JP6998841B2 - 細胞解析方法 - Google Patents
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Description
P:送液用ポンプが解析用チップ側の液体と膜フィルタ側の液体との間に生じさせる圧力差
k:膜フィルタの形状に関する固有係数
γ:解析用チップに導入する液体の表面張力
θ:解析用チップに導入する液体と膜フィルタとの接触角
D:膜フィルタに設けられた孔の孔径
図1は、本開示の単一細胞解析システムを表す模式図である。単一細胞解析システムは、単一細胞解析装置11、分注装置9および送液用ポンプ10を備える。
被検対象である細胞1を含んだ細胞懸濁液5を分注装置9にセットし、制御用PC32によって制御しながら単一細胞解析装置11の解析用チップ7の上部に分注する。細胞懸濁液5の分注量は5マイクロリットルほどとし、細胞懸濁液5の内部に存在する細胞数は八十個ほどを目安にする。また、解析用チップ7の上部の様子はカメラ31でモニタリングし、細胞捕捉孔2に細胞が捕捉される様子および解析チップ7の上部の溶液の残量を確認する。必要な量の細胞懸濁液5が分注された後、フロー(a)を終了する。
フロー(a)終了後、以下の式2を満たすような界面活性剤4を準備し、分注装置9にセットする。
P:送液用ポンプ10が解析用チップ7側の液体と膜フィルタ8側の液体との間に生じさせる圧力差
k:膜フィルタ8の形状に関する固有係数
γ1:界面活性剤4の表面張力
θ:界面活性剤4と膜フィルタ8との接触角
D:膜フィルタ8に設けられた孔の孔径
フロー(b)の終了後、送液用ポンプ10を起動する。送液用ポンプ10によって解析用チップ7の上方に存在する細胞懸濁液5は解析用チップ7の下部の流路を介して排出され始め、それに伴い細胞懸濁液5中の細胞1は細胞捕捉孔2に捕捉される。細胞懸濁液5の送液完了後、細胞懸濁液5の上方に存在していた界面活性剤4が解析用チップ7の上方に存在しなくなるまで完全に送液される。解析チップ7の上方の溶液の残量はカメラ31で確認することが可能で、界面活性剤4が完全に送液されたことを確認されれば、送液用ポンプ10を停止してフロー(c)を終了する。
フロー(c)の終了後、解析用チップ7上には細胞捕捉孔2に捕捉された被検細胞1が残っている状態となる。フロー(d)では遺伝子発現解析を行うための試薬を分注し、解析用チップ中で反応を行う。実施例1では細胞膜を破壊するLysisバッファを第1試薬として分注した。試薬の種類はこれに限ったものではなくユーザの任意で選択して構わない。単一細胞解析装置11に導入する全ての反応試薬には、以下の式3を満たすような界面活性剤4を混合し、予め分注装置9にセットしておく。
P:送液用ポンプ10が解析用チップ7側の液体と膜フィルタ8側の液体との間に生じさせる圧力差
k:膜フィルタ8の形状に関する固有係数
γ2:界面活性剤4と反応試薬との混合液体の表面張力
θ:混合液体と膜フィルタ8との接触角
D:膜フィルタ8に設けられた孔の孔径
フロー(d)の終了後、送液用ポンプ10を起動する。フロー(d)で分注したLysisバッファによって細胞捕捉孔2に捕捉した細胞1の細胞膜を破壊し、細胞1内の被検核酸22を細胞捕捉孔2の下部へ吸引する。被検核酸22は、核酸捕捉ビーズ3の表面に固定されているDNAプライマー21に捕捉される。細胞1の細胞膜が破壊されたかどうかをカメラ31でモニタリングし、細胞膜の破壊が不十分な場合は、制御用PC32が分注装置9を制御してLysisバッファの追加分注を行う。捕捉された全ての細胞1が破壊されたのを確認し、全てのLysisバッファの送液が完了したら、送液用ポンプ10を停止し、フロー(e)を終了する。フロー(e)を終了した後、解析用チップ7の上方には何もない状態となる。
実施例1では、反応手順が全2工程存在する例を説明するため、操作フローにしたがってもう一度、フロー(d)を行う。実施例1では第2試薬として逆転写反応を行うためのRT試薬を分注する。以下に示す式4の条件を満たすように界面活性剤4を混合したRT試薬を分注装置9によって分注する。
P:送液用ポンプ10が解析用チップ7側の液体と膜フィルタ8側の液体との間に生じさせる圧力差
k:膜フィルタ8の形状に関する固有係数
γ22:界面活性剤4と第2試薬との混合液体の表面張力
θ:混合液体と膜フィルタ8との接触角
D:膜フィルタ8に設けられた孔の孔径
フロー(d’)の終了後、送液用ポンプ10を起動し、界面活性剤4入りのRT試薬を送液する。解析チップ7の上方のRT試薬の残量をカメラ31で確認しながら送液を行い、全ての溶液を送液するまでに、一度、送液用ポンプ10を停止し、逆転写反応が十分行われる時間(例えば50分)静置する。逆転写反応の終了後、再度、送液用ポンプ10を起動し、残りのRT試薬を全て送液する。全ての溶液の送液が完了した後、送液用ポンプ10を停止し、フロー(e’)を終了する。
実施例2では、実施例1に示した方法よりも細胞1が界面活性剤4から受けるダメージをさらに減少させることができる方法を説明する。実施例2の細胞解析方法は、上で説明した操作フローのうち、フロー(b)(S402)が実施例1とは異なる。以下に、実施例2のフロー(b)について説明する。
フロー(a)の終了後、上記式2を満たすような界面活性剤4を準備し、分注装置9にセットする。フロー(a)の終了後、解析チップ7の上方には細胞懸濁液5のみが分注されている状態である。続いて、界面活性剤4を分注する前に送液用ポンプ10を起動し、送液を開始する。分注装置9は、細胞懸濁液5の液面のレベルが解析用チップ7の上方にあるうちに、界面活性剤4の分注を開始する。界面活性剤4を分注し終え、且つ分注した界面活性剤4の送液を終えた後、送液用ポンプ10を停止する。この際、制御用PC32には、細胞懸濁液5が送液し終わる前のタイミングで準備した界面活性剤4の分注を開始するようにプログラムが記録されるか、または、ユーザによって設定される。または、カメラ31によって細胞懸濁液5の残量を観察しながら制御用PC32を操作し、界面活性剤4を分注してもよい。界面活性剤4の送液が完了後、実施例1と同様にフロー(d)以降を行う。
実施例1および2では、細胞懸濁液5を分注し終えてから界面活性剤4を分注した。実施例3では、細胞懸濁液5に界面活性剤4を混合した混合液体を分注することによって、実施例1において説明したフロー(a)および(b)を代替する。この際、界面活性剤4は、以下の式5の条件式を満たすように選ばれる。
P:送液用ポンプ10が解析用チップ7側の液体と膜フィルタ8側の液体との間に生じさせる圧力差
k:膜フィルタ8の形状に関する固有係数
γ3:界面活性剤4と細胞懸濁液5との混合液体の表面張力
θ:混合液体と膜フィルタ8との接触角
D:膜フィルタ8に設けられた孔の孔径
Claims (15)
- 解析用チップと前記解析用チップに積層された膜フィルタとを備える単一細胞解析装置を用いる細胞解析方法であって、
前記解析用チップに細胞を含む第1の液体を導入するステップと、
前記解析用チップに前記第1の液体よりも表面張力が小さい第2の液体を導入するステップと、
前記第1の液体と前記第2の液体とを前記膜フィルタ側の流路と接続された送液用ポンプによって吸引するステップと、
前記解析用チップに前記細胞と反応する反応試薬を導入し、前記細胞から抽出される分子を固相に反応させるステップと、
前記反応試薬を前記送液用ポンプによって吸引するステップと、
前記解析用チップの中から前記固相を取り出して解析するステップと、
を含む細胞解析方法。 - 請求項1に記載の細胞解析方法であって、
前記第2の液体を導入するステップにおいて、前記第1の液体からなる第1の液層と前記第2の液体からなる第2の液層とが形成されるように前記第2の液体を導入する、
細胞解析方法。 - 請求項1に記載の細胞解析方法であって、
前記第2の液体を導入するステップにおいて、前記第2の液体として界面活性剤を導入する、
細胞解析方法。 - 請求項1に記載の細胞解析方法であって、
前記膜フィルタは多孔質膜または網目状のフィルタである、
細胞解析方法。 - 請求項1に記載の細胞解析方法であって、
前記第2の液体を導入するステップにおいて、前記第1の液体を吸引しながら前記第2の液体を導入する、
細胞解析方法。 - 請求項1に記載の細胞解析方法であって、
前記第2の液体を導入するステップにおいて、前記第2の液体の表面張力は純水の表面張力よりも小さい、
細胞解析方法。 - 請求項1に記載の細胞解析方法であって、
前記第2の液体を導入するステップにおいて、前記解析用チップの映像をモニタに表示しながら前記第2の液体を導入する、
細胞解析方法。 - 請求項1に記載の細胞解析方法であって、
前記膜フィルタは0.5~3.0マイクロメートルの孔径が設けられた多孔質膜である、
細胞解析方法。 - 請求項1に記載の細胞解析方法であって、
前記第2の液体を導入するステップにおいて、前記第1の液体に分注ピペットの先端が付着した状態で前記第2の液体を導入する、
細胞解析方法。 - 請求項1に記載の細胞解析方法であって、
前記解析用チップは大気圧下に置かれる、
細胞解析方法。 - 解析用チップと前記解析用チップに積層された膜フィルタとを備える単一細胞解析装置を用いる細胞解析方法であって、
細胞を含む第1の液体と表面張力が前記第1の液体の表面張力よりも小さく前記細胞を破壊しない目安となる所定の値よりも大きい第2の液体とを混合して混合液体を調製するステップと、
前記解析用チップに前記混合液体を導入するステップと、
前記混合液体を前記膜フィルタ側の流路と接続された送液用ポンプによって吸引するステップと、
前記解析用チップに前記細胞と反応する反応試薬を導入し、前記細胞から抽出される分子を固相に反応させるステップと、
前記反応試薬を前記送液用ポンプによって吸引するステップと、
前記解析用チップの中から前記固相を取り出して解析するステップと、
を含む細胞解析方法。 - 請求項13に記載の細胞解析方法であって、
前記第2の液体は界面活性剤である、
細胞解析方法。
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SHIRAI M., et al., "Vertical flow array chips reliably identify cell types from single-cell mRNA seq,Scientific Reports, 2016 Nov 23, vol. 6, 36014 (pp. 1-14) |
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