JP6916316B2 - パターン角度空間選択構造化照明イメージング - Google Patents

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［関連出願の相互参照］
本願は、２０１８年１月１６日に出願された「パターン角度空間選択構造化照明イメージング（Pattern Angle Spatial Selection Structured Illumination Imaging）」と題する米国仮特許出願第６２／６１８，０５９号及び２０１８年３月２０日に出願された「パターン角度空間選択構造化照明イメージング」と題するオランダ特許出願第２０２０６２０号の優先権を主張する。上記出願それぞれの全内容を参照により本明細書に援用する。

構造化照明顕微鏡法（ＳＩＭ）は、空間構造化（すなわち、パターン化）光を用いて試料を撮像し、顕微鏡の横分解能を２倍以上高める技術を言う。場合によっては、試料の撮像中に試料の縞パターンの３つの画像が種々のパターン位相（例えば、０°、１２０°、及び２４０°）で取得されるので、試料上の各位置がある範囲の照明強度に曝され、光軸の周りでパターンの向きを３つの別個の角度（例えば、０°、６０°及び１２０°）に回転させることによりこの手順が繰り返される。取り込み画像（例えば、９つの画像）は、拡張された空間周波数帯域幅を有する単一の画像に合成することができ、それを実空間に再変換して従来の顕微鏡により取り込まれるものよりも高い解像度を有する画像を生成することができる。

現在のＳＩＭシステムのいくつかの実施形態では、直線偏光ビームが光ビームスプリッタを通して方向付けられ、光ビームスプリッタはビームを２つ以上の別個の次数に分割し、それらが合成されて正弦波状の強度変化を有する干渉縞パターンとして撮像試料に投影され得る。回折格子が、コヒーレンス度が高く伝播角度が安定したビームを生成することができるビームスプリッタの例である。２つのかかるビームが合成されると、両者間の干渉により均一な規則的に繰り返す縞パターンが生成され、その間隔は干渉ビーム間の角度を含む因子により決まる。３つ以上のビームが合成される場合、得られるパターンは、通常は混ざり合った縞間隔を含む結果として最大強度と最小強度との間の差（「変調度」としても知られている）が減り、ＳＩＭの目的に適さないものとなる。

現在のＳＩＭシステムのいくつかの実施形態では、投影パターンの向きは、ビーム分割素子を光軸周りで回転させることにより制御され、パターンの位相は、当該素子を軸に対して横方向に移動させることにより調整される。このようなシステムでは、回折格子が通常は並進ステージに取り付けられ、並進ステージがさらに回転ステージに取り付けられる。さらに、このようなシステムは、多くの場合は直線偏光子を利用して光源が発した光を偏光させた後に、格子で受光する。

本明細書に開示する実施形態は、構造化照明システム及び方法を対象とする。

第１の組の実施形態において、ＳＩＭイメージングシステムは、多アーム（arm：腕）ＳＩＭイメージングシステムとして実現することができ、システムの各アームが発光装置とシステムの光軸に対して特定の固定の向きを有するビームスプリッタ（例えば、透過型回折格子）とを含む。

多アームＳＩＭイメージングシステムの一実施形態では、システムは、発光する第１の発光装置及び第１の複数の縞を試料の平面に投影するよう第１の発光装置が発した光を分割する第１のビームスプリッタを含む第１の光アームと、発光する第２の発光装置及び第２の複数の縞を試料の平面に投影するよう第２の発光装置が発した光を分割する第２のビームスプリッタを含む第２の光アームとを含む。この実施形態では、システムは、第１のアーム及び第２のアームの光路を合成する光学素子も含み得る。さらに、システムは、試料が発した光を集光するイメージセンサを含み得る。いくつかの実施形態では、試料は、矩形アレイ又は六角形アレイ状に規則的にパターン化された複数のフィーチャ（features）を含み得る。

いくつかの実施形態では、第１のビームスプリッタは第１の透過型回折格子を含み、第２のビームスプリッタは第２の透過型回折格子を含む。いくつかの実施形態では、第１のビームスプリッタは第１の反射型回折格子を含み、第２のビームスプリッタは第２の反射型回折格子を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のビームスプリッタは、それぞれがビームスプリッタキューブ又はプレートを含む。

いくつかの実施形態では、第１及び第２のビームスプリッタは非偏光を発し、第１及び第２の透過型回折格子は、第１及び第２の発光装置のそれぞれが発した非偏光を回折させる。

いくつかの実施形態では、第１の複数の縞及び第２の複数の縞の光路を合成する光学素子は、穴あきミラーを含み、ミラーは第１の回折格子により回折された光を反射するよう配置され、穴は第２の回折格子により回折された少なくとも１次光（first orders of light）を通過させるよう配置される。いくつかの実施形態では、第１のアーム及び第２のアームの光路を合成する光学素子は、偏光ビームスプリッタを含み、第１の回折格子が垂直偏光を回折させ、第２の回折格子が水平偏光を回折させる。

いくつかの実施形態では、多アームＳＩＭイメージングシステムは、第１の複数の縞及び第２の複数の縞を位相シフトさせる１つ又は複数の光学素子を含む。

いくつかの実施形態では、第１の複数の縞及び第２の複数の縞を位相シフトさせる１つ又は複数の光学素子は、第１の複数の縞を位相シフトさせる第１の回転光学窓と、第２の複数の縞を位相シフトさせる第２の回転光学窓とを含む。いくつかの実施形態では、第１の複数の縞及び第２の複数の縞を位相シフトさせる１つ又は複数の光学素子は、第１の回折格子を並進させる第１の直線運動ステージと、第２の回折格子を並進させる第２の直線運動ステージとを含む。いくつかの実施形態では、第１の複数の縞及び第２の複数の縞を位相シフトさせる１つ又は複数の光学素子は、単一の回転光学窓を含み、単一の回転光学窓は、試料までの光路において穴あきミラーの後に位置決めされる。

いくつかの実施形態では、単一の回転光学窓の回転軸は、格子のそれぞれの光軸から約４５°オフセットされる。

いくつかの実施形態では、第１の複数の縞は、試料平面上の第２の複数の縞から約９０°の角度でオフセットされる。

いくつかの実施形態では、システムは、第１の複数の縞及び第２の複数の縞のそれぞれを試料に投影する対物レンズも含む。

いくつかの実施形態では、システムは、第１及び第２の回折格子のそれぞれが発した０次光（zero orders of light）を遮断する１つ又は複数の光ビームブロッカも含む。特定の実施形態では、１つ又は複数の光ビームブロックはブラッグ格子を含む。

多アームＳＩＭイメージングシステムの一実施形態では、方法が、構造化照明システムの第１の光アームをオンにするステップであり、第１の光アームは、発光する第１の発光装置及び特定の方向に向いた第１の複数の縞を試料の平面に投影するよう第１の発光装置が発した光を回折させる第１の回折格子を含むステップと、試料の第１の複数の位相画像を取り込むステップであり、第１の複数の画像の取り込み中に第１の複数の縞の位置を試料の平面上でシフトさせるステップと、構造化照明システムの第２の光アームをオンにするステップであり、第２の光アームは、発光する第２の発光装置及び第２の複数の縞を試料の平面に投影するよう第２の発光装置が発した光を回折させる第２の回折格子を含み、第２の複数の縞は、試料の平面上で第１の複数の縞から角度がオフセットされるステップと、第２の複数の縞で照明された試料の第２の複数の位相画像を取り込むステップであり、第２の複数の画像の取り込み中に第２の複数の縞の位置を試料の平面上でシフトさせるステップとを含む。この方法の実施形態において、第１の回折格子及び第２の回折格子は透過型回折格子であり、構造化照明システムは、第１の回折格子により回折された光を反射して第２の回折格子により回折された少なくとも１次光を通過させる穴あきミラーを含む。

実施形態では、本方法は、少なくとも取り込まれた第１の複数の位相画像及び取り込まれた第２の複数の位相画像を用いて、取り込まれた第１及び第２の複数の位相画像のそれぞれよりも高い解像度を有する１つ又は複数の画像を計算的に再構成するステップをさらに含む。実施形態では、第１の複数の縞は、試料平面上で第２の複数の縞から約９０°の角度でオフセットされる。

実施形態では、第１の複数の縞及び第２の複数の縞は、試料と第１及び第２の格子のそれぞれとの間の光路に位置決めされた単一の光学窓を回転させることにより位相シフトされ、単一の回転光学窓の回転軸は、格子のそれぞれの光軸からオフセットされる。

本方法の実施形態において、第１の複数の位相画像の取り込み後に、構造化照明システムの第１の光アームはオフにされ、構造化照明システムの第２の光アームはオンにされる。

本方法の実施形態において、第１の回折格子及び第２の回折格子は、画像取り込み中に機械的に固定される。

第２の組の実施形態において、ＳＩＭイメージングシステムは、多ビームスプリッタスライド（multiple beam splitter slide）ＳＩＭイメージングシステムとして実現することができ、１つの直線運動ステージに、システムの光軸に対して対応する固定の向きを有する複数のビームスプリッタが取り付けられる。

多ビームスプリッタスライドＳＩＭイメージングシステムの一実施形態では、システムは、発光する発光装置と、第１のビームスプリッタ及び第２のビームスプリッタが取り付けられた直線運動ステージであり、第１のビームスプリッタは、第１の複数の縞を試料の平面に投影するよう発光装置が発した光を分割し、第２のビームスプリッタは、第２の複数の縞を試料の平面に投影するよう発光装置が発した光を分割する直線運動ステージと、試料が発した光を集光するイメージセンサとを含む。実施形態では、直線運動ステージは１次元直線運動ステージであり、直線運動ステージは、１次元に沿って並進して第１のビームスプリッタ及び第２のビームスプリッタのそれぞれを発光装置に光学的に結合し、第１のビームスプリッタは、１次元に沿って第２のビームスプリッタに隣接する。実施形態では、第１の複数の縞は、試料表面上で第２の複数の縞から約９０°の角度でオフセットされる。

実施形態では、第１のビームスプリッタは第１の透過型回折格子を含み、第２のビームスプリッタは第２の透過型回折格子を含む。第１の回折格子及び第２の回折格子は、１次元から角度がオフセットされ（すなわち、光の伝播方向を軸に回転させられ）得る。特定の実施形態では、第１の回折格子及び第２の回折格子は、１次元から約±４５°の角度でオフセットされる。

いくつかの実施形態では、第１の回折格子及び第２の回折格子は、直線運動ステージに取り付けられた単一の光学素子に組み込まれ得る。回折格子が単一の光学素子に組み込まれる実施形態では、単一の光学素子は、第１の回折格子でパターン化された第１の辺と、第１の側に隣接する第２の回折格子でパターン化された第２の辺とを含み得る。

いくつかの実施形態では、システムは、第１及び第２の回折格子のそれぞれが発した０次光を遮断する１つ又は複数の光ビームブロッカをさらに含み得る。

いくつかの実施形態では、システムは、直線運動ステージと対物レンズとの間の光路に投影レンズをさらに含み得る。投影レンズは、第１の回折格子及び第２の回折格子のそれぞれのフーリエ変換を対物レンズの入射瞳に投影し得る。

いくつかの実施形態では、システムは、直線運動ステージに取り付けられたコンポーネントに形成されたアライメントパターンをさらに含むことができ、アライメントパターンは、撮像アライメント用のパターンを試料の平面に投影するよう発光装置が発した光を分割する。アライメントパターンは、第１の回折格子及び第２の回折格子の少なくとも一方を含む基板に形成され得る。投影されたパターンは、投影された第１の複数の縞及び第２の複数の縞よりも低い周波数を有する線を含み得る。

いくつかの実施形態では、システムは、試料の平面に投影される第１の複数の縞及び第２の複数の縞を位相シフトさせる光位相変調器をさらに含み得る。このような実施形態では、光位相変調器は、直線運動ステージとは別個のコンポーネントであり得る。

多ビームスプリッタスライドＳＩＭイメージングシステムの一実施形態では、方法が、構造化照明イメージングシステムの発光装置をオンにするステップであり、構造化照明イメージングシステムは第１の回折格子及び第２の回折格子が取り付けられた１次元直線運動ステージを含み、直線運動ステージは１次元に沿って並進するステップと、直線運動ステージを１次元に沿って並進させて、第１の回折格子により試料に投影された第１の複数の縞を位相シフトさせるステップと、直線運動ステージを並進させて、第２の回折格子を発光装置に光学的に結合するステップと、第２の回折格子を発光装置に光学的に結合した後に、直線運動ステージを１次元に沿って並進させて、第２の回折格子により試料に投影された第２の複数の縞を位相シフトさせるステップとを含む。第１の回折格子及び第２の回折格子は透過型回折格子であり得ると共に、１並進次元から角度がオフセットされ得る。例えば、第１の回折格子及び第２の回折格子は、１次元から約±４５°の角度でオフセットされ得る。

実施形態では、本方法は、直線運動ステージを１次元に沿って複数回並進させて、第１の回折格子により試料に投影された第１の複数の縞を複数回位相シフトさせるステップと、第２の回折格子を発光装置に光学的に結合した後に、直線運動ステージを１次元に沿って複数回並進させて、第２の回折格子により試料に投影された第２の複数の縞を複数回位相シフトさせるステップとをさらに含み得る。

実施形態では、本方法は、直線運動ステージを並進させて第１の複数の縞を位相シフトさせる度にその後に試料の画像を取り込むステップと、直線運動ステージを並進させて第２の複数の縞を位相シフトさせる度にその後に試料の画像を取り込むステップとをさらに含み得る。取り込み画像を用いて、取り込み画像のそれぞれよりも高い解像度を有する画像を計算的に再構成することができる。

本方法の実施形態では、第１の複数の縞又は第２の複数の縞が試料上で位相シフトされる度に、直線運動ステージを１次元に沿ってほぼ同じ距離だけ並進させる。

特定の実施形態では、第２の回折格子が発光装置に光学的に結合されるときに、直線運動ステージを約１０ｍｍ〜１５ｍｍ並進させる。

第３の組の実施形態では、ＳＩＭイメージングシステムは、パターン角度空間選択ＳＩＭイメージングシステムとして実現することができ、固定２次元回折格子を空間フィルタホイールと組み合わせて用いて１次元縞パターンを試料に投影する。

パターン角度空間選択ＳＩＭイメージングシステムの一実施形態では、システムは、発光する発光装置と、第１の方向に向いた第１の複数の縞を試料平面に投影し且つ第１の方向に対して垂直な第２の方向に向いた第２の複数の縞を試料表面に投影するよう発光装置が発した光を回折させる２次元回折格子と、第１又は第２の方向のいずれか一方（a respective one of the first or second directions）で２次元回折格子から受光された回折光を通過させて第１又は第２の方向のいずれか一方の光を遮断する空間フィルタホイールであり、第１の複数の開口及び第１の複数の開口に直交する第２の複数の開口を含む空間フィルタホイールとを含む。第１の複数の開口は、２次元回折により回折された光を第１の方向に通過させることができ、第２の複数の開口は、２次元回折により回折された光を第２の方向に通過させることができる。

いくつかの実施形態では、システムは、２次元回折格子を透過した０次光を遮断するビーム遮断素子をさらに含む。特定の実施形態では、ビーム遮断素子は、当該素子に対して垂直な光を反射して他の角度の光を通過させるようパターン化された回折光学素子を含む。

いくつかの実施形態では、空間フィルタホイールは、２次元回折格子から受光されて通過しない回折次数光を反射する。

いくつかの実施形態では、２次元回折格子は透過型回折格子である。透過型回折格子は、固体光学素子（solid optic）のうち発光装置から受光する面上に配置又は形成され得る。透過型回折格子は、０次光が固体光学素子のうちの反対側で遮断されるような分散角となるよう配置され得る。いくつかの実施形態では、固体光学素子は、２次元透過型回折格子により回折された１次光を回折させて出力する斜面を含む。特定の実施形態では、斜面は集束レンズを含む。いくつかの実施形態では、投影レンズが固体光学素子により出力された光を受光する。

いくつかの実施形態では、２次元回折格子は２次元反射型回折格子である。２次元反射型回折格子は、発光装置から受光する固体光学素子の開口とは反対側の面上に配置又は形成され得る。固体光学素子は、２次元反射型回折格子により回折された１次光を反射して固体光学素子の出口面を通して出力する反射内面を含み得る。特定の実施形態では、出口面は回折集束レンズを含む。いくつかの実施形態では、投影レンズは固体光学素子により出力された光を受光する。

いくつかの実施形態では、システムは、第１の複数の縞及び第２の複数の縞を位相シフトさせる１つ又は複数の光学素子をさらに含む。特定の実施形態では、第１の複数の縞及び第２の複数の縞を位相シフトさせる１つ又は複数の光学素子は、直交する２方向に傾斜した平行平板光学素子を含む。

パターン角度空間選択ＳＩＭイメージングシステムの一実施形態では、方法が、２次元回折格子を含む構造化照明イメージングシステムの発光装置をオンにするステップと、発光装置が発した光を２次元回折格子で受光して、第１の方向に向いた第１の回折光及び第１の方向に対して垂直な第２の方向に向いた第２の回折光を出力するステップと、第１の回折光を空間フィルタホイールの第１の複数の開口に通過させ第２の回折光を空間フィルタホイールで遮断するステップと、第１の複数の穴を通過した第１の回折光を第１の複数の縞として試料平面に投影するステップと、試料が発した光の第１の複数の位相画像を取り込むステップであり、第１の複数の画像の取り込み中に第１の複数の縞を試料平面上で位相シフトさせるステップとを含む。第１の複数の縞は、試料の移動（例えば、運動ステージの使用）、投影縞の移動、又は試料及び投影縞両方の移動により位相シフトされ得る。

実施形態では、本方法は、第２の回折光を空間フィルタホイールの第２の複数の開口に通過させ第１の回折光を空間フィルタホイールで遮断するように空間フィルタホイールを回転させるステップと、第２の複数の穴を通過する第２の回折光を第１の複数の縞に直交する第２の複数の縞として試料平面に投影するステップと、試料が発した光の第２の複数の位相画像を取り込むステップであり、第２の複数の画像の取り込み中に第２の複数の縞を試料平面上で位相シフトさせるステップとをさらに含む。

本方法の特定の実施形態では、２次元回折格子は、固体光学素子の１面上に形成又は配置された２次元透過型回折格子であり、本方法は、透過型回折格子により出力された０次光を固体光学素子のうち透過型回折格子とは反対側で遮断するステップと、２次元透過型回折格子により回折された１次光を固体光学素子の斜面から回折させて出力するステップとをさらに含む。

本方法の特定の実施形態では、２次元回折格子は、発光装置から受光する固体光学素子の開口とは反対側の固体光学素子の面上に形成又は配置された２次元反射型回折格子であり、本方法は、２次元反射型回折格子により回折された１次光を固体光学素子の複数面で反射するステップをさらに含む。

開示技術の他の特徴及び態様は、例として開示技術の本明細書に記載のいくつかの実施形態による特徴を示す添付図面と共に以下の詳細な説明を読めば明らかとなるであろう。発明の概要は、特許請求の範囲及び等価物により定められる本明細書に記載の発明の範囲を制限するためのものではない。

当然ながら、上記概念の全ての組み合わせは（かかる概念が相互に矛盾しない場合）、本明細書に開示される発明の主題の一部と考えられる。特に、本開示の最後に載せた特許請求の範囲に記載の主題の全ての組み合わせが、本明細書に開示される発明の主題の一部と考えられる。

本明細書に記載のいくつかの実施形態による、試料を空間構造化光で照明する構造化照明イメージングシステムを示す。 本明細書に記載のいくつかの実施形態による、２アーム構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ）イメージングシステムの例示的な一光学構成を示す光路図である。 本明細書に記載のいくつかの実施形態による、２アームＳＩＭイメージングシステムの別の例示的な光学構成を示す光路図である。 本明細書に記載のいくつかの実施形態による、２アームＳＩＭイメージングシステムの別の例示的な光学構成を示す光路図である。 本明細書に記載のいくつかの実施形態による、構造化光を用いて高解像度画像を作成する１撮像サイクル中の多アームＳＩＭイメージングシステムにより実施され得る例示的な方法を示す動作フロー図である。 本明細書に記載のいくつかの実施形態による、画像取り込み中に２アームＳＩＭイメージングシステムの垂直格子及び水平格子により試料の平面に投影され得る簡略化した照明縞パターンを示す。 本明細書に記載のいくつかの実施形態による、偏光ビームスプリッタを用いて垂直格子を垂直偏光で照明し水平格子を水平偏光で照明する２アームＳＩＭイメージングシステムの例示的な実験設計を示す。 ２０ｘ／０．７５ＮＡ顕微鏡を用いた図７の例示的なＳＩＭイメージングシステムを用いて取り込まれたアフォーカルミラー（afocal mirror）画像及び蛍光スライドを示す。 ビーズ状（beaded：数珠状）フローセルと共に図７のシステムを用いて取得された縞変調測定値を示し、図７の平行平板Ｗ２の角度の変化に伴うこの例の位相調整サイクル中の通常のフィーチャ画像強度の変化を示すグラフである。 本明細書に記載のいくつかの実施形態による２アームＳＩＭイメージングシステムの別の例示的な光学構成を示す。 本明細書に記載のいくつかの実施形態による、二重（dual）光学格子スライドＳＩＭイメージングシステムの第１の回折格子位置での例示的な光学構成を示す概略図である。 本明細書に記載のいくつかの実施形態による、図１０Ａの二重光学格子スライドＳＩＭイメージングシステムの第２の回折格子位置での例示的な光学構成を示す概略図である。 本明細書に記載のいくつかの実施形態による、構造化光を用いて高解像度画像を作成する１撮像サイクル中の多光学格子スライドＳＩＭイメージングシステムにより実施され得る例示的な方法を示す動作フロー図である。 本明細書に記載のいくつかの実施形態による、画像取り込み中に二重光学格子スライドＳＩＭイメージングシステムの第１の回折格子及び第２の回折格子により試料の平面に投影され得る簡略化した照明縞パターンを示す。 本明細書に記載のいくつかの実施形態による例示的な二重光学格子スライドＳＩＭイメージング構成を示す図である。 本明細書に記載のいくつかの実施形態によるパターン角度空間選択ＳＩＭイメージングシステムの例示的な光学構成を示す概略図である。 本明細書に記載のいくつかの実施形態によるパターン角度空間選択ＳＩＭイメージングシステムの別の例示的な光学構成を示す概略図である。 本明細書に記載のいくつかの実施形態によるパターン角度空間選択ＳＩＭイメージングシステムの別の例示的な光学構成を示す概略図である。 多光学格子スライドＳＩＭイメージングシステムのいくつかの実施形態で用いられ得るアライメントパターンの一例を示す。 本明細書に記載のいくつかの実施形態によるＳＩＭイメージングシステムのイメージセンサアセンブリ上に形成され得る試料を示す。 本明細書に記載のいくつかの実施形態による例示的な二重光学格子スライドＳＩＭイメージングシステムのいくつかのコンポーネントを示す。

本開示を、１つ又は複数の実施形態に従って添付の図を参照して詳細に説明する。図は、説明のためだけに提供されており、例示的な実施形態を示すものにすぎない。さらに、明確化のため且つ説明を容易にするために、図中の要素は必ずしも同一の縮尺となっていないことに留意されたい。

本明細書に含まれる図のいくつかは、開示技術の種々の実施形態を異なる視野角から示している。それに付随する説明文は、こうした視野を「上面」図、「下面」図、又は「側面」図と称する場合があるが、このような言及は説明的なものにすぎず、別段の明記のない限りは特定の空間的向きでの実施又は使用を意味することも必要とすることもない。

図は、網羅的なものではなく、本開示を開示された形態そのものに限定するものでもない。

本明細書において回折格子により回折された光の言及に用いる場合、用語「次」又は「次数」は、強め合う干渉に関する回折格子の隣接するスリット又は構造からの光の経路長差を表す整数波長の数を意味することが意図される。反復する一連の格子構造又は他のビーム分割構造に対する入射光ビームの相互作用により、光ビームの一部を原ビームから予測可能な角度方向に再指向又は回折させることができる。用語「０次」又は「０次極大（zeroth order maximum）」は、回折格子が発した回折のない中央の明るい縞を指すことが意図される。用語「１次」は、０次の縞の両側に回折された２つの明るい縞を指すことが意図され、経路長差は±１波長である。高次になるほど原ビームから大きな角度に回折される。格子の特性を操作して、どの程度のビーム強度を種々の次数に指向させるかを制御することができる。例えば、±１次の透過を最大にし且つ０次ビームの透過を最小にする位相格子を作製することができる。

本明細書において試料の言及に用いる場合、用語「フィーチャ」は、相対位置に従って他の点又は領域から区別できるパターン内の点又は領域を意味することが意図される。個々のフィーチャは、特定のタイプの１つ又は複数の分子を含み得る。例えば、フィーチャが特定の配列を有する単一の標的核酸分子を含み得るか、又はフィーチャが同じ配列（及び／又はその相補的配列）を有する複数の核酸分子を含み得る。

本明細書において、用語「ｘｙ平面」は、デカルト座標系において直線軸ｘ及びｙにより規定される２次元領域を意味することが意図される。検出器及び検出器により観察される物体に関して用いられる場合、この領域は、ビーム軸すなわち検出器と被検出物体との間の観察方向に直交するものとしてさらに指定され得る。

本明細書において、用語「ｚ座標」は、ｘｙ平面に直交する軸に沿った点、線、又は領域の位置を指定する情報を意味することが意図される。特定の実施形態において、ｚ軸は、検出器により観察される物体の領域に直交する。例えば、光学系のフォーカス方向は、ｚ軸に沿って指定され得る。

本明細書において、用語「光学的に結合され」は、ある要素が別の要素に直接的又は間接的に光を伝えるよう適合されることを指すことが意図される。

上記のように、ＳＩＭシステムの既存の実施形態は、回折格子を並進ステージに取り付け、並進ステージはさらに回転ステージに取り付けられる。さらに、このようなシステムは、多くの場合は格子での受光前に光源を偏光させる直線偏光子を利用する。この既存の設計には、高スループットの顕微鏡システムでの使用にとっていくつかの欠点がある。第１に、画像セットの取得中に回転ステージが格子を複数回（例えば、３回）回転させなければならず、これが機器を減速させてその安定性に影響を及ぼす。通常、ステージにより可能な格子の回転は最高で約数十ミリ秒（ｍｓ）であり、これは撮像速度に機械的スループット限界を課す。第２に、回転ステージの機械公差が画像取得セット毎の構造化照明パターンの再現性を制限するので、既存の設計は再現性が低い。これも、非常に精密な回転ステージが必要となるのでＳＩＭシステムのコストを増加させる。

第３に、既存のＳＩＭ設計は、格子を回転させるために行われる作動数により、高スループットの顕微鏡システムでの使用にとって最も信頼できるものではない。例えば、毎秒１つのＳＩＭ画像セットが取得される場合、回転ステージは、１年に数百万〜数千万回の作動を必要とし得る。第４に、既存のＳＩＭ設計は、直線偏光子が格子で受光された光の５０％以上を遮断するので光学効率が低い。

この目的で、本明細書に開示される実施形態は、ＳＩＭシステム及び方法の改良を対象とする。

本明細書に開示される技術の第１の組の実施形態によれば、ＳＩＭイメージングシステムは、多アームＳＩＭイメージングシステムとして実現することができ、システムの各アームが発光装置とシステムの光軸に対して特定の固定の向きを有するビームスプリッタ（例えば、透過型回折格子）とを含む。これらの実施形態によれば、ＳＩＭイメージングシステムのビームスプリッタは回転可能に固定され（すなわち、機械的回転を必要とせず）、これがシステム速度、信頼度、及び再現性の向上をもたらし得る。被撮像物体が主に直交する２軸に沿った（すなわち、垂直及び水平の）向きであるシステムでは、ランダムな向きの物体に通常用いられる３つの角度の代わりに２つのパターン角度を用いて空間分解能の向上を達成することが可能である。特定の実施形態では、システムは、各縞パターンを撮像試料に投影する固定垂直格子及び固定水平格子を含む２アームＳＩＭイメージングシステムとして実現され得る。試料物体の向きと位置合わせされるならば、他の直交格子対及びパターン角度を用いることができる。さらに、システムは、２つのアームを無損失で光路に合成する穴あきミラーを含み得る。

本明細書に開示される技術の第２の組の実施形態によれば、ＳＩＭイメージングシステムは、多ビームスプリッタスライドＳＩＭイメージングシステムとして実現することができ、１つの直線運動ステージに、システムの光軸に対して対応する固定の向きを有する複数のビームスプリッタ（例えば、回折格子）が取り付けられる。特定の実施形態では、ＳＩＭイメージングシステムは、二重光学格子スライドＳＩＭイメージングシステムとして実現することができ、撮像試料に投影された格子パターンの位相シフト及び回転の全てが、単一の運動軸に沿った運動ステージの直線並進により行われて、２つの格子の一方が選択され得るか又は選択された格子により生成されたパターンの位相シフトが行われ得る。このような実施形態では、単一の発光装置及び単一の直線運動ステージを有する単一の光アームしか試料の照明に必要なく、これにより可動システム部品数を減らす等のシステム上の利点が得られて速度、複雑さ、及びコストを改善することができる。さらに、このような実施形態では、偏光子がないことで光学効率が高いという利点を得ることができる。

本明細書に開示される技術の第３の組の実施形態によれば、ＳＩＭイメージングシステムは、パターン角度空間選択ＳＩＭイメージングシステムとして実現することができ、固定２次元回折格子を空間フィルタホイールと組み合わせて用いて１次元回折パターンを試料に投影する。このような実施形態では、イメージングシステムの主光学コンポーネントを固定のままとすることができ、これにより光学系（及び照明パターン）の安定性が向上し得ると共にシステムの可動素子の重量、振動出力、及びコストが最小化され得る。

本明細書に開示されるシステム及び方法の種々の実施形態を説明する前に、本明細書に開示される技術を実施できる例示的な環境を説明することが有用である。そのような例示的な環境の１つは、試料を空間構造化光で照明する図１に示す構造化照明イメージングシステム１００の環境である。例えば、システム１００は、空間構造化励起光を利用して生体試料を撮像する構造化照明蛍光顕微鏡システムであり得る。

図１の例では、発光装置１５０が、コリメーションレンズ１５１によりコリメートされる光ビームを出力するよう構成される。コリメート光は、光構造化光学アセンブリ１５５により構造化（パターン化）され、ダイクロイックミラー１６０により対物レンズ１４２を通して運動ステージ１７０上に位置決めされた試料容器１１０の試料へ向けられる。蛍光試料の場合、構造化励起光に応じて試料が蛍光を発し、得られた光は対物レンズ１４２により集光されカメラシステム１４０のイメージセンサへ向けられて蛍光が検出される。

以下でさらに説明する種々の実施形態の光構造化光学アセンブリ１５５は、試料容器１１０の試料に投影される光のパターン（例えば、縞、通常は正弦波状）を生成する１つ又は複数の光回折格子又は他のビーム分割素子（例えば、ビームスプリッタキューブ又はプレート）を含む。回折格子は、１次元又は２次元の透過型又は反射型格子であり得る。回折格子は、正弦波振幅格子又は正弦波位相格子であり得る。

特定の実施形態に関して以下でさらに説明するように、システム１００において、回折格子は上述した既存のシステムの通常の構造化照明顕微鏡システムのような回転ステージを必要としない。いくつかの実施形態では、回折格子は、イメージングシステムの動作中に固定され得る（すなわち、回転又は直線運動を必要としない）。例えば、以下でさらに説明する特定の実施形態では、回折格子は、相互に対して垂直な向きの２つの固定された１次元透過型回折格子（例えば、水平回折格子及び垂直回折格子）を含み得る。

図１の例に示すように、光構造化光学アセンブリ１５５は、１次の回折光ビーム（例えば、ｍ＝±１次）を出力する一方で０次を含む他の全ての次数を遮断又は最小化する。しかしながら、代替的な実施形態では、付加的な次数の光が試料に投影され得る。

各撮像サイクル中に、イメージングシステム１００は、光構造化光学アセンブリ１５５を利用して縞パターンを変調方向（例えば、ｘ−ｙ平面で縞に対して垂直）に対して横方向に変位させた種々の位相で複数の画像を取得し、光軸周りで（すなわち、試料のｘ−ｙ平面に対して）パターンの向きを回転させることによりこの手順を１回又は複数回繰り返す。取り込み画像を続いて計算的に再構成して、より高い解像度の画像（例えば、個々の画像の横空間分解能の約２倍を有する画像）を生成することができる。

システム１００において、発光装置１５０は、インコヒーレント発光装置（例えば、１つ又は複数の励起用ダイオードにより出力される光ビームを発する）又は１つ又は複数のレーザ又はレーザダイオードにより出力される光の発光装置等のコヒーレント発光装置であり得る。システム１００の例に示すように、発光装置１５０は、出力される光ビームを誘導する光ファイバ１５２を含む。しかしながら、発光装置１５０の他の構成を用いてもよい。マルチチャネルイメージングシステム（例えば、複数の光波長を利用するマルチチャネル蛍光顕微鏡）で構造化照明を利用する実施形態では、光ファイバ１５２は、それぞれが異なる波長の光を発する複数の異なる光源（図示せず）に光学的に結合し得る。システム１００は単一の発光装置１５０を有するものとして示されているが、実施形態によっては複数の発光装置１５０が含まれ得る。例えば、以下でさらに説明する複数のアームを利用する構造化照明イメージングシステムの場合、複数の発光装置が含まれ得る。

いくつかの実施形態によれば、システム１００は、構造化ビームの形状及び経路を調整するようｚ軸に沿って関節運動する（articulate）レンズ素子を含み得る投影レンズ１５６を含み得る。例えば、投影レンズのコンポーネントは、容器１１０内の試料のある範囲の試料厚さ（例えば、異なるカバーガラスの厚さ）に対応するよう関節運動し得る。

システム１００の例では、流体供給モジュール又は装置１９０が、試料容器１１０及び逃がし弁１２０へ（且つそれを通して）試薬（例えば、蛍光標識ヌクレオチド、緩衝液、酵素、切断試薬等）の流れを向けることができる。試料容器１１０は、試料が設けられる１つ又は複数の基板を含むことができる。例えば、多数の異なる核酸配列を解析するシステムの場合、試料容器１１０は、シーケンシングすべき核酸が結合、付着、又は関連する１つ又は複数の基板を含むことができる。基板は、核酸を付着させることができる任意の不活性基板又は基質、例えばガラス表面、プラスチック表面、ラテックス、デキストラン、ポリスチレン表面、ポリプロピレン表面、ポリアクリルアミドゲル、金表面、及びシリコンウェハ等を含み得る。用途によっては、基板は、チャネル又は他の領域内で試料容器１１０にわたって行列又はアレイ状に形成された複数の位置にある。システム１００は、試料容器１１０内の流体の状態の温度（temperature of conditions）を任意に調節することができる温度ステーションアクチュエータ１３０及びヒータ／クーラ１３５も含み得る。

特定の実施形態では、試料容器１１０は、透光性カバープレート、基板、及びこれらの間に収容された液体を含むパターン化フローセルとして実現することができ、生体試料を透光性カバープレートの内面又は基板の内面に位置付けることができる。フローセルは、基板に画定されたアレイ（例えば、六角形アレイ、矩形アレイ等）状にパターン化された多数の（例えば、数千個、数百万個、又は数十億個）のウェル又は領域を含み得る。各領域は、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、又は１塩基合成反応（sequencing by synthesis）を用いてシーケンシングされ得る別のゲノム材料等の生体試料のクラスタ（例えば、モノクローナルクラスタ）を形成し得る。フローセルは、それぞれが六角形のクラスタアレイを含む複数の離間したレーン（例えば、８つのレーン）にさらに分割され得る。本明細書に開示される実施形態で用いられ得る例示的なフローセルは、米国特許第８，７７８，８４８号に記載されている。

試料容器１１０を試料ステージ１７０に取り付けて、対物レンズ１４２に対する試料容器１１０の移動及び位置合わせを行うことができる。試料ステージは、３次元のうちのいずれかでこれを移動させる１つ又は複数のアクチュエータを有することができる。例えば、デカルト座標系に関して、ステージを対物レンズに対してＸ方向、Ｙ方向、及びＺ方向にさせるアクチュエータを設けることができる。これにより、試料容器１１０上の１つ又は複数の試料位置を対物レンズ１４２と光学的に位置合わせして位置決めすることができるようになる。対物レンズ１４２に対する試料ステージ１７０の移動は、試料ステージ自体、対物レンズ、イメージングシステムの他の何らかのコンポーネント、又は上記の任意の組み合わせを移動させることにより達成することができる。いくつかの実施形態では、試料ステージ１７０の移動を構造化照明撮像中に実施して、構造化照明縞を試料に対して移動させて位相を変えてもよい。さらに他の実施形態は、固定された試料上でイメージングシステム全体を移動させることも含み得る。代替として、試料１１０が撮像中に固定され得る。

いくつかの実施形態では、試料容器１１０に対する光学コンポーネントのフォーカス方向（通常はｚ軸又はｚ方向と称する）の位置決めを制御するフォーカス（ｚ軸）コンポーネント１７５が含まれ得る。フォーカスコンポーネント１７５は、光学ステージ若しくは試料ステージ又は両方に物理的に結合された１つ又は複数のアクチュエータを含むことができ、このアクチュエータは、試料ステージ１７０上の試料容器１１０を光学コンポーネント（例えば、対物レンズ１４２）に対して移動させて撮像動作に適した合焦をもたらす。例えば、アクチュエータは各ステージに、例えばステージに対する直接的又は間接的な機械的、流体的、若しくは他の取り付け又は接触等により物理的に結合され得る。１つ又は複数のアクチュエータは、試料ステージを同じ平面に維持しつつ（例えば、光軸に対して垂直なレベル又は水平姿勢を維持しつつ）ステージをｚ方向に移動させるよう構成することができる。１つ又は複数のアクチュエータは、ステージを傾斜させるように構成することもできる。これは例えば、試料容器１１０をその表面の傾きに対応するよう動的に水平化することができるように行われ得る。

当然ながら、図１は、２つのビーム次数を合成して干渉縞パターンとして撮像試料に投影するための対物レンズ１４２の使用を示しているが、他の適当な手段を用いて２つのビームを合成し且つ／又は干渉パターンを試料に投影してもよい。ビームが通過する経路長がビームの時間的コヒーレンス長内にあれば、（例えば、ミラーを用いた）ビームを再指向させる任意の手段で十分であり得る。さらに、いくつかの実施形態では、２つのビーム次数はビームスプリッタ（例えば、回折格子）を越える距離では自動的に重畳し得る。このような実施形態では、干渉パターンが格子付近に現れ、回折格子が試料に十分に近く配置されている場合は付加的な投影システムの必要がなくなる。したがって、当然ながら、本明細書に記載のＳＩＭの実施形態は、干渉パターンを投影するのに対物レンズ系に依存しないシステムに適用され得る。

撮像中の試料位置にある試験試料から出る構造化光は、ダイクロイックミラー１６０を通してカメラシステム１４０の１つ又は複数の検出器へ向けることができる。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のエミッションフィルタを有するフィルタ切替アセンブリ１６５を含むことができ、１つ又は複数のエミッションフィルタを用いて、特定の発光波長を通過させて他の発光波長を遮断（又は反射）することができる。例えば、１つ又は複数のエミッションフィルタを用いて、イメージングシステムの異なるチャネル間の切り替えが行われ得る。特定の実施形態では、エミッションフィルタは、異なる波長の発光をカメラシステム１４０の異なるイメージセンサへ向けるダイクロイックミラーとして実現され得る。

カメラシステム１４０は、試料容器１１０の撮像（例えば、シーケンシング）を監視及び追跡する１つ又は複数のイメージセンサを含むことができる。カメラシステム１４０は、例えば電荷結合素子（ＣＣＤ）イメージセンサカメラとして実現することができるが、アクティブピクセルセンサ（例えば、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）イメージセンサ）等の他のイメージセンサ技術を用いることができる。いくつかの実施形態では、構造化照明イメージングシステム１００は、試料のアクティブ面におけるイメージセンサ（例えば、アクティブピクセルセンサ）を利用し得る。このような実施形態では、撮像試料は、イメージセンサ上にパターン化及び／又は位置合わせされ得る。

カメラシステム１４０からの出力データ（例えば、画像）は、リアルタイム分析モジュール（図示せず）に通信することができ、このリアルタイム分析モジュールは、以下でさらに説明するように、各撮像サイクル中に取り込まれた画像を再構成してより高い空間分解能を有する画像を生成することができるソフトウェアアプリケーションとして具現され得る。代替として、出力データは後で再構成するために記憶され得る。

図示はしないが、構造化照明イメージングシステム１００の種々の光学コンポーネントの同期を含むシステム１００の動作を制御するコントローラを設けることができる。コントローラは、システム動作の態様、例えば光構造化光学アセンブリ１５５の構成（例えば、回折格子の選択及び／又は直線並進）、投影レンズ１５６の移動、合焦、ステージ移動、及び撮像動作を制御するよう実装され得る。種々の実施形態において、コントローラは、ハードウェア、アルゴリズム（例えば、機械実行可能な命令）、又は上記の組み合わせを用いて実装され得る。例えば、いくつかの実施形態では、コントローラは、関連するメモリを有する１つ又は複数のＣＰＵ又はプロセッサを含み得る。別の例として、コントローラは、コンピュータプロセッサ及び機械可読命令が記憶された非一時的なコンピュータ可読媒体等、動作を制御するハードウェア又は他の回路を含み得る。例えば、この回路は、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、特定用途向け位集積回路（ＡＳＩＣ）、プログラマブルロジックデバイス（ＰＬＤ）、コンプレックスプログラマブルロジックデバイス（ＣＰＬＤ）、プログラマブルロジックアレイ（ＰＬＡ）、プログラマブルアレイロジック（ＰＡＬ）、又は他の同様の処理装置又は回路の１つ又は複数を含み得る。さらにまた別の例として、コントローラは、この回路と１つ又は複数のプロセッサとの組み合わせを含み得る。

多アーム構造化照明顕微鏡イメージングシステム
本明細書に開示する技術のいくつかの実施形態によれば、ＳＩＭイメージングシステムは、多アームＳＩＭイメージングシステムとして実現することができ、システムの各アームが発光装置とシステムの光軸に対して特定の固定の向きを有するビームスプリッタとを含む。

図２は、本明細書に記載のいくつかの実施形態による２アームＳＩＭイメージングシステム２００の例示的な一光学構成を示す光路図である。システム２００の第１のアームは、発光装置２１０Ａ、発光装置２１０Ａにより出力された光をコリメートする光コリメータ２２０Ａ、光軸に対して第１の向きの回折格子２３０Ａ、回転窓２４０Ａ、及び投影レンズ２５０Ａを含む。システム２００の第２のアームは、発光装置２１０Ｂ、発光装置２１０Ｂにより出力された光をコリメートする光コリメータ２２０Ｂ、光軸に対して第２の向きの回折格子２３０Ｂ、回転窓２４０Ｂ、及び投影レンズ２５０Ｂを含む。この例では回折格子が図示されているが、他の実施形態では、ビームスプリッタキューブ又はプレート等の他のビーム分割素子を用いてＳＩＭイメージングシステム２００の各アームで受光された光を分割してもよい。

各発光装置２１０Ａ、２１０Ｂは、インコヒーレント発光装置（例えば、１つ又は複数の発光ダイオード（ＬＥＤ）により出力される光ビームを発する）又は１つ又は複数のレーザ又はレーザダイオードにより出力される光の発光装置等のコヒーレント発光装置であり得る。システム２００の例では、各発光装置２１０Ａ、２１０Ｂは、各コリメータ２２０Ａ、２２０Ｂによりコリメートされる光ビームを出力する光ファイバである。

いくつかの実施形態では、各光ファイバは、レーザ等の対応する光源（図示せず）に光学的に結合され得る。撮像中に、各光ファイバは、ファイバと光源との間の光路に位置決めされた高速シャッタ（図示せず）により、又は撮像中に所定の周波数でファイバの対応する光源をパルス化することによりオンオフを切り替えることができる。いくつかの実施形態では、各光ファイバは、同じ光源に光学的に結合され得る。このような実施形態では、ビームスプリッタ又は他の適当な光学素子を用いて、光源から光ファイバのそれぞれに光が誘導され得る。このような例では、各光ファイバは、ファイバとビームスプリッタとの間の光路に位置決めされた高速シャッタ（図示せず）を用いてオンオフを切り替えることができる。

例示的なＳＩＭイメージングシステム２００では、第１のアームは、第１の向きの格子パターン（例えば、縦縞パターン）を試料に投影する固定垂直格子２３０Ａを含み、第２のアームは、第２の向きの格子パターン（例えば、横縞パターン）を試料２７１に投影する固定水平格子２３０Ｂを含む。既存のＳＩＭイメージングシステムとは異なり、ＳＩＭイメージングシステム２００の格子は機械的に回転も並進もさせる必要がなく、これはシステム速度、信頼度、及び再現性の向上をもたらし得る。

図２の例に示すように、格子２３０Ａ、２３０Ｂは、ガラス基板又は他の適当な表面に形成された複数の回折素子（例えば、平行なスリット又は溝）を含む透過型回折格子であり得る。格子は、格子材料の屈折率の周期的な変化を与える位相格子として実現され得る。溝又はフィーチャ間隔は、光を適当な角度で回折させるよう選択され得ると共に、ＳＩＭイメージングシステム２００の動作に関する撮像試料の最小分解可能フィーチャサイズに調整され得る。他の実施形態では、格子は反射型回折格子であり得る。

ＳＩＭイメージングシステム２００の例では、縦及び横パターンが約９０°オフセットされる。他の実施形態では、格子の他の向きを用いて約９０°のオフセットを作ってもよい。例えば、格子は、試料２７１のｘ又はｙ平面から±４５°オフセットした像を投影するような向きであり得る。例示的なＳＩＭイメージングシステム２００の構成は、矩形グリッド上にフィーチャを有する規則的にパターン化された試料２７１の場合に特に有利であり得るが、それは直交する２つの格子（例えば、垂直格子及び水平格子）のみを用いて構造化分解能向上（structured resolution enhancement）を達成できるからである。

システム２００の例の格子２３０Ａ、２３０Ｂは、入力ビームを複数の次数（例えば、０次、±１次、±２次等）に回折させるよう構成され、そのうちの±１次を試料２７１に投影することができる。この例に示すように、垂直格子２３０Ａは、コリメート光ビームを１次回折ビーム（±１次）に回折させて紙面の平面方向にこれを広げ、水平格子２３０Ｂは、コリメート光ビームを１次回折ビームに回折させて紙面に対して上下方向に（すなわち、紙面に対して垂直な平面で）これを広げる。システムの効率を上げるために、０次ビーム及び他の全ての高次ビーム（すなわち、±２次以上）は遮断（すなわち、試料２７１に投影された照明パターンから除去）され得る。例えば、次数フィルタ等のビーム遮断素子（図示せず）が、各回折格子の後の光路に挿入されて０次ビーム及び高次ビームを遮断し得る。いくつかの実施形態では、回折格子２３０Ａ、２３０Ｂはビームを１次のみに回折させるよう構成され、０次（非回折ビーム）は何らかのビーム遮断素子により遮断され得る。

各アームは、格子２３０のそれぞれにより出力された回折光を位相シフトさせる光位相変調器又は位相シフタ２４０Ａ、２４０Ｂを含む。例えば、構造化撮像中に、各回折ビームの光位相が構造化パターンの各縞のピッチ（λ）の数分の一（例えば、１／２、１／３、１／４等）だけシフトされ得る。図２の例では、位相変調器２４０Ａ及び２４０Ｂは、ガルバノメータ又は他の回転アクチュエータを用いて各回折ビームを回転させその光路長を変調することができる回転窓として実現され得る。例えば、窓２４０Ａは、鉛直軸周りに回転して垂直格子２３０Ａにより試料２７１に投影された像を左右にシフトさせ、窓２４０Ｂは、水平軸周りに回転して水平格子２３０Ｂにより試料２７１に投影された像を上下にシフトさせることができる。

以下でさらに説明する他の実施形態では、回折光の光路長を変える他の位相変調器（例えば、直線並進ステージ、ウェッジ等）が用いられ得る。さらに、光位相変調器２４０Ａ、２４０Ｂは格子２３０Ａ、２３０Ｂの後に配置されるものとして図示されているが、他の実施形態では照明システムにおける他の位置に配置され得る。いくつかの実施形態では、以下で説明するように、単一の位相変調器が縞パターン毎に異なる２つの方向に動作し得るか、又は単一の位相変調器が単一の運動を用いて両方の経路長を調整し得る。

例示的なシステム２００において、穴２６１を有するミラー２６０が２つのアームを無損失で（例えば、反射コーティングでのわずかな吸収以外は光パワーを大きく損なわずに）光路に結合する。ミラー２６０は、格子のそれぞれからの回折次数が空間的に分解されて不要な次数を遮断できるように位置付けることができる。ミラー２６０は、第１のアームにより出力された１次光を穴２６１に通過させる。ミラー２６０は、第２のアームにより出力された１次光を反射する。したがって、構造化照明パターンは、各発光装置をオンオフすることにより、又は光ファイバケーブルを通して光源の光を導く光シャッタを開閉することにより、垂直の向き（例えば、格子２３０Ａ）から水平の向き（例えば、格子２３０Ｂ）に切り替えられ得る。他の実施形態では、構造化照明パターンは、光スイッチを用いて試料を照明するアームを変えることにより切り替えることができる。

例示的なイメージングシステム２００には、投影レンズ２６５、半反射ミラー２８０、対物レンズ２７０、及びカメラ２９０も示されている。投影レンズ２６５は、レンズ２５０Ａと共に利用されて格子２３０Ａのフーリエ変換を対物レンズ２７０の入射瞳に投影し得る。同様に、投影レンズ２６５は、レンズ２５０Ｂと共に利用されて格子２３０Ｂのフーリエ変換を対物レンズ２７０の入射瞳に投影し得る。投影レンズ２６５は、ｚ軸に沿って関節運動して試料平面上の格子フォーカスを調整するよう実装することもできる。半反射ミラー２８０は、各アームから受光された構造化照明光を対物レンズ２７０まで反射して試料２７１に投影させると共に、試料２７１が発した光（例えば、励起とは異なる波長で発した蛍光）をカメラ２９０まで通過させるダイクロイックミラーであり得る。

注目すべきは、システム２００の例が、偏光子がないことにより高い光学効率をもたらし得ることである。さらに、非偏光の使用が、対物レンズ２７０の開口数設定に応じてパターンコントラストに大きな影響を与えることはない。

簡単のために、ＳＩＭイメージングシステム２００の光学コンポーネントが上記説明から省かれている場合があることに留意されたい。さらに、システム２００はこの例ではシングルチャネルシステムとして示されているが、他の実施形態ではマルチチャネルシステムとして（例えば、２つの異なるカメラ及び２つの異なる波長で発光する光源を用いることにより）実現され得る。

図３は、本明細書に記載のいくつかの実施形態による２アームＳＩＭイメージングシステム３００の別の例示的な光学構成を示す光路図である。システム３００において、大きな回転光学窓３１０が穴２６１を有するミラー２６０の後に配置され得る。この場合、窓３１０を窓２４０Ａ及び２４０Ｂの代わりに用いて、垂直及び水平回折格子により出力された両組の回折ビームの位相を変調することができる。格子の一方の光軸に対して平行である代わりに、回転窓１３０の回転軸は、垂直及び水平格子のそれぞれの光軸から４５°オフセット（又は他の何らかの角度オフセット）して、窓３１０の１つの共通回転軸に沿った両方向に沿った位相シフトを可能にし得る。いくつかの実施形態では、回転窓３１０の代わりに楔形の光学素子を公称ビーム軸周りに回転させてもよい。

図４は、本明細書に記載のいくつかの実施形態による２アームＳＩＭイメージングシステム４００の別の例示的な光学構成を示す光路図である。システム４００において、格子２３０Ａ及び２３０Ｂはそれぞれの直線運動ステージ４１０Ａ及び４１０Ｂに取り付けられ、直線運動ステージ４１０Ａ及び４１０Ｂを並進させて格子２３０Ａ及び２３０Ｂが発した光の光路長（したがって位相）を変えることができる。直線運動ステージ４１０Ａ、４１０Ｂの運動軸をそれぞれの格子の向きに対して垂直又は他の角度でオフセットさせて、試料２７１に沿った格子のパターンの並進を実現することができる。実施形態では、ステージ４１０Ａ及び４１０Ｂは、それぞれがクロスローラベアリング、リニアモータ、高精度リニアエンコーダ、及び／又は他の技術を利用して格子を精密に直線並進させ、投影像を位相シフトさせることができる。

図５は、本明細書に記載のいくつかの実施形態による、構造化光を用いて高解像度画像を作成する１撮像サイクル中の多アームＳＩＭイメージングシステムにより実施され得る例示的な方法５００を示す動作フロー図である。実施形態では、方法５００は、試料全体又はより大きな試料の一部を撮像するために実施され得る。方法５００は、図６と併せて説明されるものであり、図６は、画像取り込み中に２アームＳＩＭイメージングシステムの垂直格子及び水平格子により試料２７１の平面に投影され得る簡略化した照明縞パターンを示す。例えば、ＳＩＭイメージングシステム２００は、垂直格子２３０Ａ及び水平格子２３０Ｂを用いて図６に示す垂直及び水平照明パターンを生成することができ、位相変調器２３０Ａ及び２３０Ｂは、図示の３つの位相シフトを生成するよう３つの異なる位置に設定され得る。

動作５１０において、第１の格子向きに対応する第１のアームをオンにして、第１のアームを用いた照明パターンの生成を開始する。例えば、イメージングシステム２００の実施形態において、光ファイバ２１０Ａと光源との間の経路に位置決めされた高速シャッタを開くか又は他の方法で作動させて、光源が遮断されないようにすることができる。代替として、１つ又は複数の光源をオンオフ（例えばパルス化）してもよく、又は光スイッチを用いて第１のアームの光路を通して（例えば、第１又は第２の発光装置の一方を通して）光源を導いてもよい。場合によっては、動作５１０は、光源をオンにすることも含み得る（例えば、最初の撮像サイクルの場合）。

第１のアームがオンにされたら、動作５２０において、第１の格子パターンを試料に投影して画像を取り込むことができる。例えば、図６に示すように、垂直格子２３０Ａが１次照明縞を試料２７１に投影し得る。試料が発した光はカメラ２９０により取り込むことができ、第１のパターン（例えば、縦パターン）の第１の位相画像を取り込むことができる。例えば、試料２７１の種々のフィーチャに位置する蛍光染料が蛍光を発し、得られる光が対物レンズ２７０により集光されカメラ２９０のイメージセンサへ向けられて蛍光が検出され得る。

追加の位相シフト画像を取り込む必要がある場合（判定５３０）、動作５４０において、格子により投影されたパターンを位相シフトさせてパターンの次の位相画像を取り込むことができる。例えば、システム２００の実施形態では、垂直格子２３０Ａにより投影されたパターンの位相が光学窓２４０Ａの回転により位相シフトされ得る。代替として、並進ステージ又は回転光学ウェッジ等の他の光位相変調器を用いて位相をシフトさせてもよい。例えば、図６の例に示すように、試料に投影されたパターンが前に取り込まれた画像から１／３λオフセットされるように、位相を縞パターンのピッチ（λ）の１／３シフトさせることができる。いくつかの実施形態では、格子により投影されたパターンは、投影縞を固定したまま（例えば、運動ステージを用いて）試料を動かすことにより位相シフトさせることができる。いくつかの実施形態では、格子により投影されたパターンは、試料及び投影縞の両方を動かすことにより位相シフトさせることができる。第１のパターンの全位相画像が取り込まれる（例えば、図６の場合は縦パターンの３つの位相画像）まで、動作５２０〜５４０が繰り返され得る。

パターンの全位相画像が取り込まれたら、動作５６０において、ＳＩＭイメージングシステムの第２の格子向きに対応する第２のアームをオンにすることができる。例えば、イメージングシステム２００の実施形態において、光ファイバ２１０Ｂと光源との間の経路に位置決めされた高速シャッタを開くか又は他の方法で作動させて、光源が遮断されないようにすることができる。代替として、１つ又は複数の光源をオンオフ（例えばパルス化）してもよく、又は光スイッチを用いて第２のアームの光路を通して光源を導いてもよい。さらに、他方のアームがオフにされ得る。動作５２０〜５４０を繰り返すことにより、次のアームについて一連の位相画像を続いて取り込むことができる。例えば、図６に示すように、水平格子２３０Ｂが１次照明縞を試料２７１に投影することができ、投影縞の位置を１／３λシフトさせて横パターンの３つの位相画像を取り込むことができる。別の例として、格子により投影されたパターンは、投影縞を固定したまま（例えば、運動ステージを用いて）試料を動かすことにより、又は試料及び投影縞の両方を動かすことにより位相シフトさせることができる。

撮像サイクルで全画像が取り込まれたら、動作５７０において、取り込み画像から高解像度画像を再構成することができる。例えば、高解像度画像は、図６に示す６つの画像から再構成され得る。適当なアルゴリズムを用いてこれらの種々の画像を組み合わせて、個々の構成要素画像のいずれよりも大幅に高い空間分解能を有する試料の単一画像を合成することができる。

方法５００は、主にシングルチャネルイメージング（例えば、単一波長を有する光源を用いた試料の撮像）に関して記載しているが、いくつかの実施形態では、方法５００がマルチチャネルイメージング（例えば、異なる波長を有する複数光源を用いた試料の撮像）に適合され得ることに留意されたい。このような実施形態では、方法５００をイメージングシステムのチャネル毎に（例えば順次又は並行して）繰り返して、チャネル毎に高解像度画像を生成することができる。

本明細書に記載の２アームＳＩＭイメージングシステム２００の実施形態は、穴２６１を有するミラー２６０を利用して２つのアームの光路を無損失で合成するシステム２００に関してこれまでは記載しているが、代替的な実施形態では、穴あきミラーの代わりに変更ビームスプリッタを用いて垂直格子を垂直偏光で照明し水平格子を水平偏光で照明することにより、水平及び垂直格子２３０Ａ、２３０Ｂの２つの画像を無損失で合成することができる。このような実施形態では、構造化照明パターンは、対応する偏光照明源をオンオフすることにより水平から垂直に切り替えることができる。

例として、図７は、偏光ビームスプリッタを用いてアームの光路を合成し且つ垂直格子を垂直偏光で照明し水平格子を水平偏光で照明する、２アームＳＩＭイメージングシステム７００の例示的な実験設計を示す。図７の実施形態では、水平及び垂直格子はＧ１及びＧ２であり、水平及び垂直回転窓はＷ１及びＷ２であり、水平及び垂直格子像を合成するための偏光ビームスプリッタはＰＢＳ２である。ファイバ結合モードスクランブルマルチモードレーザ（fiber-coupled mode-scrambled multimode laser）の出力はＦｉｂｅｒ１である。

図８Ａは、２０ｘ／０．７５ＮＡ顕微鏡を用いた例示的なＳＩＭイメージングシステム７００を用いて取り込まれたアフォーカルミラー画像及び蛍光スライドを示す。アフォーカルミラー画像は、縞鮮明度が８４％である。蛍光スライド画像は、縞鮮明度が６．６％である。

図８Ｂは、ビーズ状フローセルと共に図７のシステム７００を用いて取得された縞変調測定値を示す。このグラフは、図７の平行平板Ｗ２の角度の変化に伴う位相調整サイクル中の通常のフィーチャ画像強度の変化を示す。

図９は、本明細書に記載のいくつかの実施形態による２アームＳＩＭイメージングシステム９００の別の例示的な光学構成を示す。システム９００の第１のアームは、発光装置９１０Ａ（例えば、光ファイバ）、発光装置９１０Ａにより出力された光をコリメートする光コリメータ９２０Ａ、光軸に対して第１の向きの回折格子９３０Ａ、及びリレーレンズ９４０Ａを含む。システム９００の第２のアームは、発光装置９１０Ｂ、発光装置９１０Ｂにより出力された光をコリメートする光コリメータ９２０Ｂ、光軸に対して第２の向きの回折格子９３０Ｂ、及びリレーレンズ９４０Ｂを含む。

システム９００は、光学系の２つのアームを合成するビーム合成素子９５０も含む。図示のように、ビーム合成素子９５０は、システムの第２のアームからの構造化光を通過させる穴と第１のアームから受光した構造化光を反射する鏡面とを有する４５°プリズムを含む。ビーム合成素子９５０に入射する前に、各構造化光ビームは、±１次を通過させ他の次数を遮断する一対の開口を有する空間フィルタを通過する。第１の平面で第１のアームから出る構造化光は、反射光学素子９４５によりビーム合成素子９５０へ向けることができる。システム９００では、平行平板光学素子９６０が位相調整器として働き、ビーム合成素子９５０の後のいずれかの方向に構造化光をシフトさせるよう回転させることができる。

本明細書に記載の実施形態は、２つの異なる角度に向いた２つの格子を含む２アーム構造化照明イメージングシステムに関してこれまでは記載しているが、他の実施形態では、３つ以上のアームを有するシステムが実現され得ることに留意されたい。矩形グリッド上にフィーチャを有する規則的にパターン化された試料の場合、上述のように２つの直交する角度（例えば、垂直格子及び水平格子）のみで分解能向上を達成することができる。他方では、他の試料（例えば、六角形パターン化試料）の全方向での画像の高解像度化には、３つの格子角度が用いられ得る。例えば、３アームシステムが３つの発光装置及び３つの固定回折格子（アーム毎に１つ）を含むことができ、各回折格子は、システムの光軸の周りで各パターンの向きを試料に投影するような向きにされる（例えば、０°パターン、１２０°パターン、又は２４０°パターン）。このようなシステムでは、追加の穴あきミラーを用いて、追加の格子の追加の像をシステムに無損失で合成することができる。代替として、このようなシステムは、１つ又は複数の偏光ビームスプリッタを利用して格子のそれぞれの画像を合成することができる。

多光学格子スライド構造化照明顕微鏡イメージングシステム
本明細書に開示される技術のいくつかの実施形態によれば、ＳＩＭイメージングシステムは、多光学格子スライドＳＩＭイメージングシステムとして実現することができ、１つの直線運動ステージに、システムの光軸に対して対応する固定の向きを有する複数の回折格子（又は他のビーム分割光学素子）が取り付けられる。

図１０Ａ、図１０Ｂは、本明細書に記載のいくつかの実施形態による、二重光学格子スライドＳＩＭイメージングシステム１０００の例示的な光学構成を示す概略図である。以下でさらに説明するように、システム１０００の構成では、試料１０７０に投影された格子パターンに対する全ての変更（例えば、パターン位相シフト又は回転）が、運動ステージ１０３０を単一の運動軸に沿って直線並進させて格子１０３１又は１０３２を選択する（すなわち、格子の向きを選択する）か又は格子１０３１、１０３２の一方を位相シフトさせることにより行われ得る。

システム１００は、発光装置１０１０（例えば、光源に光学的に結合された光ファイバ）、発光装置１０１０により出力された光をコリメートする第１の光コリメータ１０２０（例えば、コリメーションレンズ）、第１の回折格子１０３１（例えば、水平格子）及び第２の回折格子１０３２（例えば、垂直格子）が取り付けられた直線運動ステージ１０３０、投影レンズ１０４０、半反射ミラー１０５０（例えば、ダイクロイックミラー）、対物レンズ１０６０、試料１０７０、及びカメラ１０８０を含む。簡単のために、ＳＩＭイメージングシステム１０００の光学コンポーネントは図１０Ａから省かれている場合がある。さらに、システム１０００はこの例ではシングルチャネルシステムとして図示されているが、他の実施形態ではマルチチャネルシステムとして（例えば、２つの異なるカメラ及び２つの異なる波長で発光する光源を用いることにより）実現され得る。

図１０Ａに示すように、格子１０３１（例えば、水平回折格子）は、コリメート光ビームを（紙面の平面上で）１次回折光ビームに回折させることができる。図１０Ｂに示すように、回折格子１０３２（例えば、垂直回折格子）は、ビームを（紙面の上下で）１次に回折させることができる。この構成では、単一の発光装置１０１０（例えば、光ファイバ）及び単一の直線運動ステージを有する単一の光アームしか試料１０７０の撮像に必要なく、これにより可動システム部品数を減らす等のシステム上の利点が得られて速度、複雑さ、及びコストを改善することができる。さらに、システム１０００では、偏光子がないことで上述した光学効率が高いという利点を得ることができる。例示的なＳＩＭイメージングシステム２００の構成は、矩形グリッド上にフィーチャを有する規則的にパターン化された試料１０７０の場合に特に有利であり得るが、それは直交する２つの格子（例えば、垂直格子及び水平格子）のみを用いて構造化分解能向上を達成できるからである。

システムの効率を上げるために、各格子により出力された０次ビーム及び他の全ての高次回折ビーム（すなわち、±２次以上）は遮断（すなわち、試料１０７０に投影された照明パターンから除去）され得る。例えば、次数フィルタ等のビーム遮断素子（図示せず）が、運動ステージ１０３０の後の光路に挿入され得る。いくつかの実施形態では、回折格子１３０１、１３０２はビームを１次のみに回折させるよう構成され、０次（非回折ビーム）は何らかのビーム遮断素子により遮断され得る。

システム１０００の例では、単一の直線運動軸に沿って格子１０３１、１０３２毎に位相シフトが実現され得るように、２つの格子が運動軸から約±４５°に配置され得る（又は約＋４０°／−５０°、約＋３０°／−６０°等の運動軸からの他の何らかの角度オフセット）。いくつかの実施形態では、２つの格子が組み合わせられて１つの物理光学素子になり得る。例えば、物理光学素子の１辺が第１の向きの格子パターンを有することができ、物理光学素子の隣接辺が第１の向きに直交する第２の向きの格子パターンを有することができる。

短軸直線運動ステージ１０３０は、これを試料平面に対してＸ軸に沿って又は試料平面に対したＹ軸に沿って移動させる１つ又は複数のアクチュエータを含み得る。動作中に、直線運動ステージ１０３０は、効率的な画像再構成のために正確な照明パターンを投影させるのに十分な移動量（例えば、約１２ｍｍ〜１５ｍｍ）及び精度（例えば、約０．５マイクロメートル未満の再現性）を与えることができる。運動ステージ１０３０が蛍光顕微鏡等の自動イメージングシステムで利用される実施形態では、運動ステージ１０３０は、高い動作速度、最小限の振動発生、及び長い動作寿命を与えるよう構成され得る。実施形態では、直線運動ステージ１０３０は、クロスローラベアリング、リニアモータ、高精度リニアエンコーダ、及び／又は他のコンポーネントを含み得る。例えば、運動ステージ１０３０は、コントローラを用いて並進させることができる高精度ステッパ又はピエゾ運動ステージとして実現され得る。

図１１は、本明細書に記載のいくつかの実施形態による、構造化光を用いて高解像度画像を作成する１撮像サイクル中の多光学格子スライドＳＩＭイメージングシステムにより実施され得る例示的な方法１１００を示す動作フロー図である。実施形態に応じて、方法１１００は、試料全体又はより大きな試料の一部を撮像するために実施され得る。方法１１００は、図１２と併せて説明されるものであり、図１２は、画像取り込み中に二重光学格子スライドＳＩＭイメージングシステムの第１の回折格子及び第２の回折格子により試料１０７０の平面に投影され得る簡略化した照明縞パターンを示す。例えば、ＳＩＭイメージングシステム１０００は、第１の回折格子１０３１及び第２の回折格子１０３２を用いて図１２に示す照明パターンを生成し得る。図１２の例に示すように、２つの格子は、相互に垂直な縞パターンを試料１０７０の表面に投影し、直線運動ステージ１０３０の運動軸から約±４５°に配置される。

動作１１１０において、光源をオンにする。例えば、光シャッタを作動させて発光装置１０１０の光ファイバを光源に光学的に結合することができる。別の例として、光源をパルス化してもよく、又は光スイッチを用いて発光装置の光路を通して光源を導いてもよい。動作１１２０において、第１の格子パターンを試料に投影して画像を取り込むことができる。例えば、図１２に示すように、第１の格子（例えば、格子１０３１）が１次照明縞を試料１０７０に投影し得る。試料が発した光はカメラ１０８０により取り込むことができ、第１のパターン（例えば、＋４５°パターン）の第１の位相画像を取り込むことができる。例えば、試料１０７０の種々のフィーチャに位置する蛍光染料が蛍光を発し、得られる光が対物レンズ１０６０により集光されカメラ１０８０のイメージセンサへ向けられて蛍光が検出され得る。

追加の位相シフト画像を取り込むために、動作１１４０において、格子により投影されたパターンを直線運動ステージの並進により位相シフトさせることができる。図１２の例において、これらの位相シフト運動をステップ１及び２として示す。位相シフト運動は、格子に投影された縞パターンをわずかにシフトさせる格子の小さな（例えば、約３〜５マイクロメートル以下の）動きをもたらし得る。

特定の例として、図１１の試料における縞のピッチλが２１００ｎｍである場合を考える。この場合、３つの位相シフト画像が試料で取り込まれ、投影縞の位相シフトをλ／３すなわち７００ｎｍとする必要がある。対物照明倍率（objective illumination magnification）が１０倍であるとすると、単軸直線運動ステージに必要な位相シフトステップ（直線並進）は、７００ｎｍ＊１０＊ｓｑｒｔ（２）すなわち約９．９μｍとして計算され得る。この場合、ｓｑｒｔ（２）因子は、格子の向きと運動ステージの運動軸との間の４５°オフセットに対応する。より一般的には、この例示的な構成における各位相シフトステップ中の直線運動ステージの並進距離は、λ／３×ＭＡＧ×√２で表され、式中、ＭＡＧは照明倍率である。

回折格子の全位相シフト画像の取り込み後に（判定１１３０）、動作１１６０において、システムは、直線運動ステージの並進により回折格子を切り替えて、別の回折格子をイメージングシステムの光源に光学的に結合することができる（例えば、図１０Ａから図１０Ｂへの移行）。この運動を図１２の例においてステップ３として示す。回折格子変更の場合、直線運動ステージは、比較的大きな並進（例えば、約１２ｍｍ〜１５ｍｍ）をもたらし得る。

動作１１２０〜１１４０を繰り返すことにより、次の格子について一連の位相画像を続いて取り込むことができる。例えば、図１２に示すように、第２の回折格子が１次照明縞を試料２７１に投影することができ、直線運動ステージの並進により投影縞の位置をλ／３シフトさせて格子のパターンの３つの位相画像を取り込むことができる（例えば、図１２のステップ４及び５）。

撮像サイクルで全画像が取り込まれたら、動作１１７０において、取り込み画像から高解像度画像を再構成することができる。例えば、高解像度画像は、図１２に概略的に示す６つの画像から再構成され得る。上記例が示すように、多光学格子スライドＳＩＭイメージングシステムは、単一のリニアアクチュエータで縞角度及び位相を切り替えることにより、構造化照明イメージングシステムのコスト及び複雑さを抑えることが有利であり得る。

図１３は、例示的な二重光学格子スライドＳＩＭイメージング構成１３００を示す図である。図示のように、構成１３００は、発光する光ファイバ１３１０、コリメータ１３２０、第１及び第２回折格子１３３１及び１３３２が取り付けられた直線運動ステージ１３３０、投影レンズ１３４０、及び回動ミラー１３５０を含み得る。この例では、格子１３３１、１３３２は、ステージ１３３０の運動軸に沿って相互に隣接して同じ物体に埋め込まれる。ダイクロイックミラー１０５０、対物レンズ１０６０、及び試料１０７０等の図示しない他のコンポーネントは、図１０Ａのものと同様であり得る。

いくつかの実施形態では、二重光学格子スライドＳＩＭイメージングシステムの直線運動ステージ又はスライドは、撮像格子（例えば、直線運動ステージの運動軸から約±４５°に配置された２つの格子）により試料に投影される縞パターンの位置合わせを助けるために１つ又は複数の付加的な低周波パターンが設けられ得る。例えば、図１０Ａ、図１０Ｂの直線運動ステージ１０３０に付加的なアライメントパターンを設けてもよく、又は図１３の直線運動ステージ１３３０に付加的なアライメントパターンを設けてもよい。図１３に示すように２つの結像格子が同じ基板に埋め込まれる場合、アライメント格子をその基板に埋め込むことができるか、又は別個の基板に組み込むことができる。アライメントパターンは、２つの撮像格子間に又は運動ステージ上の他の何らかの適当な位置に配置することができる。

アライメントパターンは、照明されると、周波数が低く且つ／又はピッチが大きなパターンを試料に投影するよう構成され得る。これらの特徴により、試料に対する格子の粗い位置合わせを容易にすることができる。アライメントパターンは、他の格子よりもスリットの周波数が低い平行線、直交線、及び／又は格子として実現され得る。いくつかの実施形態では、複数のアライメントパターンを用いることができる。図１７は、本開示の実施形態で用いられ得るアライメントパターンの一例を示す。この例に示すように、アライメントパターンマーク１６０５が、格子１６１５と同じ基板上のクリアアパーチャ１６２５の外側に設けられる。この例では、アライメントパターンは２組の直交線として設けられる。この実施形態により、格子の傾斜を確認することができる。いくつかの実施形態では、図示のアライメントパターンは複数領域（例えば、基板の四隅）に設けられ得る。

使用中に、アライメントパターンを照明してパターンを投影することができる。アライメントパターンは、ＳＩＭイメージングシステムの製造中、現場での設置中、又は現場でのサービス技術者による確認中に利用され得る。いくつかの実施形態では、アライメントパターンは、二重光学格子スライドＳＩＭイメージングシステムの動作中に利用され得る。例えば、試料の撮像開始前にアライメントパターンを照明してアライメントパターンを投影することができる。

二重光学格子スライドＳＩＭイメージングシステムのいくつかの実施形態では、直線運動ステージとは別個のコンポーネントである光位相変調器（例えば、回転窓）が位相同調に利用され得る。このような実施形態では、光位相変調器は、直線運動ステージの代わりに位相同調に用いられ得る（例えば、直線運動ステージは、２つの格子間の切り替えのみに用いられ得る）。このような実施形態により、システムの速度、精度、及び／又は信頼度は、運動ステージが経時的に必要とする並進数を実質的に減らすことにより、且つ位相の選択に運動ステージを用いて細かい並進（例えば、μｍオーダ）を行う必要をなくすことにより、改善される可能性があり得る。

光位相変調器は、光源と試料との間の光路で格子の後に（例えば、運動ステージの直後に）配置され得る。図１９は、このような実施形態による１つの例示的な二重光学格子スライドＳＩＭイメージングシステム１９００のいくつかのコンポーネントを示す。図示のように、システム１９００は、発光装置１９１０（例えば、光源に光学的に結合された光ファイバ）、発光装置１９１０により出力された光をコリメートする第１の光コリメータ１９２０（例えば、コリメーションレンズ）、第１の回折格子１９３１（例えば、水平格子）及び第２の回折格子１９３２（例えば、垂直格子）が取り付けられた直線運動ステージ１９３０、及び各格子により出力された回折光を位相シフトさせる光位相変調器１９４０を含む。

パターン角度空間選択構造化照明顕微鏡イメージングシステム
本明細書に開示される技術のいくつかの実施形態によれば、ＳＩＭイメージングシステムは、パターン角度空間選択ＳＩＭイメージングシステムとして実現することができ、固定２次元回折格子を空間フィルタホイールと組み合わせて用いて１次元回折パターンを試料に投影する。

図１４は、本明細書に記載のいくつかの実施形態によるパターン角度空間選択ＳＩＭイメージングシステム１４００の例示的な光学構成を示す概略図である。簡単のために、ＳＩＭイメージングシステム１４００の光学コンポーネントが図１４から省かれている場合がある。さらに、システム１４００はこの例ではシングルチャネルシステムとして示されているが、他の実施形態ではマルチチャネルシステムとして（例えば、２つの異なるカメラ及び２つの異なる波長で発光する光源を用いることにより）実現され得る。

図示のように、システム１４００は、発光装置１４１０（例えば、光ファイバ）、発光装置１４１０が発した光をコリメートするコリメータ１４２０、２次元格子１４３０、０次ビームブロッカ１４４０、光位相変調器１４５０、投影レンズ１４６０、空間フィルタホイール１４７０、ダイクロイックミラー１４８０、対物レンズ１４９０、試料１４９１、及びカメラ１４９５を含む。

この例示的な構成では、格子１４３０は、入力ビームを直交する２方向で複数の次数（例えば、０次、±１次、±２次等）に回折させるよう構成された２次元透過型回折格子である。システムの効率及び性能を上げるために、０次ビーム及び他の全ての高次ビーム（すなわち、±２次以上）は遮断（すなわち、試料１４９１に投影された照明パターンから除去）され得る。高次は、広い角度に回折されてさまざまなフィルタリング素子を用いてフィルタリングされ得るが、０次成分はビーム経路の格子をそのまま通過して試料に向かう。０次成分を遮断するために、ビーム遮断素子１４４０が２次元回折格子１４３０の後の光路に挿入され得る。例えば、ビーム遮断素子１４４０は、体積ブラッグ格子（ＶＢＧ）とすることができ、これは、素子に対して垂直な光（例えば、０次光）を反射して＋１次及び−１次等の他の角度の光を通過させるようパターン化されることができる回折光学素子である。０次が除去されることで、より小さくよりコンパクトな光学系を用いて＋１次及び−１次を対物レンズまで集束させることができる。

光位相変調器１４５０（例えば、回転窓）を用いて、入射光の位相を変えて試料１４９１上のパターン位相位置を調整することができる。例えば、光位相変調器１４５０は、光軸に対して可変角度で傾斜した平行平板光学素子、光軸周りに回転する楔形の光学素子、ビームを並進させるよう傾くミラー、電気光学素子、又は音響光学素子等、さまざまな可動光学素子を含み得る。特定の一実施形態では、光位相変調器１４５０は、２つの異なる格子角度パターンの位相を調整するよう直交する２方向に傾く平行平板光学素子として実現され得る。代替として、いくつかの実施形態では、パターン位相位置は、投影パターンを固定したまま（例えば、運動ステージを用いて）試料を動かすことにより、又は試料及び投影パターンの両方を動かすことにより調整することができる。

システム１４００の例では、回転空間フィルタホイール１４７０は、試料１４９１に投影する垂直格子像又は水平格子像を選択するために直交する２方向に向いた複数の穴（例えば、垂直方向穴セット１４７１及び水平方向穴セット１４７２）を含み得る。例えば、空間フィルタホイールの回転により、格子パターンの１つの＋／−１次を穴セットの一方に通過させて、試料１４９１上に横又は縦縞パターンを生成することができる。実施形態では、空間フィルタホイール１４７０は、軽量のマスク又は空間フィルタ（例えば、複数のポート又は開口を含む回転ディスク）として実現され得る。

システム１４００の構成では、システム１４００の主光学コンポーネントは固定されたままであり、これにより光学系（及び照明パターン）の安定性が向上し得ると共に可動素子の重量、振動出力、及びコストが最小化され得る。ビーム強度の一部（例えば、最大５０％）を空間フィルタホイール１４７０のいずれの向きでも除去する必要があり得るので、いくつかの実施形態では、空間フィルタは、不要なビーム（例えば、通過しない回折格子パターンの次数）を適切な熱管理のためにビームダンプへ反射するよう構成され得る。

図１５は、本明細書に記載のいくつかの実施形態によるパターン角度空間選択ＳＩＭイメージングシステム１５００の別の例示的な光学構成を示す概略図である。例示的なイメージングシステム１５００において、２次元透過型格子及びビーム遮断素子の機能を固体光学押し１５１０に組み込むことができる。さらに、投影レンズの機能を固体光学素子１５１０に組み込むことができる。この例示的な実施形態では、２次元透過型格子１５１１は、光学素子１５１０のうち発光装置１４１０からコリメート光を受光する面（光学素子１５１０の入力）に加工又は他の方法で配置される。格子１５１１は、０次光を当該光学素子のうちの反対側で遮断できるような分散角となるよう配置され得る。両方向の所望の＋１次及び−１次は、光学素子１５１０から斜面１５１２（光学素子１５１０の出力）を通って出射することができ、斜面１５１２は＋１次及び−１次を光学的に所望の方向に回折させる。これらの出力面は、回折集束レンズを含み得る。代替として、別個の光学素子を投影レンズとして用いてビームを対物レンズ１４９０に集束させることができる。システム１５００では、上述のように位相シフタ１４５０及び回転空間フィルタマスク１４７０が用いられ得る。

図１６は、本明細書に記載のいくつかの実施形態によるパターン角度空間選択ＳＩＭイメージングシステム１６００の別の例示的な光学構成を示す概略図である。例示的なイメージングシステム１６００において、固体光学系１６１０をこの場合も用いて２次元格子及びビーム遮断素子の機能を組み込むことができる。さらに、投影レンズの機能も組み込むことができる。例示的なイメージングシステム１６００とは対照的に、固体光学系１６１０の入力は、受光した光を２次元反射型格子１６１１へ誘導する入口窓又は開口１６１４である。この例では格子１６１１が反射型なので、０次光を反射して入口窓１６１４を通して出すことができる。所望の＋１次及び−１次の回折光は、直交する方向のそれぞれで、光学素子１６１０の各反射コーティング内面１６１３から反射して出口面１６１２を通って出射する。実施形態では、これらの出口面は、回折集束レンズを含み得る。代替として、別個の投影レンズ光学素子１６１５を用いてビームを対物レンズ１４９０に集束させてもよい。システム１６００では、上述のように位相シフタ１４５０及び回転空間フィルタマスク１４７０を用いることができる。

本開示のいくつかの実施形態は、１つ又は複数の光学素子を用いて集光された励起光（例えば、対物レンズにより回収された光）をイメージセンサ（例えば、ＣＣＤカメラセンサ）に再結像するＳＩＭイメージングシステムに関して図示しているが、当然ながら、本明細書に記載の種々の実施形態は、撮像試料のアクティブ面にあるイメージセンサ（例えば、ＣＭＯＳセンサ）を利用するＳＩＭイメージングシステムに適用され得る。説明例として、図１８は、本明細書に記載のいくつかの実施形態によるＳＩＭイメージングシステムのイメージセンサアセンブリ１７４０上に形成され得る試料１７１０を示す。例えば、試料のフィーチャは、イメージセンサの画素とフォトリソグラフィにより位置合わせされ得る。構造化照明に応じてパターン化試料１７１０が発した光は、この例では試料１７１０の直下に位置決めされているイメージセンサアセンブリ１７４０により集光される。試料１７１０をイメージセンサアセンブリ１７４０上に形成することで、試料１７１０のパターン化フィーチャ１７１１が撮像中にイメージセンサアセンブリ１７４０の特定のフォトサイト（例えば、画素）に対して確実に位置合わせされたままとなるという利点を得ることができる。

試料１７１０は、イメージセンサ１７４０の各光センサ（例えば画素）の上に１つ又は複数のフィーチャ１７１１が形成且つ／又は搭載されるようにパターン化され且つイメージセンサアセンブリ１７４０と位置合わせされ得る。図１８の例に示すように、試料１７１０は、１つのフィーチャ１７１１がイメージセンサアセンブリ１７４０の画素アレイの各画素上に形成されるようにイメージセンサアセンブリ１７４０上にパターン化される。他の実施形態では、２つ以上のフィーチャが各画素上に形成され得る。

例えば蛍光試料の場合、試料の照明されたフィーチャ１７１１は、構造化励起光１７６０に応じて蛍光を発することができ、結果としてフィーチャ１７１１が発した光１７６１は、イメージセンサアセンブリ１７４０のフォトサイト（例えば、画素）により集光されて蛍光が検出され得る。例えば、図１８に示すように、イメージセンサアセンブリ１７４０の画素（１，１）及び（１，３）は、その上に位置決め又はパターン化された試料のフィーチャ１７１１が発した光１７６１を集光し得る。いくつかの実施形態では、層（図示せず）が試料１７１０とイメージセンサアセンブリ１７４０との間の隔離を行い（例えば、イメージセンサアセンブリを試料の流体環境から遮蔽し）得る。他の実施形態では、試料１７１０は、イメージセンサアセンブリ１７４０上に搭載且つ位置合わせされ得る。

図１８は、ＳＩＭ縞が正しい向きで試料のフィーチャと揃うＳＩＭイメージングシステムの例示的な図を示すが、実際にはこれは必ずしもＳＩＭイメージングに必要ではなく典型的でもないことに留意されたい。例えば、経時的及び／又は空間的に、隣接する縞間の間隔、構造化照明パターンの位相若しくは角度、及び／又は照明された試料に対する縞パターンの向きにずれがあり得る。ＳＩＭパラメータのこれらのばらつきに起因して、場合によっては、８０％「オン」の照明されたフィーチャがある一方で、他のフィーチャは６０％「オン」であり、さらに他のフィーチャは２０％「オン」である場合がある。したがって、当然ながら、このようなシステムでは、ＳＩＭイメージングアルゴリズムを利用して画像再構成中のこれらのプロセスばらつきが考慮され得る。例えば、構造化照明パラメータのばらつきを経時的に推定且つ／又は予測して、これらのばらつきに対応し得る。

本明細書において、モジュールという用語は、本願の１つ又は複数の実施形態に従って実施できる所与の機能単位を表し得る。本明細書において、モジュールは、任意の形態のハードウェア、ソフトウェア、又はそれらの組み合わせを利用して実施され得る。例えば、１つ又は複数のプロセッサ、コントローラ、ＡＳＩＣ、ＰＬＡ、ＰＡＬ、ＣＰＬＤ、ＦＰＧＡ、論理コンポーネント、ソフトウェアルーチン、又は他の機構が、モジュールを構成するために実施され得る。実施形態において、本明細書に記載の種々のモジュールがディスクリートモジュールとして実現され得るか、又は記載の機能及び特徴の一部又は全部を、１つ又は複数のモジュール間で共有することができる。換言すれば、当業者がこの説明を読んだ後に明らかとなるように、本明細書に記載の種々の特徴及び機能は、いかなる用途で実施してもよく、１つ又は複数の別個の又は共有のモジュールで種々の組み合わせ及び順列で実施することができる。種々の特徴又は機能要素が別個のモジュールとして個別に記載又は特許請求される場合があるが、当業者には理解されるように、これらの特徴及び機能を１つ又は複数の共通のソフトウェア及びハードウェア要素間で共有することができ、そのような記載は、別個のハードウェア又はソフトウェアコンポーネントを用いてかかる特徴又は機能が実施されることを要求も暗示もしないものとする。

本明細書において、用語「コンピュータ可読媒体」、「コンピュータ可用媒体」、及び「コンピュータプログラム媒体」は、揮発性又は不揮発性の非一時的媒体、例えばメモリ、記憶ユニット、及び媒体等を概して指すために用いられる。これら及び他の種々の形態のコンピュータプログラム媒体又はコンピュータ可用媒体は、１つ又は複数の命令の１つ又は複数のシーケンスを処理装置に伝えて実行させることに関与し得る。媒体で具現されるかかる命令は、「コンピュータプログラムコード」又は「コンピュータプログラム製品」（コンピュータプログラム又は他の分類の形態で分類され得る）と概して称する。

種々の例示的な実施形態に関して上述したが、個々の実施形態の１つ又は複数に記載された種々の特徴、態様、及び機能が、それと共に記載された特定の実施形態への適用性に限定されるのではなく、単独で又は種々の組み合わせで本願の他の実施形態の１つ又は複数に適用することができ、かかる実施形態が記載されているか否かもかかる特徴が記載の実施形態の一部として提示されているかも問わないことを理解されたい。したがって、本願の広さ及び範囲は、上述の例示的な実施形態のいずれによっても制限されるべきでない。

当然ながら、上記概念の全ての組み合わせは（かかる概念が相互に矛盾しない場合）、本明細書に開示される発明の主題の一部と考えられる。特に、本開示の最後に載せた特許請求の範囲に記載の主題の全ての組み合わせが、本明細書に開示される発明の主題の一部と考えられる。

特許請求の範囲を含め本開示全体で用いられる用語「実質的に」及び「約」は、処理時のばらつき等に起因した小さな変動を表し考慮するために用いられる。例えば、これらの用語は、±５％以下、例えば±２％以下、例えば±１％以下、例えば±０．５％以下、例えば±０．２％以下、例えば±０．１％以下、例えば±０．０５％以下を指すことができる。

該当する限り、本明細書中の用語「第１の」、「第２の」、「第３の」等は、これらの用語により表される各物体を別個の実体として示すために用いられるにすぎず、本明細書に別段の明記のない限り、時系列順の含意は意図されない。

本明細書で用いられる用語及び語句並びにそれらの変形は、別段の明記のない限り、限定的ではなくオープンエンドであると解釈すべきである。上記の例として、用語「含む」は、「限定なしに含む」等を意味すると解釈すべきであり、用語「例」は、検討中のアイテムの網羅的又は限定的な羅列ではなくそのいくつかの事例を提供するために用いられ、用語「ある（"a" or "an"）」は、「少なくとも１つ」、「１つ又は複数」等を意味すると解釈すべきであり、「従来の」、「旧来の」、「通常の」、「標準的な」、「既知の」、及び同様の意味の用語等の形容詞は、記載のアイテムを所与の期間に又は所与の時点で利用可能なアイテムに限定するものと解釈すべきでなく、現在又は将来のいつでも利用可能であり得る又は知られ得る従来の、旧来の、通常の、又は標準的な技術を包含すると解釈すべきである。同様に、本明細書が当業者に自明又は既知であろう技術に言及する場合、かかる技術は現在又は将来のいつでも当業者に自明又は既知である技術を包含する。

「１つ又は複数」、「少なくとも１つ」、「限定はされないが」、又は場合によっては他の同様の語句等の拡張的な単語及び語句の存在は、かかる拡張的な語句がないような場合に狭義の状況が意図又は要求されることを意味すると解釈されないものとする。用語「モジュール」の使用は、モジュールの一部として記載又は特許請求されたコンポーネント又は機能が全て共通のパッケージで構成されることを意味しない。実際には、制御論理であるか他のコンポーネントであるかを問わず、モジュールの種々のコンポーネントのいずれか又は全部を単一のパッケージに組み合わせるか又は別個に維持することができ、複数の分類若しくはパッケージに又は複数の場所にさらに分配することができる。

さらに、本明細書に記載の種々の実施形態は、例示的なブロック図、フロー図、及び他の図に関して説明される。当業者が本明細書を読んだ後に明らかとなるように、図示の実施形態及びそれらの種々の代替形態は、図示の例に制限されずに実施することができる。例えば、ブロック図及びそれらに付随する説明は、特定のアーキテクチャ又は構成を命ずるものと解釈すべきでない。

本開示の種々の実施形態を上述したが、これらは単なる例として提示されたものであり限定ではないことを理解されたい。同様に、種々の図は、本開示に含むことができる特徴及び機能の理解を助けるためになされる本開示の例示的なアーキテクチャ又は他の構成を示し得る。本開示は、図示の例示的なアーキテクチャ又は構成に制限されず、さまざまな代替的なアーキテクチャ及び構成を用いて所望の特徴を実施することができる。実際には、本開示の所望の特徴を実施するために代替の機能的、論理的、又は物理的区分及び構成をどのように実施することができるかが、当業者には明らかであろう。また、本明細書に図示するもの以外の多数の異なる構成モジュール名を、種々の区画に適用することができる。さらに、フロー図、動作説明、及び方法請求項に関して、本明細書中でステップが提示される順序は、文脈上別段の指定のない限り、種々の実施形態が記載の機能を同じ順序で実行するよう実施されることを命じないものとする。

Claims (15)

1. 発光する発光装置と、
   第１の方向に向いた第１の複数の縞を試料平面に投影し且つ前記第１の方向に対して垂直な第２の方向に向いた第２の複数の縞を前記試料平面に投影するよう前記発光装置が発した光を回折させる２次元回折格子と、
   前記第１又は第２の方向のそれぞれで前記２次元回折格子から受光される回折光を通過させて前記第１又は第２の方向のそれぞれの光を遮断する空間フィルタホイールであり、第１の複数の開口及び前記第１の複数の開口に直交する第２の複数の開口を含む空間フィルタホイールと
   を備える構造化照明イメージングシステムであり、
   前記第１の複数の開口は、前記２次元回折により回折される光を前記第１の方向に通過させ、前記第２の複数の開口は、前記２次元回折により回折される光を前記第２の方向に通過させ、前記２次元回折格子は透過型回折格子であり、
   前記構造化照明イメージングシステムは、固体光学素子をさらに備え、前記透過型回折格子は、前記発光装置から光を受ける前記固体光学素子の面上に配置又は形成され、
   前記透過型回折格子の分散角は、０次光が前記固体光学素子のうちの反対側で遮断されるよう配置され、
   前記固体光学素子は、２次元透過型回折格子により回折される１次光を回折させて出力する斜面を含む、構造化照明イメージングシステム。
2. 請求項１に記載の構造化照明イメージングシステムにおいて、前記２次元回折格子を透過した０次光を遮断するビーム遮断素子をさらに備える構造化照明イメージングシステム。
3. 請求項２に記載の構造化照明イメージングシステムにおいて、前記ビーム遮断素子は、前記ビーム遮断素子に対して垂直な光を反射して他の角度の光を通過させるようパターン化された回折光学素子を含む、構造化照明イメージングシステム。
4. 請求項１に記載の構造化照明イメージングシステムにおいて、前記空間フィルタホイールは、前記２次元回折格子から受光されて通過しない回折次数光を反射する、構造化照明イメージングシステム。
5. 請求項１に記載の構造化照明イメージングシステムにおいて、前記斜面は集束レンズを含む、構造化照明イメージングシステム。
6. 請求項１に記載の構造化照明イメージングシステムにおいて、前記固体光学素子により出力される光を受光する投影レンズをさらに備える構造化照明イメージングシステム。
7. 請求項１に記載の構造化照明イメージングシステムにおいて、前記２次元回折格子は２次元反射型回折格子である、構造化照明イメージングシステム。
8. 請求項７に記載の構造化照明イメージングシステムにおいて、固体光学素子をさらに備え、前記２次元反射型回折格子は、前記発光装置から光を受ける前記固体光学素子の開口とは反対側の前記固体光学素子の面上に形成又は配置される、構造化照明イメージングシステム。
9. 請求項８に記載の構造化照明イメージングシステムにおいて、前記固体光学素子は、前記２次元反射型回折格子により回折される１次光を反射して前記固体光学素子の出口面を通して出力する反射内面をさらに含む、構造化照明イメージングシステム。
10. 請求項９に記載の構造化照明イメージングシステムにおいて、前記出口面は回折集束レンズを含む、構造化照明顕微鏡イメージングシステム。
11. 請求項９に記載の構造化照明イメージングシステムにおいて、前記固体光学素子により出力される光を受光する投影レンズをさらに備える構造化照明顕微鏡イメージングシステム。
12. 請求項１に記載の構造化照明イメージングシステムにおいて、前記第１の複数の縞及び前記第２の複数の縞を位相シフトさせる１つ又は複数の光学素子をさらに備え、前記第１の複数の縞及び前記第２の複数の縞を位相シフトさせる前記１つ又は複数の光学素子は、直交する２方向に傾斜した平行平板光学素子を含む、構造化照明イメージングシステム。
13. ２次元回折格子を備えた構造化照明イメージングシステムの発光装置をオンにするステップと、
    前記発光装置が発した光を前記２次元回折格子で受光して、第１の方向に向いた第１の回折光及び前記第１の方向に対して垂直な第２の方向に向いた第２の回折光を出力するステップと、
    前記第１の回折光を空間フィルタホイールの第１の複数の開口に通過させ前記第２の回折光を前記空間フィルタホイールで遮断するステップと、
    前記第１の複数の穴を通過した前記第１の回折光を第１の複数の縞として試料平面に投影するステップと、
    前記試料が発した光の第１の複数の位相画像を取り込むステップであり、前記第１の複数の画像の取り込み中に前記第１の複数の縞を前記試料平面上で位相シフトさせるステップと
    を含む方法であり、
    前記２次元回折格子は、固体光学素子の面上に形成される２次元透過型回折格子であり、
    前記方法は、
    前記透過型回折格子により出力される０次光を前記固体光学素子のうち前記透過型回折格子とは反対側で遮断するステップと、
    前記２次元透過型回折格子により回折される１次光を前記固体光学素子の斜面から回折させて出力するステップと
    をさらに含む、方法。
14. 請求項１３に記載の方法において、
    前記空間フィルタホイールを回転させ、前記第２の回折光を前記空間フィルタホイールの第２の複数の開口に通過させ前記第１の回折光を前記空間フィルタホイールで遮断するステップと、
    前記第２の複数の穴を通過する前記第２の回折光を前記第１の複数の縞に直交する第２の複数の縞として前記試料平面に投影するステップと、
    前記試料が発した光の第２の複数の位相画像を取り込むステップであり、前記第２の複数の画像の取り込み中に前記第２の複数の縞を前記試料平面上で位相シフトさせるステップと
    をさらに含む方法。
15. 請求項１３に記載の方法において、前記２次元回折格子は、前記発光装置から光を受ける固体光学素子の開口とは反対側の固体光学素子の面上に形成される２次元反射型回折格子であり、
    前記方法は、前記２次元反射型回折格子により回折される１次光を前記固体光学素子の複数面で反射するステップをさらに含む、方法。

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