JP6704403B2 - 浮腫の治療のための組成物及び方法 - Google Patents

浮腫の治療のための組成物及び方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年２月５日に出願された米国仮特許出願第６２／１１２，２７３号の優先権を主張し、その全体の内容は参照により本明細書に援用される。
政府助成に関する陳述
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって授与された補助金番号Ｒ０１ ＨＬ１１１１３０−０１、Ｔ３２ ＣＡ００９６８５−２１Ａ１、及び１ Ｓ１０ ＲＲ０２８８８９−０１、ならびにＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって授与された補助金番号Ｐ３０ ＣＡ００８７４８下の政府助成により行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
著作権
本特許文書の開示の一部分は、著作権保護を受ける材料を含有する。著作権所有者は、特許文書又は特許開示が特許商標庁の特許ファイル又は記録中で掲載される通りに任意の者によって複製されることに異議を唱えないが、それ以外はどんなものであれすべての著作権を留保する。
参照による援用
参照による援用を許可する国については、本開示中で引用されるすべての参照は、それらの全体を参照することによって本明細書に援用される。加えて、本明細書において引用又は言及される任意の製品のための任意の製造業者の説明書又はカタログは、参照によって援用される。本テキストの中へ参照によって援用された文書又はその中の任意の教示は、本発明の実践において使用することができる。本テキストの中へ参照によって援用された文書は、先行技術であるとは認められない。
リンパ浮腫は、米国及び西洋諸国において癌治療の合併症として最も頻繁に起こる慢性的な消耗性疾患である。この状況において、リンパ浮腫は、最も一般的にはリンパ節郭清後のリンパ系への医原性損傷の結果として、そして広範囲の皮膚切除及び照射によるアジュバント療法の結果としても起こる。Ｐｕｒｕｓｈｏｔｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３：４３１２−４３２１（２００５）；Ｓｚｕｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ９５：２２６０−２２６７（２００２）；Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．１６：１９５９−７２（２００９）。リンパ節郭清を受ける３名の患者中の１名がリンパ浮腫を発症するだろうと推定され、控え目な推定から５０，０００人もの新しい患者が毎年診断されることが示唆される。ＤｉＳｉｐｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．１４：５００−５１５（２０１３）；Ｐｅｔｒｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ８３：２７７６−２７８１（１９９８）。リンパ浮腫は治癒できない生涯にわたる疾患であるので、罹患者の数は、最近の推定で５〜６００万人の間の範囲の米国人（Ｒｏｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１１３１：１４７−１５４（２００８））及び世界中で２億人以上が毎年増加している。リンパ浮腫の発症が癌生存者とほぼ直線的に比例するので、及びリンパ浮腫についての既知のリスクファクター（肥満及び放射線等）の罹患率が上昇しているので、この数はおそらく将来増加し続けるであろう。Ｅｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９３：９６−１１１（２００１）。
リンパ浮腫は外観を損ない消耗させ、患者には、罹患した四肢の慢性的膨潤、再発性感染、運動性の限定、及び生活の質の低下がある。Ｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ １１８：２２３７−２２４９（２０１２）。加えて、一旦リンパ浮腫が発症すれば、それは通常進行性である。リンパ浮腫が一般的であり非常に病的であるという事実にもかかわらず、現在のところ治癒せず、治療は、リンパ機能の回復ではなく疾患進行を予防することを目標とする緩和である。Ｖｅｌａｎｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．１７７：１８４−１８７（１９９９）；Ｂｅａｕｌａｃ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．１３７；１２５３−１２５７（２００２）。結果として、患者は、罹患した四肢中のリンパ液集積を予防し、非常に強く時間のかかる理学療法治療を受けるという努力の一環において、残りの人生の間窮屈で不快な衣服の着用が要求される。Ｋｏｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｏｎｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．，６７：８４１−８４６（２００７）。加えて、常習的なケアの継続にもかかわらず、幾人かの患者には、依然としてリンパ浮腫性肢における膨潤の増加及び頻繁な感染を伴う疾患の深刻な進行がある。現在、進行を中断することができるか又はリンパ浮腫の消失を促進することができる公知の薬理療法はない。Ｃｏｒｍｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．１９：６４２−６５１（２０１２）。したがって、リンパ浮腫について標的化された治療の開発は重要な目標であり、満たされていない生物医学的必要性である。
最近の研究により、線維化はリンパ浮腫の臨床的特徴だけでなく疾患の重要な病理学的調節因子でもあることが示された。Ｃｈｅｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｒａｄｉａｔ．Ｏｎｃｏｌ．１３：２１４−２２５（２００３）；Ｍｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７：ｅ４１１２６（２０１２）；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：７４−８２（２００９）。トランスフォーミング増殖因子ベータ−１（ＴＧＦ−β１）は、線維芽細胞によるコラーゲン産生を増加させマトリックス産物のターンオーバーを減少させる直接的なメカニズムを介して作用する、様々な器官系における線維化の重要な調節因子である。Ｗｉｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６６：１３２１−１３３２（２００５）；Ｓａｋａｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１８４：２６１１−２６１７（２０１４）；Ｑｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．ＲｅｎａｌＰｈｙｓｉｏｌ．２８８：Ｆ８００−Ｆ８０９（２００５）；Ｂｏｎｎｉａｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：２０９９−２１０８（２００４）；Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３０５：１００２−１００７（２００３）；Ｓｔｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０３：２２６−２３２（２００５）；Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１０：４７−５１（１９９８）；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９６：８７４−８８１（１９９７）；Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２１：１１３−１１９（１９９５）；Ｐｅｌｔｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．９７：２４０−２４８（１９９１）；Ｖａｎ Ｌａｅｔｈｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１０：５７６−５８２（１９９６）。加えて、ＴＧＦ−β１は炎症性応答の重要な調節因子であり、慢性炎症の修飾によって線維化を間接的に調節すると考えられる。Ｐｅｓｃｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．５：ｅ１０００３７１（２００９）。リンパ浮腫性組織（臨床的なもの及びリンパ浮腫のマウスモデルの両方）においてＴＧＦ−β１の発現が著しく増加することが、最近本出願人により示された。免疫療法を使用するＴＧＦ−β１の阻害は、マウス尾のモデルにおいてリンパ管再生を有意に加速し、線維化を減少させ、炎症を減少させ、リンパ機能を改善する。Ａｖｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．１２４：４３８−４５０（２００９）；Ｃｌａｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９５：Ｈ２１１３−Ｈ２１２７（２００８）；Ａｖｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７７：３２０２−３２１４（２０１０）。
線維化応答の阻害は、間質液及び炎症細胞を輸送するリンパ系の能力を維持する。本出願人の研究室からの最近の研究により、リンパ浮腫の臨床モデル及び動物モデルの両方における線維化の調節でＣＤ４+細胞が重要な役割を果たすことが示された。Ａｖｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７７：３２０２−３２１４（２０１０）；Ａｖｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．２７：１１１４−１１２６（２０１３）；Ｚａｍｐｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３０２：Ｃ３９２−Ｃ４０４（２０１２）；Ｚａｍｐｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ４９９４０（２０１２）。例えば、臨床的リンパ浮腫の生検試料及びリンパ浮腫の動物モデルにはＣＤ４+細胞が浸潤し、これらの細胞の数が線維化及び疾患の臨床的重症度の程度と相関することが、本出願人により見出された。Ａｖｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．２７：１１１４−１１２６（２０１３）。後期ステージのリンパ浮腫に罹患する患者は、初期ステージの疾患に罹患する患者よりも一般に有意に多くの浸潤Ｔ細胞（特に多くのＣＤ４+細胞）を有していた。リンパ管静脈バイパス（閉塞したリンパ管を静脈循環へ短絡させる手順）後のリンパ浮腫の臨床症状における改善は、組織線維化の減少及びＣＤ４+細胞浸潤の減少と関連する。Ｔｏｒｒｉｓｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｌｙｍｐｈａｔ．Ｒｅｓ．Ｂｉｏｌ．１３：４６−５３（２０１５）。
リンパ浮腫におけるＣＤ４+細胞応答は、他の線維増殖性障害に類似して、混合Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞集団によって特徴づけられる。Ａｖｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．２７：１１１４−１１２６（２０１３）。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔヘルパー細胞又はＴｈ細胞としても公知）は、二次リンパ組織様構造を巡回し、活性化に際して、多数の別個の／重複する細胞タイプ（例えばＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔ、調節性、など）に沿って分化する。細胞のＴｈ２サブセットは、寄生生物への応答及びいくつかの自己免疫反応の調節において重要な役割を果たす。これらの細胞は、多くの器官系（心臓、肺、腎臓及び皮膚が含まれる）における線維増殖性疾患の病理にも関与している。より最近の研究により、Ｔｈ２の数はリンパ浮腫に罹患する患者から得られた組織生検中で増加し、Ｔｈ２分化の阻害はマウスモデルにおけるリンパ浮腫の病変を減少させることが示された。
ＣＤ４+細胞（但しＣＤ８+細胞又はマクロファージが含まれる他の炎症細胞タイプではない）の涸渇、又はＴｈ２分化の阻害（但し全身性炎症又はインターロイキン６の阻害ではない）は、線維化の程度を著しく減少させ、リンパ管新生及びリンパ液輸送を増加させ、前臨床マウスモデルにおいて確立されたリンパ浮腫を効果的に治療する。Ａｖｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．２７：１１１４−１１２６（２０１３）；Ｚａｍｐｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ４９９４０（２０１２）；Ｇｈａｎｔａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３０８：Ｈ１０６５−１０７７（２０１５）。これらの所見は、抗リンパ管新生性のサイトカイン／増殖因子（インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（ＩＬ）−４、ＩＬ−１３、及びＴＧＦ−β１が含まれる）の産生によって、Ｔ細胞がリンパ管新生を強力に阻害することを実証する最近の研究によって支持される。Ｋａｔａｒｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３４：９６−１０７（２０１１）；Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．６：６１９６（２０１５）；Ｓｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．２６：５６８−５７４（２００６）；Ｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１１：４５７１−４５７９（２００８）。総合すると、これらの調査結果は、リンパ浮腫性組織中の浸潤ＣＤ４+細胞が、複数のメカニズム（組織線維化に続発するリンパ管の構造変化の誘導、及び側副リンパ管形成の阻害が含まれる）を介して、リンパ機能を減少させることを示唆する。
リンパ浮腫についての先行する実験的な治療は、リンパ管新生性サイトカインの送達に注目した。Ｓｋｏｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７：１９２−１９８（２００１）。例えば、いくつかの先行する研究は、リンパ管新生性サイトカイン（血管内皮増殖因子ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）等）を使用してダメージを受けたリンパ管を修復することに注目した。Ｔａｍｍｅｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１３：１４５８−１４６６（２００７）；Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１２：Ｒ７０（２０１０）。見込みはあるだろうが、このアプローチの適用（特に癌患者への）は、これらの同じメカニズムが腫瘍増殖及び転移を調節し、癌転移又は再発のリスクを高めるので、支持できないかもしれない。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７０：２４９５−２５０３（２０１０）；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２８：９８（２００９）；Ｓｕｇｉｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．３４：６７３−６８０（２００９）；Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ２５：７１７−７２５（２００８）；Ｋａｚａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ５４：７１−７６（２００７）；Ｈｉｒａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０９：１０１０−１０１７（２００７）。これとは対照的に、ＣＤ４＋Ｔ細胞の局部的な涸渇は、リンパ管新生を促進するだけではなく、根底にある病変を治療することができ、したがって癌患者における使用のためにはるかに安全であり得る。このアプローチは、したがって、リンパ浮腫の再発／増悪の間の癌生存者の治療を可能にするか、外科手術をしない患者における保存療法に加えるか、ハイリスクの患者における疾患発生を予防するか、又はリンパ浮腫のための外科手術治療の転帰を改善する。
タクロリムスは、局所製剤としてＦＤＡに認可された抗Ｔ細胞剤であり、皮膚の炎症性疾患／線維症（アトピー性皮膚炎（Ｒｕｚｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３７：８１６−８２１（１９９７））、乾癬（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｍｅｄ．Ｓｕｒｇ．１８：８−１４（２０１４））、及び限局性強皮症（Ｍａｎｃｕｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１５２：１８０−１８２（２００５））が含まれる）の治療に使用される。タクロリムスは土壌細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓによって産生されるマクロライドであり、それは、移植拒絶反応の予防及び様々な自己免疫性疾患の治療のために使用した場合に良好な耐容性を示す。タクロリムスはＦＫ−５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ−１２）へ結合し、したがってカルシニューリンを阻害し、最終的にＩＬ−２発現を減少させることによって、その抗Ｔ細胞特性を発揮する。Ｃｌｉｐｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：６９５−６９７（１９９２）。ＩＬ−２がＴ細胞活性化及びＣＤ４+Ｔ細胞の分化のために不可欠であるので、カルシニューリン阻害剤は充分なＣＤ４+細胞免疫抑制効果を有する。Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３８：１３−２５（２０１３）；Ｒａｕｔａｊｏｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｍｅｄ．４０：３２２−３３５（２００８）。
テリフルノミドはＴ細胞炎症性応答を減少させる免疫抑制物質である。テリフルノミドの経口投与は多発性硬化症の治療のためにＦＤＡに認可されている。Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２２４６７−２２４７２（１９９５）；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：１２７０−１２７３（１９９６）；Ｉｇｌｅｓｉａｓ−Ｂｒｅｇｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３４７：２０３−２１１（２０１３）。テリフルノミドはレフルノミドの活性代謝物質であり、酵素ジヒドロオロテート脱水素酵素のブロックによってデノボのピリミジン合成を阻害する。テリフルノミドはシグナル伝達兼転写活性化因子−６（ＳＴＡＴ−６）（Ｔｈ２分化の重要な調節因子）の活性化も阻害することが示された。Ｏｌｓａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０８：１８０６７−１８０７２（２０１１）。これらのメカニズムの結果として、テリフルノミドは活発に分裂するＴｈ２細胞を阻害し、炎症性応答を減少させる。
ピルフェニドンは抗線維化効果及び抗炎症効果を有する化合物である。最近の研究により、この活性が少なくとも部分的にＴＧＦ−βの産生及び活性の阻害に起因することが示唆された。Ｉｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９１：３６７−３７３（１９９９）；Ｔａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８：５２２−５２７（２００１）；Ｏｋｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５９０：４００−４０８（２００８）；Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｎ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｊ．２１：１４５−１５１（２００６）；Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｒｅｖ．２０：８５−９７（２０１１）。安全性及び有効性が特発性肺線維症（ＩＰＦ）に罹患する１，２４７名の患者の３つの臨床試験において確立された後に、ピルフェニドンはＩＰＦの治療における経口投与のためにＦＤＡによって米国で現在認可されている。Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．３５：８２１−８２９（２０１０）；Ｎｏｂｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３７７：１７６０−１７６９（２０１１）；Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７０：２０８３−２０９２（２０１４）。ＩＰＦの治療に加えて、ピルフェニドンは、他の慢性的な線維化疾患（腎線維症、肝線維症及び骨髄線維症が含まれる）の治療のための安全性及び有効性について臨床的に評価された。Ｔａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８：５２２−５２７（２００１）；Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．２：９０６−９１３（２００７）；Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．４１：１１１８−１１２３（２００２）；Ｒａｇｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．ＣａｒｅＭｅｄ．１５９：１０６１−１０６９（１９９９）；Ｇａｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．７６：２３４−２４２（２００２）；Ａｒｍｅｎｄａｒｉｚ−Ｂｏｒｕｎｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｕｔ５５：１６６３−１６６５（２００６）；Ａｎｇｕｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．４７：１５７−１６１（２００２）；Ｍｅｓａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１１４：１１１−１１３（２００１）。
カプトプリルは、高血圧症ならびに特定のタイプの心不全及び糖尿病性腎症の治療における経口投与のために、ＦＤＡによって認可されたアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤である。ＡＣＥはアンジオテンシンＩ（ＡｎｇＩ）をアンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）に変換し、血管狭窄を引き起こし、血管拡張を阻害し、レニン‐アンジオテンシン系（ＲＡＳ）に対する効果によって血管内液体積を間接的に調節する。したがって、ＡＣＥの阻害は高血圧症のための主力療法であった。多くの最近の研究により、ＡｎｇＩＩが様々な器官系（腎臓、）肝臓、及び肺が含まれる）における線維化の重要な調節因子でもあることが示された。Ｌａｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ ２９：２６７０−２６７５（２００６）；Ａｌｖｅｓ ｄｅ Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｌ．６５：８４６−８５９（２００４）；Ｏｓｔｅｒｒｅｉｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．５０：９２９−９３８（２００９）；Ｍａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２３：１４３４−１４４３（２０１５）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６：６９７−７１１（２０１５）。ＡｎｇＩＩの線維化促進効果は、多くのメカニズム（活性酸素種の産生、ケモカイン及びサイトカインの産生、接着分子の発現増加、ならびにＴＧＦ−β発現／活性の調節が含まれる）によって媒介される。これとは対照的に、ＡｎｇＩはその細胞表面受容体（Ｍａｓ）の活性化によって抗増殖性及び抗線維化活性を有する。Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２０１２：３０７３１５（２０１１）。結果として、ＡＣＥ及び／又はＡｎｇＩＩの阻害剤（カプトプリル、ロサルタン、及び他の類似する医薬物等）は、肺、腎臓及び肝臓の線維化疾患のために可能な治療法の選択肢として提案された。
リンパ浮腫の治療のために利用可能な薬理療法は現在のところない。リンパ浮腫についての先行研究は、全身性医薬物による治療に注目していた。例えば、経口服用されたクマリンはリンパ浮腫に罹患する患者において使用され、中等度の成功を収めた。Ｃａｓｌｅｙ−Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＪ ３０７：１０３７−１０４１（１９９３）；Ｃａｓｌｅｙ−Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２９：１１５８−１１６３（１９９３）；Ｃａｓｌｅｙ−Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｕｓｔｒａｌａｓ Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．３３：６９−７４（１９９２）；Ｌｏｐｒｉｎｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４０：３４６−３５０（１９９９）。しかしながら、この薬物の広く普及した臨床適用は、有意な毒性（肝不全及び死が含まれる）によって妨げられてきた。Ｌｏｐｒｉｎｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４０：３４６−３５０（１９９９）。線維化を標的とする戦略（特に全身性ＣＤ４+炎症性応答、Ｔｈ２分化、及び／又はＴＧＦ−β経路の阻害）は、リンパ浮腫の治療のための臨床的な将来性がある。極めて効果的であるが、ＣＤ４＋細胞の全身性涸渇は、許容できない死亡率及び全身性合併症（感染、癌再発及び自己免疫疾患等）に起因して、臨床的に実現可能ではない。これとは対照的に、リンパ浮腫に関連する病理学的事象を治療する薬剤の局部送達は、全身性毒性を制限し得る新規アプローチである。リンパ浮腫が主として四肢の皮膚及び皮下軟組織の疾患であるので、局所的アプローチを使用することは可能であり、それはより良好な耐容性を示し、より標的化されたアプローチを提供し、それによって全身性合併症を回避することできる。したがって、リンパ浮腫のための新規治療、特に局所治療について当技術分野における必要性がある。
本発明の主要な態様のいくつかは以下で要約される。追加の態様は、本開示の、発明を実施するための形態、実施例、図面、及び請求項のセクション中で記載される。本開示の各々のセクション中の記載は、他のセクションと併用して読了されることが意図される。さらに、本開示の各々のセクション中で記載される様々な実施形態は、様々な異なる手法で組み合わせることができ、すべてのかかる組み合わせは、本発明の範囲内であることが意図される。
一態様において、本発明は、抗Ｔ細胞剤、抗ＴＧＦ−β１剤、及び／又は抗アンジオテンシン剤の組み合わせを含む、医薬組成物を提供する。例えば、本発明は、（ｉ）有効量の１つ又は複数の抗Ｔ細胞剤と（ｉｉ）有効量の１つ又は複数の抗ＴＧＦ−β１剤及び／又は有効量の１つ又は複数の抗アンジオテンシン剤とを含む、医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、本発明は、（ｉ）有効量の１つ又は複数の抗Ｔ細胞剤と（ｉｉ）有効量の１つ又は複数の抗ＴＧＦ−β１剤とを含む、医薬組成物を提供する。別の実施形態において、本発明は、（ｉ）有効量の１つ又は複数の抗Ｔ細胞剤と（ｉｉ）有効量の１つ又は複数の抗アンジオテンシン剤とを含む、医薬組成物を提供する。なお更なる実施形態において、本発明は、（ｉ）有効量の１つ又は複数の抗Ｔ細胞剤と（ｉｉ）有効量の１つ又は複数の抗ＴＧＦ−β１剤と（ｉｉｉ）有効量の１つ又は複数の抗アンジオテンシン剤とを含む、医薬組成物を提供する。
一実施形態において、抗Ｔ細胞剤は、タクロリムス、テリフルノミド、レフルノミド、シクロスポリン、ピメクロリムス、デニロイキン・ジフチトクス、及びバシリキシマブからなる群から選択される。一実施形態において、抗ＴＧＦ−β１剤又は抗アンジオテンシン剤は、ピルフェニドン、カプトプリル、ゾフェノプリル、エナラプリル、リシノプリル、ラミプリル、キナプリル、ペリンドプリル、ベナゼプリル、イミダプリル、トランドラプリル、シラザプリル、フォシノプリル、ロサルタン、イルベサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、及びフィマサルタンからなる群から選択される。特定の実施形態において、抗アンジオテンシン剤は、ＡＣＥアゴニスト（例えばＡＣＥ−２アゴニスト）である。組成物は、全身投与又は局部投与のために製剤化することができる。好ましい実施形態において、組成物は局所投与のために製剤化される。
本発明の医薬組成物は、抗Ｔ細胞剤、抗ＴＧＦ−β１剤、及び／又は抗アンジオテンシン剤の任意の組み合わせを含むことができる。例えば、一実施形態において、組成物はタクロリムス及びピルフェニドンを含む。別の実施形態において、組成物は、タクロリムス、ピルフェニドン及びテリフルノミドを含む。追加の実施形態において、組成物は、タクロリムス、ピルフェニドン及びレフルノミドを含む。更なる態様において、組成物は、タクロリムス及びカプトプリル；又はテリフルノミド及びカプトプリル；又はレフルノミド及びカプトプリル；又はピルフェニドン及びカプトプリル；又はタクロリムス、カプトプリル、及びテリフルノミド；又はタクロリムス、カプトプリル、及びレフルノミド；又はタクロリムス、カプトプリル、及びピルフェニドンを含む。
医薬組成物が局所投与のために製剤化される実施形態において、組成物は、約０．０１％〜約１％のタクロリムス、好ましくは約０．０５〜約０．２％のタクロリムス；約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのピルフェニドン、好ましくは約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌのピルフェニドン；約１０ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌのテリフルノミド、好ましくは約２０ｍｇ／ｍｌ〜約３０ｍｇ／ｍｌのテリフルノミド；約１％〜約２０％のレフルノミド、好ましくは約５％〜約１５％のレフルノミド；及び／又は約１％〜約２０％のカプトプリルを含むことができる。医薬組成物は、好ましくは、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、ムース、泡、ラッカー、懸濁物、液体、及びスプレーから選択される形態である。好ましい実施形態において、組成物は軟膏の形態である。
本発明の医薬組成物は、浮腫の治療又は予防に使用することができる。
本発明は、浮腫を治療又は予防する方法であって、タクロリムス、テリフルノミド、レフルノミド、シクロスポリン、ピメクロリムス、デニロイキン・ジフチトクス、バシリキシマブ、ピルフェニドン、カプトプリル、ゾフェノプリル、エナラプリル、リシノプリル、ラミプリル、キナプリル、ペリンドプリル、ベナゼプリル、イミダプリル、トランドラプリル、シラザプリル、フォシノプリル、ロサルタン、イルベサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、及びフィマサルタンからなる群から選択される、有効量の１つ又は複数の薬物を含む医薬組成物をそれを必要とする被験体へ投与することを含む、該方法も提供する。
一態様において、浮腫はリンパ浮腫である。
一態様において、本発明の方法は、抗Ｔ細胞剤、抗ＴＧＦ−β１剤、及び／又は抗アンジオテンシン剤の組み合わせを投与することを含み得る。特定の実施形態において、方法は、（ｉ）タクロリムス、テリフルノミド、レフルノミド、シクロスポリン、ピメクロリムス、デニロイキン・ジフチトクス、及びバシリキシマブからなる群から選択される、有効量の１つ又は複数の抗Ｔ細胞剤と；（ｉｉ）ピルフェニドン、カプトプリル、ゾフェノプリル、エナラプリル、リシノプリル、ラミプリル、キナプリル、ペリンドプリル、ベナゼプリル、イミダプリル、トランドラプリル、シラザプリル、フォシノプリル、ロサルタン、イルベサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、及びフィマサルタンからなる群から選択される、有効量の１つ又は複数の抗ＴＧＦ−β１剤及び／又は抗アンジオテンシン剤とを含む、医薬組成物を投与することを含む。方法は、抗Ｔ細胞剤、抗ＴＧＦ−β１剤、及び／又は抗アンジオテンシン剤の任意の組み合わせを投与することを含み得る。例えば、一実施形態において、方法は、タクロリムス及びピルフェニドンを含む医薬組成物を投与することを含む。別の実施形態において、方法は、タクロリムス、ピルフェニドン、及びテリフルノミドを含む医薬組成物を投与することを含む。追加の実施形態において、方法は、タクロリムス、ピルフェニドン、及びレフルノミドを含む医薬組成物を投与することを含む。更なる態様において、方法は、タクロリムス及びカプトプリル；又はテリフルノミド及びカプトプリル；又はレフルノミド及びカプトプリル；又はピルフェニドン及びカプトプリル；又はタクロリムス、カプトプリル、及びテリフルノミド；又はタクロリムス、カプトプリル、及びレフルノミド；又はタクロリムス、カプトプリル、及びピルフェニドンを含む医薬組成物を投与することを含む。
本発明の方法において、医薬組成物は、全身的又は局部的に投与することができる。好ましい方法において、医薬組成物は局所的に投与される。本発明の本態様において、医薬組成物は、約０．０１％〜約１％のタクロリムス、好ましくは約０．０５〜約０．２％のタクロリムス；約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのピルフェニドン、好ましくは約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌのピルフェニドン；約１０ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌのテリフルノミド、好ましくは約２０ｍｇ／ｍｌ〜約３０ｍｇ／ｍｌのテリフルノミド；約１％〜約２０％のレフルノミド、好ましくは約５％〜約１５％のレフルノミド；及び／又は約１％〜約２０％のカプトプリルである。局所投与の方法において、医薬組成物は、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、ムース、泡、ラッカー、懸濁物、液体、及びスプレーから選択される形態であり得る。好ましくは、医薬組成物は軟膏の形態である。
全身投与又は局部投与のための投薬スケジュール及び継続期間を決定することは、当業者の技能内である。一実施形態において、医薬組成物は少なくとも１日１回局所投与される。別の実施形態において、医薬組成物は少なくとも１日２回局所投与される。医薬組成物又は方法が浮腫の予防、特にリンパ浮腫の予防を包含する場合には、組成物は、リンパ管損傷の約６週間以内に、好ましくはリンパ管損傷の約２週間以内に投与することができる。
図１Ａ−Ｅは局所的なタクロリムスが尾リンパ浮腫を減少させることを示す。図１Ａは表在／深部集合リンパ管の外科的切除後、及び外科手術後の２週間（初期治療）又は６週間（後期治療）のいずれかに開始する局所的なタクロリムス有り又は無しの治療後の、マウス尾の代表的な写真を示す。矢印は治療法の開始を示す。図１Ｂはタクロリムスによる初期（*ｐ＝０．０２１）又は後期（*ｐ＝０．０１８）治療後の尾体積変化の対照と比較したグラフ表示である。図１Ｃ（上部パネル）は、リンパアブレーションの６週間後に採取した対照マウス及びタクロリムスで初期治療されたマウス尾の代表的な横断面の組織学的画像を示す。カッコは軟組織の厚みを示す。図１Ｃ（下部パネル）は、タクロリムスによる初期治療又は後期治療後の軟組織変化の定量化を示す（*ｐ＝＜０．００１）。図１Ｄは、全血のタクロリムスレベルの定量化を示し、全身治療された動物（毎日４ｍｇ／ｋｇ腹腔内）において免疫抑制性濃度であり、局所治療された群において非免疫抑制性レベルであることを実証する（*ｐ＝０．００７）。図１Ｅは、ベヒクル対照、局所的なタクロリムス又は全身的なタクロリムスにより治療された動物におけるフローサイトメトリープロット（上部パネル）及び血液のＴ細胞の定量化（下部パネル）を示す。フロープロットは、Ｙ軸上に側方散乱面積（ＳＳＡ）及びＸ軸上にＣＤ３+提示Ｔ細胞を示す。全身治療された動物のみでのＴ細胞の有意な低下に注目されたい（*ｐ＝０．０１２）。 図２Ａ−Ｄは局所的なタクロリムスがリンパ管損傷後の炎症を減少させることを示す。図２Ａ−ＤはＣＤ４５+（図２Ａi及び２Ａii）、ＣＤ３+（図２Ｂi及び２Ｂii）細胞、ＣＤ４+（図２Ｃi及び２Ｃii）細胞、及びＩＦＮ−γ+（図２Ｄi及び２Ｄii）細胞の免疫蛍光の局在化による、外科手術の６週間後の対照動物及びタクロリムス治療動物から採取した尾組織断面の代表的な４０×画像を示す。より高い倍率（８０×）の画像を各々の図の上部右側の角の挿入図中で示す。リンパ管は各々の図中で染色される（ＬＹＶＥ−１）。初期治療及び後期治療についての細胞カウントの定量化を各々の図の右側に示す（すべてについてｐ＜０．００１）。 図３Ａ−Ｄは局所的なタクロリムスがリンパ浮腫における線維化を減少させることを示す。図３Ａi及び３Ａiiは、Ｉ型コラーゲン及びリンパ管の免疫蛍光の局在化による、外科手術の６週間後の対照又はタクロリムスによる初期治療から採取した尾組織の代表的な４０×画像を示す。初期治療及び後期治療におけるＩ型コラーゲン染色面積の定量化を右側に示す（両方についてｐ＜０．００１）。図３Ｂi及び３Ｂiiは、対照動物及び初期のタクロリムス治療動物から採取した尾組織のピクロシリウスレッド染色の代表的な４０×画像を示す（Ｉ型コラーゲン及びＩＩＩ型コラーゲンの沈着）。瘢痕指標（赤色：緑色の比）の定量化を右側に示す（ｐ＝０．０３６初期；ｐ＜０．００１後期）。図３Ｃi/ii及び図３Ｄi/iiは、外科手術の６週間後の対照又はタクロリムスによる初期治療により治療された動物から採取した尾組織のリンパ管による、ＴＧＦ−β１又はｐＳＭＡＤ３の代表的な４０×免疫蛍光の共局在化を示す。陽性細胞の数／０．２５ｍｍ2の面積の定量化を各々の図の右側に示す。 図４Ａ−Ｇはタクロリムスが外科的リンパ管損傷後のリンパ機能を改善することを示す。図４Ａはタクロリムス有り又は無しの初期治療が続いて行われる外科手術の６週間後のマウス尾の代表的なＩＣＧ画像を示す。タクロリムス治療動物における創傷を近位へと横切るＩＣＧの流れに注目されたい。挿入図は、方向性のために同じマウスの写真を示す。図４Ｂi及び図４Ｂiiは、対照動物及び初期タクロリムス治療（外科手術の２週間後に開始）動物における、表在／深部リンパ管の外科的結紮の６週間後の仙骨リンパ節による99mＴｃの崩壊補正した取り込みを示す（*ｐ＝０．００５）。図４Ｂiiの上部パネル中で示されるマウス尾の肉眼的な写真は方向性のためであり、99mＴｃ注入の部位及び仙骨リンパ節の所在位置を示す。代表的なヒートマップを仙骨リンパ節を指す白色矢印と共に下部パネル中で示す。図４ＣはＰＬＮＤの４週間後のタクロリムス有り又は無しで治療されたマウスにおける、脚遠位部への注入５０分後に得られた後肢の代表的なＩＣＧ画像を示す。白色矢印はＩＣＧの皮膚逆流を示す。挿入図の写真は方向性を示す。図４Ｄi及びＤiiは、ＰＬＮＤの４週間後のタクロリムス有り又は無しで治療されたマウスの後肢集合管におけるリンパ管の拍動のグラフ表示である。拍動頻度の定量化を右側に示す（*ｐ＝０．００１）。図４ＥはＰＬＮＤの４週間後の対照又はタクロリムスにより治療された動物の遠位後肢から採取した組織における炎症細胞（ＣＤ４５+；上部パネル）、ｉＮＯＳ+細胞（下部パネル）、及びリンパ管（ＬＹＶＥ−１+）の代表的な４０×蛍光性共局在化画像を示す。ＣＤ４５+細胞及びｉＮＯＳ+細胞のリンパ周囲での蓄積に注目されたい。図４Ｆ及び４ＧはＰＬＮＤの４週間後に採取した対照又はタクロリムス治療動物の遠位後肢組織におけるリンパ周囲のＣＤ４５+細胞（図４Ｆ）及びｉＮＯＳ+細胞（図４Ｇ）の定量化を示す。 図５Ａ−Ｄは局所的なタクロリムスがリンパ管損傷後の側副リンパ管の形成を増加させることを示す。図５Ａiは、リンパ管損傷の６週間後に採取した対照マウス及びタクロリムスにより初期治療されたマウスの、外科的に生成された尾創傷を架橋するＬＹＶＥ−１管の代表的な縦方向の免疫蛍光の４０×画像を示す。挿入図は縦断面図が得られた領域を示す。図５Ａiiは、対照ｖｓタクロリムスにより初期治療又は後期治療されたマウス（両方についてｐ＜０．００１）における尾の創傷を受けた部分中の架橋リンパ管密度（ＬＶＤ）の定量化を示す。図５Ａiiiは、リンパ管損傷の６週間後に採取した対照マウス及びタクロリムスより初期治療されたマウス尾の組織から採取したＲＮＡのｑＰＣＲを示し、ＶＥＧＦ−Ｃ（ｐ＝０．２６４）、ＴＧＦ−β１（ｐ＝０．００６）、及びＩＦＮ−γ（ｐ＝０．０１４）の相対的発現を実証する。図５ＢはＰＬＮＤの前後の鼠径リンパ節に向かって排出させる側副管形成の部位を示すマウス後肢の写真である。図５ＣはＰＬＮＤの４週間後の対照動物及びタクロリムス治療動物における、代表的なＩＣＧ（左側パネル）及びＬＹＶＥ−１+管の４０×免疫蛍光画像（右側パネルはボックス中の領域を示す）を示す。図５Ｄは対照又はタクロリムスにより治療された動物の大腿前外側部領域中の側副リンパ管のＬＶＤの定量化を示す（ｐ＜０．００１）。 図６Ａ−Ｆはタクロリムスが炎症性リンパ管新生を増加させることを示す。（Ａ）縫合糸設置及びベヒクル対照又は全身的なタクロリムスのいずれかによる治療の２週間後に採取した、リンパ管（ＬＹＶＥ−１+／弱いＣＤ３１+）及び血管（ＣＤ３１+／ＬＹＶＥ−１-）について染色されたマウス角膜の代表的な肉眼的（左側パネル）及びホールマウント５×画像（右側パネル）。ボックスは、ホールマウント画像中で示される領域を表す。図６Ｂ及びＣは角膜のリンパ管（ＬＹＶＥ−１+）及び血管（ＣＤ３１+／ＬＹＶＥ−１-）の定量化を示す。図６Ｄは耳創傷の代表的な蛍光ホールマウント５×画像を示し、創傷の４週間後に採取した対照又は局所的なタクロリムス治療動物においてＬＹＶＥ−１+が局在する。挿入図写真は断面図が得られた領域を示す。図６Ｅは耳皮膚におけるＬＹＶＥ−１+染色領域（創傷の４００μｍ内）の定量化を示し、タクロリムス治療動物におけるリンパ管新生における増加を実証する（ｐ＜０．００１）。図６Ｆはタクロリムス有り又は無しで治療された耳創傷における単位面積あたりのリンパ管分岐点の定量化を示し、タクロリムス治療動物における分岐の増加を実証する（ｐ＜０．００１）。 図７は局所的なタクロリムスが循環ＣＤ４+Ｔ細胞を減少させないことを示す。末梢血ＣＤ４+細胞の代表的なフロープロット（上部パネル）は、局所的なタクロリムス、全身的なタクロリムス、又はベヒクル対照による２週間の治療後のものを、ＣＤ４+Ｔ細胞の定量化（下部パネル）と共に示す。 図８は局所的なタクロリムスが外科手術後のリンパ浮腫におけるマクロファージ浸潤を減少させることを示す。Ｆ４／８０+細胞の免疫蛍光局在化による、外科手術の６週間後に採取した対照動物及び局所的タクロリムス初期治療動物からの尾組織断面の代表的な４０×画像を、上部パネル中で示す。初期治療及び後期治療の実験についての定量化を下に示す。 図９Ａ−Ｃは膝窩リンパ節郭清モデルを示す。図９Ａは膝窩脂肪体中の目視可能な膝窩リンパ節（エバンスブルーの対比を充填した）を示す。図９Ｂは膝窩リンパ節がその周囲の脂肪体と共に単離されることを、輸入性及び輸出性の集合管と一緒に示す。図９Ｃは、外科的切除後に、外科手術部位で自由に流出するエバンスブルーの対比を示す。 図１０Ａ−Ｂは、ＰＬＮＤが、模擬手術対照肢と比較して、ＲＯＳ及びＤＡＭＰの増加をもたらすことを示す。図１０ＡはＰＬＮＤの直後（６時間）及び１週間後の後肢における発光（ＲＯＳを指摘する）を示す代表的なマウス画像（左側パネル）を示す。蛍光光子の定量化（右側パネル）は、１週目でＰＬＮＤ領域においてＲＯＳレベルが有意に増加するが模擬手術においてしないことを示す。図１０Ｂは、ＨＳＰ−７０（上部パネル）及びＨＭＧＢ１（下部パネル）について染色した模擬手術マウス及びＰＬＮＤマウスからの後肢皮膚断面の代表的な免疫蛍光画像を示す。 図１１は局所的なタクロリムスがＰＬＮＤ後にリンパ周囲のＣＤ４+細胞の浸潤を減少させることを示す。上部パネルは、対照又はタクロリムスにより治療し、ＰＬＮＤの４週間後に採取した動物におけるＣＤ４+細胞及びリンパ管（ＬＹＶＥ−１+）の免疫蛍光局在化の代表的な画像を示す。定量化を下に示す。 図１２Ａ−Ｂは局所的なタクロリムスがＰＬＮＤ後にリンパ周囲のＦ４／８０+細胞浸潤を減少させることを示す。図１２Ａはリンパ管（ＬＹＶＥ−１）及びマクロファージ（Ｆ４／８０）について染色された、タクロリムス治療及びベヒクル治療のＰＬＮＤ後肢の皮膚組織断面の代表的な免疫蛍光画像を示す。図１２Ｂはリンパ周囲のＦ４／８０+マクロファージの定量化を示す。 図１３は局所的なタクロリムスがリンパ管損傷又は炎症の非存在下において集合リンパ管の拍動又はリンパ管新生を改変しないことを示す。上部パネルは、２週間の対照又は局所的なタクロリムスによる治療後の、模擬手術マウス（すなわち切開又はＰＬＮＤ無しで麻酔）における後肢リンパ管のＮＩＲリンパの画像の代表的な画像である。タクロリムスによる治療後の３日目又は１４日目の集合リンパ管の拍動頻度の定量化を下に示す。 図１４Ａ−Ｂは局所的なタクロリムス治療がリンパ管損傷後に血管透過性を改変しないことを示す。図１４Ａは血管透過性を測定するために尾静脈にエバンスブルーを注入した後の、タクロリムス治療又はベヒクル治療されたＰＬＮＤマウスの後肢の代表的な肉眼的な画像を示す。図１４Ｂはタクロリムス治療及びベヒクル治療されたＰＬＮＤ後肢組織からのホルムアミド抽出したエバンスブルーの吸光度の定量化を示す。 図１５Ａ−ＢはＰＬＮＤ後の局所的なタクロリムスが後肢リンパ集合管のα−ＳＭＡ被覆又は内腔径を改変しないことを示す。図１５Ａは黄色楕円によって示される横断面のレベルを伴う、マウス後肢の外側面の明視野画像；外側面上に２つの大口径管を備えた後肢のリンパ管の解剖を示すマウス後肢のＮＩＲ画像；２つの主要な集合リンパ管が位置する脚の前外側部を示す黄色ボックスを伴う、マウス後肢の５×ＩＦ画像；主要な集合管が位置する（白色矢印により示される）領域の２０×画像を示す（左側から右側へ）。図１５Ｂはポドプラニン及びα−ＳＭＡについて二重免疫蛍光染色後の集合リンパ管の横断面の代表的な１００×画像を示す。図１５Ｃは内腔面積の定量化を示す。図１５Ｄはα−ＳＭＡの厚みの定量化を示す。 図１６は局所的なタクロリムスが傷害／炎症の非存在下においてリンパ管新生を増加させないことを示す。上部パネルは、局所的なタクロリムス又はベヒクル対照の４週間の適用後の、創傷を受けていないマウス耳中のリンパ管の免疫蛍光染色の代表的な５×画像を示す。ＬＹＶＥ−１+染色面積の定量化を下に示す。 図１７Ａ−ＩはＴＧＦ−βの阻害がリンパ機能を改善し、膝窩リンパ節郭清後の炎症細胞のリンパ周囲での蓄積を減少させることを示す。図１７ＡはＰＬＮＤの４週間後の、イソタイプ対照又はＴＧＦ−βモノクローナル抗体（ｍＡｂ）により治療されたマウスの遠位後肢の近赤外画像の代表的な写真（上部パネル）及び集合リンパ管における駆出頻度（下部パネル）を示す。ＴＧＦ−β ｍＡｂ治療マウスにおける後肢集合管の駆出頻度の増加に注目されたい。対照において皮膚逆流（白色矢印）があるが、ＴＧＦ−β ｍＡｂ治療マウスにはないことにも注目されたい。図１７Ｂは対照マウス及びＴＧＦ−β ｍＡＢ治療マウスにおける集合リンパ管駆出（脈拍）頻度の定量化を示す。図１７Ｃは対照マウス及びＴＧＦ−β ｍＡＢ治療マウスにおける皮膚逆流の定量化を示す。図１７ＤはＰＬＮＤの４週間後の対照マウス及びＴＧＦ−β ｍＡｂ治療マウスの遠位後肢組織からの代表的なフローサイトメトリープロットを示す。ＴＧＦ−β ｍＡｂ治療マウスにおけるＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞のパーセンテージの減少に注目されたい。図１７Ｅは対照マウス及びＴＧＦ−β ｍＡｂ治療マウスにおけるリンパ周囲の（ＬＹＶＥ−１＋）炎症細胞（ＣＤ４５＋；上部）及びｉＮＯＳ＋（下部）細胞の代表的な低倍率及び高倍率（挿入図）の顕微鏡写真を示す。図１７Ｆは対照マウス及びＴＧＦ−β ｍＡｂ治療マウスの後肢組織におけるＣＤ４＋細胞についてのフローサイトメトリーの定量化を示す。図１７Ｇは対照マウス及びＴＧＦ−β ｍＡｂ治療マウスにおけるＬＹＶＥ−１＋管の数の定量化を示す。図１７Ｈは対照マウス及びＴＧＦ−β ｍＡｂ治療マウスにおけるリンパ周囲のＣＤ４５＋細胞の数の定量化を示す。図１７Ｉは対照マウス及びＴＧＦ−β ｍＡｂ治療マウスにおけるリンパ周囲のｉＮＯＳ＋細胞の数の定量化を示す。 図１８Ａ−Ｇは外科的リンパ管損傷後の全身的なピルフェニドンが後肢におけるリンパ機能を改善することを示す。図１８Ａは上部パネルは、ＰＬＮＤの４週間後のピルフェニドン有り又は無しで治療されたマウスにおいて、ＩＣＧの脚遠位部注入の５０分後に得られた後肢の代表的なＮＩＲ画像を示す。白色矢印はＩＣＧの皮膚逆流を示す。挿入図写真は方向性のためである。下部パネルは、ＰＬＮＤの４週間後のピルフェニドン有り又は無しで治療されたマウスの後肢集合管におけるリンパ管拍動のグラフ表示を示す。図１８Ｂは右側に拍動頻度（脈拍／分間）の定量化を示す（ｎ＝６匹の動物／群；*ｐ＜０．０５）。図１８Ｃは対照マウス及びピルフェニドン治療マウスにおける皮膚逆流の定量化を示す。図１８ＤはＰＬＮＤの４週間後に採取した対照動物又はピルフェニドン治療動物の遠位後肢組織におけるＬＹＶＥ−１+管／０．２５ｍｍ2面積の定量化を示す（ｎ＝６匹の動物／群；*ＬＹＶＥ−１についてｐ＜０．００１）。図１８ＥはＰＬＮＤの４週間後のピルフェニドン有り又は無しで治療された動物の遠位後肢から採取した組織における、炎症細胞（ＣＤ４５+；上部パネル）、ｉＮＯＳ+細胞（下部パネル）及びリンパ管（ＬＹＶＥ−１+）の代表的な低倍率及び高倍率（挿入図）の蛍光共局在化画像を示す（スケールバー＝１００μｍ）。より高い倍率（８０×）の画像を各々の図の右下角の挿入図で示す（スケールバー＝２０μｍ）。ＣＤ４５+細胞及びｉＮＯＳ+細胞のリンパ周囲での蓄積に注目されたい。図１８Ｆは対照マウス及びピルフェニドン治療マウスにおけるリンパ周囲のＣＤ４５+細胞の定量化を示す。図１８Ｇは対照マウス及びピルフェニドン治療マウスにおけるリンパ周囲のｉＮＯＳ+細胞／ｈｐｆの定量化を示す。 図１９Ａ−Ｉは全身的及び局所的なピルフェニドンがマウス尾のリンパ浮腫及び炎症を減少させることを示す。図１９Ａはピルフェニドン又はベヒクル対照による全身的及び局所的な治療後のマウス尾の代表的な写真を示す。治療は尾リンパ管損傷の７週間後に開始された。ピルフェニドン治療マウスにおける著しい改善に注目されたい。図１９Ｂは対照、局所的なピルフェニドン、及び全身的なピルフェニドンにより治療されたマウスにおけるマウス尾体積の定量化を示す。ピルフェニドン治療マウスにおける有意な低減に注目されたい（矢印は、ピルフェニドン治療がいつ開始されたかを示す）。図１９Ｃは対照マウス及びピルフェニドン治療マウスにおける脂肪線維組織の沈着の定量化を示す。図１９Ｄは対照マウス及びピルフェニドン治療マウスにおけるＩ型コラーゲン沈着の定量化を示す。図１９Ｅは対照又はピルフェニドン（全身的又は局所的）により治療されたマウス尾の代表的な横断面の顕微鏡写真を示す。図１９ＦはＩ型コラーゲン及びリンパ管（ＬＹＶＥ−１）について染色した尾横断面の代表的な高倍率の顕微鏡写真を示す。ピルフェニドン治療されたマウスにおけるＩ型コラーゲン沈着の減少に注目されたい。図１９Ｇは硫黄コロイドをコンジュゲートした99Ｔｃの尾遠位部への注入後の99Ｔｃのピークのリンパ節による取り込みを示す。ピルフェニドン治療マウスの仙骨リンパ節における取り込みの増加に注目されたい。図１９Ｈは尾遠位部への注入後の99Ｔｃのリンパ節取り込み率を示す。ピルフェニドン治療マウスにおけるより急速な取り込みに注目されたい。図１９Ｉは白血球（ＣＤ４５+）及びリンパ管（ＬＹＶＥ−１）について染色された尾横断面の代表的な高倍率の顕微鏡写真を示す。ピルフェニドン治療マウスにおけるリンパ周囲のＣＤ４５+細胞蓄積の減少に注目されたい。 図２０Ａ−Ｋはピルフェニドンがリンパ周囲の炎症及びＴＧＦ−β発現を減少させることを示す。図２０Ａは対照動物及びピルフェニドン治療動物（左側パネルで全身的な治療が示され；右側パネルで局所的な治療が示される）におけるＣＤ４＋細胞のリンパ周囲の蓄積を実証する後肢断面の代表的な顕微鏡写真を示す。高倍率の画像を挿入図中に示す。図２０Ｂは対照動物及びピルフェニドン治療動物（左側パネルで全身的な治療が示され；右側パネルで局所的な治療が示される）におけるＴＧＦ−β１＋細胞のリンパ周囲の蓄積を実証する後肢断面の代表的な顕微鏡写真を示す。図２０Ｃは対照動物及びピルフェニドン治療動物（左側パネルで全身的な治療が示され；右側パネルで局所的な治療が示される）におけるＳＭＡＤ３＋細胞のリンパ周囲の蓄積を実証する後肢断面の代表的な顕微鏡写真を示す。図２０Ｄは対照マウス及びピルフェニドン治療マウスにおけるリンパ周囲のＣＤ４＋細胞の定量化を示す。図２０Ｅは対照マウス及びピルフェニドン治療マウスにおけるリンパ周囲のＴＧＦ−β１＋細胞の定量化を示す。図２０Ｆは対照マウス及びピルフェニドン治療マウスにおけるリンパ周囲のＳＭＡＤ３＋細胞の定量化を示す。図２０Ｇはポドプラニン、α−ＳＭＡ及びＩ型コラーゲンについて染色された対照マウス及びピルフェニドン治療マウスからの後肢集合管の高倍率の顕微鏡写真を示す。対照マウスにおけるα−ＳＭＡ＋細胞の肥厚及び増殖に注目されたい。図２０Ｈは対照マウス及びピルフェニドン治療マウスの集合リンパ管の周囲のＩ型コラーゲン沈着の定量化を示す。図２０Ｉは対照マウス及び全身的ピルフェニドン治療マウスにおける血清のＴＧＦ−β１発現を示す。図２０Ｊは対照マウス及び全身的ピルフェニドン治療マウスにおける血清のＩＦＮ−γ発現を示す。図２０Ｋは対照マウス及び全身的ピルフェニドン治療マウスにおける血清のＶＥＧＦ−Ｃ発現を示す。 図２１Ａ−ＦはＴ細胞のＴＧＦ−β発現の消失がリンパ管損傷後のリンパ浮腫の発症を予防するが、骨髄系細胞ではないことを示す。図２１Ａは尾のリンパ管損傷の６週間後に、対照動物、Ｔ細胞cre動物、及び骨髄系cre動物から採取した尾組織におけるＴＧＦ−β１ ｍＲＮＡの相対的発現を示す。図２１Ｂは対照マウス、骨髄系−ＴＧＦ−β１cre、及びＴ細胞−ＴＧＦ−β１creマウスの代表的な顕微鏡写真を示す。Ｔ細胞creマウスにおける膨潤の欠損に注目されたい。図２１Ｃは様々な群におけるマウス尾の体積の定量化を示す。野生型対照と比較して、Ｔ細胞creマウス尾の体積の減少に注目されたい。図２１Ｄは様々な群における、ヘマトキシリン・エオシン（上部）、Ｉ型コラーゲン／ＬＹＶＥ−１（中央）について染色された尾横断面の代表的な顕微鏡写真、ならびに脂肪線維組織の沈着及びＩ型コラーゲン発現の定量化（下部）を示す。Ｔ細胞creマウスにおける脂肪線維組織の沈着に注目されたい。図２１Ｅは尾遠位部に注入された99Ｔｃのピークのリンパ節による取り込みを示す。Ｔ細胞creマウスの取り込みの増加に注目されたい。図２１Ｆは様々な群における99Ｔｃの仙骨リンパ節による取り込み率を示す。Ｔ細胞creマウスにおけるより急速な取り込みに注目されたい。 図２２Ａ−ＧはＴＧＦ−β１を発現するＴ細胞を欠損するマウスがリンパ周囲の炎症及びＴＧＦ−β１発現を減少させることを示す。図２２ＡはＣＤ４＋細胞（上部）、ＩＬ１３＋細胞（中央）、ｐＳＭＡＤ３＋細胞（下部）、及びリンパ管（ＬＹＶＥ−１＋）について染色された様々な群からのマウス後肢の代表的な顕微鏡写真を示す。Ｔ細胞creマウスにおけるＣＤ４＋細胞蓄積の減少、ＩＬ１３＋細胞の数の減少、及びｐＳＭＡＤ３＋細胞の数の減少に注目されたい。図２２Ｂは様々な群における動物の後肢組織のＣＤ４+細胞の定量化を示す。図２２Ｃは様々な群における動物の後肢組織のＴｈ２細胞（ＣＤ４＋／ＩＬ１３＋）の定量化を示す。図２２Ｄは様々な群における動物の後肢組織のｐＳＭＡＤ３+細胞の定量化を示す。図２２Ｅ−Ｇは対照マウス、骨髄系Creマウス、及びＴ細胞creマウスからのＩＦＮ−γ（図２２Ｅ）、ＴＧＦ−β１（図２２Ｆ）、及びＶＥＧＦ−Ｃ（図２２Ｇ）のタンパク質濃度の血清レベルを示す。 図２３Ａ−ＨはＬＥＣのＴＧＦ−β１への応答性の低下は、尾のリンパ浮腫、炎症、又は線維化を変化させないが、リンパ管新生を改善したことを示す。図２３ＡはｐＳＭＡＤ+及びＬＹＶＥ−１の免疫蛍光の共局在化による対照マウス及びＦＬＴ４creのマウスから採取したリンパ節断面の代表的な高倍率（８０×）の画像を示す（スケールバー＝１０μｍ）。矢印はＬＹＶＥ−１+管におけるｐＳＭＡＤ３の共局在化を示す。図２３Ｂは外科手術の６週間後の対照マウス及びＦＬＴ４creマウスにおける尾のＴＧＦ−β１のタンパク質濃度の定量化を示す（ｎ＝５匹の動物／群；両方についてｐ＝有意差なし）。図２３Ｃは外科手術の６週間後の、表在／深部集合リンパ管の外科的切除後の対照マウス及びＦＬＴ４creマウス尾の代表的な写真を示す。図２３ＤはＦＬＴ４creマウス尾の、対照と比較した、尾体積の変化のグラフ表示を示す（ｎ＝５匹の動物／群；ｐ＝有意差なし）。図２３Ｅは対照マウス及びＦＬＴ４creマウスの軟組織変化の定量化を示す（ｎ＝５匹の動物／群；ｐ＝有意差なし）。図２３ＦはＩ型コラーゲン染色の面積の定量化を示す（ｎ＝５匹の動物／群；ｐ＝有意差なし）。図２３Ｇ（上部パネル）は、リンパアブレーションの６週間後に採取した対照マウス及びＦＬＴ４creマウス尾の代表的な横断面の組織学的画像を示す。カッコは軟組織厚みを図示する（スケールバー＝５００μｍ）。図２３Ｇ（中央のパネル）は、Ｉ型コラーゲン及びリンパ管の免疫蛍光の局在化による、外科手術の６週間後の対照及びＦＬＴ４creの動物から採取した尾組織の代表的な４０×画像を示す。図２３Ｇ（下部パネル）は、ｐＳＭＡＤ３及びリンパ管の局在化を示す。スケールバー＝１００μｍ。図２３ＨはＬＹＶＥ−１の免疫蛍光の局在化による、外科手術の６週間後の対照マウス及びＦＬＴ４creマウス尾の創傷から採取された尾組織の縦断面の代表的なより高い倍率（６０×）の画像を示す（スケールバー＝５０μｍ）。対照マウス及びＦＬＴ４creマウスについて架橋ＬＹＶＥ−１+管密度（ＬＶＤ）（ｎ／０．２５ｍｍ2面積）の定量化（ｎ＝５匹の動物／群；*ｐ＜０．０１）。 図２４Ａ−Ｄはテリフルノミドがリンパ浮腫を減少させることを示す。図２４Ａはリンパアブレーションの６週間後の、ベヒクル（対照）又は局所的なテリフルノミドにより治療されたマウス尾の肉眼的な顕微鏡写真を示す。図２４Ｂはベヒクル又は局所的なテリフルノミドにより治療された動物における、リンパアブレーションの６週間後の尾体積の変化を示す（*ｐ＜０．０００２）。図２４Ｃは対照マウス及びテリフルノミドに治療されたマウスのリンパ管損傷ゾーンから１ｃｍ遠位で採取したマウス尾の組織学的横断面を示す。カッコは脂肪線維組織の沈着の領域を示す。図２４Ｄはベヒクル対照又は局所的なテリフルノミドにより治療されたマウス尾の横断面における脂肪線維組織の沈着の定量化を示す（*ｐ＜０．０００１）。 図２５Ａ−Ｄはテリフルノミドが線維化を減少させることを示す。図２５Ａは対照マウス及びテリフルノミド治療マウスからのマウス尾の横断面の代表的な顕微鏡写真を示し、Ｉ型コラーゲン線維及び真皮リンパ管が局在する。テリフルノミド治療動物における線維化の著しい減少に注目されたい。図２５Ｂはベヒクル対照又は局所的なテリフルノミドにより治療されたマウス尾におけるＩ型コラーゲン沈着の定量化を示す（*ｐ＜０．００１）。図２５Ｃは対照又はテリフルノミドにより治療された動物における主要な後肢集合管の代表的な顕微鏡写真を示し、α−ＳＭＡ及びポドプラニンが局在する。テリフルノミド治療マウスにおけるα−ＳＭＡ陽性細胞の増殖の減少及び集合リンパ管のより広い管腔に注目されたい。図２５ＤはＰＬＮＤ後の対照マウス及びテリフルノミド治療マウスにおけるリンパ周囲の平滑筋の厚みの定量化を示す（*ｐ＜０．０５）。 図２６Ａ−Ｂはテリフルノミドが炎症を減少させることを示す。図２６Ａは対照マウス及びテリフルノミド治療マウスからのマウス尾の横断面の代表的な顕微鏡写真を示し、ＣＤ４＋細胞及び真皮リンパ管が局在する。テリフルノミド治療動物においてＣＤ４＋細胞浸潤の著しい減少がある。ボックス挿入図は高倍率視野（８０×）を示す。図２６Ｂはベヒクル対照又は局所的なテリフルノミドにより治療されたマウス尾におけるＣＤ４＋細胞の定量化を示す（*ｐ＜０．０００１）。 図２７Ａ−Ｄはテリフルノミドがリンパ管新生を増加させることを示す。図２７Ａはベヒクル対照又はテリフルノミドにより治療された動物におけるマウス後肢リンパ管及び側副管形成（白丸）の近赤外線画像化の代表的な顕微鏡写真を示す。新しく形成された側副リンパ管は、テリフルノミド治療マウスにおける膝窩リンパ節をバイパスする。図２７ＢはＰＬＮＤ後にベヒクル対照又はテリフルノミドにより治療された動物における側副リンパ管形成の定量化を示す（*ｐ＜０．００１）。図２７Ｃはベヒクル対照又は局所的なテリフルノミドにより治療されたマウスにおける尾創傷の代表的な顕微鏡写真を示し、新しく形成された交差するリンパ管が局在する。テリフルノミド治療マウスにおいてリンパ管新生の著しい増加がある。図２７Ｄはリンパアブレーションの６週間後の対照動物及びテリフルノミド治療動物のマウス尾の創傷における側副リンパ管の定量化を示す（*ｐ＜０．００１）。 図２８は局所的なテリフルノミドがリンパの漏出性を減少させることを示す。ＰＬＮＤ後のベヒクル対照又はテリフルノミドにより治療されたマウスの後肢におけるリンパ管の代表的な近赤外画像。テリフルノミド治療マウスにおけるリンパ管の漏出性の減少（矢印）に注目されたい。 図２９Ａ−Ｂは局所的なテリフルノミドがリンパ機能を増加させることを示す。図２９ＡはＰＬＮＤ後のベヒクル対照又はテリフルノミドにより治療されたマウスの鼠径リンパ節における、トラフィッキングされた樹状細胞（ＤＣ）の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。マウスの後肢遠位部でＦＩＴＣの局所製剤により処理して組織内在性ＤＣをタグ付けし、２４時間後に鼠径リンパ節を採取し、フローサイトメトリーを使用して分析して周辺部からトラフィッキングされたＤＣの数を定量化した。ＤＣのトラフィッキングの著しい増加は、テリフルノミド治療動物におけるリンパ機能の改善を示す。図２９Ｂは対照動物及びテリフルノミド治療動物におけるＤＣのトラフィッキングの定量化を示す（ｎ＝６；*ｐ＜０．０００１）。 図３０Ａ−Ｂは局所的なテリフルノミドがリンパ管の駆出を増加させることを示す。図３０ＡはＰＬＮＤ後の対照マウス及びテリフルノミド治療マウスにおける後肢の集合リンパ管の駆出のプロットを示す。図３０ＢはＰＬＮＤ後の対照マウス及びテリフルノミド治療マウスにおける後肢の集合リンパ管の駆出頻度の定量化を示す。テリフルノミド治療動物における駆出の有意な増加に注目されたい（*ｐ＜０．００２）。 図３１Ａ−Ｂはカプトプリル治療がリンパ管損傷後の樹状細胞のトラフィッキングを増加させることを示す。図３１Ａは鼠径リンパ節からの代表的なフローサイトメトリーを示し、ＰＬＮＤ後の対照マウス及びカプトプリル治療マウスにおけるＦＩＴＣ＋ＣＤ１１ｃ細胞を実証する。図３１ＢはＰＬＮＤ後の対照マウス及びカプトプリル治療マウスの鼠径リンパ節における、ＦＩＴＣ＋ＣＤ１１ｃ細胞のパーセンテージ（左側）及び絶対数（右側）を示す。 図３２Ａ−Ｂはカプトプリル治療が後肢の集合リンパ管の駆出を増加させることを示す。図３２ＡはＰＬＮＤ後の対照マウス及びカプトプリル治療マウスにおいてＩＣＧリンパ管造影法によって査定される、集合リンパ管の駆出の代表的なプロットを示す。図３２Ｂは後肢集合リンパ管のパケット頻度（駆出）の定量化を示す。 図３３Ａ−Ｃはカプトプリル治療がＰＬＮＤ後のＴ細胞浸潤を減少させることを示す。ＣＤ３＋（Ｔ細胞マーカー）及びＬＹＶＥ−１（リンパのマーカー）について染色された対照マウス（図３３Ａ）及びカプトプリル治療マウス（図３３Ｂ）の後肢断面の代表的な高倍率顕微鏡写真を示す。核対比染色をＤＡＰＩにより示す。図３３Ｃは対照マウス及びカプトプリル治療マウスの後肢組織におけるＣＤ３＋細胞の定量化を示す。 図３４Ａ−Ｃはカプトプリル治療がＰＬＮＤ後のマクロファージ浸潤を減少させることを示す。Ｆ４／８０＋（マクロファージマーカー）及びＬＹＶＥ−１（リンパのマーカー）について染色された対照マウス（図３４Ａ）及びカプトプリル治療マウス（図３４Ｂ）の後肢断面の代表的な高倍率顕微鏡写真を示す。核対比染色をＤＡＰＩにより示す。図３４Ｃは対照マウス及びカプトプリル治療マウスの後肢組織におけるｆ４／８０＋細胞の定量化を示す。 図３５Ａ−Ｄはカプトプリル治療がＰＬＮＤ後のリンパ管新生を増加させることを示す。ＬＹＶＥ−１（リンパ管マーカー）について染色された対照マウス（図３５Ａ）及びカプトプリル治療マウス（図３５Ｂ）の後肢断面の代表的な高倍率顕微鏡写真を示す。核対比染色をＤＡＰＩにより示す。図３５Ｃは対照マウス及びカプトプリル治療マウスにおけるＬＹＶＥ−１＋管の定量化を示す（*ｐ＜０．０５）。 図３６はカプトプリル治療がＤＴによる後肢リンパアブレーション後の脚部膨潤を減少させることを示す。ＤＴリンパアブレーション後の様々な時間での、対照マウス群（上部）及びカプトプリル治療マウス群（下部）におけるマウス脚部の代表的な写真。カプトプリル治療マウスの脚部膨潤における明らかな減少に注目されたい。 図３７Ａ−Ｃはカプトプリル治療がＤＴによる後肢リンパアブレーション後のＴ細胞浸潤を減少させることを示す。ＣＤ３＋（Ｔ細胞マーカー）及びＬＹＶＥ−１（リンパ管マーカー）について染色された対照マウス（図３７Ａ）及びカプトプリル治療マウス（図３７Ｂ）の後肢断面の代表的な高倍率顕微鏡写真。同側組織はＤＴにより処理された肢から採取されるが、対側組織は反対の無治療の肢からである。核対比染色をＤＡＰＩにより示す。図３７Ｃは対照マウス及びカプトプリル治療マウスの後肢組織におけるＣＤ３＋細胞の定量化を示す。同側対照と同側カプトプリルの四肢との間の有意差（*ｐ＜０．０５）に注目されたい。 図３８Ａ−Ｃはカプトプリル治療がＤＴによるリンパアブレーション後の後肢のマクロファージ浸潤を減少させることを示す。Ｆ４／８０＋（マクロファージマーカー）及びＬＹＶＥ−１（リンパのマーカー）について染色された対照マウス（図３８Ａ）及びカプトプリル治療マウス（図３８Ｂ）の後肢断面の代表的な高倍率顕微鏡写真が示される。核対比染色をＤＡＰＩにより示す。図３８Ｃは対照マウス及びカプトプリル治療マウスの後肢組織におけるＦ４／８０＋細胞の定量化を示す。同側対照と同側カプトプリルの四肢との間の有意差（*ｐ＜０．００５）に注目されたい。 図３９Ａ−Ｃはカプトプリル治療がＤＴによるリンパアブレーション後の後肢の集合管平滑筋沈着を減少させることを示す。アルファ平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）（平滑筋マーカー）及びポドプラニン（リンパ管マーカー）について染色された対照マウス（図３９Ａ）及びカプトプリル治療マウス（図３９Ｂ）の後肢断面の代表的な高倍率顕微鏡写真。核対比染色をＤＡＰＩにより示す。図３９Ｃは対照マウス及びカプトプリル治療マウスの後肢組織におけるα−ＳＭＡ＋細胞の定量化を示す。同側対照と同側カプトプリルの四肢との間の有意差（*ｐ＜０．０５）に注目されたい。 図４０Ａ−Ｃはカプトプリル治療がＤＴによるリンパアブレーション後の後肢のＩ型コラーゲン沈着を減少させることを示す。Ｉ型コラーゲン（線維化マーカー）及びＬＹＶＥ−１（リンパのマーカー）について染色された対照マウス（図４０Ａ）及びカプトプリル治療マウス（図４０Ｂ）の後肢断面の代表的な高倍率顕微鏡写真が示される。核対比染色をＤＡＰＩにより示す。図４０Ｃは対照マウス及びカプトプリル治療マウスの後肢組織におけるＩ型コラーゲンの定量化を示す。同側対照と同側カプトプリルの四肢との間の有意差（*ｐ＜０．０００１）に注目されたい。 図４１Ａ−Ｃはカプトプリル治療がＤＴによるリンパアブレーション後の後肢のアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）発現を減少させることを示す。ＡＣＥ及びＬＹＶＥ−１（リンパ管マーカー）について染色された対照マウス（図４１Ａ）及びカプトプリル治療マウス（図４１Ｂ）の後肢断面の代表的な高倍率顕微鏡写真。核対比染色をＤＡＰＩにより示す。図４１Ｃは対照マウス及びカプトプリル治療マウスの後肢組織におけるＡＣＥの定量化を示す。同側対照と同側カプトプリルの四肢との間の有意差（*ｐ＜０．０００１）に注目されたい。 図４２はカプトプリル治療がＤＴによる後肢リンパアブレーション後の側副リンパ管の形成を増加させることを示す。対照（左側パネル）、カプトプリル（中央）、及び正常なリンパの構成（すなわちＤＴ処理はない）の後肢の代表的なＩＣＧ写真を示す。点線の円は、鼠径リンパ節の中へ排出するように側副リンパ管が形成される領域を提示する。 図４３Ａ−Ｄはカプトプリル治療がＤＴによるリンパアブレーション後の後肢のリンパ管新生を減少させることを示す。ＬＹＶＥ−１（リンパ管マーカー）について染色された対照マウス（図４３Ａ）及びカプトプリル治療マウス（図４３Ｂ）の後肢断面の代表的な高倍率顕微鏡写真。核対比染色をＤＡＰＩにより示す。図４３Ｃは対照マウス及びカプトプリル治療マウスの後肢組織におけるＬＹＶＥ−１＋リンパ管の定量化を示す。同側対照と同側カプトプリルの四肢との間の有意差（*ｐ＜０．０００１）に注目されたい。図４３Ｄは対照マウス及びカプトプリル治療マウスの後肢組織におけるＬＹＶＥ−１＋リンパ管面積の定量化を示す。同側対照と同側カプトプリルの四肢との間の有意な減少（*ｐ＜０．００５）に注目されたい。 図４４はカプトプリル治療がＤＴによる後肢リンパアブレーション後の四肢体積を減少させることを示す。ＤＴによるリンパアブレーション後の対照マウス及びカプトプリル治療マウスにおける後肢体積の定量化。カプトプリル治療マウスにおける著しい減少に注目されたい（*ｐ＜０．００７）。 図４５Ａ−Ｂはカプトプリル治療がリンパアブレーションの６週間後のマウス尾のリンパ浮腫を減少させることを示す。図４５Ａはマウス尾の手術前ならびにリンパアブレーション及びベヒクル対照又はカプトプリルによる治療後の毎週の代表的な写真を示す。矢印は治療開始のタイミングを示す。図４５Ｂは対照マウス及びカプトプリル治療マウスにおけるマウス尾の体積の変化の定量化を示す。 図４６Ａ−Ｂはカプトプリル治療がリンパアブレーションの６週間後のリンパ浮腫のマウス尾モデルにおける脂肪線維組織の沈着を減少させることを示す。図４６Ａはリンパアブレーション及び対照（左側）又はカプトプリルにより局所的に治療された６週間後の代表的なヘマトキシリン・エオシン染色したマウス尾横断面を示す。カッコは脂肪線維組織の沈着を提示する。図４６Ｂは尾のリンパアブレーションの６週間後の対照マウス又はカプトプリルにより局所的に治療されたマウスにおける皮下脂肪線維の沈着の定量化を示す。カプトプリル治療マウスにおける有意な減少に注目されたい（*ｐ＜０．０００１）。 図４７Ａ−Ｃはリンパアブレーションの６週間後のカプトプリル治療がマウス尾の集合管の駆出頻度を増加させることを示す。６週間の間対照（図４７Ａ）又はカプトプリル軟膏（図４７Ｂ）により局所的に治療されたマウス尾のインドシアニングリーン解析（上部）の代表的な写真を示す。集合リンパ管の収縮を提示する線グラフを写真の下に示す。カプトプリル治療動物における収縮数の増加に注目されたい。図４７Ｃは対照動物及びカプトプリル治療動物におけるマウス尾の集合リンパ管の収縮頻度の定量化を示す。カプトプリル治療マウスにおける頻度の増加に注目されたい（*ｐ＜０．０１）。 図４８Ａ−Ｃはカプトプリル治療がリンパアブレーションの６週間後のリンパ浮腫のマウス尾のモデルにおける尾創傷の領域に交差するリンパ管の数を増加させることを示す。ＬＹＶＥ−１（リンパ管マーカー）について染色された、対照動物（図４８Ａ）及びカプトプリル治療動物（図４８Ｂ）におけるマウス尾の代表的な縦断面を示す。図４８Ｃは尾のリンパアブレーションの６週間後の対照マウス及びカプトプリル治療マウスにおけるＬＹＶＥ−１＋管の密度の定量化を示す。 図４９Ａ−Ｃはリンパアブレーションの６週間後のリンパ浮腫のマウス尾のモデルにおいて、カプトプリル治療がリンパ管の面積を減少させ、リンパ管の鬱滞の減少と相関することを示す。ＬＹＶＥ−１（リンパ管マーカー）について染色された対照動物（図４９Ａ）及びカプトプリル治療動物（図４９Ｂ）におけるマウス尾の代表的な横断面を示す。カプトプリル治療マウスにおけるリンパ管の直径の減少に注目されたい。図４９Ｃは対照マウス及びカプトプリルマウスにおけるＬＹＶＥ−１＋管面積の定量化を示す。リンパ管の鬱滞の減少に対応するリンパ管面積の有意な減少に注目されたい。 図５０Ａ−Ｃはリンパアブレーションの６週間後に、カプトプリル治療がリンパ浮腫のマウス尾のモデルにおける真皮線維化及びＩ型コラーゲン沈着を減少させることを示す。Ｉ型コラーゲン、ＬＹＶＥ−１及びＤＡＰＩについて染色された、対照動物（図５０Ａ）及びカプトプリル治療動物（図５０Ｂ）におけるマウス尾の代表的な横断面を示す。カプトプリル治療動物における線維化の減少に注目されたい。図５０Ｃは対照マウス及びカプトプリル治療マウスにおけるマウス尾の真皮のＩ型コラーゲン染色面積の定量化を示す。カプトプリル治療動物における有意な減少に注目されたい（*ｐ＜０．０００１）。 図５１Ａ−Ｃはリンパアブレーションの６週間後に、カプトプリル治療がリンパ浮腫のマウス尾のモデルにおけるアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の発現を減少させることを示す。ＡＣＥ、ＬＹＶＥ−１及びＤＡＰＩについて染色された、対照動物（図５１Ａ）及びカプトプリル治療動物（図５１Ｂ）におけるマウス尾の代表的な横断面を示す。カプトプリル治療動物におけるＡＣＥの発現の減少に注目されたい。図５１Ｃは対照マウス及びカプトプリル治療マウスにおけるマウス尾のＡＣＥ染色面積の定量化を示す。カプトプリル治療動物における有意な減少に注目されたい（*ｐ＜０．０００１）。 図５２Ａ−Ｃはリンパアブレーションの６週間後に、カプトプリル治療がリンパ浮腫のマウス尾のモデルにおけるＴ細胞（ＣＤ３＋）のリンパ周囲の蓄積を減少させることを示す。ＣＤ３、ＬＹＶＥ−１、及びＤＡＰＩについて染色された、対照動物（図５２Ａ）及びカプトプリル治療動物（図５２Ｂ）におけるマウス尾の代表的な横断面を示す。カプトプリル治療動物におけるＡＣＥの発現の減少に注目されたい。図５２Ｃは対照マウス及びカプトプリル治療マウスにおけるマウス尾のリンパ周囲のＣＤ３＋細胞／管の定量化を示す。カプトプリル治療動物における有意な減少に注目されたい（*ｐ＜０．０００１）。 図５３Ａ−Ｃはリンパアブレーションの６週間後に、カプトプリル治療がリンパ浮腫のマウス尾のモデルにおけるマクロファージ（Ｆ４／８０＋細胞）のリンパ周囲の蓄積を減少させることを示す。Ｆ４／８０、ＬＹＶＥ−１、及びＤＡＰＩについて染色された、対照動物（図５３Ａ）及びカプトプリル治療動物（図５３Ｂ）におけるマウス尾の代表的な横断面を示す。カプトプリル治療動物におけるＡＣＥの発現の減少に注目されたい。図５３Ｃは対照マウス及びカプトプリル治療マウスにおけるマウス尾のリンパ周囲のＦ４／８０細胞／管の定量化を示す。カプトプリル治療動物における有意な減少に注目されたい（*ｐ＜０．０００１）。
本発明は、浮腫、特にリンパ浮腫のための新規の安全で効果的な治療としての抗Ｔ細胞剤及び／又は抗ＴＧＦ−β１剤及び／又は抗アンジオテンシン剤の使用に部分的に関する。本発明は、抗Ｔ細胞、抗ＴＧＦ−β１、及び／又は抗アンジオテンシン剤（例えばタクロリムス、ピルフェニドン、テリフルノミド、レフルノミド、及び／又はカプトプリル）の全身投与又は局部投与は、リンパ浮腫及びリンパ機能を劇的に改善し、哺乳類被験体に投与された場合に様々な他の有益な生物学的効果（リンパ管新生の刺激が含まれる）を有するという、意外な解明に部分的に基づく。さらに、これらの薬剤が線維化経路の異なるステップで作用するので、抗Ｔ細胞剤、抗ＴＧＦ−β１剤、及び／又は抗アンジオテンシン剤の組み合わせは、単一の薬剤の投与よりも効果的であり得る（相乗効果の可能性を示す）。
したがって、本発明は、浮腫（リンパ浮腫等）を治療又は予防するための、及び／又は様々な他の有益な生物学的効果を産生するための組成物及び方法を提供し、それらには、組織膨潤の低減、リンパ液の鬱滞又は「貯留」の低減、組織線維化の低減、組織炎症の低減、白血球浸潤の低減、マクロファージ浸潤の低減、ナイーブＴ細胞及び分化したＴ細胞の浸潤の低減、ＴＧＦ−β１発現の低減ならびに下流のメディエーター（例えばｐＳｍａｄ３）の発現及び／もしくは活性化の低減、アンジオテンシン及び／もしくはＡＣＥのレベルの低減、コラーゲン沈着及び／もしくは瘢痕形成の低減、リンパ機能の改善もしくは増加、リンパ液輸送の改善もしくは増加、リンパ管新生の改善もしくは増加、ならびに／又はリンパ拍動頻度の改善もしくは増加が含まれるが、これらに限定されない。
特別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が関連する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（５ｔｈ ｅｄ．Ｊ．Ｍ．Ｌａｃｋｉｅ ｅｄ．，２０１３）、ｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｄ ｅｄ．Ｒ．Ｃａｍｍａｃｋ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，２００８）及びＴｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｄ ｅｄ．Ｐ−Ｓ．Ｊｕｏ，２００２）は、本明細書において使用されるいくつかの用語の一般的な定義による技能のうちの１つを提供することができる。
本明細書及び添付の請求項において使用される時、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈が明らかに指示しない限り、複数の指示物が含まれる。「ａ」（又は「ａｎ」）という用語は、「１つ又は複数の」及び「少なくとも１つの」という用語と同様に、互換的に使用することができる。
さらに、「及び／又は」は、他のものが有り又は無しの２つの指定された特色又は構成要素の各々の具体的な開示と見なされる。したがって、「及び／又は」という用語は、「Ａ及び／又はＢ」等の語句中で使用される時、Ａ及びＢ、Ａ又はＢ、Ａ（単独）、ならびにＢ（単独）が含まれることを意図する。同様に、「及び／又は」という用語は、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」等の語句中で使用される時、Ａ、Ｂ及びＣ；Ａ、Ｂ又はＣ；Ａ又はＢ；Ａ又はＣ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＢ；Ａ及びＣ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）が含まれることを意図する。
単位、接頭語、及び記号は、Ｓｙｓｔｅｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｕｎｉｔｅｓ（ＳＩ）で容認された形態で表わされる。数値範囲は、範囲を定義する数について包括的である。数値の用語に「約」が先行する場合、この用語には、明示された数、及び明示された数の±１０％の値が含まれる。本明細書において提供される見出しは、本発明の様々な態様又は実施形態の限定ではなく、全体として明細書を参照できるということである。したがって、直後で定義される用語は、明細書を全体で参照することによってより完全に定義される。
実施形態が文言「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」により記載される場合ならいつでも、他の場合には「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び／又は「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」に関して記載される類似した実施形態が含まれる。
「浮腫」という用語には、本明細書において使用される時、リンパ浮腫、リンパ機能不全、リンパ組織線維化、特発性浮腫、末梢性浮腫、及び眼球浮腫が含まれる。本明細書において使用される時、「浮腫」には肺浮腫又は脳水腫が含まれない。浮腫には、急性浮腫、慢性的浮腫、術後浮腫、及び緩徐発症浮腫が含まれ得る。浮腫の症状には、組織の膨潤、肥大もしくは腫脹、炎症、線維化、重感、疼痛、可動域の減少、痛み、再発性感染、皮膚肥厚、又は不快症状が含まれ得る。
「活性薬剤」は、それ自体が生物学的活性を有するか、又は生物学的活性を有する薬剤へ身体中で変換される前駆体もしくはプロドラッグである、薬剤である。浮腫の治療又は予防のための活性薬剤には、免疫抑制剤、抗線維化剤、抗Ｔ細胞剤、抗ＴＧＦ−β１剤、及び抗アンジオテンシン剤が含まれ得る。いくつかの実施形態において、薬剤は小分子化合物である。他の実施形態において、薬剤はポリヌクレオチド（例えば阻害性ＲＮＡ）又はポリペプチド（例えば抗体）等のマクロ分子である。
「抗Ｔ細胞剤」は、Ｔ細胞媒介性炎症、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞分化、及び／又はＴ細胞増殖を減少させる分子である。抗Ｔ細胞剤のクラスにはカルシニューリン阻害剤及びＩＬ−２阻害剤が含まれる。小分子の抗Ｔ細胞剤の例には、タクロリムス、テリフルノミド、レフルノミド、シクロスポリン、及びピメクロリムスが含まれる。マクロ分子の抗Ｔ細胞剤の例には、デニロイキン・ジフチトクス及びバシリキシマブが含まれる。
「抗ＴＧＦ−β１剤」は、トランスフォーミング増殖因子ベータ１の発現、分泌、活性化、シグナリング、又は活性を阻害する分子である。ピルフェニドンは、小分子の抗ＴＧＦ−β１剤の１つの例である。
「抗アンジオテンシン剤」は、ＡｎｇＩ又はＡｎｇＩＩの活性を阻害する分子、又はＡｎｇＩをＡｎｇＩＩへの変換を阻害する分子（例えばＡＣＥ阻害薬又はＡＣＥアゴニスト）である。抗アンジオテンシン剤の例には、カプトプリル、ゾフェノプリル、エナラプリル、リシノプリル、ラミプリル、キナプリル、ペリンドプリル、ベナゼプリル、イミダプリル、トランドラプリル、シラザプリル、フォシノプリル、ロサルタン、イルベサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、フィマサルタン、ジミナゼン・アセチュレート、キサンテノン、及びＡＶＥ ０９９が含まれる。
「阻害する」、「ブロックする」、及び「抑制する」という用語は互換的に使用され、生物学的活性の任意の統計的に有意な減少（活性の完全なブロッキングが含まれる）を指す。
一態様において、本発明の方法は、抗Ｔ細胞剤、抗ＴＧＦ−β１剤、及び／又は抗アンジオテンシン剤の組み合わせを投与することを含み得る。特定の実施形態において、方法は、（ｉ）タクロリムス、テリフルノミド、レフルノミド、シクロスポリン、ピメクロリムス、デニロイキン・ジフチトクス、及びバシリキシマブからなる群から選択される、有効量の１つ又は複数の抗Ｔ細胞剤と；（ｉｉ）ピルフェニドン、カプトプリル、ゾフェノプリル、エナラプリル、リシノプリル、ラミプリル、キナプリル、ペリンドプリル、ベナゼプリル、イミダプリル、トランドラプリル、シラザプリル、及びフォシノプリル、ロサルタン、イルベサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、ならびにフィマサルタンからなる群から選択される、有効量の１つもしくは複数の抗ＴＧＦ−β１剤及び／又は１つもしくは複数の抗アンジオテンシン剤とを含む、本発明の医薬組成物を投与することを含む。本発明の方法は、抗Ｔ細胞剤、抗ＴＧＦ−β１剤、及び／又は抗アンジオテンシン剤の任意の組み合わせを含む、本発明の医薬化合物を投与することを含み得る。例えば、一実施形態において、方法は、タクロリムス及びピルフェニドンを含む医薬組成物を投与することを含む。別の実施形態において、方法は、タクロリムス、ピルフェニドン、及びテリフルノミドを含む医薬組成物を投与することを含む。追加の実施形態において、方法は、タクロリムス、ピルフェニドン、及びレフルノミドを含む医薬組成物を投与することを含む。更なる態様において、方法は、タクロリムス及びカプトプリル；又はテリフルノミド及びカプトプリル；又はレフルノミド及びカプトプリル；又はピルフェニドン及びカプトプリル；又はタクロリムス、カプトプリル、及びテリフルノミド；又はタクロリムス、カプトプリル、及びレフルノミド；又はタクロリムス、カプトプリル、及びピルフェニドンを含む医薬組成物を投与することを含む。
「被験体」又は「個体」又は「患者」によって、診断、予測、又は治療法が所望される任意の被験体（好ましくは哺乳類被験体）が意味される。哺乳類被験体にはヒト、飼育動物、家畜、競技用動物、及び動物園の動物が含まれ、これらには例えばヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシなどが含まれる。
いくつかの実施形態において、被験体は、癌（例えば固形腫瘍を含む癌）を有し得るか又は以前に有し得る。いくつかの実施形態において、被験体は、乳癌、又は女性生殖器、皮膚系、筋骨格系、四肢又は体幹の軟組織、男性生殖器系、尿路系もしくは頭頸部に発症する癌を有し得るか又は以前に有し得る。いくつかの実施形態において、被験体は腋窩リンパ節郭清を受け得る。いくつかの実施形態において、被験体は癌の治療を受け、浮腫、リンパ浮腫、又はリンパ管損傷は癌の治療又は診断と関連する。例えば、被験体は、癌治療又は他の適応症のための化学療法又は放射線療法を現在受け得るかもしくは以前に受け得るか、又は癌の治療もしくは診断の過程で１つ又は複数のリンパ節が外科的に除去され得る。
いくつかの実施形態において、被験体は、リンパ管損傷（例えばリンパ節もしくはリンパ管の除去、結紮もしくは閉塞、又はリンパ組織の線維化の結果として）を持続させ得るか、又は、被験体は肥満であり得るか、又は浮腫（リンパ浮腫等）を引き起こす感染を有し得るかもしくは以前に有し得る。いくつかの実施形態において、感染は、リンパ浮腫又はリンパ管損傷に関連する皮膚感染、又は皮膚感染（複数可）の既往歴であり得る。いくつかの実施形態において、感染は、リンパの流れを閉塞させるか又はリンパ系を傷つける寄生虫感染症であり得る。いくつかの実施形態において、被験体は、関節置換術、外傷、熱傷、照射、又は化学療法からのリンパ管損傷を持続させ得る。
「治療すること」又は「治療」等又は「治療する」又は「緩和すること」又は「緩和する」等の用語は、診断された病理学的な病態又は障害を、治癒する、減速する、その症状を軽減する、及び／又はその進行を停止する、治療的措置を指す。したがって、治療を必要とする者には、障害に既に罹患する者が含まれる。ある特定の実施形態において、患者が、例えば疾患又は障害と関連する症状の全体的、部分的、又は一時的な緩和又は消失を示すならば、被験体は、本明細書において提供される方法に記載の疾患又は障害について成功して「治療される」。例えば、「浮腫を治療すること」には、膨潤を減少させること、炎症を減少させること、線維化を減少させること、疼痛を減少させること、可動域を増加させること、重感を減少させること、緊張を減少させること、皮膚肥厚を減少させること、及び／又はリンパ機能を改善させることが含まれ得るが、これらに限定されない。
「予防する」又は「予防」は、標的の病理学的な病態又は障害の発生を防止及び／又は遅延させる、予防的又は防止的な措置を指す。したがって、予防を必要とする者には、障害を発症するリスクがあるか又は感受性がある者が含まれる。リンパ浮腫を発症するリスクがあるか又は感受性がある被験体には、放射線療法、化学療法、及び／又は外科的リンパ節郭清を受ける癌患者が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、患者が、本発明の方法を受けていない患者よりも、一時的に又は恒久的に、例えば、疾患もしくは障害と関連する症状がより少ないかもしくはより重症度が低いか、又は疾患もしくは障害と関連する症状の開始がより遅くなれば、疾患又は障害は本明細書において提供される方法に従って成功して予防される。
予防的な文脈において、本発明の医薬組成物は、被験体をリンパ管損傷及び／又は浮腫発症のリスクがあるか又は感受性があるようにする事象（例えば放射線療法、化学療法、又は外科的リンパ節郭清）の前又は後の任意の時間で投与することができる。いくつかの態様において、医薬組成物は、事象の最大約１週間前（事象の１、２、３、４、５、６、又は７日前等）に予防的に投与される。いくつかの実例において、医薬組成物は事象と同じ日に予防的に投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、事象の６週間以内（例えば事象の約１、２、３、４、５もしくは６日以内、又は約１、２、３、４、５もしくは６週間以内）に予防的に投与される。一実施形態において、医薬組成物は、約２〜４週間の間又は約１、２、３、４、５もしくは６週間の間予防的に投与される。
いくつかの実施形態において、本明細書において記載される治療法及び／又は予防法は、当技術分野において公知の１つ又は複数の、追加の浮腫又はリンパ浮腫の治療法及び／又は予防法（例えば他の治療法薬剤の投与を含む治療方法、及び／又は外科手術、マッサージ、圧迫療法、体液排出療法、はり治療、レーザー、もしくは他の好適な治療方法を含む治療方法）と組み合わせて実行することができる。
「医薬組成物」という用語は、活性成分の生物学的活性が効果的であることを許容し、組成物が投与される被験体に許容できない毒性の追加成分を含有しないような形態である調製物を指す。医薬組成物は、多数の投薬形態（例えば錠剤、カプセル、液体、溶液、ソフトゲル、懸濁物、エマルション、シロップ、エリキシル、チンキ、フィルム、粉末、ハイドロゲル、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、ムース、泡、ラッカー、スプレー、エアロゾル、吸入器、ネブライザー、点眼薬、パッチ、坐薬、及び／又は浣腸）であり得る。医薬組成物は、典型的には薬学的に許容される担体を含み、バッファー（例えば酢酸バッファー、リン酸バッファー又はクエン酸バッファー）、界面活性剤（例えばポリソルベート）、安定化剤（例えばヒトアルブミン）、保存剤（例えばベンジルアルコール）、経皮吸収促進剤、バイオアベイラビリティーを向上させる吸収促進剤、及び／又は他の従来の可溶化剤もしくは分散剤のうちの１つ又は複数を含むことができる。投薬形態及び賦形剤の選択は、送達される活性薬剤及び治療又は予防される疾患又は障害に依存し、当業者にとって常用されている。
「全身投与」は、活性薬剤が例えば腸経路、非経口経路、吸入経路、又は経皮経路経由で循環系に入るように、医薬組成物が投与されることを意味する。腸の投与経路は胃腸管を包含し、経口送達、舌下送達、頬側送達、及び直腸送達が限定されずに含まれる。非経口的投与経路は胃腸管以外の経路を包含し、静脈内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、及び皮下が限定されずに含まれる。「局部投与」は、その作用が所望される場所へ（例えば傷害もしくは症状の部位で、又はその近くで）医薬組成物が直接投与されることを意味する。局部的投与経路には、吸入、局所、皮下、目、及び耳が限定されずに含まれる。それらの意図された投与経路に好適な医薬組成物を製剤化することは、当業者の理解範囲内である。
組成物の「有効量」は、本明細書において開示される時、具体的に明示された目的を実行するのに十分な量である。「有効量」は、明示された目的及び投与経路及び投薬形態に関連して、経験的に常用の様式で決定することができる。
いくつかの実施形態において、抗Ｔ細胞剤及び／又は抗ＴＧＦ−β１剤及び／又は抗アンジオテンシン剤の投与は、当技術分野における当業者によって決定されるように、任意の好適な用量での、及び／又は任意の好適な投薬レジメンに従う、全身投与を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態において、タクロリムス、又はその類似体、バリアントもしくは誘導体は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの１日の用量で被験体へ全身的に投与される。より詳細には、タクロリムス、又はその類似体、バリアントもしくは誘導体は、約０．０１、０．０１５、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０３５、０．０４、０．０４５、０．０５、０．０５５、０．０６、０．０６５、０．０７、０．０７５、０．０８、０．０８５、０．０９、０．０９５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．２５、２．５、２．７５、３．０、３．２５、３．５、３．７５、４．０、４．２５、４．５、４．７５、又は５．０ｍｇ／ｋｇの１日の用量で被験体へ投与され得る。
いくつかの実施形態において、テリフルノミド、又はその類似体、バリアントもしくは誘導体は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの１日の用量で被験体へ全身的に投与される。より詳細には、テリフルノミド、又はその類似体、バリアントもしくは誘導体は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．２５、２．５、２．７５、３．０、３．２５、３．５、３．７５、４．０、４．２５、４．５、４．７５、又は５．０ｍｇ／ｋｇの１日の用量で被験体へ投与され得る。
いくつかの実施形態において、レフルノミド、又はその類似体、バリアントもしくは誘導体は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの１日の用量で被験体へ全身的に投与される。より詳細には、レフルノミド、又はその類似体、バリアントもしくは誘導体は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．２５、２．５、２．７５、３．０、３．２５、３．５、３．７５、４．０、４．２５、４．５、４．７５、又は５．０ｍｇ／ｋｇの１日の用量で被験体へ投与され得る。
いくつかの実施形態において、ピルフェニドン、又はその類似体、バリアントもしくは誘導体は、約５０ｍｇ／ｋｇ〜約２５００ｍｇ／ｋｇの１日の用量で被験体へ全身的に投与される。より詳細には、ピルフェニドン、又はその類似体、バリアントもしくは誘導体は、約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、又は２５００ｍｇ／ｋｇの１日の用量で被験体へ投与され得る。
いくつかの実施形態において、カプトプリル、又はその類似体、バリアントもしくは誘導体は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの１日の用量で被験体へ全身的に投与される。より詳細には、カプトプリル、又はその類似体、バリアントもしくは誘導体は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．２５、２．５、２．７５、３．０、３．２５、３．５、３．７５、４．０、４．２５、４．５、４．７５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、又は１０ｍｇ／ｋｇの１日の用量で被験体へ投与され得る。
いくつかの実施形態において、抗Ｔ細胞剤及び／又は抗ＴＧＦ−β１剤及び／又は抗アンジオテンシン剤の投与は、当技術分野における当業者によって決定されるように、任意の好適な用量での、及び／又は任意の好適な投薬レジメンに従う、局部投与を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態において、タクロリムス、又はその類似体、バリアントもしくは誘導体は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、又は約０．１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌ、又は約０．０１、０．０１５、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０３５、０．０４、０．０４５、０．０５、０．０５５、０．０６、０．０６５、０．０７、０．０７５、０．０８、０．０８５、０．０９、０．０９５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．２５、２．５、２．７５、３．０、３．２５、３．５、３．７５、４．０、４．２５、４．５、４．７５もしくは５．０ｍｇ／ｍｌのタクロリムス、又はその類似体、バリアントもしくは誘導体を含む局所組成物の形態で被験体へ投与される。いくつかの実施形態において、タクロリムス、又はその類似体、バリアントもしくは誘導体は、約０．０１％〜約１％、又は約０．０３％〜約０．５％、又は約０．０５〜約０．２％、又は約０．０１、０．０１５、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０３５、０．０４、０．０４５、０．０５、０．０５５、０．０６、０．０６５、０．０７、０．０７５、０．０８、０．０８５、０．０９、０．０９５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５もしくは１．０％のタクロリムス、又はその類似体、バリアントもしくは誘導体を含む局所組成物の形態で被験体へ投与される。
いくつかの実施形態において、テリフルノミド、又はその類似体、バリアントもしくは誘導体は、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌ、又は約２０ｍｇ／ｍｌ〜約３０ｍｇ／ｍｌ、又は約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０ｍｇ／ｍｌのテリフルノミド、又はその類似体、バリアントもしくは誘導体を含む局所組成物の形態で被験体へ投与される。いくつかの実施形態において、テリフルノミド、又はその類似体、バリアントもしくは誘導体は、約１％〜約２０％、又は約５％〜約１５％、又は約１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．２５、２．５、２．７５、３．０、３．２５、３．５、３．７５、４．０、４．２５、４．５、４．７５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５もしくは２０％のテリフルノミド、又はその類似体、バリアントもしくは誘導体を含む局所組成物の形態で被験体へ投与される。
いくつかの実施形態において、レフルノミド、又はその類似体、バリアントもしくは誘導体は、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌ、又は約２０ｍｇ／ｍｌ〜約３０ｍｇ／ｍｌ、又は約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０ｍｇ／ｍｌのレフルノミド、又はその類似体、バリアントもしくは誘導体を含む局所組成物の形態で被験体へ投与される。いくつかの実施形態において、レフルノミド、又はその類似体、バリアントもしくは誘導体は、約１％〜約２０％、又は約５％〜約１５％、又は約１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．２５、２．５、２．７５、３．０、３．２５、３．５、３．７５、４．０、４．２５、４．５、４．７５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５もしくは２０％のレフルノミド、又はその類似体、バリアントもしくは誘導体を含む局所組成物の形態で被験体へ投与される。
いくつかの実施形態において、ピルフェニドン、又はその類似体、バリアントもしくは誘導体は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、又は約０．５ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌ、又は約０．０１、０．０１５、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０３５、０．０４、０．０４５、０．０５、０．０５５、０．０６、０．０６５、０．０７、０．０７５、０．０８、０．０８５、０．０９、０．０９５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．２５、２．５、２．７５、３．０、３．２５、３．５、３．７５、４．０、４．２５、４．５、４．７５もしくは５．０ｍｇ／ｍｌのピルフェニドン、又はその類似体、バリアントもしくは誘導体を含む局所組成物の形態で被験体へ投与される。いくつかの実施形態において、ピルフェニドン、又はその類似体、バリアントもしくは誘導体は、約０．１％〜約２０％、又は約１％〜約１０％、又は約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．２５、２．５、２．７５、３．０、３．２５、３．５、３．７５、４．０、４．２５、４．５、４．７５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５もしくは２０％のピルフェニドン、又はその類似体、バリアントもしくは誘導体を含む局所組成物の形態で被験体へ投与される。
いくつかの実施形態において、カプトプリル、又はその類似体、バリアントもしくは誘導体は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、又は約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、又は約０．０１、０．０１５、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０３５、０．０４、０．０４５、０．０５、０．０５５、０．０６、０．０６５、０．０７、０．０７５、０．０８、０．０８５、０．０９、０．０９５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．２５、２．５、２．７５、３．０、３．２５、３．５、３．７５、４．０、４．２５、４．５、４．７５もしくは５．０ｍｇ／ｍｌのカプトプリル、又はその類似体、バリアントもしくは誘導体を含む局所組成物の形態で被験体へ投与される。いくつかの実施形態において、カプトプリル、又はその類似体、バリアントもしくは誘導体は、約１％〜約２０％、又は約５％〜約１５％、又は約１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．２５、２．５、２．７５、３．０、３．２５、３．５、３．７５、４．０、４．２５、４．５、４．７５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５もしくは２０％のカプトプリル、又はその類似体、バリアントもしくは誘導体を含む局所組成物の形態で被験体へ投与される。
例えば１日の用量が２つ以上の分離した用量へと分割される場合、抗Ｔ細胞剤及び／又は抗ＴＧＦ−β１剤及び／又は抗アンジオテンシン剤は、任意の好適な投薬レジメンに従って投与され得る。全身投与又は局部投与のための投薬スケジュール及び継続期間を決定することは、当業者の技能内である。いくつかの実施形態において、医薬組成物は少なくとも１日１回又は少なくとも１日２回経口的に投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は少なくとも１日１回又は少なくとも１日２回静脈内に投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は少なくとも１日１回又は少なくとも１日２回局所的に投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は少なくとも１日１回又は少なくとも１日２回皮下に投与される。
２つ以上の活性薬剤が投与される複数の実施形態において、薬剤は、一緒に（例えば同じ製剤中で及び／又は同じ時間で）、又は独立して（例えば異なる製剤中で及び／又は異なる時間で）投与することができる。いくつかのかかる実施形態において、薬剤は全身的に投与される。いくつかのかかる実施形態において、薬剤は局部的に投与される。いくつかのかかる実施形態において、１つ（又は複数）の薬剤は全身的に投与され、１つ（又は複数）の薬剤は局部的に（例えば局所的に）投与される。２つのかかる薬剤が使用される場合、各々の薬剤が単独で使用される場合に必要な投薬量と比較して、より少ない投薬量又は量の各々の薬剤を使用することは可能である。
本開示の実施形態は、更に以下の非限定実施例への参照によって定義することができる。本開示の範囲から逸脱せずに、材料及び方法の両方へ多くの修飾を実践することができることは当業者に明らかであろう。
実施例１．タクロリムスを使用するリンパ浮腫の治療及び予防
タクロリムスは、全身的な免疫抑制なしに尾リンパ浮腫を減少させる
リンパ浮腫に対する局所的なタクロリムスの効果を研究するために、以前に記載されたリンパ浮腫のマウス尾モデルを使用した。Ｇｏｌｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９６：１１９３−１１９９（２００５）；Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃ．２：ｅ０００４３８（２０１３）；Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １２５：８７２−８８２（２０１２）；Ｔａｂｉｂｉａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｍｅｄ．３：ｅ２５４（２００６）；Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１１：７１７−７２５（２００３）。マウス尾の表在リンパ管及び深部リンパ管の破壊は、外科手術の２週間後に１００％を超える尾体積の増加をもたらした（図１Ａ、１Ｂ）。この時点での膨潤は主として間質液の蓄積に起因することが、以前に本出願人により示されている。Ａｖｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．２７：１１１４−１１２６（２０１３）。尾における慢性的なリンパ管閉塞は、脂肪線維組織による間質液の段階的な置き換えをもたらすだけでなく、炎症細胞の蓄積が続く４週間にわたって起こる。Ａｖｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．２７：１１１４−１１２６（２０１３）。これらの病理学的な変化は臨床的リンパ浮腫を非常によく反映し、一旦リンパ浮腫が確立されれば、追加の少なくとも６〜９週間の間持続する。Ｇｏｌｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９６：１１９３−１１９９（２００５）；Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃ．２：ｅ０００４３８（２０１３）；Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １２５：８７２−８８２（２０１２）；Ｔａｂｉｂｉａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｍｅｄ．３：ｅ２５４（２００６）；Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１１：７１７−７２５（２００３）。
この知識に基づいて、２つの異なるタクロリムス治療アプローチを使用した。リンパ浮腫の発症を予防する取り組みにおいて（すなわち初期治療）、１つの群の動物を外科手術の２週間後に開始するタクロリムスにより４週間治療した（尾外科手術後に合計６週間）。別の群において、確立された軟組織変化を治療する意図で（すなわち後期治療）、リンパ浮腫が確立するようにリンパアブレーション後に６週間待機し、次いで９週間目までタクロリムスにより治療した。すべての研究において、０．１％のタクロリムス（０．０５ｇ／適用）又はベヒクル対照（ワセリン）のいずれかにより１日２回動物を治療した。タクロリムス又はベヒクル対照を、外科手術部位から遠位の（すなわち含まない）尾全体へ薄層として適用した。
局所的なタクロリムスによる初期治療は著しく尾膨潤を減少させ、持続的な膨潤の発生を予防した（図１Ａ、１Ｂ）。実験動物からの尾の肉眼的な検討により、リンパ浮腫のほぼ完全な消失が実証され、この変化は尾体積の９５％の減少及び軟組織厚みのおよそ５０％の減少に対応した（図１Ｂ、１Ｃ）。後期治療も、対照と比較して、肉眼的な尾膨潤、尾体積、及び軟組織厚みの減少に極めて効果的であったが、これらの動物において尾体積は手術前のレベルへ戻らなかった（図１Ｂ、１Ｃ）。
タクロリムスの全身的なレベル及び周辺Ｔ細胞カウントも分析して、局所的に適用されたタクロリムスが感知できる様式で吸収されるかどうかを決定した。この解析により、局所的なタクロリムスの体内吸収（１．０６ｎｇ／ｍＬの平均値）が全身投与（５〜１５ｎｇ／ｍＬ；図１Ｄ）により達成される既知療法の免疫抑制レベルより有意に低いままであることが実証された。加えて、ベヒクル治療対照と比較して、局所的なタクロリムスにより治療された動物は、循環血液Ｔ細胞又はＣＤ４+細胞の変化を示さなかった（図１Ｅ、図７）。
タクロリムスはリンパ管損傷後の炎症及び線維化を減少させる
慢性炎症は、臨床的なリンパ浮腫の組織学的特徴であり、Ｔヘルパー細胞、Ｔ調節性細胞、及びマクロファージの蓄積の増加によって特徴づけられる。Ａｖｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．２７：１１１４−１１２６（２０１３）；Ｚａｍｐｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ４９９４０（２０１２）；Ｇｈａｎｔａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３０８：Ｈ１０６５−１０７７（２０１５）；Ｏｌｓｚｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌｙｍｐｈｏｌｏｇｙ ２３：２３−３３（１９９０）。このことと一致して、タクロリムス治療動物では、対照と比較して、真皮及び皮下脂肪に浸潤する白血球の数が著しく減少したことが見出された（ＣＤ４５+細胞；５６％の低減、初期治療；４９％の低減、後期治療；図２Ａ）。対照動物から採取されたリンパ浮腫性組織中の炎症細胞は毛細管及び集合リンパ管に非常に接近して位置したが、タクロリムス治療マウス中で実質的には存在しなかった。同様に、浸潤するＣＤ３+細胞（５３％の低減、初期治療；４９％の低減、後期治療；図２Ｂ）、ＣＤ４+細胞（７８％の低減、初期治療、７１％の低減、後期治療；図２Ｃ）、及びＩＦＮ−γ産生細胞（５４％の低減、初期治療、５７％の低減、後期治療；図２Ｄ）の数の著しい減少が、本出願人により指摘された。加えて、マクロファージ（Ｆ４／８０+細胞；８６％の低減、初期治療；７３％の低減、後期治療；図８）の軟組織浸潤の減少が、指摘された。総合すると、これらの所見は、リンパ管損傷後に多数の炎症細胞が皮膚／皮下のリンパ管に非常に接近して蓄積し、この応答がタクロリムスの局所適用によって緩和されることを示す。
リンパ浮腫に罹患する患者は進行性の軟組織線維化を有し、線維化の程度は疾患の重症度と相関する。Ｔａｓｓｅｎｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｌｙｍｐｈａｔ．Ｒｅｓ．Ｂｉｏｌ．７：１４５−１５１（２００９）。したがって、疾患のこの態様に対するタクロリムス治療の効果を理解するために尾組織中の線維化の複数のマーカーを分析した。タクロリムスによる局所的な治療は、対照マウスと比較して、真皮及び皮下のＩ型コラーゲン沈着及び瘢痕指標（Ｉ型／ＩＩＩ型コラーゲンの比を測定するピクロシリウスレッド複屈折）を著しく減少させることが見出された（図３Ａ、３Ｂ）。対照マウスのリンパ管はＩ型コラーゲンの厚い層によって囲まれた。これとは対照的に、タクロリムス治療動物は本質的に正常なリンパ管を有していた。この観察及び本出願人の先行報告（Ｃｌａｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９５：Ｈ２１１３−２１２７（２００８））と一致して、タクロリムス治療が、線維化を促進する増殖因子ＴＧＦ−β１の発現及びその活性化された下流のシグナリング分子（リン酸化されたＳＭＡＤ３）の細胞発現を著しく減少させることも見出された（ｐＳＭＡＤ−３；図３Ｃ、３Ｄ）。この応答の程度は初期及び後期のタクロリムス治療について類似していた。
タクロリムスはリンパ機能を増加させる
リンパ機能を査定するために、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）による近赤外（ＮＩＲ）リンパ管造影法（それはリンパ管のリアルタイム画像化、パケット頻度（又はリンパ液の拍動流）の計算を可能にすることによって、ヒト、ブタ及びマウスにおけるリンパ機能を定量化する効果的な手段として記述された）、ならびに皮膚逆流及び色素クリアランスの解析を実行した。Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌｙｍｐｈａｔ．Ｒｅｓ．Ｂｉｏｌ．５：２１９−２３１（２００７）；Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９２：Ｈ３１０９−３１１８（２００７）；Ｕｎｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．５２：９４６−９５２（２０１０）。リンパ管結紮の６週間後にＮＩＲ画像化を使用して、リンパ管損傷の２週間後に治療が開始された動物において、尾創傷を近位へと横切る間質液の急速な輸送が、指摘された（初期治療；図４Ａ）。これとは対照的に、対照動物は、傷害ゾーンを横切った輸送はなく、リンパの切除部位から遠位でのＩＣＧの貯留を実証した。この所見は、テクネチウム９９ｍ（99mＴｃ）リンパ管シンチグラフィー（放射性トレーサーを尾遠位部中に注入し、仙骨リンパ節による取り込みを経時的に測定する技法）を使用して確認された。初期治療動物における仙骨リンパ節の崩壊補正取り込みは、対照と比較して、タクロリムス治療動物における99mＴｃ取り込みの６倍を超える増加を実証した（図４Ｂ）。タクロリムスによる後期治療は同様にリンパ節による取り込みを増加させた（２倍）が、この差は統計的有意差に達しなかった。
尾モデルにおけるリンパ浮腫の予防及び治療のタクロリムスの有効性を考慮して、次にタクロリムスが、以前に記載された膝窩リンパ節郭清（ＰＬＮＤ）のモデルを使用して、リンパ管損傷後にどのようにリンパ機能を修飾するかを研究することにした（図９）。Ｂｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．１３９：８１−８６（２０１３）。リンパ節郭清は、癌治療の過程で先進国におけるリンパ浮腫の最も一般的な原因であるので、このモデルは臨床に関連するものである。慢性的な炎症反応がリンパ管損傷後に活性化されるメカニズムを十分に理解するために、最初にＰＬＮＤマウスのモデルを利用した。
先行研究により、リンパ内皮細胞（ＬＥＣ）が活性酸素種（ＲＯＳ）に極めて感受性があり（Ｋａｓｕｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．４：４１７３（２０１４））、ＲＯＳが慢性炎症を活性化し得ることが実証されている。Ｇｏｒｌａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｄｏｘ Ｂｉｏｌ．６：３７２−３８５（２０１５）。ＲＯＳがＰＬＮＤ後に存在するかどうかを決定するために、細胞代謝産物の除去におけるリンパ管の既知の役割に基づいて、傷害の１週間後に傷害ゾーンから遠位の組織におけるＲＯＳの蓄積を分析した。実際、この解析により、ＰＬＮＤにより処理された動物における膝窩部にすぐ遠位の後肢組織におけるＲＯＳの有意な蓄積が実証された（図１０）。これとは対照的に、リンパ節切除なしに皮膚切開により処理された対照動物には、ＲＯＳの蓄積が実質的にはなかった。ＲＯＳは、先天性免疫応答（危険関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ）が含まれる）を活性化することができる。Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９４：４２９−４３７（２０１５）。これらの研究及びＰＬＮＤ後のＲＯＳの増加についての本所見に加えて、リンパ腫組織における様々な細胞タイプにおけるＨＭＧＢ１の発現増加を実証したリンパ浮腫の尾モデルを使用する本出願人の先行研究（Ｚａｍｐｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３００：Ｃ１１０７−１１２１（２０１１））、と一致して、ＤＡＭＰ（熱ショックタンパク質−７０（ＨＳＰ７０）及び高移動度群ボックス１（ＨＭＧＢ−１）等）の発現の著しい増加が指摘された（図１０）。これらの所見により、リンパ管損傷がＲＯＳの生成をもたらし、次に、細胞傷害、ＤＡＭＰの発現、及び炎症応答の開始をもたらすことが指摘される。
先行する臨床及び実験室での研究は、漏洩する機能障害のリンパ管からもたらされる間質腔の中へのＩＣＧの貯留として皮膚逆流を記載していた。Ｂｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．１３９：８１−８６（２０１３）；Ｔａｓｈｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｐｌａｓｔ．Ｓｕｒｇ．ｄｏｉ：１０．１０９７／ＳＡＰ．５９９（２０１５）；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．１２８：３１４ｅ−３２１ｅ（２０１１）。これらの報告と一致して、４週間の間ワセリン単独により局所的に治療された対照動物は、脚パッドの毛細リンパ管の著しい漏出性（白色矢印によって示される明るいＩＣＧ蓄積の斑点状領域；図４Ｃ）及び皮膚逆流（真皮におけるＩＣＧの全般的な保持；図４Ｃ）を有することが見出された。この病理学的応答は、局所的なタクロリムスにより治療された動物において著しく減少し、注入されたＩＣＧのリンパの漏出性の減少及びクリアランスの改善をもたらした。
低速度撮影を使用する集合管におけるＩＣＧ蛍光強度における変動の解析は、リンパ管の駆出率の測定に以前から使用されている技法である。Ｓｅｖｉｃｋ−Ｍｕｒａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２４：９０５−９１４（２０１４）。この解析は「ＩＣＧパケット頻度」の計算を可能にし、ＰＬＮＤ後の集合リンパ機能の分析に使用された。Ｂｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．１３９：８１−８６（２０１３）。この技法を使用して、局所的なタクロリムス療法は、対照と比較して、集合リンパ管のパケット頻度を著しく増加させる（＞２倍の増加）ことが見出され、この治療が集合リンパ機能を増加させることが指摘された（図４Ｄ）。
加えて、尾モデルによる本所見に類似して、ＰＬＮＤ後の局所的なタクロリムスによる治療は、ベヒクル治療対照と比較して、炎症細胞のリンパ周囲の浸潤を著しく減少させる（ＣＤ４５+細胞の３９％の低減（図４Ｅの上部パネル、図４Ｆ）、ＣＤ４+細胞の５６％の低減（図１１）、及びＦ４／８０+細胞の３６％の低減（図１２））ことが見出された。局所的なタクロリムスによる治療は、炎症細胞による誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）のリンパ周囲での発現の有意な減少（ｉＮＯＳ発現細胞数の４２％の低減）ももたらした（図４Ｅ下部パネル、図４Ｇ）。リンパ周囲のｉＮＯＳ発現は集合リンパ管の駆出能力の重要な調節因子であると先行研究が示したので、これは重要である。Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０８：１８７８４−１８７８９（２０１１）。重要なことには、手術されていない動物（すなわち麻酔のみだが外科手術はない）のタクロリムスによる治療が、リンパ管の収縮頻度又は炎症細胞のリンパ周囲の蓄積を増加させなかったので、局所的なタクロリムス治療に応答したリンパ管の収縮性の変化は、リンパ管損傷の状況でのみ観察された（図１３）。
加えて、リンパ機能に対するタクロリムスの観察された効果が、血管透過性及び血管漏出の減少の結果ではなかったことを保証するために、Ｍｉｌｅｓアッセイを実行して、タクロリムス有り及び無しでＰＬＮＤ外科手術後の血管透過性を測定した。タクロリムス治療とベヒクル対照との間に血管透過性の差は観察されず、リンパ機能の増加におけるタクロリムスの効果は、確かに血管漏出の減少ではなくリンパ機能の増加に起因することが示唆された（図１４）。
次に、長年の重篤なリンパ浮腫に罹患する患者が平滑筋細胞肥大によりリンパ管を絞めつけるという先行する臨床報告が示した事実に基づいて、対照動物及びタクロリムス治療動物におけるＰＬＮＤ後の後肢の集合リンパ管の内腔径及びアルファ平滑筋細胞被覆を検査した。Ｍｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７：ｅ４１１２６（２０１２）。驚くことではないが、リンパ管損傷後のこの比較的早期の期間において（すなわち４週間）、タクロリムス治療マウス及び対照治療マウスを比較する場合に、後肢の集合管の管の周囲又は内腔領域でのアルファ平滑筋の数の差は、見出されなかった。この所見により、リンパ管の構造的な変化によってではなく、リンパの微小環境（例えばリンパ周囲の炎症又はｉＮＯＳの発現；図１５）における変化に起因して、タクロリムス治療後の集合リンパ管のパケット頻度の増加が調節されることが指摘される。
タクロリムスは側副リンパ管形成を増加させる
Ｔ細胞が、リンパ節のリンパ管新生（Ｋａｔａｒｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３４：９６−１０７（２０１１））及び創傷修復の間の炎症性リンパ管新生（Ｚａｍｐｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３０２：Ｃ３９２−Ｃ４０４（２０１２））を強力に阻害することが公知であるので、次にタクロリムスによる治療が側副リンパ管の形成を増加させるかどうかを決定することにした。確かに、尾創傷の組織学的分析及びＬＹＶＥ−１の免疫蛍光（ＩＦ）染色を使用するリンパ管の同定により、リンパ管損傷ゾーンを架橋する新しく形成されたリンパ管の著しい増加が実証された（初期治療後に１８９％の増加；後期治療後に１０６％の増加；図５Ａ）。対照動物とタクロリムス治療動物との間でＶＥＧＦ−Ｃ ｍＲＮＡ発現における差が指摘されなかったので、このリンパ管新生応答はＶＥＧＦ−Ｃ発現に非依存性であると思われた（図５Ａ）。しかしながら、本出願人によるＩＦ染色解析と一致して、２つの強力な抗リンパ管新生性の増殖因子及びサイトカイン、ＴＧＦ−β１（Ｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１１：４５７１−４５７９（２００８）；Ｃｌａｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９５：Ｈ２１１３−２１２７（２００８））及びＩＦＮ−γ（Ｋａｔａｒｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３４：９６−１０７（２０１１）；Ｓｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．２６：５６８−５７４（２００６））の発現の有意な減少が指摘された（図５Ａ）。ＰＬＮＤの４週間後の後肢におけるＮＩＲ画像化によるリンパ管造影の解析及びリンパ管についてのＩＦ染色により、本出願人による尾モデルについての所見が確認され、タクロリムスにより治療された動物が、鼠径リンパ節に向かって排出させる側副リンパ管を一貫して有意に多く有し、それによって傷害ゾーンをバイパスすることが実証された（図５Ｂ〜５Ｄ）。
リンパ液の排出が外科的に閉塞されない他の炎症モデル及び創傷モデルにおけるタクロリムスのリンパ管新生効果を決定するために、次に炎症性リンパ管新生の２つの他のモデルを使用した。角膜は血管及びリンパ管の両方を通常は欠いているが、炎症の状況において両者を発生させるので、角膜はリンパ管新生の研究のための有用な組織である。Ｃｕｒｓｉｅｆｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１３：１０４０−１０５０（２００４）。マウスの角膜中に縫合糸を設置し、全身的なタクロリムス又はベヒクル対照によりマウスを２週間の間毎日治療し、血管ではなくリンパ管の増殖における有意な増加（４８％の増加）をタクロリムス治療がもたらすことが見出された（図６Ａ〜６Ｃ）。
耳ポンチ創傷モデルを使用し、局所的なタクロリムス又は対照軟膏を４週間の間適用して、創傷治癒の間のリンパ管新生も研究した。角膜モデルに類似して、局所的なタクロリムスは、対照と比較して、創傷に隣接する耳皮膚におけるリンパ管密度及び分岐を有意に増加させたことが見出された（図６Ｄ〜６Ｆ）。タクロリムスの直接的なリンパ管新生性の効果の可能性を試験するために、創傷を受けていないマウス耳へタクロリムスを４週間の間適用し、次いでリンパ管のホールマウント共焦点画像化を実行した。この損傷のない炎症を起こしていない状況において、リンパ管新生の増加は観察されなかった（図１６）。総合すると、これらの結果により、タクロリムスは、一般的には炎症の状況において、及び特異的にはリンパ浮腫／リンパ管損傷の状況において、新しいリンパ管の形成を促進することが指摘される。
方法
研究デザイン
この研究の目的は、Ｔ細胞の局部的阻害がリンパ管損傷後のリンパ浮腫の発症を予防することができ、発症した後の確立しているリンパ浮腫を治療することができるという仮説を試験することである。リンパ管損傷及びリンパ浮腫の２つの異なるマウスモデルを使用して、タクロリムス（これらの転帰に対してＦＤＡによって認可された局所的な抗Ｔ細胞医薬物）の有効性を分析した。タクロリムスがリンパ浮腫の予防及び治療において確かに効果的であることが見出されたので、次いで、この応答を調節する細胞メカニズム及び分子メカニズムを分析することにした。これらの後続する研究において、ＣＤ４＋炎症応答の阻害が、側副リンパ管の形成を増加させること、毛細リンパ管を囲む細胞間マトリックス中のコラーゲン沈着を減少させること、及び集合リンパ管の駆出頻度を増加させることによって、リンパ機能を改善したという仮説を試験した。本研究はすべて、光及び温度を制御した病原体不含有環境において維持し自由摂食させた、成体メス（１０〜１４週齢）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）を使用して実行した。すべての研究はＭｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒの研究機関内動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって認可された。各々の実験を最低でも６〜８匹の動物を使用して実行し、アッセイを三重で実行した。すべての細胞カウントは、介入に対して盲検化された審査員によって実行した。
動物モデル及び治療
尾の外科手術及びリンパのアブレーションを、以前公表されたように実行した。Ｃｌａｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９５：Ｈ２１１３−Ｈ２１２７（２００８）。簡潔には、尾の中間部分の表在集合リンパ管及び深部集合リンパ管を、２ｍｍの環状切除を使用して切除した。外科手術の２週間後に開始（初期治療）及び外科手術の６週間後に開始（後期治療）して、０．１％のタクロリムス（Ａｓｔｅｌｌａｓ、Ｔｏｋｙｏ、日本）／ベヒクル対照（ワセリン）で、異なるセットの動物を局所的に治療した。両方のアプローチについて、４週間の期間（初期治療について）及び３週間の期間（後期治療）の間０．１％のタクロリムス又はベヒクル対照により動物を１日２回治療した。タクロリムス（およそ０．０５ｇ）を尾領域全体に薄層として適用した。リンパ集合管の駆出能力の解析を可能にするために、以前に記載されたマウス膝窩リンパ節切除モデルを利用した。Ｂｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ １３９：８１−８６（２０１３）；Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９２：Ｈ３１０９−Ｈ３１１８（２００７）。簡潔には、後肢の集合管及び膝窩リンパ節を同定し、リンパ節を膝窩脂肪体と共に切除した。外科手術の２週間後に開始する、０．１％の局所的なタクロリムス又はベヒクル対照（ワセリン）のいずれかによる２週間の間の１日２回の治療に対して、動物を無作為化した。
角膜のリンパ管新生のアッセイを以前に報告されたように実行した。Ｃｕｒｓｉｅｆｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｒｎｅａ ２５：４４３−４４７（２００６）。簡潔には、１０−０ナイロン縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ）を１２０°の角度で角膜中に設置した。縫合糸設置後に開始して、動物を全身的なタクロリムス又はベヒクル対照により２週間の間毎日治療し、続いて共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｅｉｔｚｉａｒ、ドイツ）を使用して解析した。全身的なタクロリムス（Ｂｉｏｔａｎｇ Ｉｎｃ．、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）をＰＢＳ中の１０％のエタノールと１％のツイーン８０中に溶解し（Ｒｏｚｋａｌｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．４１：６５０−６５４（２０１１）；Ｂｕｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７：６９３９−６９４６（１９９７））、４ｍｇ／ｋｇで腹腔内に毎日投薬した。全身的なタクロリムスについてのベヒクル対照は、同等の体積のＰＢＳ中の１０％のエタノール、１％のツイーン（ｔｗｅｅｎ）８０であった。皮膚のリンパ管新生を以前に報告されたように耳ポンチ創傷モデルを使用して査定した。Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：４９４６−４９５１（２００６）。創傷に続いて、耳皮膚を局所的なタクロリムス又はベヒクル対照のいずれかにより４週間の間治療した。次いで耳を採取し、１％のＰＦＡ中で一晩固定した。次いで耳皮膚の前方部分及び後方部分を分割して軟骨を除去し、ＬＹＶＥ−１及びＣＤ３１についてのホールマウント染色を実行した。共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｅｉｔｚｉａｒ、ドイツ）を使用してタイルスキャン画像を獲得し、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して創傷端部の４００μｍ内の皮膚を分析した。標準化された（２００μｍ×２００μｍ）視野を、２名の盲検化された審査員によって、単位面積あたり存在する分岐点の数について分析した。
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーを以前に報告されたように末梢血サンプルで実行した。Ｚａｍｐｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ４９９４０（２０１２）。簡潔には、赤血球をＲＢＣ溶解バッファー（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）により溶解し、続いてフルオロフォアコンジュゲート抗体（ＣＤ４５、ＣＤ３、及びＣＤ４；すべてＢｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから）により染色し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）により解析した。
質量分析によるタクロリムス血中レベル
タクロリムスの血中レベルを以前に報告された方法を修飾した質量分析を使用して測定した。Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６０３：４７９−４８７（２０１０）。簡潔には、全血をＥＤＴＡナトリウムコートチューブ（Ｔｅｒｕｍｏ、Ｓｈｉｂｕｙａ、日本）中に収集し、次いでＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｕｌｔｒａトリプル四重極質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、ＭＡ）に連結されたＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｒｉａ ＴＬＸ−２乱流クロマトグラフ（ＴＦＣ）を使用して分析した。使用したＴｕｒｂｏＦｌｏｗカラムはサイクロンＰ−５０×０．５ｍｍであり、一方分析カラムは３×５０ｍｍのＨｙｐｅｒｓｉｌ Ｇｏｌｄ Ｃ−１８カラムであった。全血（５０μＬ）へ、内部標準物質としてアスコマイシンを含有する２００μＬの０．２ｍＭのＺｎＳＯ4を添加した。３０分間のインキュベーション及び遠心分離に続いて、５０μＬの上清をＴＦＣシステムの中へ注入した。１０ｍＭのギ酸アンモニウム及び０．１％の蟻酸を含有する水及びメタノール溶液の勾配によりカラム（０．７５ｍＬ／分間）を介して、検体を溶出させた。分析実行時間は４．５分間であった。アッセイ日の間の不正確度を１０日の期間にわたって３つの濃度で決定した。３．３、１２．６及び３１．９ｎｇ／ｍＬの濃度で、変動係数はそれぞれ９．８、７．０及び７．８％であった。アッセイは０〜４０ｎｇ／ｍＬで直線範囲を有する。
リンパ機能の解析
尾の体積を以前に報告されたように円錐台式を使用して計算し（Ｃｌａｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９５：Ｈ２１１３−Ｈ２１２７（２００８））、Ｍｉｒａｘ画像化ソフトウェア（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｍｕｎｉｃｈ、ドイツ）を使用する標準化された様式で、皮膚／皮下組織の軟組織厚みの組織学的測定を使用して確認した。
本出願人の以前に出版された方法を使用してリンパ管シンチグラフィーを実行した。Ａｖｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７７：３２０２−３２１４（２０１０）。簡潔には、５０μｌの濾過されたテクネチウム９９ｍ（99mＴｃ）硫黄コロイド（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒｏｃｋａｗａｙ、ＮＪ）を、尾遠位部中に注入した。Ｘ−ＳＰＥＣＴカメラ（Ｇａｍｍａ Ｍｅｄｉｃａ、Ｎｏｒｔｈｒｉｄｇｅ、ＣＡ）を使用して画像を採取し、対象となる領域の解析を実行して、仙骨リンパ節中の崩壊補正カウントを導き出し、ＡＳＩＰｒｏソフトウェア（ＣＴＩ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ、Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ、ＴＮ）を使用してリンパ節の取り込みのピーク及び率を計算した。
近赤外画像化（ＮＩＲ）は以前に出版された結果の修飾を使用して実行した。Ｔａｓｓｅｎｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｌｙｍｐｈａｔ．Ｒｅｓ．Ｂｉｏｌ．７：１４５−１５１（２００９）。簡潔には、１５μｌ（０．１５ｍｇ／ｍＬ）のインドシアニングリーン（ＩＣＧ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、背側後肢の趾間中に皮内注射し、ＬＥＤ光源（ＣｏｏｌＬＥＤ、Ａｎｄｏｖｅｒ、イギリス）を備えたＥＶＯＳ ＥＭＣＣＤカメラ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して可視化した。Ｚｅｉｓｓ Ｖ１２ Ｓｔｅｒｅｏｌｕｍａｒ顕微鏡（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）を使用して、静止画像／ビデオ画像を得て、脚の主要な集合管にわたって対象となる領域を同定すること及び経時的にプロットされたバックグラウンドの蛍光強度を引くことによって、Ｆｉｊｉソフトウェア（ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を使用して、リンパ管のポンプ機能を分析した。
組織学及び免疫染色
本出願人の出版された方法を使用して免疫組織化学的染色を実行した。Ｃｌａｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９５：Ｈ２１１３−Ｈ２１２７（２００８）。簡潔には、組織を４％のパラホルムアルデヒド中で４℃で固定し、５％のＥＤＴＡナトリウム（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）中で脱灰し、パラフィン中に包埋し、５マイクロメートルで切片を作成した。切片を湿らせ、加熱媒介性の抗原のマスキングの除去を９０℃のクエン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して実行した。非特異的結合はを２％のＢＳＡ／２０％の動物血清によりブロックした。組織を一次抗体により４℃で一晩インキュベーションした。免疫組織化学の染色のために使用された一次抗体は、ヤギ抗マウスＬＹＶＥ−１、ラット抗マウスＣＤ４５、ウサギ抗マウスＣＤ４、ラット抗マウスＦ４／８０（すべてＲ＆Ｄ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮから）、ウサギ抗マウスＣＤ３（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡから）、Ｃｙ３コンジュゲート抗マウスαＳＭＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから）、ウサギ抗ヒトＩＦＮ−γ、ウサギ抗マウスＴＧＦ−β１、ウサギ抗マウスｐ−ＳＭＡＤ３、ウサギ抗マウスＩ型コラーゲン、ウサギ抗マウスｉＮＯＳ、ハムスター抗マウスポドプラニン、ウサギ抗マウスＨＭＧＢ−１及びＨＳＰ−７０（すべてＡＢＣＡＭ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡから）を含んでいた。
免疫蛍光染色は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒフルオロフォアコンジュゲート二次抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）を使用して実行した。画像はＭｉｒａｘ画像化ソフトウェア（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を使用してスキャンした。リンパ周囲のＣＤ４５+及びＣＤ４+細胞カウントは、各々の脚の四半部分中で最も炎症を起こしたリンパ管の５０μｍ以内で陽性染色された細胞のカウントによって査定した。陽性染色された細胞は、１匹の動物あたり最低４つの視野で４つの無作為に選択された４０×高倍率視野において２名の盲検化された審査員によってカウントした。Ｉ型コラーゲン沈着は、５μｍの横断切片の真皮領域中でＭｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して定量化した。この解析は、以前に報告されたようにピクロシリウスレッド染色及び瘢痕指標計算を使用して確認した。Ｆｌａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６３：２２４７−２２５７（２００３）。マウス尾における架橋リンパ管は、１つの尾あたり４つの異なる高倍率視野で再上皮化した外科手術部位においてカウントした。
シリウスレッド染色
尾組織のパラフィン切片を、製造者の説明書に従ってピクロシリウスレッド染色キット（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）により染色した。Ａｘｉｏｃａｍ ２顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）にて偏光を介して画像を得て、瘢痕指標は、赤色〜オレンジ色の線維：緑色〜黄色の線維の比（より大きい数は瘢痕化の増加を表わす）の計算によって、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアで定量化した。
リアルタイムＰＣＲ
ＲＮＡ抽出は、製造業者の推奨に従ってＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して尾皮膚で実行した。ＲＮＡの質及び量は、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ；Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して査定した。ＴａｑＭａｎ逆転写酵素キット（Ｒｏｃｈｅ、Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、ＮＪ）を使用して、単離されたＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、群間の遺伝子発現の相対的発現を、以前に記載されたように、デルタ−デルタＣＴ ＰＣＲ解析を使用してそしてＧＡＰＤＨのＲＮＡ増幅の使用により遺伝子発現を正規化して、実行した。Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．３：１１０１−１１０８（２００８）。相対的発現は、式：２［−（Ｃｔ対象となる遺伝子−Ｃｔ内在性対照）サンプルＡ−（Ｃｔ対象となる遺伝子−Ｃｔ内在性対照）サンプルＢ］を使用して計算した。すべてのサンプルは三重で実行した。対象となるＰＣＲ標的のために使用されたプライマーは、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＴＧＦ−β１、及びＩＦＮ−γのためのもの（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ（ＣＡ））であった。
ＲＯＳのインビボ検出及び血管透過性についてのＭｉｌｅｓアッセイ
ＲＯＳのインビボの検出は、Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．ｄｏｉ：１０．３７９１／３９２５（２０１２））によって記載されたようにＮＡＤＰＨオキシダーゼの生物発光画像化によって実行した。簡潔には、ＰＢＳ中で溶解したＬ−０１２（ルミノールの類似体）（２０μｇ／ｇ）をＰＬＮＤ後の異なるタイムポイントでマウスに全身的に注射し、ＰＬＮＤ外科手術部位でＲＯＳを表わす発光シグナルを画像化し、ＩＶＩＳスペクトル２００（Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して定量化した。記載されたように血管透過性についてのＭｉｌｅｓアッセイを実行した。Ｒａｄｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．ｄｏｉ：１０．３７９１／５００６２（２０１３）。簡潔には、２００μｌの０．５％の滅菌されたエバンスブルーを、２週間タクロリムスで治療されたＰＬＮＤマウスへ尾静脈を介して注射した。３０分後に、ＰＬＮＤ後肢を画像化してエバンスブルー漏出を観察した。後肢を切除し、５５℃で４８時間ホルムアミド中でインキュベーションしてエバンスブルーを抽出した。抽出されたエバンスブルーは、６１０ｎｍで吸光度を測定することによって定量化した。
統計解析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して、データを分析及び提示した。値は、特に断りのない限り、平均±標準偏差として表示される。統計的有意差をｐ≦０．０５で設定し、２つの群の間の差をＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により査定し、一方で群内の比較のために事後検定によるＡＮＯＶＡを使用して複数の分析を実行した。
結論
ＣＤ４+Ｔ細胞がリンパ浮腫病理において重要な役割を果たすので、この研究の目的は、リンパ浮腫の予防及び治療のための局所的なタクロリムスの有効性を評価することであった。本出願人は、記載されたリンパ浮腫のマウス尾モデルに加えて、以前に記載された膝窩リンパ節郭清（ＰＬＮＤ）からもたらされるリンパ管損傷のモデルを適切に使用して、局所的なタクロリムスが、慢性的な炎症応答を減少させ、組織及びリンパの線維化を減少させ、集合リンパ管の駆出を増加させ、及び側副リンパ管形成を増加させることによって、リンパ管損傷後のリンパ浮腫の発症を強力に予防することを示した。先行する実験的な試みが主として外来性リンパ管新生増殖因子を使用してリンパ管再生を増加させることに注目したので、これらの所見はリンパ浮腫の治療について重要な意味合いを有する。
タクロリムスが、リンパ管損傷後の真皮及び皮下のＴ細胞浸潤及び組織線維化を強力に減少させることも見出された。これらの変化はリンパ浮腫の発症を予防し、一旦リンパ浮腫が確立されたならば病理学的な変化を回復させることができる。タクロリムスによる治療は、側副リンパ管の形成を増加させることによって、及び集合リンパ管の駆出頻度を増加させることによって、リンパ機能を増加させる。本出願人の知識によれば、これは、外科手術後のリンパ浮腫を予防及び治療する、初めての標的化された局所的な薬理学的手段である。
外科手術直後に、先に適用された場合のタクロリムスがより効果的であることが見出され、この治療は確立している病理が回復することを要求しなかったという事実をおそらく反映する。この所見は、予防の方が組織学的変化の回復よりもはるかに効果的である他の線維増殖性障害（肝線維症等）における先行する研究と一致している。Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４３：Ｓ８２−Ｓ８８（２００６）。
実施例２．ピルフェニドンを使用するリンパ浮腫の治療及び予防
ピルフェニドンは尾のリンパ浮腫を減少させる
マウス尾の表在リンパ管及び深部リンパ管の破壊は、外科手術の２週間後にほぼ８０％の尾体積の増加をもたらした（図１９Ａ、１９Ｂ）。この時点での膨潤は主として間質液の蓄積に起因することが、以前に本出願人により示されている。Ａｖｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．２７：１１１４−１１２６（２０１３）。尾における慢性的なリンパ管閉塞は、続く４週間にわたって、脂肪線維組織による間質液の段階的な置き換え及び炎症細胞の蓄積をもたらす。Ａｖｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．２７：１１１４−１１２６（２０１３）。これらの病理学的な変化は臨床的リンパ浮腫を非常によく反映し、一旦リンパ浮腫が確立されれば、追加の少なくとも８〜１０週間の間持続する。この知識に基づいて、これらの確立された軟組織変化を治療する意図で、リンパ浮腫が確立するように外科手術後に７週間待機し、次いでピルフェニドンによる治療を開始した。最初に全身的な治療により開始したが、これは、ピルフェニドンについての大部分の先行研究がこの投与経路を線維症の治療のために使用するからである。しかしながら、一旦効果的な治療としてピルフェニドンが確立されたならば、局部投与は、全身治療に起因する任意の可能性のある副作用を最小限にすることで好ましいので、局所製剤を開発した。全身的及び局所的なピルフェニドンによる治療は、対照と比較して、肉眼的な尾膨潤、尾体積、及び軟組織厚みを著しく減少させた（図１９Ａ〜１９Ｃ、１９Ｅ；両方の治療群で、尾体積についてｐ＜０．０１及び厚みについてｐ＜０．０５）。
ピルフェニドンは尾におけるリンパ機能を増加させる
尾モデルにおけるリンパ浮腫の治療のピルフェニドンの有効性を考慮して、次にピルフェニドンがリンパ管損傷後のリンパ機能を調節するかどうかを研究することにした。99Ｔｃリンパ管シンチグラフィー（放射性トレーサーを尾遠位部中に注射する技法）を使用して、９０分間にわたる仙骨リンパ節による取り込みを測定した。全身的及び局所的なピルフェニドン治療動物における仙骨リンパ節の崩壊補正取り込みは、対照と比較して、ピルフェニドン治療動物における99Ｔｃ取り込みのほぼ４倍の増加を実証した。加えて、全身的及び局所的に治療された動物は、ピークのリンパ節取り込みのほぼ４倍の増加を実証した（図１９Ｇ；両方についてｐ＜０．０１）。同様に、崩壊補正曲線の勾配の増加によって示されるように、全身的及び局所的に治療された動物における取り込みの率の増加があった（図１９Ｈ；それぞれｐ＜０．０１及びｐ＜０．０５）。
ピルフェニドンはリンパ管損傷後の尾における炎症及び線維化を減少させる
慢性炎症は、臨床的なリンパ浮腫の組織学的特徴であり、炎症細胞（特にＴヘルパー細胞）の蓄積の増加によって特徴づけられる。Ａｖｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．２７：１１１４−１１２６（２０１３）；Ｚａｍｐｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ４９９４０（２０１２）；Ｇｈａｎｔａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３０８：Ｈ１０６５−１０７７（２０１５）；Ｏｌｓｚｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌｙｍｐｈｏｌｏｇｙ ２３：２３−３３（１９９０）。このことと一致して、全身的及び局所的に治療された両方の動物では、対照と比較して、真皮及び皮下脂肪に浸潤する白血球の数が著しく減少したことが見出された。対照動物から採取されたリンパ浮腫性組織中の炎症細胞は毛細管及び集合リンパ管に非常に接近して位置したが、ピルフェニドン治療マウス中で実質的には存在しなかった。同様に、浸潤するＣＤ３+細胞及びＣＤ４+細胞の数の著しい減少が、本出願人により指摘された（図２０Ａ、２０Ｄ；両方についてｐ＜０．００１）。さらに、ＩＦＮ−γタンパク質（強力な抗リンパ管新生性であることが以前に見出された、Ｔヘルパー（Ｔｈ）１細胞産生サイトカイン）の蓄積の有意な減少が、指摘された（図２０Ｊ；ｐ＜０．０１）。Ｋａｔａｒｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３４：９６−１０７（２０１１）；Ｓｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．２６：５６８−５７４（２００６）。
加えて、リンパ管損傷から遠位の組織中でマクロファージが蓄積することが、以前に本出願人により示された。Ｚａｍｐｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ４９９４０（２０１２）。マクロファージが線維化（主としてＴＧＦ−β１を介する）を調節し、リンパ管新生（ＶＥＧＦ−Ｃを介する）を調節するので、マクロファージ浸潤に対するピルフェニドンの効果を分析した。対照と比較して、全身的及び局所的の両方のピルフェニドン治療によるリンパ浮腫性の尾組織において、Ｆ４／８０+細胞浸潤における差は見出されなかった。このことと一致して、ピルフェニドンによる治療後にＶＥＧＦ−Ｃタンパク質蓄積における差は見出されなかった（図２０Ｋ；ｐ＝有意差なし）。総合すると、これらの所見は、リンパ管損傷後に多数の炎症細胞（特にＴ細胞）が皮膚／皮下のリンパ管に非常に接近して蓄積し、この応答が全身的及び局所的なピルフェニドン治療によって緩和されることを示す。
リンパ浮腫に罹患する患者は進行性の軟組織線維化を有し、線維化の程度は疾患の重症度と臨床的に相関する。Ｔａｓｓｅｎｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｌｙｍｐｈａｔ．Ｒｅｓ．Ｂｉｏｌ．７：１４５−１５１（２００９）。他の線維化疾患と一致して、ＴＧＦ−β１がリンパ浮腫における重要な線維化促進増殖因子であることが、以前に本出願人により示された。Ａｖｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７７：３２０２−３２１４（２０１０）。加えて、ＴＧＦ−β１がＬＥＣに対する直接的な抗リンパ管新生効果を有することが、本出願人により示された。Ｃｌａｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９５：Ｈ２１１３−Ｈ２１２７（２００８）。したがって、ＴＧＦ−β１+細胞の浸潤及びその活性化された下流のシグナリング分子（ｐＳＭＡＤ３）の細胞発現を分析した。全身的及び局所的なピルフェニドン治療群において、対照と比較して、ＴＧＦ−β１+細胞及びｐＳＭＡＤ３+細胞の両方の蓄積の著しい減少が見出された（図２０Ｂ、２０Ｃ、２０Ｅ、２０Ｆ；すべてについてｐ＜０．００１）。このことと一致して、ピルフェニドンによる治療後にＴＧＦ−β１タンパク質蓄積の蓄積減少が見出された（図２０Ｉ；ｐ＜０．０５）。これは、両方の治療群において、対照マウスと比較して、真皮及び皮下のＩ型コラーゲン沈着の有意な減少と相関した（図１９Ｄ、１９Ｆ；全身的についてｐ＜０．００１及び局所的にについてｐ＜０．０５）。
集合リンパ管における構造変化（平滑筋の肥大、Ｉ型コラーゲンの厚い層、管腔の狭窄）が、リンパ浮腫に罹患するヒト患者において記載されているので、類似する変化について実験中の動物の集合リンパ管を検査した。Ｍｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７：ｅ４１１２６（２０１２）。これらのヒト研究と一致して、集合リンパ管（α−ＳＭＡ+／ポドプラニン+）はＩ型コラーゲンの厚い層によって囲まれたが、ピルフェニドン治療動物は本質的に正常なリンパ管を有していた（図２０Ｈ）。
ピルフェニドンは後肢におけるリンパ機能を増加させる
ピルフェニドンがリンパ機能を増加させるメカニズムを理解するために、マウス後肢のＰＬＮＤモデルを使用して、毛細リンパ管における皮膚逆流及び集合リンパ管の駆出能力を分析した。Ｂｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．１３９：８１−８６（２０１３）。ＰＬＮＤの４週間後にＮＩＲリンパ管造影法を使用して、２週間の全身的なピルフェニドンにより治療された動物は、ベヒクルに治療された対照と比較して、皮膚逆流及び毛細管管漏出が著しく少ないことが見出された（図１８Ａ、白色矢印）。加えて、ピルフェニドン治療動物では、対照と比較して、集合リンパ管収縮率が有意に増加していた（２倍の増加；図１８Ａ、１８Ｂ；ｐ＜０．００１５）。この応答は、尾モデルによる本出願人の所見に類似して、ピルフェニドンにより治療されたマウスにおける炎症細胞のリンパ周囲の浸潤の有意な減少と相関した（図１８Ｅ（上部パネル）、図１８Ｆ；ｐ＜０．０１）。加えて、ピルフェニドンによる治療は、炎症細胞によるｉＮＯＳのリンパ周囲での発現の有意な減少をもたらした（図１８Ｅ（下部パネル）、図１８Ｇ；ｐ＜０．０１）。炎症の状況におけるリンパ周囲のｉＮＯＳ蓄積の増加は、正常な統合されたリンパ管収縮性のために重要な正常な一酸化窒素勾配を破壊することが示されているので、これは重要な所見である。Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０８：１８７８４−１８７８９（２０１１）。これはピルフェニドンがどのようにリンパ管収縮性を改善するのかに関して重要なメカニズムを提供する。
ピルフェニドンは側副リンパ管形成を増加させる
Ｔ細胞（特にＴｈ１及びＴｈ２サイトカイン）が、リンパ節のリンパ管新生及び創傷修復の間の炎症性リンパ管新生を強力に阻害することが公知であるので、次にピルフェニドンによる治療が側副リンパ管の形成を増加させるかどうかを決定することにした。Ｋａｔａｒｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３４：９６−１０７（２０１１）；Ｃｌａｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９５：Ｈ２１１３−Ｈ２１２７（２００８）；Ｚａｍｐｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３０２：Ｃ３９２−Ｃ４０４（２０１２）；Ｓａｖｅｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０：ｅ０１２６９０８（２０１５）。確かに、ＬＹＶＥ−１の免疫蛍光の染色を使用するリンパ管の組織学的分析及び同定により、尾及び後肢の両方におけるリンパ管密度の著しい増加が実証された（図１８Ｄ、１８Ｅ；ｐ＜０．００１）。対照と比較して、ピルフェニドン治療リンパ浮腫性の尾におけるＶＥＧＦ−Ｃタンパク質分析の差が指摘されないが、抗リンパ管新生Ｔ細胞サイトカイン（ＩＦＮ−γ及びＴＧＦ−β１等）の重大な減少があったので、このリンパ管新生応答はＶＥＧＦ−Ｃ発現に非依存性であると思われた（図２０Ｅ、２０Ｉ、２０Ｋ；ＴＧＦ−β１についてｐ＜０．０５、ＩＦＮ−γについてｐ＜０．０１、及びＶＥＧＦ−Ｃについてｐ＝有意差なし）。
ピルフェニドンを伴うＴＧＦ−β１免疫療法はリンパ機能を更に改善しない
ピルフェニドンの主要な作用メカニズムがＴＧＦ−β１活性の遮断であることをを考慮して、分離した研究において、ＰＬＮＤ後のピルフェニドン治療の効果をＴＧＦ−β１免疫療法と比較した。Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｒｅｖ．２０：８５−９７（２０１１）。ＮＩＲ画像化を使用して、ＴＧＦ−β１免疫療法単独に加えて、ＴＧＦ−β１免疫療法とピルフェニドンの組み合わせが、イソタイプ対照と比較して、皮膚逆流を減少させ、集合リンパ管収縮率を有意に増加させることが見出された。より重要なことには、免疫療法単独と比較して、組み合わせ療法による追加の利益は無く、利用した用量で最大にＴＧＦ−β１を阻害していたことが指摘される（図２１Ａ〜２１Ｃ；ｐ＝有意差なし）。同様に、フローサイトメトリーを使用して、ＴＧＦ−β１免疫療法単独に加えて、ＴＧＦ−β１免疫療法とピルフェニドンの組み合わせが、イソタイプ対照と比較して、リンパ管損傷から遠位でのＴヘルパー細胞の組織内蓄積を有意に減少させたが、免疫療法単独と比較して、組み合わせ療法による追加はなかったことが見出された。
Ｔ細胞からのＴＧＦ−β１のノックアウトは、リンパ管損傷後の尾における、尾リンパ浮腫を減少させ、リンパ機能を改善し、炎症及び線維化を減少させる
リンパ浮腫の状況におけるＴＧＦ−β１の細胞性源を決定するために、Ｔ細胞及び骨髄球からのＴＧＦ−β１産生の選択的ノックアウトを備えた遺伝子導入マウスを開発した。これらの遺伝子導入マウスの表現型の確認は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、対照マウスと比較して、Ｔ細胞cre及び骨髄系creマウスからそれぞれ単離されたＴ細胞及び骨髄系細胞からのＴＧＦ−β１発現の有意な減少を示したことで確認された（図２１Ａ；両方についてｐ＜０．０５）。尾の外科手術を実行し、外科手術の６週間後に解析を実行した。Ｔ細胞creマウスは、骨髄系creマウス及び対照マウスと比較して、肉眼的な尾膨潤、尾体積、及び脂肪線維の厚みが著しく減少していた（図２１Ｂ〜２１Ｄ；尾体積及びｐについてｐ＜０．０１、厚みについて＜０．０５）。99Ｔｃリンパ管シンチグラフィーの解析により、Ｔ細胞creマウスの仙骨リンパ節におけるトレーサーの崩壊補正取り込みが、骨髄系creマウス及び対照マウスと比較して、ほぼ４倍に増加したことが実証された。同様に、Ｔ細胞creマウスにおいて、骨髄系creマウス及び対照マウスと比較して、ピークのリンパ節取り込みに加えてトレーサー取り込み率の増加があった（図２１Ｅ〜２１Ｆ；それぞれｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１）。
以前に、リンパ浮腫の尾モデルにおけるＴＧＦ−β１免疫療法が、線維化の減少に加えて、炎症（特にＴヘルパー細胞の組織浸潤）の減少をもたらすことが、本出願人により示された。Ａｖｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７７：３２０２−３２１４（２０１０）。興味深いことには、Ｔ細胞creマウスは、骨髄系creマウス及び対照マウスと比較して、真皮及び皮下脂肪を浸潤するＴヘルパー細胞の数を著しく減少させた（図２２Ａ、２２Ｂ；ｐ＜０．０１）。さらに、ピルフェニドン治療動物における本出願人の所見に類似して、ＩＦＮ−γタンパク質の蓄積の有意な減少が指摘された（図２２Ｄ；ｐ＜０．０１）。ＴＧＦ−β１+細胞及びタンパク質蓄積に加えて、その活性化された下流のシグナリング分子（ｐＳＭＡＤ３）の細胞発現の解析により、骨髄系creマウス及び対照マウスと比較して、Ｔ細胞creマウスにおいて著しく減少することが見出された（図２２Ａ、２２Ｃ、２２Ｅ；ｐＳＭＡＤ３についてｐ＜０．０１及びＴＧＦ−β１タンパク質についてｐ＜０．０５）。すべての群の間で、Ｆ４／８０+細胞又はＶＥＧＦ−Ｃタンパク質蓄積において差は見出されなかった（図２２Ｆ；ｐ＝有意差なし）。これは、Ｔ細胞creマウスにおいて、骨髄系creマウス及び対照マウスと比較して、真皮及び皮下のＩ型コラーゲン沈着の有意な減少と相関した（図２１Ｄ；ｐ＜０．０５）。骨髄系creマウスにおいて炎症、線維化、及び抗リンパ管新生性サイトカイン発現が減少する傾向性があるように思われたが、それは有意ではなかった。リンパ浮腫におけるＴＧＦ−β１の主要な細胞性源がＴ細胞であると指摘されるので、これらの所見は重要である。
ＬＥＣのＴＧＦ−β１応答性の低下は、リンパ管損傷後の尾における尾リンパ浮腫、炎症、又は線維化を変化させなかった
リンパ浮腫の状況におけるＬＥＣに対するＴＧＦ−β１の直接効果を分析し、インビボのモデルへ本出願人の先行するインビトロの所見を適用するために、ＦＬＴ４Creマウスで尾の外科手術を実行し、外科手術の６週間後に解析を実行した。Ａｖｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．１２４：４３８−４５０（２００９）。これらの遺伝子導入マウスの表現型の確認を、ＬＹＶＥ−１及びｐＳＭＡＤ３についてのリンパ節に対する染色により確認した。ＦＬＴ４CreマウスはＬＥＣ上に検出可能なｐＳＭＡＤ３染色を有しておらず、ＴＧＦ−β１へのＬＥＣの不反応性を示す（図２３Ａ、白色矢印はｐＳＭＡＤ３+ＬＥＣを示す）。ＦＬＴ４Creマウスは、対照マウスと比較して、肉眼的な尾膨潤、尾体積、及び脂肪線維の厚みにおける差を有していなかった（図２３Ｃ〜２３Ｅ、２３Ｇ；ｐ＝有意差なし）。興味深いことに、そして本出願人の先行するインビトロの所見に類似して、創傷の架橋部分においてリンパ管密度の増加が見出された（図２３Ｈ；ｐ＜０．０１）。Ｃｌａｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９５：Ｈ２１１３−Ｈ２１２７（２００８）。創傷の架橋部分は皮膚リンパ管がすべて外科手術により除去された領域である。したがって、これは、リンパ浮腫の状況におけるＴＧＦ−β１へのＬＥＣの不反応性の結果としての改善されたリンパ管新生を指摘する。
ＦＬＴ４Creマウスと対照マウスとの間の炎症性の浸潤細胞及びサイトカイン蓄積の解析により、ＣＤ４+細胞及びＩＦＮ−γタンパク質蓄積（両方についてｐ＝有意差なし）、Ｆ４／８０+細胞又はＶＥＧＦ−Ｃタンパク質蓄積（ｐ＝有意差なし）、ＴＧＦ−β１+細胞及びタンパク質蓄積（図２３Ｂ；ｐ＝有意差なし）に加えて、その活性化された下流のシグナリング分子（ｐＳＭＡＤ３）の細胞発現（図２３Ｇ；ｐ＝有意差なし）において差は示されなかった。同様に、Ｉ型コラーゲン沈着は、ＦＬＴ４Creマウスと対照マウスとの間に有意に異なっていなかった（図２３Ｆ、２３Ｇ；ｐ＝有意差なし）。これらの所見により、炎症、線維化及び最終的にリンパの機能不全の促進におけるＴＧＦ−β１の主要効果は細胞間マトリックス中にあり、一方で直接的な抗リンパ管新生はリンパ浮腫の状況において比較的マイナーな役割を果たすことが示唆される。
方法
研究デザイン
本出願人の仮説は、ＴＧＦ−β１の阻害によってリンパ浮腫を治療し、それによって炎症及び線維化の両方を減少させることができるということであった。複数の異なる動物モデルにおいてこの仮説の異なる態様を調査して、傷害後の膨潤、炎症、線維化、リンパ管機能、及びリンパ管新生を詳細に査定することを可能にした。成体メス（１０〜１４週齢）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）を、光及び温度を制御した病原体不含有環境において維持し、自由摂食させた。すべての研究はＭｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒの研究機関内動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって認可された。尾の外科手術を受けた後に、尾遠位部が壊死したならば、動物を実験から除外した。動物を治療群又は対照群へ無作為化する前に、この評価を行った。各々の実験を最低でも６〜８匹の動物を使用して実行し、アッセイを三重で実行した。すべてのカウントは、介入に対して盲検化された審査員によって実行した。
動物モデル及び治療
十分に記載されたリンパ浮腫のマウス尾モデルを使用するリンパアブレーション（尾の中間部分で２ｍｍの環状の皮膚切除を介して尾の表在リンパ系及び深部リンパ系を切除する）を、動物に行った。Ｃｌａｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９５：Ｈ２１１３−Ｈ２１２７（２００８）；Ａｖｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７７：３２０２−３２１４（２０１０）；Ｒｕｔｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．７２：１６１−２７１（２００６）；Ｔａｂｉｂｉａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｍｅｄ．３：ｅ２５４（２００６）。本出願人のグループ及び他のグループは、このモデルが、少なくとも手術後１０週間の間、尾遠位部の持続的リンパ浮腫、リンパ機能における重度の不全、及び臨床的なリンパ浮腫の組織学的特色（例えば慢性炎症、脂肪の沈着、線維化）をもたらすことを以前に示した。Ｃｌａｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９５：Ｈ２１１３−Ｈ２１２７（２００８）；Ａｖｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７７：３２０２−３２１４（２０１０）；Ｒｕｔｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．７２：１６１−２７１（２００６）；Ｔａｂｉｂｉａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｍｅｄ．３：ｅ２５４（２００６）。外科手術の７週間後に（リンパ浮腫が確立された時）、動物を実験（ピルフェニドン）群又は対照群へ無作為化し、以下で略述されるように、３週間の間１日１回治療し続いて解析した。
尾モデルは、組織学的組織変化（すなわち線維化及び脂肪沈着）の分析のために有用であるが、集合管が小口径であることに起因して、このモデルはリンパ管のポンプ機能の分析については理想的ではない。したがって、集合リンパ管のリンパの駆出能力の回復におけるピルフェニドンの有効性を決定するために、及びリンパ管損傷ゾーンから遠位の組織におけるリンパの増殖に対するこの治療の効果を分析するために、以前に記載されたように膝窩リンパ節郭清（ＰＬＮＤ）を実行した。Ｂｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．１３９：８１−８６（２０１３）。簡潔には、後足の中への５０μｌの３％のエバンスブルーの注入後に、リンパ管を可視化した。膝窩領域中の集合リンパ管を膝窩リンパ節と一緒に切除した。外科手術の２週間後に、動物を、２週間の間の１日１回の全身的なピルフェニドン又は対照による治療へ無作為化し、続いて解析した。
全身的な実験において、マウスは、ＰＢＳ中の１０％のＤＭＳＯ／０．５％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）中で溶解された用量４００ｍｇ／ｋｇのピルフェニドン（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）、又はベヒクル（ＰＢＳ中の１０％のＤＭＳＯ／０．５％のＣＭＣ）のいずれかにより、経口的に毎日治療した。この用量は、線維化の様々なモデルにおいて効果的な治療レジメンを示す先行研究に基づいて決定した。Ｏｋｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５９０：４００−４０８（２００８）；Ｋａｋｕｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．２４：５７−６５（２００４）；Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｓｔ １４２：１０１１−１０１９（２０１２）。ピルフェニドンの局所製剤を、Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ＣｅｎｔｅｒのＲｅｓｅａｒｃｈ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙと共同して開発した。これらの実験において、マウスを４１％のワセリン中の１ｍｇ／ｍｌの局所的なピルフェニドン（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）により毎日治療し、一方で対照動物にベヒクル単独（４１％のワセリン）を投与した。
リンパ浮腫におけるＴＧＦ−β１の細胞性源を調査するために、Ｔ細胞及び骨髄球からのＴＧＦ−β１産生の選択的ノックアウトを備えた非誘導性遺伝子導入マウスを開発した。Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から、Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（Ｌｃｋ−ｃｒｅ）５４８Ｊｘｍ／Ｊ（Ｌｃｋ（リンパ球タンパク質チロシンキナーゼ）プロモーターの制御下でＣｒｅを発現し、ｌｏｘＰが隣接する対象となる配列の胸腺細胞特異的切り出しを可能にする）を購入した。Ｌｃｋ遺伝子は、主としてＴリンパ球（Ｌｃｋ遺伝子が細胞内シグナル伝達経路に関与するタンパク質のチロシン残基をリン酸化するところ）によって発現される。加えて、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から、Ｂ６．１２９Ｐ２−Ｌｙｚ２ｔｍ１（ｃｒｅ）Ｉｆｏ／Ｊ遺伝子導入系統（リゾチーム２遺伝子（Ｌｙｚ２）の第１のコーディングＡＴＧの中へ核局所化Ｃｒｅリコンビナーゼが挿入されたＬｙｓＭｃｒｅノックイン対立遺伝子を備え、内在性Ｌｙｚ２遺伝子機能を消失させ、ＮＬＳ−Ｃｒｅ発現を内在性Ｌｙｚ２プロモーター／エンハンサーエレメントの制御下に置く）を購入した。これらの遺伝子導入マウスの各々を、Ｔｇｆｂ１tm2.1Doe／Ｊ変異マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）（ＴＧＦ−β１遺伝子のエクソン６に隣接するｌｏｘＰ部位を保有する）と交配した。結果として、Ｃｒｅ媒介性の組換えは、Ｔリンパ球系譜及び骨髄系細胞系譜（単球、成熟マクロファージ及び顆粒球が含まれる）中での標的化された遺伝子（ＴＧＦ−β１）の欠失をもたらす。
ＬＥＣに対するＴＧＦ−β１の直接効果を調査するために、ＬＥＣ上での非機能的なＴＧＦ−β受容体を備えた誘導可能な遺伝子導入マウスを開発した。ＦＬＴ４ｃｒｅマウス（Ｓａｇｒａｒｉｏ Ｏｒｔｅｇａ博士の寄贈）を使用し、これらのマウスにおけるＶＥＧＦＲ−３のＦｌｔ４プロモーターは、エストロゲン受容体タイプ２（ＥＲ２）の制御下にあり、成体マウスにおいてすべてのＬＥＣによって高発現される。Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｃｏｒｒａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０９：６２２３−６２２８（２０１２）。ＦＬＴ４ｃｒｅマウスを、Ｂ６；１２９−Ｔｇｆｂｒ２ｔｍ１Ｋａｒｌ／Ｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）変異マウス（トランスフォーミング増殖因子ベータ受容体ＩＩのエクソン４に隣接するｌｏｘＰ部位を持つ）と交配した。タモキシフェン（３００ｍｇ／ｋｇ／日、皮下で５日間）を使用して、成体メスＦＬＴ４ｃｒｅマウスにおいて、Ｃｒｅ発現を誘導した。
すべての遺伝子導入マウスについて、両方の導入遺伝子の遺伝子発現をジェノタイピング（Ｔｒａｎｓｎｅｔｙｘ、Ｍｅｍｐｈｉｓ、ＴＮ）によって確認し、二重ホモ接合体マウスを６世代にわたって戻し交配して一貫性を確実にした。加えて、本出願人の研究室は、ＰＣＲを使用する遺伝子発現、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用するタンパク質定量、及び組織学的染色により、新しく開発した遺伝子導入モデルのすべてについて、確認のための表現型研究を実行した（以下を参照）。
尾体積、リンパ管シンチグラフィー、及び組織学的分析
尾体積は、リンパ管損傷ゾーンから遠位で複数のデジタルキャリパーによる尾円周測定を使用して分析し、以前に記載されたように円錐台式を使用して計算した。Ｃｌａｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９５：Ｈ２１１３−Ｈ２１２７（２００８）。リンパ管シンチグラフィーも以前に記載されたように実行して、尾遠位部の中へ５０μｌの濾過されたテクネチウム（Ｔｃ99m）硫黄コロイドを注射することによって仙骨リンパ節へのリンパの流れを定量化した。Ａｖｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．２７：１１１４−１１２６（２０１３）。Ｘ−ＳＰＥＣＴカメラ（Ｇａｍｍａ Ｍｅｄｉｃａ、Ｎｏｒｔｈｒｉｄｇｅ、ＣＡ）を使用して、崩壊補正取り込みを仙骨リンパ節において記録し、ＡＳＩＰｒｏソフトウェア（ＣＴＩ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ、Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ、ＴＮ）を使用して対象となる領域の解析を実行した。Ｃｌａｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９５：Ｈ２１１３−Ｈ２１２７（２００８）。
組織学的分析及び免疫組織化学的分析のために、尾切片を採取し、４％の氷冷パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中で短時間固定し、５％のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）を使用して脱灰し、パラフィン中に包埋した。標準的な技法を使用してヘマトキシリン−エオシン切片を調製し、１群あたり最低６匹の動物において２名の盲検化された審査員により尾の４つの四半部分の皮膚及び軟組織の厚みを測定することによって、皮下組織の厚みを標準化された組織学的横断切片において定量化した。
免疫組織化学的染色を本出願人の確立した技法に従って実行した。Ａｖｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７７：３２０２−３２１４（２０１０）。パラフィン包埋組織を湿らせ、抗原のマスキングの除去を沸騰クエン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して実行し、続いて２％のＢＳＡ／２０％動物血清により内在性ペルオキシダーゼ活性をクエンチングした。組織を一次抗体により４℃で一晩インキュベーションした。免疫組織化学の染色のために使用された一次抗体は、ＬＹＶＥ−１、ＣＤ４５、及びＣＤ４（すべてＲ＆Ｄ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮから）、Ｆ４／８０、ＴＧＦ−β１、ｐＳＭＡＤ３、ポドプラニン（すべてＡｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡから）、アルファ−ＳＭＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ｉＮＯＳ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）、ならびにＣＤ３（Ｄａｋｏ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）を含んでいた。すべての二次抗体はＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。スライドは、Ｍｉｒａｘスライドスキャナー（Ｚｅｉｓｓ、Ｍｕｎｉｃｈ、ドイツ）を使用してスキャンした後に分析した。Ｉ型コラーゲンの免疫組織化学を、マウスＩ型コラーゲンへの抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を使用して実行し、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈオフラインソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して、固定した閾値内で陽性染色された真皮面積対全組織面積の比として定量化した。細胞カウントは、２名の盲検化された審査員によって、最小で１群あたり４〜６匹の動物及び４〜５ＨＰＦ／動物で高倍率切片上で実行した。
タンパク質分析
タンパク質分析のための尾組織をリンパ管損傷から１．５ｃｍ遠位で採取し、急速凍結し、粉砕し、ホスファターゼ及びプロテアーゼ阻害因子（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）と混合された組織抽出タンパク質試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）により抽出した。サンプル（ｎ＝３〜５動物／群）からの２０〜３０ｍｇのタンパク質をＥＬＩＳＡによって分析して、製造業者のプロトコール（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に従ってＴＧＦ−β１、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、及び血管内皮増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）を定量化した。すべての実験は二重で実行した。
リンパ管機能のインビボ画像化
後肢の集合リンパ管の収縮性を査定するために、１５μｌの０．１５ｍｇ／ｍｌのインドシアニングリーン（ＩＣＧ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を後足の背面において皮内で注射した後、近赤外画像化（ＮＩＲ）によりビデオを録画した。注入後２０分間放置して集合管の中への取り込みを可能にした。次いでカスタムメイドのＥＶＯＳ ＥＭＣＣＤカメラ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）及びＬＥＤ光源（ＣｏｏｌＬＥＤ、Ａｎｄｏｖｅｒ、英国）を使用して、動物を画像化した。Ｚｅｉｓｓ Ｖ１２ Ｓｔｅｒｅｏｌｕｍａｒ顕微鏡（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）を使用してビデオ画像を得た。８秒ごとに３０分間画像を得た。リンパ管のポンプ機能は、Ｆｉｊｉソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤによって開発された無料のオープンソースデータ解析ツール）を使用して分析した。対象となる領域を主要な集合管にわたって選択し、ノイズを引いた蛍光強度を経時的にプロットした。内因性のポンプ機能を評価するために、各々のビデオの最初の１０分間はポジショニングからのリンパ管の刺激に起因して除外し、各々のビデオの最後の２０分間のみを分析した。ポンプ機能は毎分の拍動で定量化した。
遺伝子発現ＰＣＲ
Ｔ細胞及び骨髄球からのＴＧＦ−β１のノックアウトの表現型を確認するために、脾臓をこれらのマウスから採取した。正の選択のＣＤ３磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を使用して製造者の推奨に従って、Ｔ細胞cre遺伝子導入マウスの脾臓から、Ｔ細胞を単離した。同様に、正の選択のＣＤ１１ｂ磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を使用して製造者の推奨に従って、骨髄系cre遺伝子導入マウスの脾臓から、骨髄系細胞を単離した。次いで単離された細胞をＴＲＩｚｏｌ中に設置した。標準的なＴＲＩｚｏｌ抽出手順を使用してＲＮＡを単離した。Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（１９８７）；Ｒｉｂａｕｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．）Ｃｈａｐｔｅｒ １０，Ｕｎｉｔ １０ １１（２００１）。ＴａｑＭａｎ逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して逆転写、続いてＴａｑＭａｎユニバーサルマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒサーモサイクラー（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用して定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を実行した。ＴＧＦ−β１発現レベルをＧＡＰＤＨに対して正規化した。実験は三重で実行した。
ＴＧＦ−β１活性の修飾
ピルフェニドンの主要な作用メカニズムがＴＧＦ−β１活性の遮断であることを先行研究が示唆したので、分離した研究において、ＰＬＮＤ後のピルフェニドン治療の効果をＴＧＦ−β１免疫療法と比較した。Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｒｅｖ．２０：８５−９７（２０１１）。重要なことには、ＴＧＦ−β１に対するモノクローナル抗体がＴＧＦ−β１生物学的活性の中和に効果的であるだけでなく、この治療がリンパ浮腫を著しく減少させ、リンパ機能を改善することが、以前に本出願人によって示された。Ａｖｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７７：３２０２−３２１４（２０１０）。上で略述されたように動物にＰＬＮＤを行い、外科手術の２週間後に、ＴＧＦ−βモノクローナルマウス中和抗体単独（ＴＧＦｍａｂ；クローン１Ｄ１１；Ｂｉｏ−ｘ−ｃｅｌｌ、Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＨ）又は１５０μｌのＰＢＳ中で希釈した用量５ｍｇ／ｋｇのピルフェニドン＋ＴＧＦｍａｂのいずれかによる治療へ無作為化し、１週間あたり３回腹腔内に送達した。Ｒｕｚｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ．２５：２３５−２５７（２００３）。対照動物は、ピルフェニドンについてのベヒクル対照、又はＴＧＦｍａｂと同じスケジュールで腹腔内で送達された非特異的イソタイプ抗体のいずれかにより治療した。
統計解析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）ソフトウェアを使用して、統計解析を実行した。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を２つの群の間で差を比較するために使用した。事後検定による二元配置ＡＮＯＶＡを使用して複数のタイムポイントの間の解析（リンパ管シンチグラフィー）を実行して、個々の群を比較した。記述的分析及びグラフ法を使用して結果を分析及び要約した。データは特に断りのない限り平均±標準偏差として表示し、ｐ＜０．０５で有意であると判断した。
結論
この研究の１つの目的は、リンパ浮腫及びリンパ管損傷の前臨床マウスモデルにおいてリンパ浮腫の治療に対するピルフェニドンの有効性を分析することであった。２つの異なるマウスモデルを使用して、確立されたリンパ浮腫の全身的及び局所的なピルフェニドン治療は、線維化を著しく減少させること及びリンパ機能を改善することが示された。ピルフェニドンによる治療は、リンパ節切除後に、慢性的な炎症反応を減少させ、リンパ集合管の駆出能力を著しく増加させる。加えて、ピルフェニドンは、リンパ管損傷後の線維化の予防に極めて効果的であり、おそらくこの応答はＴＧＦ−β１の阻害に対して二次的なものである。本出願人のＰＬＮＤモデルにおいてＴＧＦ−β１免疫療法を使用して、ピルフェニドンの主要な効果はＴＧＦ−β１阻害であり、ＴＧＦ−β１の最大阻害は利用した用量で達成されたことが示された。さらに、本出願人のマウスのリンパ浮腫の尾モデルを使用して、Ｔ細胞（特にＣＤ４＋細胞）がリンパ浮腫の状況においてＴＧＦ−β１の主な源であることが示される。加えて、Ｔｈ１及びＴｈ２のサイトカインと一緒にＴ細胞からのＴＧＦ−β１の欠損がリンパ浮腫に誘導された慢性炎症（ＣＤ４+細胞等）を減少させたことが、本出願人によって示された。
実施例３．テリフルノミドを使用するリンパ浮腫の治療及び予防
リンパ管損傷後のリンパの機能不全の予防におけるテリフルノミドの有効性を試験するために、十分に記載された膝窩リンパ節郭清（ＰＬＮＤ）（膝窩リンパ節は小さな皮膚切開を使用して除去される）のマウスモデルを使用した。確立されたリンパ浮腫の治療におけるこの治療の有効性を試験するために、リンパ浮腫のマウス尾モデル（尾の表在リンパ系及び深部リンパ系が中断され、動物は臨床疾患と一致する組織学的変化を発達させる）を使用した。
動物をＰＬＮＤ群又は尾リンパ浮腫群のいずれかへ無作為化し、外科手術の２週間後に、２〜４週間（ＰＬＮＤ後に２週間；尾リンパ浮腫後に４週間）の間、テリフルノミド（２７ｍｇ／ｍｌ；Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）又はベヒクル対照（Ａｑｕａｐｈｏｒ／グリセリン軟膏）の局所製剤により１日１回治療した。局所製剤を、Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ＣｅｎｔｅｒのＲｅｓｅａｒｃｈ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙと共同して開発した。次いでマウスを屠殺し、リンパ機能、線維化、リンパ管新生をすべて標準的なアッセイを使用して査定した。
尾のリンパアブレーション後の局所的なテリフルノミドによるマウスの治療は、リンパ浮腫及び脂肪線維の沈着（疾患の組織学的特徴）を著しく減少させた（図２４）。対照マウスは尾の明らかな膨潤及び線維化を有していたが（非対称性のコラーゲン沈着からもたらされる固定した「Ｊ型の立体配置」）、テリフルノミド治療マウスは、リンパ管損傷の６週間後に本質的に正常な外見の尾を有していた（図２４Ａ）。これらの肉眼的な変化は、テリフルノミド治療マウスの尾体積のほぼ６倍の減少に対応した（図２４Ｂ）。対照マウス尾の組織学的横断面は、脂肪線維組織の有意な蓄積を示し、これとは対照的に、テリフルノミド治療マウスは最小の脂肪組織沈着を有していた（図２４Ｃ、２４Ｄ）。この所見はＩ型コラーゲンの免疫蛍光染色により確認され、傷害の６週間後の対照動物におけるコラーゲン線維による表在リンパ管の不整狭窄及びテリフルノミド治療動物におけるコラーゲン沈着の著しい減少を実証した（図２５Ａ、２５Ｂ）。加えて、テリフルノミドは集合リンパ管を囲むアルファ平滑筋細胞の増殖を減少させ、したがってこれらの管の多くの正常な解剖学的立体配置を維持した（図２５Ｃ、２５Ｄ）。
テリフルノミド療法がＣＤ４＋細胞の浸潤を減少させたかどうかを決定するために、次にＣＤ４を標的とする免疫蛍光抗体を使用して対照マウス及び治療マウスからの組織切片を分析した（図２６Ａ、２６Ｂ）。この解析により、対照と比較して、テリフルノミド治療動物から採取されたＣＤ４＋細胞浸潤が尾組織において著しく減少したことが実証された。実際、テリフルノミド療法は、浸潤するＣＤ４＋細胞の数を８倍を越えて減少させた（Ｐ＜０．００１）。
最近の研究により、ＣＤ４＋細胞が強力な抗リンパ管新生性サイトカイン（インターフェロンガンマ、インターロイキン−４（ＩＬ４）、及びＩＬ１３が含まれる）を産生することが示された。このことと一致して、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）の近赤外画像化を使用して査定されるように、ＰＬＮＤを行った動物のテリフルノミドによる治療は、傷害ゾーンをバイパスする側副リンパ管の形成を著しく増加させる（４．５倍；ｐ＜０．００１）ことが見出された（図２７Ａ）。同様に、尾のリンパアブレーション後のテリフルノミドによるマウスの治療は、対照と比較して、傷害ゾーンを交差する新しく形成されたリンパ管の有意な増加をもたらした（図２７Ｂ）。テリフルノミド動物における側副リンパ管の再生は、真皮におけるリンパ管の漏出性を有意に減少させ、大量の間質液が近位へ伝導されることを可能にした（図２８）。
テリフルノミド治療マウスの新しく形成されたリンパ管及び既在のリンパ管の病理学的変化の減少は、樹状細胞（ＤＣ）の移動によって分析されるように、リンパ機能の著しい改善へ転換される。ＤＣはリンパ管経由で末梢組織から領域リンパ節へ移動して、抗原を提示し適応的免疫応答を促進する。標準的なアッセイ（ＦＩＴＣペインティング）を使用するＰＬＮＤ後のテリフルノミド動物におけるＤＣのトラフィッキングの解析により、対照と比較して、鼠径リンパ節（膝窩リンパ節に後続するつながりにおける次のリンパ節）へトラフィッキングしたＤＣの数における５倍を超える増加が実証された（図２９Ａ、２９Ｂ）。ＤＣはリンパ管のみを介してトラフィッキングするので、この所見はテリフルノミドがリンパ機能を増加させる実質的証拠を提供する。
集合リンパ管は、平滑筋細胞の包囲による能動的収縮及び逆流を予防する一方向の弁を使用して、リンパを近位へ伝導する。テリフルノミドがリンパ管の輸送機能を増加させ、リンパ管を囲むアルファ平滑筋細胞の線維化／増殖を減少させるという本出願人の所見と一致して、この治療が集合リンパの駆出を著しく増加させることも見出された（図３０）。ＰＬＮＤ後のテリフルノミド治療は、主要な後肢集合リンパ管の頻度をほぼ２倍にし、それによってリンパ液の近位への伝播を増加させた。
本出願人は、リンパ浮腫の予防及び治療のためのテリフルノミドの使用を初めて記載する。本所見により、テリフルノミドによる治療がリンパ管損傷後のリンパ浮腫及び脂肪線維組織の沈着を実質的に減少させることが示される。加えて、この効果が、ＣＤ４＋Ｔ細胞の浸潤の減少、側副リンパ管の形成の増加、リンパ管の漏出性の減少、及びリンパ機能の改善と相関することが示される。これらの所見がリンパ浮腫（以前に緩和介入でのみ治療されていた疾患）のための標的化療法を提供するので、これらは新規のものである。
実施例４．カプトプリルを使用するリンパ浮腫の治療及び予防
上述のように、ＰＬＮＤモデルを使用して、リンパ管損傷後のリンパの機能不全の予防における、及びマウス尾モデルを使用して、確立されたリンパ浮腫の治療における、カプトプリルの有効性を試験した。動物を、２〜４週間（ＰＬＮＤ後に２週間；尾リンパ浮腫後に４週間）の間、カプトプリル（５％）又はベヒクル対照（ワセリン又はＡｑｕａｐｈｏｒ／グリセリン軟膏）の局所製剤により１日１回治療した。次いでマウスを屠殺し、リンパ機能、線維化、及びリンパ管新生をすべて標準的なアッセイを使用して査定した。局所的なカプトプリルによる治療は、ＰＬＮＤモデルにおいてリンパ機能の改善及び尾モデルにおいてリンパ浮腫の減少をもたらした。結果を図３１〜５３中で示す。
実施例５．薬物の組み合わせを使用するリンパ浮腫の治療及び予防
ＰＬＮＤ及びマウス尾モデルを使用して、実施例１〜４中で記載されたように、抗線維化薬物又はベヒクル対照の組み合わせを含む局所製剤を動物に投与する。治療組成物を表１中で示す。
２〜４週間（ＰＬＮＤ後に２週間；尾リンパ浮腫後に４週間）の間１日１回マウスを治療した。次いでマウスを屠殺し、リンパ機能、線維化、リンパ管新生を標準的なアッセイを使用して査定する。ＰＬＮＤモデルにおいて、局所的な抗線維化薬物の組み合わせによる治療は、単一の抗線維化薬物による治療と比較して、リンパ機能の改善をもたらす。同様に、尾モデルにおいて、局所的な抗線維化薬物の組み合わせによる治療は、単一の抗線維化薬物による治療と比較して、リンパ浮腫の減少をもたらす。より効果的であることに加えて、組み合わせは相乗効果をもたらし、その結果、組み合わせで投与された各々の薬物の有効な用量は、単独で投与された各々の薬物の有効な用量よりも低い。
先の具体的な実施形態の記載は、他者が、様々な適用のために、不必要な実験なしに、本発明の一般的な概念から逸脱することなしに、当該技術分野の技能内の知識の適用によって、かかる具体的な実施形態を容易に修飾及び／又は適合させることができるという、本発明の一般的な性質を十分に明らかにするだろう。したがって、かかる適合及び修飾は、本明細書において提示された教示及び指針に基づいて、開示した実施形態の等価物の意味及び範囲内であることが意図される。本明細書における語法又は用語は、本明細書の用語又は語法が教示及び指針に照らして当業者によって解釈されるように、記載の目的のためのであり、限定するのではないことを理解すべきである。本発明は以下の請求項によって更に記載される。
本発明は以下の態様を含む。
項目［１］
（ｉ）有効量の１つ又は複数の抗Ｔ細胞剤と；
（ｉｉ）有効量の１つ若しくは複数の抗ＴＧＦ−β１剤及び／又は有効量の１つ若しくは複数の抗アンジオテンシン剤と
を含む、医薬組成物であって；
局所投与のために製剤化される、前記医薬組成物。
項目［２］
前記抗Ｔ細胞剤が、タクロリムス、テリフルノミド、レフルノミド、シクロスポリン、ピメクロリムス、デニロイキン・ジフチトクス、及びバシリキシマブからなる群から選択される、項目［１］に記載の医薬組成物。
項目［３］
前記抗ＴＧＦ−β１剤がピルフェニドンである、先行項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
項目［４］
前記抗アンジオテンシン剤がアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）アゴニストである、先行項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
項目［５］
前記抗アンジオテンシン剤が、カプトプリル、ゾフェノプリル、エナラプリル、リシノプリル、ラミプリル、キナプリル、ペリンドプリル、ベナゼプリル、イミダプリル、トランドラプリル、シラザプリル、フォシノプリル、ロサルタン、イルベサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、及びフィマサルタンからなる群から選択される、先行項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
項目［６］
タクロリムスを含む、先行項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
項目［７］
約０．０１％〜約１％のタクロリムスを含む、先行項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
項目［８］
約０．０５％〜約０．２％のタクロリムスを含む、先行項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
項目［９］
ピルフェニドンを含む、先行項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
項目［１０］
約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのピルフェニドンを含む、先行項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
項目［１１］
約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌのピルフェニドンを含む、先行項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
項目［１２］
テリフルノミドを含む、先行項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
項目［１３］
約１０ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌのテリフルノミドを含む、先行項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
項目［１４］
約２０ｍｇ／ｍｌ〜約３０ｍｇ／ｍｌのテリフルノミドを含む、先行項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
項目［１５］
レフルノミドを含む、項目［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
項目［１６］
約１％〜約２０％のレフルノミドを含む、項目［１５］に記載の医薬組成物。
項目［１７］
約５％〜約１５％のレフルノミドを含む、項目［１６］に記載の医薬組成物。
項目［１８］
カプトプリルを含む、先行項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
項目［１９］
約１％〜約２０％のカプトプリルを含む、項目［１８］に記載の医薬組成物。
項目［２０］
約５％〜約１５％のカプトプリルを含む、項目［１９］に記載の医薬組成物。
項目［２１］
前記組成物が、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、ムース、泡、ラッカー、懸濁物、液体、及びスプレーから選択される形態である、先行項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
項目［２２］
前記組成物が軟膏の形態である、項目［２１］に記載の医薬組成物。
項目［２３］
浮腫の治療又は予防における使用のための、先行項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
項目［２４］
前記浮腫がリンパ浮腫である、項目［２３］に記載の医薬組成物。
項目［２５］
浮腫を治療又は予防する方法であって、タクロリムス、テリフルノミド、レフルノミド、シクロスポリン、ピメクロリムス、デニロイキン・ジフチトクス、バシリキシマブ、ピルフェニドン、カプトプリル、ゾフェノプリル、エナラプリル、リシノプリル、ラミプリル、キナプリル、ペリンドプリル、ベナゼプリル、イミダプリル、トランドラプリル、シラザプリル、フォシノプリル、ロサルタン、イルベサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、及びフィマサルタンからなる群から選択される、有効量の１つ又は複数の薬物を含む医薬組成物をそれを必要とする被験体へ投与することを含む、前記方法。
項目［２６］
前記医薬組成物が、
（ｉ）タクロリムス、テリフルノミド、レフルノミド、シクロスポリン、ピメクロリムス、デニロイキン・ジフチトクス、及びバシリキシマブからなる群から選択される、有効量の１つ又は複数の抗Ｔ細胞剤と；
（ｉｉ）ピルフェニドン、カプトプリル、ゾフェノプリル、エナラプリル、リシノプリル、ラミプリル、キナプリル、ペリンドプリル、ベナゼプリル、イミダプリル、トランドラプリル、シラザプリル、フォシノプリル、ロサルタン、イルベサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、及びフィマサルタンからなる群から選択される、有効量の１つ若しくは複数の抗ＴＧＦ−β１剤及び／又は抗アンジオテンシン剤と
を含む、項目［２５］に記載の方法。
項目［２７］
前記医薬組成物がタクロリムスを含む、項目［２５］又は項目［２６］に記載の方法。
項目［２８］
前記医薬組成物がピルフェニドンを含む、項目［２５］〜［２７］のいずれか一項に記載の方法。
項目［２９］
前記医薬組成物がテリフルノミドを含む、項目［２５］〜［２８］のいずれか一項に記載の方法。
項目［３０］
前記医薬組成物がレフルノミドを含む、項目［２５］〜［２８］のいずれか一項に記載の方法。
項目［３１］
前記医薬組成物がカプトプリルを含む、項目［２５］〜［３０］のいずれか一項に記載の方法。
項目［３２］
前記医薬組成物が局所的に投与される、項目［２５］〜［３１］のいずれか一項に記載の方法。
項目［３３］
前記医薬組成物が０．０１％〜１％のタクロリムスを含む、項目［３２］に記載の方法。
項目［３４］
前記医薬組成物が０．０５％〜０．２％のタクロリムスを含む、項目［３３］に記載の方法。
項目［３５］
前記医薬組成物が０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌのピルフェニドンを含む、項目［３２］〜［３４］のいずれか一項に記載の方法。
項目［３６］
前記医薬組成物が０．５ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌのピルフェニドンを含む、項目［３５］に記載の方法。
項目［３７］
前記医薬組成物が１０ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌのテリフルノミドを含む、項目［３２］〜［３６］のいずれか一項に記載の方法。
項目［３８］
前記医薬組成物が２０ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌのテリフルノミドを含む、項目［３７］に記載の方法。
項目［３９］
前記医薬組成物が１％〜２０％のレフルノミドを含む、項目［３２］〜［３６］のいずれか一項に記載の方法。
項目［４０］
前記医薬組成物が５％〜１５％のレフルノミドを含む、項目［３９］に記載の方法。
項目［４１］
前記医薬組成物が、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、ムース、泡、ラッカー、懸濁物、液体、及びスプレーから選択される形態である、項目［３２］〜［４０］のいずれか一項に記載の方法。
項目［４２］
前記医薬組成物が軟膏の形態である、項目［４１］に記載の方法。
項目［４３］
前記医薬組成物が少なくとも１日１回局所的に投与される、項目［２３］〜［４２］のいずれか一項に記載の医薬組成物又は方法。
項目［４４］
前記医薬組成物が少なくとも１日２回局所的に投与される、項目［４３］に記載の医薬組成物又は方法。
項目［４５］
前記医薬組成物がリンパ管損傷の約６週間以内に予防的に投与される、項目［２３］〜［４４］のいずれか一項に記載の医薬組成物又は方法。
項目［４６］
前記医薬組成物がリンパ管損傷の約２週間以内に予防的に投与される、項目［４５］に記載の医薬組成物又は方法。

Claims (22)

  1. （ｉ）タクロリムス、テリフルノミド、及びレフルノミドからなる群から選択される、有効量の１つ又は複数の抗Ｔ細胞剤と；
    （ｉｉ）有効量のピルフェニドン及び／又は有効量の１つ若しくは複数の抗アンジオテンシン剤と
    を含む、医薬組成物であって；
    前記抗アンジオテンシン剤がカプトプリル、ゾフェノプリル、エナラプリル、リシノプリル、ラミプリル、キナプリル、ペリンドプリル、ベナゼプリル、イミダプリル、トランドラプリル、シラザプリル、及びフォシノプリルからなる群から選択され、
    前記医薬組成物は局所投与のために製剤化されており、リンパ浮腫の治療又は予防のためのものである、前記医薬組成物。
  2. タクロリムスを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 約０．０１％〜約１％のタクロリムスを含む、請求項２に記載の医薬組成物。
  4. 約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのピルフェニドンを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  5. テリフルノミドを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  6. 約１０ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌのテリフルノミドを含む、請求項５に記載の医薬組成物。
  7. レフルノミドを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  8. 約１％〜約２０％のレフルノミドを含む、請求項７に記載の医薬組成物。
  9. カプトプリルを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  10. 約１％〜約２０％のカプトプリルを含む、請求項９に記載の医薬組成物。
  11. 前記組成物が、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、ムース、泡、ラッカー、懸濁物、液体、及びスプレーから選択される形態である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  12. 前記組成物が軟膏の形態である、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. タクロリムス、テリフルノミド、レフルノミド、ピルフェニドン、カプトプリル、ゾフェノプリル、エナラプリル、リシノプリル、ラミプリル、キナプリル、ペリンドプリル、ベナゼプリル、イミダプリル、トランドラプリル、シラザプリル、及びフォシノプリルからなる群から選択される、有効量の１つ又は複数の薬物を含む、リンパ浮腫を治療又は予防するための医薬組成物。
  14. 前記医薬組成物が、
    （ｉ）タクロリムス、テリフルノミド、及びレフルノミドからなる群から選択される、有効量の１つ又は複数の抗Ｔ細胞剤と；
    （ｉｉ）ピルフェニドン、カプトプリル、ゾフェノプリル、エナラプリル、リシノプリル、ラミプリル、キナプリル、ペリンドプリル、ベナゼプリル、イミダプリル、トランドラプリル、シラザプリル、及びフォシノプリルからなる群から選択される、有効量の１つ若しくは複数の抗ＴＧＦ−β１剤及び／又は抗アンジオテンシン剤と
    を含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. 前記医薬組成物がタクロリムスを含む、請求項１３又は請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 前記医薬組成物がピルフェニドンを含む、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  17. 前記医薬組成物がテリフルノミドを含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  18. 前記医薬組成物がレフルノミドを含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  19. 前記医薬組成物がカプトプリルを含む、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  20. 前記医薬組成物が局所的に投与される、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  21. 前記医薬組成物が少なくとも１日１回局所的に投与される、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  22. 前記医薬組成物がリンパ管損傷の約６週間以内に予防的に投与される、請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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