JP6900354B2 - 癌治療のための二重特異性ｈｅｒ２リガンド - Google Patents

Description

本発明は、二重特異性標的剤に関し、好ましくはＨＥＲ２を標的とする抗体、抗体断片又はその他ポリペプチドリガンドであり、それらは癌治療の利用に関する。

チロシンキナーゼの受容体であるＨＥＲファミリーのメンバーは、細胞増殖、分化、遊走そして生存に重要なメディエーターである。この受容体ファミリーは上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１又はＨＥＲ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２又はｐ１８５〈ｎｅｕ〉）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）を含む、４つの独立したメンバーを含む。ＥＧＦＲファミリーのメンバーは、単鎖モジュレーター糖タンパク質と密接に関係しており、細胞外リガンド結合領域、１回膜貫通ドメイン及び細胞内チロシンキナーゼをともない、下流のシグナルタンパク質に結合するために重要な特異的リン酸化部位へと続く。

ＨＥＲ受容体ファミリーの細胞外領域は、２つの相同リガンド結合ドメイン（ドメイン１及び３）及び２つの富システインドメイン（ドメイン２及び４）を含み、それらは受容体が二量体化するために重要である。リガンドが存在しない場合、ＨＥＲ受容体は通常不活性化単量体として存在し、該構造は「テザー」構造として知られており、それはドメイン２及び４の密接な相互作用として特徴づけられている。細胞外ドメインに結合するリガンドは立体構造の再構築を促進し、二量体ドメイン２及び４を露出させる。そのため、増殖因子のＨＥＲ受容体への結合は、立体構造変化を促進し、受容体を二量体化させる。細胞外受容体が二量体化した後は、細胞膜貫通へリックスは活性型へと変わり、細胞内キナーゼドメインが互いに自己リン酸化できるようになる。このリン酸化イベントによって、特異的な下流のシグナルタンパク質の収集が行われる。

上皮増殖因子受容体１（ＥＧＦＲ）は、ヒト悪性腫瘍の原因に関連していると考えられてきた。特に、乳房、膀胱、肺、脳、頸部及び胃の癌において、神経膠芽腫と同様にＥＧＦＲの発現上昇が認められてきた。

ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ２又はＮｅｕ；ＵｎｉＰｒｏＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ ＮＯ．Ｐ０４６２６としても知られている）は１２３３アミノ酸から構築され、構造がＥＧＦＲと似ており、１−４の４つのサブドメインから構築される細胞外ドメイン、細胞膜貫通ドメイン、膜近傍ドメイン、細胞内細胞質チロシンキナーゼ及び制御Ｃ−末端をともなっている。しかし、ＨＥＲ２の細胞外領域の構造は、他のＥＧＦ受容体と重要な側面において異なっている。他のＥＧＦ受容体は、不活性化状態では、ドメイン２はドメイン４と結合している。ドメイン１及び３が結合すると、活性化増殖因子（リガンド）は構造を選択、安定化させ、ＥｒｂＢ二量体パートナーとの相互作用をするための二量体化アームをドメイン２から伸長させる。その一方で、ＨＥＲ２は、固定された構造を取り、該構造はその他の受容体メンバーのリガンド活性化状態と酷似している。ドメイン２−４の相互結合は無く、ドメイン２における二量体ループが恒常的に露出している。ＨＥＲ２はその他のＥｒｂＢファミリーのメンバーと異性二量体複合体の形成を介して活性化し、それによってＥＧＦＲ及びＨＥＲ３リガンドによって間接的に制御される。ＨＥＲ２は他の３つのＥｒｂＢ受容体の優先的な異性二量体パートナーであり、リガンド−受容体複合体の解離率を下げることで、ＥｒｂＢ受容体とそれらのリガンドとの親和性を促進し、それによってＨＥＲ２はシグナルを増強及び増長している。

細胞表面における過剰なＨＥＲ２は、様々な組織からの上皮細胞の転移を引き起こす。ヒトｎｅｕ遺伝子（ＨＥＲ２としても知られる）の相同体の増幅は、乳癌や卵巣癌において観察され、予後の悪さと相関している（米国特許第４９６８６０３号明細書）。ＨＥＲ２の過剰発現は、他の癌腫においても観察される。該癌腫は胃、子宮内膜、唾液腺、肺、肝臓、大腸、甲状腺、膵臓及び膀胱における癌腫である。

ＨＥＲ２標的抗体
Ｄｒｅｂｉｎと同僚はラットｎｅｕ遺伝子産物に対する抗体を構築した、ｐ１８５〈ｎｅｕ〉米国特許出願公開第６７３３７５２号明細書参照。

ＨｕｄｚｉａｋらのＭｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９（３）：１１６５−１１７２（１９８９）はＨＥＲ２に対する抗体群を構築したと述べている。該抗体群は、ヒト肺癌細胞株ＳｋＢｒ−３を用いて特徴づけられた。細胞増殖評価を使用すると、最大抑制は４Ｄ５と呼ばれる抗体によって得られた。該抗体４Ｄ５はＨＥＲ２を過剰発現している肺癌細胞株におけるＴＮＦαによる細胞毒性効果の感受性を増加させることも、さらに認められた；米国特許第５６７７１７１号明細書参照。人工ヒト化齧歯類ＨＥＲ２抗体４Ｄ５リコンビナント（ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８、ｒｈｕＭＡｂ ＨＥＲ２、トラスツズマブ又はハーセプチン；米国特許第５８２１３３７号明細書）はＨＥＲ２を過剰発現している転移性の乳癌患者にとって臨床的に有効であり、癌に対する広範囲な前治療として受け入れられている。ハーセプチンは、ＨＥＲ２陽性転移性の腹部（胃）の癌患者へ化学治療と組み合わせて使うことが受け入れられている。

ハーセプチンはＨＥＲ２タンパク質を過剰発現及び／又はＨＥＲ２遺伝子が増幅している転移性の乳癌同様、早期の患者の治療に広く使用されている。例えば、乳癌患者へハーセプチン／トラスツズマブの処理が推奨されており、現在では、ＨＥＲ２陽性の疾患患者への使用は一般的である；米国特許出願公開第２００２／００６４７８５号明細書、米国特許出願公開第２００３／０１７０２３４号明細書、米国特許出願公開第２００３／０１３４３４４号明細書、及び米国特許出願公開第２００３／０１４７８８４号明細書参照。したがって、先行技術は乳癌患者のハーセプチン／トラスツズマブ治療への適格性に焦点を当てている。該適格性はＨＥＲ２タンパク質の高発現量（例えば免疫組織化学（ＩＨＣ）によるＨＥＲ２（３＋）として定義されるもの）に基づいている。乳癌におけるＨＥＲ２陽性疾患は、免疫組織化学的な手段でＨＥＲ２（タンパク質）が検出されるか（例えば、ＨＥＲ２（＋＋＋））又はＨＥＲ２遺伝子増幅しているか（例えば、腫瘍細胞につきＨＥＲ２遺伝子が４コピー以上）、若しくはその両方が乳房組織の患者の試料生検や外科手術から得られた組織又は侵出した組織において検出されることで定義される。ＨＥＲ２の過剰発現や遺伝子レベルでの増幅を検出する方法として頻繁に適用されている手法の１つは、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）である。Ｃｏｈｅｎらの米国特許出願公開第２００３／０１５２９８７号明細書にも記載されている。

ペルツズマブはヒト化抗体であり、作用剤の新しいクラスの一番初めのものであり、ＨＥＲ二量体化阻害剤（ＨＤＩ）として知られる。ペルツズマブはＨＥＲ２の二量体化ドメインに結合し、そうすることで、活性化異性二量体受容体複合体の形成能を抑制し、その結果として細胞増殖及び分裂を引き起こす下流のシグナルカスケードを止める。ペルツズマブは、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン２に対する抗体である。ＨＥＲ２のドメイン４に結合することで機能するトラスツズマブに対して、ペルツズマブはＨＥＲ二量体化形成阻害剤である。ペルツズマブは、それぞれの活性化型リガンドが存在する状況下で、ＨＥＲ２とＨＥＲ３及びその他ＥＧＦＲ受容体ファミリーが二量体化することを防ぐ。複合体形成を阻害することで、ペルツズマブは、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４のリガンドによって活性化される成長刺激効果及び細胞生存シグナルを防ぐ。ペルツズマブはパージェタという名称でＦＤＡによって承認されており、ＨＥＲ２陽性の転移性の乳癌患者へトラスツズマブとドセタキセルを組み合わせて処方される。該患者は、抗ＨＥＲ２前治療又は化学治療を受けていない患者である。ペルツズマブは完全にヒト化されたリコンビナントモノクロ抗体であり、ヒトＩｇＧκフレームワーク配列に基づいている。ペルツズマブに関する特許出願公開及び治療の為の患者の選択は以下に含まれる：米国特許出願公開第２００６００７３１４３号明細書；米国特許出願公開第２００３／００８６９２４号明細書；米国特許出願公開第２００４／００１３６６７号明細書及び米国特許出願公開第２００４／０１０６１６１号明細書。

トラスツズマブに関しては、例えば化学治療と組み合わせることで化学治療単体よりも生存率を伸ばすという点で臨床的に効果が示されることが知られている一方で、ＨＥＲ２陽性の乳癌患者の多くが、それにも関わらず、非反応者であることが分かっている（ハーセプチン＋化学治療の反応率は４５％、化学治療のみは２９％）。

従って、ＨＥＲ２に対する直接的なモノクローナル抗体治療は、例えばＨＥＲ２を過剰発現している転移性の乳癌へ改善された治療法を提供するが、未だ改善の余地がある。

ＨＥＲ２を標的とする非抗体性足場
近年、代替標的タンパク質が提案されており、それらはヒト免疫グロブリン由来の抗体断片及び抗体由来コンストラクト若しくは形成物よりも分子構造に多様性が有る。そして、それ故異性二量体や多量体などの構造物を作ることで追加的な分子構造を作ることができ、新しい生理学的機能を付与することが可能となる。いくつかのそのような標的タンパク質は、以下に示される（（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ ２００５、Ｖｏｌ２３：１２５７−１１２６８）参照）。そのような標的タンパク質の非限定的な例は、ラクダ抗体、タンパク質Ａドメインに由来するタンパク質の足場（「アフィボディー」とよばれる、Ａｆｆｉｂｏｄｙ ＡＢ）、テンダスタット（アルファアミラーゼ阻害剤、ストレプトマイセス テンデ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｅｎｄａｅ）由来のアルファアミラーゼ阻害剤７４アミノ酸βシートタンパク質）、フィブロネクチン、リポカリン（「アンチカリン」、Ｐｉｅｒｉｓ）、Ｔ細胞受容体、アンキリン（ＤＡＲＰｉｎとよばれる設計されたアンキリン反復タンパク、チューリッヒ大学とモレキュラーパートナー 米国特許出願公開第２０１２０１４２６１１号明細書参照）、様々な受容体のＡ−ドメイン（「アビマー」、Ａｖｉｄｉａ）及びＰＤＺドメイン、フィブロネクチンドメイン（ＦＮ３）（「アドネクチン」、Ａｄｎｅｘｕｓ）、共通フィブロネクチンドメイン（「センチリンズ」、Ｃｅｎｔｙｒｅｘ／Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ユビキチン（「アフィリンズ」、ＳＣＩＬ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、及びノッティンズ（Ｍｏｏｒｅ ａｎｄ Ｃｏｃｈｒａｎｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ５０３（２０１２）、２２３−２５１とこれに記載される引用文献参照）である。

これらのタンパク質から、多量体や多選択制の集合体が構築され得る（Ｃａｒａｖｅｌｌａ ａｎｄ Ｌｕｇｏｖｓｋｏｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇ ２０１０、１４：５２０−５２８；Ｖａｎｌａｎｄｓｃｈｏｏｔ ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１１ ９２：３８９−４０７；Ｌｏｂｌｏｍ ｅｔ ａｌ．２０１１ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１１ ２２：８４３−８４８、Ｂｏｅｒｓｍａ ｅｔ ａｌ．２０１１ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：８４９−８５７）。これら及び他のペプチドドメインを抗体と融合させることで、ザイボディーとよばれるものを創出することを可能にする（Ｚｙｎｇｅｎｉａ Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）。

当業者によく知られた選択技術を用いれば、すべての前記足場は、異なる固有の性質をともない、特異的なエピトープと結合する抗体となることができることで共通している（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ ２００５、２３：１２５７−１２６８）。

例えば、バキュロウィルス発現システムを用いて、ドメイン１及びドメイン４によって示されるように、独立して異なるＨＥＲ２のドメインを昆虫の細胞に個別に発現させることができる（Ｆｒｅｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２ ３０：９９７−１００１）。そうすることで、選択されたバインダーを目的のドメインに結合させることが保証される。ＨＥＲ２ドメインは以前示されたとおりビオチン化することができ（Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＥＲ２ ｂｉｎｄｉｎｇ−ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１）、ストレプトコートしたマグネティックビーズ又は、ストレプトアビジン若しくはニュートラアビジンでコートしたマイクロタイタープレートに固定することができる（Ｓｔｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８２、１２１１−１２２７）、（Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６９、１０１５−１０２８．）。そして、こうして固定されたＨＥＲ２ドメインはリボソームディスプレイ法又はファージディスプレイ法のどちらの方法においても、様々なタンパク質ライブラリーの標的として提供できる。様々な異なる抗体ライブラリーが公開されており（Ｍｏｎｄｏｎ Ｐ．ｅｔ ａｌ．、Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：ａ ｒａｃｅ ｔｏ ｅｎｇｉｎｅｅｒ ａｎｄ ｅｘｐｌｏｒｅ ａ ｌａｒｇｅｒ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．１３：１ １ １７−１ １２９、２００８）、結合する抗体を選択する技術は当業者にはよく知られている。ファージディスプレイは抗体断片（Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片又は単抗体ドメイン）（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ＨＲ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２３（９）：１１０５−１１１６、２００５ Ｓｅｐ）及び、他のジスルフィド結合を含む足場に適しているが、ジスルフィド結合を含まない足場にも用いられている（例えば、Ｓｔｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８２、１２１１−１２２７）（Ｒｅｎｔｅｒｏ ｅｔ ａｌ． Ｃｈｉｍｉａ．６５（１１）：８４３−５、２０１１．、Ｓｋｅｒｒａ Ａ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１８（４）：２９５−３０４、２００７ Ａｕｇ）。同様に、リボソーディスプレイも抗体断片（Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）、Ｐｉｃｏｍｏｌａｒ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｆｕｌｌｙ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｎａｉｖｅ ｌｉｂｒａｒｙ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｅｖｏｌｖｅｄ ｂｙ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８、１２８７−１２９２）及び他の足場のために利用することができる（Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ：ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ａｎｄ ｅｖｏｌｖｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｈａｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄ ｔｏ ａ ｔａｒｇｅｔ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４、２６９−２７９；Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６９、１０１５−２８．）。３つ目の強力な手法は酵母ディスプレイである（Ｐｅｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．１１（２）：１２７−１３４、２００８ Ｆｅｂ．）。この手法において、目的の結合タンパク質のライブラリーは酵母の表面に提示され、それぞれのＨＥＲ２のドメインは直接蛍光色素でラベルされているか、ＨＥＲ２のドメインのヒスタグが抗ヒスタグ抗体で検出される。抗ヒスタグ抗体で検出されたＨＥＲ２のドメインのヒスタグは次いで、二次抗体で検出することができる。このような方法は当業者にはよく知られている（Ｂｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｙｅａｓｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｆｏｒ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ａｆｆｉｎｉｔｙ、ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．３２８：４３０−４４、２０００．）。

この技術のもう１つの可能性は、前記バインダーを結合することで二重特異性又はより多方面に結合できる分子を創出することである。こういった結合は、個々の従属請求の範囲に含まれるそれぞれの、又はいかなる組み合わせの、ふたつかそれ以上の結合分子を遺伝子工学的に融合させること、又は離れて出現する分子を化学的に交差結合させること、若しくは二量体化ドメインを加えることで達成される（例えば、Ｓｔｅｆａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１３：８２６−８４３；Ｂｏｅｒｓｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８６：４１２７３−４１２８５参照）。

二重特異性ＨＥＲ２ラクダ抗体コンストラクト（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｎａｎｏｂｏｄｙ）は米国特許出願公開第２０１１００５９０９０号明細書に示されている。この文献は二重特異性分子に関し、該二重特異性分子はＨＥＲ２の細胞外ドメイン２及びドメイン４を同時に標的とする。該ＨＥＲ２の細胞外ドメイン２はペルツズマブの競合であると定義される。該ＨＥＲ２の細胞外ドメイン４はトラスツズマブの競合であると定義される。この分子は、ＳｋＢｒ３細胞株を使った培養モデルを用いた系で直接比較した結果、トラスツズマブ（ハーセプチン）よりも強い抗増殖活性を示すと述べられている。

ＨＥＲ２の特異的なリガンドが知られていないため、現在のＨＥＲ２標的戦略は、相互作用表面に結合して受容体の二量体化を抑制することを目的としている。今日のＨＥＲ２受容体二量体化に関する知見は、ほとんどがＥＧＦＲ相同二量体のリガンド結合型結晶構造に基づいており、該構造は全てのＥＧＦ受容体ファミリーの活性型であることが認知されている（Ｇａｒｒｅｔ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｅｌｌ １１０、７６３−７７３）。２つのＥＧＦＲ分子は背面同士で結合する。この発見を、ＨＥＲ２及びその他のＥＧＦＲファミリーのメンバーとＨＥＲ２の可能性のある相互作用へと拡張すると、１つの相互作用面はＨＥＲ２の細胞外部のドメイン２に存在する。ペルツズマブはドメイン２に結合し、実際この接触面で受容体を阻害していることが知られている。他の相互作用として知られているのは、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン４である。この相互作用面はトラスツズマブによって阻害されていると考えられている。しかし、ペルツズマブ及びトラスツズマブどちらの抗体も、両方を同時に使用したときでさえ、全てのＨＥＲ２相互作用を完全に遮断することはできない。細胞外部とＨＥＲ２のキナーゼドメインの相互作用は、ペルツズマブやトラスツズマブに遮断された状況でも余剰の相互作用によって保たれていると考えられており、そのことは結晶構造解析からも示唆される（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．（２０１０） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（２２）：５４３２−５４４３）。前記二重特異性リガンドは両方のエピトープ（ペルツズマブ及びトラスツズマブ）に対して同時に結合し（米国特許出願公開第２０１１００５９０９０号明細書）、細胞培養系においてはおおよそ５０％まで細胞増殖を減少させるが、それに比べてトラスツズマブは細胞増殖をおおよそ４０％減少させる。しかしながら、同様の効果はペルツズマブ及びトラスツズマブを同時に処理したときに得られる。

米国特許第４９６８６０３号明細書 米国特許第６７３３７５２号明細書 米国特許第５６７７１７１号明細書 米国特許第５８２１３３７号明細書 米国特許出願公開第２００２／００６４７８５号明細書 米国特許出願公開第２００３／０１７０２３４号明細書 米国特許出願公開第２００３／０１３４３４４号明細書 米国特許出願公開第２００３／０１４７８８４号明細書 米国特許出願公開第２００３／０１５２９８７号明細書 米国特許出願公開第２００６００７３１４３号明細書 米国特許出願公開第２００３／００８６９２４号明細書 米国特許出願公開第２００４／００１３６６７号明細書 米国特許出願公開第２００４／０１０６１６１号明細書 米国特許出願公開第２０１２０１４２６１１号明細書 米国特許出願公開第２０１１００５９０９０号明細書

Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９（３）：１１６５−１１７２（１９８９） Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ ２００５、Ｖｏｌ２３：１２５７−１１２６８ Ｍｏｏｒｅ ａｎｄ Ｃｏｃｈｒａｎｅ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ５０３（２０１２）、２２３−２５１ Ｃａｒａｖｅｌｌａ ａｎｄ Ｌｕｇｏｖｓｋｏｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇ ２０１０、１４：５２０−５２８ Ｖａｎｌａｎｄｓｃｈｏｏｔ ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１１ ９２：３８９−４０７；Ｌｏｂｌｏｍ ｅｔ ａｌ．２０１１ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１１ ２２：８４３−８４８ Ｂｏｅｒｓｍａ ｅｔ ａｌ．２０１１ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：８４９−８５７ Ｆｒｅｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２ ３０：９９７−１００１ Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＥＲ２ ｂｉｎｄｉｎｇ−ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１ Ｓｔｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８２、１２１１ −１２２７ Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６９、１０１５−１０２８ Ｍｏｎｄｏｎ Ｐ．ｅｔ ａｌ．、Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：ａ ｒａｃｅ ｔｏ ｅｎｇｉｎｅｅｒ ａｎｄ ｅｘｐｌｏｒｅ ａ ｌａｒｇｅｒ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．１３：１１１７−１１２９、２００８ Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ＨＲ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２３（９）：１１０５−１１１６、２００５ Ｓｅｐ Ｒｅｎｔｅｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｉｍｉａ．６５（１１）：８４３−５、２０１１．、Ｓｋｅｒｒａ Ａ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１８（４）：２９５−３０４、２００７ Ａｕｇ Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）、Ｐｉｃｏｍｏｌａｒ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｆｕｌｌｙ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｎａｉｖｅ ｌｉｂｒａｒｙ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｅｖｏｌｖｅｄ ｂｙ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８、１２８７−１２９２ Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ： ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ａｎｄ ｅｖｏｌｖｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｈａｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄ ｔｏ ａ ｔａｒｇｅｔ． Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ４、２６９−２７９ Ｐｅｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．１１（２）：１２７−１３４、２００８ Ｆｅｂ Ｂｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｙｅａｓｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｆｏｒ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ａｆｆｉｎｉｔｙ、ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．３２８：４３０−４４、２０００ Ｓｔｅｆａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１３：８２６−８４３；Ｂｏｅｒｓｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８６：４１２７３−４１２８５ Ｇａｒｒｅｔ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｅｌｌ １１０、７６３−７７３ Ｌｕ ｅｔ ａｌ．（２０１０） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（２２）：５４３２−５４４３

前記の技術水準の観点から、本発明の目的は、癌治療に用いるためのＨＥＲ２タンパク質を標的とする手技及び手法を向上させることである。

この目的は、各請求項の内容によって達成される。

図１ａは細胞増殖測定における二重特異性標的剤の抗腫瘍活性の増加を示している。Ｙ軸はＨＥＲ２を発現している異なる細胞株に、凡例で示されたいずれかの前記剤を処理した後の細胞の生存率を示している。 図１ｂは細胞増殖測定における二重特異性標的剤の抗腫瘍活性の増加を示している。Ｙ軸はＨＥＲ２を発現している異なる細胞株に、凡例で示されたいずれかの前記剤を処理した後の細胞の生存率を示している。 図１ｃは細胞増殖測定における二重特異性標的剤の抗腫瘍活性の増加を示している。Ｙ軸はＨＥＲ２を発現している異なる細胞株に、凡例で示されたいずれかの前記剤を処理した後の細胞の生存率を示している。 図２は異なる抗腫瘍剤の非存在下又は存在下における、細胞ＤＮＡ内容物をフローサイトメーターを用いて測定したものを示している。 図３ａはターミナルトランスフェレースｄＵＴＰニックエンド標識（ＴＵＮＥＬ）測定及びフローサイトメーターを用いて、二重特異性標的剤のアポトーシス誘導を定量したものを示している。 図３ｂはターミナルトランスフェレースｄＵＴＰニックエンド標識（ＴＵＮＥＬ）測定及びフローサイトメーターを用いて、二重特異性標的剤のアポトーシス誘導を定量したものを示している。 図４はＨＥＲ２／ＨＥＲ３シグナル経路、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路及びＭＡＰＫ経路、及びその下流の標的である細胞周期及びアポトーシスを、ウェスタンブロットを用いて測定したものを示している。 図５ａは抗ＨＥＲ２結合剤を処理した後の、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３受容体の発現とリン酸化を処理時間を変化させて測定した定量的ウェスタンブロットの結果を示している。 図５ｂは抗ＨＥＲ２結合剤を処理した後の、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３受容体の発現とリン酸化を処理時間を変化させて測定した定量的ウェスタンブロットの結果を示している。 図６は二重特異性標的剤によるリガンド刺激増殖の阻害を細胞増殖測定によって調べたものを示している。 図７は抗ＨＥＲ２標的フォーマットのイラストによるまとめを示している。 図８は二重特異性結合剤による抗腫瘍活性を細胞増殖測定で定量し、異なる濃度の抗腫瘍剤の影響を細胞生存率を用いて示している。 図９は細胞増殖測定における、すべてのコンストラクトの抗腫瘍活性を示しており、該コンストラクトは、ＨＥＲ２のドメイン１における近似エピトープを共有している。Ｙ軸は凡例に示されたいずれかの剤を処理した後のＢＴ４７４細胞の生存率を示している。 図１０は単結合剤による抗腫瘍活性を示している。Ｙ軸は凡例で示されたいずれかの剤をそれぞれＢＴ４７４細胞に処理した後の生存を示している。 図１１は凡例に示されたいずれかの剤をＢＴ４７４細胞に処理した後の、単体抗ＨＥＲ２結合剤の複合処理の細胞生存率（Ｙ軸）への効果を示している。 図１２ａは細胞増殖測定を用いて測定した、トラスツズマブ抵抗性細胞株における異なる抗腫瘍剤の効果を示している。Ｙ軸は凡例で示されたいずれかの剤を処理した後の還元型ＸＴＴの吸光度から決定した細胞生存率を示している。 図１２ｂは細胞増殖測定を用いて測定した、トラスツズマブ抵抗性細胞株における異なる抗腫瘍剤の効果を示している。Ｙ軸は凡例で示されたいずれかの剤を処理した後の還元型ＸＴＴの吸光度から決定した細胞生存率を示している。 図１２ｃは細胞増殖測定を用いて測定した、トラスツズマブ抵抗性細胞株における異なる抗腫瘍剤の効果を示している。Ｙ軸は凡例で示されたいずれかの剤を処理した後の還元型ＸＴＴの吸光度から決定した細胞生存率を示している。 図１２ｄは細胞増殖測定を用いて測定した、トラスツズマブ抵抗性細胞株における異なる抗腫瘍剤の効果を示している。Ｙ軸は凡例で示されたいずれかの剤を処理した後の還元型ＸＴＴの吸光度から決定した細胞生存率を示している。 図１２ｅは細胞増殖測定を用いて測定した、トラスツズマブ抵抗性細胞株における異なる抗腫瘍剤の効果を示している。Ｙ軸は凡例で示されたいずれかの剤を処理した後の還元型ＸＴＴの吸光度から決定した細胞生存率を示している。 図１３ａは細胞増殖測定を用いて二重特異性標的剤の抗腫瘍活性存在下におけるトラスツズマブ及びペルツズマブの抗腫瘍活性を示している。データは図１１と同様の示し方をしている。 図１３ｂは細胞増殖測定を用いて二重特異性標的剤の抗腫瘍活性存在下におけるトラスツズマブ及びペルツズマブの抗腫瘍活性を示している。データは図１１と同様の示し方をしている。 図１４は細胞増殖測定における、異なる抗腫瘍活性剤の抗腫瘍活性を示している。データは図１１と同様の示し方をしている。 図１５は二重特異性標的剤及びペルツズマブのＥＬＩＳＡの結果を示している。Ｙ軸はペルツズマブ存在下において、ＨＥＲ２に結合する凡例に示された剤の濃度を示している。 図１６はＧ３及びＨ１４のトラスツズマブへの競合的結合を示している。Ｙ軸はトラスツズマブ存在下における、ＨＥＲ２のドメイン４へ結合する凡例に示されている剤の割合を示している。 図１７ａは癌細胞の表面に存在するＨＥＲ２への、単結合ユニット及び二重特異性結合剤の結合親和性、結合量及び結合様式を示している。Ａ及びＢは単結合剤のオンレートの測定、Ｃは二重特異性結合剤のオンレートの測定、Ｄは単結合剤及び二重特異性剤のオフレートの測定を示している。ＭＦＩは平均蛍光強度を表している。 図１７ｂは癌細胞の表面に存在するＨＥＲ２への、単結合ユニット及び二重特異性結合剤の結合親和性、結合量及び結合様式を示している。Ａ及びＢは単結合剤のオンレートの測定、Ｃは二重特異性結合剤のオンレートの測定、Ｄは単結合剤及び二重特異性剤のオフレートの測定を示している。ＭＦＩは平均蛍光強度を表している。 図１８は単結合剤及び二重特異性剤のＢＴ４７４細胞の細胞表面の細胞解離率（Ａ）及び抗腫瘍活性（Ｂ−Ｇ）を示している。Ａ：ＢＴ４７４細胞の表面へ結合する蛍光標識された剤の蛍光強度の平均値を、解離時間能としてプロットしたものを示している。Ｂ−Ｇ：Ｙ軸は凡例に示されるいずれかの剤を処理した後の、ＢＴ４７４細胞（Ｂ−Ｄ、Ｆ、Ｇ）及びＭＣＦ７細胞（Ｅ）の生存率を示している。 図１９はＣＨＯ細胞に発現させるＡ２１Ｈ＿４Ｄ５ＬＨ＿Ａ２１Ｌ（Ａ）の構築原理と、完全な二重特異性剤コンストラクトの図を示している。ここで、「重鎖」はＶＨドメインに関し、「軽鎖」とはＶＬドメインに関する。 図２０は細胞増殖測定を用いてＢＴ４７４細胞の生存率を調べることで、異なる抗腫瘍活性剤の効果を示している。Ｙ軸は凡例に示されるいずれかの剤（１００ｎＭ）を処理した後の還元型ＸＴＴの吸光度を調べ、細胞の生存率を調べている。データはコントロールを用いて標準化し、それを１００％とした。 図２１はＨＣＣ１４１９の生存率を細胞増殖測定を用いて測定し、抗腫瘍活性剤の効果を示している。Ｙ軸は凡例に示されるいずれかの剤（１００ｎＭ）を処理した後の還元型ＸＴＴの吸光度を調べ、細胞株の生存率を調べている。データはコントロールを用いて標準化し、コントロールを１００％とした。 図２２はターミナルトランスフェレースｄＵＴＰニックエンド標識（ＴＵＮＥＬ測定）とフローサイトメトリーを用いてＢＴ４７４細胞のアポトーシス誘導率を定量したものを示している。 図２３はウェスタンブロット解析を用いてポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の切断を検出することでアポトーシスを測定している。ＧＡＰＤＨをローディングコントロールとしている。 図２４は細胞増殖測定を行うことで、ＢＴ４７４細胞への抗腫瘍剤の効果を示している。Ｙ軸は図の凡例に示されるいずれかの剤を処理した後の還元型ＸＴＴの吸光度を調べ、細胞の生存率を調べている。

発明の１つの側面は、
ａ．ＨＥＲ２の細胞外ドメイン１に結合する第１のリガンドと、
ｂ．ＨＥＲ２の細胞外ドメイン４に結合する第２のリガンドと、
ｃ．前記第１のリガンド及び前記第２のリガンドをつなぐリンカー
を含む、二重特異性剤が提供される。

幾つかの実施態様では、二重特異性剤はポリペプチドである。当業者は単純に現在の方法に基づき、合理的に設計された非ポリペプチド標的剤を想像するであろう。例えば非限定的な例として、ＲＮＡアプタマー又はＬ−ＲＮＡアプタマーなどである（米国特許第６６０５７１３号明細書及びこの文献の引用文献参照）。本発明の熟考された実施態様の大部分はポリペプチドリガンドに関するものである。構造定義の理由により、実施態様の大部分がさらにポリペプチドリンカーによって結合されており、単アミノ酸鎖の一部である。本発明には非ポリペプチド二重特異性剤も明確に含まれているが、本明細書で示す全ての実施態様は明確にポリペプチド剤、特に単アミノ酸鎖ポリペプチド剤を含むものとして理解されるべきである。

幾つかの実施態様では、二重特異性剤はアミノ酸の単配列を含む。幾つかの実施態様では、第１のリガンドは第２のリガンドが架橋部位を介して共有結合的に付着しており、該架橋部位は第１及び第２のリガンドのアミノ酸側鎖に付着している。幾つかの実施態様では、第１のリガンド及び第２のリガンドは二量体ドメインを介して結合しており、該二量体化ドメインは第１のリガンド及び第２のリガンドの両方と非共有的な相互作用によって結合する。

本発明の別の側面は、
ａ．ＨＥＲ２の細胞外ドメイン１に結合する第１の結合部位と、
ｂ．ＨＥＲ２の細胞外ドメイン４に結合する第２の結合部位と、及び、
ｃ．上記の第１の結合部位及び第２の結合部位を共有結合でつなぐリンカー
を含むポリペプチドが提供される。

本明細書の文脈における「結合部位」という用語は、特にアミノ酸残基であり、第１又は第２のポリペプチドリガンドの構築部位に関し、例えば特異的なエピトープである、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン１又は４などの特異的な部位と結合することで相互作用する。

本発明の別の側面は、
ａ．ＨＥＲ２の細胞外ドメイン１と結合する第１のポリペプチドリガンドと（配列番号０１）、
ｂ．ＨＥＲ２の細胞外ドメイン４と結合する第２のポリペプチドリガンドと（配列番号０２）、
ｃ．上記の第１のポリペプチドリガンドと第２のポリペプチドリガンドを共有結合的に付着するリンカー
とを含む二重特異性ＨＥＲ２標的剤が提供される。

本明細書の文脈における「二重特異性」とはＨＥＲ２の異なる２つのエピトープに特異的に結合できる前記剤の能力に関する。

本明細書の文脈において、「結合」又は「特異的な結合」は第１（及び、それぞれ第２）のポリペプチドリガンドへの特異的な結合能と、ＨＥＲ２のドメイン１（又は、それぞれドメイン４）への非共有結合的な付着であって、解離定数が１０^−７、１０^−８、１０^−９Ｍと同等又はそれ以下のものに関する。

ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ−２、アクセッション番号ＮＰ＿００４４３９．２）のドメイン１（配列番号０１）はアミノ酸配列である。
ＱＶＣＴ ＧＴＤＭＫＬＲＬＰＡ ＳＰＥＴＨＬＤＭＬＲ ＨＬＹＱＧＣＱＶＶＱ ＧＮＬＥＬＴＹＬＰＴ ＮＡＳＬＳＦＬＱＤＩ ＱＥＶＱＧＹＶＬＩＡ ＨＮＱＶＲＱＶＰＬＱ ＲＬＲＩＶＲＧＴＱＬ ＦＥＤＮＹＡＬＡＶＬ ＤＮＧＤＰＬＮＮＴＴ ＰＶＴＧＡＳＰＧＧＬ ＲＥＬＱＬＲＳＬＴＥ ＩＬＫＧＧＶＬＩＱＲ ＮＰＱＬＣＹＱＤＴＩ ＬＷＫＤＩＦＨＫＮＮ ＱＬＡＬＴＬＩＤＴＮ ＲＳＲＡＣＨＰＣＳＰ ＭＣＫＧＳＲＣＷＧＥ ＳＳＥＤＣＱＳＬＴＲ ＴＶＡ．

ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ−２、アクセッション番号ＮＰ＿００４４３９．２）のドメイン４（配列番号０２）はアミノ酸配列である。
ＶＮＣＳ ＱＦＬＲＧＱＥＣＶＥ ＥＣＲＶＬＱＧＬＰＲ ＥＹＶＮＡＲＨＣＬＰ ＣＨＰＥＣＱＰＱＮＧ ＳＶＴＣＦＧＰＥＡＤＱＣＶＡＣＡＨＹＫＤ ＰＰＦＣＶＡＲＣＰＳ ＧＶＫＰＤＬＳＹＭＰ ＩＷＫＦＰＤＥＥＧＡ ＣＱＰ

アクセッション番号及び遺伝子ＩＤは、国立生物工学情報センター、ベセスダ、メリーランド、ＭＤに記載のものに関する。

ユニプロット番号は、ユニプロットナレッジベールに記載のものに関する。

ＡＴＣＣ番号は、アメリカンタイプカルチャーコレクションに記載のものに関する。

ＰＤＢ番号はプロテインデータバンクに記載のものに関する。

幾つかの実施態様では、第１のポリペプチドリガンド又は第２のポリペプチドリガンドは抗体、抗体断片、抗体様分子又はポリペプチド由来のタンパク質Ａドメインである。

幾つかの実施態様では、抗体は免疫グロブリンであり、２つの重鎖及び軽鎖を含む。幾つかの実施態様では、抗体とは単鎖ドメイン抗体であり、重鎖又は軽鎖から単離された可変領域を含む。幾つかの実施態様では、抗体はラクダ科に見られる抗体のような重鎖のみから構築される重鎖抗体である。

幾つかの実施態様では、抗体断片はＦａｂ抗体であり、すなわち抗体の抗原結合断片又は、単鎖可変領域であって、すなわちペプチドリンカーによって結合される抗体の重鎖と軽鎖可変領域の融合タンパク質である。

本明細書の文脈における抗体様分子とは、特異的な結合を示す分子に関し、該分子は抗体の特異的結合と同様に他の分子や標的物と結合する。幾つかの実施態様では、抗体様分子とはアンキリン反復タンパク質（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｚｕｒｉｃｈ）、アルマジロ反復タンパク質由来のポリペプチド、富ロイシン反復タンパク質由来のポリペプチド、又はテトラトリコペプチド反復タンパク質由来のポリペプチドなどの反復タンパク質である。

幾つかの実施態様では、抗体様分子はプロテインＡドメイン由来のポリペプチド、フィブロネクチンドメインＦＮ３由来のポリペプチド、コンセンサスフィブロネクチンドメイン由来のポリペプチド、リポカリン由来のポリペプチド、ジンクフィンガー由来のポリペプチド、Ｓｒｃ相同ドメイン２（ＳＨ２）由来のポリペプチド、Ｓｒｃ相同ドメイン３（ＳＨ３）由来のポリペプチド、ＰＤＺドメイン由来のポリペプチド、ガンマクリスタリン由来のポリペプチド、ユビキチン由来のポリペプチド、システインノットポリペプチド由来のポリペプチド、又はノッチン由来のポリペプチドでもよい。

プロテインＡドメイン由来のポリペプチドはプロテインＡから派生した分子に関し、免疫グロブリンのＦｃ領域とＦａｂ領域に特異的に結合できる分子に関する。

アルマジロ反復タンパク質は、少なくとも１つのアルマジロ反復を含むポリペプチドに関する。該アルマジロ反復とは、ヘアピン構造を形成するアルファへリックス対によって特徴づけられる。

本明細書の文脈におけるヒト化ラクダ抗体とは、重鎖又は重鎖由来の可変領域（ＶＨＨドメイン）のみで構築され、該ヒト化ラクダ抗体のアミノ酸配列がヒトにおいて自然に産生される抗体と相同性が増すよう修飾されていて、ヒトに投与しても免疫反応が減少しているものである。

ラクダ抗体の一般的なヒト化の方法はＶｉｎｃｋｅ ｅｔ ａｌ「Ｇｅｎｅｒａｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ ｈｕｍａｎｉｚｅ ａ ｃａｍｅｌｉｄ ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｈｕｍｎｉｚｅｄ ｎａｎｏｂｏｄ ｓｃａｆｆｏｌｄ」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００９ Ｊａｎ ３０；２８４（５）：３２７３−３２８４、及び米国特許出願公開第２０１１１６５２１号明細書に示されている。

幾つかの実施態様では、第１のポリペプチドリガンド及び／又は第２のポリペプチドリガンドは
ａ．免疫グロブリンＦａｂ断片、
ｂ．免疫グロブリンｓｃＦｖ断片、
ｃ．免疫グロブリンの可変領域（抗体ドメイン）、
ｄ．ヒト化ラクダ類抗体、
ｅ．タンパク質Ａドメイン由来のポリペプチド、
ｆ．ファイブロネクチンドメインＦＮ３由来のポリペプチド、
ｇ．コンセンサスファイブロネクチン由来のポリペプチド、
ｈ．リポカリン由来のポリペプチド、
ｉ．アルマジロ反復タンパク質由来のポリペプチド、
ｊ．テトラトリコペプチド反復タンパク質由来のポリペプチド、
ｋ．富ロイシン反復タンパク質由来のポリペプチド、
ｌ．ジンクフィンガー由来のポリペプチド、
ｍ．Ｓｒｃ相同ドメイン２（ＳＨ２）由来のポリペプチド、
ｎ．Ｓｒｃ相同ドメイン３（ＳＨ３）由来のポリペプチド、
ｏ．ＰＤＺドメイン由来のポリペプチド、
ｐ．ガンマクリスタリン由来のポリペプチド、
ｑ．ユビキチン由来のポリペプチド、
ｒ．システインノットポリペプチド由来のポリペプチド、
ｓ．ノッチン由来のポリペプチド、
ｔ．ＨＥＲ２のドメイン１又はドメイン４に結合するランダムペプチドライブラリーから選ばれるペプチド
から選ばれる。

本発明の別の側面によれば
ａ．ＨＥＲ２のドメイン１に結合する第１のＦａｂ断片及びＨＥＲ２のドメイン４に結合する第２のＦａｂ断片を含む二重特異性ＩｇＧ、
ｂ．ＨＥＲ２のドメイン１に結合するＶＨドメイン及びＨＥＲ２のドメイン４に結合するＶＬドメインを含むＩｇＧ、
ｃ．ＨＥＲ２のドメイン４に結合するＶＨドメイン及びＨＥＲ２のドメイン１に結合するＶＬドメインを含むＩｇＧ、
ｄ．ＨＥＲ２のドメイン１に結合する第１のｓｃＦｖ断片、ＨＥＲ２のドメイン４に結合する第２のｓｃＦｖ断片及び前記第１のｓｃＦｖ断片並びに前記第２のｓｃＦｖ断片を結合するリンカーを含むコンストラクト、
ｅ．ＨＥＲ２のドメイン１に結合する第１の結合部位及びＨＥＲ２のドメイン４に結合する第２の結合部位を有する二重特異性抗体、
ｆ．本発明の上記の実施例に記載のリストから選択されるＨＥＲ２のドメイン１を標的とするポリペプチドリガンド、又はＨＥＲ２のドメイン１と結合するペプチドライブラリーから選択される５〜３５アミノ酸のペプチドリガンドと結合するＨＥＲ２のドメイン４を標的とするＩｇＧであって、前記ポリペプチドリガンド又はペプチドリガンドは
ｉ． 前記ＩｇＧの重鎖のＮ末端、
ｉｉ． 前記ＩｇＧの重鎖のＣ末端、
ｉｉｉ． 前記ＩｇＧの軽鎖のＮ末端、若しくは
ｉｖ． 前記ＩｇＧの軽鎖のＣ末端
に結合する前記ＩｇＧ
ｇ．本発明の上記の実施態様に記載のリストから選択されるＨＥＲ２のドメイン４を標的とするポリペプチドリガンド、又はＨＥＲ２のドメイン１と結合するペプチドライブラリーから選択される５〜３５アミノ酸のペプチドリガンドと結合するＨＥＲ２のドメイン１を標的とするＩｇＧであって、前記ポリペプチドリガンド又はペプチドリガンドは
ｉ． 前記ＩｇＧの重鎖のＮ末端、
ｉｉ． 前記ＩｇＧの重鎖のＣ末端、
ｉｉｉ． 前記ＩｇＧの軽鎖のＮ末端、若しくは
ｉｖ． 前記ＩｇＧの軽鎖のＣ末端、
と結合する前記ＩｇＧ
から選ばれる二重特異性抗体が提供される。

本明細書の文脈における「ダイアボディ」とは、二重特異性抗体に関する。該二重特異性抗体は第２の抗体のＶＬ抗体（可変軽鎖）と結合している第１の抗体のＶＨ（可変重鎖）ドメイン及び第２の抗体のＶＨ抗体（可変重鎖）が融合している第１の抗体のＶＬ（可変軽鎖）ドメインを含む。

本明細書の文脈において「ＶＬドメイン」は抗体の軽鎖の可変領域に関する。

同様に、本明細書の文脈において「ＶＨドメイン」は抗体の重鎖の可変領域に関する。

幾つかの実施態様では、二重特異性ＩｇＧとは、ＨＥＲ２のドメイン１に結合するＶＨドメイン及びＨＥＲ２の第４のドメインに結合するＶＬドメイン、ＨＥＲ２のドメイン１に結合するＶＨドメイン又はＨＥＲ２のドメイン４に結合するＶＬドメイン及びリンカーを排他的に含む。

幾つかの実施態様では、本発明である二重特異性ＨＥＲ２標的剤とは、
− ＨＥＲ２のドメイン４に結合するＶＨドメイン及びＨＥＲ２のドメイン１に結合するＶＬドメイン並びに２つのドメインと結合するリンカー、又は
− ＨＥＲ２のドメイン４に結合するＶＨドメイン、ＨＥＲ２のドメイン１に結合するＶＬドメイン及び２つのドメインと結合するリンカー
を排他的に含む二重特異性ＩｇＧである。

幾つかの実施態様では、本発明の二重特異性ＨＥＲ２標的剤とは二重特異性ＩｇＧであり、ＨＥＲ２のドメイン４を標的とするＩｇＧを排他的に含む。該二重特異性ＨＥＲ２標的剤は、ＨＥＲ２のドメイン１のエピトープに結合するよう修飾されたＦｃ鎖に１つ又はそれ以上のループ構造を有する（Ｗｏｚｎｉａｋ−Ｋｎｏｐｐ ｅｔ ａｌ．（２０１０）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２３、２８９−２９７参照）。

幾つかの実施態様において、本発明である二重特異性ＨＥＲ２標的剤とは二重特異性ＩｇＧであり、ＨＥＲ２のドメイン１を標的とするＩｇＧを排他的に含む。該二重特異性ＨＥＲ２標的剤においては、ＦＣ鎖の１つ又はそれ以上の構造ループがＨＥＲ２のドメイン４にあるエピトープへ結合するよう修飾されている。

幾つかの実施態様では、第１のポリペプチドリガンド及び／又は第２のポリペプチドリガンドはポリペプチドを基本としたアンキリン反復である。

本明細書の文脈においてアンキリン反復を基本とするポリペプチドは、繰り返し型アミノ酸配列を含むポリペプチドに関し、それらの繰り返し型配列はループによって分けられた２つのアルファへリックスを含む。

幾つかの実施態様では、抗体様分子とは、米国特許出願公開第２０１２１４２６１１号明細書にある設計されたアンキリン反復タンパクである（ＤＡＲＰｉｎ）。

幾つかの実施態様では、第１のポリペプリドリガンドは
配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６及び配列番号９３
からなる群から選ばれる配列を含む又は該配列である。

前記ポリペプチドは、前記段落に記載の配列を含む、又は該配列であり、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン１に結合するアンキリン反復型ポリペプチドである。

幾つかの実施態様では、第２のポリペプチドリガンドは
配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９及び配列番号９２
からなる群から選ばれる配列を含む、又は該配列である。

これらのポリペプチドは、前記段落に記載の配列を含む、又は該配列であり、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン４に結合するアンキリン反復型ポリペプチドである。

特有の配列によって特徴づけられるポリペプチドに関する参照において、ここで参照された特異的な配列と同等の機能を有するポリペプチドも含むことを意味する。そして、該ポリペプチドは特異的な配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、又は９５％の相同性を示す。

本明細書における同一性は、配列の場所同士を比較した結果を表わす単一の定量可能なパラメーターである。本分野において配列比較法は、例えば公に利用可能であるＢＬＡＳＴアルゴリズムが知られている。

幾つかの実施態様では、第１のポリペプチドリガンド及び第２のポリペプチドリガンドはオリゴペプチドリンカーによって互いに付着しており、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド及びリンカーは連続的なポリペプチド鎖を形成している。

連続的なポリペプチド鎖によって構築されている二重特異性ＨＥＲ２標的剤の利点は、リコンビナントバイオテクノロジーによって、該剤を簡易的に製造できることである。該リコンビナントバイオテクノロジーは連続的なポリペプチド鎖をコードしている単一ヌクレオチド配列を大腸菌、酵母又は哺乳類の細胞などの安定的な宿主に発現させることである。

幾つかの実施態様では、第１のポリペプチドリガンドは連続的なポリペプチド鎖のＮ末端にあり、第２のポリペプチド鎖は連続的なポリペプチド鎖のＣ末端にあり、リンカーは第１のリガンド及び第２のリガンドの間に位置する。本発明の前記剤の実施態様は、連続した１つのポリペプチド鎖で構築されており、生化学リコンビナント手法によって１つの工程で該剤を構築できる利点があり、該剤構築の再生産を容易にしている。

幾つかの実施態様では、第１のポリペプチドリガンド及び第２のポリペプチドリガンドは架橋部位又はクロスリンカーによって互いが共有結合的に付着している。

幾つかの実施態様では、クロスリンカーはリシン側鎖のアミノ基又はシステイン側鎖のチオール基といった官能基又は第１のポリペプチドリガンドにおけるＮ末端アミノ酸群を第２のポリペプチドリガンドのアミノ酸側鎖の官能基へと結合させる。

幾つかの実施態様では、クロスリンカーはグルタルアルデヒド、スクシンイミド、トリス［２−マレイミドエチル］アミン、１，４−ビスマレイミドブタン、及び１，４ビスマレイミジル−２，３−ジハイドロキシブタンから選ばれる。

幾つかの実施態様は、本発明の上記の側面又は実施態様に関する二重特異性ＨＥＲ２標的剤が提供され、ただし、
ａ）第１のポリペプチドリガンドは部分的又は全体的に、
ｉ．第１のＤ１エピトープ（ドメイン１）であって、アミノ酸残基Ｅ８７、Ｎ８９、Ｙ９０、Ｌ１３２、Ｒ１３５、Ｄ１４３、Ｉ１４５、Ｗ１４７、Ｋ１４８、Ｌ１５７、Ａ１５８、Ｌ１５９、Ｔ１６０、Ｌ１６１及びＩ１６２をＨＥＲ２のアミノ酸配列中に含む該第１のＤ１エピトープ、
ｉｉ．第２のＤ１エピトープであって、アミノ酸残基Ｄ８８、Ａ９３、Ｖ９４、Ｉ１３３、Ｑ１３４、Ｑ１４２、Ｔ１４４、Ｌ１４６、Ｆ１５１、Ｈ１５２、Ｋ１５３、Ｎ１５４、Ｑ１５６及びＤ１６３をＨＥＲ２のアミノ酸配列中に含む該第２のＤ１エピトープ、
ｉｉｉ．配列番号５５配列によって特徴づけられる第３のＤ１エピトープ、
ｉｖ．第４のＤ１エピトープであって、アミノ酸残基Ｐ１００、Ｌ１０１、Ｎ１０２、Ｎ１０３、Ｔ１０４、Ｒ１３５、Ｎ１３６、Ｐ１３７、Ｙ１４１、Ｄ１４３、Ｔ１４４を含む該第４のＤ１エピトープ、
又は
ｖ．ＨＥＲ２のドメイン１のＤ１エピトープ（配列番号０１）であって、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６及び配列番号９３から選択されるポリペプチドによって、Ｄ１エピトープとの結合が競合する該ＨＥＲ２のドメイン１のＤ１エピトープ
と相互作用する第１のポリペプチドリガンド
及び／又は
ｂ）前記第２のポリペプチドリガンドは部分的又は全体的に
ｉ．第１のＤ４エピトープ（ドメイン４）であって、アミノ酸残基Ｆ５１２、Ｅ５２１、Ｖ５２４、Ｌ５２５、Ｑ５２６、Ｙ５３２、Ｖ５３３、Ｎ５３４、Ａ５３５、Ｒ５３６、Ｄ５４９、Ｇ５５０、Ｓ５５１、Ｖ５５２、Ｃ５５４、Ｆ５５５及びＶ５６３をＨＥＲ２のアミノ酸配列中に含む該第１のＤ４エピトープ、
ｉｉ．第２のＤ４エピトープであって、アミノ酸残基Ｃ５２２、Ｒ５２３、Ｔ５５３、Ｃ５６２及びＡ５６４をＨＥＲ２のアミノ酸配列中に含む該第２のＤ４エピトープ、
ｉｉｉ．配列番号５６配列によって特徴づけられる第３のＤ４エピトープ、
ｉｖ．配列番号５７配列によって特徴づけられる第４のＤ４エピトープ、
ｖ．第５のＤ４エピトープであって、アミノ酸残基Ｐ５５７、Ｅ５５８、Ａ５５９、Ｄ５６０、Ｑ５６１、Ｄ５７０、Ｐ５７１、Ｐ５７２、Ｆ５７３、Ｐ５９５、Ｄ５９６、Ｅ５９７、Ｅ５９８、Ｇ５９９、Ａ６００、Ｃ６０１、Ｑ６０２及びＰ６０３をＨＥＲ２のアミノ酸配列中に含む該第５のＤ４エピトープ、又は、
ｖｉ．ＨＥＲ２のドメイン４のＤ４エピトープ（配列番号０２）であって、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９及び配列番号９２から選択される配列を有するポリペプチドによってＤ４エピトープへの結合と競合する、該ＨＥＲ２のドメイン４のＤ４エピトープ
と相互作用する第２のポリペプチドリガンドである。

本発明の文脈における非共有結合的な相互作用とは、以下に限定されるものではないが静電気的相互作用、水素結合及びファンデルワールス力が挙げられる。

幾つかの実施態様では、非共有結合的な相互作用はポリペプチドリガンドの結合を仲介し、１０^−７Ｍ、１０^−８Ｍ又は１０^−９Ｍと同等かそれ以下の平行解離定数をともなう。

本発明の文脈における「エピトープ」とは、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン１又は４に関し、第１又は第２のポリペプチドによって結合される。

上記に開示されるエピトープの提示されたアミノ酸残基が、おおよそ２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％のポリペプチドリガンドと相互作用（例えば、水素結合、ファンデルワールス力及び非共有結合類似相互作用）するときは、上記の定義における文脈において、ポリペプチドリガンドはエピトープと部分的に相互作用すると考えられる。

同様に、全て又は少なくとも９５％の提示されたエピトープのアミノ酸残基がポリペプチドリガンドと相互作用するとき、ポリペプチドリガンドはエピトープと完全に相互作用する。

幾つかの実施態様は、本発明に関する二重特異性ＨＥＲ２標的剤が提供され、ただし、
ａ）第１のポリペプチドリガンドはアンキリン反復ポリペプチドであり、そして第２のポリペプチドリガンドは抗体、抗体断片、抗体可変領域ドメイン又は以下のａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔから選ばれる又は上記の実施態様で引用されポリペプチドリガンド、又は、
ｂ）第１のポリペプチドリガンドは抗体、抗体断片、抗体可変領域又は以下のａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔから選ばれる又は上記の実施態様に引用されるポリペプチドリガンド又は、第２のポリペプチドリガンドがアンキリン反復ポリペプチドを基にしたポリペプチドである。

幾つかの実施態様は、本発明に関する二重特異性ＨＥＲ２標的剤が提供され、ただし、
ａ）第１のポリペプチドリガンドは以下のａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、又はｔから選ばれるポリペプチドリガンド又は上記の実施態様において引用されるものであり、第２のポリペプチドリガンドは抗体、抗体断片、又は抗体の可変領域、又は、
ｂ）第１のポリペプチドリガンドは抗体、抗体断片又は抗体の可変領域であり、第２のポリペプチドリガンドは、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、又はｔから選ばれるポリペプチドリガンド又は上記の実施態様において引用される。

幾つかの実施態様では、リンカーの長さは６５オングストローム、６０オングストローム、５５オングストローム、５０オングストローム、４５オングストローム、４０オングストローム、３５オングストローム、３０オングストローム、２５オングストローム、２０オングストローム、１５オングストローム、１０オングストローム又は５オングストロームと同一又はそれ以下である。

幾つかの実施態様は、上記の側面又は実施態様に関する二重特異性ＨＥＲ２標的剤が提供され、ただし、
ａ）第１のポリペプチドリガンドはＤ１結合サイトを介してＨＥＲ２の細胞外ドメイン１と結合し、
ｂ）第２のポリペプチドリガンドはＤ４結合サイトを介してＨＥＲ２の細胞外ドメイン４と結合し、及び、
ｃ）リンカーは以下の空間に存在し、言い換えればＤ１結合サイト及びＤ４結合サイトの最大距離は８０オングストローム、７５オングストローム、７０オングストローム、６５オングストローム、６０オングストローム、５５オングストローム、５０オングストローム、４５オングストローム、４０オングストローム、３５オングストローム、３０オングストローム、２５オングストローム、２０オングストローム、１５オングストローム、１０オングストローム又は５オングストローム以下である。

幾つかの実施態様において、リンカーは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０のアミノ酸を含む。幾つかの実施態様において、リンカーとは１−１０、１−１５、１−２０、５−１５、５−１０、５−２０、又は５−２５アミノ酸を含む。

幾つかの実施態様において、リンカーはポリグリシン／セリンリンカーである。

「ポリグリシン／セリンリンカー」という用語は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％のグリシン及び／又はセリン残基を含むポリペプチドリンカーに関する。

幾つかの実施態様では、リンカーは（ＧＧＧＧＳ）_ｎというアミノ酸配列によって特徴づけられる。ｎは１、２、３、４又は５である。

幾つかの実施態様では、リンカーは配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３又は配列番号５４の配列を有する。

本発明の別の側面は、
ａ）ＨＥＲ２の細胞外ドメイン１に結合する第１のポリペプチドリガンド、
ｂ）ＨＥＲ２の細胞外ドメイン４に結合する第２のポリペプチドリガンド、及び、
ｃ）前記第１のポリペプチドリガンド及び前記第２のポリペプチドリガンドが前記第１のポリペプチドリガンド及び前記第２のポリペプチドリガンドと共通の構造要素で共有結合的に結合している
二重特異性ＨＥＲ２標的剤が提供される。

言い換えれば、弾力性のあるリンカーを持たない場合、第１又は第２のリガンドはペプチドの二次構造による結合モチーフによって定義される結合配列体によって厳格に結合している。前記結合配列体とは両リガンドで共通の、又は共有の、この例に限定されないがアルファへリックスなどのことである。

幾つかの実施態様は、リンカーは第１のポリペプチドリガンドのＣ末端と第２のポリペプチドのリガンドのＮ末端によって形成されているか、又は第２のポリペプチドリガンドのＣ末端と第１のポリペプチドリガンドのＮ末端によって形成されている。

幾つかの実施態様は、リンカーは二次構造エレメントを含む、又は該配列であり、第１のポリペプチドリガンド及び第２のポリペプチドリガンドによって共有されている。幾つかの実施態様では、第１のポリペプチドリガンドと第２のポリペプチドリガンドを結合する共有した構造要素はアルファへリックスであり、言い換えれば、同アルファへリックス二次構造モチーフは、第１のポリペプチドリガンド及び第２のポリペプチドリガンドによって共有される。

幾つかの実施態様は、第１のポリペプチドリガンドがポリペプチドに基づいたアンキリン反復型ポリペプチドであり、例えば米国特許出願公開第２０１２０１４２６１１号明細書に示されるＤＡＲＰｉｎであり、そして第２のポリペプチドもアンキリン反復型ポリペプチド又はＤＡＲＰｉｎである。そして該第１のポリペプチドリガンドのＣ末端のアルファへリックス及び該第２のポリペプチドリガンドのＮ末端のアルファへリックスが共有アルファへリックス構造をともに形成し、該第１のポリペプチドリガンド及び該第２のポリペプチドリガンドを結合させている。また該第２のポリペプチドリガンドのＣ末端のアルファへリックス及び該第１のポリペプチドリガンドのＮ末端のアルファへリックスが共有アルファへリックス構造をともに形成し、第１のポリペプチドリガンド及び第２のポリペプチドリガンドを結合させている。

幾つかの実施態様において、本発明に関する二重特異性ＨＥＲ２標的剤が提供され、該二重特異性ＨＥＲ２標的剤はＡＵ５６５（ＡＵ−５６５も同様、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２３５１）、ＢＴ４７４（ＢＴ−４７４も同様、ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−２０）、ＨＣＣ１１４９（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２３２６）、ＨＣＣ２２１８（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２３４３）、ＳｋＢｒ３（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−３０）及び／又はＺＲ７５３０（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５０４）を含む群から選択される培養癌細胞の生存率の著しい減少を導く。上記の比較における生存率の著しい減少は、トラスツズマブの同様の処理との比較に関する。

本明細書の文脈における生存率とは、細胞が恒常性を維持できる能力に関する。細胞の生存率は、特に、分光器を用いてホルマザン色素の濃度を測定することで決定される。前記ホルマザン色素は、ＭＴＴ（３−（４、５−ジメチル−２−チアゾリル）−２、５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロマイド）又はＸＴＴ（２、３−ビス−（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５−カルボキサニリド）などのテトラゾリウム塩の還元中に形成される。該ＭＴＴ又は該ＸＴＴは生存細胞における脱水素酵素又は還元酵素によって触媒反応が引き起こされる。

本発明の二重特異性剤の効果は、前段落で述べたように癌細胞の生存率を減少させ、癌の治療に有効な手段である。

細胞生存率の減少は細胞増殖の抑制、細胞数の減少、細胞のタンパク質内容物の減少、細胞の代謝活性の減少、又は細胞のアポトーシス誘導をともなっておこる。

幾つかの実施態様では、本発明に関する二重特異性ＨＥＲ２標的剤が提供され、該二重特異性ＨＥＲ２標的剤をＡＵ５６５細胞株とともにインキュベートすると、ウェスタンブロットにおいて、ＨＥＲ２−Ｙ１２４８、ＨＥＲ３−Ｙ１２８９、ＡＫＴ−Ｓ４７３、ＥＲＫ１／２−Ｔ２０２／Ｙ２０４及び／又は、ＰＡＲＰのシグナルの低下を導く。

幾つかの実施態様では、本発明に関する二重特異性ＨＥＲ２標的剤が提供され、該二重特異性ＨＥＲ２標的剤をＨＣＣ１４１９細胞とともにインキュベートすると、ウェスタンブロットにおいて、ＨＥＲ２−Ｙ１２４８、ＨＥＲ３−Ｙ１２８９、ＡＫＴ−Ｓ４７３、及び／又はＥＲＫ１／２−Ｔ２０２／Ｙ２０４のシグナルの低下を導く。

幾つかの実施態様では、本発明に関する二重特異性ＨＥＲ２標的剤が提供され、該二重特異性ＨＥＲ２標的剤をＨＣＣ２２１８細胞株とともにインキュベートすると、ウェスタンブロットにおいて、ＨＥＲ２−Ｙ１２４８、ＨＥＲ３−Ｙ１２８９、ＡＫＴ−Ｓ４７３、及び／又はＥＲＫ１／２−Ｔ２０２／Ｙ２０４のシグナルを減少させる。

幾つかの実施態様では、本発明に関する二重特異性ＨＥＲ２標的剤が提供され、該二重特異性ＨＥＲ２標的剤をＺＲ７５３０細胞株とともにインキュベートすると、ウェスタンブロットにおいて、ＨＥＲ２−Ｙ１２４８、ＨＥＲ３−Ｙ１２８９、ＡＫＴ−Ｓ４７３、ＥＲＫ１／２−Ｔ２０２／Ｙ２０４及び／又は、ＰＡＲＰのシグナルを減少させる。

本明細書の文脈における「ＨＥＲ２−Ｙ１２４８」という用語は、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＮＰ＿００４４３９．２）に関し、該ヒト上皮増殖因子受容体２のチロシン１２４８残基はリン酸化されている。

本明細書の文脈における「ＨＥＲ３−Ｙ１２８９」という用語は、ヒト上皮増殖因子受容体３（ＮＰ＿００１００５９１５．１）に関し、該ヒト上皮増殖因子受容体３のチロシン１２８９残基はリン酸化されている。

本明細書の文脈における「ＡＫＴ−Ｓ４７３」という用語は、タンパク質キナーゼＢ（ＵｎｉＰｒｏｔ．ＮｏＰ３１７４９）に関し、該タンパク質キナーゼＢのセリン残基４７３はリン酸化されている。

本明細書の文脈における「ＥＲＫ１／２−Ｔ２０２／Ｙ２０４」という用語は、マイトジェン活性タンパク質キナーゼ３（ＮＰ＿００１０３５１４５．１）及びマイトジェン活性タンパク質キナーゼ１（ＮＰ＿００２７３６．３）に関し、該マイトジェン活性タンパク質キナーゼ３のチロシン２０４残基はリン酸化されており、該マイトジェン活性タンパク質キナーゼ１のチロシン２０２残基はリン酸化されている。

本明細書の文脈における「ＰＡＲＰ」という用語は、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ１（ＵｎｉＰｒｏｔ．Ｎｏ．Ｐ０９８７４）に関する。

ウェスタンブロットを用いたシグナルの減少は、示唆されたタンパク質の減少量に関し、該タンパク質は吸着膜に固定、染色された。

上記で述べたシグナルの減少例は、本発明である前記剤の使用に起因するものであり、実施例１に示されている。

幾つかの実施態様では、本発明に関する二重特異性ＨＥＲ２標的剤が提供され、該二重特異性ＨＥＲ２標的剤はＢＴ４７４細胞を少なくとも４０％、ＡＵ５６５細胞においては８％、ＨＣＣ１４１９細胞においては２０％及び／又はＨＣＣ２２１８細胞においては２０％アポトーシスを誘導する。該アポトーシスは、該二重特異性ＨＥＲ２標的剤と該細胞をともにインキュベートしたときに誘導される。

本発明の別の側面は、二重特異性ＨＥＲ２標的剤が提供され、
配列番号０３、配列番号０４、配列番号０５、配列番号０６、配列番号０７、配列番号０８、配列番号０９、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９及び配列番号１１０から選択される配列によって特徴づけられる該二重特異性ＨＥＲ２標的剤である。

本発明の他の側面によれば、本発明の上記のいかなる側面又は実施態様に関する、二重特異性ＨＥＲ２標的剤は悪性腫瘍の予防又は治療に利用されるために提供される。

本発明の他の側面によれば、本発明の上記のいかなる側面又は実施態様に関する、二重特異性ＨＥＲ２標的剤は悪性腫瘍疾患の予防又は治療に利用されるために提供される。該疾患とはＨＥＲ２を過剰発現した細胞によって特徴づけられる。

ＨＥＲ２を過剰発現した細胞によって特徴づけられる疾患又はＨＥＲ２陽性疾患は、本明細書の文脈において患者由来のサンプル中に、高レベルのＨＥＲ２（タンパク質）発現が、免疫組織化学法、ＦＡＣＳなどのフローサイトメトリー法によって検出されるかどうか、又は例えばＨＥＲ２の遺伝子コピー数が腫瘍細胞につき４コピーを超えるといった、ＨＥＲ２遺伝子増殖が認められるか、又はこれらの方法を組み合わせることで特徴づけられるかどうかによって定義される。このような疾患の例として、乳癌がよく挙げられる。該疾患においては、乳組織生検又は乳組織の摘出部若しくは転移した組織においてＨＥＲ２を過剰発現した細胞が得られる。ＨＥＲ２の過剰発現及び遺伝子増幅を検出する上で、頻繁に適用される方法の１つは蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）における遺伝子レベルでの増幅であり、米国特許出願公開第２００３／０１５２９８７号明細書にも述べられている。

幾つかの実施態様によれば、ＨＥＲ２を過剰発現した細胞は、少なくとも２、４、６、８、１０、１５、２０又は２５コピーのＨＥＲ２遺伝子（ＥＲＢＢ２遺伝子、遺伝子番号２０６４）を核内に有することで特徴づけられている。該ＨＥＲ遺伝子増殖はＦＩＳＨ（蛍光インサイチュハイブリダイゼーション）測定する。

１つの実施態様として、ＨＥＲ２遺伝子のコピー数は蛍光インサイチュハイブリダイゼーションで測定する。

１つの実施態様として、ＨＥＲ２を過剰発現した細胞は、核内において蛍光インサイチュハイブリダイゼーションによる少なくとも２、４、６、８、１０、１５、２０又は２５倍のシグナルによって特徴づけられる。

さらに本発明の別の側面は、悪性腫瘍を患っている患者を治療するための方法が提供され、該方法は本発明のいかなる上記の特定の側面又は実施態様に関する二重特異性剤を該患者に投薬することを含む。

幾つかの実施態様において、悪性腫瘍疾患とは、胃、子宮、唾液腺、肺、肝臓、小腸、甲状腺、膵臓又は膀胱における悪性腫瘍のことである。

二重特異性標的剤の抗腫瘍活性の原理
本発明の二重特異性剤は最小で３つのユニットから構築される。第１に、二重特異性結合剤は、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン（細胞外ドメイン）のドメイン１を標的とする結合ユニットを含む。第２に、二重特異性結合剤は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインのドメイン４を標的とする結合ユニットを含む。第３に、リンカーユニット又はリンカーを二重特異性結合剤はＨＥＲ２の標的ドメイン１及び４の間に有し、該リンカーユニット又はリンカーの適切な長さは両結合ユニットの性質に依存する。

幾つかの実施態様は、リンカー又はリンカーユニットがポリペプチドリンカーである。

幾つか実施態様は、リンカーはポリグリシン／セリンリンカーである。このようなリンカーは水溶性が高く、弾力性のあるフォールドを有し、加水分解に抵抗性があり、そしてランダムコイル又は延長構造に適応できるという利点がある。

幾つかの実施態様では、リンカーはＧＧＧＳ（Ｇ_４Ｓ）アミノ酸を含む短いリンカーである。１から４のＧ_４Ｓ反復を含む二重特異性コンストラクトは優れた抗腫瘍活性を示す。Ｇ_４Ｓ反復を５又はそれ以上含む二重特異性コンストラクトは、長いリンカー長をともない、抗腫瘍活性が減少する。他のアミノ酸組成を結合ユニットと接続するために使用してもよい。

幾つかの実施態様では、リンカー又はリンカーユニットは上記で述べたように足場に結合する弾力性のある部位を含むか、又は化学的なクロスリンカーであり、両結合ユニットはリンカーによって共有結合的に結合している。本明細書の文脈における化学的なクロスリンカーとは、本発明の第１又は第２のポリペプチドリガンドを共有結合的に結合することのできる化合物に関する。このような化学交差バインダーは、以下に限定されるものではないが、グルタルデハイド、ビススルフォスクシンイミジルスベリン酸、カルボジイミド、ビス（スクシンイミジル）ぺンタ（エチレングリコール）、ビス（スクシンイミジル）ノナ（エチレングリコール）、ビス（スクシンイミジル）スベリン酸、スベルイミノ酸ジメチル、化学式（−ＣＨ_２ＯＨ−ＣＨ_２ＯＨ−）_ｎによって特徴づけられるエチレングリコール、ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５、及び１つ又は２つのターミナルエチレングリコールがスクシンミド又はメラミド群、Ｎ−（Ｋ−マレイミドウンデカノイルオキシ）スルフォスクシンイミドエステル、スルフォスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート、１，８−ビスマレイミドジエチレングリコール及び１，１１−ビスマレイミドトリエチレングリコールによって置換されているものに関する。

幾つかの実施態様として、リンカー又はリンカーユニットは二量体化ドメイン又は付随機能ユニットであり、ＨＥＲ２の両エピトープに結合し両バインダーユニットの二量体化を引き起こす。または、該エピトープは、言い換えれば複数の二量体化ドメインである。

本明細書の文脈における二量体化ドメインは２つのポリペプチドを含む機能的ユニットに関し、それらは互いが特異的に結合すること又は二量体化を可能にする。２つのポリペプチドは同ポリペプチドの一部であってもよい。このような二量体ドメインの非限定的な例は、ＧＣＮ４（ＵｎｉＰｒｏｔ．Ｎｏ．Ｐ０３０６９）等にあるロイシンジッパードメイン、へリックス−へリックスドメイン、ベータシートを含む二量体化ドメイン、ｃ−Ｊｕｎ（Ｕｎｉｐｒｏｔ．Ｎｏ．Ｐ０５４１２）等のコイルドコイルへリックス又はｃ−Ｆｏｓ（Ｕｎｉｐｒｏｔ．ＮｏＰ０１１００）、ミップタンパク質の二量体化ドメイン等におけるヘリックスバンドル（Ｕｎｉｐｒｏｔ．ＮｏＱ７０ＹＩ１）、抑制タンパク質ｃｌ（Ｕｎｉｐｒｏｔ．Ｎｏ．Ｐ０３０３４）等にあるへリックス−ターン−へリックスモチーフ及び抗体Ｆｃ部位である。

上記にあるようなリンカーユニットは、二重特異性標的剤の抗腫瘍活性を決定することができる。本明細書に例示される単結合ユニットは単剤としては抗腫瘍活性は全くないか又はわずかである。

幾つかの実施態様によれば、他の組成のリンカーは、前記結合ドメインを標的細胞におけるアポトーシスへと誘導する配列へ運ぶという条件で、利用される。このことは本明細書に記載の方法で分析することができる。

特定の実施態様によれば、ＤＡＲＰｉｎ融合体の構築物であるバインダーＡ−ＦＬ−バインダーＢ（ＦＬは「弾力性のあるリンカー」を意味し、例えば（Ｇ_４Ｓ）_ｎによって特徴づけられるリンカーであり、ｎは１から５である）が提供され、それは強い抗腫瘍活性を示す（８０−９０％まで癌細胞増殖を減少させる）。本文において、「バインダーＡ」はＨＥＲ２のサブドメイン１における前記エピトープと結合するＤＡＲＰｉｎであることができ、又は重複するエピトープに結合する他のいずれかのタンパク質であり得る。その一方で「バインダーＢ」はＨＥＲ２のサブドメイン４におけるエピトープと結合するＤＡＲＰｉｎであることができ、又は重複するエピトープに結合する他のいかなるタンパク質であり得る。ＦＬは弾力性のあるリンカーに関する。バインダーＡの例として、サブドメイン１（配列番号０１）に結合するＤＡＲＰｉｎ９．２９（「９＿２９」は配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号６１又は配列番号６２としても参照される）又はＤＡＲＰｉｎ９．２６（「９＿２６」は配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号６３又は配列番号６４としても参照される）であり、その一方でバインダーＢの例としてサブドメイン４（配列番号０２）に結合するＤＡＲＰｉｎＧ３（配列番号２５）又はＨ１４（配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８又は配列番号２９）である。この例において、「ＦＬ」とは（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）_ｎで構築されるリンカーであり、ｎは１、２、３又は４である。

本明細書における「弾力性のあるリンカー」という用語は、第１のポリペプチドリガンドと第２のポリペプチドリガンドを結合するポリペプチドに関し、ランダムコイル構造又は延長構造によって特徴づけられる。弾力性のあるリンカーとは、さらにへリックス又はベータシートなどの二次構造を含まないか、又は最大１０％、２０％、３０％。又は４０％の二次構造を含むことができる。

本明細書の文脈における「重複するエピトープ」とは、特定のエピトープと部分的に同一なエピトープである。

幾つかの実施態様において、最も好ましいエピトープのバインダーは、以前示したディスプレイ法を用いて構築される（ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、又はイーストディスプレイ）。ＤＡＲＰｉｎ９２６、９２９又はＧ３は、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２５、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、及び配列番号６４に示される配列であり、競合体として使用することができる。それらの遺伝子は合成することができ、Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６９、１０１５−１０２８に示された方法で発現、精製することができる。リボソームディスプレイ又はファージディスプレイから選ばれたＨＥＲ２ドメインのバインダーの集合を、磁気ビーズ上又はマイクロタイタープレート中に固相化させ、ＤＡＲＰｉｎと競合させるために曝し、バインダーを優先的に溶出する。該バインダーは同じエピトープを示す。

ひとつの実施態様として、本発明によって構築される１つの二重特異性分子の結合様式は分子間である。二重特異性剤におけるリンカーユニットは結合様式を決定する。より詳細には、リンカーの長さ及びリンカーの結合部位における結合ドメインの方向性が、二重特異性分子が分子間様式結合、言い換えれば２つのＨＥＲ２分子の結合をするかどうかに影響する。それゆえ、細胞上の結合では、二重特異性剤はＨＥＲ２受容体分子のドメイン１及び他のＨＥＲ２受容体分子のドメイン４に結合する。

幾つかの実施態様において、両エピトープ間の結合は、結合ユニットである特異的活性化型二重特異性コンストラクトによって結合され、短いリンカーによって架橋される（５つのアミノ酸又はおおよそ１５オングストローム）。

ＨＥＲ２の細胞外ドメイン全体構造（ＰＤＢＩＤ：１Ｎ８Ｚ）（Ｃｈｏ ＨＳ、ｅｔ ａｌ．（２００３）、Ｎａｔｕｒｅ４２１：７５６−７６０）において、ドメイン１のエピトープ及びドメイン４のエピトープの距離は少なくとも８０オングストロームであり、それゆえ二重特異性分子が内部分子様式でＨＥＲ２の該構造と結合することは不可能である（例えば、ドメイン１の結合部位とドメイン４の結合部位は同じＨＥＲ２分子のドメイン１及び４に結合できない）。

ＨＥＲ２受容体のドメイン４はＨＥＲ２受容体の膜貫通へリックスと接近しており、それゆえその動作自由度により制限される。ドメイン１、２及び３はドメイン４と弾力性のあるヒンジによって結合する。他のＥＧＦＲ受容体として知られるドメイン１、２及び４はそれらのリガンド結合における相対的な方向性を変えることができる。他のＥＧＦＲ受容体の構造変化は、ドメイン２及び４が直接結合しており、ドメイン１及び３が離れている（テザー構造）状態から、ドメイン２及び４が離れ、ドメイン１及び３がそれぞれのリガンドを介して結合している状態への変化を引き起こす。（Ｍａｒｋ Ａ．Ｌｅｍｍｏｎ、Ｌｉｇａｎｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＥｒｂＢ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３１５（４）、２００９、Ｐａｇｅｓ６３８−６６４）。しかしながら、テザー構造においても、ドメイン１及び４の距離は広すぎるので、１５オングストロームのリンカーで適用性がない。さらには、テザー構造はＨＥＲ２には存在しないと考えられているが、それはドメイン４結合部位にアミノ酸安定性がない（例えばＨＥＲ３のＧ５６３及びＨ５６５がＰ及びＦによって置き換えられている）などの幾つかの発見やＨＥＲ２の結晶構造などの知見に起因している（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．、２００３Ｎａｔｕｒｅ４２１：７５６−７６０）。

それゆえ、いかなる理論に拘束されることを望むものではないが、立体構造は本発明である二重特異性剤によって誘導又は安定化されると仮定される。この立体構造とは、以下の安定化した不活性型ＨＥＲ２相同二量体立体構造に関する。これらのＨＥＲ２の安定型不活性相同二量体は広いＨＥＲ２−ＨＥＲ２相互作用ユニットの文脈においても存在し、該相互作用は例えば三量体、四量体又はＨＥＲ２クラスターなどである。ここで示される例は、本発明の特定の実施態様において、ＨＥＲ２の細胞内部位におけるリン酸化テールの重要なチロシン残基及びキナーゼドメインは二重特異性標的剤の処理により脱リン酸化されるが、その一方で総ＨＥＲ２レベルは癌細胞において完全に一定なので、アポトーシスを引き起こすことはない。

特定の実施態様において、本発明において公表される二重特異性標的剤による不活性型ＨＥＲ２相同二量体の安定化は、他のＨＥＲ２相互作用を結果として抑制する。該相互作用は、例えばＨＥＲ３との相互作用である。ＨＥＲ２及びＨＥＲ３受容体の異性二量体の形成は強烈に癌化、抗アポトーシスシグナルを引き起こす。ＨＥＲ２のリン酸化及びＨＥＲ３のリン酸化を抑制した結果、その下流経路のＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ及びＭＡＰＫ−ＥＲＫ、そして他の可能性のある経路も持続的に不活性化され、負に制御される。両経路がある程度負に制御されると、ＢＩＭなどの癌細胞で高く発現している原癌タンパク質も負に制御され、カスパーゼなどが活性化され、最終的にアポトーシスが引き起こされる。

発明の描写：活性型二重特異性分子の構築基準
ＤＡＲＰｉｎ９．２６又は９．２９とＤＡＲＰｉｎＧ３又はＨ１４との短い弾力性のあるリンカーによる結合に関する例が提供される一方で、当業者は本明細書によって提供された情報を照らして、該ＤＡＲＰｉｎのいずれか又は両方を第１のドメイン又は第４のドメインそれぞれの重複するエピトープに結合する他の足場、Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖ断片又は抗体断片によって置き換えることができる。結合タンパク質の方向性が構造モデル又は実験的な構造決定から知られていない場合、本明細書に提示される情報を考慮し、両結合体（バインダーＡ−ＦＬ−バインダーＢ及びバインダーＡ−ＦＬ−バインダーＢ）が構築され、試される。二重特異性標的剤の構造原理からして、当業者であれば結合や結合ユニットによる構築部位を置き換えることができる。

二重特異性ＨＥＲ２標的化
本発明はＨＥＲ２特異的分子クロスリンカーが、ＨＥＲ２の二量体化を抑制することなくＨＥＲ２相同二量体を不活性化させる機能を有する結合分子を基にしている。したがって、本発明の標的分子の活性化機構はこれまで述べてきたＨＥＲ２指向性治療とは根本的に異なる。本発明の前記剤はＨＥＲ２の相同二量体化を誘導し、これまで述べてきた方法で結合させることでシグナル不活性化を引き起こす。本明細書に示される例はＨＥＲ２の細胞内部位の重要なチロシン残基の脱リン酸化を示している。それゆえ、ＨＥＲ２の相同二量体化はＭＡＰＫ経路を介した下流シグナルを強力に減少させるが、そのことはＭＡＰ−キナーゼ細胞外シグナル制御Ｅｒｋ１及び２（Ｅｒｋ１／２）の脱リン酸化により直接示されている。

さらに、これらの不活性化ＨＥＲ２相同二量体は、幾つかの実施態様によれば、他のＥＧＦ受容体ファミリーと相互作用することができず、最も重要なことにＨＥＲ３とも結合することができない。ＨＥＲ２−ＨＥＲ３の相互作用とそれにともなうフォスファチジルイノシトール３キナーゼタンパク質キナーゼＢ（ＰＩ３Ｋ−ＰＫＢ、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴとも呼ばれる）シグナルパスウェイは、ＨＥＲ２過剰発現癌細胞において細胞増殖を促進し、アポトーシスを抑制することが知られている。

さらに他の実施態様において、不活性化ＨＥＲ２相同二量体の安定化によるＨＥＲ２−ＨＥＲ３相互作用を防ぐことで、下流経路ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴも抑制されている。それゆえ、ＡＫＴの脱リン酸化は本発明の分子を応用した結果を示している。前記両経路の同時抑制は、トラスツズマブ又はペルツズマブ単独又は両方の作用や刺激又は、さらに他の実施態様であるＢｃｌ−２様タンパク質１１（ＢＩＭ）発現によって達成される効果よりも高い効果がある。

ＢＩＭの発現は、主にショートアイソフォームのＢＩＭであるが、特定の実施態様によれば、最終的に細胞固有のアポトーシスプログラムを引き起こす。これまで示されてきた様に、二重特異性標的剤の作用機序は既知の分子形式の作用の組み合わせではなく、集合体に起因するので、単結合剤それ自体に抗腫瘍活性がある必要はない。しかしながら、望ましい幾何学的な配置の、優先的な分子間様式における、本明細書で開示された両エピトープの結合が、効果のある抗腫瘍活性剤を作り出す。

本明細書ではＨＥＲ２の標的分子によって結合されるであろう２つのエピトープが開示され、該結合はＨＥＲ２の細胞外ドメインの単アミノ酸レベルである。このことはそれぞれのタンパク質及びＨＥＲ２の複合体の複数の結晶構造に由来している。さらに、このような二重特異性分子の構築計画があれば、当業者は前記分子などを容易に構築することができる。

特定の実施態様によれば、分子構造は二重特異性結合分子なので、トラスツズマブ及びペルツズマブに対して優れた抗腫瘍活性を示し、ＨＥＲ２依存的癌細胞にアポトーシスを引き起こす。この二重特異性結合分子は、特定の実施態様において、毒性、半減期を伸ばす群又は他の機能を有する部位と結合すればより改善することができる。

本発明は典型的に、二重特異性結合分子として示され、設計されたアンキリン反復タンパク質によって構築される（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔ．Ｂｉｏ．Ｔｅｃｈ．２２５７５−５８２；米国特許出願公開第２０１２０１４２６１１号明細書−２０１２−０６−０７）。しかし本明細書において、分子内におけるＤＡＲＰｉｎの特異的な機能は存在せず、したがって、ＤＡＲＰｉｎは他の結合タンパク質によって代替され、該タンパク質は同じエピトープを並列させることに役立つので、２つのＨＥＲ２分子を細胞表面上の類似した不活性配位へと運ぶ。

本発明の前記剤と前記手段は、同じエピトープに結合する公知の他の方法又は試薬の組み合わせとは異なっている。ＩｇＧを単価結合剤へと変えると（例えばＦａｂ断片又はｓｃＦｖ断片を構築する方法によって）抗腫瘍活性はほとんど又は完全に消失する。本明細書における結果は、４Ｄ５のｓｃＦｖは、培養細胞において全長の抗体の活性として、おおよそ２０％の抗腫瘍活性しか有さないことを示している（ＡＤＣＣなどの二次効果のないもので測定、図８）。

重要なことに、それゆえ、二重特異性剤は結合ユニットを含み、該結合ユニットはＨＥＲ２の細胞外ドメインのドメイン１及びＨＥＲ２の細胞外ドメインのドメイン４に結合するが、該二重特異性剤はそれぞれの抗体が有する作用機序の組合わせではなく、本発明に関する新しい分子実体である。

代替可能な単一切り離し可能構造体であればどこであっても、例えば第１のリガンド、第２のリガンド、結合エピトープ、足場バインダー、リンカー部分又は化学構築リンカーを本明細書において「実施態様」とした。この代替可能部は本明細書において示された発明の個々の実施態様を形成するために自由に組み合わせることができると理解される。したがって、ドメイン１のエピトープの代替可能な実施態様をドメイン４のエピトープの代替可能な実施態様と組み合わせることができ、それらの組み合わせは本明細書で示されたいかなるリンカーと組み合わせることができるであろう。

本発明は、以下の実施例と図によってより詳細に示され、そこにはさらなる実施態様と利点が記述されている。これらの実施例は発明を記述するが、いかなる制限を設けるものではない。

本明細書において引用されたいかなる米国特許又は米国特許の適用は参考文献として本明細書中に組み込まれるものとする。

（実施例１）トラスツズマブ及びペルツズマブと比較した、二重特異性抗ＨＥＲ２結合剤の抗腫瘍活性

ＨＥＲ２を強制発現させた癌細胞株群を用いて、ＸＴＴ細胞増殖測定を９６ウェル組織培養プレート中で行った（図１）。規定した数の細胞を１０％胎児子牛血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて播種した。癌細胞を１００ｎＭの抗ＨＥＲ２剤及びコントロールを用いて４日間処理した。測定点にて３回記録を行った。ＸＴＴ細胞生存測定は、製造業者のプロトコールに従って進めた。１００ｎＭの濃度で、全ての抗ＨＥＲ２剤は最大の抗腫瘍活性を示した（力価は示していない）。三回のデータの平均を標準誤差とともに示した。データはそれぞれのプレートのネガティブコントロールに対して標準化した。該ネガティブコントロールは、未処理の細胞に相当する（最大増殖）。二重特異性標的剤はＨＥＲ２依存的癌細胞の細胞増殖を６０−８０％まで減少させた。その一方で、トラスツズマブ（ｈｕ４Ｄ５）は細胞増殖をわずか２０−６０％まで減少させた。二重特異性標的剤（９２６−ＦＬ−Ｇ３、９２９−ＦＬ−Ｈ１４）は、全ての細胞株に恒常的に強力な抗腫瘍活性を示した。その一方で、幾つかの細胞株はトラスツズマブ処理に対して抵抗性を示した。感受性の高い細胞株を、ＨＥＲ２依存性（例えばＨＥＲ２過剰発現）であり、いかなるＰＩ３Ｋ活性変異も欠失していると大まかに定義し得る。

図２は、二重特異性標的剤がＳ期への移行を阻害し、Ｇ_０／１期の蓄積を誘導することを示している。ＢＴ４７４細胞をＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地内で処理する１６時間前に播種した。抗ＨＥＲ２剤を最終濃度が１００ｎＭとなるように処理し、細胞を３日間処理した。その後、細胞を７０％エタノール中で固定し、プロピジウムイオダイド（ＰＩ）を用いて染色した。ＦＡＣＳ測定では、前方散乱光対側方散乱光プロットにおいて細胞破片を排除するためにゲートを設け、１０^４個のイベントを記録した。ＰＩ蛍光ヒストグラムをＦｌｏｗＪｏ７．２．５ソフトウェアを用いて測定し、細胞周期分布をＤｅａｎ−Ｊｅｔｔ−Ｆｏｘアルゴリズムを用いて適合させた。該アルゴリズムはアポトーシス性サブＧ_１集団の細胞を排除する。二重特異性標的剤（９２６−ＦＬ−Ｇ３、９２９−ＦＬ−Ｈ１４）を用いた処理は、ＨＥＲ２依存的癌細胞におけるＳ期及びＧ_２／Ｍ期の含有量を減少させた。トラスツズマブ（ｈｕ４Ｄ５）の処理は、感受的ＨＥＲ２依存的癌細胞株がＳ期へと移行することを阻害することで、細胞周期停止を引き起こすことが示された。ここで、二重特異性標的剤はトラスツズマブ感受性細胞株の細胞周期停止も引き起こすことが示される。

ターミナルトランスフェラーゼｄＵＴＰニックエンド標識（ＴＵＮＥＬ）測定及びフローサイトメトリーによる定量は、抗ＨＥＲ２剤で処理したアポトーシス性細胞の割合を測定するために使われた（図３）。癌細胞をＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地内で処理する１６時間前に播種した。抗ＨＥＲ２剤（ペルツズマブ：ｈｕ２Ｃ４、トラスツズマブ：ｈｕ４Ｄ５、二重特異性標的剤：９２６−ＦＬ−Ｇ３、９２９−ＦＬ−Ｈ１４、ｍｏｃｋ処理：Ｏｆｆ７−ＦＬ−Ｏｆｆ７）を最終濃度が１００ｎＭになるよう処理し、細胞を３日間処理した。接着系及び非接着系の細胞画分を回収した。細胞を２％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％トライトンＸ−１００を含む０．１％冷クエン酸ナトリウムで２分浸透し、冷ＰＢＳで３回洗浄し、フルオレセインがコンジュゲートしたｄＵＴＰで標識化した。ＦＡＣＳ測定では、前方散乱光対側方散乱光プロットにおいて細胞破片を排除するためにゲートを設け、１０^４個のイベントを記録した。測定は１つのパラメーターであるＦＬ１ヒストグラムプロットとして描いた（Ｘ軸にＦＩＴＣ蛍光を、Ｙ軸に数を示す）。ＴＵＮＥＬ陽性細胞の集団（ＦＬ１が高くなる方へ移動する）を、ＴＵＮＥＬ陰性細胞（自家蛍光）を除いた一次元の特異的なゲートで定量した。ゲートは自家蛍光細胞を除くためにネガティブコントロールを用いて決定した。二重特異性標的剤を用いた処理は、ＨＥＲ２依存的癌細胞にアポトーシスの特徴であるＤＮＡ分解を引き起こす。細胞周期解析の結果から、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の数はサブＧ_１集団の形成と相関する（データは示されていない）。本定量により、ＨＥＲ２依存的癌細胞において、トラスツズマブ又はペルツズマブに比べ、二重特異性結合剤はＴＵＮＥＬシグナルが３０〜８０倍高いことを示す。

ＨＥＲ２／ＨＥＲ３シグナル経路、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ及びＭＡＰＫ回路、細胞周期及びアポトーシスの下流の標的に対するウェスタンブロット解析を行うために、癌細胞を１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地内で処理する２４時間前に播種した。抗ＨＥＲ２剤を終濃度１００ｎＭとなるよう処理し、細胞を３日間処理した。その後、アポトーシス性非接着細胞画分を集めて、遠心をして分離した。残りの接着細胞を冷ＰＢＳで洗い、氷上でＰＢＳ＿Ｉ（プロテアーゼ阻害剤（ペファブロック、ロイペプチン、ぺプスタチン、マリマスタット）及びリン酸化阻害剤（オルトバナジン酸ナトリウム、メタバナジン酸ナトリウム、モリブデン酸ナトリウム、βグリセロールリン酸、フッ化ナトリウムを含むＰＢＳ））の中へ掻き出した。両細胞画分を集め、ＰＢＳ＿Ｉ中で洗った。その後細胞を１％トライトンＸ−１００を含むＰＢＳ＿Ｉ中で３０分４℃でロッカー上で溶解させ、そして細胞ライセートを２０，０００ｇで２０分４℃で遠心した。それぞれの細胞ライセート中のタンパク質濃度をＢＣＡ測定で決定し、そして完全に還元させるために、サンプルをβメルカプトエタノールを含むドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）の中へと加えた。サンプルを８０℃で５分加熱した。サンプルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードし、その後バイオラッドのプロトコールに従い、ＰＶＤＦ−ＦＬ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。一次抗体とともにインキュベートした後、ウェスタンブロット（図４）を赤外線染色剤でラベルされた二次抗体を用いて染色し、膜をオデッセイＩＲ−蛍光スキャニングシステム（ＬＩＣＯＲ）でスキャンした。一次抗体は、以下のものを用いた。ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、リン酸化チロシン１２４８ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２−Ｙ１２４８）、ヒト上皮増殖因子受容体３（ＨＥＲ３）、リン酸化チロシン１２８９ヒト上皮増殖因子受容体３（ＨＥＲ３−Ｙ１２８９）、タンパク質キナーゼＢ（ＡＫＴ）、リン酸化セリン４７３タンパク質キナーゼＢ（ＡＫＴ−Ｓ４７３）、ｐ４４／４２ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）、リン酸化チロシン２０２／チロシン２０４ ｐ４４／４２ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２−Ｔ２０２／Ｙ２０４）、サイクリン依存キナーゼ阻害１Ｂ（ｐ２７ＫＩＰ１）、サイクリンＤ１（サイクリンＤ１）、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）、Ｂｃｌ−２細胞死インタラクティングメディエーター（ＢＩＭ）、グリセルアルデヒドー３ーリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）。

タイムコース処理をした定量的ウェスタンブロット解析のために、ＢＴ４７４細胞を１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地内で処理する２４時間前に播種した。抗ＨＥＲ２剤を１００ｎＭの濃度で処理し、細胞を３日間処理した。その後、緩く接着した細胞画分のみを冷ＰＢＳで洗い流した。接着細胞を氷上でＰＢＳ＿Ｉ（プロテアーゼ阻害剤（ペファブロック、ロイペプチン、ぺプスタチン、マリマスタット）及びリン酸化阻害剤（オルトバナジン酸ナトリウム、メタバナジン酸ナトリウム、モリブデン酸ナトリウム、βグリセロールリン酸、フッ化ナトリウムを含むＰＢＳ））中へ掻き出した。その後、細胞を１％トライトンＸ−１００を含むＰＢＳ＿Ｉ中でロッカー上で３０分４℃で振とうさせて溶解させ、細胞ライセートを２０，０００ｇで２０分４℃で遠心した。それぞれの細胞ライセート中のタンパク質濃度をＢＣＡ測定で決定した。ＨＥＲ２受容体を９０１−ＦＬ−ｚＨＥＲ２を用いて免疫沈降した。該９０１−ＦＬ−ｚＨＥＲ２はＤＡＲＰｉｎ−アフィボディー融合コンストラクトであり、バイオサポートウルトラリンクビーズに結合している。ＨＥＲ２受容体をＢＴ４７４細胞ライセートから濃縮した（ライセイート中において１ｍｇ相当のタンパク質）。ビーズを冷ＰＢＳ＿Ｉで３回洗った。ＨＥＲ２受容体を８０℃で５分ドデシル硫酸リチウム中で加熱し、ビーズから溶出した。該ドデシル硫酸リチウムは前記ＨＥＲ２受容体を完全に還元させるためのβメルカプトエタノールを含んでいる。ＨＥＲ３サンプルを、８０℃で５分ドデシル硫酸リチウム中で加熱した。該ドデシル硫酸リチウムは前記ＨＥＲ２受容体を完全に還元させるためのβメルカプトエタノールを含んでいる。サンプルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードし、その後バイオラッドのプロトコールに従いＰＶＤＦ−ＦＬ膜に転写した。ウェスタンブロットを赤外線染色剤でラベルされた二次抗体を用いて染色し、膜をオデッセイＩＲ−蛍光スキャニングシステム（ＬＩＣＯＲ）でスキャンした。

すべてのＨＥＲ２依存的癌細胞において、二重特異性剤はリン酸化ＨＥＲ２の量を恒常的に負に制限する。ＨＥＲ２のリン酸化の負の制御はＨＥＲ２の発現の負の制御と相関しており、アポトーシス性細胞画分で観察される（図４）。ＨＥＲ２の恒常的な発現レベルは、例えばＢＴ４７４及びＳｋＢｒ３等の接着系細胞画分で観察される。その一方で、それらの細胞ではリン酸化ＨＥＲ２レベルは強く抑制されている（図５）。それなので、ＨＥＲ２の発現の負の制限がＨＥＲ２依存的癌細胞のアポトーシス性画分で観察されるが、それはアポトーシスの誘導する原因となるものではないだろう。むしろ、リン酸化ＨＥＲ２の負の制限と同時のリン酸化ＨＥＲ３の減少が、アポトーシスを誘導する原因となるだろう。リン酸化ＨＥＲ３の負の制御は、二重特異性標的剤及びトラスツズマブをともに処理した後で観察される。二重特異性標的剤はトラスツズマブよりも強力にリン酸化ＨＥＲ３を負に制御する。二重特異性標的剤に処理した後は、ＨＥＲ３発現の正の制御が観察される。フィードバックループがリン酸化ＡＫＴの阻害を感知し、その結果としてＨＥＲ３の発現が正に制御されたことが提案されている。二重特異性標的剤はリン酸化ＡＫＴ（ＨＥＲ３の下流）とリン酸化ＥＲＫ（ＨＥＲ２の下流）シグナリングを同時に減少させる。トラスツズマブの処理は主にリン酸化ＡＫＴを負に制御するが、その一方ではＺＲ７５３０細胞においては、トラスツズマブの処理はリン酸化ＥＲＫの負の制御を誘導する。幾つかのＨＥＲ２依存的癌細胞株において、細胞周期制御因子ｐ２７ＫＩＰ１（サイクリン依存的キナーゼ阻害剤）は正に制御されており、Ｇ_１／Ｓ期の移行を介在するサイクリンＤ１の発現は負に制御されている。さらに、二重特異性標的剤による細胞周期の抑制は必ずしも観察されないが、トラスツズマブ処理感受性細胞株において、細胞周期停止が観察された。ＢＭＩの正の制御と、ＰＡＲＰの切断（ＰＡＲＰｐ８９の正の制御）は全てのＨＥＲ２依存的癌細胞株で観察される。このことは、二重特異性標的剤を処理すると、アポトーシスが誘導されることを示す。トラスツズマブを処理後ＺＲ７５３０細胞及びＢＴ４７４細胞においてもＰＡＲＰ切断が認められたが、二重特異性標的剤では恒常的に強いシグナルを示していた。

９６ウェル組織培養プレート中でＢＴ４７４細胞のＸＴＴ細胞増殖測定を行った（図６）。１％ＦＣＳ（低濃度の追加の増殖因子を含む）を含むＲＰＭＩ１６４０培地内で処理する１６時間前に、１０^４個細胞／ｃｍ^２となるよう細胞を播種した。前処理として、１００ｎＭの抗ＨＥＲ２剤を２時間処理した。その後、細胞に１ｎＭの濃度のヘレグリンβ１（ＨＲＧ）を処理することで刺激した（リコンビナントヒトＮＲＧ１−β１／ＨＲＧ１−β１：２６．９ｋＤａ）。１％ＦＣＳ単独における標準的な増殖と比較して、ＨＲＧ処理はＢＴ４７４細胞の生存率を２０％までの増殖を導く（図６）。そこで、ＨＲＧ非存在下（生存率１００％）又はＨＲＧ存在下（生存率１２０％）において、抗ＨＥＲ２剤と単独剤の処理と、対応するコントロールの処理との比較を行った。トラスツズマブ（ｈｕ４Ｄ５）を処理するとＨＲＧ非存在下では、生存率５０−６０％まで減少させたが、リガンド刺激癌細胞において抗腫瘍活性は認められなかった。１ｎＭのＨＲＧ存在下では、トラスツズマブは抗腫瘍活性を完全に失っていた。ペルツズマブ（ｈｕ２Ｃ４）はＨＲＧ存在下又は非存在下で生存率を２０−３０％まで減少させた。二重特異性標的剤はＨＲＧ非存在下で生存率を８０−９０％まで減少させ、ＨＲＧ存在下では４０−５０％まで減少を示した。つまり二重特異性標的剤はＨＲＧ存在下、非存在下ともに強力な抗腫瘍活性を示す。トラスツズマブ及びペルツズマブの追加効果は、単剤の独立した最大抗腫瘍活性と似ているが（データは示されていない）、ビトロモデルにおいては、重要な機構的相乗効果はない。それゆえ、インビトロモデルにおいて二重特異的標的剤の活性化機序はトラスツズマブとペルツズマブを組み合わせた処理よりも優れている。二重特異性剤の処理は前記両抗体の効果の合計より優れている。

当業者であれば、ＸＴＴ測定は細胞毒性及び抗腫瘍候補化合物の効能を評価するための適した評価系であると認識しているはずである（Ｊｏｓｔ ｅｔ ａｌ、（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ、１４７、１５３−１６５、Ｓｃｕｄｉｅｒｏ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４８、４８２７−４８３３；Ａｎｄｊｉｌａｎｉ ｅｔ ａｌ、（２００５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１１７、６８−８１、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ、８２（１３）、１１１３−１１１７、Ｍｏｎｋｓｅｔａｌ．（１９９１）Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ、８３（１１）、７５７−７６６参照）。

（実施例２）ＨＥＲ２依存的癌細胞にアポトーシスを誘導する二重特異性抗ＨＥＲ２標的剤の構築計画

活性化分子の構築部分を形成する結合剤の構築
結合分子は、アンキリン反復タンパク質ライブラリーのリボソームディスプレイセレクションを用いて得た。該結合分子は、ＨＥＲ２の全長細胞外ドメイン（細胞外ドメイン ＨＥＲ２）と特異的に結合するためのものであり、前記方法は以前示した方法である（Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９、１８８７０−１８８７７）。

ビオチン化ＨＥＲ２標的化の準備
独立したドメインへのバインダーを得るために、バキュロ発現システムを用いて、ＨＥＲ２の異なる独立したドメインを昆虫細胞へそれぞれ発現させた。それゆえ、選択されたバインダーは目的のドメインに直接結合することが保証されている。簡単に説明すると、バキュロバイラルベクターを用いて、Ｎ末端メリッティンシグナル配列（ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＷＹＩＳＹＩＹＡ、配列番号１０１）及びＮ末端ヒス６タグを有するリコンビナントＥｒｂＢ２−エクトドメインをスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ９）細胞に発現させるものである。Ｓｆ９細胞は４×１０^６個／ｍｌの濃度で増殖させ、１．７２時間感染後に１ＭＯＩのそれぞれのウィルスをともに感染させ、感染後の細胞を遠心で集め（３０分、５０００ｇ、４℃）、上清をＮｉ−ＮＴＡスーパーフロー精製樹脂固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）にかけた。

細胞外部位のいかなるドメインに対するバインダーを構築するために、ＨＥＲ２の細胞外ドメイン（１−６２１残基）をリボソームディスプレイを用いた選択のための標的として使用した（Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００６）２８１：３５１６７−３５１７５）。また、初めの３つのドメインに対するバインダーを構築するために、ＨＥＲ２残基１−５０９を使用した。

固定操作としては、標的タンパク質の一部（２００−６００μｇ）をＥＺ−ｌｉｎｋＳｌｆｏＮＨ−ＳＳ−Ｂｉｏｔｉｎを用いて化学的にビオチン化した。標的タンパク質にサイズの違いがあるので、標的タンパク質に対して様々なモルで、過剰量のビオチン化試薬を使用した（ＨＥＲ２、１−６２１又は１−５０９に対しては６倍、シングルドメインに対しては３倍）。反応条件については添付の提供者マニュアルに従った。ビオチン化が成功しているかについては、ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロットを用いて確認した。ビオチン化されたＨＥＲ２コンストラクトはＰＢＳ１５０に対して広範囲に透析された。

選択のために標的タンパク質を固定化した。固形プラスチック（ポリスチレンなど）表面に直接固定した結果、標的タンパク質が部分的に変成することを防ぐために、ビオチン化標的タンパク質をニュートラビジン又はストレプトアビジンと結合させた。該ニュートラビジン又は該ストレプトアビジンは、以下の通り固形プラスチックに直接固定させた。ＰＢＳ中のニュートラビジン（６６ｎＭ、１００μｌ／ウェル）又はストレプトアビジン（６６ｎＭ、１００μｌ／ウェル）をマキシソーププレート（Ｎｕｎｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）上で４℃で一晩インキュベートすることで固定した。ウェルに３００μｌのＰＢＳＴＢ（０．１％ツイーン２０、０．２％ＢＳＡを含むＰＢＳ）を加え、室温で１時間ブロックした。ＰＢＳＴＢ中でビオチン化標的タンパク質（選択のために１００μｌ、１００ｎＭ）を結合させるために４℃で１時間反応させた。固定化タンパク質の第１の選択工程において、多量に必要となるので、ＰＢＳ中のニュートラビジン（６６ｎＭ、４ｍｌ／チューブ）をマキシソープ免疫チューブ状で４℃で１晩インキュベートさせ固定した。チューブを４ｍｌのＰＢＳＴＢで１時間室温で反応させブロックした。ＰＢＳＴＢ中のビオチン化標的タンパク質（４ｍｌ、１００ｎＭ）を結合させるために４℃で１時間反応させた。固定化タンパク質を選択する上で、ニュートラビジン及びストレプトアビジンに結合するバインダーを選んでしまうことを避けるために、選択工程毎にニュートラビジン及びストレプトアビジンを交互に使用した。

リボソームディスプレイ
リボソームディスプレイは以下の公開されたプロトコールに従った（Ｄｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．８０５、２６１−２８６、Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ４、２６９−２７９．）。一般的に３回又は４回行なった。以下のプロトコールに詳しく述べられているとおり（Ｄｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．８０５、２６１−２８６、Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ４、２６９−２７９）、第１の工程は通常プレート上で行い、残りの選択工程はプレート上又は溶液中で行い、そこでビオチン化ＨＥＲ２標的物はストレプトアビジン被覆磁気ビーズと結合させた。上記のことは、以下のプロトコールに詳細に述べられている（Ｄｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８０５，２６１−２８６；Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４，２６９−２７９．）。

第４の工程は、オフレート選択を採用することで選択圧を上げた。この目的のために、５倍希釈した氷冷ＷＢＴバッファー（５０ｍＭのトリスアセチレート、ｐＨ７．５、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、５０ｍＭの酢酸マグネシウム、０．０５％ツイーン２０）でビトロ翻訳を止めた後、最終濃度が１０ｎＭとなるようビオチン化ＨＥＲ２コンストラクトを処理し、４℃で２時間反応させることで翻訳物を平衡化させた。翻訳反応物を２つに分けて、非ビオチン化ＨＥＲ２コンストラクトが最終濃度１μＭになるようにそれぞれに処理した。該非ビオチン化ＨＥＲ２コンストラクト濃度は、１００倍を超えるビオチン化抗原に相当する。その後２つに分けた翻訳反応物を、緩慢なオフレートによる選択の厳密性を上昇させるために、それぞれ２時間から２０時間インキュベートした。リボソーム複合体は３０μｌのストレプトアビジンでコートされたマグネティックビーズを利用して修復させた。次の工程では、１７５ｎＭのビオチン化ＨＥＲ２コンストラクトを、ニュートラビジンコートマキシソーププレート、つまりバインダーを回収するためのむしろ厳重でない条件で固定した（「回収工程」）（Ｄｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．８０５、２６１−２８６、Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ４、２６９−２７９．）。

固相固定化ＨＥＲ２コンストラクトを用いた全ての選択工程において、以下に示されているように、ニュートラビジンコートマキシソーププレート上で３０分の前処理工程を行った（Ｄｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．８０５、２６１−２８６、Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ４、２６９−２７９）。前処理工程後は、翻訳抽出物をＨＥＲ２コンストラクトコートマキシソーププレートに４５分結合反応させた。得られた複合体をＷＢＴバッファーで徹底して洗った。

ファージディスプレイ
ＤＡＲＰｉｎライブラリーのファージディスプレイは公開されているプロトコールに従った（Ｓｔｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８２、１２１１−１２２７）。様々なビオチン化ＨＥＲ２コンストラクトの固定化は上記で述べてきた通りである。

他の記述がない限り、ファージディスプレイセレクションの全ての工程は室温で行った。選択工程は溶媒中でビオチン化標的タンパク質をストレプトアビジンコートマグネティックビーズ上で捉えるか（溶媒中の標的タンパク質参照）、又は以下に述べるように、固形プラスチック表面に直接固定したニュートラビジン又はストレプトアビジンにビオチン化標的タンパク質（固定化標的タンパク質とよぶ）を結合させた。第１の選択工程で固定化標的タンパク質の系を行うと、非常に良い結果が得られた。それはバインダーを捉える効率が非常に良かったためだと考えられる（特に第１の工程では重要）。それ以後を溶媒中の標的タンパク質の系で行うと、非常に良い結果が得られた。それは、バックグラウンドバインダーの濃縮率が低かったためだと考えられた。

溶媒中の標的タンパク質の選択
第１の選択サイクルを溶媒中で行うとき、第１の選択工程においてファージＤＡＲＰｉｎライブラリーのおおよそ２．５×１０^１３個のファージ粒子と、２ｍｌのＰＢＳＴＢに入れた１００ｎＭのビオチン化標識タンパク質とともに1時間インキュベートした。次の工程では、おおよそ１０^１２個のファージ粒子を使用した（下記参照）。その後ファージ−抗体複合体を１００μｌのストレプトアビジンでコートしたパラマグネティックビーズ（１０ｍ／ｍｌ）上で２０分捕捉した。ＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．１％ツイーン−２０）で８回洗った後、ファージ粒子を２００μｌの１００ｍＭトリチルアミン（Ｅｔ３Ｎ、ｐＨ調整なし）で６分溶出し、２００μｌの１００ｍＭのグリシン塩酸、ｐＨ２で１０分溶出した。溶出物は１００μｌの１Ｍのトリス塩酸、ｐＨ７又は１８μｌの２Ｍトリスでそれぞれ平衡化させ、指数関数的に増殖する大腸菌ＸＬブルー細胞に感染させるために、混合及び使用した。３７℃で１時間振とう後、１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む５０ｍｌの新鮮な２ＹＴ培地（５ｇの塩化ナトリウム、１０ｇの大腸菌抽出物、１６ｇのトリプトン／Ｌ）を用いて細胞を増やし、３７℃で振とうをさせながらインキュベートした。最大５時間（ＯＤ６００＝０．５に達すればより短時間）後に、最終濃度が０．２Ｍとなるようイソプロピル−３−Ｄ−チオガラクトサイド（ＩＰＴＧ）を処理し、１５分後にＶＣＳＭ１３ヘルパーファージを１０^１０ｐｆｕ（プラーク形成単位）／ｍｌ（感染多重度２０）感染させることでファージライブラリーレスキューした。カナマイシンを処理せず、細胞を３７℃で一晩増殖させた。細胞を遠心で除き（５６００ｇ、４℃、１０分）４０ｍｌの培養上清を、１／４量の冷ＰＥＧ／塩化ナトリウム（２０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００、２．５Ｍの塩化ナトリウム）溶液とともに１時間氷上でインキュベートした。そして遠心（５６００ｇ、４℃、１５分）を行うことで沈殿させたファージ粒子を集め、２ｍｌのＰＢＳ中に溶解させ、第２の選択工程で使用した。

次の工程として、おおよそ１０^１２個に増殖させたファージ粒子をインプットとして使用し、非特異的又はストレプトアビジンに結合するファージ粒子を除くために、１００μｌのストレプトアビジンでコートしたマグネティックビーズとともに１時間インキュベートした。ビーズを除いた後、ファージ粒子を１００ｍＭのビオチン化標的タンパク質とともに１時間インキュベートし、複合体を新しいビーズで捕捉し、ビーズを１２回ＰＢＳＴで洗い、ファージを４００μｌの１００ｍＭグリシンＨＣＬ、ｐＨ２で１０分溶出し、溶出物を３６μｌの２Ｍトリスベースで平衡化させ、ファージ粒子を上記の方法で増幅、精製した。

第３の工程後に、ＨＥＲ２標的コンストラクトに特異的に結合するＤＡＲＰｉｎを表示するファージ粒子濃縮物を、ファージイライザによって特定した。初期のライブラリー及び増幅された各工程の集団におけるおおよそ５×１０^１０個のファージ粒子（分光測定により概算）を固定化した標的タンパク質とともに、又はともなわずにウェルの中で混合し、室温で２時間インキュベートした。ウェルを３００μｌのＰＢＳＴで４度洗った後、マウス抗Ｍ１３ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート抗体及び水溶性ＢＭブルーペルオキシダーゼ基質（ＰＯＤ）を用いて結合ファージ粒子を検出した。

固相化標的タンパク質の選択
第１の選択サイクルでは、ファージＤＡＲＰｉｎライブラリーにおけるおおよそ３．５×１０^１３のファージ粒子を固相化標的タンパク質（プラスチック表面に直接固相化したニュートラビジンに結合させたビオチン化標的タンパク質）を含む免疫チューブに処理し、回転させながら２時間ローテートした。チューブを１０回ＰＢＳＴで洗浄し、ファージ粒子を５００μＬの１００ｍＭのＥｔ３Ｎ（ｐＨ調整なし）で６分、続いて５００μＬの１００ｍＭのグリシン−塩酸、ｐＨ２で１０分溶出した。溶出物を２５０μＬの１Ｍのトリス−塩酸ｐＨ７、又は４５μＬの２Ｍのトリスベースそれぞれで平衡化させ、指数関数的に増殖する１３ｍｌの大腸菌ＸＬ１ブルー細胞に感染させるために組み合わせ、使用された。３７℃で１時間振とうさせた後、１０μｇのクロラムフェニコール（ｃａｍ）を含む１３０ｍｌの新鮮な２ＹＴ培地中で、３７℃で振とうし増殖させた。ファージの増殖と沈降反応は上記と同様に行った。

次の選択工程は、ニュートラビジン、ストレプトアビジン又は非特異的結合ファージ粒子を分離するために、おおよそ１０^１２の増殖させたファージ粒子をブロックした免疫チューブ（前工程で標的タンパク質を固相化するためにニュートラビジン又はストレプトアビジン及びＢＳＡでコートしたチューブ）中で１時間インキュベートした。結合選択段階では、ファージ粒子を、固相化ビオチン化標的タンパク質（次の工程でニュートラビジン又はストレプトアビジンを交互に使用した）を含む４つのウェルで１時間インキュベートした。ＰＢＳＴでウェルを１２回洗い、１００μＭのグリシン塩酸、ｐＨ２、１００ｍｌを用いて各ウェルから１０分ファージを溶出し、溶出物複合体を２Ｍのトリスベース３６μｌで平衡化し、上記の方法でファージ粒子を増幅させ、精製した。第３の工程後は、ＥＬＩＳＡ法を用いてファージの濃度を決定した。

抗体ライブラリー由来のファージディスプレイ
ＨＥＲ２に結合するための単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を、人工合成ヒト抗体断片ライブラリーであるＨｕＣＡＬ−１（Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．、２０００）から選択した。該単鎖抗体断片は分子量３０ｋＤａである。このライブラリーは、２×１０^９メンバーの多様性を有する（Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．、ＪＭＢ、２０００、２９６（１）、５７−８６）。Ｍ１３ファージが提示するＨｕＣＡＬ−１ｓｃＦｖライブラリーは、ｇ３ｐコートタンパク質のＣＴドメインと融合するとして、水溶性ビオチン化ＨＥＲ２ドメイン１又は４と結合させるために選択された。該ＨＥＲ２ドメイン１又は４は上記の方法でマイクロタイターウェル上のニュートラビジン又はストレプトアビジンに固相化した。

ファージの選択は、１ｐｍｏｌのファージをともなう５０ｐｍｏｌのビオチン化抗体を０．５％のＢＳＡを含む１００μｌのＰＢＳ中で４℃で１時間インキュベートすることで行われた。この複合体を、１ｍｇのＢＳＡでブロッキングをしたストレプトアビジン磁気粒子で捕捉し、０．５％ＢＳＡ入りＰＢＳで１０回洗浄した。

結合させたファージをｐＨ２．２の１００ｍＭグリシンで溶出し、等量のｐＨ８の１Ｍトリスで平衡化させた。大腸菌ＴＧ１に溶出したファージを感染させ、１％グルコース及び３４ｍｇ／ｍｌのクロラムフェニコ−ルを含むＬＢアガロースにまいた。このプレートを３０℃で一晩インキュベートし、大腸菌を１％グルコース及び３４ｍｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有した２×ＹＴ培地に植菌するために掻きだした。この培養液を３７℃でインキュべートし、ＯＤ６００＝０．５において、ファージライブラリーにＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を感染させることでレスキューした。大腸菌を遠心することで回収し、３０ｍｇ／ｌのカナマイシン、３４ｍｇ／ｌのクロラムフェニコール、０．１ｍＭのＩＰＴＧ入り２×ＹＴ培地に再懸濁し、３０℃で一晩培養した。ポリエチレングリコールＰＥＧ−６０００（最終濃度３．３％）、塩化ナトリウム（最終濃度０．４Ｍ）を処理し、ファージを培地上清から沈殿させた。ファージをＨ_２Ｏ中に再懸濁し、ポリエチレングリコールＰＥＧ−６０００（最終濃度３．３％）、塩化ナトリウム（最終濃度０．４Ｍ）を処理し沈殿させた後、ＰＢＳに再懸濁した。

ファージディスプレイの第４及び５の工程を行った後、ｓｃＦｃをコードする配列から選択される集団を、制限酵素サイトであるＸｂａｌとＥｃｏＲ１がある部位を介して発現プラスミドであるｐＭＸ７へサブクローニングを行った（Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，ＪＭＢ，２０００，２９６（１），５７−８６）。大腸菌ＳＢ５３６細胞に構築したベクターを形質転換した。大腸菌を０．１％のグルコース及び３４ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含む２×ＴＹ培地を用いて３７℃で培養した。ＯＤ_６００＝０．５培地に１ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導した。ＳｃＦｖ断片が大腸菌の周辺質から分泌された。小規模の発現のために、誘導後、培地を３０℃で５時間インキュベートした。周辺質抽出物のために、細胞を遠心して集め、３００ｍＭのホウ酸、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ中で、ｐＨ８、４℃で一晩インキュベートした。遠心後、上清を酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）スクリーニングへ利用した。

ｓｃＦｖ断片の大規模発現のために、培養物を２２℃で２時間インキュベートした。その後大腸菌を遠心して回収し、５０ｍＭのリン酸２水素ナトリウム、３００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ８に再懸濁した。少量のＤＮＡｓｅＩ及び２ｍＭの塩化マグネシウムを処理した後、大腸菌をフレンチプレッシャーセル（細胞粉砕器）でライセートにした。ライセートをフィルターに通し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースを用いて精製し、１６カラム量であれば５０ｍＭのリン酸２水素ナトリウム、３００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ８で洗浄し、１２カラム量であれば５０ｍＭのリン酸２水素ナトリウム、９００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ８で洗浄し、１６カラム量であれば５０ｍＭのリン酸２水素ナトリウム、３００ｍＭの塩化ナトリウム、０．１％のトライトンＸ−１００、ｐＨ８で洗浄し、８カラム量であれば５０ｍＭのリン酸２水素ナトリウム、３００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ８で洗浄した。溶出物を超遠心を行って回収し、マイクロバイオスピンＰ−６カラムを用いてＰＢＳへとバッファーを変えた。増殖測定のために、サンプルにＤｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌエンドトキシンリムーバルカラム上でさらに精製し、ＰＢＳで溶出した。４℃で無菌条件下で保存したとき、精製したｓｃＦｖ断片の結合能は変化せず３ヶ月以上維持した。

二重特異性ｓｃＦｖ１−リンカー−ｓｃＦｖ２コンストラクト
上記に記した方法で、ＨＥＲ２ドメイン１又はドメイン４のどちらにも結合する抗体ｓｃＦｖ断片をＥＬＩＳＡを用いて同定した。これらのｓｃＦｖ断片から、一連の二重特異性ｓｃＦｖ１−リンカー−ｓｃＦｖ２コンストラクト（二重特異性直列ｓｃＦｖ）は常にＨＥＲ２ドメイン１バインダー及びＨＥＲ２ドメイン４バインダーが結合しており（どのような方向性であっても）、以下のように構築される。全てのＨｕＣＡＬｓｃＦｖ断片は共通した内部制限酵素サイトがあるので、ｐＨｕ２０２というベクターを構築することができる。該ベクター中の、上流のｓｃＦｖ配列は弾力性のあるリンカーを介して下流の断片と結合する。該断片はシグナル配列を有していないので、その結果としてｐｈｏＡ−ｓｃＦｖ１−リンカー−ｓｃＦｖ２の配列となり、そこではｐｈｏＡが分泌シグナルとなる。リンカー部位はユニーク制限サイトを介して交換することができる。該リンカーは、断片の中のＮｏｔ１及びＳｆｉｌｎｏの付近に組み込まれる。従って、可能性のある活性型二重特異性抗体全ての組合わせは、リンカー−ｓｃＦｖ２ユニットを、ｓｃＦｖ１の下流であるｐｈｏＡ−ｓｃＦｖ１を含む分泌ベクターへ連結させることで簡易に構築した。活性のある組合わせを同定後、リンカーを異なる長さの一連のリンカーと交換し、Ｎｏｔ１とＳｆｉｌを介して結合させることでリンカーを前記コンストラクトの中で計画的に変更した。

ｓｃＦｖ１−リンカー−ｓｃＦｖ２断片の大規模発現のために、培養物を２２℃で２０時間インキュベートした。大腸菌を遠心して集め、５０ｍＭのリン酸２水素ナトリウム、３００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ８に再懸濁した。少量のＤＮＡｓｅI及び２ｍＭの塩化マグネシウムを２ｍＭ処理した後、大腸菌をフレンチプレッシャーセル（細胞粉砕器）でライセートにした。ライセートをフィルターに通し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースを用いて精製し、１６カラム量であれば５０ｍＭのリン酸２水素ナトリウム、３００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ８、１２カラム量であれば５０ｍＭのリン酸２水素ナトリウム、９００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ８、１６カラム量であれば５０ｍＭのリン酸２水素ナトリウム、３００ｍＭの塩化ナトリウム、０．１％のトライトンＸ−１００、ｐＨ８、８カラム量であれば５０ｍＭのリン酸２水素ナトリウム、３００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ８で洗浄した。溶出物を超遠心を行い回収し、マイクロバイオスピンＰ−６カラムを用いてＰＢＳへとバッファーを変えた。増殖測定のために、サンプルにＤｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌエンドトキシンリムーバルカラム上でさらに精製し、ＰＢＳで溶出した。

二重特異性抗体
二重特異性抗体のクローニングは、タンデムｓｃＦｖのクローニングと相似しているが、しかし幾つかの重要な相違点がある。２つの遺伝子ｐｈｏＡ−ＶＨ１−ＶＨ２、続いてｐｈｏＡ−ＶＨ２−ＶＨ１を複製する必要がある。単純に、２つのプロモーターを選択する。該プロモーターはそれぞれ１つの遺伝子をドライブする。ＶＨ１及びＶＬ１はｓｖＦｖ１の重鎖、軽鎖の可変部位であり、ＶＨ２及びＶＬ２はｓｖＦｖ２の重鎖、軽鎖の可変部である。しかし、二重特異性抗体において、前記重鎖及び軽鎖はここでは他のｓｃＦｖの相補鎖と結合している。合成ＨｕＣＡＬライブラリーのモジュール性は、合成遺伝子の中に保存された制限酵素配列をともない、クローニングを非常に容易にする。周知ではあるが、独特な制限酵素サイトを利用して、ｓｃＦｖ断片中のＶＨ（又はＶＬ）を交換することだけを必要とする。ｓｃＦｖ断片におけるＶＨとＶＬは独特な該制限酵素サイトによって平滑化される（Ｋｎａｐｐｉｋｅｔａｌ．、２０００）。カセット全体である、プロモーター−ｐｈｏＡ−ＶＨ１−リンカー−ＶＨ２はｐＤｉａ２０３の中に新たに構築されたＮｏｔ１とＳｆｉＬ部位によって平滑化され、その一方でｐＤｉａ２０３は同部位がｓｃＦｖ発現部位の下流であるよう設計されている。それなので、完全なプロモーター−ｐｈｏＡ−ＶＨ１−リンカー−ＶＨ２ユニットはすでにプロモーター−ｐｈｏＡ−ＶＨ２−リンカー−ＶＨ１を含むベクターへクローニングされうる。したがって、二重特異性剤の両鎖は同じプラスミド上にコードされている。二重特異性剤の両鎖は、それらが組み立てられる近傍に分泌される。

二重特異性剤の大規模発現のために、培地を２２℃で２０時間インキュベートした。大腸菌を遠心して回収し、５０ｍＭのリン酸２水素ナトリウム、３００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ８に再懸濁した。少量のＤＮＡｓｅI と２ｍＭの塩化マグネシウムを処理した後、大腸菌をフレンチプレッシャーセルでライセートにした。ライセートをフィルターに通し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース上で精製し、１６カラムの場合は５０ｍＭのリン酸２水素ナトリウム、３００ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ８、１２カラムの場合は５０ｍＭのリン酸２水素ナトリウム、９００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ８、１６カラムの場合は５０ｍＭのリン酸２水素ナトリウム、３００ｍＭの塩化ナトリウム、０．１％トライトンＸ−１００、ｐＨ８、８カラムの場合は５０ｍＭのリン２酸水素ナトリウム、３００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ８で洗った。溶出物を超遠心を行い濃縮し、マイクロバイオスピンＰ６カラムを用いたＰＢＳバッファー置換をした。増殖測定を行うために、サンプルをデトキシゲルエンドトキシンリム−バルカラムでさらに精製し、ＰＢＳで溶出した。

さらに、単鎖二重特異性コンストラクトは、実施例５に記述されるように構築した（ａｎａｌｏｇｏｕｓ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｂｙ Ｖｏｌｋｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １４、８１５−８２３）。

単結合剤の解析
結合剤は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって特徴づけられた。各結合剤それぞれすべての結合を明らかにするためにＥＬＩＳＡを行った。該ＥＬＩＳＡでは、コートのためにＨＥＲ２の細胞外ドメイン全長を使用した。ＨＥＲ２のこの部位へ特異的に結合するＤＡＲＰｉｎを明らかにするために、ＥＬＩＳＡを行った。該ＥＬＩＳＡでは、トランケート型のＨＥＲ２細胞外ドメイン（ドメイン１−３）を標的とした。この方法は、本来９ＸＸシリーズのバインダー（ＨＥＲ２＿５０９に由来する分子）を回収するために適用された。ドメイン４バインダーＧ３及びＨ１４はＨＥＲの全長細胞外ドメインの結合によって同定されたが、ドメイン１及び３のみから構築されるＨＥＲ２のトランケート細胞外ドメインとは結合しない。

特異的結合実験は、ＨＥＲ２を過剰発現するさまざまな癌細胞、例えばＢＴ４７４、ＳｋＢｒ３、ＳｋＯｖ３の表面上で行われ、標準的なフローサイトメトリー法が用いられた。多蛍光検出系、例えば抗ヒスタグ抗体及びそれに続くアレクサ４８８でラベルした二次抗体によるヒスタグ、又は代わりに、結合分子とスーパーホルダーＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ）遺伝子の融合物、又は直接的なアレクサ４８８標的結合試薬を使用し、ＨＥＲ２を過剰発現させた癌細胞の表面と特異的に結合する全ての単結合剤を確認するために利用した。蛍光強度の平均値の測定によってシングルエピトープへの結合が検出され、飽和状態では全てのバインダーについて同様の値になる。さらに重要なことに、非標識のコントロールの結合が該エピトープと競合した時に、シグナルが完全に抑制される。単結合剤は、サイズ排除クロマトグラフィー、多角度光散乱検出器及びポリアクリル電気泳動（ＰＡＧＥ）などの異なる精度管理測定法も通過した。

結合剤の競合結合解析
９ＸＸコレクションの結合剤のエピトープを特徴づけるために、競合結合解析をおこなった。９．０１バインダーを除き、９ＸＸコレクションの全ての結合剤は、ＨＥＲ２のドメイン１における類似したエピトープへの結合において競合する。ドメイン４結合剤と、トラスツズマブとの競合結合ＦＡＣＳ解析も行った。競合、非競合結合剤の集合を同定した。重要なことに、トラスツズマブエピトープへの結合は、二重特異性分子（Ｇ３はトラスツズマブと結合において競合しない）の抗腫瘍活性に必要ではない。バインダーＨ１４はＧ３と競合し、トラスツズマブと競合を示す。

競合結合ＦＡＣＳ解析は、９ＸＸ結合分子とペルツズマブの結合は競合しないことを示した。ペルツズマブエピトープに結合する単結合剤は存在しない。ＨＥＲ２の細胞外ドメイン１を標的として、９ＸＸコレクションに特異的に結合することを示すためにＥＬＩＳＡを行った。

表１は優先的な結合単体の性質（生化学活性をともなう二重特異性抗体の構築部位となりうる）及び標準結合ユニット（生化学活性に寄与しない）をまとめたものである。該表１は、優れた抗腫瘍活性を有する二重特異性結合剤を構築するためのものである。リストにあるＨＥＲ２の細胞外部位のシングルドメインは、単剤によって結合されている。エピトープは、ＥＬＩＳＡによる結合測定の抑制又は、ＨＥＲ２を過剰発現する癌細胞の表面におけるフローサイトメトリーによって特徴づけられている。結晶構造のデータは、示唆された結合剤へ利用可能である。該結合剤は、単アミノ酸レベルでの詳細な特異的エピトープが特徴づけられている。効果のある二重特異性抗腫瘍剤を構築するために、ＨＥＲ２のドメイン１を標的とする結合剤をＨＥＲ２のドメイン４を標的とする結合剤へと優先的に融合させた。該結合剤は示唆された結合剤のリストから選択された。

実施例５にｓｃＦｖＡ２１と結合するドメイン１を示している。

二重特異性結合剤の発現
二重特異性分子の遺伝子又はコード配列をｐＱｉＢｉ−０１−（又は−１１−、−１２−、−２２−、−２３−、−３３−）ベクターの中に構築した。Ｎ末端の結合分子におけるＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII制限サイトとＣ末端の結合分子におけるＢｇｌII／ＢｓａＩ制限サイトに対して通常の制限消化及びライゲーション技術を用いた。このベクターはｐＱＥ３０に由来しているが、ｌａｃｌ^ｑ遺伝子とユニーク制限酵素サイト（それぞれＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII及びＢｇｌII／ＢｓａＩ）を有する。該制限酵素サイトは、上流に１つのバインダーを複製し、もう一方の下流にＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIIIを介してリンカーを下流に複製するためのものである。前記の数字はそれぞれのリンカーの長さを示し、それぞれのユニットは（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）ユニットである。例えば、ｐＱｉＢｉ−２２−ベクターはバインダーの間に４つの（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）ユニットを有する。

二重特異性コンストラクトをＸＬＩブルー系列の大腸菌又はＢＬ２１系列の大腸菌にラック−オペロン導入システムを利用しイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて発現させた。大腸菌をフレンチプレス法又は超音波を用いて溶菌した。溶菌した大腸菌をろ過し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースベンチトップカラムに充てんし、ＴＢＳ＿Ｗ（５０ｍＭのトリス、４００ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．５）を用いて洗い、さらにエンドトキシンを取り除くため０．１％のトライトンＸ−１１４を含んだ７０ＣＶのＰＢＳで洗った。タンパク質を２５０ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳで溶出した。タンパク質をさらにサイズ排除クロマトグラフィーを用いてＰＢＳバッファーで精製した。カブトガニ血球抽出成分（ＬＡＬ）測定を行い、エンドトキシン内容物を測定した。タンパク質の濃度は２８０ｎｍの吸光波長又はＢＣＡ測定を用いて測定した。

さらなる二重特異性剤は実施例５及び６に記載されている。

二重特異性結合剤の測定
二重特異性結合剤は分子量、単量体状態、ＨＥＲ２の細胞外ドメインへの結合などの品質管理測定を通過した。予想通り、トラスツズマブ−競合バインダー（例えば、ＤＡＲＰｉｎＨ１４）を含む二重特異性結合剤は、二重特異性物中のトラスツズマブとも競合した。予想通り、二重特異性バインダーは、トラスツズマブ−競合ユニットを含んでおらず、二重特異性物中においても競合を示さなかった。全長のＨＥＲ２細胞外ドメインを標的として用いて、全ての二重標的結合剤と、ペルツズマブに対しても競合ＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡにおいて、全長のＨＥＲ２の細胞外ドメインに対してペルツズマブと競合的に結合する二重特異性剤はなかった。ＨＥＲ２を過剰発現させた生存可能な細胞の表面に対する結合は、フローサイトメーターを用いて示された。

二重特異性剤の抗腫瘍活性を決定するために（図８）、ＢＴ４７４細胞を１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０中で処理する１６時間前に１０×１０^４個／ｃｍ^２の濃度で９６ウェルプレートに播種した。１００ｐＭから１μＭの力価となるよう各剤を処理し（最終濃度）、細胞培養インキュベーターの中で４日間細胞培養を行った。ＸＴＴ生存測定を製造業者のプロトコールに従って行い、癌細胞の残存生存率を測定した。該標的剤は、抗腫瘍活性によって分類することができる。単結合剤であるｓｃＦｖ４Ｄ５及びＤＡＲＰｉｎＨ１４は同程度の２０−３０％まで細胞増殖を減少させた。トラスツズマブはおおよそ５０％程度細胞増殖を減少させた。弾力性のある二重特異性剤である９２６−ＦＬ−Ｇ３及び９２９−ＦＬ−Ｈ１４は同程度の８０−９０％まで細胞増殖を減少させた。

例えばＨＥＲ２の細胞外ドメイン１上の一価のＤＡＲＰｉｎ９２９と類似したエピトープを共有する全ての二重特異性コンストラクトは、細胞増殖測定において強力な抗腫瘍活性を有する（図９）。ＢＴ４７４細胞を１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０中で処理する１６時間前に１０×１０^４個／ｃｍ^２の濃度で９６ウェルプレートに播種した。抗ＨＥＲ２結合剤を１００ｎＭ（終濃度）の濃度で処理し、細胞に４日間処理した。ＸＴＴ細胞増殖測定を製造業者のプロトコールに従って行った。Ｎ末端に９ＸＸを含むすべての二重特異性剤は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインのＥＬＩＳＡにおいて９２６及び９２９と競合的に結合し、癌細胞の生存率を７０−８０％まで減少させた。それはトラスツズマブよりも高い割合である。

単結合剤の抗腫瘍活性を決定するために、ＢＴ４７４細胞を１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０中で処理する１６時間前に１０×１０^４個／ｃｍ^２の濃度で９６ウェルプレートに播種した。抗ＨＥＲ２結合剤を１００ｎＭの濃度で処理し、細胞に４日間処理した。ＸＴＴ細胞増殖測定を製造業者のプロトコールに従って行った。Ｈ１４は、ＨＥＲ２のドメイン４に結合する剤であり、トラスツズマブ（ｈｕ４Ｄ５）の結合と競合し、腫瘍活性を２０％減少させた。９ＸＸドメイン１結合剤は単結合剤として抗腫瘍活性を示さなかった（図１０）。

抗ＨＥＲ２単結合剤の組み合わせによる処理を図１１に示している。ＢＴ４７４細胞を１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０中で処理する１６時間前に１０×１０^４個／ｃｍ^２の濃度で９６ウェルプレートに播種した。抗ＨＥＲ２結合剤を１００ｎＭの濃度で処理し、細胞に４日間処理した。ＸＴＴ細胞増殖測定を製造業者のプロトコールに従って展開した。９ＸＸドメイン４結合剤はＨ１４の追加的な抗腫瘍効果を示さなかった。それゆえ、強力な抗腫瘍活性は二重特異性分子の中に二重特異性剤が連結されることを必要とする。

トラスツズマブ抵抗性細胞株を用いた細胞増殖測定を図１２に示している。癌細胞を試薬処理１６時間前に９６ウェルプレートに播種した。段階希釈をした抗ＨＥＲ２結合剤を処理し、細胞に４日間処理した。ＸＴＴ細胞増殖測定を製造業者のプロトコールに従って展開した。二重特異性標的剤の抗腫瘍活性はトラスツズマブ抵抗性細胞株におけるトラスツズマブと同程度の控えめなものであった。

（実施例３）先行技術コンストラクトとの違い：７Ｃ２及び４Ｄ５の組合わせと二重特異性標的剤によって誘導されるアポトーシスの比較

以下の特許にもあるように（米国特許第７３７１３７６号明細書、米国特許出願公開第２０１１００３３４６０号明細書、抗ＥｒｂＢ２抗体）、７Ｃ２抗体は単剤としてＢＴ４７４、ＳｋＢｒ３、ＳｋＯｖ３又はＣａｌｕ−３にアポトーシスを引き起こすことができる。７Ｃ２及び７Ｆ３が結合するＨＥＲ２の細胞外ドメインのドメイン１のエピトープは、９ＸＸコレクションが結合するエピトープとは異なっており（下記参照）、ｓｃＦｃ断片Ａ２１が結合するエピトープとも異なっている（下記実施例５参照）。本明細書における二重特異性標的剤は、ＢＴ４７４、ＳｋＢｒ３細胞にはアポトーシスを誘導するが、ＳｋＯｖ３にはアポトーシスを誘導しない。ＳｋＯｖ細胞において抗腫瘍活性がないのは、ＰＩ３−キナーゼの活性型変異体Ｈ１０４７Ｒによって説明される。したがって、二重特異性剤によるアポトーシスの誘導は、ＨＥＲ２及び３の変異のない野生型の下流シグナル経路と相関した。

抗腫瘍活性の欠如は、７Ｃ２及び７Ｆ３抗体のもう１つの違いであり、それは単剤として抗腫瘍活性はある。米国特許出願公開第２０１１００３３４６０号明細書には、抗腫瘍活性の７Ｃ２及び４Ｄ５（トラスツズマブ）の追加効果が示される。その一方で、本明細書における二重特異性標的剤の抗腫瘍活性はトラスツズマブと組み合わせることで有意に減少した（図１３）。

更に重要なことに、本明細書中の標的剤に類似して構築された単一特異性、二価コンストラクトは混合しても活性化しない（図１４；下記の詳細な実施例の説明参照）。このことは抗体７Ｃ２に４Ｃ５及び７Ｃ３に４Ｄ５を混合した時と対照的である。このことは、前記抗体の混合物と本明細書における二重特異性標的剤の作用機序が完全に異なっていると明確に示している。本明細書における二重特異性標的剤においては、ドメイン１結合ユニットとドメイン４結合ユニットが共有的に結合していることが作用機序にとって必須である。

Ｈ１４融合物の場合には、活性が減少していたことは、同一エピトープに結合し単純に競合していたことで説明できる。その一方でＧ３融合物の場合には、トラスツズマブ及びＧ３がドメイン４の結合において競合しない。それなので、トラスツズマブは不活性型ＨＥＲ２相同二量体の形成を阻害する。この不活性型ＨＥＲ２相同二量体の形成は、本発明である二重特異性剤によって引き起こされる。それゆえ、７Ｃ２及び４Ｄ５の組合わせによる作用機序は、本発明である二重特異性標的剤と比較すると、異なっている。さらには、ＨＥＲ２を過剰発現している細胞へアポトーシスを引き起こす概念も全く異なっている。本明細書では、ＨＥＲ２依存的癌細胞における細胞内シグナルの強力な抑制を通して、アポトーシスが二重特異性結合分子によって誘導されることが示されている。それに対して、７Ｃ２は、相同二重特異性ＩｇＧであり、アポトーシスは誘導するが、細胞増殖抑制は誘導しない。この作用機序は、アポトーシスに由来するシグナルから切り離され、それゆえ細胞死受容体シグナル（ＦＡＳ、ＴＮＦ受容体）などの例とより類似している。発明者は、特定の理論に縛られることを望むものではないが、本発明に関する二重特異性剤は主に活性化二量体の形成を阻害することでシグナルのレベルを下げていると考えている。受容体の負の制御は本明細書で示す二重特異性分子の本質的な機構を形成するものではないようである。対照的に、７Ｃ２及び４Ｄ５の組合わせによる作用機序は、受容体を負に制御することを作用機序の一部とするようである。

トラスツズマブ抗体（ＴＴ、４Ｄ５）及びペルツズマブ抗体（ＰＥＲ、２Ｃ４）は二重特異性標的剤によって形成される不活性ＨＥＲ２相同二量体形成を阻害した（図１３）。ＢＴ４７４細胞１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０中で処理する１６時間以上前に１０×１０^４個／ｃｍ^２の濃度で９６ウェルプレートに播種した。二重特異性標的剤９２６−Ｇ３及び９２６−Ｈ１４を１００ｍＭとなるよう処理した。次に、１０ｐＭ〜１μＭの力価の抗ＨＥＲ２抗体、トラスツズマブ（ＴＴ、４Ｄ５）又はペルツズマブ（ＰＥＲ、２Ｃ４）を処理した。ＢＴ４７４細胞に４日間３７℃、５％ＣＯ_２濃度で細胞培養インキュベーター中で処理した。ＸＴＴ細胞生存率測定を製造業者のプロトコールに従い行った。４５０ｎｍの吸光度と生存細胞の数は正比例する。二重特異性剤９２６−Ｇ３及び９２９−Ｈ１４存在下でトラスツズマブ又はペルツズマブ濃度が上昇すると、二重特異性標的剤の抗腫瘍活性が有意に減少していた。このことは、本発明に関する二重特異性分子の抗腫瘍効果はトラスツズマブ又はペルツズマブの抗腫瘍効果より優れていることを示唆している。

二重特異性剤の抗腫瘍活性は、受容体のランダム交差結合によって生じるものではない（図１４、Ａ−コントロール、Ｃ−９２６−２２−９２６／Ｈ１４Ｒ−２２−Ｈ１４Ｒ、Ｄ−９２６ＡｖａｎｔＥ−２２−９２６ＡｖｅｎｔＥ／Ｈ１４Ｒ−２２−Ｈ１４Ｒ、Ｅ−９２６ＡｖａｎｔＥ−２２−９２６ＡｖｅｎｔＥ／Ｈ１４ＡｖａｎｔＥ−２２−Ｈ１４ＡｖｅｎｔＥ、Ｆ−９２６−２２−９２６／Ｇ３−２２−Ｇ３、第１のカラム＝１０ｐＭ、第２のカラム＝１００ｐＭ、第３のカラム＝１ｎＭ、第４のカラム＝１０ｎＭ、第５のカラム＝１００ｎＭ及び第６のカラム＝１μΜのＣ、Ｄ、Ｅ及びＦ）。ＢＴ４７４細胞１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０中で処理する１６時間以上前に１０×１０^４個／ｃｍ^２の濃度で９６ウェルプレートに播種した。相同二価性標的剤の組合わせは、１０ｐＭから１μＭの力価で行った。相同二価性標的剤の組合わせはともに癌細胞の生存率の有意な減少を示さなかった。

ＥＬＩＳＡにおいて、二重特異性標的剤はペルツズマブの結合と競合しない（図１５、Ａ−ペルツズマブ、二次抗体（非競合体）、Ｂ−二次抗体、Ｃ−ペルツズマブ、二次抗体（非ＥｒｂＢ２）、Ｄ−二次抗体（非ＥｒｂＢ２））。マキシソーププレートのウェルに１００μｌの６６ｎＭストレプトアビジンを含むＰＢＳを加え１２時間４℃でコートした。各工程の後は、溶液を完全に取り除いた。プラスチック表面をＰＢＳ＿ＴＢ（０．１％ツイーン２０、０．２％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で１時間、室温で振とうし、ブロックした。その後、２０ｎＭの切断型ＥｒｂＢ２−アビジンコンジュゲートを１００μｌのＰＢＳ中で処理し、１時間インキュベートした。プレートを４回ＰＢＳ＿ＴＢ中で洗浄した。そして、二価ＤＡＲＰｉｎを１μＭＰＢＳ＿ＴＢ中で処理し、３時間振とうさせ結合を行った。次に、１ｎＭのペルツズマブを処理し、３０分インキュベートした。プレートを４回ＰＢＳ＿ＴＢで洗った。アルカリフォスファターゼ結合型抗ヒト二次抗体を１００μｌのＰＢＳ＿ＴＢ中で１時間インキュベートした。プレートを４回ＰＢＳ＿ＴＢで洗浄した。最後に、新しく用意した１００μｌのフィルターを通したｐＮＰＰ溶媒（３ｍＭ ｐＮＰＰ、５０ｍＭの炭酸水素ナトリウム、５０ｍＭの塩化マグネシウム）を処理し、室温で５分反応させ色素反応を展開させた。吸光度は４０５ｎｍの波長においてＥＬＩＳＡプレート上で検出した。

ＨＥＲ２のドメイン４への競合的結合能の測定をフローサイトメトリーで測定した（図１６）。１０^５個のＢＴ４７４細胞を１００μｌのＰＢＳ＿ＢＡ（ＰＢＳ、０．２％のアジ化ナトリウム、１％のＢＳＡ）中で、１μＭのＧ３又はＨ１４のどちらかと３０分室温でインキュベートした。次に、アレクサ_４８８サクシニミジルエステルでラベルしたアレクサ_４８８−トラスツズマブを１００ｎＭの濃度で処理し、３０分室温でインキュべートした。その後、細胞を２度ＰＢＳ＿ＢＡを用いて洗った。サイフロースペースシステムを用いて、フローサイトメーター測定を行った。細胞の適切なサイズを測定するために前方散乱光／側方散乱光ゲートを設けて、１０^４イベントの細胞を記録した。蛍光強度の中央値をＦｌｏＪｏソフトウェアを用いて測定し、アレクサ_４８８−トラスツズマブ結合のＭＦＩへ標準化させた。Ｇ３はトラスツズマブの結合と競合しないが、その一方でＨ１４及びトラスツズマブは常に似たエピトープと結合し、それゆえ１００％競合結合を示した。

癌細胞の表面におけるＨＥＲ２への二重特異性標的剤の二価の結合は、強力な抗腫瘍活性において必須である。二重特異性剤の結合を確認するために、フローサイトメトリーを用いて完全細胞の結合定数Ｋｏｎ及び解離定数Ｋｏｆｆを測定できる（図１７）（Ｔａｍａｓｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０３、１０１−１３４）。

以下の表２及び３は一重、二重特異性結合剤及びいくつかのＤＡＲＰｉｎの結合親和性を決定したものを示している。

フローサイトメトリー測定のための癌細胞の準備
細胞をコラゲナーゼ及びＥＤＴＡを３７℃で５分処理して剥がした。培地を処理することで溶媒を失活させ、３００ｇで３分遠心した。細胞を温めたＰＢＳ中で２回洗った。細胞の濃度をＣＡＳＹ細胞測定器で測定し、サンプルにつき１０^６細胞に調製した。内部移行を０．２％アジ化ナトリウム及び１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で３７℃で３０分インキュベートすることで阻害した。

フローサイトメーター測定
サンプルを１ｍｌの冷ＰＢＳで再懸濁し、フローサイトメーターで測定した。サンプル毎に１０，０００細胞を記録した。結果を細胞の前方散乱光対側方散乱光でゲートした。緑色蛍光物質をＦＬ１検出器で検出した。データをＦｌｏｗＪｏ７．２．５ソフトウェアで解析した。

癌細胞の表面への二重特異性剤の結合測定
オンレート測定のために、ＢＴ４７４細胞を１０^６個／ｃｍに２．５、７．５及び２２．５ｎＭのＤＡＲＰｉｎ−アレクサフロアー４８８コンジュゲートを含むＰＢＳ＿ＢＡとともに室温で１〜６０分の間のあらかじめ決定しておいた時間インキュベートした。各時点で、１ｍｌの細胞を分取し、ＦＡＣＳで解析した。ラベルしたリガンドコンジュゲートの適用した濃度が非常に薄かったので、そして測定の時間分解能はオンレート測定の正確性を保証するために維持することになるので、サンプルはさらに洗浄せずに測定した。各時点毎に、少なくとも１０^４個の完全細胞（前方散乱光／側方散乱光スキャッタープロットで適切な集団としてゲートされた）を数え、ＭＦＩを記録した。

癌細胞表面への二重特異性剤の解離測定
１０^６個の細胞を各時点で１μＭのアレクサ４８８でラベルした結合剤を含む１００μｌのＰＢＳ（０．２％のアジ化ナトリウム、１％のＢＳＡ）とともに４℃で１時間振とう台上でインキュベートした。１００μｌの細胞懸濁液に対して、１ｍｌのＰＢＳ（０．２％のアジ化ナトリウム、１％のＢＳＡ）中で２度サンプルを洗い、６００ｇで３０秒室温で遠心した。細胞を１００ｎＭに等価の非標識結合剤を含む１ｍｌのＰＢＳ（０．２％のアジ化ナトリウム、１％のＢＳＡ）に再懸濁した。解離反応を各時間（１５、３０、６０、１２０、１８０及び２４０分）室温でインキュベートし、その間は継続して暗室で攪拌を行った。氷上に細胞ペレットを置くことで、解離反応を止めた。各サンプルを冷ＰＢＳ１ｍｌで１度洗浄した。

（実施例４）細胞増殖及び細胞死における一及び二価コンストラクトの構築及び効果に関する追加のデータ

ファージディスプレイ又はリボソームディスプレイによって選択された、ＨＥＲ２の細胞外全長ドメインを捉えるためのＤＡＲＰｉｎは、他のＥＧＦＲファミリーメンバーに交差特異性を示さず、４つのＨＥＲ２サブドメインのＤＡＲＰｉｎがエピトープを形成することを考慮して特徴づけられた。ＤＡＲＰｉｎは一般的に立体的なエピトープを認識するので、サブドメインは単独及び組み合わせで、バキュロシステムを用いて昆虫細胞に発現させた。次の結晶化において糖鎖修飾を最小限にするために、Ｎ結合型糖鎖修飾部位だと予想されるアスパラギン酸残基をアスパラギン残基に置き換えた。このタンパク質上のＥＬＩＳＡはＨＥＲ２−Ｉに位置するＤＡＲＰｉｎ９＿２６及びＤＡＲＰｉｎ９＿２９によって認識されるエピトープを示す。その一方でＤＡＲＰｉｎＧ３はＨＥＲ２−ＩＶに結合する。ＨＥＲ２過剰発現細胞への結合能をフローサイトメーターを用いて測定した比較から、ＤＡＲＰｉｎ９＿２６とＤＡＲＰｉｎ９＿２９は完全に同じエピトープであることが示された。ＤＡＲＰｉｎＧ３はＨＥＲ２のサブドメインＩＶに結合するが、トラスツズマブと競合しない。しかし異なるＨＥＲ２特異的ＤＡＲＰｉｎである、Ｈ１４とは競合し、次いでトラスツズマブと競合する。

様々な二価及び二重特異性コンストラクトを、異なる長さの（Ｇ_４Ｓ）_ｎリンカーを用いて２つのＤＡＲＰｉｎを遺伝子工学的に融合させることで構築した。単一分子を用いて２つの重複しないエピトープを標的とするために、ＤＡＲＰｉｎ９＿２９又はＤＡＲＰｉｎ９＿２６を、２０アミノ酸リンカーを用いてＤＡＲＰｉｎＧ３と結合した。該結合体は、Ｎ末端の細胞外ドメイン−Ｉバインダー及びＣ末端の細胞外ドメイン−ＩＶ結合又はそれらの反対の組合わせをともなう。ＨＥＲ２過剰発現細胞を用いて、４つの異なる二重特異性バインダー（例えば２つのＤＡＲＰｉｎ及び２０アミノ酸を９＿２６−（Ｇ_４Ｓ）_４−Ｇ３とし、６＿２０＿Ｇと省略する）の結合能をテストした。９０ｐＭのＫＤを有するＧ３が、本研究で用いられた３つのＨＥＲ２バインダーの中で最も高い結合能を示した。本研究では、１ｎＭのＫＤの９＿２６及び１ｎＭの９＿２９と比較した。競合ＤＡＲＰｉｎ存在下（再結合を防ぐための）において細胞上で動的試験を行った結果、二重特異性バインダーのオフレートは一重特異性Ｇ３より１０倍以上低いことが明らかとなった（図１８Ａ）。一価構築剤の構築要素と比較すると、二重特異性コンストラクトは解離速度が低くＫＤが高いため、結合活性効果の起因となり、このことから細胞上のＨＥＲ２の二重特異性結合が示唆された。

異なるＤＡＲＰｉｎコンストラクトの細胞増殖及び細胞生存率への影響を、ＨＲＥ２依存細胞株の例としてＢＴ４７４細胞を用いて、ＸＴＴ測定法で測定した。ＢＴ４７４細胞と比べるとＨＥＲ２の発現が著しく低いＭＣＦ７をコントロールとして用いた。校正試験の結果では、シグナルが６０％まで減少しており、未処理の細胞に対してＸＴＴ測定をおこなう前の細胞増殖に対して４日間の細胞増殖の欠失に相当する−大幅な減少は細胞死を示唆していた。ＸＴＴ測定は実施例１で述べた方法で行った。

ＸＴＴ測定を行った結果、様々な細胞に影響を与える一価のＤＡＲＰｉｎは存在しなかった（図１８Ｂ）。２つの異なるＤＡＲＰｉｎを混合しても、コントロールとして使用した二重特異性抗体の片方の分子をＨＥＲ２と結合しないＤＡＲＰｉｎに置き換えたものと同様活性がないことが証明された（ＤＡＲＰｉｎ ｏｆｆ７、マルトース結合タンパク質を標的とする）（図１８Ｃ）。単一特異性二価ＤＡＲＰｉｎＧ＿２０＿Ｇは細胞増殖を活性化すらさせた（図１８Ｃ）。

二重特異性コンストラクトはＮ端末のサブドメインＩとＣ端末のサブドメインＩＶを含み（６＿２０＿Ｇ又は９＿２０＿Ｇ）濃度依存的に７５％に至るまで細胞生存率の減少を示した。その一方で、トラスツズマブは〜５０％まで減少させた（図１８Ｄ）。正反対の方向性のコンストラクト（Ｇ＿２０＿９）は細胞増殖（Ｇ＿２０＿６）への影響を失っているか、又はわずかに細胞増殖を増加させる傾向さえあった。トラスツズマブ同様に、二重特異性コンストラクトはＭＣＦ７細胞の細胞増殖に影響が無かった（図１８Ｅ）。このことから、ＨＥＲ２依存的細胞への観察された効果の制限が示唆された。５、１０、２０、３０及び４０アミノ酸リンカーをともなうコンストラクトの比較から、９＿ｘ＿Ｇコンストラクトはリンカーの長さが増える毎に、特異的な活性と能力が減少した。最も効果のある配列は、たった５つのアミノ酸である（Ｇ_４Ｓ）−リンカーを有する６＿５＿Ｇ又は９＿５＿Ｇであった。それらは、４日の細胞増殖後においてＸＴＴ測定を行った結果、未処理のものと比較すると８０％まで細胞生存率を減少させ、６＿２０＿Ｇ及び９＿２０＿Ｇを１ｎＭ処理したときと比較すると１００ｐＭ以下の濃度で最大半減量を示した。反対に、リンカーの長さが４０アミノ酸より増えると、例えば６＿４０＿Ｇ及び９＿４０＿Ｇなどは、生理活性が減少した（増殖減少がたったの４０％）（図１８Ｆ）。Ｇ＿Ｘ＿６及びＧ＿Ｘ＿９の反転したコンストラクトでは、Ｇ＿Ｘ＿６及びＧ＿Ｘ＿９では不活性又はリンカーの長さが２０アミノ酸の時はむしろ細胞増殖を刺激し、リンカーが短くなれば抗増殖活性を得たが、最も活性を有するものでも、トラスツズマブと同程度の効果しかなかった（図１８Ｇ）。

フローサイトメーターで確認したとおり、単一ＤＡＲＰｉｎ及び二重特異性コンストラクトはＨＥＲ２の内部移行化や分解への影響は無かった。

（実施例５）１つ又は２つの抗体断片をともなう二重特異性ＨＥＲ２結合剤

抗体断片から構築した二重特異性ＨＥＲ２結合剤の細胞毒性を測定するために、ｓｃＦｖ１−リンカー−ｓｃＦｖ２、ＤＡＲＰｉｎ−リンカー−ｓｃＦｖ及びＤＡＲＰｉｎ−リンカー−ｓｃＦｖコンストラクト型の二重特異性コンストラクトを構築した。ここでは、各融合タンパク質は、１つのユニット（ｓｃＦｖ１、ｓｃＦｖ２、ｓｃＦｖ又はＤＡＲＰｉｎ）がドメイン１に結合し、もう１つのユニットがドメイン４に結合する。

ｓｃＦｖ１−リンカー−ｓｃＦｖ２コンストラクトは実施例２に示した通りである。

ドメイン１に結合するｓｃＦｖを構築するために、ｓｃＦｖｃｈＡ２１（Ａ２１）を以下に述べられている方法（Ｈｕ Ｓ．ｅｔａｌ．、（２００８）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ７０：９３８−９４９．）で利用した。ＨＥＲ２との複合体の結晶構造を決定し、このｓｃＦｖがドメイン１に結合することを確かめた。ｓｃＦｖＡ２１の重鎖及び軽鎖のタンパク質配列は、ＰＤＢファイルより得た（ＰＤＢ番号：２ＧＪＪ）。どちらの方向においても、４×ＧＧＧＧＳユニット（ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ、配列番号５４）からなる弾力性のあるグリシン−セリンリンカーは重鎖と軽鎖へとの結合へと導かれる。したがって、前記グリシン−セリンリンカーで結合した、Ｎ末端から重鎖、軽鎖と融合しているもの（Ａ２１ＨＬ、配列番号６５）又は、Ｎ末端から軽鎖、重鎖と融合しているものの２つの方向性を有する（Ａ２１ＬＨ、配列番号６６又は９３）配列が１つのタンパク質配列の中に得られる。

それぞれの遺伝子配列はジーンスクリプト社によって合成され、それらは直接クローニングするためのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIIIクロ−ニングサイトを追加的に含む（以下参照）。

ドメイン４に結合するｓｃＦｖを構築するために、ｓｃＦｖに対する抗体であるｈｕ４Ｄ５を構築した。ＨＥＲ２との複合体中のＦａｂ断片に対応する結晶構造（ｈｕ４Ｄ５、トラスツズマブ、ハーセプチン）を決定し、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．、（２００３）Ｎａｔｕｒｅ４２１：７５６−７６０に述べられている通りｓｃＦｖのドメイン４への結合サイトを決定した。ｓｃＦｖ４Ｄ５を構築するための、重鎖及び軽鎖のタンパク質配列をＰＢＤファイルより得た（ＰＢＤＩＤ：１Ｎ８Ｚ）。４×ＧＧＧＧＳユニット（ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ）の弾力性のあるグリシン−セリンリンカーは重鎖及び軽鎖のどちらの方向においても結合へと導かれる：Ｎ末端から重鎖、軽鎖となっているもの（４Ｄ５ＨＬ、配列番号６７）又はＮ末端から軽鎖、重鎖となっている２つの方向性を有する（４Ｄ５ＨＬ、配列番号６８又は９２）前記グリシン−セリンリンカーで結合した１つのタンパク質配列が得られる。また、代替物をともなう追加のｓｃＦｖ４Ｄ５ＬＨ（配列番号６９）を構築した。

それぞれの遺伝子配列はジーンスクリプト社によって合成され、それらは直接クローニングするためのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIIIクローニングサイトを追加的に含む（以下参照）。

ｓｃＦｖ１−リンカー−ｓｃＦｖ２、ＤＡＲＰｉｎ−リンカー−ｓｃＦ及びｓｃＦ−リンカー−ＤＡＲＰｉｎ融合タンパク質の構築
ＨＥＲ２のドメイン１及びドメイン４の結合部位を含む二重特異性融合タンパク質の遺伝子を構築するために、遺伝子ベクター（ｐＭｘＡＣ）を利用した。このベクターは、ｐＭｘ９（Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ、Ｒ． ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８、３８１９４−３８２０５）が基になっており、大腸菌の周辺質発現のためのＯｍｐＡシグナル配列を含んでいる。ＯｍｐＡシグナル配列は、ｐＤＳｔ０６６ベクター由来のＤｓｂＡシグナル配列によって置き換えられている（Ｓｔｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３８２：１２１１−１１２７参照）。それに加えて、ＤｓｂＡシグナル配列を含むｐＭｘ９ベクターには、新しいマルチプルクローニングサイトが導入され、その制限酵素サイトは弾力性のあるグリシン−セリンリンカーのどちら側にも特異的なクローニングすることができる。それなので、これらのクローニングカセットは、ｐＱｉＢｉ−２２−（４ｘＧＧＧＧｓ弾力性のあるリンカー、配列番号５４）、ｐＱｉＢｉ−１１−（２ｘＧＧＧＧｓ弾力性のあるリンカー、配列番号５２）及びｐＱｉＢｉ−０１−（１ｘＧＧＧＧｓ弾力性のあるリンカー、配列番号５１）（Ｂｏｅｒｓｍａｅｔａｌ．（２０１１）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８６、４１２７３−４１２８５．）由来の異なる長さのバインダーを有する融合タンパク質を構築することができる（Ｂｏｅｒｓｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１１），Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２８６，４１２７３−４１２８５．）。

新しいベクターは、それぞれｐＭｘＡＣ−２２−（４ｘＧＧＧＧｓ弾力性のあるリンカー、配列番号５４）、ｐＭｘＡＣ−１１−（２ｘＧＧＧＧｓ弾力性のあるリンカー、配列番号５２）又はｐＭｘＡＣ−０１−（１ｘＧＧＧＧｓ弾力性のあるリンカー配列番号５１）とした。

これらのｐＭｘＡＣベクターは、Ｎ末端結合コンストラクト（リンカーの上流）を挿入するためのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩクローニングサイト及び、Ｃ末端結合部位を導入するための（リンカーの下流）ＢｇＩＩＩ／Ｂｓａｌサイト（ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩクローニングサイトと互換性のある）を含む。それに加えて、このコンストラクトは精製、検出のためにＣ末端に６×ヒスタグを含み、周辺移行を検出するのためにＭ１ＦＬＡＧタグを含む（Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７、７５４−７６１．）。

ｐＭｘＡＣ−２２ベクターのＯＲＦマップ

凡例、異なる構成要素の説明：

ｓｃＦｖ／ＤＡＲＰｉｎ融合タンパク質の代替ベクター
上記で述べた大腸菌における周辺質発現に加えて、ｓｃＦｖ／ＤＡＲＰｉｎ融合タンパク質の発現は、以前述べたようなマルチバックシステムを用いたスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ９）細胞由来の分泌物を用いて行った（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００６）ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓ３：１０２１−３２．）。要約すると、融合タンパク質をコードしている配列をライゲーション非依存的クローニング（ＬＩＣ）を介してドナーベクターであるｐＦＬｍＬＩＣへサブクローニングし、Ｎ末端溶解シグナル配列を導入する（配列番号９９）。ドナーベクターは融合タンパク質をコードする配列をバクミドＥｍＢａｃＹへ導入するために使用される。Ｓｆ９へインフェクションするためのバキュロウィルスはｓｆ９細胞にバクミドＤＮＡをトランスフェクションすることで構築した。発現段階において、Ｓｆ９細胞は４×１０^６細胞／ｍＬの濃度になるよう培養し、１．７２時間感染後に１ＭＯＩのそれぞれのウィルスを共感染させ、遠心（３０分、５０００ｇ、４℃）をして回収し、上清に対してＮｉ−ＮＴＡスーパーフロー（Ｑｉａｇｅｎ）精製樹脂を用いて固定金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を行った。

以下の表４では、Ｓｆ９細胞又は大腸菌に発現させたｓｃＦｖ／ＤＡＲＰｉｎ融合タンパク質を示している。Ｎ末端の溶解シグナル配列（ＭＶＶＹＩＳＹＩＹ、配列番号９９）はタンパク質分泌時に切断され、精製後のタンパク質には存在しないことを特に言及する。

大腸菌周辺質におけるｓｃＦｖ１−リンカー−ｓｃＦｖ２の発現
ｓｃＦｖ１−リンカー−ｓｃＦｖ２コンストラクトを周辺質シャペロンとともに、大腸菌の周辺質へ共発現させた。この目的のために、ｐＭｓＡＣｓｃＦｖ１−リンカー−ｓｃＦｖ２プラスミドをｐＣＨ−Ａ１プラスミドとともに大腸菌ＳＦ１３０（Ｍｅｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｇｅｏｒｇｉｏｕ（１９９４）；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１２：１１０７−１１１０）へ共形質転換した（Ｓｃｈａｅｆｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０１０）Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏf ｓｃＦｖｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｂｙ ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ、ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ、ｅｄｓ．、Ｖｏｌ．２、２ｎｄｅｄｉｔ．、ｐｐ．３４５−３６１、ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ、ＢｅｒｌｉｎＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。形質転換後、大腸菌のシングルクローンをテリフィックブロス増殖培地（ＴＢ；ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｏｔｏｃｏｌｓ）に一晩順化させ、初期ＯＤ６００が０．１の発現培地１ＬをＴＢ発現培地へと移した。ＳｃＦｖ融合配列発現はイソプロピル−３−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって誘導し、２５℃一晩かけて行った。

大腸菌発現培地からｓｃＦｖ１−リンカー−ｓｃＦｖ２コンストラクトの精製
発現培地を遠心によってペレットにし、トリスバッファー（５０ｍＭのトリスベース、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．５）を用いて洗い、タンパク質分解阻害剤（Ｒｏｃｈｅ−完全タンパク質分解阻害剤混合液）及びＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）を含む冷トリスバッファーに再懸濁した。上記の工程は４℃でおこなった。大腸菌をフレンチプレスでライセートにし、２００００ｇで３０分遠心した。上清の最終濃度が２０ｍＭのイミダゾール、４００ｍＭの塩化ナトリウム、１０％のグリセロール、ｐＨ７．５に合わせ、Ｎｉ−ＮＴＡカラムに処理した。カラムを２０ｍＭイミダゾール、４００ｍＭの塩化ナトリウム、１０％のグリセロールを含む３０ＣＶのトリスバッファー、１Ｍの塩化ナトリウムを含む３０ＣＶのトリスバッファーで高塩濃度を用いて洗い、１０ｍＭの塩化ナトリウムを含む３０ＣＶのトリスバッファーで低塩濃度を用いて洗った。結合画分は、３００ｍＭのイミダゾールを含むトリスバッファーを用いて溶出した。Ｎｉ−ＮＴＡ溶出タンパク質をプロテインＡベンチトップカラムに処理し、０．１％トライトンＸ−１１４を含む８０ＣＶのリン酸緩衝生理食塩水（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＰＢＳ）とともにエンドトキシン洗浄をし、３０ＣＶのＰＢＳとともに洗い、４ＣＶの１００ｍＭのグリシンバッファーｐＨ３．６を用いて、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、４ＣＶの１．５ＭのトリスバッファーｐＨ８の中へ溶出した。タンパク質を濃縮し、ＨＥＰＥＳ培地（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．５）を用いて透析した。

以下の表５に、大腸菌に発現させたｓｃＦｖ１−リンカー−ｓｃＦｖ２コンストラクトを示す。

二重特異性抗体Ａ２１Ｈ４Ｄ５ＬＨＡ２１Ｌ
二重特異性抗体コンストラクトの遺伝子（Ｖｏｌｋｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １４、８１５−８２３に述べたコンストラクトに相似する）は４Ｄ５及びＡ２１のｓｃＦｖ断片に由来するドメインを構築し、ジーンスクリプト社によって合成され、ｐｃＤＮＡ３へ直接クローニングするために、追加のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIIIクローニングサイトをともなう（下記参照）。

二重特異性抗体コンストラクトであるＡ２１Ｈ＿４Ｄ５ＬＨ＿Ａ２１Ｌ（配列番号７９）は第１の部位及び第２の部位を含む。第１の部位は、４Ｄ５軽鎖と結合するＡ２１重鎖を含み、該結合は配列番号５１で特徴づけられるグリシン／セリンリンカーによっている。第２の部位は、Ａ２１軽鎖と結合する４Ｄ５重鎖から構築され、該結合は配列番号５１で特徴づけられるグリシン／セリンリンカーによっている。該二重特異性抗体コンストラクトにおいて、前記第１部位と前記第２部位は配列番号５４で特徴づけられるグリシン／セリンリンカーで結合される（図１９Ａ）。

ＣＨＯ細胞を用いた二重特異性抗体の発現
二重特異性抗体コンストラクトＡ２１Ｈ＿４Ｄ５ＬＨ＿Ａ２１Ｌを発現させるために、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）Ｈｙｇｒｏを基にしたプラスミドベクターを構築した。ポリリンカー（マルチプルクローニングサイト）を合成した。該ポリリンカーは、マウスＩｇκ軽鎖のＮ末端シグナル配列の後にＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIIIクローニングサイトがあり、Ｃ末端に６×ヒスタグを有する（図１９Ｂ）。このベクターを、ｐｃＤＮＡ３．１ｓｅｑｍｌｇＫとした。

インビトロジェンのチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）フリースタイルを無血清増殖停止条件に適応させ、二重特異性抗体コンストラクトを一過的に発現させるために使用した。二重特異性抗体のプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１ＳｅｑｍｌｇＫＡ２１Ｈ＿４Ｄ５ＬＨ＿Ａ２１Ｌ）をＴｒａｎｓＩＴ−Ｐｒｏ（Ｍｉｒｕｓ）トランスフェクション試薬を用いて、製造業者のプロトコールに従ってＣＨＯ細胞に形質転換した。発現はバイオリアクター（シグマ）中で１週間ＣＨＯ−フリースタイル培地（インビトロジェン）で行った。

ＣＨＯ細胞上清からの二重特異性抗体コンストラクトの精製
発現後、上清を遠心して回収し、小容量にするためにろ過し、濃縮した。上清をトリスバッファー（５０ｍＭのトリスベース、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．５）で透析し、その後２０ｍＭのイミダゾール、４００ｍＭの塩化ナトリウム、１０％グリセロールに調整し、Ｎｉ−ＮＴＡベンチトップカラムに処理した。カラムを２０ｍＭのイミダゾール、４００ｍＭの塩化ナトリウム、１０％のグリセロールを含むｐＨ７．５の３０ＣＶのトリスバッファーで洗い、３００ｍＭのイミダゾールを含むｐＨ７．５の２ＣＶのトリスバッファーで溶出した。サンプルを濃縮し（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．５）、ＨＥＰＥＳ培地で透析した。

トラスツズマブに対する二重特異性ＨＥＲ２結合剤の抗腫瘍活性の比較
上記で述べてきたような、二重特異性ＨＥＲ２結合剤の細胞毒活性を調べるために、実施例１において述べたようにＸＴＴ測定を行った。図２０はＢＴ４７４細胞において測定した結果を示している。そして、図２１はＨＣＣ１４１９細胞において測定した結果を示している。以下コントロールをＣＴＲＬとし未処理を意味し、Ａ２１はｓｃＦｖ断片Ａ２１、４Ｄ５はｓｃＦｖ断片４Ｄ５、Ａ２１＋４Ｄ５はｓｃＦｖ断片Ａ２１及びｓｃＦｖ断片４Ｄ５の混合物、そしてＴＺＢはトラスツズマブを意味している。図２１に示される実施例において二重特異性抗体（配列番号７９）は１０ｎＭのみ使用し、その一方でその他の単体は１００ｎＭ使用したことを特に言及する。

以上の結果は、強力な細胞毒性及び／又は抗増殖活性効果のある化合物を得るために、バインダーがあるか、又は抗体断片又はＤＡＲＰｉｎで含むかどうかということを問わず、ＨＥＲのドメイン１のバインダーをリンカーよってＨＥＲ２のドメインのバインダーに結合することで機能するという概念を示している。

さらに、実施例１で示したＴＵＮＥＬ測定を上記において言及した二重特異性ＨＥＲ２結合剤で行った。図２２に示されるとおり、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合はトラスツズマブと比較をすると、有意に高いことが示された。この結果はウェスタンブロット解析でも確認され、該ウェスタンブロットにおいて、ポリＡＤＰリボソームポリメラーゼの切断によってアポトーシスが検出された（図２３）。ウェスタンブロット解析は実施例１において示した方法で行った。

まとめとして、二重特異性ＨＥＲ２結合剤は１つ又は２つの抗体断片を含み、標的細胞に対してトラスツズマブよりアポトーシスを引き起こせることが示された。

（実施例６）共有へリックスによって結合される２つのＤＡＲＰｉｎを含む二重特異性ＨＥＲ２結合剤

二重特異性コンストラクトの原則は、すなわちＨＥＲ２＿I及びＨＥＲ２＿IＶバインダーは２つの異なるＨＥＲ２分子のそれぞれのドメインを接近させるために融合され、原則的に異なる長さの弾力性のあるバインダーをともなって機能する。これに代替するものとして、２つのＤＡＲＰｉｎが異なる角度で厳格に融合されているＤＡＲＰｉｎコンストラクトが確認され、実施例１で述べた様に細胞生存測定の試験された。

試験を行った９つの全てのコンストラクトは９．２９＿ＳＨ＿Ｇ３＃２（配列番号１０２）、９．２９＿ＳＨ＿Ｇ３＃６（配列番号１０３）、９．２９＿ＳＨ＿Ｇ３＃９（配列番号１０４）、９．２９＿ＳＨ＿Ｇ３＃１０（配列番号１０５）、９．２９＿ＳＨ＿Ｇ３＃１１（配列番号１０６）、９．２９＿ＳＨ＿Ｇ３＃１２（配列番号１０７）、９．２９＿ＳＨ＿Ｇ３＃１３（配列番号１０８）、９．２９＿ＳＨ＿Ｇ３＃１４（配列番号１０９）、９．２９＿ＳＨ＿Ｇ３＃１５（配列番号１１０）であり、ＨＥＲ２依存的癌細胞（ＢＴ４７４）に対して強力な抗増殖活性と、抗生存活性を示した。しかし、程度の差はあった。

いかなる理論に拘束されることを望むものではないが、標的（ＨＥＲ２）は膜貫通部位に渡って様々な方向で適応できることが示唆された。さらに、全ての異なる方向性においても、結合受容体の２つの膜貫通へリックスはキナーゼ活性を抑制するために十分な距離を保っている。この構造は、ＨＥＲ２＿ＩとＨＥＲ２＿ＩＶに結合されるエピトープ及びこれらのエピトープが結合する部位に柔軟性を与える。

Claims (5)

1. ａ．ＨＥＲ２の細胞外ドメイン１に結合する第１のポリペプチドリガンドであり、ここで前記第１のポリペプチドリガンドはＤ１結合部位を通じてＨＥＲ２細胞外ドメイン１と接触する第１のポリペプチドリガンドと、
   ｂ．ＨＥＲ２の細胞外ドメイン４に結合する第２のポリペプチドリガンドであり、ここで前記第２のポリペプチドリガンドはＤ４結合部位を通じてＨＥＲ２細胞外ドメイン４と接触する第２のポリペプチドリガンドと、
   ｃ．前記第１のポリペプチドリガンド及び前記第２のポリペプチドリガンドを共有結合的に付着させるリンカーであり、ここで前記リンカーは、前記Ｄ４結合部位及び前記Ｄ１結合部位の間に７５オングストロームより短い空間的隔離を可能にすることで選択されるリンカーを含み、
   ｄ．前記第１のポリペプチドリガンドが
   ｉ．配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６及び配列番号９３
   からなる群から選ばれる配列であり、
   ｅ．前記第２のポリペプチドリガンドが
   ｉ．配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、及び配列番号９２
   からなる群から選ばれる配列であり、
   前記リンカーは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０アミノ酸からなり、
   前記第１のポリペプチドリガンド及び前記第２のポリペプチドリガンドがオリゴペプチドリンカーによって互いに付着され、前記第１のポリペプチドリガンド、前記第２のポリペプチドリガンド及び前記リンカーは１つの連続したポリペプチド鎖を形成する前記リンカーによって互いに付着され、
   前記リンカーはポリグリシン／セリンリンカーであり、特にｎが１、２、３、４又は５であるアミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）ｎによって特徴づけられる、
   癌を治療又は予防する方法に使用するための二重特異性ＨＥＲ２標的剤。
2. 前記第１のポリペプチド配列が前記連続したポリペプチド鎖のＮ末端に配置され、前記第２のポリペプチド配列が前記連続したポリペプチド鎖のＣ末端に配置され、及び前記リンカーは前記第１及び第２のポリペプチドリガンドの間に配置される、請求項１に記載の癌を治療又は予防する方法に使用するための二重特異性ＨＥＲ２標的剤。
3. 前記第１のポリペプチドリガンド及び前記第２のポリペプチドリガンドがクロスリンカーによって互いに共有的に付着される、請求項１〜２のいずれかに記載の癌を治療又は予防する方法に使用するための二重特異性ＨＥＲ２標的剤。
4. 前記リンカーは６５オングストローム、６０オングストローム、５５オングストローム、５０オングストローム、４５オングストローム、４０オングストローム、３５オングストローム、３０オングストローム、２５オングストローム、２０オングストローム、１５オングストローム、１０オングストローム若しくは５オングストロームと同じ長さ又はそれよりも短い長さを有する、
   請求項１〜３のいずれか１項に記載の癌を治療又は予防する方法に使用するための二重特異性ＨＥＲ２標的剤。
5. ａ．ＡＵ５６５、ＢＴ４７４、ＨＣＣ１４１９、ＨＣＣ２２１８、ＳｋＢｒ３及び／又はＺＲ７５３０から選択される細胞の生存率の低下を導き、前記低下はトラスツズマブを用いて同様に処理することにより達成される低下よりも高く、
   ｂ．ＡＵ５６５細胞株の細胞とともにインキュベートするとき、ウェスタンブロットにおいて、ＨＥＲ２−Ｙ１２４８、ＨＥＲ３−Ｙ１２８９、ＡＫＴ−Ｓ４７３、ＥＲＫ１／２−Ｔ２０２／Ｙ２０４及び／又はＰＡＲＰのシグナル低下を導き、
   ｃ．ＨＣＣ１４１９細胞株とともにインキュベートするとき、ウェスタンブロットにおいて、ＨＥＲ２−Ｙ１２４８、ＨＥＲ３−Ｙ１２８９、ＡＫＴ−Ｓ４７３及び／又はＥＲＫ１／２−Ｔ２０２／Ｙ２０４のシグナル低下を導き、
   ｄ．ＨＣＣ２２１８細胞株とともにインキュベートするとき、ウェスタンブロットにおいて、ＨＥＲ２−Ｙ１２４８、ＨＥＲ３−Ｙ１２８９、ＡＫＴ−Ｓ４７３及び／又はＥＲＫ１／２−Ｔ２０２／Ｙ２０４のシグナル低下を導き、
   ｅ．ＺＲ７５３０細胞株とともにインキュベートするとき、ＨＥＲ２−Ｙ１２４８、ＨＥＲ３−Ｙ１２８９、ＡＫＴ−Ｓ４７３、ＥＲＫ１／２−Ｔ２０２／Ｙ２０４及び／又はＰＡＲＰのシグナル低下を導き、又は
   ｆ．示される細胞株とともにインキュベートするとき、ＢＴ４７４細胞の少なくとも４０％、ＡＵ５６５細胞の少なくとも８％、ＨＣＣ１４１９細胞の少なくとも２０％及び／又はＨＣＣ２２１８細胞の少なくとも２０％のアポトーシスの誘導を導く、
   請求項１〜４のいずれか１項に記載の癌を治療又は予防する方法に使用するための二重特異性ＨＥＲ２標的剤。
   

Images