JP6898353B2 - 三次元プリンティング用インクを供給する方法およびこれを用いた三次元印刷方法 - Google Patents

Description

本発明は、三次元プリンティング装置のインク収容部にインクを供給する方法、前記方法を含む三次元印刷方法および前記方法が適用された三次元プリンティング装置に関するものであって、さらに詳しくは三次元プリンティング装置に備えられたインク収容部に、三次元印刷方法でインクを提供する方法および前記方法が適用された三次元プリンティング装置に関するものである。本発明による方法を用いれば、複雑な構造の生体組織形状を高い精密度で印刷することができる。

再生医学および組織工学は損傷された臓器を復元するか代替するための分野であって、三次元的組織構造体を作る方法を主に使用しており、押出積層造形基盤のバイオプリンティングはこのような三次元的組織構造体を作る最も適した方法の一つである。３Ｄバイオプリンティング技術を用いて人体を構成する組織と類似の細胞構造体の製作を通じて必要とする機能性組織を再生しようとする研究が活発に行われている。

バイオプリンティング技術に応用されたヘッドモジュールは、大きくインクジェット基盤プリンティング（ｉｎｋｊｅｔ−ｂａｓｅｄ ｐｒｉｎｔｉｎｇ）モジュールと、吐出基盤プリンティング（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｐｒｉｎｔｉｎｇ）モジュールに分けられる。それ以外にもレーザ、超音波などを用いた多様な方法が提示されたが、前記の２種類のモジュールが最も広く使用されている。

このようなバイオプリンティング技術が要求するバイオインクの物理的性質は、使用されるプリンティングヘッドモジュールによって大きく変わる。微細ノズルとシリンジを用いる吐出基盤プリンティングシステムでは、ジェッティング基盤技術に比べて材料の粘性に大きな制約を受けない。したがって、インクジェット基盤プリンティング技術に比べて応用可能な生体材料の幅がはるかに広くなる。また、厚い層の加工が容易であって、臨床で要求する大きさの細胞構造物の製作が容易である。

しかし、現在まで開発された押出積層造形基盤のバイオプリンティング技法の解像度は数百マイクロメートルであるが、人体内組織や臓器の基本構造は数十マイクロメートル以下であって、大きな差がある。特に臓器や組織を構成する細胞に栄養分を供給する毛細血管の直径は３〜４マイクロメートルであるため、現在のバイオプリンティング技法では実現が難しい。

また、バイオプリンティングを行う時に多重インクを使用する場合がある。例えば、ヒドロゲルと硬化剤を共に硬化させる場合または、様々な種類の細胞を共培養する場合、単純に細胞を混合して噴射して使用する方式より異種細胞間に区画を分けて使用する場合に細胞の機能が向上すると知られているので、多重インクを噴射してバイオプリンティングを行わなければならない。このような従来の方式によれば、多重材料が異質的に含まれている多重ヘッドを用いてこれを解決しようとしたが、プリンティング工程時間が増加して細胞生存率に悪影響を及ぼしシステムが複雑になる短所がある。

プリンティング技法の解像度を高めるためには直径が小さいノズルを使用しなければならないが、直径が小さいノズルを使用すれば吐出時にノズル内側で吐出される材料と壁面の間にせん断応力が発生して細胞の活性を低下させる副作用がある。また、せん断応力によって細胞が死滅する問題が頻繁に発生する問題があるため、ノズルの直径をむやみに小型化することも難しいのが実情である。

本発明は、三次元印刷方法を用いて複雑な構造の生体組織形状を高い精密度で製造するために、少なくとも一つのインクは三次元印刷方法でインク収容部に供給され、一つの吐出物を用いて三次元パターンを有する印刷物を製造するインク吐出部材およびこれを用いたプリンティング方法に関するものである。

本発明は、二つ以上の異なるインクを含む一つの吐出物を用いて三次元パターンを有する印刷物を製造するプリンティング装置およびこれを用いたプリンティング方法に関するものである。

本発明は、複雑な構造を有する生体組織形状を高い精密度と解像度でプリンティングする装置およびこれを用いたプリンティング方法を提供することを目的とする。

本発明は、所望の形状を異質的にプリンティングすると同時に細胞のせん断応力も大きく減らすことができるプリンティング装置およびプリンティング方法を提供するものである。

本発明は、インク収容部および吐出部を含む三次元印刷用インク吐出部材に、少なくとも１種のインクを三次元印刷方法で印刷したインク印刷物で提供するインク提供段階を含む三次元印刷方法に関するものであって、好ましくは、前記プリンティング方法は人工組織、臓器などの製作に使用されるバイオプリンティング装置および方法であり得る。

本発明の他の一例は、三次元プリンティング装置に備えられたインク収容部および吐出部を含むインク吐出部材の空間に少なくとも１種のインクを提供する段階、前記収容されたインクに物理的力を加えて収容されたインクが単一吐出口に吐出されてインク吐出物を製造する段階、および前記インク吐出物を基板に印刷する段階を含む。

前記インクを提供する段階は、少なくとも１種のインクを三次元印刷方法で印刷したインク印刷物で提供することができ、相異なる２種以上のインクを使用する場合、他の少なくとも１種のインクは三次元印刷方法以外の提供方法で提供されるインク充填物であってもよい。具体的に、少なくとも一つの第１インクをインク収容部に充填するインク充填物と少なくとも一つの第２インクを三次元印刷方法で印刷して注入するインク印刷物で提供することができる。

前記インク提供段階でインク収容部材に提供されたインク印刷物はそれ自体でも二次元または三次元パターンを有するものであってもよく、インク収容部材の断面もパターンを有し得る。印刷物が人工臓器である場合、多様な材質の一つ以上の構造からできているので特に有用である。

また、本発明の一例で、断面パターンを有する印刷物の三次元印刷方法を提供し、前記インク吐出部材は、三次元印刷物と同一な形態の断面パターンを有するようにインク充填物とインク吐出物を含むことができる。前記空間に収容されたインクに物理的な力を加えて、吐出部とこれに連結されたノズルを通じてインクを吐出して印刷物と同一な形態の断面パターンを有するインク吐出物を製造する段階、および前記インク吐出物を基板に印刷する段階を含む、断面パターンを有する印刷物の三次元印刷方法に関するものである。

前記断面パターンを有する印刷物の三次元印刷方法で、収容部から提供されたインクを加圧して吐出部またはノズルを通じて一つの吐出物として印刷され、前記吐出物は最終印刷物と同一な形態の断面パターンを有してもよく、好ましくは収容部に提供されたインクの断面パターン（Ａ）に対する前記吐出物または最終印刷物の断面パターン（Ｂ）の比率（＝Ｂ／Ａ）、例えば断面の直径比率、または断面面積比率が１００：９９〜１００：０．１、または１００：５０〜１００：１、１００：１８〜１００：１の比率で縮小され得る。また、三次元印刷方法で提供される１次インク印刷物の断面直径比率、または断面面積を基準に、１次インク印刷物と２次印刷物の断面直径比率、または断面面積比率は、１００：９９〜１００：０．１、または１００：５０〜１００：１、１００：１８〜１００：１比率で縮小され得る。

本発明の他の一例は、断面パターンを有する印刷物の三次元プリンティング装置であって、
内部空間に印刷用インクが収容される収容部と、前記収容部の下部に位置し前記インクが通過する単一通路を備え収容部に収容されたインクを吐出する吐出部を含むインク吐出部材、
前記吐出部の末端に連結されたノズル、および
前記収容されたインクに物理的な力を加える加圧部材を含み、
前記インクが単一通路を備えた吐出部を通じて印刷物と同一な形態の断面パターンを有するように印刷される三次元プリンティング装置に関するものである。

本発明によるプリンティング装置は前記収容されたインクに物理的な力を加える手段を含むことができ、例えば圧力装置やスクリューなどを用いて力を加えることができる。また、同一条件の圧力を加えるために、単一加圧部材を用いて圧力を加えるか、二つ以上の加圧部材を用いて同一圧力で加圧することができる。前記加圧部材で加圧してそれぞれ相異なるインクが単一通路を備えた吐出部を通じて印刷物と同一な形態の断面パターンを有するように印刷することができる。したがって、本発明によるプリンティング装置を用いる場合、多様な断面パターンを有する印刷物を製造することができ、特に複雑な断面構造を有する生体組織形状を高い精密度と解像度で印刷して三次元印刷方法で製造することができ、生体組織に細胞を含む場合、所望の形状を異質的にプリンティングすると同時に細胞のせん断応力も大きく減らすことができる長所がある。

以下、本発明をさらに詳しく説明する。

本発明による三次元印刷方法は、インク収容部および吐出部を含む三次元印刷用インク吐出部材に、少なくとも１種のインクを三次元印刷方法で印刷したインク印刷物で提供するインク提供段階、前記インク吐出部材に物理的な力を加えて収容されたインクが吐出部に吐出されてインク吐出物を製造する段階、および前記インク吐出物を基板に印刷する段階を含む。本発明による三次元印刷方法によって断面パターンを有する印刷物を製造することができる。

前記インク提供段階で、少なくとも１種のインクを三次元印刷方法以外の方法でインク充填物で追加的に提供することができる。本明細書で、インク充填物は三次元印刷方法でインク収容部材に提供されるインク印刷物とは異なり、三次元印刷方法でない充填方法によって提供されるインク充填物を意味し、三次元印刷方法以外の方法による充填方法の例としては、チューブや注射器などを用いて充填する方法があり、特に限定されない。

前記物理的な力を加えることはインク収容部材に提供されたインクを吐出部に押し出すための手段を用いて行うことができ、例えば圧力部材やスクリューなどを使用することができる。具体的に、前記圧力を加えることは、単一加圧部材を用いて圧力を加えるか、二つ以上の加圧部材を用いて加圧して行うことができる。例えば、前記圧力は同一条件の圧力を加えることができ、同一な条件の圧力とはインクが単一吐出口に吐出されて単一インク吐出物が形成され得る圧力条件であり、好ましくは二つ以上の相異なるインク、または三次元印刷方法で提供されたインク印刷物と三次元印刷方法以外の方法で提供されるインク充填物が単一吐出口に吐出されて単一インク吐出物が形成され、前記インク吐出物およびこれから製造される印刷物が目的対象印刷物の断面パターンと同一な形態を有するようにする圧力条件を意味する。

本発明による断面パターンを有する印刷物の三次元印刷方法は、本発明によるインク吐出部材または前記インク吐出部材を含む三次元プリンティング装置を用いて行うことができる。

本発明の他の一例による断面パターンを有する印刷物の三次元プリンティング装置は、印刷物と同一な形態の断面パターンを有するようにインクが収容される収容部と、前記収容部の下部に位置し前記インクが通過する単一通路を備え収容部に収容されたインクを吐出する吐出部を含むインク吐出部材を含み、また、追加的に前記吐出部に連結されたノズル、および前記各区画された空間に収容されたインクに圧力を加える加圧部材を含むことができる。

また、前記三次元プリンティング装置は、前記吐出物を印刷する基板（ｐｌａｔｅ）と印刷のための追加装置は通常の三次元プリンティング装置に含む構成要素を含むことができる。

具体的に、本発明による断面パターンを有する印刷物の三次元印刷方法は、前記インク吐出部材の収容部のインクを提供する段階、前記各区画された空間に収容されたインクに圧力を加えて、吐出部を通じてインクを吐出して、印刷物と同一な形態の断面パターンを有するインク吐出物を製造する段階、および前記インク吐出物を基板に印刷する段階を含む。前記インク提供段階で少なくとも１種のインクを三次元印刷方法で印刷したインク印刷物で提供することができ、少なくとも１種のインクを三次元印刷方法以外の方法でインク充填物で追加的に提供することができる。

本発明によるインク吐出部材または前記インク吐出部材を含む三次元プリンティング装置、および前記インク吐出部材または前記インク吐出部材を含む三次元プリンティング装置を用いた断面パターンを有する印刷物の製造方法は、装置の構成要素別および方法の段階別に以下で詳しく説明する。

本発明によるインク吐出部材は、印刷物と同一な形態の断面パターンを有するように、インクが収容される収容部と、前記収容部の下部に位置し前記インクが通過する単一通路を備え収容部に収容されたインクを吐出する吐出部を含む。

本発明によるインク吐出部材を使用する場合、プリンティングが可能であり商用化された収容部の直径は非常に大きいのでバイオインクが吐出されるためインクまたはこれに含まれている細胞にせん断応力がほとんど加えられない。また、多重材料が異質的に含まれている多重ヘッドを使用する従来技術に比べて、本発明は一つのインク吐出部材を用いて二つ以上の相異なるインクを共に吐出して印刷することができるので、単一プリンティングヘッドを用いることができてプリンティング工程時間が減少し、インクまたはこれに含まれている細胞にせん断応力がほとんど加えられない。したがって、本発明によるプリンティング方法または装置を用いて細胞を含むインクを使用する場合、細胞生存率が高くシステムが単純になる長所がある。

前記吐出部材は、外部から圧力が加えられてインクを押し出すことによってインクを供給する構成要素であって、通常三次元プリンティング装置に使用されるカートリッジまたはシリンジ（Ｓｙｒｉｎｇｅ）であり得る。前記インクを吐出して印刷を行うために、インク収容部材に加えられる圧力はインクの濃度およびノズルの大きさによって異なってもよいが、例えば０．１〜７００ｋＰａ、１〜５００ｋＰａまたは１〜７００ｋＰａであり得る。前記印刷空圧が高ければ過度に多くの材料が吐出され、空圧が低ければ支持する材料内側に後続物質が印刷されずに滑ることがある。

前記インク吐出部材は、前記収容部の下部に位置し前記多重インクが通過する単一通路を備え、収容部に収容されたインクを吐出する吐出部を含む。前記吐出部は単一通路を備えて、多数の空間に区画された収容部に収容されたインクを多重チャンネル制御でない単一チャンネル制御方式で吐出することができる。

前記吐出口の内径は、非常に小さく形成されている。前記吐出口を通じて前記収容部に収容されているインクはその収容部の外部に吐出可能である。前記吐出部から排出されたインク吐出物は断面パターンが前記収容部の断面パターンと同一であり、但し大きさが縮小され得る。

本発明による三次元プリンティング装置は、前記吐出部材の吐出部の端に連結されたノズルを追加的に含むことができ、前記ノズル（ｎｏｚｚｌｅ）を通じてインクが排出され、前記ノズルの下部にプレートが位置しノズルから排出された印刷用インクがプレートの上部に積層されることによって印刷物を製造するようになる。

本発明による断面パターンを有する印刷物は、人体模写組織であることが好ましい。例えば、筋肉組織（ｂｕｎｄｌｅ構造）、骨組織（ｌａｍｅｌｌａｅ ＆ ｃａｎａｌ構造）、神経組織（ｐｅｒｉｎｅｕｒｉｕｍ構造）、血管組織（ｍｕｌｔｉ−ｌａｙｅｒ構造）、脊髄（ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ）組織などがある。

押出積層造形基盤のバイオプリンティング技法の解像度を高めるためにはプリンティングノズルの直径を減らすことが必須であり、ノズルの直径が小さくなるほどノズルの内側から吐出される材料と壁面の間に発生するせん断応力によって細胞が死滅する問題が頻繁に発生する問題があるため、ノズルの直径をむやみに小型化することも難しいのが実情である。したがって、本発明によって同一な断面パターンを有する収容部と前記インクを単一通路に吐出する吐出部を備えて、高い解像度を実現することができる。

本発明による生体組織をプリンティングする方法は、印刷物の形状と比率は同一であるが、拡大された断面形状を有するプリンティングインクを収容部に提供し、前記収容部の断面パターンが同一な形態を維持しながら、収容部の断面より小さな断面を有する吐出部を通過するように圧力を制御することができる。吐出された吐出物の断面パターンが前記収容部の断面パターンと同一な形態を維持することができる水準であるのが好ましい。

本発明によれば、比較的に容易に製造できる大きな大きさのプリンティングインクを用いて複雑で大きさが非常に小さい微細構造を容易に印刷することができる効果がある。

本明細書で“同一”の意味は１００％同一なものだけでなく、実質的に同一な機能を果たすことができる程度に同一なものまでも含む意味と定義される。明細書で“断面が同一な形態を維持”するというのは、断面の大きさのみ小さくなるだけ、元の断面の形態はそのまま維持することを意味する。そのようにすることによって、より成形し易い大きな断面を有するプリンティング素材を先ず作った後に所望の大きさ、即ち、実際組織細胞の大きさに相応する組織細胞のプリンティングが可能になる。

前記プリンティングインクの粘性は、ノズルを通過して吐出された吐出物の断面が前記プリンティング素材の断面と同一な形態を維持することができる水準であるのが好ましい。

プリンティングされた結果物の断面は、現在のバイオプリンティング技術では実現できない程度の小さな大きさであるか、プリンティングされた時に生存率が顕著に低くなる微細構造であり、前述のように筋肉組織（ｂｕｎｄｌｅ構造）、骨組織（ｌａｍｅｌｌａｅ ＆ ｃａｎａｌ構造）、神経組織（ｐｅｒｉｎｅｕｒｉｕｍ構造）、血管組織（ｍｕｌｔｉ−ｌａｙｅｒ構造）、脊髄（ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ）組織などがある。

本発明による印刷装置の収容部の断面は、印刷物と同一な形態の断面パターンを有し、収容部の断面パターンが前記吐出物または印刷物の断面パターンの比率が断面の面積比率、直径比率などで多様な方法で表示され得る。収容部に提供されたインクの断面パターン（Ａ）に対する前記吐出物または最終印刷物の断面パターン（Ｂ）の比率（＝Ｂ／Ａ）が、例えば断面の直径比率、または断面面積比率が１００：９９〜１００：０．１、または１００：５０〜１００：１、１００：１８〜１００：１の比率で縮小され得る。また、三次元印刷方法で提供される１次インク印刷物の断面直径比率、または断面面積を基準に、１次インク印刷物の２次印刷物の断面直径比率、または断面面積比率は、１００：９９〜１００：０．１、または１００：５０〜１００：１、１００：１８〜１００：１の比率で縮小され得る。

前記２次印刷物の縮小比率は、下記インク収容部材に提供されたインク印刷物は２回の印刷過程を経るようになり、シリンジの内部に１次印刷されたインク印刷物を基準に縮小比率を表現する場合、三次元印刷方法でシリンジに提供された１次インク印刷物の直径から、ノズルを通じて吐出された前記プリンティングインクの２次印刷物または吐出物の直径を引いたものを、三次元印刷方法でシリンジに提供された１次インク印刷物の直径で割った比率であって、下記数式１のように表現することができる。
［数式１］
インク印刷物の縮小比率＝（Ａ−Ｂ）／Ａ×１００（％）
前記数式１中、
Ａは、三次元印刷方法でシリンジに提供された１次インク印刷物の直径であり、
Ｂは、プリンティングインクの２次印刷物の直径であり、
前記ＡおよびＢは、同一長さ単位である。

前記２次印刷物の縮小比率は、収容部の断面直径、吐出部の断面直径、またはノズルの直径などに直接的に影響を受け、目的する印刷物の断面パターンの大きさに合わせて適切に調節して多様に設計することができる。印刷物の断面直径はノズルの大きさによって変化し、この範囲は０．１ｍｍ〜１ｍｍが通常使用でき、材料の特性、圧力、プリンティングヘッドの速度、プリンティング結果物が置かれる位置（プリンティングベッド）などのプリンティング工程によって変化し得る。

本発明の実施形態によれば、比率は特定形状（実施例：Ｌｏｂｕｌｅ）の全体直径（１５ｍｍ）から９９％または９８．７％（２００μｍ）まで小型化可能である。

本発明の一例で、前記数式１で表された１次印刷されたインクの縮小比率（＝（Ａ−Ｂ）／Ａ×１００）は０．１％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９２％以上、９５％以上、または９９％以上であり得、例えば０．１〜９９．９％、５０％〜９９％または４５％〜９９％であり得る。

本発明によるインク吐出部材に提供されるインクは、人工臓器などを製造することができるバイオインクであるのが好ましい。具体的に、印刷物と同一な形態の断面パターンを有するように、インク収容部にインクを提供してプリンティングを行うことができる。前記相異なるインクとは、インクの構成成分、構成成分の含量および物性からなる群より選択された１種以上が異なるものを意味する。

本明細書で‘バイオインク’は、生きている細胞あるいはバイオ分子を含み、バイオプリンティング技術に応用して必要とする構造物を製作することができる素材をひっくるめて称する用語である。本発明のバイオインクは、複数の細胞を含む液体、半固体、または固体組成物を含む。

したがって、バイオインクは三次元加工のための物理的性質と細胞が目的とされた機能を果たすようにするための生物学的環境を提供しなければならない。プリンティング工程が長くなる時にはインク吐出部材内で細胞の生存に必要な栄養分と酸素の供給が適切に行われるのが好ましい。また、プリンティング過程で発生する物理的ストレスから細胞を保護できなければならない。それ以外にも、バイオインクは三次元パターニングの反復性、生産性、ノズルの目詰りがあってはならないなどプリンティング工程上で必要とする物理的性質を有しなければならない。

本発明によるインクはヒドロゲルであるのが好ましく、よって前記インクはゲル化高分子を含むことができ、例えば、ゲル化高分子、細胞、成長因子、および細胞外基質からなる群より選択された１種以上を含むことができる。

本発明で使用するバイオインクは例えば、所望の細胞を混合した／非混合ヒドロゲル、特定成長因子（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）が含まれているヒドロゲル、細胞と／成長因子が含まれているヒドロゲル、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）が含まれているヒドロゲル、互いに異なる種類のヒドロゲルなど。ヒドロゲルは、コラーゲン、マトリゲル、アルギネート、ゼラチン、アガロース、脱細胞化された組織由来細胞インク、ヒアルロン酸、フィブリンゲルなど或いは混合ヒドロゲルが適する。

また、バイオインクは低粘度であるほど速く拡散されるので、水（１ｃｐ）より濃い粘度として２５℃温度で測定した粘度が２ｃｐ〜１，０００，０００Ｃｐ、例えば２ｃｐ〜１０，０００ｃｐ、５ｃＰ〜１，０００，０００ｃＰ、２〜５００ｃｐ、５〜３００ｃｐなどの粘度を有するゲル状の物質が適する。インクの粘度が過度に低い場合、三次元印刷方法で印刷したインク印刷物の形状が崩れるか変形されることがあり、インク印刷物とインク充填物が混合されて境界が崩れることがある。

本発明の方法に使用されるゲル形態の物質の粘度は後述の吐出過程でプリンティング素材が吐出され得るように適切な粘性を有することが好ましい。本発明の一例によれば、吐出式三次元印刷方法を適用するので、インクジェット方式に比べて比較的に高い粘度のインクを提供することが好ましい。一例で、本発明に適用可能なインクは吐出に適切な粘度を提供するために、多様な粘度増進剤を使用してもよい。前記プリンティング素材の粘性は、ノズルを通過して吐出された吐出物の断面が前記プリンティング素材の断面と同一な形態を維持できる水準である。

前記インク充填物とインク印刷物のインク粘度差は、２５℃で測定した粘度差が５，０００ｃｐ以下、例えば０〜５，０００ｃｐ、１，０００ｃｐ以下、５００ｃｐ以下、２００ｃｐ以下、１５０ｃｐ以下、１００ｃｐ以下、５０ｃｐ以下であり得る。インクの粘度差が過度に大きければ互いに異なる物質の分子力によってインク印刷物の形状が変形されることがあり、吐出して三次元印刷をしようとする場合に同一圧力をインクまたはインク収容部材に加える場合、粘度差によってインク収容部材に収容されたインクパターンが崩れることがある。したがって、相異なる２種以上のインクを使用する場合、粘度の差が少ないほど好ましい。

前記インク充填物とインク印刷物の弾性値の差は、１０，０００Ｐａ以下、例えば０〜１０，０００Ｐａであり得る。前記インク充填物とインク印刷物は、粘性と弾性がせん断速度によって変化する推移が類似し粘性値と弾性値が類似していることが好ましい。

また、前記相異なるインクに使用されるゲル化高分子が相異なる場合、例えばゲル化高分子がコラーゲン、ゼラチンのように温度敏感性があり、他の一つがアルギネート、フィブリンゲルのように温度敏感性がなければ、シリンジ内部の温度を調節する必要があることがある。例えば、インク収容部材の温度を４℃〜３７℃の温度範囲で適切に調節することができる。

三次元バイオプリンティング分野で天然由来または合成ヒドロゲルバイオインクが開発され現在使用されているが、ヒドロゲルを基にしたバイオインクは生体適合性、プリンティング適合性、幾何学的精密性、精密度のような物理的および生物学的側面から優れていて、使用されている。

前記‘押出可能な’または‘吐出可能な’とは、吐出部、ノズル（ｎｏｚｚｌｅ）またはオリフィス（例、一つ以上の孔またはチューブ）を（例えば、圧力下で）通過させることによって成形され得ることを意味する。また、バイオインクの緻密化は適当な密度で細胞を成長させることから誘導される。バイオインクに必要な細胞密度は、使用する細胞および製造する組織または臓器によって変わる。

本発明はまた、組織由来成分が追加的に含まれることを特徴とするバイオインク組成物を提供する。組織由来成分は、軟骨、腎臓、心臓、肝、筋肉などのような動物の特定組織が脱細胞化され細胞外基質を主成分とする物質のゲル（ｇｅｌ）化されたものを意味し、これはバイオインク組成物の組織特異性を強化するために含まれ得る。

本発明において、前記バイオインク組成物は、細胞培養培地を追加的に含むことができる。前記細胞培養培地は、目的する細胞に適した任意の培地を含む概念である。

本発明によるインクはゲル化高分子を含むことができ、このようなプリンティングに使用されるゲル化高分子溶液は多様な種類を使用することができ、このような高分子溶液が有しなければならない条件は次の通りである。まず、三次元印刷がよく行われるようにするために適当な粘性を有しノズルへの噴出が容易でなければならず、排出された後に速く硬化されることによって、製作される対象の形態が崩れるなどの問題が発生してはいけない。また、根本的に製造目的上、人体内組織と類似の細胞培養環境を造成することができなければならない。

前記ゲル化高分子の例は、フコイダン、コラーゲン、アルギネート、キトサン、ヒアルロン酸、シルク、ポリイミド（ｐｏｌｙｉｍｉｄｅｓ）、ポリアミド酸（ｐｏｌｙａｍｉｃ ａｃｉｄ）、ポリカプロラクトン（ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ）、ポリエーテルイミド（ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｉｍｉｄｅ）、ナイロン（ｎｙｌｏｎ）、ポリアラミド（ｐｏｌｙａｒａｍｉｄ）、ポリビニルアルコール（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、ポリベンジルグルタメート（ｐｏｌｙ−ｂｅｎｚｙｌ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ）、ポリフェニレンテレフタルアミド（ｐｏｌｙｐｈｅｎｙｌｅｎｅｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｍｉｄｅ）、ポリアニリン（ｐｏｌｙａｎｉｌｉｎｅ）、ポリアクリロニトリル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ）、ポリエチレンオキシド（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ）、ポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）、セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ポリアクリレート（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｔｅ）、ポリメチルメタクリレート（ｐｏｌｙｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、ポリ乳酸（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ；ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ；ＰＧＡ）、ポリ乳酸とポリグリコール酸の共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリ｛ポリ（エチレンオキシド）テレフタレート−ｃｏ−ブチレンテレフタレート｝（ＰＥＯＴ／ＰＢＴ）、ポリホスホエステル（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈｏｅｓｔｅｒ；ＰＰＥ）、ポリホスファゼン（ＰＰＡ）、ポリアンヒドリド（Ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅ；ＰＡ）、ポリオルトエステル｛ｐｏｌｙ（ｏｒｔｈｏ ｅｓｔｅｒ；ＰＯＥ｝、ポリ（プロピレンフマレート）−ジアクリレート｛ｐｏｌｙ（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｆｕｍａｒａｔｅ）−ｄｉａｃｒｙｌａｔｅ；ＰＰＦ−ＤＡ｝およびポリエチレングリコールジアクリレート｛ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｄｉａｃｒｙｌａｔｅ；ＰＥＧ−ＤＡ｝からなる群より選択された１種以上または前記材料の組み合わせであり得る。しかし、本実施例で材料が制限されるのではない。また、前記ゲル化高分子は天然高分子を化学的変形したものを使用することができ、例えば、ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）とメタクリレート（ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ；ＭＡ）を化学的に結合し、光開始剤（ｐｈｏｔｏｉｎｉｔｉａｔｏｒ）を結合したＧｅｌＭＡ、アルギネート（Ａｌｇｉｎａｔｅ）／ゼラチン（Ｇｅｌａｔｉｎ）、アルギネート（Ａｌｇｉｎａｔｅ）の結合部位（ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）を追加するためにペンタペプチドシークエンシング（ｐｅｎｔａｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（ＹＩＧＳＲ）とＥＤＣ／ＮＨＳを結合したアルギネート（ａｌｇｉｎａｔｅ）などを含むことができる。

特に、前記ポリエチレングリコール、アルギネート、コラーゲンおよびゼラチンをはじめとするヒドロゲルは、水分含量が高く、生体適合性に優れ機械的特性を調節することができ生分解性に優れて細胞が包埋された担体の製造に広く用いられてきた。このような理由のために、ヒドロゲルは細胞が搭載された構造の製造に非常に適し、多様なタイプの組織再生骨格を得るために直接プリントすることができる。

前記ゼラチンは、温度−敏感性特性を示すため前記細胞運搬物質として特に適する。即ち、ゼラチンは、３７℃で液状化され常温以下で固体化される特性を有している。

前記ゲル化高分子は物理的処理または化学的処理を用いて架橋結合を形成することができ、前記化学的処理には架橋溶液を用いることができ、選択されたゲル化高分子によって適切に架橋溶液を選択して使用することができる。例えば、前記架橋溶液は石膏；またはヒドロキシアパタイト、炭酸アパタイト、フッ化アパタイト、塩化アパタイト、α−ＴＣＰ、β−ＴＣＰ、メタリン酸カルシウム、リン酸四カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸二水素カルシウム、ピロリン酸カルシウム、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、ＥＤＣ｛１−ｅｔｈｙｌ−（３−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ｝またはこれらの塩から選択される１種以上の混合物の溶液であり得る。

前記ゲル化高分子溶液を含むインクは、通常液状形態のコラーゲン溶液でのコラーゲン濃度比率が０．１〜３０％範囲内に形成されるのが好ましい。ヒドロゲルの製造方法は通常の三次元印刷用にインクを製造する時に使用する製造方法を適用して行うことができるが、特に限定されない。

本発明によるバイオインクは細胞を含むことができ、適用可能な細胞または組織は特に限定されず、動物細胞または植物細胞であるか、動物または植物の組織であり得る。前記細胞は、幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、造骨細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、筋芽細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔ）、腱細胞（ｔｅｎｏｃｙｔｅ）、神経芽細胞（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔ）、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、神経膠芽細胞（ｇｌｉｏｂｌａｓｔ）、胚細胞（ｇｅｒｍｃｅｌｌ）、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）、腎細胞（ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ）、支持細胞（Ｓｅｒｔｏｌｉ ｃｅｌｌ）、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）、上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、心血管細胞、角質細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）、平滑筋細胞（ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）、心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）、神経膠細胞（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、ホルモン分泌細胞、免疫細胞、膵島細胞（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｓｌｅｔ ｃｅｌｌ）および神経細胞（ｎｅｕｒｏｎ）からなる群より選択されたいずれか一つ以上であり得る。

本発明の製造された人工組織で使用される細胞類型は当業界に公知された任意の方式で培養され得る。細胞および組織培養方法は当業界に公知されている。

細胞はまた、所望の細胞株に沿って細胞の分化を誘導する細胞分化物質と培養され得る。例えば、幹細胞は分化培地と接触してインキュベーションされることによって一定範囲の細胞類型を生成する。複数類型の分化培地が適当である。前記幹細胞は非制限的例として骨原性（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ）分化培地、軟骨原性（ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ）分化培地、脂肪生成（ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ）分化培地、神経分化培地、心筋細胞分化培地、および腸細胞分化培地（例、腸上皮）を含む分化培地と接触してインキュベーションされ得る。

追加的に、細胞は成長因子、サイトカインなどと培養され得る。成長因子は、細胞によって生成されそれ自体および／または様々な他の隣接したまたはかけ離れた細胞に影響を与えることができる、サイトカインを含むタンパク質、ポリペプチド、またはポリペプチド複合体を称する。通常、成長因子は、発生的にまたは多数の生化学的なまたは環境的な刺激に反応して、特定類型の細胞の成長および／または分化に影響を与える。全部ではないが、一部の成長因子はホルモンである。例示的成長因子は、インシュリン、インシュリン類似成長因子（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、基本ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）を含む線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、ＰＤＧＦＡＡおよびＰＤＧＦ−ＡＢを含む血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７などを含む骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、形質転換成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３を含む形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー−刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ＩＬ−８などがある。

本発明での‘バイオプリンティング’とは、自動化された、コンピュータ補助の、三次元試製品化装置（例、バイオプリンタ）と常用される方法論を通じて三次元の正確な細胞沈着（例、細胞溶液、細胞含有ゲル、細胞懸濁液、細胞濃縮物、多細胞凝集体、多細胞体など）を用いることを意味する。３Ｄプリンティングは、バイオプロッター（ｂｉｏ−ｐｌｏｔｔｅｒ）を用いて生分解性高分子をノズルから押出してステージに積層することによって行われ得る。

多様な種類の組織類似器官が前記方法によって生成され得る。バイオインク組成物を積層するパターンや積層配列は、製造しようとする組織類似器官の大きさおよび直径などによって決定され得る。また、組織類似器官を製造するために使用されるバイオインクに含まれる細胞の個数は、細胞の種類、バイオインク組成物に含まれている細胞栄養成分の含量などによって調節され得る。また、バイオインク組成物に含まれる細胞の種類は、前記方法によって製造しようとする組織類似器官の種類によって多様に変更が可能である。本発明の属する技術分野における通常の技術を有する者であれば、三次元バイオプリンティングを通じて製造しようとする組織類似器官の種類によって適切な細胞を選択してこれに適用することができる。

バイオインク組成物が三次元バイオプリンタによって噴射されて積層された以後には、これを加熱するか、紫外線に露出させるか、または架橋結合溶液を添加することによってバイオインク組成物の架橋結合を促進することができる。このような架橋結合は、積層されたバイオインク組成物がより堅固な構造物として完成されるようにする。前記架橋結合を促進するために光学開始剤（ｐｈｏｔｏｉｎｉｔｉａｔｏｒ）を使用することができる。

印刷物と同一な断面パターンを有するが、大きさが同一または異なる断面パターンを有するインク吐出部材を製造するために、インク吐出部材収容部の空間に三次元印刷方法で提供される少なくとも１種以上のインクを収容し、前記収容部の下部に位置しインクが通過する単一通路を備えインクを吐出する吐出部を通過するように圧力、例えばピストンを制御する。収容部にバイオインクが充填された後には、バイオインクがあふれ出ないように予め支持物質としてヒドロゲルを０．１ｍＬ〜２ｍＬ程度少量入れた後に収容部に入れるのが好ましい。その後に、バレルにヒドロゲルを追加するか、あるいは追加しない。再びプリンティングすると、印刷初期には充填されたヒドロゲルが抜け出、その後に所望の形状がプリンティングされる。所望の形状の印刷物のプリンティングが終わると、上に満たしておいたヒドロゲルが抜け出るようになる。初期、後期に支持物質（ｓｕｐｐｏｒｔ ｍａｔｅｒｉａｌ）を入れる理由は、プリンティングが安定的に行われるようにするためである。

以下、添付図面を参照して本発明について詳しく説明する。

図１、図２、図３、図４、および図５は、本発明の一例によってインク収容部材に三次元印刷方法でインクを提供する工程を概略的に示した図である。本発明において、三次元印刷方法とは、図２に示すように、インク吐出口を水平方向に移動させながら、インク吐出口から吐出されたインク吐出物を基板に印刷することによって三次元パターンを形成することをいう。

図１には、インク吐出部材１０の内部はそれぞれのインク１１、１２、１３、１４を収容する複数個の空間が区画されている。図９には、本発明の一例によって５種類のインク（１、２、３、４、５）を吐出する例に適用できるバイオプリンティング装置が示されている。インク吐出部材１０に収容された細胞液状物質をＡ方向に押して吐出部２０またはノズル８０を通じてプリンティングインクを吐出させて最終目的物５０を完成する。この時、ピストン６０はプリンティング素材の断面が同一な形態を維持しながら大きさのみ縮小されてノズル２０を通過するように制御されるのが好ましく、場合によってベースは液状物質が入っている容器であってもよい。

前記圧力が過度に強い場合、前記ノズルにかかる負荷が大きくなって損傷が発生するか、または前記ヒドロゲルが柔らかくスレッド（ｔｈｒｅａｄ）形態に排出されず固まって不均衡な形状に排出される危険性があり、前記圧力が過度に弱い場合、前記ヒドロゲルの粘性による抵抗のため、前記ノズルから円滑な排出が行われないことがある。一方、前記直径が過度に小さい場合、排出圧力が大きくなって前記圧力が強い時の危険性が同様に発生することがあり、前記直径が過度に大きい場合、スキャフォールド製造時に三次元形状の精密度が落ちることがある。前述の圧力範囲および直径範囲は前述のような点を全て考慮して、前記ヒドロゲルの排出が適切に円滑で容易に行われ得ると同時に製造されるスキャフォールド形状の精密度を適切に所望の水準に達成することができるようにする範囲として実験的に決定されたものである。

例えば、本発明によるプリンティング方法は、前記収容部にインクを収容させる段階、前記収容部に０．１〜７００ｋＰａ、１〜５００ｋＰａまたは１〜７００ｋＰａ範囲内の圧力を加えて例えば、０．１〜１ｍｍ範囲内の排出口直径を有する前記ノズルに前記インクを吐出する段階、プリンティング装置の移動部によって前記ノズルが１〜７００ｍｍ／ｍｉｎ範囲内の速度で移動しながらインクを印刷する段階を含んで構成され得る。

その次に、インク吐出部材１０に収容された細胞液状物質をＡ方向に押して吐出部２０を通じてプリンティング素材をベース１００に吐出させて最終目的物５０を完成する。この時、ピストン６０はプリンティング素材の断面が同一な形態を維持しながら大きさのみ縮小されて吐出部２０を通過するように制御されることが好ましく、場合によってベースは液状物質が入っている容器であってもよい。

従来技術のように一つずつの材料を噴射してバイオプリンティングする場合には吐出部のノズル内径大きさ減少に制限があるため、材料の体積減少に限界があった。しかし、本発明によれば、多重インクの個数に比例して吐出されるインクの体積を減少させることができるため、従来技術に比べて精密な噴射が可能になる。そして、多重インクが吐出部２０の通路を通過する時にそれぞれのインクと吐出部通路の内側面との間に接触する面積が減少するので、発生するせん断応力が単一材料を吐出する時より低減される。したがって、細胞活性の面で従来技術に比べて有利な効果がある。

本発明によれば、多重インクの個数に比例して吐出される材料の体積を減少させることができるため、従来技術に比べて精密な噴射が可能になる。また、多重インクが吐出部またはノズルの通路を通過する時にそれぞれの材料とノズル通路の内側面との間に接触する面積が減少し、発生するせん断応力も単一材料を吐出する時より低減される。したがって、細胞活性およびプリンティング精密度向上の面で従来技術に比べて有利な効果がある。

本発明の一例によって第１インクの充填物と第２インクの印刷物を製造する過程を示す概略図である。 本発明の一例によって第１インクの充填物と螺旋形状の第２インクの印刷物が注入されたインク吐出部材およびこれから得られる吐出物を示す概略図である。 本発明の一例によって第１インクの充填物と螺旋形状の３種類のインクで製造された印刷物が注入されたインク吐出部材およびこれから得られる吐出物を示す概略図である。 本発明の一例によって三次元印刷方法でインク吐出部材にインクを注入する一例を概略的に示す図である。 本発明の一例によってインク吐出部材に第１インクの充填物に加えて、三次元印刷方法で第２〜第７のインクを注入する方法を概略的に示す図である。 実施例１によって第１インクの充填物と第２インクの印刷物を製造する過程を示すシリンジとシリンジ末端に備えられた吐出部の写真である。 実施例１によって第１インクの充填物と螺旋形状の第２インクの印刷物が注入されたインク吐出部材から得られる吐出物を用いて印刷した結果を示す共焦点顕微鏡写真である。 実施例２によって第１インクの充填物と第２インクの印刷物が充填されたシリンジと、前記シリンジから得られる吐出物を用いて印刷した結果を示す共焦点顕微鏡写真である。 本発明の一例による５種類の相異なるインクが充填された収容部を有するインク吐出部材を概略的に示した図である。 本発明の一例によるインク吐出部材を概略的に示した図である。

下記の実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明の保護範囲が下記の実施例に限定される意図ではない。

実施例１：インク印刷物とインク充填物を含むシリンジ
三次元プリンティング装置のインク収容部であるシリンジに３ｗ／ｖ％アルギン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ）材質の充填用第１ヒドロゲルを注入した。前記第１ヒドロゲルが注入されたシリンジに、長い長さのノズルを備えた三次元プリンティング装置を用いて、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）蛍光粒子が含まれている３ｗ／ｖ％アルギン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ）を第２ヒドロゲルとして三次元印刷方法で注入した。具体的な製造過程の一例は図１に例示した方法と類似の方法で行った。シリンジに印刷されたインク形状を写真で撮って図２に示した。

前記シリンジに充填用第１ヒドロゲルと三次元印刷された第２ヒドロゲルを圧力を加えて吐出部を通じて得られる吐出物を用いて三次元印刷方法で印刷し、ノズル大きさ（ｎｏｚｚｌｅ Ｉ．Ｄ）が１．０ｍｍであるノズルを用いて３つの線で印刷した。ノズル大きさ（ｎｏｚｚｌｅ Ｉ．Ｄ）が１ｍｍであるノズルを用いた場合、印刷された断面の長さが３０マイクロメートルであり、ノズル大きさ（ｎｏｚｚｌｅ Ｉ．Ｄ）が２ｍｍであるノズルを用いる場合、印刷された断面の長さが７０マイクロメートルであった。

前記印刷物を共焦点顕微鏡で蛍光観察した結果、緑色蛍光粒子が含まれているヒドロゲルがプリンティングされることを共焦点顕微鏡で確認した。前記顕微鏡写真を図３に示した。図６は、実施例１によってインク収容部を含む吐出部材を用いて支持用第１ヒドロゲルと三次元印刷方法で内部に形成された特定形状を有する第２ヒドロゲルが形成される写真を示す。図７は実施例１によって得られた第１ヒドロゲルおよび第２ヒドロゲルが充填されたインク収容部を圧力条件下に吐出して三次元印刷方法で製造された印刷物の共焦点顕微鏡観察した結果を示す。即ち、吐出された結果物を共焦点顕微鏡で蛍光観察すれば図７の図面のとおりである。本発明による方法で高い解像度で区分されてインクが印刷されるのを示す。

実施例２：多様な大きさのノズルを用いた三次元印刷
実施例１と同一なインク吐出部材を用いた三次元プリンティング装置を使用し、ノズルの大きさを１８、２０、２２、２５および２７ゲージ（Ｇａｕｇｅ）でヒドロゲルがプリンティングされることを共焦点顕微鏡で確認した。具体的に１８、２０、２２、２５および２７ゲージ（Ｇａｕｇｅ）の各ノズルの内径は０．８２ｍｍ、０．６３ｍｍ、０．４１ｍｍ、０．２８ｍｍ、および０．１ｍｍであった。前記共焦点顕微鏡写真を図８に示した。

図８は実施例２によってインク収容部を含む吐出部材を用いて第１ヒドロゲル充填物と第２ヒドロゲル印刷物がノズルの大きさの変化によるプリンティング結果物を示す共焦点顕微鏡観察結果を示す。断面図（Ｃｒｏｓｓ−ｓｅｃｔｉｏｎａｌ Ｖｉｅｗ）に示されているように、インク吐出部材の断面形状と同じ形状に小型化が可能であった。本発明の実施例によれば、比率は特定形状（実施例：Ｌｏｂｕｌｅ）の全体直径（１５ｍｍ）から９８．７％（２００μｍ）まで小型化可能であった。前記数式よって計算した。
［数式１］
インク印刷物の縮小比率＝（Ａ−Ｂ）／Ａ×１００（％）
上記数式１中、
Ａは、三次元印刷方法方法でシリンジに提供された１次インク印刷物の直径であり、
Ｂは、印刷インクの２次印刷物の直径であり、
前記ＡおよびＢは同一長さ単位である。

［表１］

実施例３：２つ以上のインクを含むインク印刷物
実施例１と同一なシリンジに第１ヒドロゲルを注入した。前記ヒドロゲルが注入されたシリンジに、長い長さのノズルを備えた三次元プリンティング装置を用いて、それぞれグリーン（Ｇｒｅｅｎ）、ブルー（Ｂｌｕｅ）、レッド（Ｒｅｄ）蛍光粒子が含まれている３ｗ／ｖ％アルギン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ）を順次に印刷したインク印刷物をシリンジに注入し、得られたＲＧＢヒドロゲルがプリンティングされることを共焦点顕微鏡で確認した。前記三つのインクで製造されたインク印刷物が充填されたシリンジおよびその製造過程の模式図を図７に示した。

本発明の方法によれば、シリンジの内部に一つのインクでインク印刷物を製造することだけでなく、２つ以上のインクで三次元印刷を行ってインク印刷物を製造できるのを確認することができ、したがって様々な形態の組織も模写できるのを確認することができる。

実施例４：内腔（ｌｕｍｅｎ）構造を有する人工血管の製作
実施例１と同一なシリンジに３ｗ／ｖ％アルギン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ）を注入し、長いノズルを用いて温度敏感性ヒドロゲルの３％ゼラチンを既注入されたアルギネートの内部に三次元印刷方法を用いて注入した。準備された複合ヒドロゲルを２００Ｍｍのカルシウムクロリドにプリンティングすればアルギネートのみゲル化が誘導されゼラチンはゲル化されないまま存在するようになる。このプリンティング構造体を３７℃の液体に入れておけば、ゲル化されたアルギネートはそのまま形状を維持するがゼラチンは溶けて内腔構造を形成した。

実施例５：細胞を含み多重内腔構造を有する血管製作
実施例４と同様な方法で、シリンジに３ｗ／ｖ％アルギン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ）を注入し、長い長さのノズルを備えた三次元プリンティング装置を用いて、平滑筋細胞が1×10⁷Ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上の濃度で含まれている３％アルギネートを前記充填された３％アルギネート内に注入し、血管内皮細胞が1×10⁷Ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上の濃度で内在された３％ゼラチンを平滑筋細胞が内在されたアルギネートに注入する連続的な方法を通じて、血管構造を模写した。

特に、血管の大動脈や大静脈は４重円筒構造で積み重なっており、この方法を通じて容易に４重構造の血管をプリンティングすることができるだけでなく、大きさ調節も可能である。だけでなく、細静脈の２重構造や微細血管の１重構造も同様に模写することができる。

以上、添付図面を参照して本発明について説明したが、本発明の権利範囲は後述の特許請求の範囲によって決定され、前述の実施例および／または図面に制限される意図ではない。

１０：インク吐出部材
２０：吐出部
４０、５０：インク吐出物
８０：インク吐出口（ノズル）
１００：プレート

Claims (14)

1. インク収容部および吐出部を含み、単一通路を備えた三次元印刷用インク吐出部材に、２つ以上の互いに異なるインクのうちの少なくとも１種のインクをインク充填物で提供した後、前記インクのうちの少なくとも１種のインクを三次元印刷方法で印刷したインク印刷物で提供するインク提供段階、
   前記インク吐出部材に物理的力を加えて収容されたインクが吐出部の単一通路に吐出されてインク吐出物を製造する段階、および
   前記インク吐出物を基板に印刷する段階を含み、少なくとも１種類のインクが細胞を含む三次元印刷方法において、
   前記インク吐出物の断面パターンがインク収容部の断面パターンと同一の形態を有し、元の断面の形態を維持して断面の大きさのみ小さくなるように、インク収容部に収容されたインクに同一条件の圧力を加えてインク吐出物を押し出すことを特徴とする、三次元印刷方法。
2. 前記インク提供段階で、インク印刷物は三次元パターンを有するものである、請求項１に記載の三次元印刷方法。
3. 前記インク提供段階で、前記インク充填物は三次元印刷方法以外の方法で提供する、請求項１に記載の三次元印刷方法。
4. 前記インクは、２５℃で測定した粘度が２ｃｐ〜１，０００，０００ｃｐの粘度を有するものである、請求項１に記載の三次元印刷方法。
5. 前記インク充填物とインク印刷物のインク粘度差は０〜５，０００ｃｐである、請求項１に記載の三次元印刷方法。
6. 前記インク充填物とインク印刷物の弾性の差が０〜１０，０００Ｐａ以内である、請求項３に記載の三次元印刷方法。
7. 前記インク提供段階で、前記インク充填物を提供した後に、少なくとも２種類のインクを三次元印刷方法で印刷したインク印刷物を提供する、請求項１に記載の三次元印刷方法。
8. 前記インク吐出部材は、内部空間にインクが収容されるインク収容部と、前記収容部の下部に位置し前記インクが通過する単一通路を備え収容部に収容されたインクを吐出する吐出部を含むものである、請求項１に記載の三次元印刷方法。
9. 前記インク吐出部材に提供されたインクの断面直径と吐出物の断面直径の比率が１００：９９〜１００：０．１である、請求項１に記載の三次元印刷方法。
10. 前記印刷物は人工組織である、請求項１に記載の三次元印刷方法。
11. 前記インク吐出物を製造する段階は、前記インクを収容する段階と順次に行われる、請求項１に記載の三次元印刷方法。
12. 前記インクは、構成成分、構成成分の含量および物性からなる群より選択された１種以上が異なるものである、請求項１に三次元印刷方法。
13. 前記インクは、ゲル化高分子を含むものである、請求項１に記載の三次元印刷方法。
14. 前記インクは、ゲル化高分子、細胞、成長因子、および細胞外基質からなる群より選択された１種以上を含むものである、請求項１に記載の三次元印刷方法。

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