JP6964308B2 - 微生物産生マンガン酸化物の製造方法、重金属吸着方法、重金属吸着剤 - Google Patents
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Description
2.前記担体が、砕石、または砂利であることを特徴とする1.に記載の製造方法。
3.二価マンガンイオン濃度が10mg/L以上であることを特徴とする1.または2.に記載の製造方法。
4.前記マンガン酸化細菌が、U9−1iクラスターに属する菌、または、レプトスリックス(Leptothrix)属であることを特徴とする1.〜3.のいずれかに記載の製造方法。
5.前記マンガン酸化細菌が、U9−1i株、または、SP−6株であることを特徴とする1.〜4.のいずれかに記載の製造方法。
6.マンガン酸化細菌を担持した担体を、重金属吸着剤とすることを特徴とする重金属吸着方法。
7.1.〜5.のいずれかに記載の製造方法で生成した微生物産生マンガン酸化物を、担体表面に付着したままの状態で、重金属吸着剤とすることを特徴とする重金属吸着方法。
8.前記担体が、砕石または砂利であることを特徴とする6.または7.に記載の重金属吸着方法。
9.担体と、該担体表面上に蓄積した微生物産生マンガン酸化物とを有することを特徴とする重金属吸着剤。
10.前記担体が、砕石または砂利であることを特徴とする9.に記載の重金属吸着剤。
微生物産生マンガン酸化物は、重金属吸着剤として用いることができる。本発明の製造方法により、重金属吸着剤(微生物産生マンガン酸化物)を短い時間で大量に製造することができるため、土壌汚染現場等で要求される大量の重金属吸着剤を迅速に供給することができる。
マンガン酸化細菌としては、特に制限されず、例えば、下記のような従来公知の細菌を使用することができる。
環境中(河川、湖沼、土壌、海洋など)に普遍的に棲息する細菌(B.M.Tebo,H.A.Johnson,J.K.McCarthy,A.S.Templeton(2005).Geomicrobiology of manganese(II) oxidation. Trends in Microbiology,13,421−428;H.L.Ehrlich,D.K.Newman(2009).Geomicrobiology,5th ed.CRC Press.)。
マンガン酸化細菌として、本発明者らが、河川床生物膜から調製したマンガン酸化汚泥(集積培養系)から単離したU9−1i株(非特許文献1)を好適に利用することができる。U9−1i株は、微結晶性であるマンガン酸化物を産生し、この微生物産生マンガン酸化物は、U9−1i株の細胞表層を覆うように蓄積される。微生物産生マンガン酸化物の生成と蓄積は、他のマンガン酸化細菌でも共通である。
U9−1i株の16S rRNA遺伝子配列(部分配列:配列番号1)を図1に示す。16S rRNA遺伝子に基づく分子系統解析の結果、U9−1i株は、α−プロテオバクテリア綱に属する新規な細菌である。16S rRNA遺伝子配列に基づいて近隣結合法で作成した系統樹を図2に示す。
マンガン酸化細菌として、U9−1i株と遺伝子的に近縁種であるU9−1iクラスターに属する菌を好適に利用することができる。ここで、本明細書において、U9−1iクラスターに属する菌とは、U9−1i株と、16S rRNA遺伝子全長1406bpとクエリーカバー率(Query cover)99%以上(1406bpのうち1392bp以上)において相同性97%以上を示し、かつ近隣結合法で作成した分子系統樹においてU9−1i株、OTSz A 272株とともに1つのクレードを形成する細菌群を意味する。
図3に示すように、U9−1iクラスターに属する菌は、U9−1i株の配列1270Fに相当する領域において配列番号3〜5に示す塩基配列1270F familyを有する。配列1270F familyは、配列1270Fの18bpの塩基配列に対して17bp以上が一致しており、94.4%以上(=17bp/18bp)の非常に高い相同性を有する。それに対し、U9−1iクラスターに属さない菌の当該領域における配列1270Fとの相同性は低く、遺伝子データベースに登録されている全真正細菌の約350万の配列のうち、配列1270Fと一致するものは僅か200配列程度である。同様に、配列1270F familyと一致するものも同程度と僅かである。さらに図3に示すように、U9−1iクラスターに属さない比較的近縁の菌では83.4%以下(18bpに対して15bp以下)の一致度であることがほとんどである。したがって、配列番号3〜5に示される配列である1270F family、またはその相補配列からなるプライマーにより、U9−1iクラスターに属する菌の16S rRNA遺伝子を、特異的に増幅することができる。
本発明の製造方法は、マンガン酸化細菌を担体に担持した状態で二価マンガンイオンを供給し、微生物産生マンガン酸化物を産生することを特徴とする。マンガン酸化細菌は、微結晶性であるマンガン酸化物を産生し、この微生物産生マンガン酸化物は、マンガン酸化細菌の細胞表層を覆うように蓄積される。すなわち、本発明の製造方法により、担体に担持されたマンガン酸化細菌の細胞表層に微生物産生マンガン酸化物が蓄積され、マンガン酸化細菌等のバイオフィルムと、このマンガン酸化細菌の細胞表層に蓄積した微生物産生マンガン酸化物を備えたマンガン酸化物担持担体が得られる。得られるマンガン酸化物担持担体は、表面に蓄積した微生物産生マンガン酸化物により褐色または黒褐色となる。
マンガン酸化細菌により産生した微生物産生マンガン酸化物は、重金属吸着剤として使用することができる。微生物産生マンガン酸化物を重金属吸着剤として使用する形態は特に制限されず、例えば、微生物産生マンガン酸化物を備えるマンガン酸化物担持担体を、焼成、消毒等せず、マンガン酸化細菌が生息している状態で、重金属吸着剤として使用することができる。
本発明の重金属吸着剤は、微生物産生マンガン酸化物が吸着可能な重金属の1種または2種以上を対象とする吸着処理に特に制限することなく使用することができる。また、本発明の重金属吸着剤は、マンガン酸化細菌によりマンガンイオンを固定化することができるため、マンガンの処理に用いることもできる。
U9−1i株、Leptothrix discophora SP−6(ATCC 51168。以下、SP−6株という。)は、下記表1に示すLeptothrix培地を用いて室温で約1週間振とう培養し、フルグロースさせた。
「実施例1」
担体(株式会社クラレ製、製品名:クラゲール、直径約4mmの球形であるポリビニルアルコールゲル)を表2に示す培地100mLに10g添加しオートクレーブ滅菌した。この培地に塩化マンガンを二価マンガンイオン濃度が6mg/Lとなるように添加した後、上記でフルグロースさせたU9−1i株の培養液を体積比10%となるように植種し、25℃、90rpmの条件で振とう培養を144時間(6日間)行った(2連)。
培養後、担体をデカンテーションにより回収して新鮮な培地に移し替え、二価マンガンイオン濃度を20mg/Lに上昇させて96時間(4日間)培養した後、さらに同様にして新鮮な培地を移し替え、二価マンガンイオン濃度を30mg/Lに上昇させて96時間(4日間)の培養を行うことにより、回分試験を行った。
担体を添加しない以外は、実施例1と同様にして、U9−1i株浮遊性菌体による回分試験を行った。なお、比較例1において、1回目および2回目の回分培養終了後は、体積比10%の培養液を新鮮な培地に植種して培養を繰り返した。
培養液上清中の二価マンガンイオン濃度をICP質量分析法(ICP―MS)で測定した。図4に、二価マンガンイオン濃度の経時変化を示す。
二価マンガンイオン濃度が6mg/Lである1回目の回分試験は、担体の有無に関わらず、試験開始直後から二価マンガンイオン濃度が減少し、48時間までにマンガンイオン濃度はほぼ0となり、微生物産生マンガン酸化物が産生した。
すなわち、マンガン酸化細菌は、担体に担持させることにより、二価マンガンイオンが高濃度であってもマンガン酸化物を産生できることが確かめられた。
「実施例2」
SP−6株を使用し、培養中の二価マンガンイオン濃度7mg/L(96時間)、30mg/L(84時間)、60mg/L(84時間)120mg/L(96時間)、120mg/L(96時間)とした以外は、上記実施例1と同様にして、回分試験を行った。
担体を添加しない以外は、実施例2と同様にして、SP−6株浮遊性菌体による回分試験を行った。なお、培地交換時には、遠心分離(8000rpm、10分)により菌体を沈殿させ、沈殿した菌体の全量を新鮮な培地に移植した。
SP−6株においても、二価マンガンイオンが低濃度(7mg/L)の場合は、担体の有無による差異はほとんど無くマンガン酸化が行われれた。
それに対し、担体無しの比較例2は、96時間程度(4日)をかければ30および60mg/Lの二価マンガンイオン濃度を全量酸化できたが、さらに高濃度(120mg/L)では、96時間経過しても全量を酸化することはできなかった。
このことから、担体に担持した実施例2が、担体に担持されていない比較例2と比較して、マンガンイオンの消費が速くなり、担体添加により微生物産生マンガン酸化物を高速で製造できることが確かめられた。
「実施例3」
培養中の二価マンガンイオン濃度を約60mg/L(108時間)とした以外は、上記実施例2と同様にして、培養を行った。
担体を添加しない以外は、実施例3と同様にして、SP−6株浮遊性菌体による培養実験を行った。
SP−6株は、培養初期における二価マンガンイオンが60mg/Lと高濃度であっても、マンガン酸化を行うことができた。しかし、担体に担持させた実施例3は、担体に担持させていない比較例3と比較して、より高速でマンガンが消費されており、担体に担持させることにより、微生物産生マンガン酸化物を高速で製造できることが確かめられた。
プラスチック製コンテナに、容積が計60Lとなるように砕石(7号砕石)を投入し、循環液20L、循環速度0.25L/分にて、培地をコンテナ上部から散水し、下部から回収して循環させた。培地は、下記表3で示した組成の培地を適宜濃縮、希釈し、さらに硫酸マンガン(5〜450mg−Mn/L)を添加したものを用いた。培地は、24時間循環させる毎に新たな培地に交換した。これに、上記で培養しておいたU9−1i株の培養液を、培養0日目に250mL、培養21日目に200mL植菌した。なお、コンテナ、及び、砕石は滅菌処理を行っていない。
培養214日目以降、マンガン濃度(流入)およびマンガン負荷量を上昇させたところ、最大でマンガン濃度(流入)300mg−Mn/L、マンガン負荷量100mg−Mn/L/日まで24時間後のマンガン濃度(流出)が0.5mg/L以下を示し、マンガン濃度(流入)450mg−Mn/L、マンガン負荷量150mg−Mn/L/日まで24時間後のマンガン酸化率99%以上を示した。
以上の結果から、担体として砕石を用いた場合でも、非常に高いマンガン濃度でのマンガン酸化が可能であり、高速での酸化マンガン生成が可能であることが確かめられた。
U9−1i株について、配列番号2に示す配列1270Fからなるオリゴヌクレオチドプローブと、真正細菌特異的なユニバーサルプライマー(1492R)とのプライマーセットを用いて、下記表4に示す条件でSYBR Green法によるリアルタイムPCRを行った。また、全細菌について、真正細菌特異的なユニバーサルプライマー(1048F、1194R)を用いて、下記表4に示す条件でSYBR Green法によるリアルタイムPCRを行った。
上記実施例4における砕石表面からバイオフィルムを約0.5g測り採った後、100mMアスコルビン酸溶液を200μL添加し、ボルテックスで5分間撹拌してMn酸化物を溶解した。Mn酸化物溶解後の試料全量を土壌DNA抽出キット(株式会社ニッポン・ジーン製、商品名:ISOIL for Beads Beating)を用いてDNAを抽出した。なお、DNA抽出は付属のマニュアルに従った。
抽出したDNAを分光光度計(Thermo Fisher Scientific社製、装置名:NanoDrop 1000)により定量後、10〜100倍に希釈して定量PCRに用いた。
鋳型DNAを段階希釈して実験を行い、最も増幅効率の高かった結果をDNAのコピー数とした。その結果を図9に示す。
一方、それぞれプライマーが異なるため、単純な割り算で存在比を求めることは難しいが、16S rRNA遺伝子数を目安として全細菌に占めるU9−1i株の存在比(U9−1i 16S rRNA遺伝子コピー数/全細菌16S rRNA遺伝子コピー数×100)を見積もった。その結果、培養開始直後から40日後までの存在比は1%から0.1%程度と低かったが、その後増加し、配列1270Fのコピー数がほぼ一定に維持された100日以後は数%〜10%程度で推移していた。
次世代シーケンサーMiSeq(Illumina社製)用のアダプター配列を連結した真正細菌に特異的なプライマーセット(http://www.earthmicrobiome.org)(515F:5’−GTGCCAGCMGCCGCGGTAA−3’、806R:5’−GGACTACHVGGGTWTCTAAT−3’)によりPCR増幅を行った。PCRは、DNAポリメラーゼ(タカラバイオ株式会社製、商品名:Ex Taq)を用いてサーマルサイクラー(ThermoFisher Scientific社製、装置名:SimpliAmp Thermal Cycler)により行った。反応液の総量は40μLとし、組成はEx Taq付属のマニュアルに従った。
PCR産物をDNA精製試薬(Beckman Coulter社製、商品名:AMPure XP)で精製後、フルオロメーター(ThermoFisher Scientific社製、装置名:Qubit)で定量後に各サンプルを同濃度で混合した。混合したPCR産物は、自動DNA断片ゲル抽出装置(Sage Science社製、装置名:BluePippin)で再度精製してアンプリコン解析用のライブラリーとした。
調製したライブラリーはシーケンサー(Illumina社製、装置名:MiSeq)により配列を決定した。得られた配列は、Claident v0.2(https://www.claident.org)を用いて分子系統学的に分類した。結果を図10に示す。
U9−1i株は、培養直後は1%以下に減少したが、培養60日目以降でU9−1i株の増加が確認され、定量PCRの結果と一致した。U9−1i株の増加は試験終了時まで持続しており、他の細菌の存在下でもU9−1i株を安定的に培養できることが確かめられた。
ガラスカラム(φ2.2cm、長さ15cm、容積57cm3)に、実験4における培養103日目の砕石と新品の7号砕石とを等量混合したものを充填した(空隙:25.5mL)。なお、ガラスカラムと新品の砕石とは、滅菌処理を行っていない。
実施例4と同様の培地をカラム下部からチューブポンプで送液した。
62日目までは、上部から流出した培地は、マンガン濃度(流出)を測定後、廃棄した。
63日目以降は、カラム上部から流出した培地は、プラスチック瓶に戻し、このプラスチック瓶からカラム下部に送液することにより循環した。培地は、1日毎に交換し、交換時にマンガン濃度(流出)を測定した。
Claims (9)
- マンガン酸化細菌を担持した砕石からなる担体に、二価マンガンイオンをマンガン濃度を上昇させながら供給することを特徴とする微生物産生マンガン酸化物の製造方法。
- 前記二価マンガンイオンが、硫酸マンガン由来であることを特徴とする請求項1に記載の製造方法。
- 製造終了時の二価マンガンイオン濃度が120mg/L以上500mg/L以下であることを特徴とする請求項1または2に記載の製造方法。
- 前記マンガン酸化細菌が、U9−1iクラスターに属する菌、または、レプトスリックス(Leptothrix)属であることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の製造方法。
- 前記マンガン酸化細菌が、U9−1i株、または、SP−6株であることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の製造方法。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の製造方法で得られたマンガン酸化細菌を担持した担体を、前記マンガン酸化細菌が生息している状態で重金属吸着剤とすることを特徴とする重金属吸着方法。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の製造方法で生成した微生物産生マンガン酸化物を、担体表面に付着したままの状態で、重金属吸着剤とすることを特徴とする重金属吸着方法。
- 担体と、該担体表面上に蓄積した微生物産生マンガン酸化物とを有し、
前記担体が砕石であることを特徴とする重金属吸着剤。 - マンガン酸化細菌が生息していることを特徴とする請求項8に記載の重金属吸着剤。
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