JP6900354B2 - 癌治療のための二重特異性her2リガンド - Google Patents
癌治療のための二重特異性her2リガンド Download PDFInfo
- Publication number
- JP6900354B2 JP6900354B2 JP2018205732A JP2018205732A JP6900354B2 JP 6900354 B2 JP6900354 B2 JP 6900354B2 JP 2018205732 A JP2018205732 A JP 2018205732A JP 2018205732 A JP2018205732 A JP 2018205732A JP 6900354 B2 JP6900354 B2 JP 6900354B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- her2
- bispecific
- linker
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
Drebinと同僚はラットneu遺伝子産物に対する抗体を構築した、p185〈neu〉米国特許出願公開第6733752号明細書参照。
近年、代替標的タンパク質が提案されており、それらはヒト免疫グロブリン由来の抗体断片及び抗体由来コンストラクト若しくは形成物よりも分子構造に多様性が有る。そして、それ故異性二量体や多量体などの構造物を作ることで追加的な分子構造を作ることができ、新しい生理学的機能を付与することが可能となる。いくつかのそのような標的タンパク質は、以下に示される((Binz et al.、Nat.Biotech 2005、Vol23:1257−11268)参照)。そのような標的タンパク質の非限定的な例は、ラクダ抗体、タンパク質Aドメインに由来するタンパク質の足場(「アフィボディー」とよばれる、Affibody AB)、テンダスタット(アルファアミラーゼ阻害剤、ストレプトマイセス テンデ(Streptomyces tendae)由来のアルファアミラーゼ阻害剤74アミノ酸βシートタンパク質)、フィブロネクチン、リポカリン(「アンチカリン」、Pieris)、T細胞受容体、アンキリン(DARPinとよばれる設計されたアンキリン反復タンパク、チューリッヒ大学とモレキュラーパートナー 米国特許出願公開第20120142611号明細書参照)、様々な受容体のA−ドメイン(「アビマー」、Avidia)及びPDZドメイン、フィブロネクチンドメイン(FN3)(「アドネクチン」、Adnexus)、共通フィブロネクチンドメイン(「センチリンズ」、Centyrex/Johnson&Johnson)、ユビキチン(「アフィリンズ」、SCIL proteins)、及びノッティンズ(Moore and Cochrane、Methods in Enzymology 503(2012)、223−251とこれに記載される引用文献参照)である。
a.HER2の細胞外ドメイン1に結合する第1のリガンドと、
b.HER2の細胞外ドメイン4に結合する第2のリガンドと、
c.前記第1のリガンド及び前記第2のリガンドをつなぐリンカー
を含む、二重特異性剤が提供される。
a.HER2の細胞外ドメイン1に結合する第1の結合部位と、
b.HER2の細胞外ドメイン4に結合する第2の結合部位と、及び、
c.上記の第1の結合部位及び第2の結合部位を共有結合でつなぐリンカー
を含むポリペプチドが提供される。
a.HER2の細胞外ドメイン1と結合する第1のポリペプチドリガンドと(配列番号01)、
b.HER2の細胞外ドメイン4と結合する第2のポリペプチドリガンドと(配列番号02)、
c.上記の第1のポリペプチドリガンドと第2のポリペプチドリガンドを共有結合的に付着するリンカー
とを含む二重特異性HER2標的剤が提供される。
QVCT GTDMKLRLPA SPETHLDMLR HLYQGCQVVQ GNLELTYLPT NASLSFLQDI QEVQGYVLIA HNQVRQVPLQ RLRIVRGTQL FEDNYALAVL DNGDPLNNTT PVTGASPGGL RELQLRSLTE ILKGGVLIQR NPQLCYQDTI LWKDIFHKNN QLALTLIDTN RSRACHPCSP MCKGSRCWGE SSEDCQSLTR TVA.
VNCS QFLRGQECVE ECRVLQGLPR EYVNARHCLP CHPECQPQNG SVTCFGPEADQCVACAHYKD PPFCVARCPS GVKPDLSYMP IWKFPDEEGA CQP
a.免疫グロブリンFab断片、
b.免疫グロブリンscFv断片、
c.免疫グロブリンの可変領域(抗体ドメイン)、
d.ヒト化ラクダ類抗体、
e.タンパク質Aドメイン由来のポリペプチド、
f.ファイブロネクチンドメインFN3由来のポリペプチド、
g.コンセンサスファイブロネクチン由来のポリペプチド、
h.リポカリン由来のポリペプチド、
i.アルマジロ反復タンパク質由来のポリペプチド、
j.テトラトリコペプチド反復タンパク質由来のポリペプチド、
k.富ロイシン反復タンパク質由来のポリペプチド、
l.ジンクフィンガー由来のポリペプチド、
m.Src相同ドメイン2(SH2)由来のポリペプチド、
n.Src相同ドメイン3(SH3)由来のポリペプチド、
o.PDZドメイン由来のポリペプチド、
p.ガンマクリスタリン由来のポリペプチド、
q.ユビキチン由来のポリペプチド、
r.システインノットポリペプチド由来のポリペプチド、
s.ノッチン由来のポリペプチド、
t.HER2のドメイン1又はドメイン4に結合するランダムペプチドライブラリーから選ばれるペプチド
から選ばれる。
a.HER2のドメイン1に結合する第1のFab断片及びHER2のドメイン4に結合する第2のFab断片を含む二重特異性IgG、
b.HER2のドメイン1に結合するVHドメイン及びHER2のドメイン4に結合するVLドメインを含むIgG、
c.HER2のドメイン4に結合するVHドメイン及びHER2のドメイン1に結合するVLドメインを含むIgG、
d.HER2のドメイン1に結合する第1のscFv断片、HER2のドメイン4に結合する第2のscFv断片及び前記第1のscFv断片並びに前記第2のscFv断片を結合するリンカーを含むコンストラクト、
e.HER2のドメイン1に結合する第1の結合部位及びHER2のドメイン4に結合する第2の結合部位を有する二重特異性抗体、
f.本発明の上記の実施例に記載のリストから選択されるHER2のドメイン1を標的とするポリペプチドリガンド、又はHER2のドメイン1と結合するペプチドライブラリーから選択される5〜35アミノ酸のペプチドリガンドと結合するHER2のドメイン4を標的とするIgGであって、前記ポリペプチドリガンド又はペプチドリガンドは
i. 前記IgGの重鎖のN末端、
ii. 前記IgGの重鎖のC末端、
iii. 前記IgGの軽鎖のN末端、若しくは
iv. 前記IgGの軽鎖のC末端
に結合する前記IgG
g.本発明の上記の実施態様に記載のリストから選択されるHER2のドメイン4を標的とするポリペプチドリガンド、又はHER2のドメイン1と結合するペプチドライブラリーから選択される5〜35アミノ酸のペプチドリガンドと結合するHER2のドメイン1を標的とするIgGであって、前記ポリペプチドリガンド又はペプチドリガンドは
i. 前記IgGの重鎖のN末端、
ii. 前記IgGの重鎖のC末端、
iii. 前記IgGの軽鎖のN末端、若しくは
iv. 前記IgGの軽鎖のC末端、
と結合する前記IgG
から選ばれる二重特異性抗体が提供される。
− HER2のドメイン4に結合するVHドメイン及びHER2のドメイン1に結合するVLドメイン並びに2つのドメインと結合するリンカー、又は
− HER2のドメイン4に結合するVHドメイン、HER2のドメイン1に結合するVLドメイン及び2つのドメインと結合するリンカー
を排他的に含む二重特異性IgGである。
配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66及び配列番号93
からなる群から選ばれる配列を含む又は該配列である。
配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号67、配列番号68、配列番号69及び配列番号92
からなる群から選ばれる配列を含む、又は該配列である。
a)第1のポリペプチドリガンドは部分的又は全体的に、
i.第1のD1エピトープ(ドメイン1)であって、アミノ酸残基E87、N89、Y90、L132、R135、D143、I145、W147、K148、L157、A158、L159、T160、L161及びI162をHER2のアミノ酸配列中に含む該第1のD1エピトープ、
ii.第2のD1エピトープであって、アミノ酸残基D88、A93、V94、I133、Q134、Q142、T144、L146、F151、H152、K153、N154、Q156及びD163をHER2のアミノ酸配列中に含む該第2のD1エピトープ、
iii.配列番号55配列によって特徴づけられる第3のD1エピトープ、
iv.第4のD1エピトープであって、アミノ酸残基P100、L101、N102、N103、T104、R135、N136、P137、Y141、D143、T144を含む該第4のD1エピトープ、
又は
v.HER2のドメイン1のD1エピトープ(配列番号01)であって、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66及び配列番号93から選択されるポリペプチドによって、D1エピトープとの結合が競合する該HER2のドメイン1のD1エピトープ
と相互作用する第1のポリペプチドリガンド
及び/又は
b)前記第2のポリペプチドリガンドは部分的又は全体的に
i.第1のD4エピトープ(ドメイン4)であって、アミノ酸残基F512、E521、V524、L525、Q526、Y532、V533、N534、A535、R536、D549、G550、S551、V552、C554、F555及びV563をHER2のアミノ酸配列中に含む該第1のD4エピトープ、
ii.第2のD4エピトープであって、アミノ酸残基C522、R523、T553、C562及びA564をHER2のアミノ酸配列中に含む該第2のD4エピトープ、
iii.配列番号56配列によって特徴づけられる第3のD4エピトープ、
iv.配列番号57配列によって特徴づけられる第4のD4エピトープ、
v.第5のD4エピトープであって、アミノ酸残基P557、E558、A559、D560、Q561、D570、P571、P572、F573、P595、D596、E597、E598、G599、A600、C601、Q602及びP603をHER2のアミノ酸配列中に含む該第5のD4エピトープ、又は、
vi.HER2のドメイン4のD4エピトープ(配列番号02)であって、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号67、配列番号68、配列番号69及び配列番号92から選択される配列を有するポリペプチドによってD4エピトープへの結合と競合する、該HER2のドメイン4のD4エピトープ
と相互作用する第2のポリペプチドリガンドである。
a)第1のポリペプチドリガンドはアンキリン反復ポリペプチドであり、そして第2のポリペプチドリガンドは抗体、抗体断片、抗体可変領域ドメイン又は以下のa、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、n、o、p、q、r、s、tから選ばれる又は上記の実施態様で引用されポリペプチドリガンド、又は、
b)第1のポリペプチドリガンドは抗体、抗体断片、抗体可変領域又は以下のa、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、n、o、p、q、r、s、tから選ばれる又は上記の実施態様に引用されるポリペプチドリガンド又は、第2のポリペプチドリガンドがアンキリン反復ポリペプチドを基にしたポリペプチドである。
a)第1のポリペプチドリガンドは以下のa、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、n、o、p、q、r、s、又はtから選ばれるポリペプチドリガンド又は上記の実施態様において引用されるものであり、第2のポリペプチドリガンドは抗体、抗体断片、又は抗体の可変領域、又は、
b)第1のポリペプチドリガンドは抗体、抗体断片又は抗体の可変領域であり、第2のポリペプチドリガンドは、a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、n、o、p、q、r、s、又はtから選ばれるポリペプチドリガンド又は上記の実施態様において引用される。
a)第1のポリペプチドリガンドはD1結合サイトを介してHER2の細胞外ドメイン1と結合し、
b)第2のポリペプチドリガンドはD4結合サイトを介してHER2の細胞外ドメイン4と結合し、及び、
c)リンカーは以下の空間に存在し、言い換えればD1結合サイト及びD4結合サイトの最大距離は80オングストローム、75オングストローム、70オングストローム、65オングストローム、60オングストローム、55オングストローム、50オングストローム、45オングストローム、40オングストローム、35オングストローム、30オングストローム、25オングストローム、20オングストローム、15オングストローム、10オングストローム又は5オングストローム以下である。
a)HER2の細胞外ドメイン1に結合する第1のポリペプチドリガンド、
b)HER2の細胞外ドメイン4に結合する第2のポリペプチドリガンド、及び、
c)前記第1のポリペプチドリガンド及び前記第2のポリペプチドリガンドが前記第1のポリペプチドリガンド及び前記第2のポリペプチドリガンドと共通の構造要素で共有結合的に結合している
二重特異性HER2標的剤が提供される。
配列番号03、配列番号04、配列番号05、配列番号06、配列番号07、配列番号08、配列番号09、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109及び配列番号110から選択される配列によって特徴づけられる該二重特異性HER2標的剤である。
本発明の二重特異性剤は最小で3つのユニットから構築される。第1に、二重特異性結合剤は、HER2の細胞外ドメイン(細胞外ドメイン)のドメイン1を標的とする結合ユニットを含む。第2に、二重特異性結合剤は、HER2の細胞外ドメインのドメイン4を標的とする結合ユニットを含む。第3に、リンカーユニット又はリンカーを二重特異性結合剤はHER2の標的ドメイン1及び4の間に有し、該リンカーユニット又はリンカーの適切な長さは両結合ユニットの性質に依存する。
DARPin9.26又は9.29とDARPinG3又はH14との短い弾力性のあるリンカーによる結合に関する例が提供される一方で、当業者は本明細書によって提供された情報を照らして、該DARPinのいずれか又は両方を第1のドメイン又は第4のドメインそれぞれの重複するエピトープに結合する他の足場、Fab断片又はscFv断片又は抗体断片によって置き換えることができる。結合タンパク質の方向性が構造モデル又は実験的な構造決定から知られていない場合、本明細書に提示される情報を考慮し、両結合体(バインダーA−FL−バインダーB及びバインダーA−FL−バインダーB)が構築され、試される。二重特異性標的剤の構造原理からして、当業者であれば結合や結合ユニットによる構築部位を置き換えることができる。
本発明はHER2特異的分子クロスリンカーが、HER2の二量体化を抑制することなくHER2相同二量体を不活性化させる機能を有する結合分子を基にしている。したがって、本発明の標的分子の活性化機構はこれまで述べてきたHER2指向性治療とは根本的に異なる。本発明の前記剤はHER2の相同二量体化を誘導し、これまで述べてきた方法で結合させることでシグナル不活性化を引き起こす。本明細書に示される例はHER2の細胞内部位の重要なチロシン残基の脱リン酸化を示している。それゆえ、HER2の相同二量体化はMAPK経路を介した下流シグナルを強力に減少させるが、そのことはMAP−キナーゼ細胞外シグナル制御Erk1及び2(Erk1/2)の脱リン酸化により直接示されている。
結合分子は、アンキリン反復タンパク質ライブラリーのリボソームディスプレイセレクションを用いて得た。該結合分子は、HER2の全長細胞外ドメイン(細胞外ドメイン HER2)と特異的に結合するためのものであり、前記方法は以前示した方法である(Zahnd et al.(2006)J.Biol.Chem.279、18870−18877)。
独立したドメインへのバインダーを得るために、バキュロ発現システムを用いて、HER2の異なる独立したドメインを昆虫細胞へそれぞれ発現させた。それゆえ、選択されたバインダーは目的のドメインに直接結合することが保証されている。簡単に説明すると、バキュロバイラルベクターを用いて、N末端メリッティンシグナル配列(MKFLVNVALVFMWYISYIYA、配列番号101)及びN末端ヒス6タグを有するリコンビナントErbB2−エクトドメインをスポドプテラ・フルギペルダ(Sf9)細胞に発現させるものである。Sf9細胞は4×106個/mlの濃度で増殖させ、1.72時間感染後に1MOIのそれぞれのウィルスをともに感染させ、感染後の細胞を遠心で集め(30分、5000g、4℃)、上清をNi−NTAスーパーフロー精製樹脂固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー(IMAC)にかけた。
リボソームディスプレイは以下の公開されたプロトコールに従った(Dreier et al.(2012)MethodsMol.Biol.805、261−286、Zahnd et al.(2007)Nat.Methods4、269−279.)。一般的に3回又は4回行なった。以下のプロトコールに詳しく述べられているとおり(Dreier et al.(2012)MethodsMol.Biol.805、261−286、Zahnd et al.(2007)Nat.Methods4、269−279)、第1の工程は通常プレート上で行い、残りの選択工程はプレート上又は溶液中で行い、そこでビオチン化HER2標的物はストレプトアビジン被覆磁気ビーズと結合させた。上記のことは、以下のプロトコールに詳細に述べられている(Dreier et al.(2012)Methods Mol.Biol.805,261−286;Zahnd et al.(2007)Nat.Methods 4,269−279.)。
DARPinライブラリーのファージディスプレイは公開されているプロトコールに従った(Steiner et al.(2008)J.Mol.Biol.382、1211−1227)。様々なビオチン化HER2コンストラクトの固定化は上記で述べてきた通りである。
第1の選択サイクルを溶媒中で行うとき、第1の選択工程においてファージDARPinライブラリーのおおよそ2.5×1013個のファージ粒子と、2mlのPBSTBに入れた100nMのビオチン化標識タンパク質とともに1時間インキュベートした。次の工程では、おおよそ1012個のファージ粒子を使用した(下記参照)。その後ファージ−抗体複合体を100μlのストレプトアビジンでコートしたパラマグネティックビーズ(10m/ml)上で20分捕捉した。PBST(PBS、0.1%ツイーン−20)で8回洗った後、ファージ粒子を200μlの100mMトリチルアミン(Et3N、pH調整なし)で6分溶出し、200μlの100mMのグリシン塩酸、pH2で10分溶出した。溶出物は100μlの1Mのトリス塩酸、pH7又は18μlの2Mトリスでそれぞれ平衡化させ、指数関数的に増殖する大腸菌XLブルー細胞に感染させるために、混合及び使用した。37℃で1時間振とう後、10μg/mlのクロラムフェニコールを含む50mlの新鮮な2YT培地(5gの塩化ナトリウム、10gの大腸菌抽出物、16gのトリプトン/L)を用いて細胞を増やし、37℃で振とうをさせながらインキュベートした。最大5時間(OD600=0.5に達すればより短時間)後に、最終濃度が0.2Mとなるようイソプロピル−3−D−チオガラクトサイド(IPTG)を処理し、15分後にVCSM13ヘルパーファージを1010pfu(プラーク形成単位)/ml(感染多重度20)感染させることでファージライブラリーレスキューした。カナマイシンを処理せず、細胞を37℃で一晩増殖させた。細胞を遠心で除き(5600g、4℃、10分)40mlの培養上清を、1/4量の冷PEG/塩化ナトリウム(20%ポリエチレングリコール(PEG)6000、2.5Mの塩化ナトリウム)溶液とともに1時間氷上でインキュベートした。そして遠心(5600g、4℃、15分)を行うことで沈殿させたファージ粒子を集め、2mlのPBS中に溶解させ、第2の選択工程で使用した。
第1の選択サイクルでは、ファージDARPinライブラリーにおけるおおよそ3.5×1013のファージ粒子を固相化標的タンパク質(プラスチック表面に直接固相化したニュートラビジンに結合させたビオチン化標的タンパク質)を含む免疫チューブに処理し、回転させながら2時間ローテートした。チューブを10回PBSTで洗浄し、ファージ粒子を500μLの100mMのEt3N(pH調整なし)で6分、続いて500μLの100mMのグリシン−塩酸、pH2で10分溶出した。溶出物を250μLの1Mのトリス−塩酸pH7、又は45μLの2Mのトリスベースそれぞれで平衡化させ、指数関数的に増殖する13mlの大腸菌XL1ブルー細胞に感染させるために組み合わせ、使用された。37℃で1時間振とうさせた後、10μgのクロラムフェニコール(cam)を含む130mlの新鮮な2YT培地中で、37℃で振とうし増殖させた。ファージの増殖と沈降反応は上記と同様に行った。
HER2に結合するための単鎖抗体断片(scFv)を、人工合成ヒト抗体断片ライブラリーであるHuCAL−1(Knappik et al.、2000)から選択した。該単鎖抗体断片は分子量30kDaである。このライブラリーは、2×109メンバーの多様性を有する(Knappik et al.、JMB、2000、296(1)、57−86)。M13ファージが提示するHuCAL−1scFvライブラリーは、g3pコートタンパク質のCTドメインと融合するとして、水溶性ビオチン化HER2ドメイン1又は4と結合させるために選択された。該HER2ドメイン1又は4は上記の方法でマイクロタイターウェル上のニュートラビジン又はストレプトアビジンに固相化した。
上記に記した方法で、HER2ドメイン1又はドメイン4のどちらにも結合する抗体scFv断片をELISAを用いて同定した。これらのscFv断片から、一連の二重特異性scFv1−リンカー−scFv2コンストラクト(二重特異性直列scFv)は常にHER2ドメイン1バインダー及びHER2ドメイン4バインダーが結合しており(どのような方向性であっても)、以下のように構築される。全てのHuCALscFv断片は共通した内部制限酵素サイトがあるので、pHu202というベクターを構築することができる。該ベクター中の、上流のscFv配列は弾力性のあるリンカーを介して下流の断片と結合する。該断片はシグナル配列を有していないので、その結果としてphoA−scFv1−リンカー−scFv2の配列となり、そこではphoAが分泌シグナルとなる。リンカー部位はユニーク制限サイトを介して交換することができる。該リンカーは、断片の中のNot1及びSfilnoの付近に組み込まれる。従って、可能性のある活性型二重特異性抗体全ての組合わせは、リンカー−scFv2ユニットを、scFv1の下流であるphoA−scFv1を含む分泌ベクターへ連結させることで簡易に構築した。活性のある組合わせを同定後、リンカーを異なる長さの一連のリンカーと交換し、Not1とSfilを介して結合させることでリンカーを前記コンストラクトの中で計画的に変更した。
二重特異性抗体のクローニングは、タンデムscFvのクローニングと相似しているが、しかし幾つかの重要な相違点がある。2つの遺伝子phoA−VH1−VH2、続いてphoA−VH2−VH1を複製する必要がある。単純に、2つのプロモーターを選択する。該プロモーターはそれぞれ1つの遺伝子をドライブする。VH1及びVL1はsvFv1の重鎖、軽鎖の可変部位であり、VH2及びVL2はsvFv2の重鎖、軽鎖の可変部である。しかし、二重特異性抗体において、前記重鎖及び軽鎖はここでは他のscFvの相補鎖と結合している。合成HuCALライブラリーのモジュール性は、合成遺伝子の中に保存された制限酵素配列をともない、クローニングを非常に容易にする。周知ではあるが、独特な制限酵素サイトを利用して、scFv断片中のVH(又はVL)を交換することだけを必要とする。scFv断片におけるVHとVLは独特な該制限酵素サイトによって平滑化される(Knappiketal.、2000)。カセット全体である、プロモーター−phoA−VH1−リンカー−VH2はpDia203の中に新たに構築されたNot1とSfiL部位によって平滑化され、その一方でpDia203は同部位がscFv発現部位の下流であるよう設計されている。それなので、完全なプロモーター−phoA−VH1−リンカー−VH2ユニットはすでにプロモーター−phoA−VH2−リンカー−VH1を含むベクターへクローニングされうる。したがって、二重特異性剤の両鎖は同じプラスミド上にコードされている。二重特異性剤の両鎖は、それらが組み立てられる近傍に分泌される。
結合剤は、酵素結合免疫吸着法(ELISA)によって特徴づけられた。各結合剤それぞれすべての結合を明らかにするためにELISAを行った。該ELISAでは、コートのためにHER2の細胞外ドメイン全長を使用した。HER2のこの部位へ特異的に結合するDARPinを明らかにするために、ELISAを行った。該ELISAでは、トランケート型のHER2細胞外ドメイン(ドメイン1−3)を標的とした。この方法は、本来9XXシリーズのバインダー(HER2_509に由来する分子)を回収するために適用された。ドメイン4バインダーG3及びH14はHERの全長細胞外ドメインの結合によって同定されたが、ドメイン1及び3のみから構築されるHER2のトランケート細胞外ドメインとは結合しない。
9XXコレクションの結合剤のエピトープを特徴づけるために、競合結合解析をおこなった。9.01バインダーを除き、9XXコレクションの全ての結合剤は、HER2のドメイン1における類似したエピトープへの結合において競合する。ドメイン4結合剤と、トラスツズマブとの競合結合FACS解析も行った。競合、非競合結合剤の集合を同定した。重要なことに、トラスツズマブエピトープへの結合は、二重特異性分子(G3はトラスツズマブと結合において競合しない)の抗腫瘍活性に必要ではない。バインダーH14はG3と競合し、トラスツズマブと競合を示す。
二重特異性分子の遺伝子又はコード配列をpQiBi−01−(又は−11−、−12−、−22−、−23−、−33−)ベクターの中に構築した。N末端の結合分子におけるBamHI/HindIII制限サイトとC末端の結合分子におけるBglII/BsaI制限サイトに対して通常の制限消化及びライゲーション技術を用いた。このベクターはpQE30に由来しているが、laclq遺伝子とユニーク制限酵素サイト(それぞれBamHI/HindIII及びBglII/BsaI)を有する。該制限酵素サイトは、上流に1つのバインダーを複製し、もう一方の下流にBamHI/HindIIIを介してリンカーを下流に複製するためのものである。前記の数字はそれぞれのリンカーの長さを示し、それぞれのユニットは(Gly4Ser)ユニットである。例えば、pQiBi−22−ベクターはバインダーの間に4つの(Gly4Ser)ユニットを有する。
二重特異性結合剤は分子量、単量体状態、HER2の細胞外ドメインへの結合などの品質管理測定を通過した。予想通り、トラスツズマブ−競合バインダー(例えば、DARPinH14)を含む二重特異性結合剤は、二重特異性物中のトラスツズマブとも競合した。予想通り、二重特異性バインダーは、トラスツズマブ−競合ユニットを含んでおらず、二重特異性物中においても競合を示さなかった。全長のHER2細胞外ドメインを標的として用いて、全ての二重標的結合剤と、ペルツズマブに対しても競合ELISAを行った。ELISAにおいて、全長のHER2の細胞外ドメインに対してペルツズマブと競合的に結合する二重特異性剤はなかった。HER2を過剰発現させた生存可能な細胞の表面に対する結合は、フローサイトメーターを用いて示された。
細胞をコラゲナーゼ及びEDTAを37℃で5分処理して剥がした。培地を処理することで溶媒を失活させ、300gで3分遠心した。細胞を温めたPBS中で2回洗った。細胞の濃度をCASY細胞測定器で測定し、サンプルにつき106細胞に調製した。内部移行を0.2%アジ化ナトリウム及び1%BSAを含むPBS中で37℃で30分インキュベートすることで阻害した。
サンプルを1mlの冷PBSで再懸濁し、フローサイトメーターで測定した。サンプル毎に10,000細胞を記録した。結果を細胞の前方散乱光対側方散乱光でゲートした。緑色蛍光物質をFL1検出器で検出した。データをFlowJo7.2.5ソフトウェアで解析した。
オンレート測定のために、BT474細胞を106個/cmに2.5、7.5及び22.5nMのDARPin−アレクサフロアー488コンジュゲートを含むPBS_BAとともに室温で1〜60分の間のあらかじめ決定しておいた時間インキュベートした。各時点で、1mlの細胞を分取し、FACSで解析した。ラベルしたリガンドコンジュゲートの適用した濃度が非常に薄かったので、そして測定の時間分解能はオンレート測定の正確性を保証するために維持することになるので、サンプルはさらに洗浄せずに測定した。各時点毎に、少なくとも104個の完全細胞(前方散乱光/側方散乱光スキャッタープロットで適切な集団としてゲートされた)を数え、MFIを記録した。
106個の細胞を各時点で1μMのアレクサ488でラベルした結合剤を含む100μlのPBS(0.2%のアジ化ナトリウム、1%のBSA)とともに4℃で1時間振とう台上でインキュベートした。100μlの細胞懸濁液に対して、1mlのPBS(0.2%のアジ化ナトリウム、1%のBSA)中で2度サンプルを洗い、600gで30秒室温で遠心した。細胞を100nMに等価の非標識結合剤を含む1mlのPBS(0.2%のアジ化ナトリウム、1%のBSA)に再懸濁した。解離反応を各時間(15、30、60、120、180及び240分)室温でインキュベートし、その間は継続して暗室で攪拌を行った。氷上に細胞ペレットを置くことで、解離反応を止めた。各サンプルを冷PBS1mlで1度洗浄した。
HER2のドメイン1及びドメイン4の結合部位を含む二重特異性融合タンパク質の遺伝子を構築するために、遺伝子ベクター(pMxAC)を利用した。このベクターは、pMx9(Rauchenberger、R. et al.(2003)J.Biol.Chem.278、38194−38205)が基になっており、大腸菌の周辺質発現のためのOmpAシグナル配列を含んでいる。OmpAシグナル配列は、pDSt066ベクター由来のDsbAシグナル配列によって置き換えられている(Steiner et al.(2008)J.Mol.Biol.,382:1211−1127参照)。それに加えて、DsbAシグナル配列を含むpMx9ベクターには、新しいマルチプルクローニングサイトが導入され、その制限酵素サイトは弾力性のあるグリシン−セリンリンカーのどちら側にも特異的なクローニングすることができる。それなので、これらのクローニングカセットは、pQiBi−22−(4xGGGGs弾力性のあるリンカー、配列番号54)、pQiBi−11−(2xGGGGs弾力性のあるリンカー、配列番号52)及びpQiBi−01−(1xGGGGs弾力性のあるリンカー、配列番号51)(Boersmaetal.(2011)、J.Biol.Chem.286、41273−41285.)由来の異なる長さのバインダーを有する融合タンパク質を構築することができる(Boersma et al.(2011),J.Biol. Chem.286,41273−41285.)。
上記で述べた大腸菌における周辺質発現に加えて、scFv/DARPin融合タンパク質の発現は、以前述べたようなマルチバックシステムを用いたスポドプテラ・フルギペルダ(Sf9)細胞由来の分泌物を用いて行った(Fitzgerald et al.(2006)NatureMethods3:1021−32.)。要約すると、融合タンパク質をコードしている配列をライゲーション非依存的クローニング(LIC)を介してドナーベクターであるpFLmLICへサブクローニングし、N末端溶解シグナル配列を導入する(配列番号99)。ドナーベクターは融合タンパク質をコードする配列をバクミドEmBacYへ導入するために使用される。Sf9へインフェクションするためのバキュロウィルスはsf9細胞にバクミドDNAをトランスフェクションすることで構築した。発現段階において、Sf9細胞は4×106細胞/mLの濃度になるよう培養し、1.72時間感染後に1MOIのそれぞれのウィルスを共感染させ、遠心(30分、5000g、4℃)をして回収し、上清に対してNi−NTAスーパーフロー(Qiagen)精製樹脂を用いて固定金属イオン親和性クロマトグラフィー(IMAC)を行った。
scFv1−リンカー−scFv2コンストラクトを周辺質シャペロンとともに、大腸菌の周辺質へ共発現させた。この目的のために、pMsACscFv1−リンカー−scFv2プラスミドをpCH−A1プラスミドとともに大腸菌SF130(Meerman and Georgiou(1994);Biotechnology(NY)12:1107−1110)へ共形質転換した(Schaefer and Pluckthun(2010)Improving expression of scFvfragments by co−expression of periplasmic chaperones、in:Antibody Engineering、Kontermann and Dubel、eds.、Vol.2、2ndedit.、pp.345−361、SpringerVerlag、BerlinHeidelberg、Germany)。形質転換後、大腸菌のシングルクローンをテリフィックブロス増殖培地(TB;ColdSpringHarborProtocols)に一晩順化させ、初期OD600が0.1の発現培地1LをTB発現培地へと移した。ScFv融合配列発現はイソプロピル−3−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)によって誘導し、25℃一晩かけて行った。
発現培地を遠心によってペレットにし、トリスバッファー(50mMのトリスベース、150mMの塩化ナトリウム、pH7.5)を用いて洗い、タンパク質分解阻害剤(Roche−完全タンパク質分解阻害剤混合液)及びDNaseI(Roche)を含む冷トリスバッファーに再懸濁した。上記の工程は4℃でおこなった。大腸菌をフレンチプレスでライセートにし、20000gで30分遠心した。上清の最終濃度が20mMのイミダゾール、400mMの塩化ナトリウム、10%のグリセロール、pH7.5に合わせ、Ni−NTAカラムに処理した。カラムを20mMイミダゾール、400mMの塩化ナトリウム、10%のグリセロールを含む30CVのトリスバッファー、1Mの塩化ナトリウムを含む30CVのトリスバッファーで高塩濃度を用いて洗い、10mMの塩化ナトリウムを含む30CVのトリスバッファーで低塩濃度を用いて洗った。結合画分は、300mMのイミダゾールを含むトリスバッファーを用いて溶出した。Ni−NTA溶出タンパク質をプロテインAベンチトップカラムに処理し、0.1%トライトンX−114を含む80CVのリン酸緩衝生理食塩水(Dulbecco’sPBS)とともにエンドトキシン洗浄をし、30CVのPBSとともに洗い、4CVの100mMのグリシンバッファーpH3.6を用いて、150mMの塩化ナトリウム、4CVの1.5MのトリスバッファーpH8の中へ溶出した。タンパク質を濃縮し、HEPES培地(25mMのHEPES、150mMの塩化ナトリウム、pH7.5)を用いて透析した。
二重特異性抗体コンストラクトの遺伝子(Volkel et al.(2001)、Protein Engineering 14、815−823に述べたコンストラクトに相似する)は4D5及びA21のscFv断片に由来するドメインを構築し、ジーンスクリプト社によって合成され、pcDNA3へ直接クローニングするために、追加のBamHI/HindIIIクローニングサイトをともなう(下記参照)。
二重特異性抗体コンストラクトA21H_4D5LH_A21Lを発現させるために、pcDNA3.1(+)Hygroを基にしたプラスミドベクターを構築した。ポリリンカー(マルチプルクローニングサイト)を合成した。該ポリリンカーは、マウスIgκ軽鎖のN末端シグナル配列の後にBamHI/HindIIIクローニングサイトがあり、C末端に6×ヒスタグを有する(図19B)。このベクターを、pcDNA3.1seqmlgKとした。
発現後、上清を遠心して回収し、小容量にするためにろ過し、濃縮した。上清をトリスバッファー(50mMのトリスベース、150mMの塩化ナトリウム、pH7.5)で透析し、その後20mMのイミダゾール、400mMの塩化ナトリウム、10%グリセロールに調整し、Ni−NTAベンチトップカラムに処理した。カラムを20mMのイミダゾール、400mMの塩化ナトリウム、10%のグリセロールを含むpH7.5の30CVのトリスバッファーで洗い、300mMのイミダゾールを含むpH7.5の2CVのトリスバッファーで溶出した。サンプルを濃縮し(25mMのHEPES、150mMの塩化ナトリウム、pH7.5)、HEPES培地で透析した。
上記で述べてきたような、二重特異性HER2結合剤の細胞毒活性を調べるために、実施例1において述べたようにXTT測定を行った。図20はBT474細胞において測定した結果を示している。そして、図21はHCC1419細胞において測定した結果を示している。以下コントロールをCTRLとし未処理を意味し、A21はscFv断片A21、4D5はscFv断片4D5、A21+4D5はscFv断片A21及びscFv断片4D5の混合物、そしてTZBはトラスツズマブを意味している。図21に示される実施例において二重特異性抗体(配列番号79)は10nMのみ使用し、その一方でその他の単体は100nM使用したことを特に言及する。
Claims (5)
- a.HER2の細胞外ドメイン1に結合する第1のポリペプチドリガンドであり、ここで前記第1のポリペプチドリガンドはD1結合部位を通じてHER2細胞外ドメイン1と接触する第1のポリペプチドリガンドと、
b.HER2の細胞外ドメイン4に結合する第2のポリペプチドリガンドであり、ここで前記第2のポリペプチドリガンドはD4結合部位を通じてHER2細胞外ドメイン4と接触する第2のポリペプチドリガンドと、
c.前記第1のポリペプチドリガンド及び前記第2のポリペプチドリガンドを共有結合的に付着させるリンカーであり、ここで前記リンカーは、前記D4結合部位及び前記D1結合部位の間に75オングストロームより短い空間的隔離を可能にすることで選択されるリンカーを含み、
d.前記第1のポリペプチドリガンドが
i.配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66及び配列番号93
からなる群から選ばれる配列であり、
e.前記第2のポリペプチドリガンドが
i.配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号67、配列番号68、配列番号69、及び配列番号92
からなる群から選ばれる配列であり、
前記リンカーは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20アミノ酸からなり、
前記第1のポリペプチドリガンド及び前記第2のポリペプチドリガンドがオリゴペプチドリンカーによって互いに付着され、前記第1のポリペプチドリガンド、前記第2のポリペプチドリガンド及び前記リンカーは1つの連続したポリペプチド鎖を形成する前記リンカーによって互いに付着され、
前記リンカーはポリグリシン/セリンリンカーであり、特にnが1、2、3、4又は5であるアミノ酸配列(GGGGS)nによって特徴づけられる、
癌を治療又は予防する方法に使用するための二重特異性HER2標的剤。 - 前記第1のポリペプチド配列が前記連続したポリペプチド鎖のN末端に配置され、前記第2のポリペプチド配列が前記連続したポリペプチド鎖のC末端に配置され、及び前記リンカーは前記第1及び第2のポリペプチドリガンドの間に配置される、請求項1に記載の癌を治療又は予防する方法に使用するための二重特異性HER2標的剤。
- 前記第1のポリペプチドリガンド及び前記第2のポリペプチドリガンドがクロスリンカーによって互いに共有的に付着される、請求項1〜2のいずれかに記載の癌を治療又は予防する方法に使用するための二重特異性HER2標的剤。
- 前記リンカーは65オングストローム、60オングストローム、55オングストローム、50オングストローム、45オングストローム、40オングストローム、35オングストローム、30オングストローム、25オングストローム、20オングストローム、15オングストローム、10オングストローム若しくは5オングストロームと同じ長さ又はそれよりも短い長さを有する、
請求項1〜3のいずれか1項に記載の癌を治療又は予防する方法に使用するための二重特異性HER2標的剤。 - a.AU565、BT474、HCC1419、HCC2218、SkBr3及び/又はZR7530から選択される細胞の生存率の低下を導き、前記低下はトラスツズマブを用いて同様に処理することにより達成される低下よりも高く、
b.AU565細胞株の細胞とともにインキュベートするとき、ウェスタンブロットにおいて、HER2−Y1248、HER3−Y1289、AKT−S473、ERK1/2−T202/Y204及び/又はPARPのシグナル低下を導き、
c.HCC1419細胞株とともにインキュベートするとき、ウェスタンブロットにおいて、HER2−Y1248、HER3−Y1289、AKT−S473及び/又はERK1/2−T202/Y204のシグナル低下を導き、
d.HCC2218細胞株とともにインキュベートするとき、ウェスタンブロットにおいて、HER2−Y1248、HER3−Y1289、AKT−S473及び/又はERK1/2−T202/Y204のシグナル低下を導き、
e.ZR7530細胞株とともにインキュベートするとき、HER2−Y1248、HER3−Y1289、AKT−S473、ERK1/2−T202/Y204及び/又はPARPのシグナル低下を導き、又は
f.示される細胞株とともにインキュベートするとき、BT474細胞の少なくとも40%、AU565細胞の少なくとも8%、HCC1419細胞の少なくとも20%及び/又はHCC2218細胞の少なくとも20%のアポトーシスの誘導を導く、
請求項1〜4のいずれか1項に記載の癌を治療又は予防する方法に使用するための二重特異性HER2標的剤。
Applications Claiming Priority (9)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP12188598 | 2012-10-15 | ||
EP12188598.2 | 2012-10-15 | ||
EP12191673 | 2012-11-07 | ||
EP12191673.8 | 2012-11-07 | ||
EP12192465.8 | 2012-11-13 | ||
EP12192465.8A EP2719706A1 (en) | 2012-10-15 | 2012-11-13 | Bispecific HER2 ligands for cancer therapy |
EP13185724 | 2013-09-24 | ||
EP13185724.5 | 2013-09-24 | ||
JP2015536180A JP2015532306A (ja) | 2012-10-15 | 2013-10-14 | 癌治療のための二重特異性her2リガンド |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015536180A Division JP2015532306A (ja) | 2012-10-15 | 2013-10-14 | 癌治療のための二重特異性her2リガンド |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019031559A JP2019031559A (ja) | 2019-02-28 |
JP6900354B2 true JP6900354B2 (ja) | 2021-07-07 |
Family
ID=50487594
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015536180A Pending JP2015532306A (ja) | 2012-10-15 | 2013-10-14 | 癌治療のための二重特異性her2リガンド |
JP2018205732A Active JP6900354B2 (ja) | 2012-10-15 | 2018-10-31 | 癌治療のための二重特異性her2リガンド |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015536180A Pending JP2015532306A (ja) | 2012-10-15 | 2013-10-14 | 癌治療のための二重特異性her2リガンド |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10093740B2 (ja) |
EP (1) | EP2906591A1 (ja) |
JP (2) | JP2015532306A (ja) |
AU (1) | AU2013331763B2 (ja) |
CA (1) | CA2883264A1 (ja) |
WO (1) | WO2014060365A1 (ja) |
Families Citing this family (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3733714A1 (en) | 2019-04-30 | 2020-11-04 | Universität Zürich | Her2-binding tetrameric polypeptides |
EP2738180A1 (en) | 2012-11-30 | 2014-06-04 | Molecular Partners AG | Binding proteins comprising at least two binding domains against HER2. |
KR102236367B1 (ko) * | 2013-07-26 | 2021-04-05 | 삼성전자주식회사 | DARPin을 포함하는 이중 특이 키메라 단백질 |
RU2737882C2 (ru) | 2013-11-27 | 2020-12-04 | Займворкс Инк. | Биспецифические антигенсвязывающие конструкции против her2 |
KR20240042540A (ko) * | 2014-02-28 | 2024-04-02 | 메뤼스 엔.페. | ErbB-2와 ErbB-3에 결합하는 항체 |
JP6771385B2 (ja) | 2014-02-28 | 2020-10-21 | メルス ナムローゼ フェンノートシャップ | 二重特異性抗体および医薬組成物 |
SI3365373T1 (sl) | 2015-10-23 | 2021-08-31 | Merus N.V. | Vezne molekule, ki zaviranjo rast raka |
EP3202783A1 (en) * | 2016-02-02 | 2017-08-09 | Ecole Polytechnique Federale de Lausanne (EPFL) | Engineered antigen presenting cells and uses thereof |
AR109680A1 (es) | 2016-09-22 | 2019-01-09 | Molecular Partners Ag | Proteínas recombinantes y sus usos |
MX2019011660A (es) | 2017-03-31 | 2019-11-18 | Merus Nv | Anticuerpos biespecificos que se unen al receptor 2 del factor de crecimiento humano (erbb-2) y receptor 3 del factor de crecimiento humano (erbb3) para usarse en el tratamiento de celulas que tienen un gen de fusion de neuregulina-1 (nrg1). |
KR20200042485A (ko) | 2017-08-09 | 2020-04-23 | 메뤼스 엔.페. | EGFR 및 cMET에 결합하는 항체 |
EP3735254A4 (en) | 2018-01-05 | 2021-11-03 | City of Hope | MULTI-SPECIFIC LIGAND BINDERS |
MX2020009469A (es) | 2018-03-13 | 2021-01-29 | Zymeworks Inc | Conjugados de anticuerpo y farmaco anti-her2 biparatopicos y metodos de uso. |
AU2019358419A1 (en) * | 2018-10-08 | 2021-04-15 | Universität Zürich | HER2-binding tetrameric polypeptides |
AU2020399230A1 (en) | 2019-12-11 | 2022-06-23 | Molecular Partners Ag | Recombinant peptide-MHC complex binding proteins and their generation and use |
IL297940A (en) | 2020-05-06 | 2023-01-01 | Molecular Partners Ag | New ankyrin repeat binding proteins and their uses |
KR20230155464A (ko) | 2021-03-09 | 2023-11-10 | 몰리큘라 파트너스 아게 | 신규한 DARPin-기반 다중특이성 T-세포 인게이저 |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4968603A (en) | 1986-12-31 | 1990-11-06 | The Regents Of The University Of California | Determination of status in neoplastic disease |
WO1989006692A1 (en) | 1988-01-12 | 1989-07-27 | Genentech, Inc. | Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function |
WO1992022653A1 (en) | 1991-06-14 | 1992-12-23 | Genentech, Inc. | Method for making humanized antibodies |
US6733752B1 (en) | 1994-03-30 | 2004-05-11 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Prevention of tumors with monoclonal antibodies against neu |
DE59708838D1 (de) | 1996-08-30 | 2003-01-09 | Jens Peter Fuerste | Spiegelselektion und spiegelevolution von nucleinsäuren |
US7371376B1 (en) * | 1996-10-18 | 2008-05-13 | Genentech, Inc. | Anti-ErbB2 antibodies |
ZA9811162B (en) | 1997-12-12 | 2000-06-07 | Genentech Inc | Treatment with anti-ERBB2 antibodies. |
US6573043B1 (en) | 1998-10-07 | 2003-06-03 | Genentech, Inc. | Tissue analysis and kits therefor |
US6949245B1 (en) | 1999-06-25 | 2005-09-27 | Genentech, Inc. | Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies |
US20040013667A1 (en) | 1999-06-25 | 2004-01-22 | Genentech, Inc. | Treatment with anti-ErbB2 antibodies |
US20030086924A1 (en) | 1999-06-25 | 2003-05-08 | Genentech, Inc. | Treatment with anti-ErbB2 antibodies |
CA2407556C (en) | 2000-05-19 | 2011-06-21 | Genentech, Inc. | Gene detection assay for improving the likelihood of an effective response to an erbb antagonist cancer therapy |
ES2335861T3 (es) | 2000-09-08 | 2010-04-06 | Universitat Zurich | Grupos de proteinas repetitivas que comprenden modulos repetitivos. |
ES2392525T3 (es) | 2002-07-15 | 2012-12-11 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Tratamiento del cáncer con el anticuerpo dirigido contra ErbB2 rhuMAb 2C4 |
JP2011504740A (ja) | 2007-11-27 | 2011-02-17 | アブリンクス エン.ヴェー. | ヘテロ二量体サイトカイン及び/又はこれらの受容体に指向性を有するアミノ酸配列、並びにこれを含むポリペプチド |
TW201120210A (en) * | 2009-11-05 | 2011-06-16 | Hoffmann La Roche | Glycosylated repeat-motif-molecule conjugates |
GB2476681B (en) | 2010-01-04 | 2012-04-04 | Argen X Bv | Humanized camelid VH, VK and VL immunoglobulin domains |
JP6105479B2 (ja) * | 2010-11-26 | 2017-03-29 | モレキュラー・パートナーズ・アーゲーMolecular Partners Ag | 血清アルブミンに結合する設計リピートタンパク質 |
EP2738180A1 (en) * | 2012-11-30 | 2014-06-04 | Molecular Partners AG | Binding proteins comprising at least two binding domains against HER2. |
-
2013
- 2013-10-14 WO PCT/EP2013/071443 patent/WO2014060365A1/en active Application Filing
- 2013-10-14 EP EP13774708.5A patent/EP2906591A1/en not_active Withdrawn
- 2013-10-14 JP JP2015536180A patent/JP2015532306A/ja active Pending
- 2013-10-14 AU AU2013331763A patent/AU2013331763B2/en active Active
- 2013-10-14 US US14/430,224 patent/US10093740B2/en active Active
- 2013-10-14 CA CA2883264A patent/CA2883264A1/en not_active Abandoned
-
2018
- 2018-10-31 JP JP2018205732A patent/JP6900354B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20150284463A1 (en) | 2015-10-08 |
WO2014060365A1 (en) | 2014-04-24 |
JP2015532306A (ja) | 2015-11-09 |
CA2883264A1 (en) | 2014-04-24 |
AU2013331763A1 (en) | 2015-03-19 |
JP2019031559A (ja) | 2019-02-28 |
EP2906591A1 (en) | 2015-08-19 |
US10093740B2 (en) | 2018-10-09 |
AU2013331763B2 (en) | 2018-02-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6900354B2 (ja) | 癌治療のための二重特異性her2リガンド | |
US20210284721A1 (en) | Modified antibody compositions, methods of making and using thereof | |
JP2023527927A (ja) | 新型コロナウイルス(sars-cov-2)スパイクタンパク質結合分子及びその使用 | |
EP2719706A1 (en) | Bispecific HER2 ligands for cancer therapy | |
US20220119546A1 (en) | Plectin-1 binding antibodies and uses thereof | |
KR20130026418A (ko) | Her2 의 세포외 도메인 2 및 3 에 대한 항체 | |
US20240263355A1 (en) | mRNA display antibody library and methods | |
US20220135700A1 (en) | Bispecific HER2 Ligands for Cancer Therapy | |
WO2019075392A1 (en) | ANTIGEN-BINDING PROTEIN CONSTRUCTS AND USES THEREOF | |
JP2022504472A (ja) | Her2結合四量体ポリペプチド | |
TWI820058B (zh) | 對表皮生長因子受體具有增加的親和性之抗體及其衍生之片段 | |
KR102590757B1 (ko) | GKN1(Gastrokine 1) 특이적 항체 및 이의 용도 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20181128 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20191217 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20200306 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200513 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20201027 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20210126 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20210326 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210413 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210518 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210616 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6900354 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |