JP6926263B2 - 浮腫の治療のための組成物及び方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2015年2月5日に出願された米国仮特許出願第62/112,273号の優先権を主張し、その全体の内容は参照により本明細書に援用される。
本発明は、National Institutes of Healthによって授与された補助金番号R01 HL111130−01、T32 CA009685−21A1、及び1 S10 RR028889−01、ならびにNational Cancer Instituteによって授与された補助金番号P30 CA008748下の政府助成により行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
本特許文書の開示の一部分は、著作権保護を受ける材料を含有する。著作権所有者は、特許文書又は特許開示が特許商標庁の特許ファイル又は記録中で掲載される通りに任意の者によって複製されることに異議を唱えないが、それ以外はどんなものであれすべての著作権を留保する。
参照による援用を許可する国については、本開示中で引用されるすべての参照は、それらの全体を参照することによって本明細書に援用される。加えて、本明細書において引用又は言及される任意の製品のための任意の製造業者の説明書又はカタログは、参照によって援用される。本テキストの中へ参照によって援用された文書又はその中の任意の教示は、本発明の実践において使用することができる。本テキストの中へ参照によって援用された文書は、先行技術であるとは認められない。
本発明は以下の態様も提供する。
[1] (i)有効量の1つ又は複数の抗T細胞剤と;
(ii)有効量の1つ若しくは複数の抗TGF−β1剤及び/又は有効量の1つ若しくは複数の抗アンジオテンシン剤と
を含む、医薬組成物であって;
局所投与のために製剤化される、前記医薬組成物。
[2] 前記抗T細胞剤が、タクロリムス、テリフルノミド、レフルノミド、シクロスポリン、ピメクロリムス、デニロイキン・ジフチトクス、及びバシリキシマブからなる群から選択される、上記[1]に記載の医薬組成物。
[3] 前記抗TGF−β1剤がピルフェニドンである、先行項のいずれかに記載の医薬組成物。
[4] 前記抗アンジオテンシン剤がアンジオテンシン変換酵素(ACE)アゴニストである、先行項のいずれかに記載の医薬組成物。
[5] 前記抗アンジオテンシン剤が、カプトプリル、ゾフェノプリル、エナラプリル、リシノプリル、ラミプリル、キナプリル、ペリンドプリル、ベナゼプリル、イミダプリル、トランドラプリル、シラザプリル、フォシノプリル、ロサルタン、イルベサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、及びフィマサルタンからなる群から選択される、先行項のいずれかに記載の医薬組成物。
[6] タクロリムスを含む、先行項のいずれかに記載の医薬組成物。
[7] 約0.01%〜約1%のタクロリムスを含む、先行項のいずれかに記載の医薬組成物。
[8] 約0.05%〜約0.2%のタクロリムスを含む、先行項のいずれかに記載の医薬組成物。
[9] ピルフェニドンを含む、先行項のいずれかに記載の医薬組成物。
[10] 約0.1mg/ml〜約5mg/mlのピルフェニドンを含む、先行項のいずれかに記載の医薬組成物。
[11] 約0.5mg/ml〜約2mg/mlのピルフェニドンを含む、先行項のいずれかに記載の医薬組成物。
[12] テリフルノミドを含む、先行項のいずれかに記載の医薬組成物。
[13] 約10mg/ml〜約50mg/mlのテリフルノミドを含む、先行項のいずれかに記載の医薬組成物。
[14] 約20mg/ml〜約30mg/mlのテリフルノミドを含む、先行項のいずれかに記載の医薬組成物。
[15] レフルノミドを含む、上記[1]〜[11]のいずれかに記載の医薬組成物。
[16] 約1%〜約20%のレフルノミドを含む、上記[15]に記載の医薬組成物。
[17] 約5%〜約15%のレフルノミドを含む、上記[16]に記載の医薬組成物。
[18] カプトプリルを含む、先行項のいずれかに記載の医薬組成物。
[19] 約1%〜約20%のカプトプリルを含む、上記[18]に記載の医薬組成物。
[20] 約5%〜約15%のカプトプリルを含む、上記[19]に記載の医薬組成物。
[21] 前記組成物が、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、ムース、泡、ラッカー、懸濁物、液体、及びスプレーから選択される形態である、先行項のいずれかに記載の医薬組成物。
[22] 前記組成物が軟膏の形態である、上記[21]に記載の医薬組成物。
[23] 浮腫の治療又は予防における使用のための、先行項のいずれかに記載の医薬組成物。
[24] 前記浮腫がリンパ浮腫である、上記[23]に記載の医薬組成物。
[25] 浮腫を治療又は予防する方法であって、タクロリムス、テリフルノミド、レフルノミド、シクロスポリン、ピメクロリムス、デニロイキン・ジフチトクス、バシリキシマブ、ピルフェニドン、カプトプリル、ゾフェノプリル、エナラプリル、リシノプリル、ラミプリル、キナプリル、ペリンドプリル、ベナゼプリル、イミダプリル、トランドラプリル、シラザプリル、フォシノプリル、ロサルタン、イルベサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、及びフィマサルタンからなる群から選択される、有効量の1つ又は複数の薬物を含む医薬組成物をそれを必要とする被験体へ投与することを含む、前記方法。
[26] 前記医薬組成物が、
(i)タクロリムス、テリフルノミド、レフルノミド、シクロスポリン、ピメクロリムス、デニロイキン・ジフチトクス、及びバシリキシマブからなる群から選択される、有効量の1つ又は複数の抗T細胞剤と;
(ii)ピルフェニドン、カプトプリル、ゾフェノプリル、エナラプリル、リシノプリル、ラミプリル、キナプリル、ペリンドプリル、ベナゼプリル、イミダプリル、トランドラプリル、シラザプリル、フォシノプリル、ロサルタン、イルベサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、及びフィマサルタンからなる群から選択される、有効量の1つ若しくは複数の抗TGF−β1剤及び/又は抗アンジオテンシン剤と
を含む、上記[25]に記載の方法。
[27] 前記医薬組成物がタクロリムスを含む、上記[25]又は上記[26]に記載の方法。
[28] 前記医薬組成物がピルフェニドンを含む、上記[25]〜[27]のいずれかに記載の方法。
[29] 前記医薬組成物がテリフルノミドを含む、上記[25]〜[28]のいずれかに記載の方法。
[30] 前記医薬組成物がレフルノミドを含む、上記[25]〜[28]のいずれかに記載の方法。
[31] 前記医薬組成物がカプトプリルを含む、上記[25]〜[30]のいずれかに記載の方法。
[32] 前記医薬組成物が局所的に投与される、上記[25]〜[31]のいずれかに記載の方法。
[33] 前記医薬組成物が0.01%〜1%のタクロリムスを含む、上記[32]に記載の方法。
[34] 前記医薬組成物が0.05%〜0.2%のタクロリムスを含む、上記[33]に記載の方法。
[35] 前記医薬組成物が0.1mg/ml〜5mg/mlのピルフェニドンを含む、上記[32]〜[34]のいずれかに記載の方法。
[36] 前記医薬組成物が0.5mg/ml〜2mg/mlのピルフェニドンを含む、上記[35]に記載の方法。
[37] 前記医薬組成物が10mg/ml〜50mg/mlのテリフルノミドを含む、上記[32]〜[36]のいずれかに記載の方法。
[38] 前記医薬組成物が20mg/ml〜30mg/mlのテリフルノミドを含む、上記[37]に記載の方法。
[39] 前記医薬組成物が1%〜20%のレフルノミドを含む、上記[32]〜[36]のいずれかに記載の方法。
[40] 前記医薬組成物が5%〜15%のレフルノミドを含む、上記[39]に記載の方法。
[41] 前記医薬組成物が、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、ムース、泡、ラッカー、懸濁物、液体、及びスプレーから選択される形態である、上記[32]〜[40]のいずれかに記載の方法。
[42] 前記医薬組成物が軟膏の形態である、上記[41]に記載の方法。
[43] 前記医薬組成物が少なくとも1日1回局所的に投与される、上記[23]〜[42]のいずれかに記載の医薬組成物又は方法。
[44] 前記医薬組成物が少なくとも1日2回局所的に投与される、上記[43]に記載の医薬組成物又は方法。
[45] 前記医薬組成物がリンパ管損傷の約6週間以内に予防的に投与される、上記[23]〜[44]のいずれかに記載の医薬組成物又は方法。
[46] 前記医薬組成物がリンパ管損傷の約2週間以内に予防的に投与される、上記[45]に記載の医薬組成物又は方法。
タクロリムスは、全身的な免疫抑制なしに尾リンパ浮腫を減少させる
リンパ浮腫に対する局所的なタクロリムスの効果を研究するために、以前に記載されたリンパ浮腫のマウス尾モデルを使用した。Goldman et al.,Circ.Res.96:1193−1199(2005);Shimizu et al.,J.Am.Heart Assoc.2:e000438(2013);Choi et al.,Circulation 125:872−882(2012);Tabibiazar et al.,PLoS Med.3:e254(2006);Yoon et al.,J.Clin.Invest.111:717−725(2003)。マウス尾の表在リンパ管及び深部リンパ管の破壊は、外科手術の2週間後に100%を超える尾体積の増加をもたらした(図1A、1B)。この時点での膨潤は主として間質液の蓄積に起因することが、以前に本出願人により示されている。Avraham et al.,FASEB J.27:1114−1126(2013)。尾における慢性的なリンパ管閉塞は、脂肪線維組織による間質液の段階的な置き換えをもたらすだけでなく、炎症細胞の蓄積が続く4週間にわたって起こる。Avraham et al.,FASEB J.27:1114−1126(2013)。これらの病理学的な変化は臨床的リンパ浮腫を非常によく反映し、一旦リンパ浮腫が確立されれば、追加の少なくとも6〜9週間の間持続する。Goldman et al.,Circ.Res.96:1193−1199(2005);Shimizu et al.,J.Am.Heart Assoc.2:e000438(2013);Choi et al.,Circulation 125:872−882(2012);Tabibiazar et al.,PLoS Med.3:e254(2006);Yoon et al.,J.Clin.Invest.111:717−725(2003)。
慢性炎症は、臨床的なリンパ浮腫の組織学的特徴であり、Tヘルパー細胞、T調節性細胞、及びマクロファージの蓄積の増加によって特徴づけられる。Avraham et al.,FASEB J.27:1114−1126(2013);Zampell et al.,PLoS ONE 7:e49940(2012);Ghanta et al.,Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.308:H1065−1077(2015);Olszewski et al.,Lymphology 23:23−33(1990)。このことと一致して、タクロリムス治療動物では、対照と比較して、真皮及び皮下脂肪に浸潤する白血球の数が著しく減少したことが見出された(CD45+細胞;56%の低減、初期治療;49%の低減、後期治療;図2A)。対照動物から採取されたリンパ浮腫性組織中の炎症細胞は毛細管及び集合リンパ管に非常に接近して位置したが、タクロリムス治療マウス中で実質的には存在しなかった。同様に、浸潤するCD3+細胞(53%の低減、初期治療;49%の低減、後期治療;図2B)、CD4+細胞(78%の低減、初期治療、71%の低減、後期治療;図2C)、及びIFN−γ産生細胞(54%の低減、初期治療、57%の低減、後期治療;図2D)の数の著しい減少が、本出願人により指摘された。加えて、マクロファージ(F4/80+細胞;86%の低減、初期治療;73%の低減、後期治療;図8)の軟組織浸潤の減少が、指摘された。総合すると、これらの所見は、リンパ管損傷後に多数の炎症細胞が皮膚/皮下のリンパ管に非常に接近して蓄積し、この応答がタクロリムスの局所適用によって緩和されることを示す。
リンパ機能を査定するために、インドシアニングリーン(ICG)による近赤外(NIR)リンパ管造影法(それはリンパ管のリアルタイム画像化、パケット頻度(又はリンパ液の拍動流)の計算を可能にすることによって、ヒト、ブタ及びマウスにおけるリンパ機能を定量化する効果的な手段として記述された)、ならびに皮膚逆流及び色素クリアランスの解析を実行した。Kwon et al.,Lymphat.Res.Biol.5:219−231(2007);Sharma et al.,Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.292:H3109−3118(2007);Unno et al.,J.Vasc.Surg.52:946−952(2010)。リンパ管結紮の6週間後にNIR画像化を使用して、リンパ管損傷の2週間後に治療が開始された動物において、尾創傷を近位へと横切る間質液の急速な輸送が、指摘された(初期治療;図4A)。これとは対照的に、対照動物は、傷害ゾーンを横切った輸送はなく、リンパの切除部位から遠位でのICGの貯留を実証した。この所見は、テクネチウム99m(99mTc)リンパ管シンチグラフィー(放射性トレーサーを尾遠位部中に注入し、仙骨リンパ節による取り込みを経時的に測定する技法)を使用して確認された。初期治療動物における仙骨リンパ節の崩壊補正取り込みは、対照と比較して、タクロリムス治療動物における99mTc取り込みの6倍を超える増加を実証した(図4B)。タクロリムスによる後期治療は同様にリンパ節による取り込みを増加させた(2倍)が、この差は統計的有意差に達しなかった。
T細胞が、リンパ節のリンパ管新生(Kataru et al.,Immunity 34:96−107(2011))及び創傷修復の間の炎症性リンパ管新生(Zampell et al.,Am.J.Physiol.Cell Physiol.302:C392−C404(2012))を強力に阻害することが公知であるので、次にタクロリムスによる治療が側副リンパ管の形成を増加させるかどうかを決定することにした。確かに、尾創傷の組織学的分析及びLYVE−1の免疫蛍光(IF)染色を使用するリンパ管の同定により、リンパ管損傷ゾーンを架橋する新しく形成されたリンパ管の著しい増加が実証された(初期治療後に189%の増加;後期治療後に106%の増加;図5A)。対照動物とタクロリムス治療動物との間でVEGF−C mRNA発現における差が指摘されなかったので、このリンパ管新生応答はVEGF−C発現に非依存性であると思われた(図5A)。しかしながら、本出願人によるIF染色解析と一致して、2つの強力な抗リンパ管新生性の増殖因子及びサイトカイン、TGF−β1(Oka et al.,Blood 111:4571−4579(2008);Clavin et al.,Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.295:H2113−2127(2008))及びIFN−γ(Kataru et al.,Immunity 34:96−107(2011);Shao et al.,J.Interferon Cytokine Res.26:568−574(2006))の発現の有意な減少が指摘された(図5A)。PLNDの4週間後の後肢におけるNIR画像化によるリンパ管造影の解析及びリンパ管についてのIF染色により、本出願人による尾モデルについての所見が確認され、タクロリムスにより治療された動物が、鼠径リンパ節に向かって排出させる側副リンパ管を一貫して有意に多く有し、それによって傷害ゾーンをバイパスすることが実証された(図5B〜5D)。
研究デザイン
この研究の目的は、T細胞の局部的阻害がリンパ管損傷後のリンパ浮腫の発症を予防することができ、発症した後の確立しているリンパ浮腫を治療することができるという仮説を試験することである。リンパ管損傷及びリンパ浮腫の2つの異なるマウスモデルを使用して、タクロリムス(これらの転帰に対してFDAによって認可された局所的な抗T細胞医薬物)の有効性を分析した。タクロリムスがリンパ浮腫の予防及び治療において確かに効果的であることが見出されたので、次いで、この応答を調節する細胞メカニズム及び分子メカニズムを分析することにした。これらの後続する研究において、CD4+炎症応答の阻害が、側副リンパ管の形成を増加させること、毛細リンパ管を囲む細胞間マトリックス中のコラーゲン沈着を減少させること、及び集合リンパ管の駆出頻度を増加させることによって、リンパ機能を改善したという仮説を試験した。本研究はすべて、光及び温度を制御した病原体不含有環境において維持し自由摂食させた、成体メス(10〜14週齢)C57BL/6Jマウス(Jackson Laboratories、Bar Harbor、ME)を使用して実行した。すべての研究はMemorial Sloan Kettering Cancer Centerの研究機関内動物実験委員会(IACUC)によって認可された。各々の実験を最低でも6〜8匹の動物を使用して実行し、アッセイを三重で実行した。すべての細胞カウントは、介入に対して盲検化された審査員によって実行した。
尾の外科手術及びリンパのアブレーションを、以前公表されたように実行した。Clavin et al.,Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.295:H2113−H2127(2008)。簡潔には、尾の中間部分の表在集合リンパ管及び深部集合リンパ管を、2mmの環状切除を使用して切除した。外科手術の2週間後に開始(初期治療)及び外科手術の6週間後に開始(後期治療)して、0.1%のタクロリムス(Astellas、Tokyo、日本)/ベヒクル対照(ワセリン)で、異なるセットの動物を局所的に治療した。両方のアプローチについて、4週間の期間(初期治療について)及び3週間の期間(後期治療)の間0.1%のタクロリムス又はベヒクル対照により動物を1日2回治療した。タクロリムス(およそ0.05g)を尾領域全体に薄層として適用した。リンパ集合管の駆出能力の解析を可能にするために、以前に記載されたマウス膝窩リンパ節切除モデルを利用した。Blum et al.,Breast Cancer Res Treat 139:81−86(2013);Sharma et al.,Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.292:H3109−H3118(2007)。簡潔には、後肢の集合管及び膝窩リンパ節を同定し、リンパ節を膝窩脂肪体と共に切除した。外科手術の2週間後に開始する、0.1%の局所的なタクロリムス又はベヒクル対照(ワセリン)のいずれかによる2週間の間の1日2回の治療に対して、動物を無作為化した。
フローサイトメトリーを以前に報告されたように末梢血サンプルで実行した。Zampell et al.,PLoS ONE 7:e49940(2012)。簡潔には、赤血球をRBC溶解バッファー(Ebioscience、San Diego、CA)により溶解し、続いてフルオロフォアコンジュゲート抗体(CD45、CD3、及びCD4;すべてBiolegend、San Diego、CAから)により染色し、FlowJoソフトウェア(Tree Star、Ashland、OR)を使用して、FACSCaliburフローサイトメーター(BD Biosciences、Franklin Lakes、NJ)により解析した。
タクロリムスの血中レベルを以前に報告された方法を修飾した質量分析を使用して測定した。Donaldson et al.,Meth.Mol.Biol.603:479−487(2010)。簡潔には、全血をEDTAナトリウムコートチューブ(Terumo、Shibuya、日本)中に収集し、次いでTSQ Quantum Ultraトリプル四重極質量分析計(Thermo Scientific、Franklin、MA)に連結されたThermo Scientific Aria TLX−2乱流クロマトグラフ(TFC)を使用して分析した。使用したTurboFlowカラムはサイクロンP−50×0.5mmであり、一方分析カラムは3×50mmのHypersil Gold C−18カラムであった。全血(50μL)へ、内部標準物質としてアスコマイシンを含有する200μLの0.2mMのZnSO4を添加した。30分間のインキュベーション及び遠心分離に続いて、50μLの上清をTFCシステムの中へ注入した。10mMのギ酸アンモニウム及び0.1%の蟻酸を含有する水及びメタノール溶液の勾配によりカラム(0.75mL/分間)を介して、検体を溶出させた。分析実行時間は4.5分間であった。アッセイ日の間の不正確度を10日の期間にわたって3つの濃度で決定した。3.3、12.6及び31.9ng/mLの濃度で、変動係数はそれぞれ9.8、7.0及び7.8%であった。アッセイは0〜40ng/mLで直線範囲を有する。
尾の体積を以前に報告されたように円錐台式を使用して計算し(Clavin et al.,Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.295:H2113−H2127(2008))、Mirax画像化ソフトウェア(Carl Zeiss、Munich、ドイツ)を使用する標準化された様式で、皮膚/皮下組織の軟組織厚みの組織学的測定を使用して確認した。
本出願人の出版された方法を使用して免疫組織化学的染色を実行した。Clavin et al.,Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.295:H2113−H2127(2008)。簡潔には、組織を4%のパラホルムアルデヒド中で4℃で固定し、5%のEDTAナトリウム(Santa Cruz Biotechnology、Dallas、TX)中で脱灰し、パラフィン中に包埋し、5マイクロメートルで切片を作成した。切片を湿らせ、加熱媒介性の抗原のマスキングの除去を90℃のクエン酸ナトリウム(Sigma−Aldrich)を使用して実行した。非特異的結合はを2%のBSA/20%の動物血清によりブロックした。組織を一次抗体により4℃で一晩インキュベーションした。免疫組織化学の染色のために使用された一次抗体は、ヤギ抗マウスLYVE−1、ラット抗マウスCD45、ウサギ抗マウスCD4、ラット抗マウスF4/80(すべてR&D、Minneapolis、MNから)、ウサギ抗マウスCD3(Dako、Carpinteria、CAから)、Cy3コンジュゲート抗マウスαSMA(Sigma−Aldrichから)、ウサギ抗ヒトIFN−γ、ウサギ抗マウスTGF−β1、ウサギ抗マウスp−SMAD3、ウサギ抗マウスI型コラーゲン、ウサギ抗マウスiNOS、ハムスター抗マウスポドプラニン、ウサギ抗マウスHMGB−1及びHSP−70(すべてABCAM、Cambridge、MAから)を含んでいた。
尾組織のパラフィン切片を、製造者の説明書に従ってピクロシリウスレッド染色キット(Polysciences、Warrington、PA)により染色した。Axiocam 2顕微鏡(Carl Zeiss)にて偏光を介して画像を得て、瘢痕指標は、赤色〜オレンジ色の線維:緑色〜黄色の線維の比(より大きい数は瘢痕化の増加を表わす)の計算によって、Metamorphソフトウェアで定量化した。
RNA抽出は、製造業者の推奨に従ってTRIZOL(Invitrogen、Life Technologies、Carlsbad、CA)を使用して尾皮膚で実行した。RNAの質及び量は、Agilentバイオアナライザー(Agilent Technologies,Inc;Santa Clara、CA)を使用して査定した。TaqMan逆転写酵素キット(Roche、Branchburg、NJ)を使用して、単離されたRNAをcDNAに変換し、群間の遺伝子発現の相対的発現を、以前に記載されたように、デルタ−デルタCT PCR解析を使用してそしてGAPDHのRNA増幅の使用により遺伝子発現を正規化して、実行した。Schmittgen et al.,Nat.Protoc.3:1101−1108(2008)。相対的発現は、式:2[−(Ct対象となる遺伝子−Ct内在性対照)サンプルA−(Ct対象となる遺伝子−Ct内在性対照)サンプルB]を使用して計算した。すべてのサンプルは三重で実行した。対象となるPCR標的のために使用されたプライマーは、VEGF−C、TGF−β1、及びIFN−γのためのもの(Applied Biosystems、Life Technologies、Carlsbad(CA))であった。
ROSのインビボの検出は、Han et al.(J.Vis.Exp.doi:10.3791/3925(2012))によって記載されたようにNADPHオキシダーゼの生物発光画像化によって実行した。簡潔には、PBS中で溶解したL−012(ルミノールの類似体)(20μg/g)をPLND後の異なるタイムポイントでマウスに全身的に注射し、PLND外科手術部位でROSを表わす発光シグナルを画像化し、IVISスペクトル200(Xenogen Corporation)を使用して定量化した。記載されたように血管透過性についてのMilesアッセイを実行した。Radu et al.,J.Vis.Exp.doi:10.3791/50062(2013)。簡潔には、200μlの0.5%の滅菌されたエバンスブルーを、2週間タクロリムスで治療されたPLNDマウスへ尾静脈を介して注射した。30分後に、PLND後肢を画像化してエバンスブルー漏出を観察した。後肢を切除し、55℃で48時間ホルムアミド中でインキュベーションしてエバンスブルーを抽出した。抽出されたエバンスブルーは、610nmで吸光度を測定することによって定量化した。
GraphPad Prismソフトウェア(GraphPad Software、La Jolla、CA)を使用して、データを分析及び提示した。値は、特に断りのない限り、平均±標準偏差として表示される。統計的有意差をp≦0.05で設定し、2つの群の間の差をStudentのt検定により査定し、一方で群内の比較のために事後検定によるANOVAを使用して複数の分析を実行した。
CD4+T細胞がリンパ浮腫病理において重要な役割を果たすので、この研究の目的は、リンパ浮腫の予防及び治療のための局所的なタクロリムスの有効性を評価することであった。本出願人は、記載されたリンパ浮腫のマウス尾モデルに加えて、以前に記載された膝窩リンパ節郭清(PLND)からもたらされるリンパ管損傷のモデルを適切に使用して、局所的なタクロリムスが、慢性的な炎症応答を減少させ、組織及びリンパの線維化を減少させ、集合リンパ管の駆出を増加させ、及び側副リンパ管形成を増加させることによって、リンパ管損傷後のリンパ浮腫の発症を強力に予防することを示した。先行する実験的な試みが主として外来性リンパ管新生増殖因子を使用してリンパ管再生を増加させることに注目したので、これらの所見はリンパ浮腫の治療について重要な意味合いを有する。
ピルフェニドンは尾のリンパ浮腫を減少させる
マウス尾の表在リンパ管及び深部リンパ管の破壊は、外科手術の2週間後にほぼ80%の尾体積の増加をもたらした(図19A、19B)。この時点での膨潤は主として間質液の蓄積に起因することが、以前に本出願人により示されている。Avraham et al.,FASEB J.27:1114−1126(2013)。尾における慢性的なリンパ管閉塞は、続く4週間にわたって、脂肪線維組織による間質液の段階的な置き換え及び炎症細胞の蓄積をもたらす。Avraham et al.,FASEB J.27:1114−1126(2013)。これらの病理学的な変化は臨床的リンパ浮腫を非常によく反映し、一旦リンパ浮腫が確立されれば、追加の少なくとも8〜10週間の間持続する。この知識に基づいて、これらの確立された軟組織変化を治療する意図で、リンパ浮腫が確立するように外科手術後に7週間待機し、次いでピルフェニドンによる治療を開始した。最初に全身的な治療により開始したが、これは、ピルフェニドンについての大部分の先行研究がこの投与経路を線維症の治療のために使用するからである。しかしながら、一旦効果的な治療としてピルフェニドンが確立されたならば、局部投与は、全身治療に起因する任意の可能性のある副作用を最小限にすることで好ましいので、局所製剤を開発した。全身的及び局所的なピルフェニドンによる治療は、対照と比較して、肉眼的な尾膨潤、尾体積、及び軟組織厚みを著しく減少させた(図19A〜19C、19E;両方の治療群で、尾体積についてp<0.01及び厚みについてp<0.05)。
尾モデルにおけるリンパ浮腫の治療のピルフェニドンの有効性を考慮して、次にピルフェニドンがリンパ管損傷後のリンパ機能を調節するかどうかを研究することにした。99Tcリンパ管シンチグラフィー(放射性トレーサーを尾遠位部中に注射する技法)を使用して、90分間にわたる仙骨リンパ節による取り込みを測定した。全身的及び局所的なピルフェニドン治療動物における仙骨リンパ節の崩壊補正取り込みは、対照と比較して、ピルフェニドン治療動物における99Tc取り込みのほぼ4倍の増加を実証した。加えて、全身的及び局所的に治療された動物は、ピークのリンパ節取り込みのほぼ4倍の増加を実証した(図19G;両方についてp<0.01)。同様に、崩壊補正曲線の勾配の増加によって示されるように、全身的及び局所的に治療された動物における取り込みの率の増加があった(図19H;それぞれp<0.01及びp<0.05)。
慢性炎症は、臨床的なリンパ浮腫の組織学的特徴であり、炎症細胞(特にTヘルパー細胞)の蓄積の増加によって特徴づけられる。Avraham et al.,FASEB J.27:1114−1126(2013);Zampell et al.,PLoS ONE 7:e49940(2012);Ghanta et al.,Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.308:H1065−1077(2015);Olszewski et al.,Lymphology 23:23−33(1990)。このことと一致して、全身的及び局所的に治療された両方の動物では、対照と比較して、真皮及び皮下脂肪に浸潤する白血球の数が著しく減少したことが見出された。対照動物から採取されたリンパ浮腫性組織中の炎症細胞は毛細管及び集合リンパ管に非常に接近して位置したが、ピルフェニドン治療マウス中で実質的には存在しなかった。同様に、浸潤するCD3+細胞及びCD4+細胞の数の著しい減少が、本出願人により指摘された(図20A、20D;両方についてp<0.001)。さらに、IFN−γタンパク質(強力な抗リンパ管新生性であることが以前に見出された、Tヘルパー(Th)1細胞産生サイトカイン)の蓄積の有意な減少が、指摘された(図20J;p<0.01)。Kataru et al.,Immunity 34:96−107(2011);Shao et al.,J.Interferon Cytokine Res.26:568−574(2006)。
ピルフェニドンがリンパ機能を増加させるメカニズムを理解するために、マウス後肢のPLNDモデルを使用して、毛細リンパ管における皮膚逆流及び集合リンパ管の駆出能力を分析した。Blum et al.,Breast Cancer Res.Treat.139:81−86(2013)。PLNDの4週間後にNIRリンパ管造影法を使用して、2週間の全身的なピルフェニドンにより治療された動物は、ベヒクルに治療された対照と比較して、皮膚逆流及び毛細管管漏出が著しく少ないことが見出された(図18A、白色矢印)。加えて、ピルフェニドン治療動物では、対照と比較して、集合リンパ管収縮率が有意に増加していた(2倍の増加;図18A、18B;p<0.0015)。この応答は、尾モデルによる本出願人の所見に類似して、ピルフェニドンにより治療されたマウスにおける炎症細胞のリンパ周囲の浸潤の有意な減少と相関した(図18E(上部パネル)、図18F;p<0.01)。加えて、ピルフェニドンによる治療は、炎症細胞によるiNOSのリンパ周囲での発現の有意な減少をもたらした(図18E(下部パネル)、図18G;p<0.01)。炎症の状況におけるリンパ周囲のiNOS蓄積の増加は、正常な統合されたリンパ管収縮性のために重要な正常な一酸化窒素勾配を破壊することが示されているので、これは重要な所見である。Liao et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108:18784−18789(2011)。これはピルフェニドンがどのようにリンパ管収縮性を改善するのかに関して重要なメカニズムを提供する。
T細胞(特にTh1及びTh2サイトカイン)が、リンパ節のリンパ管新生及び創傷修復の間の炎症性リンパ管新生を強力に阻害することが公知であるので、次にピルフェニドンによる治療が側副リンパ管の形成を増加させるかどうかを決定することにした。Kataru et al.,Immunity 34:96−107(2011);Clavin et al.,Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.295:H2113−H2127(2008);Zampell et al.,Am.J.Physiol.Cell Physiol.302:C392−C404(2012);Savetsky et al.,PLoS One 10:e0126908(2015)。確かに、LYVE−1の免疫蛍光の染色を使用するリンパ管の組織学的分析及び同定により、尾及び後肢の両方におけるリンパ管密度の著しい増加が実証された(図18D、18E;p<0.001)。対照と比較して、ピルフェニドン治療リンパ浮腫性の尾におけるVEGF−Cタンパク質分析の差が指摘されないが、抗リンパ管新生T細胞サイトカイン(IFN−γ及びTGF−β1等)の重大な減少があったので、このリンパ管新生応答はVEGF−C発現に非依存性であると思われた(図20E、20I、20K;TGF−β1についてp<0.05、IFN−γについてp<0.01、及びVEGF−Cについてp=有意差なし)。
ピルフェニドンの主要な作用メカニズムがTGF−β1活性の遮断であることをを考慮して、分離した研究において、PLND後のピルフェニドン治療の効果をTGF−β1免疫療法と比較した。Schaefer et al.,Eur.Respir.Rev.20:85−97(2011)。NIR画像化を使用して、TGF−β1免疫療法単独に加えて、TGF−β1免疫療法とピルフェニドンの組み合わせが、イソタイプ対照と比較して、皮膚逆流を減少させ、集合リンパ管収縮率を有意に増加させることが見出された。より重要なことには、免疫療法単独と比較して、組み合わせ療法による追加の利益は無く、利用した用量で最大にTGF−β1を阻害していたことが指摘される(図21A〜21C;p=有意差なし)。同様に、フローサイトメトリーを使用して、TGF−β1免疫療法単独に加えて、TGF−β1免疫療法とピルフェニドンの組み合わせが、イソタイプ対照と比較して、リンパ管損傷から遠位でのTヘルパー細胞の組織内蓄積を有意に減少させたが、免疫療法単独と比較して、組み合わせ療法による追加はなかったことが見出された。
リンパ浮腫の状況におけるTGF−β1の細胞性源を決定するために、T細胞及び骨髄球からのTGF−β1産生の選択的ノックアウトを備えた遺伝子導入マウスを開発した。これらの遺伝子導入マウスの表現型の確認は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して、対照マウスと比較して、T細胞cre及び骨髄系creマウスからそれぞれ単離されたT細胞及び骨髄系細胞からのTGF−β1発現の有意な減少を示したことで確認された(図21A;両方についてp<0.05)。尾の外科手術を実行し、外科手術の6週間後に解析を実行した。T細胞creマウスは、骨髄系creマウス及び対照マウスと比較して、肉眼的な尾膨潤、尾体積、及び脂肪線維の厚みが著しく減少していた(図21B〜21D;尾体積及びpについてp<0.01、厚みについて<0.05)。99Tcリンパ管シンチグラフィーの解析により、T細胞creマウスの仙骨リンパ節におけるトレーサーの崩壊補正取り込みが、骨髄系creマウス及び対照マウスと比較して、ほぼ4倍に増加したことが実証された。同様に、T細胞creマウスにおいて、骨髄系creマウス及び対照マウスと比較して、ピークのリンパ節取り込みに加えてトレーサー取り込み率の増加があった(図21E〜21F;それぞれp<0.05及びp<0.01)。
リンパ浮腫の状況におけるLECに対するTGF−β1の直接効果を分析し、インビボのモデルへ本出願人の先行するインビトロの所見を適用するために、FLT4Creマウスで尾の外科手術を実行し、外科手術の6週間後に解析を実行した。Avraham et al.,Plast.Reconstr.Surg.124:438−450(2009)。これらの遺伝子導入マウスの表現型の確認を、LYVE−1及びpSMAD3についてのリンパ節に対する染色により確認した。FLT4CreマウスはLEC上に検出可能なpSMAD3染色を有しておらず、TGF−β1へのLECの不反応性を示す(図23A、白色矢印はpSMAD3+LECを示す)。FLT4Creマウスは、対照マウスと比較して、肉眼的な尾膨潤、尾体積、及び脂肪線維の厚みにおける差を有していなかった(図23C〜23E、23G;p=有意差なし)。興味深いことに、そして本出願人の先行するインビトロの所見に類似して、創傷の架橋部分においてリンパ管密度の増加が見出された(図23H;p<0.01)。Clavin et al.,Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.295:H2113−H2127(2008)。創傷の架橋部分は皮膚リンパ管がすべて外科手術により除去された領域である。したがって、これは、リンパ浮腫の状況におけるTGF−β1へのLECの不反応性の結果としての改善されたリンパ管新生を指摘する。
研究デザイン
本出願人の仮説は、TGF−β1の阻害によってリンパ浮腫を治療し、それによって炎症及び線維化の両方を減少させることができるということであった。複数の異なる動物モデルにおいてこの仮説の異なる態様を調査して、傷害後の膨潤、炎症、線維化、リンパ管機能、及びリンパ管新生を詳細に査定することを可能にした。成体メス(10〜14週齢)C57BL/6Jマウス(Jackson Laboratories、Bar Harbor、ME)を、光及び温度を制御した病原体不含有環境において維持し、自由摂食させた。すべての研究はMemorial Sloan Kettering Cancer Centerの研究機関内動物実験委員会(IACUC)によって認可された。尾の外科手術を受けた後に、尾遠位部が壊死したならば、動物を実験から除外した。動物を治療群又は対照群へ無作為化する前に、この評価を行った。各々の実験を最低でも6〜8匹の動物を使用して実行し、アッセイを三重で実行した。すべてのカウントは、介入に対して盲検化された審査員によって実行した。
十分に記載されたリンパ浮腫のマウス尾モデルを使用するリンパアブレーション(尾の中間部分で2mmの環状の皮膚切除を介して尾の表在リンパ系及び深部リンパ系を切除する)を、動物に行った。Clavin et al.,Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.295:H2113−H2127(2008);Avraham et al.,Am.J.Pathol.177:3202−3214(2010);Rutkowski et al.,Microvasc.Res.72:161−271(2006);Tabibiazar et al.,PLoS Med.3:e254(2006)。本出願人のグループ及び他のグループは、このモデルが、少なくとも手術後10週間の間、尾遠位部の持続的リンパ浮腫、リンパ機能における重度の不全、及び臨床的なリンパ浮腫の組織学的特色(例えば慢性炎症、脂肪の沈着、線維化)をもたらすことを以前に示した。Clavin et al.,Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.295:H2113−H2127(2008);Avraham et al.,Am.J.Pathol.177:3202−3214(2010);Rutkowski et al.,Microvasc.Res.72:161−271(2006);Tabibiazar et al.,PLoS Med.3:e254(2006)。外科手術の7週間後に(リンパ浮腫が確立された時)、動物を実験(ピルフェニドン)群又は対照群へ無作為化し、以下で略述されるように、3週間の間1日1回治療し続いて解析した。
尾体積は、リンパ管損傷ゾーンから遠位で複数のデジタルキャリパーによる尾円周測定を使用して分析し、以前に記載されたように円錐台式を使用して計算した。Clavin et al.,Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.295:H2113−H2127(2008)。リンパ管シンチグラフィーも以前に記載されたように実行して、尾遠位部の中へ50μlの濾過されたテクネチウム(Tc99m)硫黄コロイドを注射することによって仙骨リンパ節へのリンパの流れを定量化した。Avraham et al.,FASEB J.27:1114−1126(2013)。X−SPECTカメラ(Gamma Medica、Northridge、CA)を使用して、崩壊補正取り込みを仙骨リンパ節において記録し、ASIProソフトウェア(CTI Molecular Imaging、Knoxville、TN)を使用して対象となる領域の解析を実行した。Clavin et al.,Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.295:H2113−H2127(2008)。
タンパク質分析のための尾組織をリンパ管損傷から1.5cm遠位で採取し、急速凍結し、粉砕し、ホスファターゼ及びプロテアーゼ阻害因子(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO)と混合された組織抽出タンパク質試薬(ThermoFisher Scientific、Waltham、MA)により抽出した。サンプル(n=3〜5動物/群)からの20〜30mgのタンパク質をELISAによって分析して、製造業者のプロトコール(eBioscience、San Diego、CA)に従ってTGF−β1、インターフェロン−ガンマ(IFN−γ)、及び血管内皮増殖因子C(VEGF−C)を定量化した。すべての実験は二重で実行した。
後肢の集合リンパ管の収縮性を査定するために、15μlの0.15mg/mlのインドシアニングリーン(ICG)(Sigma−Aldrich、Saint Louis、MO)を後足の背面において皮内で注射した後、近赤外画像化(NIR)によりビデオを録画した。注入後20分間放置して集合管の中への取り込みを可能にした。次いでカスタムメイドのEVOS EMCCDカメラ(Life Technologies、Carlsbad、CA)及びLED光源(CoolLED、Andover、英国)を使用して、動物を画像化した。Zeiss V12 Stereolumar顕微鏡(Caliper Life Sciences、Hopkinton、MA)を使用してビデオ画像を得た。8秒ごとに30分間画像を得た。リンパ管のポンプ機能は、Fijiソフトウェア(National Institutes of Health、Bethesda、MDによって開発された無料のオープンソースデータ解析ツール)を使用して分析した。対象となる領域を主要な集合管にわたって選択し、ノイズを引いた蛍光強度を経時的にプロットした。内因性のポンプ機能を評価するために、各々のビデオの最初の10分間はポジショニングからのリンパ管の刺激に起因して除外し、各々のビデオの最後の20分間のみを分析した。ポンプ機能は毎分の拍動で定量化した。
T細胞及び骨髄球からのTGF−β1のノックアウトの表現型を確認するために、脾臓をこれらのマウスから採取した。正の選択のCD3磁性ビーズ(Miltenyi Biotec、Cambridge、MA)を使用して製造者の推奨に従って、T細胞cre遺伝子導入マウスの脾臓から、T細胞を単離した。同様に、正の選択のCD11b磁性ビーズ(Miltenyi Biotec、Cambridge、MA)を使用して製造者の推奨に従って、骨髄系cre遺伝子導入マウスの脾臓から、骨髄系細胞を単離した。次いで単離された細胞をTRIzol中に設置した。標準的なTRIzol抽出手順を使用してRNAを単離した。Chomczynski et al.Anal.Biochem.162:156−159(1987);Ribaudo et al.,Curr.Protocols Immunol.,(Coligan et al.eds.)Chapter 10,Unit 10 11(2001)。TaqMan逆転写試薬(Applied Biosystems、Foster City、CA)を使用して逆転写、続いてTaqManユニバーサルマスターミックス(Applied Biosystems)及びLightCyclerサーモサイクラー(Roche Diagnostics、Indianapolis、IN)を使用して定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)を実行した。TGF−β1発現レベルをGAPDHに対して正規化した。実験は三重で実行した。
ピルフェニドンの主要な作用メカニズムがTGF−β1活性の遮断であることを先行研究が示唆したので、分離した研究において、PLND後のピルフェニドン治療の効果をTGF−β1免疫療法と比較した。Schaefer et al.,Eur.Respir.Rev.20:85−97(2011)。重要なことには、TGF−β1に対するモノクローナル抗体がTGF−β1生物学的活性の中和に効果的であるだけでなく、この治療がリンパ浮腫を著しく減少させ、リンパ機能を改善することが、以前に本出願人によって示された。Avraham et al.,Am.J.Pathol.177:3202−3214(2010)。上で略述されたように動物にPLNDを行い、外科手術の2週間後に、TGF−βモノクローナルマウス中和抗体単独(TGFmab;クローン1D11;Bio−x−cell、West Lebanon、NH)又は150μlのPBS中で希釈した用量5mg/kgのピルフェニドン+TGFmabのいずれかによる治療へ無作為化し、1週間あたり3回腹腔内に送達した。Ruzek et al.,Immunopharmacol.Immunotoxicol.25:235−257(2003)。対照動物は、ピルフェニドンについてのベヒクル対照、又はTGFmabと同じスケジュールで腹腔内で送達された非特異的イソタイプ抗体のいずれかにより治療した。
GraphPad Prism(GraphPad Software,Inc.、San Diego、CA)ソフトウェアを使用して、統計解析を実行した。Studentのt検定を2つの群の間で差を比較するために使用した。事後検定による二元配置ANOVAを使用して複数のタイムポイントの間の解析(リンパ管シンチグラフィー)を実行して、個々の群を比較した。記述的分析及びグラフ法を使用して結果を分析及び要約した。データは特に断りのない限り平均±標準偏差として表示し、p<0.05で有意であると判断した。
この研究の1つの目的は、リンパ浮腫及びリンパ管損傷の前臨床マウスモデルにおいてリンパ浮腫の治療に対するピルフェニドンの有効性を分析することであった。2つの異なるマウスモデルを使用して、確立されたリンパ浮腫の全身的及び局所的なピルフェニドン治療は、線維化を著しく減少させること及びリンパ機能を改善することが示された。ピルフェニドンによる治療は、リンパ節切除後に、慢性的な炎症反応を減少させ、リンパ集合管の駆出能力を著しく増加させる。加えて、ピルフェニドンは、リンパ管損傷後の線維化の予防に極めて効果的であり、おそらくこの応答はTGF−β1の阻害に対して二次的なものである。本出願人のPLNDモデルにおいてTGF−β1免疫療法を使用して、ピルフェニドンの主要な効果はTGF−β1阻害であり、TGF−β1の最大阻害は利用した用量で達成されたことが示された。さらに、本出願人のマウスのリンパ浮腫の尾モデルを使用して、T細胞(特にCD4+細胞)がリンパ浮腫の状況においてTGF−β1の主な源であることが示される。加えて、Th1及びTh2のサイトカインと一緒にT細胞からのTGF−β1の欠損がリンパ浮腫に誘導された慢性炎症(CD4+細胞等)を減少させたことが、本出願人によって示された。
リンパ管損傷後のリンパの機能不全の予防におけるテリフルノミドの有効性を試験するために、十分に記載された膝窩リンパ節郭清(PLND)(膝窩リンパ節は小さな皮膚切開を使用して除去される)のマウスモデルを使用した。確立されたリンパ浮腫の治療におけるこの治療の有効性を試験するために、リンパ浮腫のマウス尾モデル(尾の表在リンパ系及び深部リンパ系が中断され、動物は臨床疾患と一致する組織学的変化を発達させる)を使用した。
上述のように、PLNDモデルを使用して、リンパ管損傷後のリンパの機能不全の予防における、及びマウス尾モデルを使用して、確立されたリンパ浮腫の治療における、カプトプリルの有効性を試験した。動物を、2〜4週間(PLND後に2週間;尾リンパ浮腫後に4週間)の間、カプトプリル(5%)又はベヒクル対照(ワセリン又はAquaphor/グリセリン軟膏)の局所製剤により1日1回治療した。次いでマウスを屠殺し、リンパ機能、線維化、及びリンパ管新生をすべて標準的なアッセイを使用して査定した。局所的なカプトプリルによる治療は、PLNDモデルにおいてリンパ機能の改善及び尾モデルにおいてリンパ浮腫の減少をもたらした。結果を図31〜53中で示す。
PLND及びマウス尾モデルを使用して、実施例1〜4中で記載されたように、抗線維化薬物又はベヒクル対照の組み合わせを含む局所製剤を動物に投与する。治療組成物を表1中で示す。
Claims (12)
- 有効量のピルフェニドンを含む、リンパ浮腫の治療又は予防における使用のための医薬組成物であって、前記医薬組成物が、局所投与され、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、ムース、泡、ラッカー、懸濁物、液体、及びスプレーから選択される形態である、医薬組成物。
- 前記医薬組成物が軟膏の形態である、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物が少なくとも1日1回局所的に投与される、請求項1又は2に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物が少なくとも1日2回局所的に投与される、請求項3に記載の医薬組成物。
- 有効量のピルフェニドンを含む、リンパ浮腫の治療又は予防における使用のための医薬組成物であって、前記医薬組成物が経口投与される、医薬組成物。
- 前記医薬組成物が、錠剤、カプセル、液体、溶液、ソフトゲル、懸濁物、エマルション、シロップ、及びエリキシルから選択される形態である、請求項5に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物が、錠剤又はカプセルの形態である、請求項5又は6に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物が少なくとも1日1回経口投与される、請求項5〜7のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物が少なくとも1日2回経口投与される、請求項8に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物がリンパ管損傷の約6週間以内に予防的に投与される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物がリンパ管損傷の約2週間以内に予防的に投与される、請求項10に記載の医薬組成物。
- リンパ浮腫の治療のための医薬の製造における、ピルフェニドンの使用。
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