JP6947777B2 - Tm4sf1結合性タンパク質およびそれを使用する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、部分的に、国立衛生研究所(NIH)によって与えられた助成金番号P01CA92644の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
血管新生は、血管内皮細胞(EC)が増殖し、一部除去され、かつ再編して、既存の血管網から新しい血管を形成する、重要な細胞的事象である。血管供給の発達が、正常および病的な増殖プロセスに必須であるという有力な証拠がある。酸素および栄養素の送達、ならびに異化産物の除去は、多細胞生物において生じる大多数の成長プロセスにおいて律速段階を示す。従って、血管区画は、胚形成中の器官発達および分化に対してだけでなく、成人における創傷治癒および生殖機能に対しても必要であると一般に考えられている。
を含むエピトープにおいてポリペプチドと特異的に結合する結合性ドメインを含む化合物を特徴とする。いくつかの態様において、ポリペプチドは4回膜貫通型L6ファミリーメンバー1(TM4SF1)である。いくつかの態様において、TM4SF1はヒトTM4SF1である。いくつかの態様において、ヒトTM4SF1はグリコシル化(例えば、N-グリコシル化)ヒトTM4SF1である。いくつかの態様において、グリコシル化ヒトTM4SF1は、残基N129または残基N159でグリコシル化されている。いくつかの態様において、グリコシル化ヒトTM4SF1は、残基N129および残基N159でグリコシル化されている。いくつかの態様において、化合物は、10 nM以下(例えば、10 nM、5 nM、2 nM、1 nM、500 pM、100 pM、50 pM、1 pM、または500 fM以下)のKd値でグリコシル化ヒトTM4SF1に特異的に結合することができる。いくつかの態様において、化合物の結合性ドメインは、
からなる群より選択される少なくとも1つアミノ酸配列(例えば、1、2、3、4、5、または6つのアミノ酸配列)を含む。いくつかの態様において、結合性ドメインは、
より選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、化合物は、
より選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのアミノ酸配列を含む結合性ドメインを含む。いくつかの態様において、化合物は、
の6つのアミノ酸配列を含む結合性ドメインを含む。
に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、または80%の配列同一性(例えば、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性)を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗体の軽鎖は、
に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、または80%の配列同一性(例えば、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性)を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗体の重鎖は、
に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、または80%の配列同一性(例えば、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性)を有するアミノ酸配列を含み、かつ抗体の軽鎖は、
に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、または80%の配列同一性(例えば、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性)を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、または合成抗体である。いくつかの態様において、抗体は抗体断片である。いくつかの態様において、化合物(例えば、抗体)は、裸であり、コンジュゲートされておらず、かつ/または修飾されていない。
を含むエピトープとの結合後にTM4SF1発現細胞中へインターナライズされることが可能であり得る。いくつかの態様において、化合物は、TM4SF1発現細胞の細胞質中へインターナライズされる。いくつかの態様において、化合物は、TM4SF1発現細胞の核中へインターナライズされる。いくつかの態様において、TM4SF1発現細胞は、腫瘍血管ECまたは腫瘍細胞である。
を含むポリペプチドを検出するための方法であって、(a)生物学的サンプルおよび対照サンプルを提供する工程;(b)生物学的サンプルおよび対照サンプルと、第1局面の化合物または第2局面の薬学的組成物とを接触させる工程;ならびに(c)生物学的サンプルおよび対照サンプル中に存在する前記化合物と前記ポリペプチドとの複合体の量を決定する工程を含む方法を特徴とする。いくつかの態様において、生物学的サンプルは、病的血管新生と関連する障害(例えば、癌)を有する疑いのある対象から得られる。
[本発明1001]
アミノ酸配列
を含むエピトープにおいてポリペプチドと特異的に結合する結合性ドメインを含む、化合物。
[本発明1002]
前記ポリペプチドが4回膜貫通型L6ファミリーメンバー1(TM4SF1)である、本発明1001の化合物。
[本発明1003]
前記TM4SF1がヒトTM4SF1である、本発明1002の化合物。
[本発明1004]
前記ヒトTM4SF1がグリコシル化ヒトTM4SF1である、本発明1003の化合物。
[本発明1005]
前記グリコシル化ヒトTM4SF1が、残基N129または残基N159でグリコシル化されている、本発明1004の化合物。
[本発明1006]
前記グリコシル化ヒトTM4SF1が、残基N129および残基N159でグリコシル化されている、本発明1005の化合物。
[本発明1007]
10 nM以下のKd値で前記グリコシル化ヒトTM4SF1に特異的に結合することができる、本発明1006の化合物。
[本発明1008]
前記Kd値が2 nM以下である、本発明1007の化合物。
[本発明1009]
前記Kd値が500 pM以下である、本発明1008の化合物。
[本発明1010]
前記結合性ドメインが、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1001〜1009のいずれかの化合物。
[本発明1011]
前記結合性ドメインが、
より選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのアミノ酸配列を含む、本発明1010の化合物。
[本発明1012]
前記結合性ドメインが、
より選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのアミノ酸配列を含む、本発明1010の化合物。
[本発明1013]
前記結合性ドメインが、
の6つのアミノ酸配列を含む、本発明1010の化合物。
[本発明1014]
抗体である、本発明1001〜1013のいずれかの化合物。
[本発明1015]
前記抗体がハイブリドーママウス細胞株8G4-5-13-13F(PTA-120523)によって産生される、本発明1014の化合物。
[本発明1016]
前記抗体の重鎖が、
に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本発明1014または1015の化合物。
[本発明1017]
前記抗体の軽鎖が、
に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本発明1014または1015の化合物。
[本発明1018]
前記抗体の重鎖が、
に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ
前記抗体の軽鎖が、
に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本発明1014または1015の化合物。
[本発明1019]
前記抗体が、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、または合成抗体である、本発明1014〜1018のいずれかの化合物。
[本発明1020]
前記抗体が抗体断片である、本発明1014〜1019のいずれかの化合物。
[本発明1021]
作用物質をさらに含む、本発明1001〜1020のいずれかの化合物。
[本発明1022]
前記作用物質が治療的作用物質または診断的作用物質である、本発明1021の化合物。
[本発明1023]
前記治療的作用物質が生物活性部分である、本発明1022の化合物。
[本発明1024]
前記診断的作用物質が標識である、本発明1022の化合物。
[本発明1025]
前記生物活性部分が、細胞傷害性物質、化学療法薬、タンパク質、ペプチド、抗体、成長阻害物質、および抗ホルモン薬からなる群より選択される、本発明1023の化合物。
[本発明1026]
細胞傷害性物質が、リボソーム不活性化タンパク質、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)インヒビター、チューブリンインヒビター、アルキル化薬、抗生物質、抗腫瘍薬、増殖抑制薬、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼIまたはIIインヒビター、ホルモンアゴニストまたはアンタゴニスト、免疫調節物質、DNA副溝バインダー、および放射性物質からなる群より選択される、本発明1025の化合物。
[本発明1027]
リボソーム不活性化タンパク質がサポリンである、本発明1026の化合物。
[本発明1028]
前記標識が、蛍光標識、発色標識、または放射標識である、本発明1024の化合物。
[本発明1029]
前記作用物質が、前記化合物に直接的にコンジュゲートされている、本発明1021〜1028のいずれかの化合物。
[本発明1030]
前記作用物質が、リンカーによって前記化合物に間接的にコンジュゲートされている、本発明1021〜1028のいずれかの化合物。
[本発明1031]
本発明1001〜1030のいずれかの化合物を含む、薬学的組成物。
[本発明1032]
薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤をさらに含む、本発明1031の薬学的組成物。
[本発明1033]
対象における病的血管新生と関連する障害を治療するために製剤化されている、本発明1031または本発明1032の薬学的組成物。
[本発明1034]
本発明1001〜1030のいずれかの化合物をコードする、ポリヌクレオチド。
[本発明1035]
本発明1034のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[本発明1036]
本発明1035のベクターを含む、宿主細胞。
[本発明1037]
哺乳動物細胞である、本発明1036の宿主細胞。
[本発明1038]
原核細胞である、本発明1036の宿主細胞。
[本発明1039]
培養培地において本発明1036の宿主細胞を培養する工程を含む、本発明1001〜1030のいずれかの化合物を製造する方法。
[本発明1040]
前記宿主細胞または前記培養培地から前記化合物を回収する工程をさらに含む、本発明1039の方法。
[本発明1041]
病的血管新生と関連する障害を有する対象を治療する方法であって、治療有効量の本発明1001〜1023、1025〜1027、1029、および1030のいずれかの化合物またはその薬学的組成物を投与し、それによって該対象を治療する工程を含む、方法。
[本発明1042]
前記化合物が約0.01 mg/kg〜約10 mg/kgの投薬量で前記対象へ投与される、本発明1041の方法。
[本発明1043]
前記化合物が約0.1 mg/kg〜約10 mg/kgの投薬量で前記対象へ投与される、本発明1042の方法。
[本発明1044]
前記化合物が約3 mg/kg〜約10 mg/kgの投薬量で前記対象へ投与される、本発明1043の方法。
[本発明1045]
前記病的血管新生と関連する障害が癌である、本発明1041〜1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
前記癌が、乳癌、卵巣癌、腎臓癌(renal cancer)、結腸直腸癌、肝臓癌、胃癌、皮膚癌、食道癌、腎臓癌(kidney cancer)、脳腫瘍、甲状腺癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、精巣癌、小腸癌、唾液腺癌、および副腎癌からなる群より選択される、本発明1045の方法。
[本発明1047]
前記病的血管新生と関連する障害が、肥満、黄斑変性、糖尿病性網膜症、乾癬、関節リウマチ、細胞性免疫、アテローム性動脈硬化症、または酒さである、本発明1041または本発明1042の方法。
[本発明1048]
前記化合物が、アミノ酸配列
を含む前記エピトープとの結合後にTM4SF1発現細胞中へインターナライズされることが可能である、本発明1041〜1047のいずれかの方法。
[本発明1049]
前記化合物が、前記TM4SF1発現細胞の細胞質中へインターナライズされる、本発明1048の方法。
[本発明1050]
前記化合物が、前記TM4SF1発現細胞の核中へインターナライズされる、本発明1048の方法。
[本発明1051]
前記TM4SF1発現細胞が、腫瘍血管内皮細胞または腫瘍細胞である、本発明1048の方法。
[本発明1052]
前記化合物または前記薬学的組成物が、筋肉内に、静脈内に、皮内に、経皮的に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、鼻腔内に、硝子体内に、膣内に、直腸内に、局所的に、腫瘍内に、腹膜に、皮下に、結膜下に、小嚢内に、粘膜に、心膜内に、臍帯内に、眼内に、経口的に、局所的に、局在的に、吸入によって、注射によって、注入によって、持続注入によって、標的細胞を直接浸す局在的な灌流によって、カテーテルによって、洗浄によって、クリームの形態で、または脂質組成物の形態で投与される、本発明1041〜1051のいずれかの方法。
[本発明1053]
前記対象が、少なくとも一用量の前記化合物または前記薬学的組成物の投与を受ける、本発明1052の方法。
[本発明1054]
前記対象が、少なくとも二用量の前記化合物または前記組成物の投与を受ける、本発明1053の方法。
[本発明1055]
前記化合物または前記組成物が、1週間に1〜7回、前記対象へ投与される、本発明1053の方法。
[本発明1056]
前記化合物または前記組成物が、4日に1回、前記対象へ投与される、本発明1055の方法。
[本発明1057]
前記対象がヒトである、本発明1041〜1055のいずれかの方法。
[本発明1058]
生物学的サンプル中のアミノ酸配列
を含むポリペプチドを検出するための方法であって、
(a)該生物学的サンプルおよび対照サンプルを提供する工程;
(b)該生物学的サンプルおよび該対照サンプルと、本発明1001〜1022、1024、もしくは1028〜1030のいずれかの化合物またはその薬学的組成物とを接触させる工程;ならびに
(c)該生物学的サンプルおよび該対照サンプル中に存在する該化合物と該ポリペプチドとの複合体の量を決定する工程
を含む、方法。
[本発明1059]
前記生物学的サンプルが、病的血管新生と関連する障害を有する疑いのある対象から得られる、本発明1058の方法。
[本発明1060]
(a)本発明1031〜1033のいずれかの薬学的組成物;および
(b)病的血管新生と関連する障害を治療するために該薬学的組成物を対象へ投与するための説明書
を含む、キット。
I.定義
本明細書において用いる場合、用語「約」は、記載された値の+/-10%を意味する。
4回膜貫通型L6ファミリーメンバー1(Transmembrane-4 L six family member-1)(TM4SF1)は、多くの癌細胞上において豊富に発現されていたことから、「L6抗原」または「腫瘍細胞抗原」として1986年に発見された(Hellstrom et al. Cancer Res. 46: 3917-3923, 1986)。予想外に、それはまた、正常組織に供給を行う血管の血管内皮上において弱く発現されることがわかった(DeNardo et al. Int J Rad Appl Instrum B. 18: 621-631, 1991; Wright et al. Protein Sci. 9: 1594-1600, 2000; Richman et al. Cancer Res. 5916s-5920s, 1995; O'Donnell et al. Prostate. 37: 91-97, 1998)。
従って、本発明は、アミノ酸配列
を含むエピトープにおいてポリペプチドと結合する(例えば、特異的に結合する)結合性ドメインを含む化合物を特徴とする。化合物は、SEQ ID NO: 1を含むエピトープにおいて4回膜貫通型L6ファミリーメンバー1(TM4SF1)またはその断片、例えば、ヒトTM4SF1(NCBI RefSeq No. NP_055035.1)またはその断片と特異的に結合する結合性ドメインを含み得る。いくつかの場合において、ヒトTM4SF1ポリペプチドは、例えば、残基N129または残基N159で、グリコシル化(例えば、N-グリコシル化)されている。いくつかの場合において、グリコシル化ヒトTM4SF1ポリペプチドは、残基N129およびN159の両方でグリコシル化されている。化合物は、10 nM以下(例えば、10 nM、5 nM、2 nM、1 nM、500 pM、100 pM、50 pM、1 pM、または500 fM以下)であるKd値でグリコシル化ヒトTM4SF1に特異的に結合し得る。化合物は、
からなる群より選択される少なくとも1つアミノ酸配列(例えば、1、2、3、4、5、または6つのアミノ酸配列)を含む結合性ドメインを含み得る。化合物は、例えば、
より選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのアミノ酸配列を含む結合性ドメインを含み得る。化合物は、例えば、
より選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つ全てのアミノ酸配列を含む結合性ドメインを含み得る。化合物は、例えば、
の6つのアミノ酸配列を含む結合性ドメインを含み得る。
に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、または80%の配列同一性(例えば、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性)を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、抗体の軽鎖は、
に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、または80%の配列同一性(例えば、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性)を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、抗体の重鎖は、
に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、または80%の配列同一性(例えば、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性)を有するアミノ酸配列を含み、かつ抗体の軽鎖は、
に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、または80%の配列同一性(例えば、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性)を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、化合物は、裸であるか、コンジュゲートされていないか、または修飾されていない化合物、例えば、裸であるか、コンジュゲートされていないか、または修飾されていない抗体であり得る。
i.ポリヌクレオチド
本発明は、1つまたは複数(例えば、1、2、3、または4つ以上)の本発明の化合物(例えば、抗TM4SF1抗体、例えば、8G4)をコードするポリヌクレオチド、またはその断片もしくは部分を特徴とする。1つまたは複数の本発明の化合物をコードするポリヌクレオチド配列は、標準的な組換え技術を用いて得ることができる。例えば、1つまたは複数の(例えば、1、2、3、または4つ以上)クローニング部位(例えば、EcoRVクローニング部位)を含む、SEQ ID NO: 1のアミノ酸配列を含むエピトープにおいてポリペプチドと特異的に結合する結合性ドメインを含む化合物またはその部分(例えば、8G4)のcDNAは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって調製することができる。
本発明は、1つまたは複数(例えば、1、2、3、または4つ以上)の本発明の化合物を含むベクターを特徴とする。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、単離され、かつさらなるクローニング(DNAの増幅)のためまたはコードポリペプチド化合物の発現のために複製可能なベクター中へ挿入され得る。例えば、化合物が抗TM4SF1抗体である場合、ポリヌクレオチドは、pBluescriptプラスミドへクローニングされ、配列が確認され、その後、Fcコーディングプラスミド、例えばpFUSE-hIgG1-Fc1(InvivoGen)へDNAがサブクローニングされ得る。多くのベクターが入手可能である。ベクターの選択は、使用される宿主細胞に部分的に依存する。各ベクターは、その機能(異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現、または両方)、およびそれが存在する特定の宿主細胞胞とのその適合性に応じて、様々な構成要素を含有する。ベクター構成要素には、一般に以下が含まれるが、これらに限定されない:複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位(RBS)、シグナル配列、異種核酸挿入物、および転写終結配列。
本発明は、1つまたは複数の本発明のベクターを含む宿主細胞、例えば、原核生物起源(例えば、大腸菌細胞)または真核生物起源(一般に哺乳動物(例えば、ヒト臍帯静脈EC(HUVEC))であるが、真菌(例えば、酵母)、昆虫(例えば、ショウジョウバエ(Drosophila)S2細胞)、植物、および他の多細胞生物由来の有核細胞も含まれる)の宿主細胞を特徴とする。いくつかの態様において、安定なクローンは、Zeocin選択などの、従来の選択方法を用いて調製することができる。
本発明の化合物(抗TM4SF1抗体)を発現させるために適した原核宿主細胞は、古細菌(Archaebacteria)および真正細菌(Eubacteria)、例えばグラム陰性またはグラム陽性生物を含む。有用な細菌の例は、エシェリキア属(Escherichia)(例えば、大腸菌)、バシラス属(Bacilli)(例えば、枯草菌(B.subtilis))、腸内細菌、シュードモナス属(Pseudomonas)の種(例えば、緑膿菌)、サルモネラ・チフィリウム(Salmonella typhimurium)、セラチア・マルセッセンス(Serratia marcescans)、クレブシエラ属(Klebsiella)、プロテウス属(Proteus)、シゲラ属(Shigella)、リゾビウム属(Rhizobia)、ビトレオシラ属(Vitreoscilla)、またはパラコッカス属(Paracoccus)を含む。一態様において、グラム陰性細胞を使用する。一態様において、大腸菌細胞を本発明のための宿主として使用する。大腸菌株の例は、W3110株 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ATCC Deposit No. 27,325)およびその派生物、例えば、遺伝子型W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanRを有する33D3株(米国特許第5,639,635号)を含む。他の株およびその派生物、例えば大腸菌294(ATCC 31,446)、大腸菌B、大腸菌λ1776(ATCC 31,537)および大腸菌RV308(ATCC 31,608)なども適する。これらの例は、限定的というよりも、むしろ説明的である。定義された遺伝子型を有する上記の細菌のいずれかの派生物を構築するための方法が、当技術分野において公知であり、例えば、Bass et al., Proteins 8:309-314 (1990)に記載される。一般的に、細菌の細胞におけるレプリコンの複製能を考慮に入れて適切な細菌を選択することが必要である。例えば、大腸菌、セラチア属(Serratia)、またはサルモネラ属(Salmonella)の種が、周知のプラスミド(例えば、pBR322、pBR325、pACYC177、またはpKN410)を、レプリコンを供給するために使用する場合、宿主として使用するのに適し得る。典型的には、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌すべきであり、追加のプロテアーゼインヒビターが望ましくは細胞培養に組み入れられ得る。
ベクター構成要素には、一般に以下のうちの1つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない:シグナル配列、複製起点、1つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列。
本発明はまた、1つまたは複数の本発明の化合物(例えば、抗TM4SF1抗体、例えば、8G4)を製造する方法を特徴とし、それによって、宿主細胞が培養培地において培養され得、本発明の化合物(例えば、抗TM4SF1抗体、例えば、8G4)が宿主細胞または培養培地(例えば、プロテイン-A Sepharoseを用いて馴化無血清培地)から回収(例えば、精製)され得る。
上述のものなどの、本発明の化合物(例えば、抗TM4SF1抗体、例えば、8G4)または本発明の化合物をコードするポリヌクレオチドのいずれか1つは、組成物(例えば、薬学的組成物)中に含まれ得る。本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤をさらに含み得る。
アミノ酸配列
を含むエピトープにおいてポリペプチド(例えば、TM4SF1)と結合する(例えば、特異的に結合する)結合性ドメインを含む本発明の化合物(例えば、抗TM4SF1抗体、例えば、8G4)は、治療適用のために使用され得る。従って、本発明は、対象を治療するために治療有効量の本発明の化合物またはその薬学的組成物を投与する工程を含む、病的血管新生と関連する障害(例えば、癌、例えば、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、結腸直腸癌、肝臓癌、胃癌、および肺癌;肥満;黄斑変性;糖尿病性網膜症;乾癬;関節リウマチ;細胞性免疫;ならびに酒さ)を有する対象を治療する方法を特徴とする。化合物または薬学的組成物は、適正な医療行為と一致する様式で処方、投薬、および投与されると考えられる。本発明に従う療法は、単独でまたは別の療法と共に行われ得、家庭、診療所、クリニック、病院の外来、または病院で提供され得る。医師が療法の効果を厳密に観察し、必要である何らかの調節をすることができるように、治療は任意で入院中に始められ、またはそれは外来患者方式で始められてもよい。療法の期間は、治療される疾患または障害のタイプ、患者の年齢および状態、患者の疾患の病期およびタイプ、ならびに治療に対する患者の反応に依存する。さらに、増殖性または病原性疾患を発症する危険性がより高い人は、症状の発症を阻害するまたは遅延させるために治療を受けることができる。
を含むエピトープとの結合後にTM4SF1発現細胞(例えば、腫瘍血管内皮細胞または腫瘍細胞)中へインターナライズされ(例えば、エンドサイトーシスによって取り込まれ)得る。いくつかの態様において、化合物、またはその薬学的組成物は、TM4SF1発現細胞の細胞質中へインターナライズされ得、そしてTM4SF1発現細胞の核中へインターナライズされ得る。従って、治療有効量の化合物、またはその薬学的組成物は、障害の症状の軽減、低減、治療、および/または停止、例えば、原発性腫瘍サイズの低減(例えば、本発明の化合物または薬学的組成物の投与後の対象における原発性腫瘍のサイズにおける、対照治療のそれと比較して5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%またはそれ以上の低減);TM4SF1発現細胞(例えば、腫瘍血管内皮細胞または腫瘍細胞)の数の減少(例えば、本発明の化合物または薬学的組成物の投与後の対象におけるTM4SF1発現細胞の数における、対照治療のそれと比較して5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%またはそれ以上の減少);および/またはTM4SF1発現細胞(例えば、腫瘍血管内皮細胞または腫瘍細胞)のアポトーシスの増加(例えば、本発明の化合物または薬学的組成物の投与後の対象におけるTM4SF1発現細胞のアポトーシスにおける、対照治療のそれと比較しての5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%またはそれ以上の誘発)をもたらし得る。病的血管新生と関連する障害のこれらの症状および/または他の症状ならびに治療中のそれらの消散は、例えば、身体検査中に医師によってまたは当技術分野において公知の他の検査および方法によって測定することができる。いくつかの態様において、1つまたは複数の本発明の化合物または薬学的組成物を用いる治療は、対象において障害の進行を停止させ得る。他の態様において、1つまたは複数の本発明の化合物またはその薬学的組成物を用いる治療は、一般的なまたは従来の療法(例えば、手術、放射線療法、化学療法、免疫療法、またはホルモン療法)と比較して、対象において障害の進行を遅らせ得る。
本明細書に記載の本発明に従う化合物および組成物(例えば、薬学的組成物)は、投与直後に(例えば、標的指向送達)、または制御または持続放出製剤を用いて投与後の任意の所定の期間で、放出されるように製剤化され得る。制御または持続放出製剤での化合物または組成物の投与は、化合物または組成物が、単独または組み合わせのいずれかで、以下を有する場合に有用である:(i)狭い治療指数(例えば、有害な副作用または中毒反応へ至る血漿濃度と、治療効果へ至る血漿濃度との差異が小さい;一般に、治療指数TIは半数致死量(LD50)対半数有効量(ED50)の比率として定義される);(ii)放出部位(例えば、胃腸管)での狭い吸収ウィンドウ、または(iii)治療レベルを持続するために1日を通して頻繁な投薬が要求されるような短い生物学的半減期。
投与される投薬量は、治療される対象(例えば、治療される対象の年齢、体重、免疫系の能力、および全体的な健康)、投与形態(例えば、固体または液体として)、投与様式(例えば、注射、吸入、ドライパウダー噴霧剤によって)、ならびに、潜在的に、標的とされるTM4SF1発現細胞(例えば、TCまたはEC、例えば、血管新生血管のもの)に依存する。さらに、特定の患者についての薬理ゲノム学的(治療薬の薬物動態、薬力学、または効能プロフィールに対する遺伝子型の影響)情報が、用いられる投薬量に影響を与え得る。組成物は、治療によって過度の生理学的有害効果が引き起こされることなく、対象において治療効果をもたらすために十分なレベルの化合物(例えば、抗TM4SF1抗体、例えば、8G4)を提供する量で、好ましくは投与される。
本発明の組成物の治療製剤は、所望の純度を有する有効成分を任意の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することにより、当技術分野において公知の標準方法を用いて調製され得る(Remington's Pharmaceutical Sciences (20th edition), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA)。許容される担体としては、食塩水、または緩衝液、例えば、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸;酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸;低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン、アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン;単糖類、二糖類、および他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、またはデキストリン;キレート剤、例えば、EDTA;糖アルコール、例えば、マンニトールまたはソルビトール;塩形成対イオン、例えば、ナトリウム;および/または非イオン性界面活性剤、例えば、TWEEN(商標)、PLURONICS(商標)、もしくはPEGが挙げられる。
本発明は、本発明の組成物(例えば、薬学的組成物)(例えば、本発明の化合物、例えば抗TM4SF1抗体、例えば8G4、を含む組成物)を含むキットを提供する。キットは、臨床家(例えば、医師または看護師)が、病的血管新生と関連する障害(例えば、癌)を治療するために、その中に含まれる組成物を対象へ投与することを可能にするための説明書を含む。
TM4SF1に対するモノクローナル抗体の調製
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)をEGM2-MV完全培地(Lonza, Walkersville, MD)中で培養し、第3〜6継代で使用した。ヒトTM4SF1を約400 mRNAコピー/細胞(天然HUVECのそれの約4×)のレベルで過剰発現(OE)するように、HUVECに形質導入した(Shih et al. Cancer Res. 69: 3272-3277, 2009; Zukauskas et al. Angiogenesis. 14: 345-354, 2011)。107 TM4SF1 OE細胞を2週間隔×5で雌性6週齢Balb-cマウスへ腹腔内注射した。TM4SF1構造を図1に示す。ハイブリドーマスクリーニング工程およびエピトープマッピング戦略を下述し、図2に示す。15個の安定したクローンが得られた。TM4SF1の変異形態との反応性に基づいて、これらのうち、13個が細胞外ループ-2(ECL2)中のエピトープを認識し、2個が細胞内ドメイン中のエピトープを認識した(図2B〜2E)。マウスTM4SF1とヒトTM4SF1との著しい構造差に恐らく起因して、ヒトECL2に対して向けられたクローンはいずれもマウスTM4SF1とは反応しなかった(図2E)。
実験手順は以前に記載された(Shih et al. Cancer Res. 69: 3272-3277, 2009; Zukauskas et al. Angiogenesis. 14: 345-354, 2011)。簡潔には、細胞および組織切片を、25℃にて20分間4%パラホルムアルデヒドで固定し、PBSで3回洗浄し、PBS/2% FBSでブロッキングし、その後、一次抗体(8G4またはヤギ抗ヒトCD144(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA))、続いてロバ抗マウスAlexa Fluor-488もしくは-594標識二次抗体、およびファロイジン(Life Technologies, Carlsbad, CA)で免疫細胞化学を行った。免疫-ナノゴールド透過型電子顕微鏡法(immune-nanogold transmission electron microscopy)(TEM)のために、ヤギ抗マウスAlexa Fluor-488/ナノゴールドFab-断片(Nanoprobes, Yaphank, NY)を二次抗体として使用した。HRP標識ヤギ抗マウス抗体(Cell Signaling, Danvers, MA)を免疫ブロットのために使用した。細胞下分画キットをThermo Scientific (Logan, UT)から得た。
サポリンコンジュゲート非特異的ヤギFab(対照ADC)およびサポリンコンジュゲートヤギ抗マウスIgG Fab(実験ADC)をAdvanced Targeting Systems (San Diego, CA)から得、実験を製造業者の説明書に従って行った。簡潔には、200 ngの8G4または対照マウスIgG(mIgG)を、25℃で1時間、10μl EGM2-MV完全培地(Lonza, Walkersville, MD)中において200 ngの対照ADCまたは実験ADCと共にプレインキュベートした。混合物を、4時間96ウェルプレート中において平板培養されたHUVEC(1×103細胞/ウェル、200μl EGM2-MV中;1群当たり4ウェル)へ添加した。MTTアッセイを第5日に行った(Life Technologies)。全ての実験を少なくとも3回繰り返した。%生存細胞を以下のように計算した:生存細胞(%) = (OD570ADC - OD750ADC)/(OD570Exp対照 - OD750Exp対照)×100。
ハイブリドーマスクリーニングおよびエピトープマッピング戦略を図2に示す。ECL2(図1Aおよび1B)上のエピトープに対して向けられた抗体のうち、8G4をその高アビディティ(Kd 約1nM)のために詳細な研究について選択した。
8G4は、HUVEC(図3A〜3C)および他の培養された内皮細胞(EC)中のTM4SF1を染色した;原形質膜およびナノポジア上ならびに核周囲および核沈着物中の断続的なTM4SF1リッチドメイン(TM4SF1-enriched domain)(TMED)中。免疫細胞化学は、TM4SF1がTriton-X100によって抽出され;膜関連染色は、核周囲および核沈着物のそれよりも大いに影響を受けたことを実証した(図3D)。TM4SF1は、28kD、25kDおよび22kDのアイソフォームを生じさせる、可能性のある代替のタンパク質翻訳開始部位を有する、2つの転写バリアントから生じると考えられている(Zukauskas et al. Angiogenesis. 14: 345-354, 2011)。免疫ブロットは、3つ全てのバンドが0.05%によって大部分が抽出されたが、0.01% Triton X-100によっては抽出されなかったことを実証した(図3E)。0.1% Tritonでの追加の抽出は、残存する28kDバンドを溶出した。28kDバンド(黒色矢印)は、可溶性核フラクションにおいて優勢であり、細胞骨格および核クロマチンフラクションにおいては排他的に存在した(図3F)。8G4は、TM4SF1発現を欠いている細胞と相互作用しなかった(図2Cおよび2D)。
以前の免疫組織化学的研究は、TM4SF1が、いくつかの異なるヒト癌の血管の内側のECによって高度に発現されることを実証した(Chang et al. Int J Cancer. 116: 243-252, 2005)。8G4での免疫蛍光染色は、これらの結果を確認し、追加のヒト癌、胃腺癌へそれらを拡張した(図4Aおよび4B)。免疫-ナノゴールド染色を伴う透過型電子顕微鏡法(TEM)は、原形質膜上の断続的なTMED焦点を実証した(図4C〜4F)。管腔の染色は、反管腔側の染色と比べて一貫してより強かった(図4Dおよび4E)。癌血管ECはまた、最大30μmの距離について血管腔中へ、TMED染色パターンを有する薄く長いナノポジアを広げた(図4G)。これらの広がりの一部は、典型的なナノポジアよりも厚く、膠原性基質を含有し、血管腔をより小さなチャネルへ分割する架橋を形成した(図4H)。同様のナノポジア様突出部が、マウス癌血管において(Nagy et al., Cancer Res. 55: 360-368, 1995)、およびVEGF-A164を発現するアデノウイルスでマウスにおいて誘導された血管において(Shih et al., Cancer Res. 69: 3272-3277, 2009)記載された。本発明者らの知る限りでは、これは、ヒト癌ECにおけるそのような突出部の最初の記載であり、それらが抗血管ターゲッティングについて実質的に増加された表面積を提供する点で、重要である。この種の突出部は、隣接する正常血管の内側のECにおいては見られず、8G4での標識化もまたこのような血管において遥かにより弱かった(図4Iおよび4J)。
8G4がTM4SF1を発現する細胞中にインターナライズされるかどうかを決定するために、8G4でプレ標識されたHUVECを培養において経時的に追跡した。フローサイトメトリーは、細胞表面シグナルの徐々の消失:2、4、および24時間で、それぞれ、20.8%、52.2%、および95%を明らかにし(図5A)、このことは、8G4がHUVEC中へ徐々にエンドサイトーシスによって取り込まれたことを示している。この消失の一部は細胞表面からの脱落を反映し得るが、共焦点-3D Z-スタック顕微鏡検査(confocal-3D Z-stack microscopy)は、細胞質区画(図5B)および核(図5C、フレーム-6、白色矢印)中への8G4シグナルの実質的で徐々の取り込みを実証した。免疫ブロットは、4時間までの核抽出物中の8G4重鎖および軽鎖の両方を実証し、これらは24時間においてより低レベルで存続した(図5D)。イムノ-ナノゴールド-EMは、ナノゴールドクラスターが核周囲細胞質中、核膜孔中、および核自体内で確認された点で、8G4エンドサイトーシスについてのさらなる証拠を提供した(図5Eおよび5F)。8G4インターナリゼーションは、非常に低いレベルでTM4SF1を発現した細胞(例えば、線維芽細胞)において検出できなかった。
TM4SF1と恐らくは複合体化された8G4は、HUVECによって効率的に取り込まれるため、本発明者らは、抗体-薬物コンジュゲート(ADC)アプローチがEC殺傷を誘発するかどうかを試験した。最近の研究は、癌療法についてのアプローチとしてのADCの有用性を実証した(Kuroda et al. Prostate. 70: 1286-1294, 2010)。成功のための要件は、標的分子が細胞表面上において高度に発現されること、および抗体結合毒素が効率的にエンドサイトーシスによって取り込まれることである。TM4SF1および本発明の化合物、例えば、8G4抗TM4SF1抗体は、これらの基準を満たす。第一に、TM4SF1は、多くの癌細胞の表面上においてだけでなく、腫瘍血管ECの原形質膜上においても高度に発現され、その殺傷は、血流を妨げ、血管バリアを破壊し、それによって腫瘍細胞へのADCのアクセスが増加することが予想される。第二に、TM4SF1に対して向けられた8G4抗体は、大量のTM4SF1を発現するECおよび他の細胞によって容易にエンドサイトーシスにより取り込まれ、結合された毒素について細胞質および核アクセスを与え、結果として細胞殺傷が生じる。まとめると、これらの知見は、TM4SF1が、本発明の化合物を用いるADC癌療法などの、ADC癌療法について適切な血管および腫瘍細胞標的であり得ることを示唆しており、これは、アミノ酸配列
を含むエピトープに特異的に結合し、好ましくは、8G4抗体について観察されたものと同様または同一の様式で細胞中へインターナライズされることが可能である。
本発明をその特定の態様と関連して記載したが、さらなる改変が可能であり、本出願は、一般に、本発明の原理に従い、上に述べた本質的な特性に適用し得る、本発明が属する技術分野内の既知のまたは通例の習慣内である本開示からの逸脱を含む、本発明のいかなるバリエーション、使用、または適応も包含することが意図されていることが理解されるだろう。
Claims (30)
- 抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物であって、該抗体またはその抗原結合性断片が、アミノ酸配列NYTFASTEGQYLLDTSTWSECTEPKHIVEWNVS (配列番号:1)を含む4回膜貫通型L6ファミリーメンバー1(TM4SF1)におけるポリペプチドに結合し、該ポリペプチドが、ヒトTM4SF1の残基N129および残基N159に対応する位置でグリコシル化部位を含み、かつ該抗体またはその抗原結合性断片が、グリコシル化依存性様式で該ポリペプチドに結合し、かつ該抗体またはその抗原結合性断片が、GFTFSSFAMS (配列番号:2)、TISSGSIYIYYTDGVKG (配列番号:3)、RGIYYGYDGYAMDY (配列番号:4)、RSSQSLVHSNGNTYLH (配列番号:5)、KVSNRFS (配列番号:6)、およびSQSTHIPLA (配列番号:7)に示されるCDR配列を含む、前記組成物。
- 前記ポリペプチドが、残基N129または残基N159の少なくとも1つでグリコシル化され、グリコシル化ポリペプチドを形成する、請求項1に記載の組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合性断片が、前記グリコシル化ポリペプチドを発現する細胞の細胞質中へインターナライズされ得る、請求項2に記載の組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合性断片が、10 nM以下のKd値で前記ポリペプチドに結合する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合性断片が、2 nM以下のKd値で前記ポリペプチドに結合する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合性断片が、500 pM以下のKd値で前記ポリペプチドに結合する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、または合成抗体である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記抗原結合性断片が、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、SMIP、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、ミニボディ、scFv-Fc、アフィボディ、またはナノボディである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記抗TM4SF1抗体またはその抗原結合性断片が、治療的作用物質または診断的作用物質にコンジュゲートされている、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記治療的作用物質が、細胞傷害性物質、化学療法薬、タンパク質、ペプチド、抗体、成長阻害物質、および抗ホルモン薬からなる群より選択される、請求項9に記載の組成物。
- 前記細胞傷害性物質が、リボソーム不活性化タンパク質、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)インヒビター、チューブリンインヒビター、アルキル化薬、抗生物質、抗腫瘍薬、増殖抑制薬、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼIまたはIIインヒビター、ホルモンアゴニストまたはアンタゴニスト、免疫調節物質、DNA副溝バインダー、および放射性物質からなる群より選択される、請求項10に記載の組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合性断片の重鎖領域が、配列番号:8のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合性断片の重鎖領域が、配列番号:8のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項12に記載の組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合性断片の重鎖領域が、配列番号:8のアミノ酸配列を含む、請求項13に記載の組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖領域が、配列番号:9のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖領域が、配列番号:9のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項15に記載の組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖領域が、配列番号:9のアミノ酸配列を含む、請求項16に記載の組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合性断片の重鎖領域が、配列番号:8のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、かつ前記抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖領域が、配列番号:9のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合性断片の重鎖領域が、配列番号:8のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、かつ前記抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖領域が、配列番号:9のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項18に記載の組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合性断片の重鎖領域が、配列番号:8のアミノ酸配列を含み、かつ前記抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖領域が、配列番号:9のアミノ酸配列を含む、請求項19に記載の組成物。
- 前記抗体がハイブリドーママウス細胞株8G4-5-13-13F(PTA-120523)によって産生される、請求項1〜20のいずれか一項に記載の組成物。
- 請求項1〜20のいずれか一項に記載の組成物の抗体またはその抗原結合性断片をコードする、ポリヌクレオチド。
- 請求項22に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 請求項23に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 病的血管新生を治療するための、請求項1〜20のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記病的血管新生が癌に関連する、請求項25に記載の組成物。
- 前記癌が、乳癌、卵巣癌、腎臓癌(renal cancer)、結腸直腸癌、肝臓癌、胃癌、皮膚癌、食道癌、腎臓癌(kidney cancer)、脳腫瘍、甲状腺癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、精巣癌、小腸癌、唾液腺癌、および副腎癌からなる群より選択される、請求項26に記載の組成物。
- 病的血管新生を治療するための医薬の製造のための、請求項1〜20のいずれか一項記載の組成物の使用。
- 前記病的血管新生が癌に関連する、請求項28に記載の使用。
- 前記癌が、乳癌、卵巣癌、腎臓癌(renal cancer)、結腸直腸癌、肝臓癌、胃癌、皮膚癌、食道癌、腎臓癌(kidney cancer)、脳腫瘍、甲状腺癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、精巣癌、小腸癌、唾液腺癌、および副腎癌からなる群より選択される、請求項29に記載の使用。
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