JP6961227B2 - 抗酸化物質の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、微生物による物質生産の技術分野に関するものであり、具体的には、化粧品、医薬品などの抗酸化剤として用い得る抗酸化物質の生産に関するものである。
微生物が抗酸化物質を産生するとの報告はこれまでにもなされている。例えば、特許文献１および特許文献２には、パラコッカス(Paracoccus)属に属する細菌を用いて、脂溶性の抗酸化物質であるカロテノイドの一種のアスタキサンチンおよびリコペンを生産する報告がある。また、特許文献3では、ファフィア(Phaffia)属に属する酵母を用いて、アスタキサンチンを生産した例が報告されている。カロテノイド以外にも、特許文献4では、トルラ酵母の生産する水溶性のタンパク質分解物に抗酸化活性があることを報告している。
しかしながら、これらの微生物が生産する抗酸化物質は、いずれも生産微生物の菌体内に蓄積されるため、生産された抗酸化物質を得るためには、有機溶媒や細胞壁溶解酵素などを用いて生産菌を壊し、抗酸化物質を抽出する必要がある。
しかしながら、これらの微生物が生産する抗酸化物質は、いずれも生産微生物の菌体内に蓄積されるため、生産された抗酸化物質を得るためには、有機溶媒や細胞壁溶解酵素などを用いて生産菌を壊し、抗酸化物質を抽出する必要がある。
本発明は、有用な物質を産生する微生物を探索し、当該微生物に当該有用な物質を産生させることにより、有用な物質を製造する新たな方法を提供することを課題とし、具体的には、微生物を用いて抗酸化物質を製造する新たな方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、担子菌系酵母であるシュードザイマ(Pseudozyma)属の酵母をミネラル培地において培養したところ、培養上清が抗酸化活性を有することを見出し、中でも、シュードザイマ・シャンキシエンシス(P. shanxiensis)、シュードザイマ・アフィディス(P. aphidis)、及びシュードザイマ・ヒュベイエンシス(P. hubeiensis)の培養上清については、１ｍＭのアスコルビン酸を上回る高い抗酸化活性を有することを見出した(図１参照)。
P. shanxiensis, P. aphidis, P. hubeiensisを含め、Pseudozyma属の酵母が抗酸化物質を生産するという報告は、今までされていない。
本発明者らは、また、ミネラル培地に含まれる窒素源を変更して培養を行うことにより、窒素源の種類が抗酸化物質の産生に影響を与えることを見出した(図３参照)。
本発明は、本発明者らによる、これらの知見に基づいてなされたものである。
P. shanxiensis, P. aphidis, P. hubeiensisを含め、Pseudozyma属の酵母が抗酸化物質を生産するという報告は、今までされていない。
本発明者らは、また、ミネラル培地に含まれる窒素源を変更して培養を行うことにより、窒素源の種類が抗酸化物質の産生に影響を与えることを見出した(図３参照)。
本発明は、本発明者らによる、これらの知見に基づいてなされたものである。
すなわち、この出願は、以下の発明を提供するものである。
〈１〉シュードザイマ(Pseudozyma)属の担子菌系酵母を培地中で培養し、抗酸化物質を産生させることを特徴とする、抗酸化物質の製造方法。
〈２〉上記酵母を培養した培地から上記抗酸化物質を回収することを特徴とする、〈１〉に記載の方法。
〈３〉シュードザイマ(Pseudozyma)属酵母が、シュードザイマ・シャンキシエンシス(Pseudozyma shanxiensis)、シュードザイマ・アフィディス(P. aphidis)、又はシュードザイマ・ヒュベイエンシス(P. hubeiensis)であることを特徴とする、〈１〉又は〈２〉に記載の方法。
〈４〉培地が、硝酸塩を含む培地であることを特徴とする、〈１〉〜〈３〉のいずれかに記載の方法。
〈１〉シュードザイマ(Pseudozyma)属の担子菌系酵母を培地中で培養し、抗酸化物質を産生させることを特徴とする、抗酸化物質の製造方法。
〈２〉上記酵母を培養した培地から上記抗酸化物質を回収することを特徴とする、〈１〉に記載の方法。
〈３〉シュードザイマ(Pseudozyma)属酵母が、シュードザイマ・シャンキシエンシス(Pseudozyma shanxiensis)、シュードザイマ・アフィディス(P. aphidis)、又はシュードザイマ・ヒュベイエンシス(P. hubeiensis)であることを特徴とする、〈１〉又は〈２〉に記載の方法。
〈４〉培地が、硝酸塩を含む培地であることを特徴とする、〈１〉〜〈３〉のいずれかに記載の方法。
本発明によれば、シュードザイマ(Pseudozyma)属の担子菌系酵母を培地中において培養することで、培地中に抗酸化物質を産生させることができる。Pseudozyma属酵母として、Pseudozyma shanxiensis、P. aphidis、又はP. hubeiensisを用いると、さらに高い収量で抗酸化物質を得ることができる。
これにより、上記酵母を大量に培養することで、抗酸化物質を、容易に、大量生産することが可能となる。
これにより、上記酵母を大量に培養することで、抗酸化物質を、容易に、大量生産することが可能となる。
本発明に用いるシュードザイマ(Pseudozyma)属酵母としては、例えば、シュードザイマ・アンタークティカ(P. antarctica)、シュードザイマ・ツクバエンシス(P. tsukubaensis)、シュードザイマ・ヒュベイエンシス(P. hubeiensis)、シュードザイマ・アフィディス(P. aphidis)、シュードザイマ・シアメンシス(P. siamensis)、及びシュードザイマ・シャンキシエンシス(P. shanxiensis)が挙げられる。中でも、P.shanxiensis、P. aphidis、又はP. hubeiensisが好ましい。
本発明の実施例においては、シュードザイマ(Pseudozyma)属酵母により抗酸化物質を産生させるにあたって、ＹＭ培地などの培地を用いて、あらかじめ酵母を前培養し、その後、前培養液をミネラル培地に植菌して培養し、抗酸化物質を産生させた。前培養の培地および培養条件は特に制限されないが、ｐＨ５〜８、好ましくはｐＨ６、温度２０〜３５℃、好ましくは２２〜２８℃の条件で培養することができる。
本発明の実施例においては、上述のとおり、シュードザイマ(Pseudozyma)属酵母により抗酸化物質を産生させる培地としてミネラル培地を用いた。ミネラル培地には、酵母等の微生物の生育に必要な、窒素、リン、マグネシウムなどの成分が、特定の硝酸塩やアンモニウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩などの形態で添加されている。本発明においては、窒素源として種々の硝酸塩、又はアンモニウム塩を含むミネラル培地を用いてPseudozyma属酵母を培養し、得られた培養上清の抗酸化活性を比較することにより、培地中に、窒素源として、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどのアンモニウム態の窒素を含むよりも、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの硝酸態の窒素を含有することが好ましいことを見出した。またミネラル培地は、酵母エキスやグルコースを含むことができる。
以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
実施例１.各種シュードザイマ(Pseudozyma)属酵母による抗酸化物質の産生
以下の各種Pseudozyma属酵母を以下の培地中で培養し、以下の方法で培養物の抗酸化活性を調べた。
１.材料および抗酸化活性の測定方法：この実験で使用した菌体、培地、及び抗酸化活性の測定方法は、以下のとおりである。
・使用菌体
シュードザイマ・アンタークティカ(Pseudozyma antarctica)KM-34株(FERM P-20730)
シュードザイマ・ツクバエンシス(Pseudozyma tsukubaensis)1E5株(JCM16987)
シュードザイマ・ヒュベイエンシス(Pseudozyma hubeiensis)KM59株(FERM P-20987)
シュードザイマ・アフィディス(Pseudozyma aphidis)JCM10318株
シュードザイマ・シアメンシス(Pseudozyma siamensis)CBS9960株
シュードザイマ・シャンキシエンシス(Pseudozyma shanxiensis)CBS10057株
・培地
ＹＭ培地：脱イオン水１Ｌに、酵母エキス３ｇ、麦芽エキス３ｇ、ペプトン５ｇ、グルコース１０ｇ、グリセロール５０ｇを溶かして調整した。
ミネラル培地：脱イオン水１Ｌに、酵母エキス１ｇ、硝酸ナトリウム３ｇ、リン酸二水素カリウム０.３ｇ、硫酸マグネシウム・七水和物０.３ｇを溶かして調整した。
・抗酸化活性の測定：Total Antioxidant Capacity (TAC) Colorimetric Assay Kit(BioVision社製)を用い、９６穴プレートにて測定した。試薬は、キット付属の物を用いた。
以下の各種Pseudozyma属酵母を以下の培地中で培養し、以下の方法で培養物の抗酸化活性を調べた。
１.材料および抗酸化活性の測定方法：この実験で使用した菌体、培地、及び抗酸化活性の測定方法は、以下のとおりである。
・使用菌体
シュードザイマ・アンタークティカ(Pseudozyma antarctica)KM-34株(FERM P-20730)
シュードザイマ・ツクバエンシス(Pseudozyma tsukubaensis)1E5株(JCM16987)
シュードザイマ・ヒュベイエンシス(Pseudozyma hubeiensis)KM59株(FERM P-20987)
シュードザイマ・アフィディス(Pseudozyma aphidis)JCM10318株
シュードザイマ・シアメンシス(Pseudozyma siamensis)CBS9960株
シュードザイマ・シャンキシエンシス(Pseudozyma shanxiensis)CBS10057株
・培地
ＹＭ培地：脱イオン水１Ｌに、酵母エキス３ｇ、麦芽エキス３ｇ、ペプトン５ｇ、グルコース１０ｇ、グリセロール５０ｇを溶かして調整した。
ミネラル培地：脱イオン水１Ｌに、酵母エキス１ｇ、硝酸ナトリウム３ｇ、リン酸二水素カリウム０.３ｇ、硫酸マグネシウム・七水和物０.３ｇを溶かして調整した。
・抗酸化活性の測定：Total Antioxidant Capacity (TAC) Colorimetric Assay Kit(BioVision社製)を用い、９６穴プレートにて測定した。試薬は、キット付属の物を用いた。
２.抗酸化活性の評価方法
上記菌株をＹＭ培地２ｍＬで２５℃、２日間振とう培養し、前培養液を得た。次いで、前培養液１ｍＬを上記ミネラル培地に５％グルコースを添加した培地２０ｍＬに接種し、２５℃で４日間振とう培養した。得られた菌体培養液を１０,０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、培養上清を得た。各菌株の培養上清、５％グルコース添加ミネラル培地(ネガティブコントロール)および１ｍＭアスコルビン酸(ポジティブコントロール)を超純水で１０倍希釈したものを検体とした。９６穴プレートに１００μＬのCu2+ Working Solution、５０μＬのProtein Maskおよび５０μＬの１０倍希釈済み検体を加え、室温で１.５時間静置した後、５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。各検体の５７０ｎｍにおける吸光度の値を、０、４、８、１２，１６，２０ｎｍｏｌのトロロックスを用いて作成した検量線に当てはめ、トロロックス等量(ｍＭ)の抗酸化活性を算出した。
上記菌株をＹＭ培地２ｍＬで２５℃、２日間振とう培養し、前培養液を得た。次いで、前培養液１ｍＬを上記ミネラル培地に５％グルコースを添加した培地２０ｍＬに接種し、２５℃で４日間振とう培養した。得られた菌体培養液を１０,０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、培養上清を得た。各菌株の培養上清、５％グルコース添加ミネラル培地(ネガティブコントロール)および１ｍＭアスコルビン酸(ポジティブコントロール)を超純水で１０倍希釈したものを検体とした。９６穴プレートに１００μＬのCu2+ Working Solution、５０μＬのProtein Maskおよび５０μＬの１０倍希釈済み検体を加え、室温で１.５時間静置した後、５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。各検体の５７０ｎｍにおける吸光度の値を、０、４、８、１２，１６，２０ｎｍｏｌのトロロックスを用いて作成した検量線に当てはめ、トロロックス等量(ｍＭ)の抗酸化活性を算出した。
３.各種菌株の培養上清の抗酸化活性
上記６菌株の培養上清の抗酸化活性を測定した結果を図１に、また菌体量を測定した結果を図２に示す。６菌株すべてで培養上清の抗酸化活性は、５％グルコース添加ミネラル培地(ネガティブコントロール)の抗酸化活性(０.６６±０.０３ｍＭトロロックス等量)よりも高い値を示した。特に、シュードザイマ・ヒュベイエンシスKM59株、シュードザイマ・アフィディスJCM10318株、シュードザイマ・シャンキシエンシスCBS10057株は、１ｍＭアスコルビン酸(３.６２±０.０７ｍＭトロロックス等量)よりも高い抗酸化活性(３.８４±０.２４、５.２８±０.０６、４.９９±０.１１ｍＭトロロックス等量)を示した。また、図１、２より、菌体量と培養上清の抗酸化活性には相関はなかった。
上記６菌株の培養上清の抗酸化活性を測定した結果を図１に、また菌体量を測定した結果を図２に示す。６菌株すべてで培養上清の抗酸化活性は、５％グルコース添加ミネラル培地(ネガティブコントロール)の抗酸化活性(０.６６±０.０３ｍＭトロロックス等量)よりも高い値を示した。特に、シュードザイマ・ヒュベイエンシスKM59株、シュードザイマ・アフィディスJCM10318株、シュードザイマ・シャンキシエンシスCBS10057株は、１ｍＭアスコルビン酸(３.６２±０.０７ｍＭトロロックス等量)よりも高い抗酸化活性(３.８４±０.２４、５.２８±０.０６、４.９９±０.１１ｍＭトロロックス等量)を示した。また、図１、２より、菌体量と培養上清の抗酸化活性には相関はなかった。
実施例２.培地中の窒素源が抗酸化活性に与える影響
シュードザイマ・シャンキシエンシスCBS10057株をＹＭ培地２ｍＬで２５℃、２日間振とう培養して得られた培養液１ｍＬを、下記表１に記載の培地に接種し、２５℃で４日間振とう培養した。培養液を上記に記載の条件で遠心分離し、培養上清を得た。培養上清の抗酸化活性を上記の方法で測定した。
シュードザイマ・シャンキシエンシスCBS10057株をＹＭ培地２ｍＬで２５℃、２日間振とう培養して得られた培養液１ｍＬを、下記表１に記載の培地に接種し、２５℃で４日間振とう培養した。培養液を上記に記載の条件で遠心分離し、培養上清を得た。培養上清の抗酸化活性を上記の方法で測定した。
培地番号１〜５で培養した際の、シュードザイマ・シャンキシエンシスCBS10057株の培養上清の抗酸化活性を測定した結果を図３に、また菌体量を測定した結果を図４に示す。図３の結果より、硝酸態窒素を含む培地番号１および５で培養した際の、培養上清の抗酸化活性は、アンモニア態窒素を含む培地番号２、３、４で培養した際よりも高いことが示された。図４より、菌体量と抗酸化活性に相関関係はなかった。
実施例３.抗酸化活性の経時変化
シュードザイマ・シャンキシエンシスCBS10057株をＹＭ培地２ｍＬで２５℃、２日間振とう培養して得られた培養液１ｍＬを、５％グルコース添加ミネラル培地(培地番号１)に接種し、２５℃で８日間振とう培養した。培養開始１、３、５、８日後の培養液を上記に記載の条件で遠心分離し、培養上清を得た。培養上清の抗酸化活性を上記の方法で測定した。
シュードザイマ・シャンキシエンシスCBS10057株をＹＭ培地２ｍＬで２５℃、２日間振とう培養して得られた培養液１ｍＬを、５％グルコース添加ミネラル培地(培地番号１)に接種し、２５℃で８日間振とう培養した。培養開始１、３、５、８日後の培養液を上記に記載の条件で遠心分離し、培養上清を得た。培養上清の抗酸化活性を上記の方法で測定した。
シュードザイマ・シャンキシエンシスCBS10057株を５％グルコース添加ミネラル培地(培地番号１)で培養した際の、培養上清の抗酸化活性の経時変化を追跡した。培養上清の抗酸化活性を測定した結果を図５に、また菌体量を測定した結果を図６に示す。図５より、培養上清の抗酸化活性は、培養５日目までは顕著に増加し、５日目の時点で５.７８±０.１１ｍＭトロロックス等量に達した。その後も培養を継続したところ、培養８日目の培養上清の抗酸化活性は６.３０±０.３３ｍＭトロロックス等量だった。図６より、菌体増殖は培養３日目で定常期に達していた。また、培養８日後の残存グルコース量は０.８±２.８％であった。
本発明により得られる抗酸化物質は、アスコルビン酸に匹敵する抗酸化活性を示すことから、これと同様に、例えば化粧品などの抗酸化剤として用い得るものと考えられる。
Claims (5)
- シュードザイマ・シャンキシエンシス、または、シュードザイマ・ヒュベイエンシスを、硝酸塩を含むミネラル培地中で培養し、抗酸化物質を産生させることを特徴とする、抗酸化物質の製造方法（ただし、前記製造方法は、前記抗酸化物質がマンノシルエリスリトールリピッドを含むものではない）。
- 前記培養に用いる前記ミネラル培地が油脂類、脂肪酸、脂肪酸誘導体、または、合成エステルを含むものではない、請求項１に記載の方法。
- 前記硝酸塩が硝酸ナトリウムまたは硝酸カリウムである、請求項１または２に記載の方法。
- 前記硝酸塩を含むミネラル培地がさらにグルコースを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
- 上記酵母を培養した培地から上記抗酸化物質を回収することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
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