JP6920071B2

JP6920071B2 - アディポネクチン分泌向上剤

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Publication number: JP6920071B2
Application number: JP2017027373A
Authority: JP
Inventors: 純吉野; 保田　尚孝; 尚孝保田; 秀夫新井; 哲郎榎本
Original assignee: Washington University in St Louis WUSTL
Current assignee: Washington University in St Louis WUSTL
Priority date: 2017-02-16
Filing date: 2017-02-16
Publication date: 2021-08-18
Anticipated expiration: 2037-02-16
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Description

本発明は、脂肪細胞からのアディポネクチンの分泌を亢進させる作用を有する素材、及び当該素材を有効成分とするアディポネクチン分泌向上剤に関する。

アディポネクチンは、脂肪細胞から分泌されるタンパク質の一種である。正常な脂肪細胞はインスリン感受性を獲得するアディポネクチンを分泌するが、肥満に陥り、脂肪細胞が脂肪を蓄積して肥大化すると、アディポネクチンの分泌が低下し、インスリン抵抗性を惹起するＴＮＦ−αやレジスチンの分泌が増加する。このことがインスリン抵抗性の原因となり、メタボリックシンドローム、糖尿病、高血圧、高脂血症、肥満及び動脈硬化などの疾患につながると考えられている。したがって、メタボリックシンドローム、糖尿病、高血圧、高脂血症、肥満、動脈硬化などの疾患を予防、改善するためには、脂肪細胞からのアディポネクチンの分泌量を増加させることが重要である。

脂肪細胞からのアディポネクチンの分泌のメカニズムは未だ解明されていない。例えば非特許文献１では、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞において、小胞体オキシドレダクターゼＥｒｏ１−Ｌαと、ＰＰＡＲγ（peroxisome proliferator-activated receptor γ）の調節因子と、ＮＡＤ依存性脱アセチル化酵素であるＳＩＲＴ１の活性とが、アディポネクチンの分泌を制御していることが報告されている。また、ＳＩＲＴ１等のサーチュイン活性やタンパク質量を増大させることにより、インシュリン耐性障害を治療又は予防できることが報告されている（例えば、特許文献１参照。）。

ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）は、補酵素ＮＡＤ^＋の生合成中間代謝産物である。近年、ＮＭＮは、老化マウスにおけるインスリン分泌能の改善効果、高脂肪食や老化によってひき起こされる２型糖尿病のマウスモデルにおいてインスリン感受性や分泌を劇的に改善する効果を有すること（例えば、特許文献２参照。）、老化した筋肉のミトコンドリア機能を顕著に高める効果を有することなどが報告されている。さらに、ＮＭＮの投与により、肥満、血中脂質濃度の上昇、インシュリン感受性の低下、記憶力低下、及び黄斑変性症等の眼機能劣化といった加齢に伴う各種疾患の症状の改善や予防に有用であることも報告されている（例えば、特許文献３参照。）。

特表２００７−５２７４１８号公報米国特許第７７３７１５８号明細書国際公開第２０１４／１４６０４４号

Qiang，et al.，MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY，2007，vol.27(13)，p.4698-4707． Gomes，et al.，Cell，2013，vol.155，p.1624-1638． Yoshino, et al., Cell Metabolism, 2011, vol.14, p.528-536.

本発明は、安全に摂取することができ、アディポネクチンの分泌量を増大させる作用を有する素材を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、β−ＮＭＮがアディポネクチンの分泌を亢進させる作用を有することを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、以下のアディポネクチン分泌向上剤、健康補助食品、及び飼料を提供するものである。
［１］ β−ＮＭＮ、その薬理学的に許容される塩、及びそれらの溶媒和物から選ばれるひとつを有効成分とし、血清又は血漿中のアディポネクチン量が低下していることが確認された動物に投与されることを特徴とする、アディポネクチン分泌向上剤。
［２］経口投与される、前記［１］の分泌向上剤。
［３］前記［１］又は［２］の分泌向上剤を含有し、血清又は血漿中のアディポネクチン量が低下していることが確認された動物に投与されることを特徴とする、アディポネクチンの分泌量を増加させるための、健康補助食品。
［４］前記［１］又は［２］の分泌向上剤を含有し、血清又は血漿中のアディポネクチン量が低下していることが確認された動物に投与されることを特徴とする、アディポネクチンの分泌量を増加させるための、飼料。

本発明に係るアディポネクチン分泌向上剤は、元々生体内に存在するβ−ＮＭＮを有効成分とし、脂肪細胞からのアディポネクチンの分泌を亢進させ、その分泌量を増大させることができる。このため、本発明に係るアディポネクチン分泌向上剤は、副作用を起こすことなく安全に摂取することができ、アディポネクチンの分泌量低下により引き起こされる疾患の予防や治療に有効である。

実施例１において、β−ＮＭＮを経口投与した各群のラット血清中のアディポネクチン量の測定結果を示した図である。実施例２において、β−ＮＭＮを経口投与した各群のマウス血清中のアディポネクチン量の測定結果を示した図である。実施例３において、β−ＮＭＮを腹腔内投与した各群のマウス血清中のアディポネクチン量の測定結果を示した図である。実施例４において、β−ＮＭＮで刺激したマウス線維芽細胞３Ｔ３−Ｌ１から分化させた脂肪細胞のアディポネクチン分泌量を測定した結果を示した図である。ＮＡＭＰＴを介した代謝経路とインスリン抵抗性獲得の関係の概略図である。実施例５において、ＡＮＫＯマウスに対してβ−ＮＭＮ投与により得られた種々の結果を示した図である。

本発明に係るアディポネクチン分泌向上剤（以下、「本発明に係る分泌向上剤」ということがある。）は、ＮＭＮ（化学式：Ｃ_１１Ｈ_１５Ｎ_２Ｏ_８Ｐ）を有効成分とし、脂肪細胞からのアディポネクチンの分泌を亢進させ、その分泌量を増大させるという効果を有する。このため、本発明に係る分泌向上剤は、メタボリックシンドローム、糖尿病、高脂血症、脂肪肝、高血圧、肥満、動脈硬化などのアディポネクチンの分泌量低下により引き起こされる疾患に対する予防又は治療のための経口用組成物又は外用組成物の有効成分として好適である。

ＮＭＮには、光学異性体としてα、βの２種類が存在するが、本発明に係る分泌向上剤の有効成分となるＮＭＮは、β−ＮＭＮ（ＣＡＳ番号：１０９４−６１−７）である。β−ＮＭＮの構造を下記に示す。

有効成分とするβ−ＮＭＮとしては、いずれの方法で調製されたものであってもよい。例えば、化学合成法、酵素法、発酵法等により、人工的に合成したβ−ＮＭＮを精製したものを、有効成分として用いることができる。また、β−ＮＭＮは広く生体に存在する成分であるため、動物、植物、微生物などの天然原料から抽出・精製することによって得られたβ−ＮＭＮを有効成分として用いることもできる。また、市販されている精製されたβ−ＮＭＮを使用してもよい。

β−ＮＭＮを合成する化学合成法としては、例えば、ニコチンアミドとＬ−リボーステトラアセテートとを反応させ、得られたニコチンアミドモノヌクレオシドをリン酸化することによりβ−ＮＭＮを製造できる。また、酵素法としては、例えば、ニコチンアミドと５’−ホスホリボシル−１’−ピロリン酸（ＰＲＰＰ）から、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）によりβ−ＮＭＮを製造できる。発酵法としては、例えば、ＮＡＭＰＴを発現している微生物の代謝系を利用して、ニコチンアミドからβ−ＮＭＮを製造できる。

本発明に係る分泌向上剤の有効成分としては、β−ＮＭＮの薬理学的に許容される塩であってもよい。β−ＮＭＮの薬理学的に許容される塩としては、無機酸塩であってもよく、アミンのような塩基性部位を有する有機酸塩であってもよい。このような酸塩を構成する酸としては、例えば、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エテンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、硝酸、パモ酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸等が挙げられる。また、β−ＮＭＮの薬理学的に許容される塩としては、アルカリ塩であってもよく、カルボン酸のような酸性部位を有する有機塩であってもよい。このような酸塩を構成する塩基としては、例えば、アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩であって、水素化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アルミニウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化亜鉛、アンモニア、トリメチルアンモニア、トリエチルアンモニア、エチレンジアミン、リジン、アルギニン、オルニチン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、プロカイン、ジエタノールアミン、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン、ジエチルアミン、ピペラジン、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、水酸化テトラメチルアンモニウム等の塩基から誘導されるものが挙げられる。

本発明に係る分泌向上剤の有効成分としては、遊離のβ−ＮＭＮ又はβ−ＮＭＮの薬理学的に許容される塩の溶媒和物であってもよい。当該溶媒和物を形成する溶媒としては、水、エタノール等が挙げられる。

本発明に係る分泌向上剤は、β−ＮＭＮに加えてその他の有効成分を含有していてもよい。当該他の有効成分としては、β−ＮＭＮによるアディポネクチン分泌量増大効果を損なわないものであれば特に限定されるものではない。当該他の有効成分としては、例えば、公知の脂肪細胞分化促進物質、脂肪蓄積抑制物質、脂肪分解促進物質、脂肪代謝改善物質等が挙げられる。具体的には、当該他の有効成分としては、例えば、タウリン、グルタチオン、カルニチン、クレアチン、コエンザイムＱ、グルクロン酸、グルクロノラクトン、トウガラシエキス、ショウガエキス、カカオエキス、ガラナエキス、ガルシニアエキス、テアニン、γ−アミノ酪酸、カプサイシン、カプシエイト、各種有機酸、フラボノイド類、ポリフェノール類、カテキン類、キサンチン誘導体、フラクトオリゴ糖などの難消化性オリゴ糖、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。

本発明に係る分泌向上剤は、有効成分のみからなるものであってもよく、その他の成分を含むものであってもよい。例えば、本発明に係る分泌向上剤は、有効成分を医薬用無毒担体と組み合わせて、製剤上の常套手段により様々な剤型に製剤化することができる。本発明に係る分泌向上剤の剤型のうち、経口投与剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、ソフトカプセル剤等の固形剤；溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤；凍結乾燥製剤等が挙げられる。非経口投与剤としては、注射剤のほか、坐剤、噴霧剤、経皮吸収剤等が挙げられる。

製剤化に使用する医薬用無毒担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、果糖、還元麦芽糖等の糖類；デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、デキストリン、β−シクロデキストリン、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の炭水化物；マンニトール、エリスリトール、ソルビトール、キシリトール等の糖アルコール；脂肪酸グリセリド、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等のエステル類；ポリエチレングリコール、エチレングリコール、アミノ酸、アルブミン、カゼイン、二酸化珪素、水、生理食塩水等が挙げられる。また、本発明に係る分泌向上剤の製剤化においては、製剤上の必要に応じて、安定化剤、滑剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、結合剤、崩壊剤、溶剤、溶解補助剤、緩衝剤、等張化剤、防腐剤、矯味矯臭剤、着色剤等の慣用の添加剤を適宜添加することができる。

本発明に係る分泌向上剤は、ヒトやヒト以外の動物に投与されることが好ましい。ヒト以外の動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等の哺乳動物が挙げられる。本発明に係る分泌向上剤としては、ヒト、家畜、実験動物、ペットに投与・摂取されるものであることが好ましく、ヒトに投与・摂取されるものであることがさらに好ましい。

本発明に係る分泌向上剤の投与・摂取量は、投与される動物の生物種、年齢（月齢）、体重、症状、疾患の程度、投与スケジュール、製剤形態等により、適宜選択・決定される。例えば、成人１人あたりの１日量を、β−ＮＭＮ量として、０．１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは０．５ｍｇ〜７ｇ、より好ましくは１０ｍｇ〜５ｇ、さらに好ましくは１００ｍｇ〜２ｇを、１回又は数回に分けて投与することができる。

β−ＮＭＮは、生体構成成分であり、かつ食品中にも含まれている成分であることから、安全性が高いと考えられる。そこで、本発明に係る分泌向上剤は、アディポネクチンの分泌量を増加させるために摂取される健康補助食品の有効成分として用いることができる。健康補助食品は、健康状態の維持又は改善を目的として栄養を補助するための飲食品であり、特定保健用食品、栄養機能食品、及び健康食品も含む。本発明に係る分泌向上剤は、安全性が高く、長期間の継続的摂取に適していることから、当該分泌向上剤を含む健康補助食品は、優れたメタボリックシンドローム、糖尿病、高脂血症、脂肪肝（アルコール性脂肪肝、非アルコール性脂肪肝）、高血圧、肥満、動脈硬化などの予防及び改善作用が期待される。

また、本発明に係る分泌向上剤は、アディポネクチンの分泌量を増加させるために動物に摂取させる飼料の有効成分として用いることができる。当該飼料を家畜、ペット、実験動物等に与えることにより、摂取させた動物の脂肪細胞からのアディポネクチンの分泌量が増大され、当該動物のインスリン感受性が高まる結果、メタボリックシンドローム、糖尿病、高血圧、高脂血症、脂肪肝（アルコール性脂肪肝、非アルコール性脂肪肝）、肥満、動脈硬化などの疾患の予防や病態の改善が期待できる。

本発明に係る健康補助食品及び飼料は、β−ＮＭＮ等に適当な助剤を添加した後、慣用の手段を用いて、食用に適した形態、例えば、粉末状、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル剤、ソフトカプセル剤、ペースト状等に形成することによって製造できる。本発明に係る健康補助食品は、そのまま食用に供してもよく、種々の食品や飲料に混合させた状態で食用に供してもよい。例えば、粉末状の健康補助食品を、水、酒類、果汁、牛乳、清涼飲料水等の飲料に溶解又は分散させた状態で摂取させることができる。本発明に係る飼料も、そのまま動物に摂取させてもよく、他の固形飼料や飲料水に混合させた状態で動物に摂取させてもよい。

本発明に係る健康補助食品及び飼料は、その他の食品素材や種々の添加剤を含有することができる。食品素材としては、ビタミン類、糖質、蛋白質、脂質、食物繊維、果汁等が挙げられる。具体的には、例えば、ビタミンＢ_１誘導体、ビタミンＢ_２、ビタミンＢ_６、ビタミンＢ_１２、ビタミンＢ_１３、ビオチン、パントテン酸、ニコチン酸、葉酸等のビタミンＢ群；ビタミンＥ、ビタミンＤ又はその誘導体、ビタミンＫ_１、ビタミンＫ_２、βカロチン等の脂溶性ビタミン；カルシウム、カリウム、鉄、亜鉛等のミネラル；酵母、Ｌ−カルニチン、クレアチン、α−リポ酸、グルタチオン、グルクロン酸、タウリン、コラーゲン、大豆イソフラボン、レシチン、ペプチド、アミノ酸、γ−アミノ酪酸、ジアシルグリセロール、ＤＨＡ、ＥＰＡ、カプサイシン、コンドロイチン硫酸、アガリクス茸エキス、ニンジンエキス、ニンニクエキス、青汁、レシチン、ローヤルゼリー、プロポリス、オクタコサノール、フラバンジェノール、ピクノジェノール、マカ、キトサン、ガルシニアエキス、コンドロイチン、グルコサミン等が挙げられる。添加剤としては、甘味料、有機酸等の酸味料、安定剤、香料、着色料等が挙げられる。

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［マウス及びラット］
以降の実験に用いたＣＤ（ＳＤ）ラット、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス、及びＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、全実験期間中を通して、ＳＰＦ環境下で飼育した。

［経口投与］
経口投与は、β−ＮＭＮ（オリエンタル酵母工業社製）を注射用水（大塚製薬工場社製）もしくはＰＢＳ（リン酸生理食塩水）に溶解させた溶液を、金属製胃ゾンデ（フチガミ器械社製）を取り付けたポリプロピレン製ディスポーザブル注射筒（テルモ社製）などで強制経口投与した。

［腹腔内投与］
腹腔内投与は、β−ＮＭＮ（オリエンタル酵母工業社製）をＰＢＳ（リン酸生理食塩水）に溶解させた溶液を、Dr. Sinclair 等の方法（非特許文献２）及びDr. Imai等の方法（非特許文献３）などに従って腹腔内投与した。

［アディポネクチン量の測定］
以降の実験において、アディポネクチン量の測定は、以下のようにして行った。

（１）抗体の調製
１次抗体液としては、抗マウスアディポネクチンポリクロ―ナル抗体（オリエンタル酵母工業社製）をＰＢＳにて１０μｇ／ｍＬに調製した。また、２次抗体液としては、抗マウスアディポネクチンポリクロ―ナル抗体（オリエンタル酵母工業社製）をビオチン化させた後、２μｇ／ｍＬに調製した。

（標準品の調製）
マウスアディポネクチン（オリエンタル酵母工業社製）を検体希釈液で４５．２ｎｇ／ｍＬに調製したものを、標準品とした。

（標準液・検体の調製）
標準品４５．２ｎｇ／ｍＬを検体希釈液で２倍段階希釈し、２２．６ｎｇ／ｍＬ、１１．３ｎｇ／ｍＬ、５．６５ｎｇ／ｍＬ、２．８３ｎｇ／ｍＬ、１．４１ｎｇ／ｍＬ、０．７１ｎｇ／ｍＬ、０．３５ｎｇ／ｍＬの標準液を調製した。なお、０ｎｇ／ｍＬについては、検体希釈液を用いた。また、検体については、ラット血清は８０８倍、マウス血清は６１６１倍になるように、検体希釈液にて２段階希釈で調製した。

（ＥＬＩＳＡ）
まず、１次抗体液を９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬずつ加え、プレートシールで蓋をした後、４℃にて一晩静置した。静置後、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を各ウェルに３５０μＬずつ加えた後、そのまま除去する操作（以下、「洗浄操作」ということがある。）を３回実施した。続いて、ブロッキング液を各ウェルに３００μＬずつ加え、プレートシールで蓋をした後、４℃にて一晩静置し、その後、前記洗浄操作を３回実施した。
続いて、調製した標準品と検体をそれぞれ指定したウェルに１００μＬ加え、プレートシールで蓋をした後、２５℃で１時間静置して反応させた。反応終了後には、反応液を除去し、前記洗浄操作を３回実施した。続いて、２次抗体液を各ウェルに１００μＬずつ加え、プレートシールで蓋をした後、２５℃で１時間静置して反応させた。反応終了後には、反応液を除去し、前記洗浄操作を３回実施した。その後、各ウェルに、酵素標識ストレプトアビジン（ＤＡＫＯ社製、＃Ｐ０３９７）の２０００倍希釈液を１００μＬずつ加え、プレートシールで蓋をした後、２５℃で１時間静置して反応させた。反応終了後には、反応液を除去し、前記洗浄操作を３回実施した。
さらに、基質液（ベクトン・ディッキンソン社製、ＴＭＢＳｕｂｓｔｒａｔｅＲｅａｇｅｎｔＳｅｔ、＃５５５２１４）を各ウェルに１００μＬずつ加え、２５℃で１５分間反応させた。２Ｎ硫酸を各ウェルに１００μＬずつ加えて反応を停止させた後、プレートリーダー（ＢＭＧＬＡＢＴＥＣＨ社製、ＦＬＵＯｓｔａｒＯＰＴＩＭＡ）にて、各ウェルの正４５０ｎｍ／副５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、ＥＬＩＳＡにて使用するマウスアディポネクチンポリクローナル抗体はラットアディポネクチンにも交差するため、標準品としているマウスアディポネクチンの濃度に換算して測定した。

［実施例１］
ＣＤラット（４週齢、オス及びメス）に対して、β−ＮＭＮを２８日間経口投与した。各群（ｎ＝６）の雌雄とβ−ＮＭＮの投与量を表１に示す。β−ＮＭＮの投与量が「０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ」とは、β−ＮＭＮを含まないＰＢＳを等量経口投与したことを意味する。第１群、第２群、第３群はオス、第４群、第５群、第６群はメスを用いた。

投与開始から２８日目のラットの血清中のアディポネクチン量を測定した。測定結果を図１に示す。図中、「ＣＴＬ」、「ＮＭＮ（２５０）」、及び「ＮＭＮ（１０００）」は、それぞれ、β−ＮＭＮの投与量が０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、２５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、及び１０００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙであったことを意味する。ラットの雌雄に関わらず、β−ＮＭＮの投与量依存的に血清中のアディポネクチン量が高くなった。これらの結果から、β−ＮＭＮの投与により、アディポネクチンの分泌量が増大することが確認できた。

［実施例２］
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（８月齢、メス）に対して、β−ＮＭＮを４日間経口投与した。各群（ｎ＝４）のβ−ＮＭＮの投与量を表２に示す。β−ＮＭＮの投与量が「０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ」とは、β−ＮＭＮを含まないＰＢＳを等量経口投与したことを意味する。

投与開始から４日目のマウスの血清中のアディポネクチン量を測定した。測定結果を図２に示す。図中、「ＣＴＬ」、「ＮＭＮ（１２５）」、及び「ＮＭＮ（６２５）」は、それぞれ、β−ＮＭＮの投与量が０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、１２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、及び６２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙであったことを意味する。第１群、第２群、及び第３群の結果を比較すると、β−ＮＭＮの投与量依存的に血清中のアディポネクチン量が高くなった。これらの結果から、β−ＮＭＮの投与により、アディポネクチンの分泌量が増大することが確認できた。

［実施例３］
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（８月齢、メス）に対して、β−ＮＭＮを４日間腹腔内投与した。各群（ｎ＝３）のβ−ＮＭＮの投与量を表３に示す。β−ＮＭＮの投与量が「０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ」とは、β−ＮＭＮを含まないＰＢＳを等量腹腔内投与したことを意味する。

投与開始から４日目のマウスの血清中のアディポネクチン量を測定した。測定結果を図３に示す。図中、「ＣＴＬ」、「ＮＭＮ（６２５）」、「ＮＭＮ（１２５０）」は、それぞれ、β−ＮＭＮの投与量が０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、６２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、１２５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙであったことを意味する。第１群、第２群、及び第３群の結果を比較すると、８月齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、β−ＮＭＮの投与量依存的に血清中のアディポネクチン量が高くなった。

［実施例４］
３Ｔ３−Ｌ１細胞を脂肪細胞に分化させた後、β−ＮＭＮで刺激してアディポネクチンの分泌量の変化を観察した。

３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪細胞への分化誘導は、以下の通りに行った。
まず、２４ウェルプレートに、３Ｔ３−Ｌ１細胞を５×１０^４細胞／ウェルで播き、培養培地（１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＤＭＥＭ）中で３７℃、５％ＣＯ_２環境下で２〜３日間培養した。次いで、第１分化誘導培地（培養培地に、１０μＭのデキサメタゾン、５μＭのＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）、１０μｇ／ｍＬのインシュリンを含有させた培地）に培地交換し、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で２日間培養した。続いて、第２分化誘導培地（培養培地に、１０μｇ／ｍＬのインシュリンを含有させた培地）に培地交換し、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で２日間培養した。その後、２〜３日置きに培養培地への培地交換を２回実施し、３Ｔ３−Ｌ１細胞を成熟脂肪細胞に分化させた。

３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の培養上清に、β−ＮＭＮを添加し、７日間培養した。培養終了後に、培養上清中の分泌されたアディポネクチンの量を測定した（「ＮＭＮ添加」）。対照として、β−ＮＭＮを添加していない３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞に対しても同様に培養上清のアディポネクチンの量を測定した（「ＮＭＮ非添加」）。ＮＭＮ添加及び非添加の培養上清中のアディポネクチン量の結果を図４に示す。この結果、β−ＮＭＮを添加した脂肪細胞では、β−ＮＭＮを添加していない脂肪細胞よりもアディポネクチン量が多く、β−ＮＭＮ刺激によりアディポネクチンの分泌が亢進されることが確認された。

［実施例５］
本発明者らは、ＮＡＤ^＋生合成における律速酵素であり、肥満及び老齢のげっ歯類及びヒトの脂肪組織において減少することが知られているＮＡＭＰＴが脂肪細胞特異的に欠損しているマウス（以下、「ＡＮＫＯマウス」）を調べた。この結果、ＡＮＫＯマウスは、脂肪組織、肝臓及び骨格筋において重度のインスリン抵抗性を示し（結果は図示せず）、また、血漿中遊離脂肪酸濃度の増加及び主要なインスリン感受性アディポカインであるアディポネクチンの血漿濃度の低下に現れる脂肪組織機能不全も示した（結果は図示せず）。さらに、ＡＮＫＯマウスでは、ＣＤＫ５（cyclin-dependent kinase 5）及びＰＰＡＲγ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma）（２７３番目のセリン）のリン酸化が増加しており、脂肪組織において肥満に関連するリン酸化ＰＰＡＲγの標的の遺伝子発現が減少していた（結果は図示せず）。

図５に、ＮＡＭＰＴを介した代謝経路とインスリン抵抗性獲得の関係の概略図を示す。肥満によりＮＡＭＰＴの発現量が低下すると、ニコチンアミドからのＮＭＮの産生が低下し、ＮＡＤ^＋量が減少する。ＮＡＤ^＋量減少により、ＣＤＫ５の活性が増大し、ＰＰＡＲγのリン酸化が増加する。この結果、脂肪細胞からのアディポネクチンの分泌量が低下し、遊離脂肪酸量が増大することによって、多臓器においてインスリン抵抗性となる。

そこで、ＡＮＫＯマウスにおける代謝障害がＮＡＤ^＋生合成経路の欠陥に依存するものであるかどうかを調べるために、ＡＮＫＯマウスに、重要なＮＡＤ^＋中間体であって、ＮＡＭＰＴ反応産物であるβ−ＮＭＮを投与し、影響を調べた。図６Ａに、ヒトのＮＡＤ^＋生合成経路の概略図を示す。図中、「ＮＡ」はニコチン酸、「ＮａＭＮ」はニコチン酸モノヌクレオシド、「ＮＩＣ」はニコチンアミド、「ＮＲ」はニコチンアミドリボシド、「Ｔｒｐ」はトリプトファン、「ＮＡＰＲＴ」はニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼを表す。ＮＭＮは、ＮＡＭＰＴを介した酵素反応の産物であり、直接ＮＡＤ^＋に変換される。ニコチン酸は、ＮＡＰＲＴ依存性ＮＡＤ^＋生合成経路の前駆体である。

ＡＮＫＯマウスは、Ｎａｍｐｔ−ｆｌｏｘｅｄ（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）マウスと、アディポネクチン−Ｃｒｅトランスジェニックマウスとを交配させて得た（Yoon et al.，Cell Metabolism，2015，vol.21，p.706-717）。マウスは、標準食餌（ＬａｂＤｉｅｔ５０５３、ＬａｂＤｉｅｔ社製）を自由摂取させて維持した。ＮＭＮ又はニコチン酸の投与試験では、離乳直後から２ヶ月までのマウスに、β−ＮＭＮ（オリエンタル酵母工業社製）又はニコチン酸（＃７２３０９、シグマ−アルドリッチ社製）を含有させた飲料水を、おおよそ５００ｍｇ／ｋｇ体重／日となるように摂取させた。

具体的には、メスのＡＮＫＯマウスにＮＭＮ（５００ｍｇ／ｋｇ体重／日）を含む飲料水を与え、４〜６週間のＮＭＮ投与後に代謝パラメーターを評価した。結果を図６Ｂ〜図６Ｊに示す。図中、「ＮＭＮ−ＡＮＫＯ」はＮＭＮ投与ＡＮＫＯマウスの結果を、「ＡＮＫＯ」はＮＭＮ投与ＡＮＫＯマウスと月齢を揃えたメスのＮＭＮ未投与ＡＮＫＯマウスの結果を、「ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ」はコントロールマウス（メスのＮａｍｐｔ−ｆｌｏｘｅｄ（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）マウス）の結果を、それぞれ示す。図中の値はいずれも平均値±ＳＥである。図中、「＊」はｐ＜０．０５、「＊＊」はｐ＜０．０１、「＊＊＊」はｐ＜０．００１を示す（ＮＭＮ処理ＡＮＫＯマウス対ＮＭＮ未投与ＡＮＫＯマウス、スチューデントｔ検定）。また、図中、「ａ」はｐ＜０．０５（ＮＭＮ処理ＡＮＫＯマウス対ＮＭＮ未投与ＡＮＫＯマウス、ＡＮＯＶＡ）、「ｂ」はｐ＜０．０５（コントロールマウス対ＮＭＮ未投与ＡＮＫＯマウス、ＡＮＯＶＡ）を示す。

図６Ｂは、４〜６週間のＮＭＮ投与投与（５００ｍｇ／ｋｇ体重／日）を行ったメスのＡＮＫＯマウスと、月齢を揃えた未投与のメスのＡＮＫＯマウスについて、脂肪組織におけるＮＡＤ^＋量を測定した結果を示す（群あたり、ｎ＝５〜７）。ＮＡＤ^＋量の測定は、ＳｕｐｅｌｃｏＬＣ−１８−Ｔカラム（＃５８９７０−Ｕ、シグマ−アルドリッチ社製）を用いたＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）システムにより行った（Yoon et al.，Cell Metabolism，2015，vol.21，p.706-717）。図６Ｃは、４週間のＮＭＮ投与の後のＮＭＮ投与マウス（ｎ＝７）、月齢を揃えた２〜３ヶ月齢の未投与のＡＮＫＯマウス（ｎ＝１４）、及びコントロールマウス（ｎ＝８）に対して、インスリンを投与して血中グルコース濃度を経時的に測定するＩＴＴ（インスリン耐性試験）を行った結果を示す。図６Ｃの左図が、グルコース濃度の経時的変化（インスリン耐性曲線）の結果であり、図６Ｃの右図が、グルコース濃度の曲線下面積（ＡＵＣ）の結果を示す。

ＮＭＮ投与ＡＮＫＯマウス、ＮＭＮ未投与ＡＮＫＯマウス、及びコントロールマウスについて、血漿インスリン濃度を測定した結果を図６Ｄに示し、血漿遊離脂肪酸（ＦＦＡ）濃度を測定した結果を図６Ｅに示す（群あたり、ｎ＝５〜１１）。また、ＮＭＮ投与ＡＮＫＯマウス及びＮＭＮ未投与ＡＮＫＯマウスからそれぞれ内蔵脂肪組織を採取し、この内蔵脂肪組織中のＰＰＡＲγ（Ｓｅｒ２７３）、ＣＤＫ５、及び核タンパク質のアセチル化リジンを測定した（群あたり、ｎ＝３〜４）。各群のＰＰＡＲγ（Ｓｅｒ２７３）のリン酸化率（［リン酸化ＰＰＡＲγ（Ｓｅｒ２７３）］／［ＰＰＡＲγ（Ｓｅｒ２７３）］）の結果を図６Ｆに、ＣＤＫ５のリン酸化率（［リン酸化ＣＤＫ５］／［ＣＤＫ５］）の結果を図６Ｇに、核タンパク質のリジンのアセチル化率（［アセチル化リジン］／［ＬＡＭＩＮＢ１］）の結果を図６Ｈに、それぞれ示す。

さらに、ＮＭＮ投与ＡＮＫＯマウス及びＮＭＮ未投与ＡＮＫＯマウスからそれぞれ採取した内蔵脂肪組織について、肥満様のＰＰＡＲγ（Ｓｅｒ２７３）の標的となる各遺伝子の発現量を調べた。結果を図６Ｉに示す（群あたり、ｎ＝４〜５）。また、図６Ｊは、ＮＭＮ投与ＡＮＫＯマウス及びＮＭＮ未投与ＡＮＫＯマウスについて、血漿アディポネクチン濃度と血漿アディプシン濃度を測定した結果を示す（群あたり、ｎ＝５〜１２）。

ＮＭＮ投与により、ＡＮＫＯマウスの脂肪組織のＮＡＤ^＋量が顕著に増加した（図６Ｂ）。ＮＭＮ投与により、ＡＮＫＯマウスのインスリン感受性は、同じ月齢のＮＭＮ未投与マウスと比較して改善された（図６Ｃ）。ＮＭＮ投与ＡＮＫＯマウスのインスリン応答は、同じ月齢の対照マウスと同程度であり、このことから、ＮＭＮ投与によりインスリン抵抗性の表現型を正常化することが示された。ＮＭＮ投与は、ＡＮＫＯマウスにおける血漿インスリン及びＦＦＡ（遊離脂肪酸）濃度も正常化した（図６Ｄ及び６Ｅ）。しかしながら、ＮＭＮ投与によっては、体重（ＡＮＫＯマウス＝１８．１±０．４ｇ；ＮＭＮ投与ＡＮＫＯマウス＝１８．０±０．５ｇ）、毎日の食物摂取量（ＡＮＫＯマウス＝０．２２±０．０１ｇ／ｇ体重；ＮＭＮ投与ＡＮＫＯマウス＝０.２１±０．０１ｇ／ｇ体重）、及び体温（ＡＮＫＯマウス＝３６．７±０．２℃；ＮＭＮ投与ＡＮＫＯマウス＝３６．７±０．３℃）は変化しなかった。

ＮＭＮ投与は、内蔵脂肪組織におけるＰＰＡＲγ（Ｓｅｒ２７３）及びＣＤＫ５のリン酸化を減少させた（図６Ｆ及び６Ｇ）。さらに、ＮＭＮ投与ＡＮＫＯマウスは、全核リジンアセチル化を減少させており（図６Ｈ）、ＮＭＮ投与がＳＩＲＴ１などの核ＮＡＤ^＋依存性脱アセチル化酵素の活性を増加させられることが示された。脂肪組織における遺伝子発現及び血漿のアディポネクチンとアディプシンの濃度は、ＮＭＮ投与により回復した（図６Ｉ及び６Ｊ）。加えて、脂肪組織はニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼを発現しているため、ニコチン酸（５００ｍｇ／ｋｇ体重／日）を５〜７週投与したところ、同様にＡＮＫＯマウスの代謝障害は改善した（結果は図示せず）。

β−ＮＭＮ又はニコチン酸の投与によりＡＮＫＯマウスの代謝障害が改善されたことから、脂肪細胞におけるＮＡＭＰＴを介したＮＡＤ^＋生合成経路が、脂肪組織及び全身の代謝機能の制御に重要であること、β−ＮＭＮ投与によってアディポネクチンの分泌が促進されることにより、肥満に関連する全身代謝異常、特に多臓器インスリン抵抗性の治療や予防が可能となることが示された。

Claims

β−ニコチンアミドモノヌクレオチド、その薬理学的に許容される塩、及びそれらの溶媒和物から選ばれるひとつを有効成分とし、血清又は血漿中のアディポネクチン量が低下していることが確認された動物に投与されることを特徴とする、アディポネクチン分泌向上剤。
経口投与される、請求項１に記載の分泌向上剤。
請求項１又は２に記載の分泌向上剤を含有し、血清又は血漿中のアディポネクチン量が低下していることが確認された動物に投与されることを特徴とする、アディポネクチンの分泌量を増加させるための、健康補助食品。
請求項１又は２に記載の分泌向上剤を含有し、血清又は血漿中のアディポネクチン量が低下していることが確認された動物に投与されることを特徴とする、アディポネクチンの分泌量を増加させるための、飼料。