitterion Chemical compound C[C@H](N)C(=O)CCCCCC(O)=O GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 108091007911 GSKs Proteins 0.000 description 2
- 102000004103 Glycogen Synthase Kinases Human genes 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 2
- 102100024952 Protein CBFA2T1 Human genes 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 102000006646 aminoglycoside phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 2
- 102000057905 human FZD10 Human genes 0.000 description 2
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 2
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 2
- VILFTWLXLYIEMV-UHFFFAOYSA-N 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+]([O-])=O)=C(F)C=C1F VILFTWLXLYIEMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O[Si](C)(C)C(C)(C)C)C1 QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 0.000 description 1
- YBBNVCVOACOHIG-UHFFFAOYSA-N 2,2-diamino-1,4-bis(4-azidophenyl)-3-butylbutane-1,4-dione Chemical compound C=1C=C(N=[N+]=[N-])C=CC=1C(=O)C(N)(N)C(CCCC)C(=O)C1=CC=C(N=[N+]=[N-])C=C1 YBBNVCVOACOHIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000473391 Archosargus rhomboidalis Species 0.000 description 1
- 101100136076 Aspergillus oryzae (strain ATCC 42149 / RIB 40) pel1 gene Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 102000008130 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010049894 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Proteins 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 108091005942 ECFP Proteins 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 101710181403 Frizzled Proteins 0.000 description 1
- 102100021259 Frizzled-1 Human genes 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 1
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000819438 Homo sapiens Frizzled-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005460 biophysical method Methods 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 201000002758 colorectal adenoma Diseases 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-N cyclohexanecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CCCCC1 NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000012954 diazonium Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 125000005442 diisocyanate group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 150000002222 fluorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 201000005243 lung squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000011242 molecular targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 101150040383 pel2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150050446 pelB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007694 polyacrylamide gel isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 208000015768 polyposis Diseases 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000026938 proteasomal ubiquitin-dependent protein catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012514 protein characterization Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 1
- 238000013391 scatchard analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012090 serum-supplement Substances 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 230000022379 skeletal muscle tissue development Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- RUELTTOHQODFPA-UHFFFAOYSA-N toluene 2,6-diisocyanate Chemical compound CC1=C(N=C=O)C=CC=C1N=C=O RUELTTOHQODFPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000225 tumor suppressor protein Substances 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 235000021247 β-casein Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/534—Production of labelled immunochemicals with radioactive label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
【課題】FZD10に特異的かつ高感度で結合する抗体を提供する。【解決手段】FZD10に対するモノクローナル抗体を提供する。さらに、該抗体を用いてFZD10関連疾患を診断する方法、FZD10タンパク質を検出する方法、FZD10阻害剤による治療後の薬効を判定する方法、FZD10阻害剤による治療効果の高い対象をスクリーニングする方法、および該抗体を含む診断試薬を提供する。【選択図】なし
Description
本発明は、FZD10に対するモノクローナル抗体、該抗体を用いてFZD10関連疾患を診断する方法、FZD10タンパク質を検出する方法、FZD10阻害剤による治療後の薬効を判定する方法、FZD10阻害剤による治療効果の高い対象をスクリーニングする方法、および該抗体を含む診断試薬に関する。
FrizzledタンパクはWntタンパク質リガンドに対する結合部位を有するGタンパク質結合受容体のファミリーである。遺伝子解析から、これまで18種のWnt遺伝子および10種のFrizzled遺伝子(FZD1~FZD10)が同定されており、これらは全て構造的に高度に類似していることが明らかになっている。
Frizzledタンパクは7回膜貫通型タンパクであり、N末端に細胞外システインリッチドメインを有する。このシステインリッチドメインがWntリガンドの結合部位である。WntリガンドとFrizzled受容体との結合は必ずしも一対一ではなく、一種のWntリガンドが複数種のFrizzled受容体と、一種のFrizzled受容体に複数種のWntリガンドが結合することが確認されている。
Frizzledタンパクは7回膜貫通型タンパクであり、N末端に細胞外システインリッチドメインを有する。このシステインリッチドメインがWntリガンドの結合部位である。WntリガンドとFrizzled受容体との結合は必ずしも一対一ではなく、一種のWntリガンドが複数種のFrizzled受容体と、一種のFrizzled受容体に複数種のWntリガンドが結合することが確認されている。
WntリガンドとFrizzled受容体との結合によりWntシグナル伝達経路が活性化されると言われている。Wntシグナル伝達経路にはβ-カテニン経路を活性化させるものと、β-カテニンを介さない経路が数種存在し、WntリガンドとFrizzled受容体の組み合わせによって異なる経路を活性化しているものと考えられている。
受容体結合により活性化されたWnt/β-カテニンシグナル伝達経路は、Frizzled受容体と直接相互作用する細胞質タンパク質であるDishevelled(Dsh)によって仲介されて、β-カテニンの細胞質での安定化および蓄積をもたらす。Wntシグナルが存在しない場合、β-カテニンは腫瘍抑制タンパク質である大腸腺腫様ポリポーシス(APC)およびアキシンを含む細胞質の分解複合体に局在する。これらのタンパク質はグリコーゲン合成酵素キナーゼ(GSK)-3βがβ-カテニンに結合してリン酸化し、これをユビキチン/プロテアソーム経路を介した分解用に指定するための重大な足場として機能する。(特許文献1)β-カテニン非依存経路は多数のプロセスに関係していることが示されているが、細胞骨格系の制御に関与する細胞内平面極性(PCP)、細胞の運動および接着に関与しているWnt/Ca2+経路、プロテインキナーゼAを介して筋新生の制御に関与する経路などが存在する。Frizzled受容体は2量体化することができ、この2量体化はWntシグナル経路の活性化に関与しているとの報告がある(非特許文献1)。
受容体結合により活性化されたWnt/β-カテニンシグナル伝達経路は、Frizzled受容体と直接相互作用する細胞質タンパク質であるDishevelled(Dsh)によって仲介されて、β-カテニンの細胞質での安定化および蓄積をもたらす。Wntシグナルが存在しない場合、β-カテニンは腫瘍抑制タンパク質である大腸腺腫様ポリポーシス(APC)およびアキシンを含む細胞質の分解複合体に局在する。これらのタンパク質はグリコーゲン合成酵素キナーゼ(GSK)-3βがβ-カテニンに結合してリン酸化し、これをユビキチン/プロテアソーム経路を介した分解用に指定するための重大な足場として機能する。(特許文献1)β-カテニン非依存経路は多数のプロセスに関係していることが示されているが、細胞骨格系の制御に関与する細胞内平面極性(PCP)、細胞の運動および接着に関与しているWnt/Ca2+経路、プロテインキナーゼAを介して筋新生の制御に関与する経路などが存在する。Frizzled受容体は2量体化することができ、この2量体化はWntシグナル経路の活性化に関与しているとの報告がある(非特許文献1)。
FZD10(参照配列:Genbankアクセッション番号NM_007197.3(SEQ ID NO:21))mRNAは、頸部、消化管および膠芽腫の細胞系統を含む多数のがん細胞系統で、ならびに約40%の原発性胃がん、原発性結腸がんおよびほとんどの滑膜肉腫組織で上方制御されているとの報告がある(特許文献1~2、非特許文献2~3)。FZD10タンパク質の過剰発現に関連する疾患として、滑膜肉腫、結腸直腸がん(大腸がん)、胃がん、慢性骨髄性白血病(CML)、及び急性骨髄性白血病(AML)などが挙げられる(特許文献3~5)。従って、FZD10は抗がん剤の適切な標的であると考えられ、FZD10に特異的なsiRNAによって滑膜肉腫細胞の増殖が抑制されることや、FZD10に対する抗体が滑膜肉腫のマウス移植片モデルにおいて抗腫瘍活性を有することが示されている(特許文献3、4)。また、FZD10に対するモノクローナル抗体は、治療における診断薬として役立つことが予測され得る。乳がん、悪性リンパ腫、および結腸がんに対するトラスツズマブの診断薬、リツキシマブの診断薬、およびベバシズマブの診断薬のようなモノクローナル抗体の臨床応用の成功例の他に、他の分子標的に対するいくつかのモノクローナル抗体が開発中であり、これらの診断効果が評価中である。これらの診断薬は、治療薬における効果的な患者の選択という観点から、より効果的な治療法に結び付くものと期待される。
Charles E Dann et al.,Nature (2001),412:86-90
H.Terasaki et al.,Int.J.Mol.Med.(2002)9,107-112
S.Nagayama et al.,Oncogene(2005)24,6201-6212
分子標的治療薬を用いた腫瘍の治療における診断薬は、標的腫瘍の大部分に過剰発現が認められ、かつ正常組織では発現されないか、最小限しか発現されない細胞タンパク質を検出することが重要である。しかしながら、腫瘍に発現されるタンパク質を特異的に高感度で検出することは困難であり、そのようなタンパク質に対する抗体を得ることも困難である。たとえば、抗がん剤の標的と考えられているFZD10については、いくつかの抗体が市販されている。しかし、本発明者らが入手した市販の抗体によってFZD10発現細胞の染色を試みたところ、FZD10の発現レベルが低い細胞においても陽性シグナル(偽陽性)を生じることがあった。このように免疫学的な特異性が不十分な抗体では、抗体の反応強度を指標としてFZD10の発現レベルの違いを明瞭に検出することができない心配がある。したがって、本発明の課題は、FZD10に特異的かつ高感度で結合する抗体を提供することにある。
そこで本発明者らは、FZD10抗原をマウスに免疫して得られたモノクローナル抗体の中からFZD10に特異的に結合する抗体を探索したところ、特定の抗体がリコンビナントヒトFZD10タンパク質に特異的に結合することができ、かつ細胞や組織内に発現するFZD10タンパク質を特異的に検出できるクローンを同定することに成功した。
具体的には、本発明は以下に関する:
〔1〕SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を含むCDR1;
SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列を含むCDR2;および
SEQ ID NO:3に示されるアミノ酸配列を含むCDR3
を含む重鎖可変領域、ならびに
SEQ ID NO:4に示されるアミノ酸配列を含むCDR1;
SEQ ID NO:5に示されるアミノ酸配列を含むCDR2;および
SEQ ID NO:6に示されるアミノ酸配列を含むCDR3
を含む軽鎖可変領域
のいずれかまたは両方を含む、FZD10タンパク質またはその部分ペプチドに結合することができる、抗体またはその抗原結合性断片。
〔2〕SEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:8に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のいずれかまたは両方を含む、〔1〕に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
〔3〕SEQ ID NO:9に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する、〔1〕または〔2〕に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
〔4〕FZD10への特異的な結合について、〔1〕~〔3〕のいずれかに記載の抗体と競合する、抗体またはその抗原結合性断片。
〔5〕アフィニティー標識、酵素標識、放射性同位体標識、または蛍光標識と結合している、〔1〕~〔4〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
〔6〕〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチド。
〔7〕〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む、FZD10関連疾患を診断、FZD10阻害剤による治療後の薬効を判定、またはFZD10阻害剤による治療効果の高い対象をスクリーニングするための試薬。
〔8〕以下の段階を含む、対象におけるFZD10関連疾患または該疾患の発症素因を診断する方法:
(a) 該対象から単離した試料を〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させる段階;
(b) 該抗体またはその抗原結合性断片と該試料との結合を検出することによって、該試料中のFZD10タンパク質を検出する段階:および
(c) 該試料中のFZD10タンパク質レベルを対照と比較する段階であって、対照と比較してFZD10タンパク質レベルが高いときに該対象が該疾患を患っているかまたはその発症リスクを有することが示される、段階。
〔9〕前記FZD10関連疾患が、FZD10を発現しているがんである、〔7〕に記載の試薬または〔8〕に記載の方法。
〔10〕前記がんが、滑膜肉腫、肺がん、食道がん、結腸直腸がん(大腸がん)、胃がん、慢性骨髄性白血病(CML)および急性骨髄性白血病(AML)からなる群より選択される、〔9〕に記載の試薬または方法。
〔11〕以下の段階を含む、試料中のFZD10タンパク質を検出する方法:
(a) 対象から単離した試料を〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させる段階;および
(b) 該抗体またはその抗原結合性断片と該試料との結合を検出することによって、該試料中のFZD10タンパク質を検出する段階。
〔12〕以下の段階を含む、対象におけるFZD10阻害剤による治療後の薬効を判定する方法:
(a) 該対象から単離した試料を〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させる段階;
(b) 該抗体またはその抗原結合性断片と該試料との結合を検出することによって、該試料中のFZD10タンパク質を検出する段階;
(c) 該試料中のFZD10タンパク質レベルを薬剤投与前の発現レベルと比較する段階であって、薬剤投与前と比較してFZD10タンパク質レベルが低いときに該対象における薬効があったことが示される、段階。
〔13〕以下の段階を含む、FZD10阻害剤による治療効果の高い対象をスクリーニングする方法:
(a) 該対象から単離した試料を〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させる段階;
(b) 該抗体または抗原結合性断片と該試料との結合を検出することによって、該試料中のFZD10タンパク質を検出する段階;
(c) 該試料中のFZD10タンパク質レベルを対照と比較する段階であって、対照と比較してFZD10タンパク質レベルが同程度かそれよりも高いときに、該対象におけるFZD10阻害剤による治療効果が高いことが示される、段階。
〔14〕前記試料が、前記対象から単離した細胞または組織である、〔8〕~〔13〕のいずれかに記載の方法。
〔15〕以下の工程を含む、FZD10タンパク質またはその部分ペプチドに結合することができる抗体を製造する方法:
(a) 〔6〕に記載のポリヌクレオチドが導入されたベクターを含む細胞を培養する段階;および
(b) 該細胞の培養物または培養培地から前記抗体を回収する段階。
〔1〕SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を含むCDR1;
SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列を含むCDR2;および
SEQ ID NO:3に示されるアミノ酸配列を含むCDR3
を含む重鎖可変領域、ならびに
SEQ ID NO:4に示されるアミノ酸配列を含むCDR1;
SEQ ID NO:5に示されるアミノ酸配列を含むCDR2;および
SEQ ID NO:6に示されるアミノ酸配列を含むCDR3
を含む軽鎖可変領域
のいずれかまたは両方を含む、FZD10タンパク質またはその部分ペプチドに結合することができる、抗体またはその抗原結合性断片。
〔2〕SEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:8に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のいずれかまたは両方を含む、〔1〕に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
〔3〕SEQ ID NO:9に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する、〔1〕または〔2〕に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
〔4〕FZD10への特異的な結合について、〔1〕~〔3〕のいずれかに記載の抗体と競合する、抗体またはその抗原結合性断片。
〔5〕アフィニティー標識、酵素標識、放射性同位体標識、または蛍光標識と結合している、〔1〕~〔4〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
〔6〕〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチド。
〔7〕〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む、FZD10関連疾患を診断、FZD10阻害剤による治療後の薬効を判定、またはFZD10阻害剤による治療効果の高い対象をスクリーニングするための試薬。
〔8〕以下の段階を含む、対象におけるFZD10関連疾患または該疾患の発症素因を診断する方法:
(a) 該対象から単離した試料を〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させる段階;
(b) 該抗体またはその抗原結合性断片と該試料との結合を検出することによって、該試料中のFZD10タンパク質を検出する段階:および
(c) 該試料中のFZD10タンパク質レベルを対照と比較する段階であって、対照と比較してFZD10タンパク質レベルが高いときに該対象が該疾患を患っているかまたはその発症リスクを有することが示される、段階。
〔9〕前記FZD10関連疾患が、FZD10を発現しているがんである、〔7〕に記載の試薬または〔8〕に記載の方法。
〔10〕前記がんが、滑膜肉腫、肺がん、食道がん、結腸直腸がん(大腸がん)、胃がん、慢性骨髄性白血病(CML)および急性骨髄性白血病(AML)からなる群より選択される、〔9〕に記載の試薬または方法。
〔11〕以下の段階を含む、試料中のFZD10タンパク質を検出する方法:
(a) 対象から単離した試料を〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させる段階;および
(b) 該抗体またはその抗原結合性断片と該試料との結合を検出することによって、該試料中のFZD10タンパク質を検出する段階。
〔12〕以下の段階を含む、対象におけるFZD10阻害剤による治療後の薬効を判定する方法:
(a) 該対象から単離した試料を〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させる段階;
(b) 該抗体またはその抗原結合性断片と該試料との結合を検出することによって、該試料中のFZD10タンパク質を検出する段階;
(c) 該試料中のFZD10タンパク質レベルを薬剤投与前の発現レベルと比較する段階であって、薬剤投与前と比較してFZD10タンパク質レベルが低いときに該対象における薬効があったことが示される、段階。
〔13〕以下の段階を含む、FZD10阻害剤による治療効果の高い対象をスクリーニングする方法:
(a) 該対象から単離した試料を〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させる段階;
(b) 該抗体または抗原結合性断片と該試料との結合を検出することによって、該試料中のFZD10タンパク質を検出する段階;
(c) 該試料中のFZD10タンパク質レベルを対照と比較する段階であって、対照と比較してFZD10タンパク質レベルが同程度かそれよりも高いときに、該対象におけるFZD10阻害剤による治療効果が高いことが示される、段階。
〔14〕前記試料が、前記対象から単離した細胞または組織である、〔8〕~〔13〕のいずれかに記載の方法。
〔15〕以下の工程を含む、FZD10タンパク質またはその部分ペプチドに結合することができる抗体を製造する方法:
(a) 〔6〕に記載のポリヌクレオチドが導入されたベクターを含む細胞を培養する段階;および
(b) 該細胞の培養物または培養培地から前記抗体を回収する段階。
本発明はさらに以下に関する:
〔16〕以下の段階を含む、FZD10関連疾患または該疾患の発症素因の診断マーカーを検出する方法:
(a) 該対象から単離した試料を〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させる段階;および
(b) 該抗体または抗原結合性断片と該試料との結合を検出することによって、該試料中のFZD10タンパク質を該マーカーとして検出する段階。
〔17〕FZD10関連疾患または該疾患の発症素因の診断における使用のための、〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
〔18〕FZD10関連疾患または該疾患の発症素因を診断するための試薬の製造における、〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片の使用。
〔19〕以下の段階を含む、FZD10阻害剤の薬効マーカーを検出する方法:
(a) 該対象から単離した試料を〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させる段階;および
(b) 該抗体または抗原結合性断片と該試料との結合を検出することによって、該試料中のFZD10タンパク質を該マーカーとして検出する段階。
〔20〕FZD10阻害剤による治療後の薬効の判定における使用のための、〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
〔21〕FZD10阻害剤による治療後の薬効を判定するための試薬の製造における、〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片の使用。
〔22〕以下の段階を含む、FZD10阻害剤治療応答性マーカーを検出する方法:
(a) 該対象から単離した試料を〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させる段階;および
(b) 該抗体または抗原結合性断片と該試料との結合を検出することによって、該試料中のFZD10タンパク質を該マーカーとして検出する段階。
〔23〕FZD10阻害剤による治療効果の高い対象のスクリーニングにおける使用のための、〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
〔24〕FZD10阻害剤による治療効果の高い対象をスクリーニングするための試薬の製造における、〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片の使用。
〔16〕以下の段階を含む、FZD10関連疾患または該疾患の発症素因の診断マーカーを検出する方法:
(a) 該対象から単離した試料を〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させる段階;および
(b) 該抗体または抗原結合性断片と該試料との結合を検出することによって、該試料中のFZD10タンパク質を該マーカーとして検出する段階。
〔17〕FZD10関連疾患または該疾患の発症素因の診断における使用のための、〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
〔18〕FZD10関連疾患または該疾患の発症素因を診断するための試薬の製造における、〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片の使用。
〔19〕以下の段階を含む、FZD10阻害剤の薬効マーカーを検出する方法:
(a) 該対象から単離した試料を〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させる段階;および
(b) 該抗体または抗原結合性断片と該試料との結合を検出することによって、該試料中のFZD10タンパク質を該マーカーとして検出する段階。
〔20〕FZD10阻害剤による治療後の薬効の判定における使用のための、〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
〔21〕FZD10阻害剤による治療後の薬効を判定するための試薬の製造における、〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片の使用。
〔22〕以下の段階を含む、FZD10阻害剤治療応答性マーカーを検出する方法:
(a) 該対象から単離した試料を〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させる段階;および
(b) 該抗体または抗原結合性断片と該試料との結合を検出することによって、該試料中のFZD10タンパク質を該マーカーとして検出する段階。
〔23〕FZD10阻害剤による治療効果の高い対象のスクリーニングにおける使用のための、〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
〔24〕FZD10阻害剤による治療効果の高い対象をスクリーニングするための試薬の製造における、〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片の使用。
上記に加え、本発明の他の目的および特徴は、添付の図表および実施例と併せて以下の詳細な説明を読むことによって、より十分に明らかになる。しかしながら、前述の発明の概要および以下の詳細な説明はいずれも例示的な態様であり、本発明または本発明のその他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。特に、本発明をいくつかの特定の態様を参照して本明細書において説明するが、その説明は本発明を例証するものであり、本発明を限定するものとして構成されていないことが理解されよう。添付の特許請求の範囲によって記載される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者は様々な変更および適用に想到することができる。同様に、本発明のその他の目的、特徴、利益、および利点は、本概要および以下に記載する特定の態様から明らかになり、当業者には容易に明白になるであろう。そのような目的、特徴、利益、および利点は、添付の実施例、データ、図表、およびそれらから引き出されるあらゆる妥当な推論と併せて上記から、単独で、または本明細書に組み入れられる参考文献を考慮して、明らかになるであろう。
詳細な説明
本発明の態様を実施または試験するにあたって、本明細書に記載の方法および材料と類似のまたは同等の任意の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料をここに記載する。しかしながら、本発明の材料および方法について記載する前に、本明細書に記載の特定の大きさ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコル等は慣例的な実験法および最適化に応じて変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。本記載に使用する専門用語は特定の型または態様のみを説明する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも、また理解されるべきである。
本発明の態様を実施または試験するにあたって、本明細書に記載の方法および材料と類似のまたは同等の任意の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料をここに記載する。しかしながら、本発明の材料および方法について記載する前に、本明細書に記載の特定の大きさ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコル等は慣例的な実験法および最適化に応じて変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。本記載に使用する専門用語は特定の型または態様のみを説明する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも、また理解されるべきである。
本発明は、FZD10タンパク質またはその部分ペプチドに特異的に結合することができる、抗FZD10モノクローナル抗体を提供する。本発明は、本発明の抗FZD10モノクローナル抗体が、免疫組織化学染色法におけるFZD10タンパク質の検出において高い特異性を有する証拠を提供する。
本発明の抗FZD10抗体(10A8H4G4)は、少なくとも可変領域に下記アミノ酸配列を有する。
10A8H4G4、重鎖可変領域アミノ酸配列(シグナル配列を除く):
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGLGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITSVDTADTATYYCARRAYYGNYYALDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:7)
10A8H4G4、軽鎖可変領域アミノ酸配列(シグナル配列を除く):
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRKSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPVTFGAGTKLELKRAD(SEQ ID NO:8)
本発明の抗体は、前記アミノ酸配列をコードするDNAを用いる組み換え技術によって製造することもできる。
10A8H4G4、重鎖可変領域アミノ酸配列(シグナル配列を除く):
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGLGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITSVDTADTATYYCARRAYYGNYYALDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:7)
10A8H4G4、軽鎖可変領域アミノ酸配列(シグナル配列を除く):
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRKSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPVTFGAGTKLELKRAD(SEQ ID NO:8)
本発明の抗体は、前記アミノ酸配列をコードするDNAを用いる組み換え技術によって製造することもできる。
本発明の抗体は、マウスへの免疫感作によって得られた複数の抗体産生ハイブリドーマから、ELISA法によって、FZD10と結合性を有する抗体をスクリーニングし選択することにより取得された。ELISA法で選択された抗体について更に免疫染色法による選抜を行った。強制発現細胞(陽性コントロール細胞)にて陽性、陰性コントロール細胞にて陰性を提示する抗体を選択し、選択された抗体について更に内因性FZD10発現細胞(陽性コントロール細胞)にて陽性、陰性コントロール細胞にて陰性を提示する抗体を選抜した。FZD10との相互作用がそれほど強いものでない場合には、弱い結合力を持つ抗体がバックグラウンドとしてつきまとってしまう。そこで、内因性FZD10発現量が予め測定された細胞株を用いて免疫染色を行ないスクリーニングすることにより、目的とするFZD10と強い結合性を有する抗体を選択することができた。
本発明の抗体は、FZD10に特異的に結合する。したがって、本発明の抗体は、FZD10またはFZD10を発現している細胞もしくは組織を検出するための道具として有用である。また、本発明の抗体は、当該抗体を検出し得る標識と結合した標識体として利用することができ、当該標識体は、例えば大腸がん等のFZD10を発現しているがん細胞またはがん組織を検出するうえでより好ましい。本発明の抗体に結合する標識としては、FZD10に結合した抗体を検出し得る標識であればよく、アフィニティー標識(例えば、ビオチン、アビジン等)、酵素標識(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等)、蛍光標識(例えば、FITC、ローダミン等)等が挙げられる。
本発明の抗体をがん治療患者の選択に診断薬として用いる場合、本発明の抗体はそのまま用いることもできるが、各種使用形態に適した組成物とすることができる。
I.定義
本明細書で用いる「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」という単語は、他に特記されない限り「少なくとも1つの」を意味する。
物質(例えば、ペプチド、抗体、ポリヌクレオチド等)に関して用いる「単離された」および「精製された」という用語は、該物質がそうでなければ天然源中に含まれ得る少なくとも1種の物質を実質的に含まないことを示す。したがって、単離または精製された抗体は、その抗体が由来する細胞もしくは組織源からの他の細胞材料、例えば糖質、脂質および他の混入タンパク質を実質的に含まない抗体を指す。好ましい態様では、本発明の抗体は単離または精製されている。
本明細書で用いる「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」という単語は、他に特記されない限り「少なくとも1つの」を意味する。
物質(例えば、ペプチド、抗体、ポリヌクレオチド等)に関して用いる「単離された」および「精製された」という用語は、該物質がそうでなければ天然源中に含まれ得る少なくとも1種の物質を実質的に含まないことを示す。したがって、単離または精製された抗体は、その抗体が由来する細胞もしくは組織源からの他の細胞材料、例えば糖質、脂質および他の混入タンパク質を実質的に含まない抗体を指す。好ましい態様では、本発明の抗体は単離または精製されている。
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、天然型アミノ酸ポリマーのほか、1個もしくは複数個の非天然型アミノ酸残基を含む非天然型アミノ酸ポリマーにも適用される。非天然型アミノ酸には、アミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体などが含まれる。
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、ヌクレオチドのポリマーを指す。
特記しない限り、「FZD10関連疾患」という用語はFZD10を発現しているがんである。
特記しない限り、「がん」という用語は、FZD10を発現しているがん、好ましくはFZD10遺伝子を過剰発現するがんを指し、その例としては、滑膜肉腫、肺がん、食道がん、結腸直腸がん(大腸がん)、胃がん、慢性骨髄性白血病(CML)および急性骨髄性白血病(AML)などが含まれるが、これらに限定されない。例えば、各がん種毎の細胞株を用いたmRNAの発現解析データベース Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE)などによって、FZD10を発現しているがん細胞を知ることができる。本願においても、肺がん、食道がん、結腸直腸がん(大腸がん)で顕著な上方制御が確認された(図1)。
本明細書において用いられる「抗体」という用語は、指定されたタンパク質またはそのペプチドに対する特異的反応性を有する免疫グロブリンおよびその断片を含むことが意図される。抗体は、他のタンパク質または標識と融合した抗体、および抗体断片を含むことができる。さらに、本明細書において抗体は最も広い意味で使用されており、具体的には、所望の生物学的活性を示す限り、インタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも二つのインタクトな抗体から形成される多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、および抗体断片を網羅する。「抗体」とは全てのクラス(例えば、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM)を指す。
「抗体断片」とは、インタクトな抗体の一部分であり、インタクトな抗体の1つまたは複数の抗原結合領域または可変領域を一般的に含む。したがって本発明において、抗体断片はインタクトな抗体の1つまたは複数の抗原結合部分を含むことができる。本明細書において用いられる、抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合性断片」という用語は、抗原(例えば、FZD10)に特異的に結合できる能力を保持する抗体の一つまたは複数の免疫学的に活性な断片を指す。抗体の抗原結合機能は全長抗体の断片によって実行されうることが示されている。抗体断片の例としては、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFv断片、直鎖状抗体、ならびに一本鎖抗体分子が含まれる。構造にかかわらず、抗体断片は、インタクトな抗体によって認識される抗原と同一の抗原に結合する。「抗体断片」という用語はまた、特異的抗原に結合する合成ポリペプチドまたは遺伝子操作ポリペプチド、例えば軽鎖可変領域からなるポリペプチド、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Fv」断片、軽鎖および重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって連結された組換え一本鎖ポリペプチド分子(「scFvタンパク質」)、ならびに超可変領域を模倣したアミノ酸残基からなる最小認識単位も含む。
特記しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって共通して理解されている用語と同じ意味を有する。
本発明において、FZD10タンパク質と、抗体の特異的な結合は、たとえば、抗体間の競合によって評価することができる。具体的には、本発明の抗体として、たとえば、SEQ ID NO:7のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、およびSEQ ID NO:8のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗体を参照抗体として、候補抗体の特異性を評価することができる。代表的な参照抗体は、10A8H4G4である。参照抗体とヒトFZD10タンパク質間の抗原抗体反応に対して、候補抗体が競合した場合に、候補抗体が、参照抗体と同等の特異性を持つことが確認できる。たとえば、候補抗体不存在化でFZD10タンパク質に結合する抗体の量が、候補抗体の共存下で参照抗体とFZD10タンパク質を反応させたときに、10%、20%、30%、あるいは40%、より好ましくは50%、あるいはそれ以上の参照抗体の結合が阻害された場合に、抗体間の競合が生じたと判定することができる。抗体間の競合の評価には、FZD10タンパク質のみならず、参照抗体が結合する限りその部分ペプチドを用いることもできる。好ましい部分ペプチドは、FZD10タンパク質のN末端細胞外ドメインペプチドであり、例えばSEQ ID NO:9のアミノ酸配列を含む部分ペプチドである。
II.抗体の産生
本発明では、抗FZD10モノクローナル抗体を用いる。当該抗体は当技術分野において周知の方法によって提供される。
本発明によって用いられる例示的な抗体産生技術について以下に記載する。
本発明では、抗FZD10モノクローナル抗体を用いる。当該抗体は当技術分野において周知の方法によって提供される。
本発明によって用いられる例示的な抗体産生技術について以下に記載する。
(i)モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は実質的に均一な抗体の集団から得られる。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、わずかな量で存在しうる可能性のある天然の変異を除き同一である。このように、「モノクローナル」という修飾語は、別個の抗体との混合物ではないという抗体の特徴を示す。
例えばモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて産生することができ、または組換えDNA法(US4,816,567号)によっても産生されうる。
モノクローナル抗体は実質的に均一な抗体の集団から得られる。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、わずかな量で存在しうる可能性のある天然の変異を除き同一である。このように、「モノクローナル」という修飾語は、別個の抗体との混合物ではないという抗体の特徴を示す。
例えばモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて産生することができ、または組換えDNA法(US4,816,567号)によっても産生されうる。
ハイブリドーマ法において、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えばハムスターなどをFZD10ポリペプチド(FZD10タンパク質またはその部分ポリペプチド)で免疫して、FZD10ポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生するまたは産生できるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロにおいてFZD10ポリペプチドで免疫してもよい。その後、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いてリンパ球を骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986))。
調製したハイブリドーマ細胞を、融合していない親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する一つまたは複数の物質を含有することが好ましい適切な培養培地中に播種し、その培地中で増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRTまたはHPRT)を欠損している場合、ハイブリドーマ用の培養培地には典型的に、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含めることができ(HAT培地)、これらの物質によってHGPRT欠損細胞の増殖を妨害する。
好ましい骨髄腫細胞とは、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体産生を補助し、かつHAT培地などの培地に感受性を有するものである。好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫株、例えばSalk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USAから入手可能なMOPC-21およびMPC-11マウス腫瘍に由来するもの、ならびに、American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USAから入手可能なSP-2細胞またはX63-Ag8-653細胞を含む。ヒトモノクローナル抗体の産生に関して、ヒト骨髄腫細胞株およびマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も記載されている(Kozbor, J. Immunol., 133: 300 1 (1984);Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について分析する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法によって、または、放射免疫測定法(RIA)もしくは酵素結合免疫吸着測定(ELISA)などの、インビトロ結合測定によって決定される。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980)の30スキャッチャード分析によって判定することができる。
所望の特異性、親和性、および/または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後に、このクローンを限界希釈法によってサブクローニングし、標準的な方法によって増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986))。この目的に適した培養培地の例として、D-MEM培地またはRPMI-1640培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞は動物における腹水腫瘍のようなインビボで増殖させることもできる。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980)の30スキャッチャード分析によって判定することができる。
所望の特異性、親和性、および/または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後に、このクローンを限界希釈法によってサブクローニングし、標準的な方法によって増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986))。この目的に適した培養培地の例として、D-MEM培地またはRPMI-1640培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞は動物における腹水腫瘍のようなインビボで増殖させることもできる。
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、均一になるまで精製してもよい。例えば、一般的なタンパク質に対して用いられる分離法および精製法に従って、抗体の分離および精製を行うことができる。例えば、これらに限定されないが、アフィニティークロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー、フィルタ、限外濾過、塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、および等電点電気泳動の使用を適切に選択しかつ組み合わせることにより、培地、腹水、または血清から適切に抗体を分離および単離することができる(Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988))。プロテインAカラムおよびプロテインGカラムをアフィニティーカラムとして使用することができる。用いられるべき例示的なプロテインAカラムには、例えば、Hyper D、POROS、およびSepharose F.F.(Pharmacia)が含まれる。
例示的なクロマトグラフィーには、アフィニティークロマトグラフィー以外に、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が含まれる(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996))。クロマトグラフィー手順は、HPLCおよびFPLCなどの液相クロマトグラフィーによって行うことができる。
モノクローナル抗体をコードするDNAは、従来の手順を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって)容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなDNAの好ましい供給源として役立つ。DNAを単離すると、発現ベクターの中に配し、これを次に、免疫グロブリンタンパク質を他の方法では産生しない大腸菌(E.coli)細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞中にトランスフェクションして、組換え宿主細胞中でのモノクローナル抗体の合成を達成することができる。抗体をコードするDNAの細菌中での組換え発現に関する総説には、Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993)およびPluckthun, Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992)が含まれる。
FZD10に対して反応性を示す特異的な抗体または抗体断片を産生するための別の方法とは、細菌中で発現される免疫グロブリン遺伝子またはその一部分をコードする発現ライブラリーを、FZD10タンパク質またはその部分ペプチドを用いてスクリーニングすることである。例えば、完全なFab断片、VH領域、およびFv領域をファージ発現ライブラリーを用いて細菌中で発現させることができる。例えば、Ward et al., Nature 341: 544-546 (1989);Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989);およびMcCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990)を参照されたい。例えばFZD10ペプチドを用いてそのようなライブラリーをスクリーニングすることによって、FZD10に対して反応性を有する免疫グロブリン断片を同定することができる。あるいは、抗体またはその断片を産生するためにSCID-huマウス(Genpharmから入手できる)を用いてもよい。
さらなる態様において、抗体または抗体断片は、McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990)に記載されている技術を用いて作製された抗体ファージライブラリーから単離することができる。Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)およびMarks et al., J MoL BioL, 222: 581-597 (1991)では、ファージライブラリーを用いたマウス抗体およびヒト抗体の単離についてそれぞれ記載している。その後の刊行物では、鎖シャッフリングによる高親和性(nM範囲)ヒト抗体の産生(Marks et al., BioTechnology, 10: 779-783 (1992))、ならびに非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略としての組み合わせ感染およびインビボ組換え(Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993))について記載されている。このようにこれらの技術は、モノクローナル抗体単離のための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に代わる実行可能な手段である。
本発明は、FZD10関連疾患の診断、FZD10阻害剤による治療後の薬効の判定、およびFZD10阻害剤による治療効果の高い対象のスクリーニングに適した抗体を提供する。本発明は、免疫組織化学染色およびフローサイトメトリーにおいて高い特異性でFZD10タンパク質を検出することができるマウスモノクローナル抗体クローン(10A8H4G4)の樹立に成功した。この抗体クローンを肺がん臨床検体の免疫組織化学染色に用いると、RealTime-PCRによりFZD10の発現レベルが高いことが確認された肺がん検体では陽性所見が認められるが、FZD10の発現レベルが低いことが確認された肺がん検体ではほとんど染色されないことが実証された。さらに、市販の抗FZD10抗体を用いるとFZD10強制発現細胞株、非発現細胞株いずれから作製された試料においても染色が認められたのに対し、本発明の抗FZD10抗体を用いた場合はFZD10強制発現細胞株から作製された試料において特異的に染色されることが明らかになった。このように高い抗原特異性を有する本発明の抗体は、FZD10発現レベルが高い患者、ひいてはFZD10阻害剤による治療が有効である可能性が高い患者を選択する上で有利である。
本発明の抗FZD10マウスモノクローナル抗体クローン(10A8H4G4)の重鎖可変領域(H鎖V領域)および軽鎖可変領域(L鎖V領域)のアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO:7および8に示されている。
重鎖可変領域および軽鎖可変領域に含まれるCDR(相補性決定領域)は、当技術分野において周知の方法にしたがって決定することができる。例えば、Kabatら(Kabat E. A. et al. (1991) Sequence of Proteins of Immunological Interest. 5th Edition)またはChothiaら(Chothia et al. J. Mol. Biol. (1987) 196; 901-917)によって記載された方法が、CDR決定に関して一般的に用いられる。Kabatの定義によって決定された本発明の抗FZD10マウスモノクローナル抗体クローン(10A8H4G4)の重鎖可変領域のCDR1、2、3は、それぞれSEQ ID NO:1、2、3に示されており、このクローンの軽鎖可変領域のCDR1、2、3は、それぞれSEQ ID NO:4、5、6に示されている。
したがって本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のいずれかまたは両方を含む、FZD10タンパク質またはその部分ペプチドに結合することができる、抗体またはその抗原結合性断片であって、該重鎖可変領域は、
SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を含むCDR1;
SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列を含むCDR2;および
SEQ ID NO:3に示されるアミノ酸配列を含むCDR3
を含み、該軽鎖可変領域は、
SEQ ID NO:4に示されるアミノ酸配列を含むCDR1;
SEQ ID NO:5に示されるアミノ酸配列を含むCDR2;および
SEQ ID NO:6に示されるアミノ酸配列を含むCDR3
を含む、抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を含むCDR1;
SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列を含むCDR2;および
SEQ ID NO:3に示されるアミノ酸配列を含むCDR3
を含み、該軽鎖可変領域は、
SEQ ID NO:4に示されるアミノ酸配列を含むCDR1;
SEQ ID NO:5に示されるアミノ酸配列を含むCDR2;および
SEQ ID NO:6に示されるアミノ酸配列を含むCDR3
を含む、抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
本発明において、本発明の抗体が結合するFZD10タンパク質の部分ペプチドは、好ましくは、FZD10タンパク質のN末端細胞外ドメインペプチドであり、例えば、FZD10タンパク質(SEQ ID NO:22)の21-161位に当たるアミノ酸配列(SEQ ID NO:9)を含み、かつSEQ ID NO:22から選択されたアミノ酸配列からなる。より好ましくは、本発明におけるFZD10タンパク質の部分ペプチドは、SEQ ID NO:9のアミノ酸配列からなることができる。
上記の「SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を含むCDR1;SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列を含むCDR2;およびSEQ ID NO:3に示されるアミノ酸配列を含むCDR3」を含む重鎖可変領域の1つの例は、SEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域である。上記の「SEQ ID NO:4に示されるアミノ酸配列を含むCDR1;SEQ ID NO:5に示されるアミノ酸配列を含むCDR2;およびSEQ ID NO:6に示されるアミノ酸配列を含むCDR3」を含む軽鎖可変領域の1つの例は、SEQ ID NO:8に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域である。
したがって、一態様において、本発明は、SEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:8に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のいずれかまたは両方を含む、抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
本発明の抗体は従来の方法によって調製することができる。例えば、従来の遺伝子組み換え技術にしたがって、抗体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを適切なベクターに組み込み、該ベクターを宿主に導入し、かつ該宿主から抗体を産生させることによって、抗体を調製することができる(例えば、Vandamme, A. M. et al., Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-75を参照されたい)。
本発明の抗体の可変領域(V領域)をコードするポリヌクレオチドの核酸配列は、本発明の抗体のV領域のアミノ酸配列から推定することができる。本発明の抗体クローンの重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)をコードする核酸配列としては、それぞれ、例えば、SEQ ID NO:10および11に示される核酸配列を用いることができる。本発明の抗体のV領域をコードするポリヌクレオチドは、固相技術(Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron (1992) 48, 2223-311; Matthes et al., EMBO J (1984) 3, 801-5)およびオリゴヌクレオチド合成技術(Jones et al. Nature (1986) 321, 522-5)のような従来の方法によって配列情報に基づき合成することができる。
抗体V領域をコードするポリヌクレオチドを、抗体定常(C)領域をコードするポリヌクレオチドを含んだ発現ベクターに組み込む。
本発明において用いられる抗体の産生のため、該抗体(抗体遺伝子)をコードするポリヌクレオチドを、発現制御要素(例えば、エンハンサー、プロモーター)の制御下で抗体遺伝子が発現できるように、発現ベクターに組み込む。発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。
本発明において用いられる抗体の産生のため、該抗体(抗体遺伝子)をコードするポリヌクレオチドを、発現制御要素(例えば、エンハンサー、プロモーター)の制御下で抗体遺伝子が発現できるように、発現ベクターに組み込む。発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。
抗体遺伝子の発現において、抗体のH鎖をコードするポリヌクレオチドとL鎖をコードするポリヌクレオチドを別個の発現ベクターに組み込んでもよく、その後、得られた組み換え発現ベクターを宿主細胞に同時形質転換する。あるいは、抗体のH鎖をコードするポリヌクレオチドとL鎖をコードするポリヌクレオチドの両方を単一の発現ベクターに一緒に組み込んでもよく、その後、得られた組み換え発現ベクターを宿主細胞に形質転換する(例えば、国際公開公報第94/11523号)。
抗体遺伝子は公知の方法によって発現させることができる。哺乳類細胞における発現の場合、従来の有用なプロモーター、発現される抗体遺伝子、およびポリ(A)シグナル(抗体遺伝子の3'末端に対して下流に位置する)を、機能的に連結させることができる。例えば、有用なプロモーター/エンハンサー系として、ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター/エンハンサー系を用いることができる。
他のプロモーター/エンハンサー系、例えば、ウイルス(例えば、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルスおよびサルウイルス40(SV40))に由来するもの、ならびに哺乳類細胞に由来するもの(例えば、ヒト伸長因子1α(HEF1α))を本発明における抗体の発現に用いることもできる。
SV40プロモーター/エンハンサー系が用いられる場合、遺伝子発現はMulliganら(Nature (1979) 277, 108-14.)の方法によって容易に行うことができる。HEF1αプロモーター/エンハンサー系が用いられる場合、遺伝子発現はMizushimaら(Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322.)の方法によって容易に行うことができる。
他のプロモーター/エンハンサー系、例えば、ウイルス(例えば、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルスおよびサルウイルス40(SV40))に由来するもの、ならびに哺乳類細胞に由来するもの(例えば、ヒト伸長因子1α(HEF1α))を本発明における抗体の発現に用いることもできる。
SV40プロモーター/エンハンサー系が用いられる場合、遺伝子発現はMulliganら(Nature (1979) 277, 108-14.)の方法によって容易に行うことができる。HEF1αプロモーター/エンハンサー系が用いられる場合、遺伝子発現はMizushimaら(Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322.)の方法によって容易に行うことができる。
大腸菌における発現の場合、従来の有用なプロモーター、関心対象の抗体を分泌させるためのシグナル配列、および抗体遺伝子を、機能的に連結させることができる。プロモーターとして、lacZプロモーターまたはaraBプロモーターを用いることができる。lacZプロモーターが用いられる場合、遺伝子発現はWardら(Nature (1098) 341, 544-6.; FASBE J. (1992) 6, 2422-7.)の方法によって行うことができ、その一方でaraBプロモーターが用いられる場合、遺伝子発現はBetterら(Science (1988) 240, 1041-3.)の方法によって行うことができる。
抗体の分泌のためのシグナル配列に関して、関心対象の抗体が大腸菌の細胞周辺腔に分泌されることが意図される場合、pelBシグナル配列(Lei, S.P. et al, J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-83.)を用いることができる。細胞周辺腔の中に分泌された抗体を単離し、その後、抗体が適切な立体構造をとるように再び折り畳ませる。
ウイルス(例えば、SV40、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス(BPV))などに由来する複製起点を用いることができる。宿主細胞系における遺伝子コピー数を増加させるために、発現ベクターには、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ(APH)遺伝子、チミジンキナーゼ(TK)遺伝子、大腸菌キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Ecogpt)遺伝子およびジヒドロ葉酸レダクターゼ(dhfr)遺伝子などの選択マーカー遺伝子をさらに含めてもよい。本発明において用いられる抗体の産生に関しては、真核生物および原核生物の細胞系を含む任意の発現系を用いることができる。真核生物細胞には、動物(例えば、哺乳類、昆虫、カビおよび真菌、酵母)の樹立細胞株が含まれる。原核生物細胞には、大腸菌細胞などの細菌細胞が含まれる。本発明において用いられる抗体は、CHO細胞、COS細胞、骨髄腫細胞、BHK細胞、Vero細胞、およびHeLa細胞などの哺乳類細胞において発現されることが好ましい。
次に、形質転換された宿主細胞をインビトロまたはインビボで培養して、関心対象の抗体を産生させる。宿主細胞の培養は任意の公知の方法によって行うことができる。本明細書において使用できる培養培地は、DMEM、MEM、RPMI-1640またはIMDM培地であってよい。培養培地は、ウシ胎仔血清(FCS)などの血清サプリメントを含んでもよい。
組み換え抗体の産生において、上記の宿主細胞のほかに、トランスジェニック動物を宿主として用いることもできる。例えば、抗体遺伝子を、動物の母乳中で元来産生されるタンパク質(例えば、βカゼイン)をコードする遺伝子の所定部位へ挿入して、融合遺伝子を調製する。抗体遺伝子が導入された融合遺伝子を含むDNA断片を非ヒト動物の胚へ注射し、この胚を次に、雌性動物へ導入する。該胚を体内に有する該雌性動物はトランスジェニック非ヒト動物を産む。関心対象の抗体は該トランスジェニック非ヒト動物またはその子孫から母乳中に分泌される。該抗体を含有する母乳の量を増加させる目的で、適切なホルモンを該トランスジェニック動物に投与することができる(Ebert, K.M. et al, Bio/Technology (1994) 12, 699-702.)。
上記のように発現され産生された抗体を、細胞または宿主動物の体から単離し、精製することができる。本発明において用いられる抗体の単離および精製は、アフィニティーカラムに対して行うことができる。抗体の単離および精製に従来用いられる他の方法を用いることもでき;したがって、方法は特に限定されない。例えば、さまざまなクロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、塩析および透析を単独でまたは組み合わせて用いて、関心対象の抗体を単離および精製することができる(Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)。
(ii)抗体断片
さまざまな技術が抗体断片の産生のために開発されている。従来は、インタクトな抗体のタンパク質分解消化を介してこれらの断片が得られていた(例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992)およびBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照されたい)。しかしながら、これらの断片は現在、組換え宿主細胞によって直接産生することができる。例えば、抗体断片を抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Fab'-SH断片を大腸菌から直接回収し、化学的にカップリングして、F(ab')2断片を形成させてもよい(Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992))。別のアプローチによれば、F(ab')2断片を組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体断片の産生のための他の技術は、当業者には明らかであろう。他の態様において、最適な抗体とは一本鎖Fv断片(scFv)である。WO93/16185号;US5,571,894号;およびUS5,587,458号を参照されたい。また抗体断片は、例えばUS5,641,870号に例えば記載されているように、「直鎖状抗体」であってもよい。そのような直鎖状抗体断片は単一特異性または二重特異性を有しうる。
さまざまな技術が抗体断片の産生のために開発されている。従来は、インタクトな抗体のタンパク質分解消化を介してこれらの断片が得られていた(例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992)およびBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照されたい)。しかしながら、これらの断片は現在、組換え宿主細胞によって直接産生することができる。例えば、抗体断片を抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Fab'-SH断片を大腸菌から直接回収し、化学的にカップリングして、F(ab')2断片を形成させてもよい(Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992))。別のアプローチによれば、F(ab')2断片を組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体断片の産生のための他の技術は、当業者には明らかであろう。他の態様において、最適な抗体とは一本鎖Fv断片(scFv)である。WO93/16185号;US5,571,894号;およびUS5,587,458号を参照されたい。また抗体断片は、例えばUS5,641,870号に例えば記載されているように、「直鎖状抗体」であってもよい。そのような直鎖状抗体断片は単一特異性または二重特異性を有しうる。
(iii)標識化抗体
本発明の抗体を、任意で、アフィニティー標識、酵素標識、放射性同位体標識、蛍光標識、または化学発光標識と結合させる。例えば、FZD10を発現しているがん組織に存在しかつ検出可能な標識の存在によって、診断される対象におけるがんまたは腫瘍の有無の判定が可能になる。また、がん組織における標識の局在性によって、疾患の拡大を判定することもできる。
使用に適した標識には、例えば、フルオレセインおよびローダミン等の蛍光標識;ならびにルシフェラーゼ等の酵素標識が含まれる。使用される検出可能な/検出用の標識は、使用するイメージング様式にしたがって選択される。そのような標識と抗体との結合体は、当技術分野で公知のプロトコルおよび技術を用いて作製することができる。本発明において、本発明の抗体は使用の直前に所望の標識と結合されてもよいし、標識と結合した抗体として提供されてもよい。
本発明の抗体を、任意で、アフィニティー標識、酵素標識、放射性同位体標識、蛍光標識、または化学発光標識と結合させる。例えば、FZD10を発現しているがん組織に存在しかつ検出可能な標識の存在によって、診断される対象におけるがんまたは腫瘍の有無の判定が可能になる。また、がん組織における標識の局在性によって、疾患の拡大を判定することもできる。
使用に適した標識には、例えば、フルオレセインおよびローダミン等の蛍光標識;ならびにルシフェラーゼ等の酵素標識が含まれる。使用される検出可能な/検出用の標識は、使用するイメージング様式にしたがって選択される。そのような標識と抗体との結合体は、当技術分野で公知のプロトコルおよび技術を用いて作製することができる。本発明において、本発明の抗体は使用の直前に所望の標識と結合されてもよいし、標識と結合した抗体として提供されてもよい。
抗体と標識との結合体は、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート、イミノチオラン(IT)、イミドエステルの二官能性誘導体(例えばアジピミド酸ジメチルHCL)、活性エステル(例えばスベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド(例えばグルタルアルデヒド)、ビス-アジド化合物(例えばビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えばビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えばトルエン2,6-ジイソシアネート)、およびビス-活性フッ素化合物(例えば1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン)などの、種々の二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製することができる。あるいは、抗体および標識を含む融合タンパク質を、例えば組換え技術またはペプチド合成により作製することができる。そのような融合タンパク質の好適な例としては、ECFP、EYFP、あるいはEGFP等の標識タンパク質と抗体との融合タンパク質が挙げられる。
III.FZD10関連疾患の診断、FZD10阻害剤による治療効果の高い対象のスクリーニング(治療前診断)、またはFZD10阻害剤による治療後の薬効の判定(治療後診断)
FZD10は、FZD10関連疾患の診断マーカーとして、ならびに当該疾患に罹患している対象におけるFZD10阻害剤に対する応答性および当該阻害剤の薬効を評価するためのマーカーとして有用である。したがって、本発明の抗体は、がんなどのFZD10関連疾患を診断するため、FZD10阻害剤による治療効果の高い対象をスクリーニングするため、またはFZD10阻害剤による治療後の薬効を判定するためのマーカーの検出試薬として用いることができる。
より具体的には、本発明の抗体によって対象から単離した試料中のFZD10タンパク質を検出し、FZD10関連疾患の診断、FZD10阻害剤による治療効果の高い対象のスクリーニング、またはFZD10阻害剤による治療後の薬効の判定を実施することができる。したがって、本発明は、対象から単離した試料において本発明の抗体を用いてFZD10タンパク質を検出することによる、対象においてFZD10関連疾患または該疾患の発症素因を診断する方法、FZD10阻害剤による治療効果の高い対象をスクリーニングする方法、および、FZD10阻害剤による治療後の薬効を判定する方法を提供する。これらの方法は以下の段階を含む:
(a) 対象から単離した試料を本発明の抗体またはその抗原結合性断片と接触させる段階;
(b) 該抗体またはその抗原結合性断片と該試料との結合を検出することによって、該試料中のFZD10タンパク質を検出する段階:および
(c) 該試料中のFZD10タンパク質レベルを対照と比較する段階。
FZD10は、FZD10関連疾患の診断マーカーとして、ならびに当該疾患に罹患している対象におけるFZD10阻害剤に対する応答性および当該阻害剤の薬効を評価するためのマーカーとして有用である。したがって、本発明の抗体は、がんなどのFZD10関連疾患を診断するため、FZD10阻害剤による治療効果の高い対象をスクリーニングするため、またはFZD10阻害剤による治療後の薬効を判定するためのマーカーの検出試薬として用いることができる。
より具体的には、本発明の抗体によって対象から単離した試料中のFZD10タンパク質を検出し、FZD10関連疾患の診断、FZD10阻害剤による治療効果の高い対象のスクリーニング、またはFZD10阻害剤による治療後の薬効の判定を実施することができる。したがって、本発明は、対象から単離した試料において本発明の抗体を用いてFZD10タンパク質を検出することによる、対象においてFZD10関連疾患または該疾患の発症素因を診断する方法、FZD10阻害剤による治療効果の高い対象をスクリーニングする方法、および、FZD10阻害剤による治療後の薬効を判定する方法を提供する。これらの方法は以下の段階を含む:
(a) 対象から単離した試料を本発明の抗体またはその抗原結合性断片と接触させる段階;
(b) 該抗体またはその抗原結合性断片と該試料との結合を検出することによって、該試料中のFZD10タンパク質を検出する段階:および
(c) 該試料中のFZD10タンパク質レベルを対照と比較する段階。
典型的な態様において、前記試料は、前記対象から単離した細胞または組織であり、好ましくは、前記対象から単離した組織である。したがって、通常、本発明の各方法は、いずれも、対象から単離した試料についてインビトロ(in vitro)で実施される。バイオプシ(生検)や採血等の手法によって対象から組織や細胞を単離する手法は公知である。あるいは、治療のための医療的な処置(外科的な手術など)を通じて対象から取り除かれた生体試料を利用することもできる。対象から単離された細胞や組織は、抗体との接触の前に適宜処理することもできる。たとえば、一般に対象から得られた組織試料は、凍結後に切片とし、更にアルコールやホルマリン等で固定して免疫組織学的な解析のための試料とすることができる。あるいはホルマリンなどで組織試料や培養細胞等を固定後に、パラフィン包埋して免疫組織学的な解析のための切片を得ることもできる。
本発明の抗体またはその抗原結合性断片の、試料との結合、すなわち、試料中の抗原タンパク質との結合は、当業者公知の方法により検出することができる。より具体的には、本発明の抗体と前記試料との接触後、試料中のFZD10に結合しなかったものを洗浄によって取り除き、その後に試料中に残る抗体を検出することにより、本発明の抗体と試料中のFZD10タンパク質の結合を検出することができる。このとき、抗体が直接標識されている場合には、標識を検出することによってFZD10タンパク質に結合した本発明の抗体の存在を検出することができる。標識が、酵素、蛍光物質、発光物質、あるいは粒子等の検出可能なものであれば、これらの標識を直ちに検出することができる。その他、本発明の抗体をビオチンなどのアフィニティー物質(結合性物質)で標識した場合(アフィニティー標識)には、標識アビジン等の結合パートナーで抗体の存在を捕捉することができる。あるいは本発明の抗体が直接標識されていない場合には、抗体に対する結合試薬によって本発明の抗体を検出することができる。たとえば、抗体結合試薬として、プロテインAや抗体に対する抗体を標識して抗体の検出に利用することができる。
FZD10関連疾患の診断の場合、前記段階(c)において、対照レベル(正常対照レベル、好ましくは、FZD10関連疾患を患っていない健常対象から単離した試料中のFZD10タンパク質の発現レベル)と比較してFZD10タンパク質レベルが高いときに、対象がFZD10関連疾患を患っているかまたはその発症リスクを有することが示される。
また、FZD10阻害剤による治療効果の高い対象のスクリーニングの場合、前記段階(c)において、対照レベル(好ましくは、FZD10関連疾患と診断された対象の組織におけるFZD10タンパク質の発現レベル)と比較してFZD10タンパク質レベルが同程度かそれよりも高いときに、対象におけるFZD10阻害剤による治療効果が高いことが示される。
一方、FZD10阻害剤による治療後の薬効の判定の場合、前記段階(c)において、対照レベル(好ましくは、薬剤投与前の対象から単離した試料中のFZD10タンパク質の発現レベル)と比較してFZD10タンパク質レベルが低いときに、対象における薬効があったことが示される。
また、FZD10阻害剤による治療効果の高い対象のスクリーニングの場合、前記段階(c)において、対照レベル(好ましくは、FZD10関連疾患と診断された対象の組織におけるFZD10タンパク質の発現レベル)と比較してFZD10タンパク質レベルが同程度かそれよりも高いときに、対象におけるFZD10阻害剤による治療効果が高いことが示される。
一方、FZD10阻害剤による治療後の薬効の判定の場合、前記段階(c)において、対照レベル(好ましくは、薬剤投与前の対象から単離した試料中のFZD10タンパク質の発現レベル)と比較してFZD10タンパク質レベルが低いときに、対象における薬効があったことが示される。
本発明の診断方法によって、FZD10関連疾患を有することが示された患者は、FZD10阻害剤による治療の対象となる可能性が高い。したがって、本発明の診断方法に続いて、FZD10関連疾患を有することが示された患者にFZD10阻害剤を投与することができる。あるいは、FZD10阻害剤の治療効果が高い可能性が示された患者にも、スクリーニングを経て、FZD10阻害剤を投与することができる。更に、FZD10阻害剤の投与を受けた患者において、当該阻害剤の治療効果が有ったことが示された場合にも、引き続き、同じ患者にFZD10阻害剤を投与することができる。
すなわち本発明は、以下の群から選択されるいずれかの患者を本発明の方法によって特定し、当該患者にFZD10阻害剤を投与する工程を含む、FZD10関連疾患の治療方法に関する;
本発明の診断方法によって、FZD10関連疾患を有することが示された患者;
FZD10阻害剤の治療効果が高い可能性が示された患者;そして
FZD10阻害剤の投与を受けた患者において、当該阻害剤の治療効果が有ったことが示された患者。
すなわち本発明は、以下の群から選択されるいずれかの患者を本発明の方法によって特定し、当該患者にFZD10阻害剤を投与する工程を含む、FZD10関連疾患の治療方法に関する;
本発明の診断方法によって、FZD10関連疾患を有することが示された患者;
FZD10阻害剤の治療効果が高い可能性が示された患者;そして
FZD10阻害剤の投与を受けた患者において、当該阻害剤の治療効果が有ったことが示された患者。
本発明において、患者に投与されるFZD10阻害剤には、公知の化合物を使用することができる。本明細書においては、FZD10発現細胞に対して細胞傷害活性を示す抗体や、FZD10の発現を抑制する二本鎖RNA分子もFZD10阻害剤に含まれる。このような抗体や二本鎖RNA分子としては、たとえば、WO2005/004912またはWO2007/148417に開示されているFZD10に対する抗体、およびWO2006/013733に開示されているFZD10に特異的なsiRNAを挙げることができる。
本発明との関連において、FZD10関連疾患を患っていない(例えば、非がん性である)とわかっている生体試料から測定された対照レベルは「正常対照レベル」と称される。対象から単離された試料におけるFZD10タンパク質レベルが正常対照レベルと比較して高い場合、対象は治療をうけるべきFZD10関連疾患を有する、と診断されうる。
一方、FZD10関連疾患を患っている(例えば、がん性である)とわかっている生体試料から測定された対照レベルは「疾患対照レベル(例えば、がん性対照レベル)」と称される。FZD10阻害剤による治療前の対象から単離された試料におけるFZD10タンパク質レベルが疾患対照レベルと同程度かそれよりも高い場合、対象はFZD10阻害剤による治療効果が高い、と診断されうる。
また、FZD10阻害剤による治療後の対象から単離された試料におけるFZD10タンパク質レベルが薬剤投与前の同対象の疾患対照レベルより低い場合、治療による薬効があった、すなわち、対象はFZD10阻害剤による治療効果が高い、と診断されうる。
一方、FZD10関連疾患を患っている(例えば、がん性である)とわかっている生体試料から測定された対照レベルは「疾患対照レベル(例えば、がん性対照レベル)」と称される。FZD10阻害剤による治療前の対象から単離された試料におけるFZD10タンパク質レベルが疾患対照レベルと同程度かそれよりも高い場合、対象はFZD10阻害剤による治療効果が高い、と診断されうる。
また、FZD10阻害剤による治療後の対象から単離された試料におけるFZD10タンパク質レベルが薬剤投与前の同対象の疾患対照レベルより低い場合、治療による薬効があった、すなわち、対象はFZD10阻害剤による治療効果が高い、と診断されうる。
特定の態様において、治療すべきFZD10関連疾患(例えば、がん)を有する器官の非罹患領域(例えば、非がん性領域)から得られた正常細胞(または組織)を、正常対照として用いてもよい。別の態様において、対照レベルは、疾患状態(例えば、がん性または非がん性)がわかっている対象由来の試料中の予め測定されたFZD10タンパク質レベルを解析することによって得られた結果に基づいて、統計的方法により決定してもよい。さらに、対照レベルは、以前に試験された試料(細胞または組織)に由来する発現パターンのデータベースに由来し得る。評価対象の試料が組織試料である場合、それと同じ組織に由来する試料を対照試料とすることが好ましい。
さらに、本発明の1つの局面に従って、生体試料中のFZD10タンパク質レベルを、複数の参照試料から測定される複数の対照レベルと比較してもよい。対象由来の生体試料の組織型と類似の組織型に由来する参照試料から測定された対照レベルを用いることが好ましい。さらに、疾患状態が判明している集団におけるFZD10タンパク質レベルの基準値を用いることが好ましい。基準値は、当技術分野において公知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均値 +/- 2 S.D.または平均値 +/- 3 S.D.の範囲を、基準値として用いることができる。
試料中のFZD10タンパク質レベルは、そのレベルが対照レベルから例えば10%、25%、もしくは50%高いか、または1.1倍超、1.5倍超、2.0倍超、5.0倍超、10.0倍超、もしくはそれ以上高い場合に、高いとみなすことができる。試料中のFZD10タンパク質レベルは、そのレベルが対照レベルから例えば10%、25%、もしくは50%低いか、または1.1倍超、1.5倍超、2.0倍超、5.0倍超、10.0倍超、もしくはそれ以上低い場合に、低いとみなすことができる。
典型的な態様において、FZD10関連疾患はFZD10を発現しているがんである。FZD10を発現しているがんは、例えば、滑膜肉腫、肺がん、食道がん、結腸直腸がん(大腸がん)、胃がん、慢性骨髄性白血病(CML)および急性骨髄性白血病(AML)であるが、これらに限定されない。
さらなる態様において、本発明は、FZD10関連疾患または該疾患の発症素因の診断マーカーを検出する方法であって、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を用いて試料中のFZD10タンパク質を当該診断マーカーとして検出する段階を含む方法を提供する。FZD10は、ある種のがん細胞において正常組織と比較して発現が増強していることが明らかにされている。したがって、FZD10の発現レベルを特異的に検出することができれば、それが関連する疾患の診断マーカーとして有用である。本発明との関連において、FZD10関連疾患または該疾患の発症素因の診断マーカーとは、本発明の抗体またはその抗原結合性断片との結合によって検出される、対象から単離された試料中のFZD10タンパク質であって、その発現レベルが対照レベルと比較して高いときに当該対象が当該疾患を患っているかまたはその発症リスクを有することが示されることを特徴とする。ここで、前記対照レベルは、正常対照レベル、好ましくは、FZD10関連疾患を患っていない健常対象から単離した試料中のFZD10タンパク質の発現レベルである。一般に対照レベルは、診断マーカーを検出しようとするがん細胞が由来する組織と同じ組織における発現レベルであることが好ましい。
本発明はまた、FZD10関連疾患または該疾患の発症素因の診断における使用のための、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を提供する。あるいは、本発明は、FZD10関連疾患または該疾患の発症素因を診断するための試薬の製造における、本発明の抗体またはその抗原結合性断片の使用を提供する。
本発明はまた、FZD10関連疾患または該疾患の発症素因の診断における使用のための、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を提供する。あるいは、本発明は、FZD10関連疾患または該疾患の発症素因を診断するための試薬の製造における、本発明の抗体またはその抗原結合性断片の使用を提供する。
加えて、本発明は、FZD10阻害剤治療応答性マーカーを検出する方法であって、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を用いて試料中のFZD10タンパク質を当該応答性マーカーとして検出する段階を含む方法を提供する。FZD10は、ある種のがん細胞において特異的に発現が増強しており、そのようながん細胞の増殖がFZD10阻害剤によって抑制されることが明らかにされている(WO2005/004912、WO2006/013733、WO2007/148417)。つまり、FZD10の発現を指標として、FZD10阻害剤に対する応答性を予測することができる。FZD10を高いレベルで発現していれば、FZD10阻害剤による細胞増殖抑制作用が期待できるためである。したがって、FZD10の発現レベルを特異的に検出することができれば、FZD10阻害剤治療応答性マーカーとして有用である。本発明との関連において、FZD10阻害剤治療応答性マーカーとは、本発明の抗体またはその抗原結合性断片との結合によって検出される、対象から単離された試料中のFZD10タンパク質であって、その発現レベルが対照レベルと比較して同程度かそれよりも高いときに当該対象におけるFZD10阻害剤による治療効果が高いことが示されることを特徴とする。ここで、前記対照レベルは、好ましくは、疾患対照レベル、すなわちFZD10関連疾患を患っているとわかっている対象の疾患部位から単離された試料におけるFZD10タンパク質の発現レベル、特に好ましくは、FZD10阻害剤による治療効果の高い対象から治療前に単離された試料におけるFZD10タンパク質の発現レベルである。
本発明はまた、FZD10阻害剤による治療効果の高い対象のスクリーニングにおける使用のための、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を提供する。あるいは、本発明は、FZD10阻害剤による治療効果の高い対象をスクリーニングするための試薬の製造における、本発明の抗体またはその抗原結合性断片の使用を提供する。
本発明はまた、FZD10阻害剤による治療効果の高い対象のスクリーニングにおける使用のための、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を提供する。あるいは、本発明は、FZD10阻害剤による治療効果の高い対象をスクリーニングするための試薬の製造における、本発明の抗体またはその抗原結合性断片の使用を提供する。
本発明はさらに、FZD10阻害剤の薬効マーカーを検出する方法であって、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を用いて試料中のFZD10タンパク質を当該薬効マーカーとして検出する段階を含む方法を提供する。FZD10は、ある種のがん細胞において特異的に発現が増強しており、そのようながん細胞の増殖がFZD10阻害剤によって抑制されることが明らかにされている(WO2005/004912、WO2006/013733、WO2007/148417)。そのため、そのようながん細胞を有するがん組織は、FZD10阻害剤によって縮小または死滅し得る。つまり、FZD10の発現レベルを指標として、そのようながん細胞を有する対象におけるFZD10阻害剤の薬効を評価することができる。FZD10陽性のがん細胞を有していた組織から単離された試料におけるFZD10の発現レベルがFZD10阻害剤による治療前に単離された試料と比較して減少していれば、FZD10阻害剤によりFZD10陽性のがん細胞が減少したとみなすことができるためである。したがって、FZD10の発現レベルを特異的に検出することができれば、FZD10阻害剤の薬効マーカーとして有用である。本発明との関連において、FZD10阻害剤の薬効マーカーとは、本発明の抗体またはその抗原結合性断片との結合によって検出される、FZD10阻害剤を投与された対象から単離された試料中のFZD10タンパク質であって、その発現レベルが対照レベルと比較して低いときに当該対象においてFZD10阻害剤の薬効があったことが示されることを特徴とする。ここで、前記対照レベルは、好ましくは、薬剤投与前の当該対象の疾患部位から単離された試料中のFZD10タンパク質の発現レベルである。
本発明はまた、FZD10阻害剤による治療後の薬効の判定における使用のための、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を提供する。あるいは、本発明は、FZD10阻害剤による治療後の薬効を判定するための試薬の製造における、本発明の抗体またはその抗原結合性断片の使用を提供する。
本発明はまた、FZD10阻害剤による治療後の薬効の判定における使用のための、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を提供する。あるいは、本発明は、FZD10阻害剤による治療後の薬効を判定するための試薬の製造における、本発明の抗体またはその抗原結合性断片の使用を提供する。
IV.FZD10関連疾患の診断、FZD10阻害剤による治療効果の高い対象のスクリーニング、またはFZD10阻害剤による治療後の薬効の判定のための試薬またはキット
本発明は、FZD10関連疾患の診断、FZD10阻害剤による治療効果の高い対象のスクリーニング、またはFZD10阻害剤による治療後の薬効の判定のための試薬またはキットを提供する。具体的には、これらのキットは、FZD10タンパク質の検出試薬として、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を含む。一態様において、本発明の診断試薬またはキットのための抗体を蛍光物質、発光物質、または放射性同位体で標識することができる。抗体を標識するための方法および標識抗体を検出するための方法は、当技術分野において周知であり、任意の標識および方法を本発明のために利用することができる。
本発明は、FZD10関連疾患の診断、FZD10阻害剤による治療効果の高い対象のスクリーニング、またはFZD10阻害剤による治療後の薬効の判定のための試薬またはキットを提供する。具体的には、これらのキットは、FZD10タンパク質の検出試薬として、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を含む。一態様において、本発明の診断試薬またはキットのための抗体を蛍光物質、発光物質、または放射性同位体で標識することができる。抗体を標識するための方法および標識抗体を検出するための方法は、当技術分野において周知であり、任意の標識および方法を本発明のために利用することができる。
本キットは、本発明の抗体またはその抗原結合性断片と他のマーカー検出試薬との組み合わせを含むことができる。本キットはさらに、FZD10に対する陽性および陰性の対照試薬、ならびに本発明の抗体を検出するための二次抗体を含むことができる。例えば、FZD10を高発現していることがわかっている細胞株の培養切片または組織試料は、有用な陽性対照試薬として役立ちうる。また、例えば、健常対象または非がん性組織から得られた組織試料は、有用な陰性対照試薬として役立ちうる。本発明の抗体を検出するための二次抗体は、蛍光物質、発光物質、放射性同位体、または酵素で標識されていることが好ましい。本発明のキットはさらに、緩衝液、希釈液、フィルタ、針、シリンジ、および使用説明を記した添付文書(例えば書面、テープ、CD-ROMなど)を含めて、商業的見地または使用者の立場から望ましい他の材料を含んでもよい。これらの試薬などを、ラベルした容器中に保持することができる。適切な容器としてはボトル、バイアル、および試験管が含まれる。容器はガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成することができる。
本発明をその特定の態様に関して本明細書において詳細に説明してきたが、前述の説明は事実上、例示的かつ説明的なものであって、本発明およびその好ましい態様を説明することを意図していることが理解されるべきである。当業者は、慣例的な実験を通して、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更および修正がその中でなされ得ることを容易に理解するであろう。したがって本発明は、上記の説明によって規定されるのではなく、添付の特許請求の範囲におよびそれらの等価物によって規定されることが意図される。
以下、実施例を参照して本発明をより詳細に記載する。しかしながら、以下の材料、方法および実施例は、本発明のある形態の作製および使用において当業者を支援するために役立ち得る一方、本発明の局面を説明するためのものにすぎず、したがって本発明の範囲を決して限定することを意図しない。当業者は、本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができる。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
〔材料および方法〕
細胞培養
ATCCから購入したヒト大腸がん細胞株であるDLD1にFZD10発現ベクターを導入させたFZD10強制発現細胞株(FZD10/DLD1)を作製し、陰性対照としてEmpty Vectorを導入させた細胞株(Mock/DLD1)を作製した。5%CO2の加湿雰囲気中37℃で、10%ウシ胎仔血清(FBS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシンおよび0.8mg/mL GENETICINを補充したRPMI-1640中で維持した。国立がん研究センター希少がんセンターから分与されたヒト滑膜肉腫細胞株であるSYO-1は、5%CO2の加湿雰囲気中37℃で、10%ウシ胎仔血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEM中で維持した。JCRBから購入したヒト食道がん細胞株であるT.Tは、5%CO2の加湿雰囲気中37℃で、10%ウシ胎仔血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEM/F12(1:1)中で維持した。ATCCから購入したヒト肺がん細胞株であるH727は、5%CO2の加湿雰囲気中37℃で、10%ウシ胎仔血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したRPMI-1640中で維持した。ATCCから購入したヒト大腸がん細胞株であるCOLO201は、5%CO2の加湿雰囲気中37℃で、10%ウシ胎仔血清(FBS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、10mM HEPES、1mM Sodium pyruvateおよび4.5g/L グルコースを補充したRPMI-1640中で維持した。ATCCから購入したヒト大腸がん細胞株であるLoVoは、CO2の加湿雰囲気中37℃で、20%ウシ胎仔血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したF12中で維持した。
細胞培養
ATCCから購入したヒト大腸がん細胞株であるDLD1にFZD10発現ベクターを導入させたFZD10強制発現細胞株(FZD10/DLD1)を作製し、陰性対照としてEmpty Vectorを導入させた細胞株(Mock/DLD1)を作製した。5%CO2の加湿雰囲気中37℃で、10%ウシ胎仔血清(FBS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシンおよび0.8mg/mL GENETICINを補充したRPMI-1640中で維持した。国立がん研究センター希少がんセンターから分与されたヒト滑膜肉腫細胞株であるSYO-1は、5%CO2の加湿雰囲気中37℃で、10%ウシ胎仔血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEM中で維持した。JCRBから購入したヒト食道がん細胞株であるT.Tは、5%CO2の加湿雰囲気中37℃で、10%ウシ胎仔血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEM/F12(1:1)中で維持した。ATCCから購入したヒト肺がん細胞株であるH727は、5%CO2の加湿雰囲気中37℃で、10%ウシ胎仔血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したRPMI-1640中で維持した。ATCCから購入したヒト大腸がん細胞株であるCOLO201は、5%CO2の加湿雰囲気中37℃で、10%ウシ胎仔血清(FBS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、10mM HEPES、1mM Sodium pyruvateおよび4.5g/L グルコースを補充したRPMI-1640中で維持した。ATCCから購入したヒト大腸がん細胞株であるLoVoは、CO2の加湿雰囲気中37℃で、20%ウシ胎仔血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したF12中で維持した。
臨床検体
外科的に切除された肺がんからの組織試料(ホルマリン固定パラフィン切片、凍結組織)、ならびにそれらの対応する臨床的情報は、書面によるインフォームドコンセントをとった上で、神奈川がんセンターから入手した。
外科的に切除された肺がんからの組織試料(ホルマリン固定パラフィン切片、凍結組織)、ならびにそれらの対応する臨床的情報は、書面によるインフォームドコンセントをとった上で、神奈川がんセンターから入手した。
免疫組織化学染色(IHC)
ホルマリン固定パラフィン切片化したFZD10/DLD1、Mock/DLD1、SYO1、T.T、H727、LoVo、COLO201および臨床検体を、キシレンに3分間3回浸漬して脱パラフィンした後、100%エタノールに1分間2回、90%、70%、および50%エタノールにてそれぞれ1分間浸漬して再水和させた。抗原賦活化処理のために抗原賦活化液pH9(ニチレイバイオサイエンス)に浸漬させた切片をFZD10/DLD1、Mock/DLD1は125℃30秒間、SYO1、T.T、H727、LoVo、COLO201および臨床検体は95℃40分間インキュベートした。インキュベート後、20分間室温放置し、流水にて5分間水洗した。3.0%過酸化水素水にて10分間浸漬して内因性ペルオキシダーゼのブロッキングを行ない、Wash Buffer(TBS-T(Takara Bio))にて、5分間3回洗浄した。さらに、非特異的な反応をブロックする目的で切片上にProtein Block液(Dako)を適量滴下し、10分間静置した。湿潤箱にて1次抗体(FZD10Ab(10A8H4G4)、FZD10(L164)pAb、FZD10 PolyclonalAb)をそれぞれ適量適下し、60分間静置後、Wash Bufferにて、5分間3回洗浄した。湿潤箱にて2次抗体としてヒストファイン シンプルステイン MAX-PO(ニチレイバイオサイエンス)を適量適下し、30分間静置した。Wash Bufferにて、5分間3回洗浄した。DAB基質溶液(ニチレイバイオサイエンス)により発色反応を行なった。スライド切片をヘマトキシリン(Dako)に20秒間浸漬し、流水で洗浄した。50%、70%、および90%エタノールにてそれぞれ1分間、および100%エタノールに1分間2回浸漬して脱水を行なった。最後に、切片をキシレンで3分間2回浸漬して透徹し、Mount-Quick(DAIDO SANGYO)によって封入した。
ホルマリン固定パラフィン切片化したFZD10/DLD1、Mock/DLD1、SYO1、T.T、H727、LoVo、COLO201および臨床検体を、キシレンに3分間3回浸漬して脱パラフィンした後、100%エタノールに1分間2回、90%、70%、および50%エタノールにてそれぞれ1分間浸漬して再水和させた。抗原賦活化処理のために抗原賦活化液pH9(ニチレイバイオサイエンス)に浸漬させた切片をFZD10/DLD1、Mock/DLD1は125℃30秒間、SYO1、T.T、H727、LoVo、COLO201および臨床検体は95℃40分間インキュベートした。インキュベート後、20分間室温放置し、流水にて5分間水洗した。3.0%過酸化水素水にて10分間浸漬して内因性ペルオキシダーゼのブロッキングを行ない、Wash Buffer(TBS-T(Takara Bio))にて、5分間3回洗浄した。さらに、非特異的な反応をブロックする目的で切片上にProtein Block液(Dako)を適量滴下し、10分間静置した。湿潤箱にて1次抗体(FZD10Ab(10A8H4G4)、FZD10(L164)pAb、FZD10 PolyclonalAb)をそれぞれ適量適下し、60分間静置後、Wash Bufferにて、5分間3回洗浄した。湿潤箱にて2次抗体としてヒストファイン シンプルステイン MAX-PO(ニチレイバイオサイエンス)を適量適下し、30分間静置した。Wash Bufferにて、5分間3回洗浄した。DAB基質溶液(ニチレイバイオサイエンス)により発色反応を行なった。スライド切片をヘマトキシリン(Dako)に20秒間浸漬し、流水で洗浄した。50%、70%、および90%エタノールにてそれぞれ1分間、および100%エタノールに1分間2回浸漬して脱水を行なった。最後に、切片をキシレンで3分間2回浸漬して透徹し、Mount-Quick(DAIDO SANGYO)によって封入した。
リアルタイム(RT)PCR
RNeasy Mini kit(QIAGEN)を用いてがん細胞株(SYO-1、COLO201)より総RNAを抽出した。臨床凍結組織(肺扁平上皮がん)については、TRIzol Reagent(Invitrogen)に凍結組織片を浸けてすり潰しクロロホルム抽出を行なった。得られた抽出液におおよそ等量の70%エタノールを加えて、RNeasy Mini kit(QIAGEN)を用いて総RNAを抽出した。SuperScript III Reverse Transcriptase(Invitrogen)の逆転写酵素を用いて総RNAよりcDNAを合成した。cDNAを鋳型としてKAPA SYBR FAST ABI Prism qPCR kit(KAPA Biosystems)を用いてPCR反応を行なった。発現解析目的遺伝子はFZD10、ハウスキーピング遺伝子はGAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)とした。FZD10は、FZD10-11F:5'-GTGTGCAGCCGTAGGTTAAAG-3'(SEQ ID NO:12)、FZD10 R5:5'-GACTGGGCAGGGATCTCATA-3'(SEQ ID NO:13)のプライマーセットを用いて、GAPDHは、GAPDH RT-PCR Fw:5'-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3'(SEQ ID NO:14)、GAPDH RT-PCR Re:5'-GGTCCACCACTGACACGTTG-3'(SEQ ID NO:15)のプライマーセットを用いてリアルタイムPCR反応を行なった。PCR増幅産物量を経時的にモニタリングし、PCR増幅産物が指数関数的に増幅している領域に閾値を設定してCt値を算出した。検量線にCt値をあてはめて未知サンプルの濃度を算出した。FZD10遺伝子の定量値をGAPDH遺伝子の定量値で割ることにより、サンプル間の鋳型量の標準化を行ない、FZD10遺伝子の発現量を比較した。
RNeasy Mini kit(QIAGEN)を用いてがん細胞株(SYO-1、COLO201)より総RNAを抽出した。臨床凍結組織(肺扁平上皮がん)については、TRIzol Reagent(Invitrogen)に凍結組織片を浸けてすり潰しクロロホルム抽出を行なった。得られた抽出液におおよそ等量の70%エタノールを加えて、RNeasy Mini kit(QIAGEN)を用いて総RNAを抽出した。SuperScript III Reverse Transcriptase(Invitrogen)の逆転写酵素を用いて総RNAよりcDNAを合成した。cDNAを鋳型としてKAPA SYBR FAST ABI Prism qPCR kit(KAPA Biosystems)を用いてPCR反応を行なった。発現解析目的遺伝子はFZD10、ハウスキーピング遺伝子はGAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)とした。FZD10は、FZD10-11F:5'-GTGTGCAGCCGTAGGTTAAAG-3'(SEQ ID NO:12)、FZD10 R5:5'-GACTGGGCAGGGATCTCATA-3'(SEQ ID NO:13)のプライマーセットを用いて、GAPDHは、GAPDH RT-PCR Fw:5'-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3'(SEQ ID NO:14)、GAPDH RT-PCR Re:5'-GGTCCACCACTGACACGTTG-3'(SEQ ID NO:15)のプライマーセットを用いてリアルタイムPCR反応を行なった。PCR増幅産物量を経時的にモニタリングし、PCR増幅産物が指数関数的に増幅している領域に閾値を設定してCt値を算出した。検量線にCt値をあてはめて未知サンプルの濃度を算出した。FZD10遺伝子の定量値をGAPDH遺伝子の定量値で割ることにより、サンプル間の鋳型量の標準化を行ない、FZD10遺伝子の発現量を比較した。
フローサイトメトリー(FCM)
SYO1、T.T、H727、およびLoVoを、初期コンフルエント(early-confluent)までそれぞれ推奨される培養培地中で維持した。細胞表面抗原の変性を回避するため、次に細胞を、細胞剥離用溶液(Cell Dissociation Solution; SIGMA, MO)で分離させ、0.5% BSA/PBSで懸濁した。セルストレイナーに懸濁した細胞を通して塊をのぞき細胞数をカウントした。細胞を96Wellアッセイプレートに分注した(2×105個/50μL)。希釈済みの試験抗体もしくは培養上清50μLを添加し、4℃で1時間静置した。プレートを1500rpm、4℃で5分間遠心し、上清を除去した後、0.5% BSA/PBS 150μLで2度洗浄した。Alexa Fluor488ヤギ抗マウスIgG(H+L)(Invitrogen, CA)20 mg/mLと混合し、暗所中4℃で1時間静置した。プレートを1500rpm、4℃で5分間遠心し、上清を除去した後、0.5% BSA/PBS 150μLで2度洗浄し、120μLの0.5% BSA/PBSで細胞を懸濁した。試験抗体の結合様式および特異性をFACS Calibur(Becton Dickinson, NJ)により製造元の使用説明書にしたがって評価した。
SYO1、T.T、H727、およびLoVoを、初期コンフルエント(early-confluent)までそれぞれ推奨される培養培地中で維持した。細胞表面抗原の変性を回避するため、次に細胞を、細胞剥離用溶液(Cell Dissociation Solution; SIGMA, MO)で分離させ、0.5% BSA/PBSで懸濁した。セルストレイナーに懸濁した細胞を通して塊をのぞき細胞数をカウントした。細胞を96Wellアッセイプレートに分注した(2×105個/50μL)。希釈済みの試験抗体もしくは培養上清50μLを添加し、4℃で1時間静置した。プレートを1500rpm、4℃で5分間遠心し、上清を除去した後、0.5% BSA/PBS 150μLで2度洗浄した。Alexa Fluor488ヤギ抗マウスIgG(H+L)(Invitrogen, CA)20 mg/mLと混合し、暗所中4℃で1時間静置した。プレートを1500rpm、4℃で5分間遠心し、上清を除去した後、0.5% BSA/PBS 150μLで2度洗浄し、120μLの0.5% BSA/PBSで細胞を懸濁した。試験抗体の結合様式および特異性をFACS Calibur(Becton Dickinson, NJ)により製造元の使用説明書にしたがって評価した。
〔実施例1〕抗FZD10モノクローナル抗体の作製
(1)可溶型FZD10タンパク質を免疫原とした抗FZD10抗体産生ハイブリドーマの取得
FZD10は膜タンパク質であるため、固定された膜タンパク質に反応する抗体作製には細胞外領域が免疫原となりうる。FZD10のN末端以外の細胞外領域は非常に短く、抗原とするには困難であると考えられたことから、N末端の細胞外領域(1-161アミノ酸)を免疫原として選択し、シグナルペプチドを除く可溶型FZD10タンパク質(21-161アミノ酸領域)(SEQ ID NO:9)を免疫原としてモノクローナル抗体を作製した。Freund Adjuvantに抗原ペプチド50μgを加えた後、エマルジョン化して、Balb/cマウス(日本エスエルシー株式会社)の皮下に注射する事により初回免疫を行った。2回目以降の免疫は同様に調製した25μg抗原ペプチド量相当を皮下に注射することにより実施した。最終免疫から3日後にマウスから脾臓細胞を無菌的に調製し、常法に従って、ポリエチレングリコール法によりマウスミエローマ細胞SP2/0との細胞融合を行った。
(1)可溶型FZD10タンパク質を免疫原とした抗FZD10抗体産生ハイブリドーマの取得
FZD10は膜タンパク質であるため、固定された膜タンパク質に反応する抗体作製には細胞外領域が免疫原となりうる。FZD10のN末端以外の細胞外領域は非常に短く、抗原とするには困難であると考えられたことから、N末端の細胞外領域(1-161アミノ酸)を免疫原として選択し、シグナルペプチドを除く可溶型FZD10タンパク質(21-161アミノ酸領域)(SEQ ID NO:9)を免疫原としてモノクローナル抗体を作製した。Freund Adjuvantに抗原ペプチド50μgを加えた後、エマルジョン化して、Balb/cマウス(日本エスエルシー株式会社)の皮下に注射する事により初回免疫を行った。2回目以降の免疫は同様に調製した25μg抗原ペプチド量相当を皮下に注射することにより実施した。最終免疫から3日後にマウスから脾臓細胞を無菌的に調製し、常法に従って、ポリエチレングリコール法によりマウスミエローマ細胞SP2/0との細胞融合を行った。
(2)抗FZD10抗体産生ハイブリドーマの選抜
抗FZD10抗体の選抜は、まず可溶性FZD10タンパク質をもちいたELISA法によりFZD10と結合性を有する抗体をスクリーニングした。ELISA法で選択された抗体について更に免疫染色法による選抜を行った。免疫染色法による選抜は、全長FZD10タンパク質(SEQ ID NO:22)を発現するFZD10強制発現細胞株FZD10/DLD1を用いた免疫組織化学染色により行った。すなわち、全長FZD10タンパク質を強制発現させたFZD10強制発現細胞株FZD10/DLD1をホルマリン固定パラフィン切片化した後、免疫染色を実施し、強い反応が認められたハイブリドーマを選抜した。
抗FZD10抗体の選抜は、まず可溶性FZD10タンパク質をもちいたELISA法によりFZD10と結合性を有する抗体をスクリーニングした。ELISA法で選択された抗体について更に免疫染色法による選抜を行った。免疫染色法による選抜は、全長FZD10タンパク質(SEQ ID NO:22)を発現するFZD10強制発現細胞株FZD10/DLD1を用いた免疫組織化学染色により行った。すなわち、全長FZD10タンパク質を強制発現させたFZD10強制発現細胞株FZD10/DLD1をホルマリン固定パラフィン切片化した後、免疫染色を実施し、強い反応が認められたハイブリドーマを選抜した。
試験したハイブリドーマのうち、FZD10特異的抗体を高レベルで産生することを確認したハイブリドーマクローン10A8H4G4についての免疫組織化学染色の結果を図2に示す。図2の写真およびグラフに示されているように、10A8H4G4を用いて染色した場合、FZD10強制発現細胞株FZD10/DLD1から作製されたパラフィン切片においては染色が認められた、すなわちFZD10陽性細胞の割合が高いことが示された。一方、陰性対照としてEmpty Vectorを導入させた細胞株(Mock/DLD1)から作製されたパラフィン切片においてはほとんど染色が認められず、FZD10陽性細胞の割合が低いことが示された。これらの結果から、ハイブリドーマクローン10A8H4G4は、免疫組織化学染色において、FZD10を特異的に検出する抗体を産生するハイブリドーマとして有用であることが示された。
一方、市販抗体(FZD10(L164)Ab、FZD10PolyclonalAb)を用いて染色した場合、FZD10/DLD1とMock/DLD1いずれにおいても染色が観察された(高い割合の細胞にシグナルが検出された)。そのため、これらの市販の抗体による検出結果には偽陽性シグナルが含まれている可能性が疑われた。
以上の結果より、本発明の抗FZD10抗体(10A8H4G4)は、免疫組織化学染色法において、市販の抗FZD10抗体と比較して高い特異性でFZD10を検出できるという有利な性質を有していることが明らかとなった。
一方、市販抗体(FZD10(L164)Ab、FZD10PolyclonalAb)を用いて染色した場合、FZD10/DLD1とMock/DLD1いずれにおいても染色が観察された(高い割合の細胞にシグナルが検出された)。そのため、これらの市販の抗体による検出結果には偽陽性シグナルが含まれている可能性が疑われた。
以上の結果より、本発明の抗FZD10抗体(10A8H4G4)は、免疫組織化学染色法において、市販の抗FZD10抗体と比較して高い特異性でFZD10を検出できるという有利な性質を有していることが明らかとなった。
このハイブリドーマクローン10A8H4G4を、さらなる実験用の抗体を産生させるのに選択した。ハイブリドーマクローン10A8H4G4を大量培養し、2~3週間後に培養液を採取した。プロテインAカラム(GE Healthcare,NJ)を用いて培養液から抗体を精製した。本明細書において、本発明の抗体は、クローン10A8H4G4とも称される。
〔実施例2〕抗FZD10モノクローナル抗体の特異性の評価
次に、FZD10の発現量が異なる種々の細胞株を用いて、10A8H4G4の特異性を評価した。すなわち、10A8H4G4を用いた免疫組織化学染色およびフローサイトメトリーの結果を比較し、FZD10タンパク質の発現量に応じた染色が認められるか検討した。ここで、各がん種毎の細胞株を用いたmRNAの発現解析データベース Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)において、肺がん、食道がん、結腸直腸がん(大腸がん)で顕著な上方制御が示されている(図1)。そこで、これらのがん種に由来する細胞株を以下の解析に用いた。
まず、10A8H4G4を用いたフローサイトメトリーにより、種々のヒトがん組織由来細胞株の細胞膜上における内因性のFZD10タンパク質の発現を確認した。図3に示されているように、内因性のFZD10タンパク質の発現が知られているヒト滑膜肉腫由来SYO-1の他、ヒト食道がん由来細胞株T.Tおよびヒト肺がん由来細胞株H727においても、10A8H4G4を用いたフローサイトメトリーによって陽性シグナルが検出された。一方、FZD10非発現細胞株であることが知られているヒト大腸がん由来細胞株LoVoにおいては、10A8H4G4を用いたフローサイトメトリーによって陽性シグナルが検出されなかった。
続いて、これらの細胞株から作製されたパラフィン切片について、10A8H4G4を用いて免疫組織化学染色を行った。図3Bに示されているように、10A8H4G4を用いて染色した結果、FZD10を発現していることが確認された細胞株SYO-1、T.T、H727から作製されたパラフィン切片において染色が認められた。これらのパラフィン切片には、フローサイトメトリーの結果と相関して高い割合の細胞に陽性のシグナルが検出された。一方、FZD10非細胞株であるLoVoから作製されたパラフィン切片はほとんど染色されず、陽性のシグナルがほとんど検出されなかった。
以上の結果より、本発明の抗FZD10抗体(10A8H4G4)は、フローサイトメトリーにおいても免疫組織化学染色法においても高い特異性で試料中のFZD10タンパク質を検出できる有用なツールであることが示された。
次に、FZD10の発現量が異なる種々の細胞株を用いて、10A8H4G4の特異性を評価した。すなわち、10A8H4G4を用いた免疫組織化学染色およびフローサイトメトリーの結果を比較し、FZD10タンパク質の発現量に応じた染色が認められるか検討した。ここで、各がん種毎の細胞株を用いたmRNAの発現解析データベース Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)において、肺がん、食道がん、結腸直腸がん(大腸がん)で顕著な上方制御が示されている(図1)。そこで、これらのがん種に由来する細胞株を以下の解析に用いた。
まず、10A8H4G4を用いたフローサイトメトリーにより、種々のヒトがん組織由来細胞株の細胞膜上における内因性のFZD10タンパク質の発現を確認した。図3に示されているように、内因性のFZD10タンパク質の発現が知られているヒト滑膜肉腫由来SYO-1の他、ヒト食道がん由来細胞株T.Tおよびヒト肺がん由来細胞株H727においても、10A8H4G4を用いたフローサイトメトリーによって陽性シグナルが検出された。一方、FZD10非発現細胞株であることが知られているヒト大腸がん由来細胞株LoVoにおいては、10A8H4G4を用いたフローサイトメトリーによって陽性シグナルが検出されなかった。
続いて、これらの細胞株から作製されたパラフィン切片について、10A8H4G4を用いて免疫組織化学染色を行った。図3Bに示されているように、10A8H4G4を用いて染色した結果、FZD10を発現していることが確認された細胞株SYO-1、T.T、H727から作製されたパラフィン切片において染色が認められた。これらのパラフィン切片には、フローサイトメトリーの結果と相関して高い割合の細胞に陽性のシグナルが検出された。一方、FZD10非細胞株であるLoVoから作製されたパラフィン切片はほとんど染色されず、陽性のシグナルがほとんど検出されなかった。
以上の結果より、本発明の抗FZD10抗体(10A8H4G4)は、フローサイトメトリーにおいても免疫組織化学染色法においても高い特異性で試料中のFZD10タンパク質を検出できる有用なツールであることが示された。
〔実施例3〕腫瘍移植モデルおよび臨床検体におけるFZD10タンパク質の検出
本発明の抗FZD10抗体(10A8H4G4)の免疫組織化学染色における特異性を、がん細胞株のマウスXenograft腫瘍から作製されたパラフィン切片ならびに肺がん臨床検体を用いて評価した。SYO-1、COLO201細胞株のマウスXenograft腫瘍から作製されたパラフィン切片ならびに肺がん臨床検体1~6の腫瘍領域および非腫瘍領域におけるFZD10のタンパク質およびRNAの発現をそれぞれ免疫組織化学染色およびRealTime-PCRによって検出した結果を図4に示す。
図4に示されているように、FZD10のRNAの高発現が確認された細胞株SYO-1のマウスXenograft腫瘍から作製されたパラフィン切片においては、10A8H4G4により染色された細胞、すなわちFZD10陽性細胞が検出されたが、FZD10のRNAの発現量が少なかった細胞株COLO201のマウスXenograft腫瘍から作製されたパラフィン切片においては、10A8H4G4により染色された細胞、すなわちFZD10陽性細胞も少なかった。この結果は、本発明の抗FZD10抗体(10A8H4G4)は、免疫組織化学染色法において試料中のFZD10タンパク質の発現量と相関した検出結果を得るために有用なツールであることを示している。
また、腫瘍領域特異的なFZD10のRNAの発現が確認された肺がん臨床検体5においては10A8H4G4により染色された細胞、すなわちFZD10陽性細胞が検出されたが、腫瘍領域特異的なFZD10のRNAの発現が確認されなかった他の肺がん臨床検体はほとんど染色されず、FZD10陽性細胞がほとんど検出されなかった。この結果は、10A8H4G4は臨床検体においても特異的にFZD10タンパク質を検出できることを示している。
本発明の抗FZD10抗体(10A8H4G4)の免疫組織化学染色における特異性を、がん細胞株のマウスXenograft腫瘍から作製されたパラフィン切片ならびに肺がん臨床検体を用いて評価した。SYO-1、COLO201細胞株のマウスXenograft腫瘍から作製されたパラフィン切片ならびに肺がん臨床検体1~6の腫瘍領域および非腫瘍領域におけるFZD10のタンパク質およびRNAの発現をそれぞれ免疫組織化学染色およびRealTime-PCRによって検出した結果を図4に示す。
図4に示されているように、FZD10のRNAの高発現が確認された細胞株SYO-1のマウスXenograft腫瘍から作製されたパラフィン切片においては、10A8H4G4により染色された細胞、すなわちFZD10陽性細胞が検出されたが、FZD10のRNAの発現量が少なかった細胞株COLO201のマウスXenograft腫瘍から作製されたパラフィン切片においては、10A8H4G4により染色された細胞、すなわちFZD10陽性細胞も少なかった。この結果は、本発明の抗FZD10抗体(10A8H4G4)は、免疫組織化学染色法において試料中のFZD10タンパク質の発現量と相関した検出結果を得るために有用なツールであることを示している。
また、腫瘍領域特異的なFZD10のRNAの発現が確認された肺がん臨床検体5においては10A8H4G4により染色された細胞、すなわちFZD10陽性細胞が検出されたが、腫瘍領域特異的なFZD10のRNAの発現が確認されなかった他の肺がん臨床検体はほとんど染色されず、FZD10陽性細胞がほとんど検出されなかった。この結果は、10A8H4G4は臨床検体においても特異的にFZD10タンパク質を検出できることを示している。
〔実施例4〕抗FZD10モノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列の分析
本発明の抗FZD10抗体(10A8H4G4)の可変領域のアミノ酸配列を分析した。
RNeasy mini kit(QIAGEN)を用いて、総RNAをハイブリドーマ10A8H4G4から抽出した。Super Script II Reverse Transcriptase(Invitrogen)を用いて、総RNAからcDNAを合成した。cDNA合成用のプライマーは以下の通りである。
重鎖3'プライマーのmIGCUniRv:
5'-CTGGGAAGGTGTGCACAC-3'(SEQ ID NO:16)
軽鎖3'プライマーのmIGKRv2:
5'-GTTGTTCAAGAAGCACACGAC-3'(SEQ ID NO:17)
5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends(Invitrogen)を用いてcDNA末端にdCのポリマーを付加し、Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitrogen)を用いて、モノクローナル抗体の可変領域をコードするポリヌクレオチドを増幅した。増幅用のプライマーは以下の通りである。プライマー配列中の塩基「I」は、イノシンを示す。
重鎖5'および軽鎖5'プライマーの5' RACE Abridged Anchor Primer:
5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3'(SEQ ID NO:18)、
重鎖3'プライマーのmIGCUniRv2:
5'-TGGACAGGGATCCAGAGTTCC-3'(SEQ ID NO:19)、ならびに
軽鎖3'プライマーのmIGKNesRv2:
5'-CAGATGTTAACTGCTCACTGGATGG-3'(SEQ ID NO:20)。
PCR産物をpGEM-T Easy Vector(Promega)にクローニングした。挿入断片領域を配列決定し、10A8H4G4の可変領域(シグナル配列を除く)の核酸配列を決定した。
本発明の抗FZD10抗体(10A8H4G4)の可変領域のアミノ酸配列を分析した。
RNeasy mini kit(QIAGEN)を用いて、総RNAをハイブリドーマ10A8H4G4から抽出した。Super Script II Reverse Transcriptase(Invitrogen)を用いて、総RNAからcDNAを合成した。cDNA合成用のプライマーは以下の通りである。
重鎖3'プライマーのmIGCUniRv:
5'-CTGGGAAGGTGTGCACAC-3'(SEQ ID NO:16)
軽鎖3'プライマーのmIGKRv2:
5'-GTTGTTCAAGAAGCACACGAC-3'(SEQ ID NO:17)
5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends(Invitrogen)を用いてcDNA末端にdCのポリマーを付加し、Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitrogen)を用いて、モノクローナル抗体の可変領域をコードするポリヌクレオチドを増幅した。増幅用のプライマーは以下の通りである。プライマー配列中の塩基「I」は、イノシンを示す。
重鎖5'および軽鎖5'プライマーの5' RACE Abridged Anchor Primer:
5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3'(SEQ ID NO:18)、
重鎖3'プライマーのmIGCUniRv2:
5'-TGGACAGGGATCCAGAGTTCC-3'(SEQ ID NO:19)、ならびに
軽鎖3'プライマーのmIGKNesRv2:
5'-CAGATGTTAACTGCTCACTGGATGG-3'(SEQ ID NO:20)。
PCR産物をpGEM-T Easy Vector(Promega)にクローニングした。挿入断片領域を配列決定し、10A8H4G4の可変領域(シグナル配列を除く)の核酸配列を決定した。
マウスモノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列および核酸配列は以下のように決定された。
10A8H4G4、重鎖可変領域アミノ酸配列(シグナル配列を除く):
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGLGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITSVDTADTATYYCARRAYYGNYYALDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:7)(SEQ ID NO:10に示される核酸配列によってコードされる)
10A8H4G4、重鎖可変領域核酸配列:
5'-CAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTCTGGGTGTGAGCTGGATTCGTCAGCCTTCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTACTGGGATGATGACAAGCGCTATAACCCATCCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCCAGCAACCAGGTATTCCTCAAGATCACCAGTGTGGACACTGCAGATACTGCCACATACTACTGTGCTCGAAGAGCCTACTATGGTAATTACTATGCTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA-3'(SEQ ID NO:10)
10A8H4G4、軽鎖可変領域アミノ酸配列(シグナル配列を除く):
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRKSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPVTFGAGTKLELKRAD(SEQ ID NO:8)(SEQ ID NO:11に示される核酸配列によってコードされる)
10A8H4G4、軽鎖可変領域核酸配列:
5'-GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGACCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACTGGGCATCCACTAGGAAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATTATAGTTATCCGGTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCTGAT-3'(SEQ ID NO:11)
10A8H4G4、重鎖可変領域アミノ酸配列(シグナル配列を除く):
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGLGVSWIRQPSGKGLEWLAHIYWDDDKRYNPSLKSRLTISKDTSSNQVFLKITSVDTADTATYYCARRAYYGNYYALDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:7)(SEQ ID NO:10に示される核酸配列によってコードされる)
10A8H4G4、重鎖可変領域核酸配列:
5'-CAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTCTGGGTGTGAGCTGGATTCGTCAGCCTTCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTACTGGGATGATGACAAGCGCTATAACCCATCCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCCAGCAACCAGGTATTCCTCAAGATCACCAGTGTGGACACTGCAGATACTGCCACATACTACTGTGCTCGAAGAGCCTACTATGGTAATTACTATGCTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA-3'(SEQ ID NO:10)
10A8H4G4、軽鎖可変領域アミノ酸配列(シグナル配列を除く):
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRKSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPVTFGAGTKLELKRAD(SEQ ID NO:8)(SEQ ID NO:11に示される核酸配列によってコードされる)
10A8H4G4、軽鎖可変領域核酸配列:
5'-GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGACCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACTGGGCATCCACTAGGAAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATTATAGTTATCCGGTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGGGCTGAT-3'(SEQ ID NO:11)
Kabatの定義によって決定された本発明の抗体(10A8H4G4)のCDR配列は以下の通りである。
重鎖CDR1(CDR-H1):TSGLGVS(SEQ ID NO:1);
重鎖CDR2(CDR-H2):HIYWDDDKRYNPSLKS(SEQ ID NO:2);
重鎖CDR3(CDR-H3):RAYYGNYYALDY(SEQ ID NO:3);
軽鎖CDR1(CDR-L1):KSSQSLLNSGNQKNYLT(SEQ ID NO:4);
軽鎖CDR2(CDR-L2):WASTRKS(SEQ ID NO:5);および
軽鎖CDR3(CDR-L3):QNDYSYPVT(SEQ ID NO:6)
重鎖CDR1(CDR-H1):TSGLGVS(SEQ ID NO:1);
重鎖CDR2(CDR-H2):HIYWDDDKRYNPSLKS(SEQ ID NO:2);
重鎖CDR3(CDR-H3):RAYYGNYYALDY(SEQ ID NO:3);
軽鎖CDR1(CDR-L1):KSSQSLLNSGNQKNYLT(SEQ ID NO:4);
軽鎖CDR2(CDR-L2):WASTRKS(SEQ ID NO:5);および
軽鎖CDR3(CDR-L3):QNDYSYPVT(SEQ ID NO:6)
本発明は、臨床検体などの対象から単離された試料におけるFZD10タンパク質を高い特異性で検出できる抗FZD10抗体を作製することに成功した。本発明の抗FZD10抗体を用いることにより、高感度かつ低バックグラウンドで試料中のFZD10タンパク質を検出することができる。したがって、本発明の抗体は、FZD10を発現するがん等のFZD10関連疾患の診断に有用である。また、本発明の抗体は、試料中のFZD10の発現量に応じたFZD10の検出が可能であることから、FZD10阻害剤による治療効果の高い対象のスクリーニング(治療前診断)や、対象におけるFZD10阻害剤による治療後の薬効の判定(治療後診断)においても有用である。
Claims (15)
- SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を含むCDR1;
SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列を含むCDR2;および
SEQ ID NO:3に示されるアミノ酸配列を含むCDR3
を含む重鎖可変領域、ならびに
SEQ ID NO:4に示されるアミノ酸配列を含むCDR1;
SEQ ID NO:5に示されるアミノ酸配列を含むCDR2;および
SEQ ID NO:6に示されるアミノ酸配列を含むCDR3
を含む軽鎖可変領域
のいずれかまたは両方を含む、FZD10タンパク質またはその部分ペプチドに結合することができる、抗体またはその抗原結合性断片。 - SEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO:8に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のいずれかまたは両方を含む、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
- SEQ ID NO:9に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する、請求項1または2に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
- FZD10への特異的な結合について、請求項1~3のいずれか一項に記載の抗体と競合する、抗体またはその抗原結合性断片。
- アフィニティー標識、酵素標識、放射性同位体標識、または蛍光標識と結合している、請求項1~4のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む、FZD10関連疾患を診断、FZD10阻害剤による治療後の薬効を判定、またはFZD10阻害剤による治療効果の高い対象をスクリーニングするための試薬。
- 以下の段階を含む、対象におけるFZD10関連疾患または該疾患の発症素因を診断する方法:
(a) 該対象から単離した試料を請求項1~5のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させる段階;
(b) 該抗体またはその抗原結合性断片と該試料との結合を検出することによって、該試料中のFZD10タンパク質を検出する段階:および
(c) 該試料中のFZD10タンパク質レベルを対照と比較する段階であって、対照と比較してFZD10タンパク質レベルが高いときに該対象が該疾患を患っているかまたはその発症リスクを有することが示される、段階。 - 前記FZD10関連疾患が、FZD10を発現しているがんである、請求項7に記載の試薬または請求項8に記載の方法。
- 前記がんが、滑膜肉腫、肺がん、食道がん、結腸直腸がん(大腸がん)、胃がん、慢性骨髄性白血病(CML)および急性骨髄性白血病(AML)からなる群より選択される、請求項9に記載の試薬または方法。
- 以下の段階を含む、試料中のFZD10タンパク質を検出する方法:
(a) 対象から単離した試料を請求項1~5のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させる段階;および
(b) 該抗体またはその抗原結合性断片と該試料との結合を検出することによって、該試料中のFZD10タンパク質を検出する段階。 - 以下の段階を含む、対象におけるFZD10阻害剤による治療後の薬効を判定する方法:
(a) 該対象から単離した試料を請求項1~5のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させる段階;
(b) 該抗体またはその抗原結合性断片と該試料との結合を検出することによって、該試料中のFZD10タンパク質を検出する段階;
(c) 該試料中のFZD10タンパク質レベルを薬剤投与前の発現レベルと比較する段階であって、薬剤投与前と比較してFZD10タンパク質レベルが低いときに該対象における薬効があったことが示される、段階。 - 以下の段階を含む、FZD10阻害剤による治療効果の高い対象をスクリーニングする方法:
(a) 該対象から単離した試料を請求項1~5のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させる段階;
(b) 該抗体またはその抗原結合性断片と該試料との結合を検出することによって、該試料中のFZD10タンパク質を検出する段階;
(c) 該試料中のFZD10タンパク質レベルを対照と比較する段階であって、対照と比較してFZD10タンパク質レベルが同程度かそれよりも高いときに、該対象におけるFZD10阻害剤による治療効果が高いことが示される、段階。 - 前記試料が、前記対象から単離した細胞または組織である、請求項8~13のいずれか一項に記載の方法。
- 以下の工程を含む、FZD10タンパク質またはその部分ペプチドに結合することができる抗体またはその抗原結合性断片を製造する方法:
(a) 請求項6に記載のポリヌクレオチドが導入されたベクターを含む細胞を培養する段階;および
(b) 該細胞の培養物または培養培地から前記抗体を回収する段階。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016197881 | 2016-10-06 | ||
JP2016197881 | 2016-10-06 | ||
PCT/JP2017/036081 WO2018066585A1 (ja) | 2016-10-06 | 2017-10-04 | Fzd10に対するモノクローナル抗体およびその使用 |
JP2018543931A JP7039039B2 (ja) | 2016-10-06 | 2017-10-04 | Fzd10に対するモノクローナル抗体およびその使用 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018543931A Division JP7039039B2 (ja) | 2016-10-06 | 2017-10-04 | Fzd10に対するモノクローナル抗体およびその使用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2022068145A true JP2022068145A (ja) | 2022-05-09 |
Family
ID=61831895
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018543931A Active JP7039039B2 (ja) | 2016-10-06 | 2017-10-04 | Fzd10に対するモノクローナル抗体およびその使用 |
JP2022004142A Pending JP2022068145A (ja) | 2016-10-06 | 2022-01-14 | Fzd10に対するモノクローナル抗体およびその使用 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018543931A Active JP7039039B2 (ja) | 2016-10-06 | 2017-10-04 | Fzd10に対するモノクローナル抗体およびその使用 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11079386B2 (ja) |
EP (1) | EP3524677B1 (ja) |
JP (2) | JP7039039B2 (ja) |
KR (1) | KR102531006B1 (ja) |
CN (1) | CN110036110B (ja) |
BR (1) | BR112019006422A2 (ja) |
CA (1) | CA3038789A1 (ja) |
RU (1) | RU2765431C2 (ja) |
TW (1) | TWI762516B (ja) |
WO (1) | WO2018066585A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TWI762516B (zh) * | 2016-10-06 | 2022-05-01 | 日商腫瘤療法 科學股份有限公司 | 針對fzd10之單株抗體及其用途 |
CN110835372B (zh) * | 2019-11-06 | 2020-12-01 | 上海健康医学院 | 一种靶向Frizzled7单克隆抗体及其制备方法与应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007526891A (ja) * | 2003-07-11 | 2007-09-20 | オンコセラピー・サイエンス株式会社 | 滑膜肉腫の治療方法 |
JP2009541204A (ja) * | 2006-06-21 | 2009-11-26 | オンコセラピー・サイエンス株式会社 | Fzd10に対する腫瘍標的化モノクローナル抗体とその使用 |
JP2013241409A (ja) * | 2005-10-31 | 2013-12-05 | Oncomed Pharmaceuticals Inc | 癌の診断および処置のための組成物および方法 |
JP7039039B2 (ja) * | 2016-10-06 | 2022-03-22 | オンコセラピー・サイエンス株式会社 | Fzd10に対するモノクローナル抗体およびその使用 |
Family Cites Families (26)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US5571894A (en) | 1991-02-05 | 1996-11-05 | Ciba-Geigy Corporation | Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor |
US5587458A (en) | 1991-10-07 | 1996-12-24 | Aronex Pharmaceuticals, Inc. | Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof |
DE69334255D1 (de) | 1992-02-06 | 2009-02-12 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Marker für Krebs und biosynthetisches Bindeprotein dafür |
US5648267A (en) | 1992-11-13 | 1997-07-15 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Impaired dominant selectable marker sequence and intronic insertion strategies for enhancement of expression of gene product and expression vector systems comprising same |
GB9414580D0 (en) | 1994-07-19 | 1994-09-07 | Cancer Res Campaign Tech | Materials and methods relating to the diagnosis of synovial sarcomas |
US5641870A (en) | 1995-04-20 | 1997-06-24 | Genentech, Inc. | Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification |
EP1272224A4 (en) | 2000-03-31 | 2004-09-29 | Gene Logic Inc | GENE EXPRESSION PROFILES IN ESOPHAGIC TISSUE |
AU2001284160A1 (en) | 2000-08-19 | 2002-03-04 | Axordia Limited | Modulation of stem cell differentiation |
WO2002055705A2 (en) | 2001-01-11 | 2002-07-18 | Curagen Corp | Proteins and nucleic acids encoding same |
US6964849B2 (en) | 2001-01-11 | 2005-11-15 | Curagen Corporation | Proteins and nucleic acids encoding same |
WO2002086443A2 (en) | 2001-04-18 | 2002-10-31 | Protein Design Labs, Inc | Methods of diagnosis of lung cancer, compositions and methods of screening for modulators of lung cancer |
US7682607B2 (en) | 2001-05-01 | 2010-03-23 | The Regents Of The University Of California | Wnt and frizzled receptors as targets for immunotherapy in head and neck squamous cell carcinomas |
US20030044409A1 (en) | 2001-05-01 | 2003-03-06 | Carson Dennis A. | Immunologic compositions and methods for studying and treating cancers expressing frizzled antigens |
WO2003004045A2 (en) | 2001-07-05 | 2003-01-16 | Xenon Genetics, Inc. | Methods for identifying therapeutic agents for treating diseases involving wnt polypeptides and wnt receptors |
AU2003256079A1 (en) | 2002-08-30 | 2004-03-19 | Japan As Represented By President Of The University Of Tokyo | Method for treating synovial sarcoma |
US7803370B2 (en) * | 2002-08-30 | 2010-09-28 | Oncotherapy Science, Inc. | Method for treating synovial sarcoma |
TW200413725A (en) | 2002-09-30 | 2004-08-01 | Oncotherapy Science Inc | Method for diagnosing non-small cell lung cancers |
US20060024692A1 (en) | 2002-09-30 | 2006-02-02 | Oncotherapy Science, Inc. | Method for diagnosing non-small cell lung cancers |
US20040247593A1 (en) | 2002-10-04 | 2004-12-09 | Regents Of The University Of California, | Methods for treating cancer by inhibiting Wnt signaling |
WO2006013733A1 (en) | 2004-08-05 | 2006-02-09 | The University Of Tokyo | Method for treating synovial sarcoma using sirna for fzd10 |
EP2295601A1 (en) | 2005-02-10 | 2011-03-16 | Oncotherapy Science, Inc. | Method of diagnosing bladder cancer |
SG190568A1 (en) * | 2008-09-26 | 2013-06-28 | Oncomed Pharm Inc | Frizzled-binding agents and uses thereof |
US20130295106A1 (en) * | 2008-09-26 | 2013-11-07 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Frizzled-Binding Agents And Uses Thereof |
EP3783028A1 (en) * | 2011-08-12 | 2021-02-24 | Omeros Corporation | Anti-fzd10 monoclonal antibodies and methods for their use |
WO2013157410A1 (ja) * | 2012-04-17 | 2013-10-24 | Hoya株式会社 | Fzd10結合性ペプチド |
-
2017
- 2017-10-03 TW TW106134171A patent/TWI762516B/zh active
- 2017-10-04 US US16/336,846 patent/US11079386B2/en active Active
- 2017-10-04 RU RU2019112825A patent/RU2765431C2/ru active
- 2017-10-04 KR KR1020197012936A patent/KR102531006B1/ko active IP Right Grant
- 2017-10-04 EP EP17858422.3A patent/EP3524677B1/en active Active
- 2017-10-04 BR BR112019006422A patent/BR112019006422A2/pt unknown
- 2017-10-04 JP JP2018543931A patent/JP7039039B2/ja active Active
- 2017-10-04 CA CA3038789A patent/CA3038789A1/en active Pending
- 2017-10-04 CN CN201780075513.0A patent/CN110036110B/zh active Active
- 2017-10-04 WO PCT/JP2017/036081 patent/WO2018066585A1/ja unknown
-
2022
- 2022-01-14 JP JP2022004142A patent/JP2022068145A/ja active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007526891A (ja) * | 2003-07-11 | 2007-09-20 | オンコセラピー・サイエンス株式会社 | 滑膜肉腫の治療方法 |
JP2013241409A (ja) * | 2005-10-31 | 2013-12-05 | Oncomed Pharmaceuticals Inc | 癌の診断および処置のための組成物および方法 |
JP2009541204A (ja) * | 2006-06-21 | 2009-11-26 | オンコセラピー・サイエンス株式会社 | Fzd10に対する腫瘍標的化モノクローナル抗体とその使用 |
JP7039039B2 (ja) * | 2016-10-06 | 2022-03-22 | オンコセラピー・サイエンス株式会社 | Fzd10に対するモノクローナル抗体およびその使用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA3038789A1 (en) | 2018-04-12 |
EP3524677B1 (en) | 2023-05-31 |
RU2765431C2 (ru) | 2022-01-31 |
TWI762516B (zh) | 2022-05-01 |
EP3524677A4 (en) | 2020-03-11 |
KR20190059318A (ko) | 2019-05-30 |
EP3524677A1 (en) | 2019-08-14 |
CN110036110B (zh) | 2023-02-03 |
JPWO2018066585A1 (ja) | 2019-07-25 |
BR112019006422A2 (pt) | 2019-06-25 |
RU2019112825A (ru) | 2020-11-09 |
WO2018066585A1 (ja) | 2018-04-12 |
TW201827465A (zh) | 2018-08-01 |
JP7039039B2 (ja) | 2022-03-22 |
US20200174002A1 (en) | 2020-06-04 |
CN110036110A (zh) | 2019-07-19 |
US11079386B2 (en) | 2021-08-03 |
KR102531006B1 (ko) | 2023-05-09 |
RU2019112825A3 (ja) | 2021-02-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6666905B2 (ja) | Pd−l1抗体及びその使用 | |
CN107011439B (zh) | 抗叶酸受体α抗体及其应用 | |
JP2022068145A (ja) | Fzd10に対するモノクローナル抗体およびその使用 | |
JP2023052360A (ja) | 膵管腺ガンを有する被験体のリスクを評価するための早期かつ非侵襲的な方法及びこのような疾患の処置方法 | |
JP7094557B2 (ja) | Melkに対するモノクローナル抗体およびその使用 | |
JP2014517282A (ja) | 膀胱癌におけるrbm3 | |
US20220381787A1 (en) | Novel lox-1 antibody compositions, lox1 neutralization assay and methods of treatment using same |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220210 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220210 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230118 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20230712 |