JP6962596B2 - Pcr産物の検出方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2016年5月18日に出願の「PCR産物のネステッド検出」と題する米国仮特許出願第62/337,917号の利益および優先権を主張し、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
プラスモジウム・ファリシプリウム用に開発された既存の試験を用いて、上記の方法20を試験した。図9は、INVITROGENTMプログラムから得られた画面コピーであり、プライマー(太字で示す)が設計された18Sリボソーム遺伝子の一部分を示す。典型的には、この方法のPCRで使用される2つのプライマー、すなわちフォワードプライマー60およびリバースプライマー62のそれぞれは、センサおよび触媒と結合する5’テールを持つ。しかし、上記の方法20を使用すると、元のリバースプライマー62の下流に位置する新規のリバースプライマー64が認められた。新規のリバースプライマー64の合成では、5’リン酸基は含むが、触媒結合のための5’テールを除外していて、エキソヌクレアーゼの分解が促進された。
汎フラビウイルス/汎アルファウイルス/汎ブンヤウイルス試験の開発のために設計されたプライマー組を用いて、多重化逆転写PCR(RT−PCR)の様々な組み合わせを評価した。この分析には、総計で9個のプライマーを使用し、全ての分析物質は、ウイルス、VEE−TC83ウイルス、デングウイルス、またはラクロスウイルスを取り込んだ、または取り込んでいない貯蔵された6〜8匹の蚊を、超音波駆動したビーズによる叩解を用いた均質化から得られた。核酸物質を、磁気的な粒子精製を用いて均質物から単離し、ゲル濾過により脱塩し、適切な多重プライマー組、すなわち汎フラビウイルスとブンヤウイルスのプライマー組または汎フラビウイルスとアルファウイルスのプライマー組のいずれかによるRT−PCR増幅に使用して、一本鎖5’テールアンプリコンを生成した。汎アルファウイルスと汎フラビウイルスのプライマー組では、PCR増幅中に互いに阻害し合うことを見出した。この問題に対処するためには、試験カートリッジは、干渉するプライマー組を別々に操作して、センサチップでのハイブリダイズ化の前に混合できるように、2つの別々のPCRチャンバを準備する。図13Aは、Cal/Bunプライマーと混合された汎フラビウイルスプライマーを用いた多重化反応において、取り込んだ蚊から精製されたデングウイルスRNA(列1〜4)のRT−PCRの遺伝子複製のゲル分析を示す。列5は、RNAを投入していない陰性対照である。図13Bは、Cal/Bunプライマーと混合された汎フラビウイルスプライマーを用いた多重化反応において、取り込んだ蚊から精製されたラクロスRNA(列1〜5)のRT−PCRのゲル分析を示す。列6は、RNAを投入していない陰性対照である。汎ブンヤウイルスプライマーと汎フラビウイルスプライマーの組合わせは、PCR反応において同等であることを知見した。
Claims (14)
- 離間配置されセンサ表面に結合した第1の電極および第2の電極並びに、前記第1の電極と前記第2の電極との間の前記センサ表面に結合した複数の捕捉プローブを含むセンサを用いて、試料中の標的核酸分子を検出する方法であって、
5’テールを持ち、かつ内部複製ブロックを含む第1のプライマーおよび5’テールを持たず、標的核酸分子に対して相補的である第2のプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を介して核酸分子増幅を実施し、一本鎖の5’テールを備えた複数の二本鎖アンプリコンを生成すること、ここで各二本鎖アンプリコンが、
内部標的配列を含み、さらに前記5’テールをさらに含む、第1の鎖、および
テールを持たない第2の鎖を備え、
前記複数の二本鎖アンプリコンを前記複数の捕捉プローブ配列にハイブリダイズすること、ここで前記複数の二本鎖アンプリコンの各々の前記一本鎖5’テールが、前記複数の捕捉プローブ配列の一つに結合し;
二本鎖DNAに特異的な5’−3’酵素を用いて、前記複数の二本鎖アンプリコンを複数の一本鎖分子に変換して、前記第一鎖の前記標的配列を露出し、ここで複数の一本鎖分子の各々の5’−テールが、前記複数の捕捉プローブ配列の一つに結合したままであり、そして反対の3’末端が未結合であり;
前記複数の一本鎖分子のそれぞれの前記内部標的配列に触媒クラスターをハイブリダイズすること、
前記触媒クラスターがその表面に結合した前記複数の一本鎖分子を金属または金属合金と接触させて、前記金属または金属合金を前記触媒クラスターの表面に析出させること、および
前記電極間を試料中の前記標的核酸分子の存在を示す電流が流れるかどうかを判定すること
を含む方法。 - 前記複数のアンプリコンの前記複数の一本鎖分子への変換は、エキソヌクレアーゼを用いて前記テールを持たない第2の鎖を消化することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記触媒クラスターは、触媒金クラスターを含み、前記金属は金を含む、請求項1に記載の方法。
- さらに前記アンプリコンの前記第1鎖の内部領域に結合する標的特異性触媒クラスターを形成することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記触媒クラスターは、それに結合したアダプターオリゴヌクレオチドを持つ汎用クラスターである、請求項1に記載の方法。
- 前記汎用クラスターは、それに結合した複数のオリゴヌクレオチドを持ち、各オリゴヌクレオチドは、異なるアンプリコンを標的とする、請求項5に記載の方法。
- 前記触媒クラスターの結合は、複数の触媒クラスターをそれぞれの一本鎖分子の内部区画に結合することを含む、請求項1に記載の方法。
- 離間配置されセンサ表面に結合した第1の電極および第2の電極、ならびに前記第1の電極と前記第2の電極との間の前記センサ表面に結合した複数の捕捉プローブを含む核酸分子検出器を作製する方法であって、
生体試料を受け取ること、
前記生体試料内の核酸分子を増幅して、単一の5’テールを持つ複数の二本鎖アンプリコンを生成すること、ここで前記複数のアンプリコンの各々が、以下の:
前記単一の5’テールと内部標的配列とを含む第一鎖;及び
5’テールを含まない第二鎖を含み;
前記複数のアンプリコンの前記単一の5’テールを、捕捉プローブ配列を各々含む前記複数の捕捉プローブのうち1つにハイブリダイズすること、ここで各アンプリコンの前記単一5’テールが捕捉プローブ配列に結合し;
5’−3’エキソヌクレアーゼを用い前記複数のアンプリコンの前記第二鎖を消化して、アンプリコンの複数の一本鎖分子を生成すること、ここで前記5’テールの前記捕捉プローブへの結合が、前記第一鎖の消化を阻害し、そしてここでアンプリコンの前記複数の一本鎖分子の各々の5’テールが捕捉プローブに結合したままであり、そして反対の3’末端が未結合であり、
標的特異性の触媒クラスターを合成すること、および
前記標的特異性の触媒クラスターを前記アンプリコンの前記複数の一本鎖分子と接触させ、ここで前記標的特異性の触媒クラスターが、前記アンプリコンの前記複数の一本鎖分子の各々の内部標的配列にハイブリダイズすることを含む、方法。 - 前記標的特異性の触媒クラスターは、触媒金クラスターを含む、請求項8に記載の方法。
- 前記標的特異性の触媒クラスターの合成は、ベース汎用クラスターをアダプターオリゴヌクレオチドとハイブリダイズして、複数のアダプターオリゴヌクレオチドがそれに結合した触媒クラスターを生成することを含む、請求項8に記載の方法。
- 前記アダプターオリゴヌクレオチドは、クラスター結合配列およびアンプリコン特異性の結合配列を持つ、請求項10に記載の方法。
- 前記ベース汎用クラスターのハイブリダイズは、前記汎用クラスターを複数のアダプターオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることを含み、アダプターオリゴヌクレオチドのそれぞれは、異なるアンプリコンを標的とする、請求項10に記載の方法。
- 前記複数の捕捉プローブのそれぞれは、分子を前記センサ表面に固定する官能化した酸化物表面を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記酵素が、方向性のヘリカーゼである、請求項1に記載の方法。
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